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KR20050043919A - 면역계 분자를 인간화시키는 방법 - Google Patents

면역계 분자를 인간화시키는 방법 Download PDF

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KR20050043919A
KR20050043919A KR1020057003169A KR20057003169A KR20050043919A KR 20050043919 A KR20050043919 A KR 20050043919A KR 1020057003169 A KR1020057003169 A KR 1020057003169A KR 20057003169 A KR20057003169 A KR 20057003169A KR 20050043919 A KR20050043919 A KR 20050043919A
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제프리 알. 스틴슨
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선올 몰레큘라 코포레이션
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Abstract

면역계 분자, 특히 인간화된 항체 및 그의 단편을 만드는 방법이 개시된다. 일반적인 방법은 개별적인 항체 프레임워크 영역 간의 유사성을 최적화하여 분자를 만들기에 적합한 인간 프레임워크 영역을 확인하는 것을 돕는다. 더 큰 항체 프레임워크, 고가변 도메인 또는 양자 간의 비교를 피한다. 또한 그 방법에 의해 인간화된 항체가 개시된다. 본 발명은 적합한 결합 친화성 및 최소화된 인간 면역원성을 갖는 인간화되 모노크롤날 항체의 생산에 있어서의 용도를 포함하여 광범위한 적용을 갖는다.

Description

면역계 분자를 인간화시키는 방법{Method of humanizing immune system molecules}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 미국 가출원 USSN 60/343,306의 우선권을 주장하는 미국 출원 번호 제 09/990,586호의 일부계속 출원인, 2002년 8월 29일 출원된 USSN 10/230,880의 우선권을 주장한다.
미국 출원 번호 제 09/990,586호는 미국 출원 번호 제 08/814,806호 (현재 미국 특허 제 5,986,065호)의 분할 출원인 미국 출원 번호 제 09/293,854호에 관련된다. 미국 출원 번호 제 10/230,880호, 제 9/990,586호, 제 60/343,306호 및 미국 특허 제 5,986,065호의 개시는 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 인간화된 면역계 분자를 만드는 방법을 특징으로 한다. 한 측면에서, 본 발명은 더 큰 프레임워크 또는 가변 도메인 보다는 개별적인 항체 프레임워크 영역 간의 서열 유사성을 최적화하는 것을 포함하는 항체를 인간화하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 적합한 결합 친화성 및 최소화된 인간 면역원성을 갖는 인간화된 모노클로날 항체의 생산에 있어서의 사용를 포함하는 넓은 범위의 적용을 갖는다.
항체가 중요한 용도를 갖는다는 일반적인 인식이 있다. 예를 들어, 정밀한 특이성을 갖는 항원을 검출하는 것이 많이 알려져 있다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 보고된 바 있다. 일반적으로 Molecular Biology of the Cell (B. Alberts 등 Eds.2nd edition) (1989) Garland Publishing, Inc. New York 및 거기에서 인용된 참고 문헌 참조.
항체 구조 및 기능의 이해에 대한 실질적인 관심이 있어 왔다. 예를 들어, 가변 (V) 도메인의 구조 및 기능에 대해 많이 알려져 있다. 거의 모든 항체 V 도메인은 고가변 상보성 결정 영역 ("CDRs", complementarity) 및 프레임워크 영역 ("FRs", framework regions)을 포함한다. 대부분의 항체 분자에 대해, 단일한 CDR은 끼어들어가 있는 FR에 의해 또다른 CDR로부터 분리되어 있다. 일반적으로 항원 인식 및 결합을 위해 적합한 형태로 CDR 루프를 위치시키는 것을 돕는 분자적 발판으로 제공된다는 것이 인식되어 있다. 일반적으로 B. Alberts 등, supra, 및 거기에서 인용된 참고 문헌 참조.
많은 연구자들이 "프레임워크"를 이용하여 단일한 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 또는 중쇄 가변 도메인 (VH)으로부터 그들 전체 중의 FRs를 기술한 바 있다. 이에 따르면, 하나의 항체 V 도메인은 각각의 서브세트가 그의 상응하는 CDR (CDR1, CDR2, 및 CDR3)에 연결된 개별적인 프레임워크 영역 서브세트(FR1, FR2, FR3 및 FR4)를 포함한다. 프레임워크는 단일한 항체로부터 그들 전체 내의 프레임워크 영역 서브세트으로 구성된다.
적어도 일부 항체에 대해, FRs 내의 아미노산 잔기는 항원 결합에 공헌하는 것으로 생각된다. Foote, J. 및 G. Winter (1992) J Mol. Biol. 224: 487 참조.
치료학적 제제로서 모노클로날 항체를 이용하는 시도가 있었다. 그러나, 그 시도는 특정 항체를 갖는 것에 적어도 해볼만 한 것이었다. 예를 들어, 일부 인간 대상체는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체에 노출 후 원치않는 면역 부작용을 나타내는 것으로 보고된 바 있다. 이러한 반응은, 일부 예에서, 심각한 건강 문제를 보일 수 있으며, 생명을 위협할 수 있다.
인간 대상체에 보다 면역학적으로 허용가능한 항체를 만들려는 시도가 있어왔다. 인간 모노클로날 항체에 대한 일부 보고가 있긴 했으나, 일반적으로 그러한 분자는 만들고 사용하기 어려운 것으로 받아들여졌다.
인간에 보다 허용가능한 항체를 만들기 위한 대안적인 전략은 비-인간 동물(예컨대 마우스) 내로 인간 항체를 코딩하는 유전자를 도입한 바 있다. 그러한 "트랜스제닉" 동물은 인간 서열을 갖는 항체를 만드는 것으로 보고된 바 있다. 그러나, 그러한 동물을 만드는 것은 종종 어렵고 시간 소비적이다. 또한, 이러한 트랜스제닉 마우스는 특허독점되어 있으며, 최적의 인간 항체 유전자 레퍼토리보다는 적게 소유하고 있다.
면역학적으로 허용가능한 항체를 만들기 위한 또다른 시도로 재조합 DNA 기술이 이용된 바 있다. 한 개념은 비인간 항체를 클로닝하고 수정하여 생성된 분자가 인간 항체를 닮도록 하는 것이다. 집합적으로, 그러한 항체는 "인간화된"이라고 언급된 바 있다. 미국 특허 제 5,766,886호, Studnicka 등 ; 5,693,762, Queen 등 ; 5,985,279, Waldeman 등 ; 5,225,539, Winter; 5,639,641, Pedersen, 등 ; 및 거기에서 인용된 참고 문헌 참조.
여러 특이적 접근법이 항체를 인간화하기 위해 제시된 바 있다.
한 전략은 키메라 항체 분자로서 기술되는 것을 만드는 것을 포함한다. 일반적으로, 마우스와 같은 비-인간 동물을 면역화시키기 위해 항원을 이용한다. 그 후, 통상적인 기술을 이용하여 동물로부터 모노클로날 항체를 만들어낸다. 모노클로날 항체를 만들어내는 유전자는 통상적인 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭을 이용하여 생성된다. 뮤린 항체 가변 도메인을 코딩하는 분리된 서열은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 인간 항체의 불변 도메인을 코딩하는 서열에 유전학적으로 융합된다. 이 전략이 인간-마우스 키메라 항체를 만드는데 이용된 바 있다. 예컨대, S. L.Morrison 및 V. Oi (1989) Adv. Immunol. 44: 65 참조.
불운하게도, 일부 키메라 항체을 만들고 이용하는데 문제점이 보고된 바 있다. 특히, 항체의 인간 대상체에의 투여 후 허용되지 않는 면역 반응이 개시된 바 있다. 감소된 순환 반감기 또한 적어도 일부 키메라 항체가 갖는 문제점으로 믿어진다. 예컨대, Boulianne 등 Nature 312 : 643 (1984);Junghansetal. CancerRes. 50: 1495 (1990) 및 Bruggemann 등 (1989) J. Exp. Med. 170:2153 참조.
인간화된 항체를 만들기 위한 추가적인 전략이 보고된 바 있다.
한 가지 시도는 "CDR 그래프팅" (때때로 "프레임워크 그래프팅" 또는 "항체 재성형"으로 불림)으로 기술된 바 있다. CDR 그래프팅은 인간 V 도메인 내로 뮤린 CDRs을 삽입하는 것을 포함하는 것으로 여겨진다. 그 후 뮤린 CDRs은 상응하는 인간 CDRs에 대해 치환된다. E. Padlan Mol. Immunol. 28: 489 (1991) 참조. 대개, V 도메인 내의 모든 FRs은 단일한 인간 항체로부터 유래된다. 기술분야의 일부 사람들은 프레임워크의 인간 FRs가 정확하게 뮤린 CDRs을 위치시켜 항원에 결합할 것을 예견한 바 있다. 그러한 항체는 인간 면역계에 의한 인식을 회피할 것으로 기대되었다. 예컨대, Jones 등, Nature 321: 522-525 (1986); Junghans 등, supra 참조.
그러나, 다수의 CDR 그래프팅 기술을 이용하는데에는 문제가 있다.
예를 들어, 일부 "그래프트된" 항체는 허용되지 않는 항원 결합 특성을 갖는다. Gorman, 등 PNAS (USA) 88: 4181 (1991) 참조. 대개 CDR 그래프트된 V 도메인에 다시 뮤린 잔기를 가하는 항원 결합을 개선하기 위한 시도는 항상 성공적인 것은 아니었다. Queen 등, PNAS (USA) 86: 10029 (1989); 및 Co, 등, PNAS(USA) 88: 2869(1991) 참조.
"항체 재표면화(antibody resurfacing)"로 기술되는 것을 이용하여 인간화된 항체를 생산하는 추가적인 시도가 있었다. 한 시도는 동종(allogeneic) 항체의 노출된 아미노산 잔기를 숙주 항체 내에서 일반적으로 발견되는 것들로 대체하는 것이었다.
가능한 한 많은 항원 결합 기능을 보존하면서도 항체의 면역원성을 감소시키고자하는 희망이 있었다. Roguska, 등 PNAS (USA) 91: 969 (1994) 참조.
불운하게도, 선행 항체 재성형 기술의 다수를 이용함에는 문제점들이 있었다.
예를 들어, 다수의 재성형된 항체는 허용되지 않는 항원 결합 특성을 발현하는 것으로 여겨진다. E. Padlan Mol. Immunol. 28: 489 (1991) 참조. 또한, 대부분의 재성형 기술은 재성형되는 항체의 구조에 대한 상세한 지식을 요구한다. 용매 접근성 및 관련된 변수에 대한 실질적인 정보들이 종종 요구된다. 그러나, 그러한 정보가 인간화되기 필요한 항체에 대해 항상 이용가능한 것은 아니다.
대부분의 항체 인간화 기술에 의해 공유되는 최대의 결점은 인간화시키기 원하는 항체에 대해, 상대적으로 큰 프레임워크 또는 V 도메인이 그래프팅 또는 재성형 조작을 위해 선택된다는 것이다. 비-인간 항체를 조작하기 위한 기초로서 그러한 큰 항체 조각을 이용하는 착상은 예컨대, 항원 결합 친화성을 감소시키고 원치않는 면역원성을 갖는, 원치않는 결과를 만들어낸다. 이러한 결함을 다루기 위해, 친화성을 복구시키기 위한 추가적인 노력이 이용된다. 이러한 노력은 일반적으로 면역원성이 또한 증가되는 것을 가하지 않으면서도 친화성을 올리기 위해 충분한 비-인간 아미노산 잔기을 가하는 것의 절충으로 끝난다.
보다 특히, 다수의 선행 인간화 기술은 허용되지 않는 큰 항체 프레임워크, 또는 더 나쁘게는, 전체 V 도메인을 이용하여 항체를 인간화시키는 조작을 포함하는 것으로 믿어진다. 한 접근법에 따르면, 그 의문(query)에 대해 허용가능한 서열 동일성을 갖는 인간 프레임워크의 세트를 확인하기 위한 의문으로서 큰 비-인간 프레임워크 또는 V 도메인을 사용하였다. 확인된 인간 프레임워크는 그것이 사용된 연구 변수와 관련된 의문 비-인간 서열을 확인하는 최대의 서열을 나타낸다면 종종 "최적 적합"으로 언급된다.
상대적으로 큰 프레임워크 또는 V 도메인과의 비교에 기초한 최적 적합 인간 프레임워크를 선택하는 과거의 실시는 인간화된 면역계 분자를 만들고 이용하기 위한 시도들을 방해한 것으로 믿어진다. 예를 들어, 선행 항체 인간화 방법의 이용은 많은 잠재적인 "최적 적합" 매치를 놓친 것으로 믿어진다. 즉, "최적 적합"의 풀(pool)이 프레임워크 또는 V 도메인에 매치되는 것을 제한함으로써, 다수의 항체를 인간화하는 능력이 손상되었다.
또한, 인간화된 항체를 만들기 위한 많은 선행 방법이 완전한 항체 서열을 이용하여 "최적 적합" 매치에 대해 조사하였다. 그러나, 이러한 전략은 심각한 손실을 나타낸다.
예를 들어, 그러한 조사 접근법은 불완전화게 서열화된 인간 항체로부터 FR 서열을 포함할 수 없다. 이러한 결점은 인간 항체 서열 정도의 보다 완전한 수집의 이점을 갖는 것을 어렵게 만든다.
인간화된 항체를 만들기 위한 선행 방법은 또다른 결점으로 문제를 겪는 것으로 믿어진다.
예를 들어, 많은 인간화된 항체가 최적의 항원 결합 친화성을 나타내지 않는다는 기술 분야의 인식이 있다. 인간 FRs에 인접한 비-인간 CDRs의 아미노산 및 FRs 내의 중요 지점 내의 아미노산 잔기 (버니어 구역 잔기로 언급) 간의 입체 방해(때때로 간섭이라 불림)가 그 문제점에 기여하는 것으로 여겨진다. 선행 인간화 방법이 많은 잠재적인 "최적 적합" 인간 FR 서열을 놓친 것으로 믿어지기 때문에, 이들 및 관련된 간섭 문제를 다루는 능력은 제한되어 왔다.
면역계 분자를 인간화시키기 위한 보다 효과적인 방법을 갖도록 하는 것이 유용할 것이다. 보다 구체적으로, 적합한 결합 친화성 및 최소화된 인간 면역원성을 갖는 인간화된 면역계 분자를 만들기 위한 기초로서 개별적인 프레임워크 서브세트 간의 서열 유사성을 최적화시키는 것을 포함하는 인간화된 항체를 만들기 위한 방법을 갖도록 하는 것이 유용할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 면역계 분자를 인간화시키기 위한 효과적이고 유용한 방법을 특징으로 한다. 한 측면에서, 본 발명은 개별적인 프레임워크 영역 서브세트 (FRs) 간의 서열 유사성을 최적화시키는 인간화된 항체 및 그의 단편을 만들기 위한 방법을 제공한다. 더 큰 항체 프레임워크 및/또는 가변 도메인 간의 비교는 피하고, 선택된 "최적 적합" 인간 FRs을 이용하여 인간화된 면역계 분자를 만든다. 본 발명은 적합한 항원 친화성 및 최소화된 인간 면역원성을 갖는 인간화된 이뮤노글로불린을 만드는데 있어서의 사용을 포함하는 매우 다양한 중요한 적용을 갖는다.
우리는 광범위한 면역계 분자 예컨대, 항체 및 그의 항원-결합 단편을 "인간화시키는" 신규한 방법을 발견하였다. 본 방법은 일반적으로 적어도 하나의 비인간 FR 서브세트 및 적어도 하나의 상응하는 인간 FR 간의 서열 유사성을 최적화하는 것을 포함한다. 서열 유사성은 일반적으로 비-인간 FRs 중 하나, 둘 또는 셋, 보다 바람직하게는 FRs (즉, FR1, FR2, FR3 및 FR4) 중 네 개 모두에 대해 최적화된다. 그러한 서열 유사성은 동시에 하나의 FR(예컨대, FR1 및 FR2와 같은 연속적인 FRs) 또는 동시에 하나 이상(예컨대, 네 개의 FRs 모두 함께)을 의도된 사용을 맞추기 위해 필요한 것으로서 고려함으로써 최적화된다. 상응하는 비-인간 FR 서브세트에 최고의 서열 유사성을 갖는 하나 이상의 확인된 인간 FR 서브세트가 추가의 조작을 위해 선택된다. 선택된 인간 FR 서브세트는 종종 그것이 비교되는 비-인간 FR 서브세트와 관련하여 "최적 적합"인 것으로서 언급된다. 본 발명의 실시는 추가로 적어도 하나의 상응하는 비-인간 FR 서브세트에 대해 적어도 하나의 "최적 적합" 인간 FR 서브세트를 치환하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 사용은 적어도 하나의 그리고 바람직하게는 개별적인 인간 및 비-인간 FR 서브세트 전부 간의 서열 유사성을 최대화시키기 위한 것으로 의도된다. 프레임워크 세트 (즉, FR1, FR2, FR3 및 FR4 함께) 및 전체 가변 도메인 수준에서의 서열 유사성을 최적화시키는 것은 피한다. 선택된 최적 적합 인간 FR 서브세트은 여기에서 기술되는 인간화된 면역계 분자를 조립하기 위한 성분으로서 계속하여 이용된다.
본 발명은 많은 중요한 이점을 제공한다.
예를 들어, 선행 실시는 전체 프레임워크 세트 또는 항체 가변 도메인 간의 유사성에 기초하여 최적 적합 인간 프레임워크 (즉, FR1-4)를 종종 탐지하였다.
이러한 접근법은 예컨대, FR 선택 민감성의 결실을 야기함으로써, 인간화된 이뮤노글로불린을 만들고 이용하기 위한 노력들을 방해한 것으로 믿어진다. 더군다나, 개별적인 인간 FRs 간의 다수의 최적 적합 매치를 놓친 바 있다.
보다 구체적으로, 선행 인간화 방법은 최적 적합 가능성의 수를 심각하게 제한시킨 것으로 믿어진다. 대조적으로, 본 발명의 실시는 그렇게 한정적이지 않다. 즉, 본 발명의 최적의 사용은 개별적인 FR 서브세트 수준에서의 서열 유사성을 확인하고 최대화시키는 것을 포함한다. 보다 큰 프레임워크 세트 및/또는 항체 가변 도메인 간의 덜 민감한 서열 비교는 특별하게 피해졌다. 본 발명에 의해 제공되는 이들 및 관련된 이점은 일반적으로 인간화되는 면역계 분자 상의 FR 서브세트의 수의 산술적 순차곱셈에 의해 최적 적합 가능성의 수를 확장시킨다. 본 발명의 이러한 특징은 인간화된 분자를 만들고 이용하는 기회를 실질적으로 증진시키고, 인간화 과정에 관련되는 비용을 낮추도록 도우며, 흥미있는 임의의 인간화된 면역계 분자를 정밀하게 조립하기 위한 기초를 제공한다.
설명의 방식에 의해, 본 발명을 이용하여 원하는 비-인간 항체을 인간화시킬 수 있다. 이러한 예에서, 서열 비교에 대해 이용가능한 인간 FR 서브세트의 풀은 서열 정보가 이용가능한(중요하게는, 불완전한 가변 도메인 서열로부터의 FR 서열 정보를 포함하여) 경쇄 및 중쇄의 각각에 대한 네 개의 프레임워크 서브세트(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 의 각각의 산술 순차곱셉이다. 중요한 결과는 적어도 약 4 배의 풀 크기에서의 증가이다. 일부 구체예에서, 풀 크기는 불완전한 V 도메인 서열으로부터의 최적 적합 FRs의 이용가능성에 기인하여 보다 더 클 수 있을 것이다. 이는 선택을 위해 이용가능한 인간 FRs 서브세트의 풀의 크기를 올리므로, 선행 방법을 넘어서는 중요한 이점이다. 따라서 잠재적인 최적 적합 인간 FR 가능성이 증진된다.
이에 따라, 최적 적합 인간 FR 서브세트를 탐지하는 기회를 과거의 접근법과 비교할 때 본 발명에 따라 더 높다.
본 발명의 실시는 또다른 중요한 이점을 제공한다.
기술된 바와 같이, 본 발명의 목적은 인간화되는 각각의 비-인간 FR 서브세트에 대한 최적 적합을 최적화하고 선택하는 것이다. 과거의 접근법과는 다르게, 이 과정은 대상 면역계 분자 내의 다른 FRs에 필수 독립적으로 수행된다. 따라서, 그들이 존재하는 모든 범위에서 매치되지 않은 아미노산의 수는 본 발명의 방법을 이용함으로써 실질적으로 저하될 것이다. 이용가능한 완전히 서열화된 인간 항체 및 가변 도메인의 풀에 의해 종종 제한되던 과거의 방법과는 달리, 본 발명의 사용은 최적 적합 인간 FR 서브세트를 선택하기 위한 새로운 기회를 제공한다. 본 발명은 추가로, 상응하는 비-인간 FR과 비교할 때 미스매치가 없거나 거의 없는 최적 적합 인간 FRs를 탐지하는 더 나은 기회를 제공한다.
따라서, 본 발명의 실시는 매우 다양한 면역계 분자를 만들고 이용하기 위한 기회를 증진시킬 것이다. 중요하게는, 그러한 방법을 이용하여 그것이 얻어진 모 비-인간 또는 키메라 분자과 비교할 때 그의 항원 결합 친화성이 실질적으로 보존된 인간화된 항체 및 단편을 제조할 수 있다.
이에 따라, 그리고 한 측면에서, 본 발명은 인간화된 항체 가변 (V) 도메인 또는 그의 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직한 단편은 항원 단독으로 또는 그의 상응하는 V 도메인 결합 파트너 또는 단편와 배합하여 특이적으로 결합한다. 대부분의 구체예에서, 그 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다.
일반적으로, 원하는 비-인간 항체 FR 서브세트 중 적어도 하나의 아미노산 서열, 바람직하게는 그러한 FRs 중 약 4개 미만, 보다 바람직하게는 FR1 또는 FR2과 같은 약 하나의 FR을, 상응하는 인간 아미노산 항체 또는 가변 도메인 서열 또는 그의 단편의 풀과 비교한다. 대부분의 예에서, 다른 집합들이 부분적 프레임워크 서열의 집합을 포함하는 일부 적용을 위해 이용될 수 있음에도, 상응하는 인간 항체 프레임워크 아미노산 서열의 집합이 비교를 위해 이용된다. 상응하는 인간 FR 서브세트는 상응하는 비-인간 FR 서브세트와 관련하여 최적 적합을 갖는 풀로부터 선택된다. 일반적으로, 적합한 최적 적합 인간 FR 서브세트는 상응하는 비-인간 FR 서브세트와 비교할 때 적어도 약 75%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 80%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 이상 내지 약 100%의 서열 동일성을 나타낼 것이다.
계속하여, 비-인간 FR 서브세트를 돌연변이시켜 상기 확인된 최적 적합 인간 FR 서브세트를 필수적으로 코딩시킨다. 표준 돌연변이 방법 중 하나 또는 배합들이 하기 기술되는 바와 같이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 비-인간 FR 서브세트의 돌연변이는 선택된 인간 FR 서브세트에 대해 실질적으로 동일한, 즉, 선택된 서브세트에 대해 적어도 약 75% 동일, 바람직하게는 적어도 약 80% 동일, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 이상 내지 약 100% 동일한, 인간화된 FR 서브세트 (종종 "huFR"이라 불림)를 생산하기 위해 수행된다.
본 발명의 이전의 인간화 단계는 비-인간 V 도메인 중 하나 이상의 원하는 FR 서브세트를 인간화시키기 위해, 필요에 따라, 반복될 수 있다. 보다 구체적으로, 그 단계는 각각의 DNA 서열이 상응하는 huFR 서브세트를 코딩하는, 복수의 DNA 서열을 생산하는 조건 하에서 1회, 2회, 3회 또는 그 이상 반복될 수 있다. 대부분의 예에서(예컨대, 완전히 인간화된 면역계 분자가 요구될 때와 같은), 각각의 FR 서브세트(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)를 인간화시키기 위해 약 3회 내지 4회 단계를 반복하는 것이 유용할 것이다.
따라서, 비-인간 항체가 관심있는 구체예에서, 각각의 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄 상의 각각의 FR 서브세트는 상기 인간화 단계를 겪게 될 것이다.
본 발명의 성공적인 실시는 의도된 결과가 달성될 때까지 비-인간 FRs을 인간화시키는 어떠한 특정한 순서에 의존하지 않는다.
그 후, huFR 서브세트를 코딩하는 DNA 서열 중 하나 또는 배합은 표준 재조합 접근법을 이용하여 적합한 (제 1) 벡터 내로 치환될 것이다.
바람직하게는, 제 1 벡터는 적어도 인간화되는 비-인간 항체의 V 도메인을 코딩한다. 그러나, 일부 구체예에서, 제 1 벡터는 추가로 V 도메인에 공유적으로 결합되는 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 코딩한다.
바람직한 치환 단계는 일반적으로 huFR DNA 서열 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두가 벡터에 의해 코딩되는 하나 이상의 상응하는 비-인간 FR 서브세트에 대한 치환으로서 이용되는 조건 하에서 수행된다. FR 치환의 순서는 일반적으로 의도된 인간화된 분자가 생산되는 것을 제공하는데 중요하지 않다. 따라서, 예를 들어, 비-인간 FR1이 처음으로 인간화된 후, 비인간 FR2가 인간화될 수 있다. 다르게는, 비-인간 FR2가 비-인간 FR1 전에 인간화될 수 있다. 바람직한 치환 단계는 통상적인 조작에 따라 수행되어, 하나 이상의 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR)에 작동가능하게 연결되는 huFR 서브세트 각각을 만들어낸다.
제 1 벡터를 이용하여 하기 기술된 바와 같은 광범위한 적합한 숙주 세포 내에서 하나 이상의 코딩된 인간화된 면역계 분자를 발현할 수 있다.
일반적으로 바람직한 방법은 숙주 세포 내에서의 인간화된 항체 V 도메인 또는 그의 단편의 발현을 돕는다. 또한 바람직한 방법은 그것을 수반하는 세포 구성물로부터 인간화된 분자를 정제하기 위해 의도된 접근법과 완전히 양립가능하다.
본 발명은 주어진 비-인간 FR 서브세트 상의 각각의 미스매치된 위치에서 비-인간 아미노산을 원하는 인간 아미노산으로 전환시키는 광범위한 재조합 접근법과 완전히 양립가능한다. 허용가능한 재조합 접근법의 예는 위치-유도 돌연변이 또는 관련 PCR-기초 방법이다. 본 발명에 따른 잠재적인 최적 적합 인간 FR 서브세트의 풀이 더 크기 때문에, 더 적은 미스매치를 갖는 인간 FR 서브세트 확인의 보다 높은 확률이 있다. 본 발명의 이러한 특징은 특정한 면역계 분자가 인간화되는 때 고려될 필요가 있는 FR 미스매치의 수를 감소시키는 것을 돕는다. 이들 및 기타 발명 이점은 많은 선행 인간화 방법의 일반적인 비용 및 시간 지출을 감소시키는 것을 돕는다.
기술된 바와 같이, 대부분의 선행 인간화 접근법은 생성된 분자의 허용되지 않는 항원 결합에 의해 방해되었다. 보다 구체적으로, 대부분의 선행 인간화된 항체는 모 분자와 비교할 때 동종의 항원에 대해 매우 낮은 친화성을 나타냈다. 많은 모 키메라 항체는 항체의 인간화된 버전보다 더 나은 항원 결합 특성을 갖는다. 이론과 결합하고자 하는 바램없이, 그러한 허용되지 않는 항원 결합은 많은 부분에서 CDRs (버니어 구역 잔기)에 인접하는 FR 서브세트 중의 하나 이상의 아미노산으로부터 유래하는 방해에 기여할 수 있다고 믿어진다. 적어도 일부 항체에 대해, 버니어 구역 잔기는 항체 V 도메인에 의한 항원 결합에 기여할 수 있다는 보고가 있다.
버니어 구역 방해 문제점을 최소화하기 위한 과거의 시도들은 매우 성공적이지 못했거나 올바르게 하기 위한 정교한 컴퓨터 알고리즘을 요구했으며 이는 컴퓨터-기초의 분자 모델링 및 구조 지식에 굉장히 의존했다.
예를 들어, 한 접근법에서, 컴퓨터-어시스트 모델링 소프트웨어를 이용해 방해를 감소시키도록 도왔다. 그러한 소프트웨어는 종종 복잡하여 사용하기 어렵다. 본 발명은 복잡한 소프트웨어의 도움 없이 최적 적합 huFR 서브세트의 탐지 및 선택을 최적화함으로써 문제를 다룬다. 즉, 본 발명은 인간화되는 면역계 분자 중의 버니어 구역 및 다른 곳에서의 미스매치에 대한 기회를 감소시켜 보다 최적의 적합 후보를 제공한다. 따라서, 본 발명의 사용은 모 면역계 분자의 항원 결합 친화성을 유의하게 유지하게 할 수 있다. 이러한 본 발명의 이점은 흥미있는 비-인간 항체가 항원에 대해 일반적으로 높은 친화성 (Kd > 10-9 M 이상의)을 가질 때 특히 중요하다. 이러한 상황에서, 높은 친화성은 종종 적당한 형태로 CDR을 유지함에 대한 요구를 둔다. 본 발명은 버니어 구역 불화합성에 대한 잠재성을 최소화하거나 제거함으로써 이러한 요구와의 실질적인 순응을 제공한다. 과거 실시는 X-선 결정학 또는 컴퓨터 기초의 항체 정보를 이용하여 버니어 구역 불화합성을 다루는 것을 도와왔다.
중요하게는, 본 발명은 이러한 정보에 대한 사용자의 의존성을 감소시키고 많은 예에서 피하게 한다.
본 발명의 다른 면은 이하에서 논의된다.
도면의 간단한 설명
도. 1A 및 1B는 밑줄친(핵산 서열에 대해 하나의 밑줄 및 아미노산 서열에 대해 이중 밑줄) 고가변 영역 (CDRs 또는 상보성 결정 영역)을 갖는 뮤린 항-조직 인자 항체인 H36. D2. B7의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 핵산 (서열번호 1 및 3) 및 아미노산 (서열번호 2 및 4) 서열을 보여준다.
도. 2는 인간화된 항-TF IgG1 항체 발현 벡터 (pSUN-34)의 플라스미드 지도를 보여주는 도면이다.
도. 3A-D는 항-TF 항체의 부분적 및 완전히 인간화된 경쇄 (LC) 가변 도메인의 서열이다(서열번호 72-82). 도. 3A는 완전히 인간화된 LC 프레임워크를 나타내는 "LC-09"라는 이름의 서열(서열번호: 79)을 보여준다. cH36 및 LC-09에 대한 경쇄 CDR 서열은 도. 3B-D (서열번호 103,6 및 7, 각각)에서 보여준다.
도. 4A-D는 항-TF 항체의 부분적 및 완전히 인간화된 중쇄 (HC) 가변 도메인의 서열(서열번호 83-96)을 보여주는 도면이다. 도.4A는 완전히 인간화된 HC 프레임워크을 나타내는 "HC-08"라는 이름의 서열(서열번호: 91)을 보여준다. cH36 및 HC-08에 대한 중쇄 CDR 서열은 도. 4B-D (서열번호 104, 104, 9, 101, 10 및 10, 각각)에서 보여준다.
도.5A-B는 IgG1 항조직 인자 항체 (hOAT) 중의 인간 불변 도메인를 보여주는 서열로, 도. 5A는 인간 카파 경쇄 불변 도메인 (서열번호: 97)을 보여주고, 도.5B는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (서열번호: 98)을 보여준다. 도면들은 hOAT(IgG1) 불변 도메인 아미노산 서열을 보여준다.
도. 6A-B는 IgG4 항조직 인자 항체(hFAT) 중의 인간 불변 도메인을 보여주는 서열로, 도. 6A는 인간 카파 경쇄 불변 도메인 (서열번호: 99)을 보여주고, 도. 6B 는 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인 (서열번호: 100)을 보여준다.
도. 7A 및 7B는 밑줄친(핵산 서열에 대해 하나의 밑줄 및 아미노산 서열에 대해 이중 밑줄) 고가변 영역 (CDRs 또는 상보성 결정 영역)을 갖는 키메라 항-LTA 항체인 A110의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 핵산 (서열번호 105 및 107) 및 아미노산 (서열번호 106 및 108) 서열을 보여준다.
도. 8은 인간화된 항-LTA IgG1를 코딩하는 발현 벡터 (pJRS 391)의 플라스미드 지도를 보여주는 도면이다.
도. 9A-H는 항-LTA 항체의 부분적 및 완전히 인간화된 가변 도메인의 서열을 보여주는 도면이다. 도. 9A는 인간화된 경쇄 (LC) 가변 도메인 프레임워크 영역의 서열(서열번호 109-114, 각각)을 보여준다. 도. 9B-D는 경쇄 CDRs 1-3 (서열번호 115-117, 각각)을 보여준다. 도. 9E는 부분적 및 완전히 인간화된 중쇄 (HC) 가변 도메인 프레임워크 영역의 서열(서열번호 118-123, 각각)을 보여준다. 도. 9F-K는 중쇄 CDRs 1-3 (서열번호 124-126, 각각)을 보여준다.
도. 10는 평가에 대해 인간화된 A110 항체를 생산하는 플라스미드 작제물을 보여주는 표이다.
도.11는 상이한 플라스미드로 인간화된 항-LTA에 의한 항체 발현의 측정을 보여주는 그래프이다.
도. 12는 LTA 결합의 측정을 보여주는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
기술된 바와 같이, 본 발명은 인간화된 면역계 분자를 만드는 방법을 특징으로 한다. 그러한 분자의 예는 인간화된 항체 가변 (V) 도메인, 인간화된 항체 (키메라 및 모노클로날) 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 적어도 하나의 비-인간 프레임워크 (FR) 서브세트, 일반적으로 그러한 서브세트 중 둘, 셋 또는 넷, 및 하나 이상의 상응하는 인간 FR 서브세트 간의 서열 유사성을 최적화하는 것을 포함하는 항체를 인간화하는 신규한 방법을 제공한다. 적어도 하나의 선택된 인간화된 FR 서브세트(huFR)를 상응하는 비-인간 FR 서브세트에 대해 치환시켜 분자를 인간화한다.
본 발명의 바람직한 인간화된 면역계 분자는 인간 대상체에서의 좋은 항원 결합 친화성 및 최소의 면역원성을 특징으로 한다.
면역계 분자를 인간화하기 위해 본 발명을 이용하는 이점은 하기 실시예 6-9를 포함하는 개시를 통해 증명된다. 기술된 바와 같이, 과거 인간화 시도와 본 발명 간의 중요한 차이점은 본 발명 방법이 최적 적합을 갖는 FRs에 대해 조사한다는 것이다. 대조적으로, 선행 시도들은 전체 프레임워크 (대개 단일한 항체 가변 도메인으로부터 유래된) 또는 더 나쁘게는, 전체 가변 도메인을 이용하여 최적 적합을 결정했다. 따라서, 본 방법으로 확인된 FRS는 각각의 항체 쇄에 대한 4 개의 상이한 항체만큼 또는 항체에 대한 총 8 개의 FRs로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 이러한 특징은 탐지가능한 최적 적합 FRs의 이용가능한 풀을 매우 확장시킨다. 최적 적합을 갖는 FRs에 대한 조사에 있어서의 이러한 유연성은 보다 많은 FRs이 고려될 수 있도록 조사에 존재하는 구속들을 보다 적게 만든다. 이러한 이점은 더 적은 아미노산 치환, 버니어 잔기에서의 더 적은 변화 및 더 나은 상동성 또는 상동성 스코어을 요구하는 더 나은 적합성을 제공하도록 돕는다. 최적 적합을 갖는 전체 프레임워크에 대한 조사에 있어서, 결과는 전체 프레임워크에 걸친 절충 최적 적합 이다. 일부 실시예, 양 쇄에 대한 전체 프레임워크는 단일한 항체로부터 얻어지거나, 일부 덜 구속적인 조사에서는, 각 쇄에 대한 프레임워크는 상이한 항체로부터 올 수 있다.
보다 특히, 하기에서 보여지는, 실시예 6은 항-TAC 항체를 인간화시키는 과거 시도와 본 발명 방법 (때때로 여기에서 "FR 최적 적합 인간화"로 언급) 간의 인 실리코(in silico) 비교를 제공한다. 이 실시예에서 보여주는 바와 같이, 본 발명의 사용은 우수한 인간화 결과를 제공한다. 즉, 본 발명에 따른 항-TAC 항체의 실질적인 인간화는 보다 나은 항체를 생산한다.
본 발명을 이용하는 추가적 이점은 실시예 7 (Mc3 항체); 실시예 8 (항-TF 항체); 및 실시예 9 (항-LTA 항체)에서 보여주는 인 실리코 결과로부터 명백하다. 실시예 6을 포함하는 이들 실시예에서, 기술된 항체의 실질적인 인간화는 선행 인간화 접근법과 대조할 때, 우수한 인간화된 항체를 생산한다. 따라서, 본 발명은 광범위한 인간화된 면역계 분자를 만들고 사용할 수 있도록 이용할 수 있는 일반적 적용의 하나이다.
기술된 바와 같이, 본 발명은 항체 및 그의 단편과 같은 광범위한 면역계 분자를 인간화하기 위해 이용할 수 있다. 특정한 본 발명 방법을 이용하여 인간화된 항체 가변 (V) 도메인 또는 항원 결합 그의 단편을 생산할 수 있다. 언급한 대로, 바람직한 단편은 일반적으로 상응하는 V 도메인 결합 파트너 또는 단편과 배합하여 특이적으로 항원에 결합한다. 한 구체예에서, 본 방법은 하기 단계 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다:
a) 비-인간 항체 가변 (V) 도메인의 프레임워크 영역 (FR)의 아미노산 서열을 인간 항체 프레임워크 아미노산 서열, 또는 그의 단편의 수집물과 비교하고,
b) 비-인간 FR에 최대의 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 FR 서열을 수집물로부터 선택하고,
c) 비-인간 FR의 DNA를 돌연변이시켜 단계 b)로부터 선택된 인간 FR에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화된 FR (huFR)를 코딩하고,
d) 비-인간 V 도메인 내의 각각의 FRs에 대해 단계 a) 내지 c)를 반복하여 각각의 DNA 서열이 인간화된 FR을 코딩하는 복수의 DNA 서열을 만들고,
e) 적어도 비-인간 항체의 V 도메인을 코딩하는 제 1 벡터 내로, 벡터에 의해 코딩된 상응하는 비-인간 FRs에 대한 단계 d)로부터의 각각의 huFR DNA 서열을 치환시키고(여기에서, 치환은 각각의 huFRs을 그의 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR)에 연결시킨다);
f) 인간화된 항체 V 도메인 또는 그의 단편를 만들도록 돕는 조건 하에서 숙주 세포 내에서 제 1 벡터를 발현시킨다.
인간화되는 V 도메인 또는 항원 결합 단편은 적어도 하나의 뮤린 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 것이다. 예상되는 바와 같이, 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄는 특정한 구조적 유사성을 공유한다, 예컨대, 각각은 그의 서열이 상대적으로 보존된 4 개의 프레임워크 영역 서브세트(FR1-4) 중 하나를 포함한다. 각각의 FR1-4(FR1, FR2, FR3, FR4)는 세 개의 CDRs 즉, CDR1, CDR2, CDR3에 의해 공유적으로 결합된다. 네 개의 FRs가 넓게 베타-시트 형태를 취하고, 연결된 CDRs이 연결 루프를 형성하여, 일부 예에서, 베타-시트 구조의 일부를 형성한다는 일반적인 인식이 있다. 대부분의 CDRs은 인접하는 FRs 및 맞은 편 경쇄 또는 중쇄의 상응하는 CDR과 모여져 항원 결합 부위를 형성하도록 돕는다. 광범위한 CDRs 및 FRs이 개시되어 있다. 예컨대, Kabat 등, Sequence of Proteins of Immunological Interest Fifth Edition, U. S. Dept. of Health 및 Human Services, U. S. Government Printing Office (1991) NIH Publication No. 91-3242 참조.
또한 EP-A-0239400 및 미국 특허 제 5,985,279호 참조(FR보다는 CDRs을 상이한 종으로부터 유래하여 변경된 항체를 만드는 방법을 기술).
구 "항원 결합 단편"은 특이적으로 항원에 결합하는 항체의 적어도 한 일부를 의미한다. 그러한 단편의 예는 항체 V 도메인 및 그의 V 도메인 결합 파트너를 포함한다. 추가의 적합한 단편은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 대략 크기를 잰 마커 단편를 이용한 크기 배제 크로마토그래피, 질량 분광법 또는 아미노산 서열 분석을 포함한 다양한 표준 방법에 의해 결정된, 약 15 킬로달톤 내지 약 40 킬로달톤, 바람직하게는 약 20 킬로달톤 내지 약 30 킬로달톤, 보다 바람직하게는 약 25 킬로달톤의 V 도메인 및 그의 V 도메인 결합 파트너에 대한 결합된 분자량을 갖는 V 도메인의 부분을 포함한다.
또한 적합한 항원 결합 단편은 항원 결합 V 도메인 단독 또는 동종 불변 (C) 도메인 또는 그의 단편 ("동종(cognate)"은 동일한 이뮤노글로불린 중쇄 (H) 또는 경쇄(L)의 두 성분 간의 관계를 나타내기 위해 사용된다)과 배합된 항원 결합 V 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 일반적인 C 도메인 단편은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 적당하게 크기를 잰 마커 단편을 이용한 크기 배제 크로마토그래피, 질량 분광법 또는 아미노산 서열 분석을 포함한 다양한 표준 방법에 의해 결정되는, 약 5 킬로달톤 내지 약 50 킬로달톤, 보다 바람직하게는 약 10 킬로달톤 내지 약 40 킬로달톤의 분자량을 갖는다. 또한 적합한 항원 결합 단편은 하기 기술된다.
용어, "특이적 결합" 또는 유사한 용어는 여기에서 기술된 분자가 또다른 분자에 결합하여 특이적 결합 쌍을 형성함을 의미한다. 그러나, 그 분자는 인식되지 않거나 예컨대, 웨스턴 블로팅 ELISA, RIA, 이동성 변경 분석, 효소-면역분석, 길항적 분석, 포화 분석 또는 당업계에 공지된 기타 단백질 결합 분석에 의해 결정되는 다른 분자에 결합하지 않는다. 일반적으로, Sambrook 등, Molecular Cloning :A Laboratory Manual (2d ed. 1989); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989 참조.
분자간의 특이적 결합을 탐지하는 방법의 예에 대한 Harlow 및 Lane, Antibody : A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor, New York 참조.
구 "인간화된"은 적어도 하나의 인간 FR 서브세트, 바람직하게는 동일한 것 중 적어도 둘 또는 셋, 보다 바람직하게는 4 개의 인간 FR 서브세트, 및 비-인간 공급원, 일반적으로 래트 또는 마우스 이뮤노글로불린과 같은 설치류로부터의 하나 이상의 CDRs을 포함하는 이뮤노글로불린을 의미한다. 본 발명의 일반적으로 바람직한 인간화된 이뮤노글로불린은 둘 또는 보다 바람직하게는 세 개의 CDRs을 포함할 것이다. 불변 도메인은 존재할 필요가 있는 것은 아니나, 인 비보 사용을 위해 의도된 인간화된 항체의 기능을 보조하기 위해 종종 유용하다. 바람직한 불변 도메인은, 존재한다면, 인간 이뮤노글로불린 불변 도메인에 실질적으로 동일, 즉, 그 아미노산 서열에 관련하여 적어도 약 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일하다. 따라서, CDRs의 가능한 예외를 갖는, 인간화된 이뮤노글로불린의 거의 모든 부분은 자연적으로 발생하는 인간 이뮤노글로불린 서열의 상응하는 부분에 바람직하게는 실질적으로 동일하다.
아미노산 서열 동일성을 결정하는 방법은 기술분야에 표준적이며, 시각적 조사 및 BLAST 및 FASTA (the National Library of Medicine (USA) 웹사이트로부터 이용가능)을 이용한 컴퓨터-보조 접근법을 포함한다. 대부분의 구체예에서 바람직한 매칭 프로그램은 the international ImMunoGeneTics (IMGT) 데이터베이스에 대한 웹사이트로부터 이용가능하며, 이 구체예에 대한 보다 바람직한 매칭 프로그램은 Kabat 데이터 베이스에서 이용가능한 Match라 불리는 프로그램이다. Johnson G, Wu T. "Kabat database and its application: Future directions." Nucleic Acids Res. (2001) 29: 205-206 참조.
구 "인간화된 항체"는 인간화된 경쇄 및 인간화된 중쇄 이뮤노글로불린을 포함하는 항체를 의미한다. S. L. Morrison, supra ; Oi 등, supra ; Teng 등, supra ; Kozbor 등, supra ; Olsson 등, supra ; 및 이전에 인용된 기타 참고문헌 참조. 따라서, "인간화된 항체 단편"은 그러한 항체의 일부, 바람직하게는 항원에 특이적으로 결합하는 일부를 의미한다.
기술된 바와 같이, 발명은 인간 아미노산 서열의 수집물, 바람직하게는 인간 항체 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 서열의 수집물에 대한 각각의 개별적인 비-인간 FR의 아미노산 서열을 비교하고 최적화하도록 의도된 하나 이상의 방법 단계를 포함한다. 실제에서, 가장 높은 서열 동일성 스코어를 갖는 인간 프레임워크 내의 FR는 비-인간 항체 FR에 상응하는 FR이나, 이는 조사 변수에 의해 필수적으로 요구되지는 않는다. "상응하는"은 항체 V 도메인 상의 동일하거나 유사한 위치로부터 두 개의 FRs 간의 관계를 의미한다. 예를 들어, 주어진 항체 경쇄로부터의 설치류 FR1은 그 경쇄로부터의 인간 FR1에 상응한다. 상응성은 종종 FR 숫자, 즉, 설치류FR1은 인간 FR1에, 설치류 FR2는 인간 FR2에 상응, 등에 의해 나타난다.
본 방법의 한 구체예에서, 기술된 V 도메인 또는 단편은 비-인간 항체 경쇄로부터의 것이다. 기술된 바와 같이 FR 서브세트 인간화의 정확한 순서는 일반적으로 중요하지 않다. 따라서, 본 발명의 한 예에서, 본 방법 중 단계 a)의 경쇄 FR 서브세트는 제 1 가변 도메인 프레임워크 영역(FR1)일 것이다. 그러나, 다른 구체예에서는, 다른 FR 서브세트가, 예컨대, FR2, FR3 또는 FR4가 FR1 전에 인간화될 수 있다.
기술된 바와 같이, 본 방법 중 단계 b)는 비-인간 FR 서브세트에 대해 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 복수의 인간 아미노산 서열로부터 인간 FR 서브세트를 선택하는 것을 포함한다. 인간화되는 비-인간 프레임워크가 FR1인 구체예에서, 비인간 항체 경쇄의 FR1 및 선택된 인간 FR 서브세트 간의 서열 동일성은 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 95%이다.
또한 기술된 바와 같이, 본 발명의 특정한 방법은 각각의 비-인간 프레임워크 영역의 반복적(일반적으로 연속적) 인간화를 포함한다. 따라서, FR1이 처음으로 조작되는 구체예에서, 본 방법은 계속적으로 FR2, FR3 및 FR4의 조작을 포함한다. 언급한 대로, FRs의 인간화의 정확한 순서는 중요하지 않으나, 편의상, 숫자상 순서로, 즉, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 순서로 경쇄 및 중쇄 프레임워크를 인간화하는 것이 이로울 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본 방법 중 단계 d)는 수집물과 비-인간 경쇄 (또는 중쇄) V 도메인의 제 2 비-인간 프레임워크 영역 (FR2)을 비교하고, 그의 인간 FR 서브세트 (실제에서, 이는 일반적으로 인간 FR2)에 대해 적어도 약 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 인간 FR 서브세트를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 방법의 단계 d)는 수집물과 비-인간 경쇄 (또는 중쇄) V 도메인의 제 3 프레임워크 영역 (FR3)을 비교하고, 인간 FR 서브세트 (실제에서, 이는 일반적으로 인간 FR3)에 대해 적어도 약 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 인간 프레임워크 영역을 선택하는 것을 추가로 포함할 것이다. 일반적으로, 단계 d)는 수집물과 비-인간 경쇄 (또는 중쇄) V 도메인의 제 4 프레임워크 영역 (FR4)을 비교하고 그의 상응하는 인간 프레임워크 서브세트 (실제에서, 이는 일반적으로 인간 FR4)에 대해 적어도 약 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 인간 프레임워크 영역을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
본 개시에 의해 명백해지는 바와 같이, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니나 T-세포 수용체, 주조직적합성 복합체, 항체를 포함하는, 임의의 이종이량체(heterodimeric) 이뮤노글로불린-유사 분자의 경쇄 V 도메인, 중쇄 V 도메인; 및 그의 항원 결합 단편을 포함하는 다양한 면역계 분자를 인간화시키기 위해 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 인간화된 경쇄 (또는 중쇄)는 서열에 공유적으로 결합된 하기 성분을 포함한다:huFRl-CDR1-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4. 본 발명에 의해 또한 포함되는 방법은 경쇄 또는 중쇄 V 도메인의 항원-결합 단편 및 관련 불변 도메인 및 그의 단편을 추가로 포함하는 분자이다.
언급한 대로, 본 발명의 목적은 적어도 하나의 V 도메인 상의 잠재적인 버니어 구역 방해 문제점을 최소화하고 바람직하게는 제거한 인간화된 항체 (및 항원 결합 단편)를 생산하는 것이다. 이러한 본 발명의 특징은 면역계 분자 및 그의 동종 항원 간의 특이적 결합을 최대화시키는 것을 돕는다. 따라서, 본 방법의 한 구체예에서, 적어도 하나의 가변 도메인의 경쇄 및 중쇄 상의 각각의 FR 서브세트 중의 버니어 구역 아미노산 잔기는 비-인간 FR 서브세트는 항체 V 도메인의 상응하는 인간 FR 서브세트와 비교할 때 동일하다. 예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 상의 비-인간 FR1의 버니어 구역 아미노산 잔기는 인간 FR1 서브세트 중의 상응하는 잔기에 동일해야 한다.
본 방법에서 사용되는 제 1 벡터는 일반적으로 원하는 숙주 중의 코딩된 면역계 분자의 적합한 발현을 위해 필요한 서열 정보를 포함한다.
면역계 분자가 인간화된 경쇄 V 도메인인 구체예에서, 제 1 벡터가 인간 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함한다면 종종 유용할 수 있다. 일반적으로, 배제적인 것은 아니나, 인간 경쇄 불변 도메인 또는 단편은 인간화된 경쇄에 공유적으로 결합될 것이다.
바람직한 구체예에서, 인간 경쇄 불변 도메인은 Cκ, Cλ 또는 그의 단편이다. 종종, 인간화된 경쇄 단편은 약 80개 내지 약 250개의 아미노산, 바람직하게는 약 95개 내지 약 235개의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 104개 내지 약 225개의 아미노산의 아미노산 길이를 가질 것이다. 인간화된 경쇄 단편의 크기는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 대략 크기를 잰 마커 단편를 이용한 크기 배제 크로마토그래피, 질량 분광법 또는 아미노산 서열 분석을 포함한 다양한 표준 방법에 의해 측정할 수 있다.
인간화된 면역계 분자가 중쇄 V 도메인인 구체예에서, 인간화된 중쇄 단편은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 대략 크기를 잰 마커 단편를 이용한 크기 배제 크로마토그래피, 질량 분광법 또는 아미노산 서열 분석을 포함한 다양한 표준 방법에 의해 측정되는, 약 80개 내지 약 650개의 아미노산, 바람직하게는 약 95개 내지 약 540개의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 102개 내지 약 527개의 아미노산의 아미노산 길이를 가질 것이다.
기술된 바와 같이, 본 방법의 목적은 비-인간 면역계 분자로부터의 각각의 프레임워크 영역을 인간 프레임워크 서브세트의 수집물과 독립적으로 비교하는 신규한 인간한 방법을 제공하는 것이다. 그러므로 예를 들어, 키메라 항체를 인간화하기 위해, 중쇄 (HC) 가변 도메인 내의 제 1 프레임워크 영역(FR1)의 서열을 인간 항체의 중쇄-가변 도메인 내의 FR 서브세트에 대해 모든 공지된 서열과 비교한다. 가장 높은 정도의 동일성 또는 상동성(아미노산 서열 중 가장 적은 수의 미스매치)을 갖는 후보자를 확인한다. 그 후, 바람직하게는 HC에 대한 FR2, FR3 및 FR4 각각에 대해 반복한다. 유사한 과정을 경쇄의 가변 도메인 내의 FR에 대해 수행한다. 최적 적합 인간 FR 서브세트는 본 발명의 의도된 사용에 맞출 필요가 있는 동일하거나 상이한 항체로부터 얻을 수 있다. 이는 선택되는 최적 적합이 단일한 인간 항체 서열로부터 그의 전체 중의 단일한 프레임워크인 다른 인간화 방법으로부터의 중요한 이탈이다.
본 방법의 특정한 구체예에서, 제 1 벡터는 인간화된 중쇄와 공유적으로 결합된 인간 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 인간 불변 도메인은 IgGI, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입 또는 그의 단편 중 하나이다.
구 "키메라 항체" 또는 복수형을 포함한 관련 구는 경쇄 및 중쇄 유전자가 일반적으로 유전 공학에 의해 다른 종에 속하는 이뮤노글로불린 유전자로부터 구성된 항체를 의미한다.
예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변 (V) 도메인은 γ1,γ2,γ3, 또는 γ4과 같은 인간 불변 (C) 도메인에 연결될 수 있다. 따라서, 전형적인 치료학적 키메라 항체는 다른 포유 동물 종이 사용될 수 있기는 하나, 마우스 항체로부터의 V 또는 항원결합 도메인 및 인간 항체로부터의 C 또는 효과기 (effector) 도메인으로 구성되는 하이브리드 단백질이다. 특이적 키메라 항체는 하기 기술되는 항-조직 인자 항체, cH36 및 항-리포테코산(anti-lipotechoic acid) 항체, c96-110 (때때로 A110로 언급)이다.
기술된 바와 같이, 본 발명 방법은 비-인간 항체 가변 (V) 도메인 프레임워크 영역 (FR)의 아미노산 서열을 복수의 인간 아미노산 서열, 바람직하게는 인간 항체 프레임워크 아미노산 서열 또는 그의 단편의 서열의 수집물에 비교한다. 그러한 수집물의 한 예는 완전히 서열화된 인간 항체의 목록을 포함하는 데이터베이스로부터의 하나이다. 선행 인간화 방법과는 달리, 수집물은 부분적으로 서열화된 인간 항체의 하나 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 수집물은 부분적으로 서열화된 인간 항체만으로 필수적으로 구성될 수 있다. 그러한 수집물의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기 데이터베이스: GenBank, IMGT, Swiss-Prot, 및 Kabat, supra를 포함한다.
본 발명의 보다 특정한 예에서, 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 만드는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 본 방법은 하기 단계 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다:
a) 비-인간 항체 경쇄 가변 (V) 도메인 프레임워크 영역의 아미노산 서열 (1-FR)을 인간 항체 경쇄 프레임워크 아미노산 서열의 수집물과 비교하고,
b) 1-FR에 대해 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 수집물로부터 인간 FR 서브세트를 선택하고,
c) 1-FR의 DNA를 돌연변이시켜 단계 b)로부터 선택된 인간 FR 서브세트에 실질적으로 동일한 아미노산을 갖는 경쇄 인간화된 FR 서브세트 (L-huFR)를 코딩하게 하고,
d) 경쇄 V 영역 내의 각각의 FR 서브세트에 대해 단계 a) 내지 c)를 반복하여 각각의 DNA 서열이 L-huFR을 코딩하는 복수의 DNA 서열을 생산하게 하고,
e) 적어도 비-인간 항체의 경쇄 V 도메인을 코딩하는 제 1 벡터 내로, 벡터에 의해 코딩되는 상응하는 1-FRs에 대해 단계 d)로부터의 각각의 L-huFR DNA 서열를 치환하고(여기에서, 치환은 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR)에 각각의 L-huFRs를 작동가능하게 연결한다),
f) 인간 항체 중쇄 아미노산 서열의 수집물에 대해 비-인간 항체 중쇄 가변 (V) 도메인 프레임워크 영역 (h-FR)의 아미노산 서열을 비교하고,
g) h-FR에 대한 가장 큰 아미노산 서열 동일성을 갖는 수집물로부터 인간 FR 서브세트를 선택하고,
h) h-FR의 DNA를 돌연변이시켜 단계 g)로부터 선택된 인간 FR에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화된 중쇄 FR 서브세트 (H-huFR)를 코딩하도록하게하고,
i) 비-인간 중쇄 V 도메인 내의 각각의 h-FRs에 대해 단계 f) 내지 h)를 반복하여 각각의 DNA 서열이 H-huFR을 코딩하는 복수의 DNA 서열을 생산하도록하고,
j) 적어도 비-인간 항체의 중쇄 V 도메인을 코딩하는 제 2 벡터 내로, 항체의 상응하는 h-FRs에 대해 단계 i)로부터의 각각의 H-huFR DNA 서열을 치환하고(여기에서, 치환은 상응하는 중쇄 CDR에 각각의 H-huFRs을 작동가능하게 연결시킨다);
k) 제 1 및 제 2 벡터를 숙주세포 내에서 인간화된 경쇄 및 중쇄를 생산하고 인간화된 항체 또는 그의 단편를 만들도록 돕는 조건하에서 발현시킨다.
이전의 방법 중 한 구체예에서, 제 1 및 제 2 벡터는 동일한 숙주 세포 내에서 발현된다. 또다른 구체예에서, 인간화된 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 분자는 단일한 벡터 상에 함유되며, 동일한 숙주 내에서 같이-발현된다(co-expressed).
상기 항체 인간화 방법과의 사용을 위해 적합한 제 1 벡터는 코딩된 면역계 분자의 적합한 발현을 위해 필요한 서열 정보를 포함할 것이다. 예를 들어, 허용가능한 제 1 벡터는 인간화된 경쇄 V 도메인에 공유적으로 결합된 인간 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 포함할 것이다. 바람직하게는, 불변 도메인은 Cκ,Cλ, 또는 그의 단편이다.
본 방법에 따른 바람직한 제 2 벡터는 일반적으로 인간화된 중쇄 V 도메인에 공유적으로 결합된 인간 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함한다. 예를 들어, 인간 불변 도메인은 그의 단편을 포함한 IgGI, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입, 또는 다른 아이소타입 (IgA, IgD, IgE 또는 IgM) 중 하나일 수 있다.
본 발명은 또한 천연적으로 그것을 수반하는 세포 성분으로부터 인간화된 면역계 분자를 정제하도록 의도된 추가적 단계와 양립가능하다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 인간화된 항체를 정제하여 항체의 실질적으로 순수한 제조물을 생산하는 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 것이다. 바람직하게는, 실질적으로 정제된 인간화된 항체는 모 비-인간 항체 보다 약 10-배 이상의 친화성을 가지며 항원에 특이적으로 결합한다.
명백해질 것과 같이, 본 발명은 광범위한 인간화된 면역계 분자를 만들기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 인간화된 본 발명의 항체는 : 1) 인간 FR 서브세트에 대해 아미노산 서열 중 각각 개별적으로 적어도 약 90% 동일한, 바람직하게는 적어도 95% 동일한, 보다 바람직하게는 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 98% 이상 내지 100% 동일한 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역 (FRs), 2) 마우스와 같은 설치류로부터의 적어도 하나의 CDR, 바람직하게는 마우스로부터 CDRs 전부, 및 3) 상응하는 인간 이뮤노글로불린 불변 도메인에 대해 적어도 약 90% 동일, 바람직하게는 적어도 95% 이상 내지 약 100% 동일한 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 합성된 인간화된 항체는 CDRs을 제공하는 항체와 같은 동일한 항원에 결합하는 것으로 기대되기 때문에 항체는 "인간화"의 과정에 의해 "인간화된" 것으로 예상될 것이다.
여기에서 기술된 특정한 인간화된 면역계 분자, 대개 인간화된 항체는 필요에 따라 인접성 또는 비-인접성일 수 있는 하나 이상의 추가적인 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 추가로 예상될 것이다. 예를 들어, 그러한 치환은 일반적으로 항원 결합 또는 기타 이뮤노글로불린 기능에 대해 실질적으로 작거나 없는 영향을 가질 것이다. 복수형을 포함하는 구 "보존적 치환"은: gly ↔ ala ;val ↔ ile ↔ leu ;asp ↔ glu ; asn ↔ gln ;ser ↔ thr, lys ↔ arg ; 및 phe ↔ tyr 의 조합을 의미한다.
본 발명의 항체는 개시된 방법 및 분석에서 사용될 때 바람직하게는 실질적으로 순수하다. "실질적으로 순수한" 항체에 대한 참조는 천연적으로 그것을 수반하는 성분으로부터 분리된 항체 또는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 표준 면역친화성 또는 단백질 A 친화성 정제 기술을 이용하여, 본 발명의 항체는 항원 또는 단백질 A 수지로서 천연 TF를 이용하여 하이브리도마 또는 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 유사하게, 천연 TF는 표준 면역친화성 정제 기술로 본 발명의 항체를 이용하여 실질적으로 순수한 형태로 얻을 수 있다. 특히, 항체 또는 단백질은 총 단백질 중 적어도 50% (주어진 샘플 중 총 단백질 중 중량 %)가 본 발명의 항체 또는 단백질일 때, 실질적으로 순수하다. 바람직하게는 항체 또는 단백질은 총 단백질 중 적어도 60 중량 %, 보다 바람직하게는 적어도 75 중량 %, 보다 더 바람직하게는 적어도 90 중량 %, 가장 바람직하게는 총 물질 중 적어도 98 중량 %이다. 순도는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE), 컬럼 크로마토그래피 (예컨대, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피), 질량 분광법 또는 HPLC 분석과 같은 공지된 방법에 의해 쉽게 분석될 수 있다.
그러한 실질적으로 정제되고 인간화된 항체는 넓은 범위의 항원에 특이적으로 결합되도록 이용될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 본 방법에 의해 생산된 항체는 리포테코산 또는 관련된 지방산을 특이적으로 인식 및 결합할 수 있도록 이용할 수 있다. 다른 인간화된 항체 및 단편은 인간 조직 인자를 특이적으로 인식하고 결합하도록 생산된다.
본 발명에 따른 인간화된 면역계 분자는 광범위한 중요한 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 인간화된 항체 및 항원-결합 단편은 인간 또는 동물에서의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 이용될 수 있다. 다른 동시적 용도는 진단 제품으로서의 용도를 포함한다.
본 발명에 따른 인간화를 위한 항체는 다양한 공급원으로부터 쉽게 얻을 수 있다. 다르게는 그들은 새로이 제작될 수 있다. 한 접근법에서, 그러한 분자는 포유 동물을 상기 기술된 바와 같이 단독으로 또는 담체와 복합되거나 애주번트와의 혼합물로 천연 인간 TF, 또는 면역원성 펩티드의 정제된 샘플로 면역화시켜 제조될 수 있다. 적합한 포유동물은 양, 염소, 래빗, 기니아 피그, 래트 및 마우스와 같은 일반적인 실험실 동물을 포함한다. 래트 및 마우스, 특히 마우스가 모노클로날 항체를 얻기 위해 바람직하다. 항체는 피하, 복강내, 정맥내, 근육내 또는 피부내 주사와 같은 많은 적합한 경로 중 임의의 것에 의해 포유동물에 투여될 수 있다.
최적의 면역화 간격, 면역화 투여량 등은 상대적으로 넓은 범위 내에서 변화될 수 있으며, 이 개시에 기초하여 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적인 방법은 여러 달에 걸친 수 회의 항원의 주사를 포함한다. 항체는 표준 기술에 의해 면역화된 동물의 혈청으로부터 수집될 수 있으며, 스크린 하여 원하는 항원에 대해 특이적인 항원을 찾아낼 수 있다. 모노클로날 항체는 항체를 생산하는 세포 중에서 생산될 수 있으며, 이들 세포를 이용하여 하이브리도마 세포를 형성하기 위한 표준 융합 기술을 이용하여 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. G. Kohler, 등, Nature 256: 456 (1975) 참조. 일반적으로 이는 골수종 세포와 같은 불사 세포를 갖는 항체-생산 세포를 융합하여 하이브리드 세포를 생산하는 것을 포함한다. 다르게는, 모노클로날 항체는 Huse, 등, Science, 256: 1275 (1989)의 방법에 의해 세포로부터 생산될 수 있다. 그러한 항체는 원한다면 통상적인 방법론에 의해 서열화될 수 있다.
일부 적용을 위해, 인간화되는 항체로서, 키메라 항체, 예컨대 비-인간 동물 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 결합한 항체 분자를 이용하는 것이 필요할 수 있다. 다양항 유형의 그러한 키메라 항체는 가변 도메인의 일부, 특히 항원-결합 도메인의 보존된 영역이, 인간 기원이고 고가변 영역만이 비-인간 기원인 인간 가변 도메인 키메라를 생산함에 의한 것을 포함하여 제조될 수 있다. S. L. Morrison, Science, 229: 1202-1207 (1985);Oi 등, Biotechnology 4: 214 (1986); Teng 등, Proc.Natl.Acad. Sci. U. S. A., 80: 7308-7312 (1983); Kozobor 등 Immunology Today 4: 72-79 (1983); Olsson 등 Meth. Enzymol. 92: 3-16 (1983)에서와 동일한 것을 생산하는 인간화된 키메라 항체 및 방법의 논의를 또한 참조.
또한, 트랜스제닉 마우스를 이용하여 특정한 인간 모노클로날 항체를 만들 수 있다. 예를 들어, 인간 항체 레파토리를 수반하는 트랜스제닉 마우스는 관심있는 항원으로 면역화될 수 있도록 형성될 수 있다.
그러한 면역화된 트렌스제닉 마우스로부터의 비장 세포(splenocyte)를 이용하여 항원에 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 형성할 수 있다. N. Lonberg 등, Nature, 368: 856-859 (1994); L. L. Green 등, Nature Genet. , 7: 13-21 (1994); S. L.Morrison, 등, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81: 6851-6855 (1984) 참조.
본 발명의 항체에 대해 코딩하는 핵산은 또한 중합효소 연쇄 반응에 의해 제조될 수 있다 (하기 실시예 1에서 기술된 프라이머 참조). 일반적으로, Sambrook 등, Molecular Cloning(2nd ed. 1989) 참조. 그러한 핵산은 또한 공지된 방법, 예컨대 포스페이트 트리에스테르 방법에 의해 (Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed. , 1984) 참조), 또는 상업적으로 이용가능한 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 합성할 수 있다. 그렇게 제조된 본 발명의 핵산은 또한 공지된 기술에 의해 본 발명의 항체를 발현하기 위해 이용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산은 작제물의 삽입을 위해 벡터를 자르는 제한 효소의 사용과 같은 공지된 방법에 의해 적합한 벡터 내로는 도입한 후 결찰시킬 수 있다. 적당하게 수술가능하게 프로모터 서열에 연결된, 삽입된 핵산 서열을 함유하는 벡터는 그 후 발현을 위해 숙주 세포 내로 도입된다. 일반적으로, Sambrook 등, supra 참조. 적합한 벡터의 선택은 클로닝 프로토콜에 관련된 인자에 경험적으로 기초하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 벡터는 사용되는 숙주세포와 양립가능하여야하며, 사용되는 숙주세포에 대해 적당한 복제단위(replicon)를 가져야만 한다. 추가로, 벡터는 삽입되는 핵산 서열을 수용할 수 있어야만 한다. 적합한 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 또는 기타 박테리아 숙주, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 또는 기타 효모(other yeast), 아스페르길러스 니게르(Aspergillus niger) 또는 기타 진균, 또는 기타 미생물 숙주, CHO, BK 또는 NSO 포유동물 세포, 조류 또는 식물 세포 등과 같은 광범위한 원핵 또는 진핵 세포를 포함할 것이다.
본 발명의 특정한 구체예에 따르면, 여기에서 기술된 방법은 이들 세포 내에서 벡터를 발현하도록 맞춰진 조건 하에서 식물 세포 내로 하나 이상의 원하는 벡터 유형을 도입하는 단계를 포함할 것이다. 흥미있는 특정한 식물 세포는 아라비돕시스이다. 미국 특허 제 6,417,429호 및 거기에서 인용된 참고 문헌 참조.
예를 들어, V 도메인 또는 항원 결합 그의 단편를 만드는 상기한 방법 중에서, 단계 e)는 식물 세포, 바람직하게는 아라비돕시스 내로 제 1 백터를 도입하여 그 안에서 제 1 벡터를 발현시켜, 항체 V 도메인을 생산하는 것을 포함할 것이다. 그 방법은 그의 항원 결합 단편을 포함하는 완전한 (전체) 항체를 발현하도록 쉽게 조절될 수 있다.
인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 만들기 위한 상기 기술된 방법과 관련하여, 단계 k)는 제 1 벡터 및 제 2 벡터를 식물 세포, 바람직하게는 아라비돕시스 내로 도입하여, 그 안에서 벡터를 발현시켜 원하는 분자를 생산해내는 것을 포함할 것이다. 일부 발명 구체예에서, "메가" 벡터로서 하기에서 언급되는 것은 제 1 및 제 2 벡터 대신에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체의 분자량은 의도된 용도 및 항체가 결합 또는 재조합적으로 융합된 독소, 약제학적, 방사성 동위원소 또는 탐지가능한 표지 등을 포함하는지 여부와 같은 수 개의 인자에 따라 변화할 것이다.
또한 분자량은, 있다면(당화와 같은) 항체에 대한 전사-후 수정의 본질 및 내용에 따라 변화할 것이다. 수정은 비-당화된 항체를 생산하는 E. coli 및 당화된 항체를 생산하는 포유동물과 같은 진핵세포 숙주가 갖는 발현을 위해 사용되는 숙주의 기능이다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 대략 20 내지 150 kDa의 분자량을 가질 것이다. 그러한 분자량은 SDS-PAGE 후 단백질 염색 또는 웨스턴 블롯 분석와 같은 분자 크기측량 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
"본 발명의 항체" 또는 다른 유사한 용어는 전체 이뮤노글로불린 및 원하는 항원에 결합하는 면역학적으로 활성인 단편을 말한다. 이뮤노글로불린 및 면역학적으로 활성인 그의 (항원-결합) 단편은 에피토프-결합 부위를 포함한다 (즉, 항원을 인식하는 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 부위 또는 에피토프). 예시적인 항체 단편은, 예를 들어, Fab, F(v), Fab', F(ab')2 단편, 이뮤노글로불린의 이황화결합을 환원시켜 유도되는 "반 분자(half molecules)", 단일 쇄 이뮤노글로불린, 또는 기타 적합한 항원 결합 단편을 포함한다 (예컨대, Bird 등, Science, 242: 423-426 (1988); Huston 등, PNAS, (USA), 85: 5879 (1988); Webber 등, Mol. Immunol., 32: 249 (1995) 참조). 항체 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편은 동물 (예컨대, 마우스 또는 래트와 같은 설치류), 또는 키메라 형태 (Morrison 등, PNAS, 81: 6851 (1984); Jones 등, Nature, 321: 522 (1986) 참조)의 것일 수 있다. 본 발명의 단일 쇄 및 인간화된 항체는 본 발명의 일부 적용을 위해 유용할 수 있다.
따라서, 또다른 구체예에 따르면, 상기 방법은 추가로 인간화된 V 영역로부터 인간화된 단일쇄 항체 (sc-Fv)를 만들기 위해 의도된 추가적인 단계를 포함한다. 또한, 인간화된 항체의 단편, 특히 F (v), F (ab')2, Fab' 또는 Fab 및 그의 항원-결합 단편은 통상적인 방법에 의해 만들 수 있다.
유사하게, "본 발명의 핵산"은 발현되어 직전의 의미로 그 용어가 구체화된 본 발명의 항체를 제공할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 말한다.
일부 예에서, 본 발명의 항체는 원하는 생물학적, 화학적 또는 물리학적 특성을 그에 주도록 수정되는 것이 필요할 수 있다. 따라서 본 발명 방법은 약제학적 제제에 하나 이상의 인간화된 면역계 분자를 결합(즉, 공유적으로 결합)시키도록 의도된 추가적인 통상적인 단계와 양립가능하다. 그러한 결합은 이종이기능성(heterobifunctional) 단백질 교차-결합제(cross-linking agent), 예컨대 SPDP, 카보디미드 등과 같은 결합 분자의 이용을 포함하는 수 개의 방법, 또는 재조합 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 인간화된 항체의 이용과 양립가능한 특정한 결합 전략은 Rhode,P. 등의 PCT 출원 WO 99/21572에 개시된 바 있다. Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989); Harlow 및 Lane in Antibody : A Laboratory Manual, CSH Publications, NY(1988)를 또한 참조.
본 발명의 특정한 인간화된 항체는 필요에 따라, 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있으며, 제한 없이, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입 또는 IgA, IgD, IgE, IgM를 가질 수 있다.
여기에서 기술된 인간화된 항체는 실시예 1-9 중에서 이하에서 기술된 것을 포함하는 전략 중 하나 또는 배합에 의해 생산될 수 있다.
실시예 1 및 4에서 기술된 접근법에서, 항체를 인간화시키기 위해 4 개의 일반적 단계가 이용되었다. 첫째, 마우스 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 cH36 마우스-인간 키메라 항체로부터 얻었다. 두번째, cH36 항체를 인간 항체 프레임워크 영역가 "최적 적합"을 주는, 즉, 마우스 프레임워크 영역 아미노산 서열을 가장 가깝게 닮은 것을 결정하여 인간화시켰다. 세번째, 관련 경쇄 및 중쇄 FR 서열을 인간화시키고, 네번째, 인간화된 경쇄 또는 중쇄 (또는 인간화된 경쇄 및 중쇄 예컨대, 하기 기술된 메가 벡터 참조)를 코딩하는 분리된 핵산(들)을 트랜스펙션 및 발현시켰다.
보다 특히, "FR 최적 적합" 접근법은 키메라 항-조직 인자 항체 cH36를 인간화하는데 적용되었다. 이 접근법에서, 도. 1A 및 1B (서열번호 2 및 4)에서 보여지는 뮤린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열이 뮤린 가변 도메인에 가장 상동성인 이들 인간 항체 가변 도메인 서열에 대한 모든 이용가능한 단백질 데이터베이스를 조사(비교)하기 위해 사용되었다. 예컨대, Kabat 등, supra 참조. BLAST, FASTA 및 관련 프로그램과 같은 많은 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 이 단계를 수행할 수 있다. 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역 1, 2, 3, 및 4은 이들 부위가 항원 결합에 대한 적당한 정위로 CDRs을 유지시키는 것으로 거의 널리 이해되고 있으므로 특별히 흥미를 두었다. 조사로부터 생긴 결과는 일반적으로 의문의 마우스 서열에 가장 상동성인 서열, 각각의 서열의 퍼센트 상동성, 및 상응하는 뮤린 서열에 대한 각각의 인간 서열의 배열의 목록이었다. 분석은 일반적으로 경쇄 및 중쇄 상에서 독립적으로 수행되었다.
"FR 최적 적합" 접근법에 따라, 의문의 마우스 FR 서브세트 및 인간 FR 서브세트 간의 미스매치된 아미노산의 수는 최소화되었다. 대부분의 경우에서, 적합한 인간 프레임워크 영역 서브세트는 하기 상동성 표준에 기초하여 선택되었다. 경쇄 상에서, 뮤린 FR1의 아미노산 서열은 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 80% 동일; 뮤린 FR2는 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 90% 동일, 뮤린 FR3은 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 90% 동일; 및 뮤린 FR4는 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 75% 동일이었다. 중쇄 상에서, 뮤린FR1의 아미노산 서열은 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 80% 동일이도록 선택되었고; 뮤린 FR2는 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 85% 동일; 뮤린 FR3는 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 70% 동일이도록 선택되었으며 ; 뮤린 FR4는 인간 FR 서브세트에 대해 적어도 약 90% 동일이었다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 유사한 후보 인간 프레임워크 영역 서열이 평가될 때 혜택을 받는다. 그러한 인자는 제공된 생성된 인간 프레임워크 영역을 키메라 cH36 항체의 인간화의 좋은 참조점으로서 고려함이 밝혀졌다.
원하는 인간 프레임워크 영역 상에서의 결정이 이루어졌을 때, 재조합 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 이용하여 경쇄 및 중쇄 양쪽에서 원하는 아미노산 치환을 만들었다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드를 만들고 이용하여 원하는 잔기를 함유하도록 마우스 가변 도메인 프레임워크을 돌연변이시켰다.
다양한 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 재조합 PCR 및 관련 방법에 관한 일반적인 개시에 대해서는 WO 92/07075 참조.
일반적으로, 보통의 PCR을 클로닝을 위해 이용하여 클로닝 또는 진단 제한 엔도뉴클라아제 부위에 도입하고 가변 도메인의 말단에 존재하는 아미노산 잔기를 변화시켰다. PCR-기초의 돌연변이를 이용하여 특히 이들 잔기가 가변 도메인의 중앙에 있을 때, 한번에 다수의 아미노산 잔기를 변화시켰다. 위치-유도 돌연변이를 이용하여 한번에 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 도입했다. 각 단계 후, 부분적으로 인간화된 클론들을 서열화하고 이들의 가변 도메인 중 일부를 이후 발현 벡터 내로 클로닝했다. 이 조작을 수행하기 위한 보다 특이적 방법은 실시예 부분에서 기술된다.
각각의 비인간 FR을 인간화하기 위한 상기 "FR 최적 적합" 접근법을 수행 후, 인간화된 프레임워크 영역 (huFR) 및/또는 CDR을 코딩하는 돌연변이된 핵산을 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 적당한 DNA에 연결시켰다. 그 후 그러한 작제물을 발현 벡터 내로 클로닝하고, 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 이들 단계는 기술 분야에서 공지된 재조합 및 세포 배양 기술을 이용하여 달성할 수 있다.
한 접근법에서, 인간화된 항체는 하기 일반적인 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 발현 숙주에 적당한 레플리콘 및 가변 도메인이 원하는 항체로부터의 개별적인 인간화된 프레임워크 영역(FR1-4) 및 뮤린 CDRs 1-3을 포함하는, 적어도 하나의 Ig 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함하는 제 1 발현 벡터를 제조하고 ,
(b) 가변 도메인이 항체로부터의 상응하는 개별적으로 인간화된 프레임워크 영역(FR1-4) 및 뮤린 CDRs 1-3을 포함하는, 상보적 Ig 경쇄 또는 중쇄 각각의 적어도 하나의 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함하는 제 2 복제가능한 발현 벡터를 제조하고;
(c) 제 1 또는 모든 제조된 벡터로 세포주를 트랜스펙션시키고,
(d) 상기 트랜스펙션된 세포주를 배양하여 상기 인간화된 항체를 생산한다.
바람직하게는 단계 (a) 및 (b) 중의 DNA 서열은 인간 항체 쇄로부터 적합한 불변 도메인을 코딩한다. 적합한 아이소타입은 제한 없이, 예를 들어, IgG1 및 IgG4를 포함한다.
다르게는, 본 발명의 적합한 인간화된 항체는 가변 도메인이 대상체 항체로부터의 각각의 개별적으로 인간화된 프레임워크 영역 (FR1-4) 및 뮤린 CDRs 1-3를 포함하는, Ig 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적당한 프로모터를 포함하는 단일한 복제가능한 "메가" 벡터를 만들어 제조할 수 있다.
한 구체예에서, 메가 벡터는 가변 도메인이 cH36 항체 또는 기타 적합한 CDRs로부터의 상응하는 개별적으로 인간화된 프레임워크 영역(FR1-4) 및 뮤린 CDRs 1-3을 포함하는, 상보적 Ig 경쇄 또는 중쇄 각각의 적어도 하나의 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적합한 프로모터를 추가로 포함할 것이다. 메가 벡터의 이용은 단일한 벡터로부터의 인간화된 항체의 발현이 필요한 경우 종종 적당할 것이다.
인간화된 cH36 항체를 만들기 위한 상기 방법이 본 발명에 따른 기타 인간화된 항체 및 항원 결합 단편을 만들기 위해 쉽게 조절될 수 있다는 것은 명백할 것이다.
본 발명의 인간화 방법에 잘 맞는 항체의 특정한 실시예는 USSN 제. 09/990,586호 ; 및 제 60/343,306호 출원 그리고 하기 실시예에 기술되어 있다.
용어 "조립하는" 또는 "조립된"은 벡터 내로 인간화된 프레임워크 또는 프레임워크 영역를 코딩하는 대상체 DNA 서열을 도입하는 표준 재조합 기술의 이용을 의미한다. 그러한 조립은, 이에 제한되는 것은 아니나, 단일한 프레임워크 또는 프레임워크 영역 서열로의 반복적 변화를 도입하고, 단편을 함께 자르고 붙이는(pasting)(제한 엔도뉴클레나아제 및 리가아제의 이용을 통해)하는 것을 포함하는 접근법 중 하나 또는 배합에 의해 또는 합성적 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로 Harlow 및 Lane supra 및 Ausubel 등 supra 참조.
인간화된 항체를 만들기 위한 상기 방법은 대부분의 임의의 허용되는 돌연변이 기술로 실행될 수 있다. 특히, 관련 방법 단계들은 위치-유도 돌연변이 및/또는 표준 PCR 방법을 사용하여 적당한 인간 아미노산으로 프레임워크 중의 원하는 설치류 아미노산을 대체할 수 있다. 이는 또한 수정된 단편 또는 전체 코딩 영역의 DNA 합성, 또는 표준 재조합 DNA 또는 유전자 공학 기술 또는 이들의 임의의 배합을 이용한 인 비트로 재조합에 의해 또한 수행될 수 있다. 일반적으로, 수정된 (인간화된) 프레임워크 또는 프레임워크 영역의 서열은 데이터베이스로부터 선택된 인간 프레임워크 또는 프레임워크 영역 서열에 상응한다.
본 발명의 적합한 핵산은 여기에서 기술된 인간화된 항체 또는 그의 단편의 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나를 코딩한다. 일반적으로, 핵산은 분리된 핵산을 포함하는 재조합 DNA 벡터이다. DNA 벡터는 천연적으로 관련된 또는 이종유래의 프로모터 영역을 포함하는, 인간화된 이뮤노글로불린 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 것이다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템일 것이나, 원핵세포 숙주의 조절 서열 또한 사용될 수 있다. 벡터가 적당한 숙주 내로 도입될 대, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고-수준 발현을 위해 적합한 조건 하에 유지될 수 있으며, 원한다면, 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 손상되지 않은 항체, 결합 단편 또는 기타 이뮤노글로불린 형태의 수집 및 정제가 뒤따를 수 있다.
원하는 인간화된 항체를 최후로 발현할 수 있는 본 발명의 핵산 서열은 다양한 상이한 폴리뉴클레오티드(지노믹 또는 cDNA, RNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 등.) 및 성분 (예컨대, V, J, D, 및 C 영역)으로부터, 다양한 상이한 기술에 의해 형성될 수 있다.
적당한 지노믹 및 합성 서열을 결합시키는 것은 현재 가장 통상적인 생산방법이나, cDNA 서열 또한 이용될 수 있다. 예컨대, S. L. Morrison, supra ; Oi 등, supra ; Teng 등, supra ; Kozbor 등, supra ; Olsson 등, supra ; 유럽 특허 공보제 0239400 호 및 Riechmann, L. 등, Nature, 332: 323-327 (1988); 및 거기에서 인용된 참고 문헌 참조.
본 발명의 이용은 광범위한 적합한 숙주 예컨대, 포유동물, 식물 또는 미생물 숙주 세포와 양립가능하다. 한 구체예에서, 적합한 DNA 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 이들 세포의 탐지를 허용하기 위한 하나 이상의 선택 마커, 예컨대, 테트라사이클린, 암피실린, 제네티신, 히그로마이신, 프로마이신,또는 네오마이신 (등)을 포함한다.(예컨대, 여기에서 참조로서 포함된 미국 특허 4,704, 362 참조). E. coli는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝을 위해 특히 유용한 원핵세포 숙주의 하나이다. 사용을 위해 적합한 기타 미생물 숙주는, 이에 제한되는 것은 아니나, 바실러스 섭틸러스와 같은 바실리 및 살모넬라, 세라티아, 다양한 슈노모나스 종과 같은 기타 엔테로박테라아케아 및 액티노마이세테스(예컨대, 스테렙토마이세스 종), 효모(예컨대, 사카로마이세스 종) 또는 진균류(예컨대, 아스퍼길루스 종)과 같은 기타 미생물을 포함한다. 이들 원핵세포 숙주에서, 발현 벡터를 만들 수 있으며, 이는 일반적으로 숙주세포와 양립가능한 발현 조절 서열을 함유할 것이다(예컨대, 프로모터 및 복제 기원). 또한, 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템과 같은 임의의 수의 다양한 공지된 프로모터가 존재할 것이다. 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열과 함께 일반적으로 발현을 조절할 것이며, 개시 및 전사 및 번역의 완결을 위해 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 효모와 같은 다른 미생물 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 사카로마이세스는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 해당 효소, 및 원한다면 복제 기원, 종결 서열 등을 포함하는 프로모터와 같은 발현 조절 서열을 갖는 적합한 벡터를 갖는 바람직한 숙주이다.
상기 미생물-기초 시스템에 부가적으로, 진핵 숙주 또한 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 생산을 위해 사용될 수 있다(여기에서 참조로서 포함된 Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, N. Y. , N. Y. (1987) 참조). 많은 구체예에서, 진핵 숙주, 일반적으로, 제한 없이, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, NSO 세포, BK 세포, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주 등, 또는 하이브리도마 형질 전환된 B-세포를 포함하는 포유동물 세포주가 바람직할 것이다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 복제 기원, 프로모터 및 인핸서와 같은 발현 조절 서열 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열과 같은 필요한 프로세싱 정보 부위를 포함할 수 있다(Queen 등, Immunol. Rev. 89: 46-68 (1986) ). 바람직한 발현 조절 서열은 이뮤노글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스(Bovine Papilloma Virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 등으로부터 유래된 프로모터이다. 다른 구체예에서, 진핵 숙주는 제한 없이, 예컨대, 아라비돕시스, 니코티니아(Nicotinia) 등을 포함하는 식물 또는 식물 세포인 것이 일반적으로 바람직할 것이며, 식물 세포 배양은 또한 본 발명의 항체를 발현 및 생산하기 위해 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 진핵 숙주는 진핵숙주가 곤충 세포, 조류 종 또는 트랜스제닉 동물인 것이 일반적으로 바람직할 것이다.
본 발명을 실시하기 위해 바람직한 DNA 벡터는 하기 작동가능하게 연결된 서열을 포함한다: 항생제 내성 마커 예컨대, 암피실린 내성, F1 기원, 및 중쇄 (HC) 또는 경쇄 (LC) 가변 도메인. 그 가변 도메인은 작동가능하게 연결된 서열: HC 가변 도메인, 인간 IgG1 또는 IgG4 불변 도메인, 제 1 폴리 A 부위, SV40 프로모터, 네오마이신 내성과 같은 항생제 내성 마커, 제 2 폴리 A 부위, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터/인핸서, 및 적합한 리더 서열을 포함하는 적당한 HC 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
또한 바람직한 DNA 벡터는 인트론이 적합한 인간 카파 불변 도메인에 작동가능하게 연결된 설치류 카파 인트론 (예컨대, 마우스)에 작동가능하게 연결된 LC 가변 도메인; 및 네오마이신 내성과 같은 항생제 내성 마커를 포함한다.
기술된 바와 같이, 본 발명의 인간화된 항체를 단일한 핵산으로부터 발현시키는 것으 종종 매우 유용할 수 있다. 바람직한 DNA 벡터는 때때로 여기에서 "메가" 벡터로서 언급되며, 서열 중 작동가능하게 연결된 하기 성분을 포함한다: SV40 프로모터, 네오마이신과 같은 항생제 내성 마커, 제 1 폴리 A 부위, 제 1 CMV프로모터/인핸서, LC 가변 도메인, 설치류 카파 인트론 (예컨대, 마우스} 인간 카파 엑손, 제 2 폴리 A 부위, 제 2 CMV 프로모터/인핸서, HC 가변 도메인, 및 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인. 그러한 메가 벡터의 특이적 예는 이하 실시예 1-3에서 기술되는 인간화된 항-TF IgG1 항체 발현 벡터이다. 도. 2를 또한 참조.
A. 인간화된 항-조직 인자 결합 항체의 제조
인간화된 항-조직 인자 결합 항체의 제조는 출원 계류 중인 미국 출원 번호 제 09/990,586호 및 제 60/343,306호에서 이미 기술된 바 있다. 이하 실시예 1-3를 또한 참조.
요약하면, 바람직한 항체는 인간 조직 인자에 결합하여 결합 복합체를 형성한다. 조직 인자는 천연적으로 발생한 것이거나 재조합 인간(rhTF)일 수 있다. 바람직하게는, 복합체에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합이 저해된다. 바람직한 발명 구체예에서, 인간화된 항체는 hTF에 대해 약 1 nM 미만, 바람직하게는 약 0.5 nM 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 nM 내지 약 0.4 nM의 뚜렷한 친화성 상수(KA, M-1)을 갖는다. 인간화된 항체에 대한 친화성 상수를 결정하는 것에 관한 보다 많은 정보에 대해서는 이하 실시예 1-3을 참조. "특이적 결합"은 인간화된 항체가 RIA, 웨스턴 블롯 또는 ELISA와 같은 표준 면역학적 기술에 의해 결정되는, 기타 다른 항원과는 결합없이 TF (또는 rhTF)와의 탐지가능한 결합 복합체를 형성하는 것을 의미한다.
본 발명에 따라 만들어진 보다 바람직한 인간화된 항-TF 결합 항체는 표면 플라스몬(surface plasmon) 분석 (특히, 하기 실시예 3의 과정에 따른 BIACore 분석) 에 의해 결정되는 천연 인간 TF에 대한 적어도 약 1x108 M-1 의 뚜렷한 친화성 상수 (KA, M-1), 보다 바람직하게는 표면 플라스몬 분석에 의해 결정되는 적어도 약 5 x 108 M-1 , 보다 더 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정되는 천연 인간 TF에 대한 적어도 약 3 x109 M-1의 뚜렷한 친화성 상수 (KA, M-1)를 나타낸다. 본 발명의 항체의 그러한 실질적인 결합 친화성은 이전에 보고된 항체의 훨씬 낮은 결합 친화성과 뚜렷하게 대조된다.
이러한 점에서, 상당히 낮은 유효 농도의 인간화된 조직 인자 결합 항체가 사용될 수 있다, 예컨대 상대적으로 낮은 농도의 항체를 이용하여 하기 실시예 2에서 기술된 것과 같은 인 비트로 분석에 있어서 원하는 바와 같이(예컨대 적어도 약 95, 98 또는 99 퍼센트 저해) TF 기능을 저해할 수 있다.
본 방법에 의해 인간화된 특정한 조직 인자 결합 항체, 즉 H36. D2. B7의 핵산 (서열번호 1 및 3) 및 아미노산 (서열번호 2 및 4) 서열. 도면 중 도 1A 및 1B 참조. 서열번호 1 및 2는 경쇄 가변 도메인의 산 및 아미노산 각각이고 , 서열번호 3 및 4는 중쇄 가변 도메인 핵산 및 아미노산 각각이며, 이들 서열은 전체 중 밑줄 친 고가변 영역 (CDRs 또는 상보성 결정 영역)을 갖는다.
본 발명의 추가적인 조직 인자 결합 인간화된 항체는 도 1 A 및 1B에서 보여주는 경쇄 또는 중쇄 서열의 하나 또는 모두에 실질적인 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 보다 특히, 그러한 항체는 서열번호 2 및/또는 4에 대해 적어도 약 70 퍼센트 상동성 (아미노산 서열 동일성), 보다 바람직하게는 서열번호 2 및/또는 4에 대해 약 80 퍼센트 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 서열번호 2 및/또는 4에 대해 약 85, 90 또는 95 퍼센트 이상의 상동성을 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 보다 특정한 조직 인자 결합 인간화된 항체는 고가변 영역(도 1A 및 도 1B 에서 이중 밑줄)에 대해 높은 아미노산 서열 상동성을 가질 것이다. 특이적 항체는 H36.D2.B7의 경쇄 가변 도메인의 상응하는 고가변 영역 중 하나, 둘 또는 셋과 동일하거나, 또는 이들에 대해 높은 서열 동일성 (적어도 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 도메인의 하나, 둘 또는 세 개의 고가변 영역을 가질 것이다(도 1A 에서 이중 밑줄 그어지고 하기와 같은 이들 고가변 영역 :
1) LASQTID (서열번호 : 5);
2) AATNLAD(서열번호 : 6); 및
3) QQVYSSPFT (서열번호: 7)).
또한 여기에서 기술된 방법에 의해 인간화되고 조직 인자에 결합하는 특이적 항체는 H36.D2.B7 의 중쇄 가변 도메인의 상응하는 고가변 영역 중 하나, 둘 또는 셋과 동일 하거나, 또는 이들에 대해 높은 서열 동일성 (적어도 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 도메인 중 하나, 둘 또는 세 개의 고가변영역을 가질 것이다 (도 1B 에서 이중 밑줄그어지고 하기와 같은 이들 고가변 영역:
1) TDYNVY (서열번호 : 8);
2) YIDPYNGITIYDQNFKG (서열 번호: 9); 및
3) DVTTALDF (서열번호: 10)).
본 발명의 특정한 핵산은 바람직하게는 하기 온건한 긴축 조건(moderately stringent conditions)(여기에서 "정상 긴축("normal stringency") 조건이라 함) 하에서 서열번호:1 및/또는 서열번호: 3의 서열에 결합하기에 충분한 길이(바람직하게는 적어도 약 100, 200 또는 250 염기쌍)인 것이다: 37℃의 온도에서 0.9 M 염수/0.12 M 소듐 시트레이트 (6xSSC) 완충액 중의 20% 포름아미드를 포함하는 혼성화 완충액의 사용 및 37℃에서 2xSSC 로 대상을 1회 세척했을 때 나머지가 결합됨.
보다 구체적으로, 본 발명의 특정한 핵산 (바람직하게는 적어도 약 100, 200 또는 250 염기쌍)은 하기 고긴축 조건(highly stringent conditions)(여기에서 "고긴축" 조건이라 함) 하에서 서열번호:1 및/또는 서열번호: 3의 서열에 결합할 것이다: 42℃의 온도에서 0.9 M 염수/0.12 M 소듐 시트레이트 (6xSSC) 완충액 중의 20% 포름아미드를 포함하는 혼성화 완충액의 사용 및 42℃에서 1xSSC 로 대상을 2회 세척했을 때 나머지가 결합됨.
본 발명의 핵산은 바람직하게는 적어도 20 염기쌍, 보다 바람직하게는 적어도 약 50 염기쌍을 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명의 핵산은 적어도 약 100, 200, 250 또는 300 염기쌍을 포함한다.
일반적으로 바람직한 본 발명의 핵산은 여기에서 기술된 바와 같이 바람직한 결합 친화성 및 기타 특성을 나타내는 본 발명의 항체를 발현할 것이다.
본 발명의 다른 핵산 또한 도 1A 및 1B에서 보여지는 경쇄 또는 중쇄 서열 중 하나 또는 둘다에 실질적인 서열 상동성을 가질 것이다. 보다 특히, 바람직한 핵산은 서열번호 1 및/또는 3에 대해 적어도 약 70 퍼센트 상동성 (뉴클레오티드 서열 상동성), 보다 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 3에 대해 약 80 퍼센트 또는 그 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 3에 대해 약 85, 90 또는 95 퍼센트 또는 그 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함할 것이다.
또한 본 발명의 특이적 핵산 서열은 서열번호 1 및 3의 고가변 영역 (도 1A 및 1B에 밑줄로 보여짐)에 대해 높은 서열 동일성을 가질 것이다. 그러한 핵산은 H36. D2. B7의 상응하는 고가변 영역 (도 1A에서 밑줄 그어진 하기와 같은 이들 고가변 영역:
1) CTGGCAAGTCAGACCATTGAT (서열번호: 11);
2) GCTGCCACCAACTTGGCAGAT (서열번호: 12); 및
3) CAACAAGTTTACAGTTCTCCATTCACGT(서열번호 : 13))
에 대해 코딩하는 서열 중 하나, 둘 또는 셋과 동일하거나 이에 대해 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 뉴클레오티드 서열 동일성)을 가지며 고가변 영역을 코딩하는 하나, 둘 또는 세 개의 서열을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 것을 포함한다.
보다 특이적 핵산은 또한 H36. D2. B7의 상응하는 고가변 영역 (도 1B 에서 밑줄 그어진 하기와 같은 이들 고가변 영역:
1) ACTGACTACAACGTGTAC (서열 번호: 14);
2)TATATTGATCCTTACAATGGTATTACTATCTACGACCAGAACTTCAAGGGC (서열번호 : 15); 및
3) GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC (서열번호: 16))
을 코딩하는 서열 중 하나, 둘 또는 셋과 동일하거나 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95%의 서열 동일성)을 갖는 고가변 영역을 코딩하는 하나, 둘 또는 세 개의 서열을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인을 코딩한다.
본 발명의 TF에 결합하는 보다 특이적인 인간화된 항체는 각각의 프레임워크 영역 (FRs) 1, 2, 3 및 4가 도 3A (서열번호 72-82)에서 보여지는 경쇄 FR 서열에, 바람직하게는, 도 3A 중의 "LC-09"로서 보여지는 서열에, 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상의 동일성을 갖는 것이다. 또한 특이적 인간화된 항체는 도 5A (서열번호: 97) 또는 도 6A (서열번호: 99)에서 보여지는 서열에 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
추가의 특이적 인간화된 항체는 프레임워크 영역 (FRs) 1,2, 3 및 4가 도 4A (서열번호 83-96)에서 보여지는 중쇄 서열, 바람직하게는, 도 4A 중 "HC-08"로서 보여지는 서열에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성을 갖는 것이다.
추가적인 인간화된 항체는 도 5B (서열번호: 98) 또는 도 6B (서열번호: 100)에서 보여지는 서열에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 불변 도메인을 갖는다.
특정 구체예에서, 인간화된 항체는 출원 계류 중인 미국 출원 번호. 제 09/990,586호 및 제 60/343,306호에서 개시된 IgG1(hOAT) 또는 IgG4(hFAT) 아이소타입을 가질 것이다.
여기에서 기술된 인간화된 항체의 기능적 단편이 본 발명에 의해 또한 제공된다. 그러한 단편의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 약 1nM 미만, 바람직하게는 약 0.5 nM 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 nM 내지 약 0.4nM의 친화성 상수 (Kd)를 가지며 TF에 결합하는 것들을 포함한다.
구체적으로 바람직한 것은 항원 결합 Fab, Fab', 및 F(ab)2 단편이다.
기술된 바와 같이, 본 발명은 적어도 하나의 뮤린 상보성 결정 영역 (CDR), 예컨대, CDR1, CDR2, CDR3를 포함하는 인간화된 항체를 특징으로 한다. 발명의 한 구체예에서, 항체는 특이적으로 인간 조직 인자 (TF)에 결합하여 복합체를 형성한다. 일반적으로, TF 또는 TF:FVIIa에의 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 거기로의 TF:FVIIa에 의한 활성화가 저해된다. 상기 언급한 대로, 바람직한 CDRs (경쇄 및 중쇄) 은 설치류 공급원, 일반적으로 마우스로부터의 것이다.
본 발명의 인간화된 항체의 한 구체예에서, 항체는 추가로 적어도 하나의 인간 프레임워크 영역 (FR) 서브세트를 포함한다. 바람직하게는, 모든 FRs (경쇄 및 중쇄)가 인간이다.
보다 특정한 구체예에서, 인간 TF에 결합하는 중쇄 고가변 영역의 제 1 CDR(CDR1)은 도 4B (서열번호: 104)에 보여지는 CDR1 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일, 바람직하게는 그 서열에 대해 적어도 약 95% 이상 상동성이다. 일반적으로, 중쇄 고가변 영역의 제 2 CDR (CDR2)는 도 4C (서열번호 9 및 101)에 보여지는 CDR2 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일하다. 바람직하게는 또한, 중쇄 고가변 영역의 제 3 CDR (CDR3)은 도 4D (서열번호: 10)에서 보여지는 CDR3 서열에 대해 적어도 90% 동일, 보다 바람직하게는 약 95% 이상 동일하다.
발명의 또다른 구체예에서, 인간 TF에 결합하는 경쇄 고가변 영역의 제1 CDR(CDR1)은 도 3B (서열번호: 103)에서 보여지는 CDR1 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일하다. 일반적으로, 경쇄 고가변 영역의 제 2 CDR (CDR2)은 도 3C (서열번호: 6)에 보여지는 CDR2 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일, 바람직하게는 약 95% 이상 동일하다. 바람직하게는, 경쇄 고가변 영역의 제 3 CDR (CDR3)은 도 3D (서열번호: 7)에 보여지는 CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일, 보다 바람직하게는 그 서열에 대해 약 95% 이상 동일하다.
본 발명의 추가적인 인간화된 항체는 FR1이 "FR1 HC-08"로서 도 4A (서열번호: 91)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 그 서열에 대해 약 95% 동일한, 인간 TF에 결합하는 중쇄 고가변 영역의 제 1 프레임워크 영역 (FR1)을 포함한다. 한 구체예에서, FR1은 적어도 하나의 하기 아미노산 변화를 포함한다: E1가 Q로; Q5가 V로; P9가 G로; L11이 V로; V12가 K로; Q19가 R로; 및 T24가 A로. 바람직하게는, FR1은 이들 변화 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯을 포함하여, 이들 아미노산 변화 모두를 갖는 것이 많은 적용에서 바람직하다.
인간 TF에 적합하게 결합하는 본 발명의 추가적인 인간화된 항체는 FR2가 "FR2HC-08"로서 도 4A (서열번호: 91)에서 보여지는 서열에 대해 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 그 서열에 대해 약 95% 동일한, 중쇄 고가변 영역의 제 2 프레임워크 영역 (FR2)를 포함한다. 한 구체예에서, FR2는 적어도 하나의 하기 아미노산 변화를 포함한다: H41이 P로; 및 S44기 G로. 바람직한 FR2는 이들 아미노산 변화 둘다를 포함한다.
본 발명은 또한 중쇄 고가변 영역의 제 3 프레임워크 영역 (FR3)이 "FR3 HC-08"로서 도 4A (서열번호: 91)에서 보여지는 서열에 대해 적어도 90% 동일, 바람직하게는 그 서열에 대해 약 95% 이상 동일한 인간 TF에 결합하는 인간화된 항체를 특징으로 한다. 한 구체예에서, FR3는 적어도 하나의 하기 아미노산 변화를 포함한다: S76이 T로; T77이 S로; F80이 Y로; H82가 E로; N84가 S로; T87이 R로; D89가 E로; 및 S91가 T로. 바람직한 FR3는 이들 아미노산 변화 중 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯을 포함하며, 일반적으로 이들 아미노산 변화 중 일곱 개 모두를 갖는 것이 바람직하다.
중쇄 고가변 영역의 제 4 프레임워크 영역 (FR4)이 "FR4 HC- 08"로서 도 4A (서열번호: 91)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일한 인간 TF에 적합하게 결합하는 인간화된 항체를 특징으로 한다. 바람직하게는, FR4는 하기 아미노산 변화를 포함한다:L113이 V로.
본 발명에 따른 인간 TF에 결합하는 추가적인 인간화된 항체는 경쇄 고가변 영역의 제 1 프레임워크 영역 (FR1)이 "FR1 LC-09"로서 도 3A (서열번호: 79)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일, 바람직하게는 그 서열에 대해 적어도 약 95% 이상의 동일한 것을 특징으로 한다.
한 구체예, FR1은 적어도 하나의 하기 아미노산 변화를 포함한다: Q11이 L로; L15가 V로; E17이 D로; 그리고 S18이 R로. 바람직한 FR1은 그러한 아미노산 변화 중 둘 또는 셋을 포함하며, 네 개 모두의 아미노산 변화를 갖는 것이 일반적으로 바람직하다.
본 발명은 또한 경쇄 고가변 영역의 제 2 프레임워크 영역 (FR2)가 "FR2LC-09"로서 도 3A (서열번호: 79)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한, 바람직하게는 그 서열에 대해 적어도 약 95% 이상 동일한 인간 TF에 결합하는 인간화된 항체를 특징으로 한다. 바람직한 FR2는 하기 아미노산 변화를 갖는다: Q37가 L로.
경쇄 고가변 영역의 제 3 프레임워크 영역 (FR3)이 "FR3 LC-09"로서 도 3A (서열번호: 79)에 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한, 바람직하게는 그 서열에 대해 적어도 약 95% 이상 동일한 인간 TF에 결합하는 인간화된 항체가 본 발명에 의해 또한 포함된다. 한 구체예에서, FR3는 적어도 하나의 하기 아미노산 변화를 포함한다: K70이 D로, K74가 T로, A80이 P로, V84가 A로, 및 N85가 T로. 바람직하게는, FR3는 그러한 아미노산 변화 중 둘, 셋, 또는 넷을 가지며, 다섯 개 모두의 변화를 갖는 것이 일반적으로 바람직하다.
TF에 결합하는 본 발명의 추가적인 인간화된 항체는 FR4가 "FR4 LC- 09"로서 도 3A (서열번호: 79)에 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한, 바람직하게는 그 서열에 대해 적어도 약 95% 이상 동일한, 경쇄 고가변 영역의 제 4 프레임워크 영역 (FR4)을 포함한다. 한 구체예에서, FR4는 하기 아미노산 변화 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다: A100가 Q로 ;그리고 L106가 I로.
본 발명은 또한 인간화된 항체의 인간 TF 결합 단편를 특징으로 한다. 그러한 단편의 예는 Fab, Fab', 및 F(ab)2를 포함한다.
본 발명에 따라 만들어진 추가적으로 바람직한 인간화된 항-TF 항체에 대한 USSN 09/990,586 및 60/343,306 특허 출원 참조. 거기에서 기술된 바와 같이, 하기 세 개의 핵산 벡터 pSUN36 (인간화된 항-TF 항체 IgG1-HC 발현 벡터), pSUN37 (인간화된 항-TF 항체 Ig G4-HC 발현 벡터), 및 pSUN38 (인간화된 항-TF 항체 LC 발현 벡터)는 부다페스트 조약에 따라 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209에 있는 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁되어 있다. 벡터는 하기 수탁번호를 받았다: PTA-3727(pSUN36) ; PTA-3728 (pSUN37) ;및 PTA-3729 (pSUN38).
본 발명의 인간화된 항-TF 항체 를 만들고 이용하기 위한 적합한 발현 및 정제 전략은 USSN 09/990,586 및 60/343,306 특허 출원에서 개시된 바 있다.
B. 인간화된 항-LTA 결합 항체의 제조
본래의 항-LT키메라 항체는 하기 특허 출원의 대상이다: U.S.S.N. 09/097,055 (WO 98/57994로 발간)로 계류 중인 "Opsonic and Protective Monoclonal and Chimeric Antibodies specific of Lipotechoic Acid of Gram Positive Bacteria".
인간화된 항-LTA (lipotechoic acid) 결합 항체의 제조 및 사용은 하기 실시예 4-5에서 기술한다. 바람직한 항체는 일반적으로 LTA에 결합하여 특이적 결합 복합체를 형성한다. 특정한 키메라 항-LTA 항체는 약 1μM 미만, 바람직하게는 약 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 약 20 nM 내지 약 2 nM의 뚜렷한 친화성 상수(KA, M-1)를 가지며 항원에 결합한다. 항-LTA 항체을 특징화하는 것에 대한 추가적 정보에 대해서는 실시예 5 참조.
리포테코산은 스타필로코쿠스 종, 일부 스트렙토코쿠스 종 및 엔테로코쿠스 종을 포함한 일부 그램-양성 박테리아에서 발견되는 세포 성분이다. 이는 분자량에서 이종분산(heterodisperse)인 혼합된 거대분자 중합체의 일부로서 세포벽 내로 도입될 수 있으며, 그러한 LTA 성분은 광범위하게 넓은 분자량 범위를 가질 수 있는 세포벽 및 그의 단편 중에서 찾을 수 있다.
보다 바람직한 것은 LTA에 대해 표면 플라스몬 분석 (특히, 하기 실시예 3의 과정에 따른 BIACore 분석)에 의해 결정되는 적어도 약 5x 106 M-1 , 보다 바람직하게는 표면 플라스몬 분석에 의해 결정되는 적어도 약 1 X 107 M-1 의 연합 상수 (KA, M-1) 인, 보다 더 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정되는 LTA에 대해 적어도 약 1 x 108 M-1 의 Ka인 인간화된 항-LTA 결합 항체이다.
한 구체예에서, LTA 항원에 결합하는 경쇄 고가변 영역의 제 1 CDR (CDR1)은 도 7A (밑줄)에서 보여지는 CDR1 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일하다. 일반적으로, 동일한 경쇄 고가변 영역의 제 2 CDR (CDR2)는 도 7A (밑줄)에서 보여지는 CDR2 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일하다. 바람직하게는 또한, 경쇄 고가변 영역의 제 3 CDR (CDR3)은 도 7A (밑줄)에서 보여지는 CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 이상의 서열 동일성이다.
중쇄 고가변 영역과 관련하여, 또한 바람직한 항- LTA 항체는 도 7B (밑줄)에서 보여지는 CDR1 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상의 동일성을 나타낼 것이다.
일반적으로, 동일한 경쇄 고가변 영역의 제 2 CDR (CDR2)은 도 7B (밑줄)에서 보여지는 CDR2 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일하다. 바람직하게는 또한, 경쇄 고가변 영역의 제 3 CDR (CDR3)은 도 7B (밑줄)에서 보여지는 CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일하다.
또한 본 발명의 특이적 항-LTA 항체는 각각의 경쇄 프레임워크 영역 서브세트 (FRs) 1, 2, 3 및 4가 실시예 5의 표 6에서 보여지는 각각의 경쇄FR 서열에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 이상 내지 100% 동일성을 갖는 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 프레임워크는 하기 아미노산 변화 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다: D1가 Q로; S5가 T로; L11가 M으로; E17이 D로; M21이 1로 ; S41이 Q로; R76이 A로; V77이 M으로 ;그리고 M102가 K로. 특히 바람직한 항-LTA 항체는 실시예 5의 표 6에서 A110-LC에 대해 보여지는 L 쇄 FR 서브세트의 각각 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두, 즉, LC-FR1 (서열번호: 109의 잔기 1 내지 23); LC-FR2 (서열번호: 109의 잔기 24 내지 38 ); LC-FR3 (서열번호: 109의 잔기 39 내지 70) 및 LC-FR4 (서열번호: 109의 잔기 71 내지 80)를 갖는다.
LTA 항원에 특이적으로 결합하는 추가의 특이적 인간화된 항체는 각각의 프레임워크 영역 (FRs) 1, 2, 3 및 4가 실시예 5의 표 7에서 보여지는 중쇄 서열에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 약 95%, 98% 이상 내지 약 100% 동일을 갖는 것들을 포함한다. 한 구체예, 프레임워크는 하기 아미노산 변화 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다: M3가 Q로 ; K15가 G로 ; Q78가 K로; S79가 N으로; M80이 S로; N87이 S로; M95가 V로, V99가 A로 그리고 L1 19가 V로. 특히 바람직한 항-LTA 항체는 실시예 5의 표 7에서의 A110-HC에 대해 보여지는 H 쇄 FR 서브세트의 각각 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두, 즉, HC-FR1 (서열번호: 118의 잔기 1 내지 25); HC-FR2 (서열번호: 118의 잔기 26 내지 39 ); HC-FR3 (서열번호: 118의 잔기 40 내재 71); 및 HC-FR4 (서열번호: 118의잔기 72 내지 82)를 갖는다.
특정 구체예에서, 인간화된 항-LTA 항체는 IgG1 중쇄 불변 도메인 (hOAT과 유사) 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인 (hFAT과 유사) 아이소타입을 가질 것이다. 계류 중인 USSN 09/990,586 및 60/343,306 특허 출원 참조.
또한 바람직한 항-LTA 항체는 실시예 5의 표 6 및 7에서 보여지는 경쇄 및 중쇄 FRs의 각각을 가질 것이다.
추가의 바람직한 인간화된 항-LTR 항체는 도 9A에서 보여지는 아미노산 서열 (서열번호: 109)에 대해 적어도 95%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 98% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 경쇄 가변 도메인을 가질 것이다.
보다 바람직하게는, 그러한 항체는 도 9A (서열번호: 109)에서 보여지는 서열과 동일한 경쇄 고가변 영역을 가질 것이다. 또한 바람직한 항체는 도 9E (서열번호: 118)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 98% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 중쇄 가변 도메인을 가질 것이다. 보다 바람직하게는, 그러한 항체는 도 9E (서열번호:118)에서 보여지는 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인을 가질 것이다.
본 발명의 특정한 실시예에서는, LTA에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나의 설치류 CDR, 대개 마우스로부터의 CDR를 포함하는 인간화된 항-LTA 항체가 제공된다. 바람직하게는, LTA 항원은 항체에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성한다. 또한 바람직하게는, 그러한 인간화된 항-LTA 항체는 중쇄 상에서 하기 성분 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다:
a) 도 9F (서열번호: 124)에서 보여지는 CDR1 아미노산에 대해 적어도 95% 동일한 제 1 CDR(CDR1),
b) 도 9G (서열번호: 125)에서 보여지는 CDR2 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 2 CDR (CDR2),
c) 도 9H (서열번호: 126)에서 보여지는 CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 3 CDR (CDR3),
d) "LC-FR1"로서 표 6A에 보여지는 아미노산 서열(서열번호: 109의 잔기 1 내지 23)에 대해 적어도 95% 동일한 제 1 프레임워크 서브세트(FR1) ,
e) "LC-FR2"로서 표 6A (서열번호: 109의 잔기 24 내지 38)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 2 프레임워크 서브세트 (FR2),
f) "LC-FR3"로서 표 6B (서열번호: 109의 잔기 39 내지 70)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 3 프레임워크 서브세트 (FR3), 및
g) "LC-FR4"로서 표 6B (서열번호: 109의 잔기 71 내지 80)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 4 프레임워크 서브세트.
특정한 구체예에서, 인간화된 항-LTA 항체는 또한 경쇄 상에 하기 성분 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다:
h) 도 9B (서열번호: 115)에 보여지는 CDR1 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 1 CDR(CDR1),
i) 도 9C (서열번호: 116)에 보여지는 CDR2 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 2 CDR (CDR2),
j) 도 9D (서열번호: 117)에 보여지는 CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 3 CDR (CDR3),
k) "HC-FR1"로서 표 7A (서열번호: 118의 잔기 1 내지 25)에 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 1 프레임워크 서브세트(FR1),
l) "HC-FR2"로서 표 7A (서열번호: 118의 잔기 26 내지 39)에서 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 2 프레임워크 서브세트 (FR2),
m) "HC-FR3"로서 표 7B (서열번호: 118의 잔기 40 내지 71)에 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 3 프레임워크 서브세트 (FR3), 및
n) "HC-FR4"로서 표 7B (서열번호: 118의 잔기 72 내지 82)에 보여지는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 제 4 프레임워크 서브세트 (FR4).
바람직하게는, 인간화된 항체는 도 6A(hFAT (IgG4) 서열번호: 99)의 경쇄 불변 서열을 추가로 포함한다. 또한 바람직하게는, 항체는 도 6B (IgG4 서열번호: 100)의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
발명은 도 9A (서열번호 109-114) 및 9E (서열번호 118- 123), 각각에서 보여지는 아미노산 항-LTA 경쇄 가변 도메인 및 항-LTA 중쇄 가변 도메인 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 보다 특이적 핵산은 바람직한 결합 친화성 및 여기에서 기술된 기타 특성을 나타내는 항-LTA 결합 항체의 적어도 일부분을 발현한다. 그러한 핵산의 분자량은 일반적으로 통상적인 겔 전기영동 방법에 의해 결정되는, 약 1000염기쌍 (bp) 미만, 바람직하게는 약 200bp 내지 약 750bp일 것이다.
본 발명에 따른 구체적으로 바람직한 핵산은 도 8 (pJRS 391)에 의해 표현되는 플라스미드이다.
여기에서 기술된 인간화된 항-LTA 항체의 기능적 단편이 또한 제공된다. 그러한 단편의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 약 100 nM 미만, 바람직하게는 약 25 nM 미만, 보다 바람직하게는 약 1 nM 내지 약 5 nM의 뚜렷한 친화성 상수(KA, M-1)를 갖는 LTA에 결합하는 것들이다. 구체적으로 바람직한 것은 항원 결합 Fab, Fab', 및 F(ab)2 단편, 단일 쇄 Fv 및 전장 항체이다.
일반적으로, 본 발명의 핵산은 분리되어 대개 주어진 분획 중에 존재하는 총 핵산의 적어도 약 0.5%, 바람직하게는 적어도 약 2%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 5% 중량을 구성한다. 부분적으로 순수한 핵산은 주어진 분획 중에 존재하는 총 핵산의 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 60% 중량을 구성한다. 순수한 핵산은 주어진 분획 중의 총 핵산의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 중량을 구성한다.
하기 비-제한적 실시예는 본 발명의 예시적인 것이다. 하기 실시예 및 어디에서든 본 방명의 방법은 뮤린 항-조직 인자 항체 H36 및 항-리포테코산 항체 A110의 인간화에 대한 적용된다. H36는 또한 H36.D2 및 H36.D2.B7로서 언급되나, H36은 모 클론에 의해 생산된 항체이고, H36.D2는 1차 클론으로부터 얻은 항체인 반면, H36.D2.B7는 2차 클론으로부터 얻은 것이다. TF를 저해하는 항체의 능력 또는 다른 물리적 특성과 관련한 세 개의 클론에 의해 생산된 항체 간의 차이는 관찰되지 않았다. 일반적 용법에서, H36는 이들 클론 중 임의의 것에 의해 생산된 항-TF 항체 또는 그 항체를 생산하는 관련 세포주를 나타내기 위해 종종 사용된다. H36의 마우스-인간 키메라 버전은 cH36 (및 또는 Sunol-cH36)로서 언급된다. 항-리포테코산 항체 A110은 또한 96-110, c96-110 및 BSYX-A110로서 언급되며, 마우스-인간 키메라 항체이다.
H36 항체를 만들고 이용하는 것에 관련된 추가의 개시에 대한 USSN 09/990,586 및 60/343,306 특허 출원 참조. 미국 특허 5,986,065를 또한 참조.
여기에서 언급된 모든 문헌은 그들 전체로서 참조로서 완전히 포함된다.
실시예 1- 항-조직 인자 항체의 인간화
H36. D2(때때로 상기 기술된 바와 같이 H36로 불림)라 불리는 특정한 뮤린 항체를 어떻게 만들고 이용하는가에 대한 서술이 미국 특허 5,986,065에 기술되어 있다. 본 실시예는 그 항체의 인간화된 버전을 어떻게 만들고 이용하는지 보여준다. 인간화된 H36 항체는 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 면역 반응에 대한 잠재성을 최소화하는 것을 돕는 것을 포함한 다양한 용도를 갖는다.
이들 및 기타 원치않는 반응은 인간 치료학적 적용에 있어서의 H36 항체에 대한 사용에 대해 문제점을 보인다.
A. 키메라 항-조직 인자 항체 (cH36의 제조)
이전에 기술된 H36 항체는 Ig G2a 뮤린 항체. H36를 임상적 개발을 위해 마우스-인간 키메라 항체로 먼저 전환시켰다. 이를 위해 H36에 대한 경쇄 및 중쇄 유전자를 클로닝했다(US 특허 번호. 5,986,065). 중쇄 가변 도메인를 인간 IgG4 불변 (Fc) 도메인에 융합시키고, 경쇄 가변 도메인을 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 융합시켰다. 생성된 IgG4κ 키메라 항체를 cH36 (또한 Sunol-cH36로 언급)로 지칭했다. 만성 질환을 갖는 환자에서의 H36 또는 cH36의 다중 사용을 위해, 완전히 인간화된 cH36는 임의의 인간 항-키메라 항체 (HACA) 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. cH36의 인간화는 하기 기술된다.
B. cH36 항체에 대한 인간화 전략
키메라 항-조직 인자 항체 cH36의 인간화는 본 발명의 "FR 최적-적합" 방법을 이용하여 달성된다. 이 방법은 공지된 아미노산 서열을 갖는 많은 수의 인간 IgGs 또는 인간 IgG 단편의 서열을 공중 데이터베이스에서 이용가능하는 사실의 완전한 이점을 갖는다. cH36에서의 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 개별적인 프레임워크 영역의 서열을 Kabat 데이터베이스에서 서열 각각의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 또는 인간 프레임워크 (또는 그의 단편)와 비교하였다(http://immun. bme. nwu. edu 참조). 하기 기준을 이용하여 인간화에 대해 원하는 인간 IgG 프레임워크 영역 서브세트를 선택했다: (1) 미스매치된 아미노산의 수가 가능한한 낮게 유지되었다. (2) "버니어" 구역 내의 아미노산(이 구역 내의 아미노산은 CDR 구조를 조절하고, 항원에 맞도록 정밀하게-조정할 수 있다, Foote, J. 및 Winter, G. , J. of Mol. Bio. 224 (2): 487-499 [1992] 참조)이 바뀌지 않은채 남아있다. (3) 보존적 아미노산 치환은 유사한 후보들을 평가할 때 이로움을 얻었다. 이 비교를 위해 사용된 매칭 프로그램은 Kabat 데이터베이스에서 찾을 수 있다. Johnson G, Wu T. "Kabat database and its application: Future directions." Nucleic acid Res. (2001) 29: 205-206 참조. 프로그램은 Kabat의 데이터베이스 중의 마우스 서열 및 인간 서열 간의 상동성의 영역을 찾고 배열한다. 이 독특한 FR 최적-적합 방법을 이용하여, 표적 IgG의 인간화된 LC 또는 HC 가변 도메인이 하나의 인간 IgG 분자만큼 작은 것부터 네 개의 상이한 인간 IgG 분자만큼 많은 것 까지로부터 유래된 네 개의 FRs 모두를 가질 수 있음이 예상된다.
B(i). 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역의 선택
cH36 LC의 각각의 프레임워크 영역 내의 아미노산 서열을 Kabat 데이터베이스 중의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인 내의 FRs내의 아미노산 서열과 비교했다. 최적-적합 FR을 상기 기술된 세 가지 기준에 기초하여 선택했다. Kabat 데이타베이스 제 005191호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 cH36 LC FR1의 인간화를 위해 선택했다. Kabat 데이타베이스 제 019308호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 cH36 LC FR2의 인간화를 위해 선택했다. Kabat 데이타베이스 제005191호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 매치시키기 위해 하기 돌연변이를 cH36 LC FR1 중에서 만들었다: Q11 → L, L15 → V, E17 → D, S18 → R. cH36 LC FR2이 Kabat 데이타베이스 제 019308호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 매치되도록 하나의 돌연변이 Q37 → L를 만들었다(서열 정보에 대한 표 1A 참조).
Kabat 데이타베이스 제 038233호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 cH36 LC FR3의 인간화를 위해 선택했다. Kabat 데이타베이스 제 004733호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 cH36 LC FR4의 인간화를 위해 선택했다. Kabat 데이타베이스 제 038233호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 매치시키기 위해 cH36 LC FR3 중에서 하기 돌연변이를 만들었다 :K70 → D, K74 → T, A80 → P, V84 → A, N85 → T. cH36 LC FR4가 Kabat 데이타베이스 제 004733호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 매치되도록 두 개의 돌연변이 A100 → Q 및 L106 → I를 만들었다 (서열 정보에 대한 표 1B 참조).
B(ii). 인간 IgG 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역의 선택
cH36 HC의 각각의 프레임워크 영역 중의 아미노산 서열을 Kabat 데이타베이스 내의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인에서의 FRs 내의 아미노산 서열과 비교했다. 최적-적합 FR은 상기 기술된 세 개의 기준에 기초하여 선택되었다. Kabat 데이터베이스 제 000042호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 cH36 HC FR1의 인간화를 위해 선택되었다. Kabat 데이타베이스 제 023960호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 cH36 HC FR2의 인간화를 위해 선택되었다. Kabat 데이타베이스 제 000042 호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산을 매치시키기 위해 cH36 HC FR1 중에서 하기 돌연변이를 만들었다: E1 → Q, Q5 → V, P9 → G, L11 → V, V12 → K, Q19 → R, T24 → A. cH36 HC FR2가 Kabat 데이타베이스 제 023960호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 매치되도록 두 개의 돌연변이 H41 → P 및 S44 → G를 만들었다(서열 정보에 대한 표 2A 참조).
Kabat 데이타베이스 제 037010호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 cH36 HC FR3의 인간화를 위해 선택했다. Kabat 데이타베이스 제 000049호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 cH36 HC FR4의 인간화를 위해 선택했다. Kabat 데이타베이스 제 037010호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 매치하도록 cH36 HC FR3 중에서 하기 돌연변이를 만들었다: S76 → T, T77 → S, F80 → Y, H82 → E, N84 → S, T87 → R, D89 → E, S91 → T. Kabat 데이타베이스 제 000049호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 매치하도록 하나의 돌연변이 L113 → V를 만들었다 (서열 정보에 대한 표 2B 참조).
표 1. cH36 (서열번호: 72) 및 인간 경쇄 (LC) (서열번호: 79) FR 서열의 비교
표 2. cH36 (서열번호: 83) 및 인간 중쇄 (HC) (서열번호: 91) FR 서열의 비교
원하는 인간 프레임워크 영역 상에서의 결정이 이루어질 때, 하기 세 가지 기술을 이용하여 경쇄 및 중쇄 모두에서의 원하는 아미노산 치환을 수행하였다: (1) 보통의 PCR을 클로닝을 위해 이용하여 클로닝 또는 진단적 제한 엔도뉴클레아제 부위를 도입하고, 가변 도메인의 말단에 위치한 아미노산 잔기를 변화시켰다. (2) PCR-기초 돌연변이를 이용하여, 특히 이들 잔기가 가변 도메인의 중앙에 있을 때, 한번에 다수의 아미노산 잔기를 변경시켰다. (3) 위치-유도 돌연변이를 이용하여 한번에 하나 또는 둘 아미노산 치환을 도입했다. 위치-유도 돌연변이는 Stratagene의 "Quick Change Site-Directed Mutagenensis Kit" (카탈로그 #;200518)에서 기술된 프로토콜을 따라 수행되었다.
각 단계 후, 부분적으로 인간화된 클론을 서열화하고, 이들 가변 도메인 중 일부를 이후 발현 벡터 내로 클로닝했다. IgG1 또는 IgG4, 각각으로서 플라스미드 tKMC180를 이용하여 LC 돌연변이주를 발현시키고, pJRS 355 또는 pLAM 356 벡터를 이용하여 HC 돌연변이주를 발현시켰다. 이후 이들 클론의 일부를 결합시키고, COS 세포 내에서 일시적으로 발현시켜 ELISA에 의해 발현 수준을 측정했다.
최종의 완전히 인간화된 형태의 항-TF 중쇄 및 경쇄 가변 도메인를 여기에서 때때로 "메가 벡터"라고 언급되는 것 내로 클로닝하고, IgG 발현을 위해 CHO 및 NSO 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 그 후, 안정한 세포주를 이용하여 분석을 위해 충분한 양의 인간화된 항-TF를 생산했다. 생성된 인간화된 버전은 100% 인간 기원 이다(CDR 서열을 고려하지 않을 때). 인간화된 IgG4 카파 버전을 hFAT (인간화된IgG Four 항-조직 인자 항체)로 지칭하고, IgG1 카파 버전을 hOAT (인간화된 IgG One 항-조직 인자 항체)로 지칭한다. cH36의 이들 완전히 인간화된 버전은 혈전증, 암 및 염증질환과 같은 만성적 징후를 치료하기 위한 것으로 의도된다.
C. 인간화된 항-TF 항체 중쇄의 생성
1. 주형으로서 플라스미드 pJAIgG4TF. A8 (키메라 H36에 대한 발현 벡터)및 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2를 이용하여 PCR 증폭 및 항-TF mAb cH36 중쇄 (HC) 가변 도메인의 pGem T-easy 내로의 클로닝을 수행하였다. 프라이머 TFHCls2는 개시 코돈의 상류 BsiW1 부위를 도입하고, 또한 프레임워크(FR) 1 내에 E1에서 Q로의 아미노산 변화를 도입했다. 프라이머 TFHClas는 FR 4내에서 L113에서 V로의 아미노산 변화를 도입했다. 이 단계는 작제물HC01를 생성시켰다.
2. 상기 작제물(HC01) 및 하기 네 개의 프라이머을 이용한 PCR-기초 돌연변이가 작제물 HC02를 생성시켰다. 상류 PCR은 프라이머 TFHCls2 및 TFHC7as를 사용했다. 하류 PCR은 프라이머 TFHC7s 및 TFHClas2를 사용했다. 주형으로서 상류 및 하류 PCR 산물 및 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2를 이용한 PCR은 HC02을 수득했다. 프라이머 TFHC7s 및 TFHC7as는 FR2 중에 두 개의 아미노산 변화를 도입했다: H41 에서 P로 및 S44 에서 G로.
3. 주형으로서 HC02 및 하기 네 개의 프라이머를 이용한 PCR-기초 돌연변이가 작제물 HC03를 생성했다. 상류 PCR은 프라이머 TFHCls2 및 TFHCSas2를 이용했다. 하류 PCR은 프라이머TFHC5s 및 TFHClas2를 이용했다. 주형으로서 상류 및 하류 PCR을 이용한 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2로의 PCR은 HC03을 수득했다. 프라이머TFHC5s 및 TFHC5as2의 사용은 FR3 중에 세 개의 아미노산 변화를 도입했다: T87가 R로, D89가 E로, 및 S91가 T로. ABglII 부위 또한 위치 87에 도입되었다.
4. PCR 증폭은 프라이머 TFHC2s 및 TFHC3as 및 주형으로서 pGem 내의 HC03를 이용하여 수행되었다. TFHC2s는 pGem 내의 클로닝 부위의 상류에 위치한다. TFHC3as는 프레임워크 3 내에 위치하고, FR3 내에서의 두 개의 아미노산 변화를 도입한다: H82가 E로 및 N84가 S로. 생성된 PCR 띠를 pGem로 클로닝한 후, 적당한 크기의 삽입물을 BsiWl 및 Bgl II로 소화시켰다. 이들 단편의 HC03로의 클로닝은 HC04를 수득한다.
5. 주형으로서 HC04 및 하기 프라이머를 이용한 PCR-기초 돌연변이는 HC05를 생성했다. 상류 PCR은 프라이머 TFHCls2 및 TFHC6as를 이용했다. 하류 PCR은 프라이머 TFHC6s 및 TFHClas2를 이용했다. 상류 및 하류 PCR 산물을 주형으로서 이용한 프라이머 TFHC1s2 및 TFHClas2로의 돌연변이 PCR은 HC05를 수득했다. 이 단계는 FR3 내에 하기 아미노산 변화를 도입했다: S76가 T로, T77이 S로, 그리고 F80이 Y로.
6. 주형으로서 HC05 및 하기 네 개의 프라이머를 이용한 PCR-기초 돌연변이가 HC06를 생성했다. 상류 PCR은 프라이머 TFHC2s 및 TFHC2as2를 이용했다. 하류 PCR은 프라이머 TFHC3s2 및 TFHClas2를 이용했다. TFHC2as2을 이용한 증폭은 FR1 내에 아미노산 변화를 도입했다 : P9가 G로. 프라이머 TFHC3s2는 Q19을 R로 그리고 T24를 A로 변화시킨다. 상류 및 하류 PCR 산물을 주형으로서 이용한 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2로의 PCR은 HC06를 수득한다.
7. FR1의 위치 2에서의 I에서 M으로의 점 돌연변이가 HC06의 작제 동안 자발적으로 도입되었다. 주형으로서 HC06 및 프라이머로서 TFHCls3 및 TFHClas2를 이용한 PCR은 이 잘못된 치환을 고쳤으며 또한 FR1에서의 아미노산 변화를 도입했다 : Q5이 V로. 생성된 작제물은 HC07이었다.
8. 작제물 HC08이 주형으로서 HC07 및 하기 프라이머를 이용한 PCR-기초 돌연변이에 의해 만들어졌다. TFHC2s 및 TFHC2as3가 상류 산물에 대해 이용되었다. 하류 산물은 TFHCls3 및 TFHClas2를 이용하여 이전에 증폭되었다 (단계 7 참조). 프라이머 TFHC2as3의 이용은 FR1 내의 두 개의 아미노산 변화를 도입했다 :L11가 V로 그리고 V12가 K로. 자발적인 돌연변이는 CDR2 내의 위치 64에서 페닐알라닌을 류신으로의 변화(F→L)를 만들었다. 추가적 스크리닝 및 시퀀싱은 작제물 HC08R1을 수득하게 하였으며, 이는 CDR2 내의 위치 64에서 F의 올바른 서열을 갖는다.
9. 두 개의 작제물, HC11 및 HC12는, HC07로부터의 위치-유도 돌연변이에 의해 생성되었다. 두 개의 상보적 프라이머 TFHC8sP 및 TFHC8asP를 주형으로서 HC07과 함께 이용하여 FR1 내에 세 개의 아미노산 변화를 갖는 HC11를 만들어냈다: G9가 P로, L11이 V로, 그리고 V12가 K로. 그 후, HC11을 메틸화시키고 다음 단계의 위치 유도 돌연변이를 위해 컬럼 정제했다. 주형으로서 HC11 및 상보적 프라이머 TFHC9sL 및 TFHCOasL를 이용한 PCR은 FR1 내에서 Vll에서 L로의 돌연변이를 갖는 HC12를 만들어냈다.
10. 주형으로서 HC12 및 상보적 프라이머 TFHCIOsK 및 TFHClOasK를 이용한 PCR 수행에 의해 HC12로부터 작제물 HC09를 유도했다 . HC09은 아미노산 변화를 포함한다: FR1 내에서 K12가 V로.
11. 작제물 HC10를 HC09로부터 만들었다. 주형으로서 HC09 및 상보적 프라이머 LV-1 및 LV-2를 이용한 PCR은 FR1 내에서 L11에서 V로의 돌연변이른 포함하는 HC10를 생성시켰다.
각 돌연변이 단계 후, 부분적으로 인간화된 또는 완전히 인간화된 클론들은 서열화되었고, 이후 이들 가변 도메인 중 일부가 발현 벡터 내로 클로닝되었다. pJRS 355 또는 pLAM 356 벡터를 이용하여 인간 IgG I 또는 IgG4의 Fc에 용합된 HC 돌연변이주를 발현시켰다.
도 3A-D는 단계 1-11을 요약하고, FR1-4 내로 도입된 증가적인 아미노산 변화를 보여준다. HC08을 제외한, 모든 다른 중쇄 돌연변이주 및 cH36은 CDR2 내의 위치 64에서 F를 포함한다. HC08은 위치 64에서 F에서 L로의 돌연변이를 갖는다. 도 4B-D는 중쇄 CDR 서열을 보여준다.
중쇄 인간화에 이용된 프라이머
D. 인간화된 항-TF 항체 경쇄의 생성
1. PCR 증폭은 주형으로서 플라스미드 pJAIgG4TF.A8 (키메라 H36에 대한 발현 벡터) 및 프라이머 TFLCls2. 1 및 TFLClas2 를 이용하여 수행되었다. 이 단계는 코딩 영역의 상류에 클로닝 부위, AgeI를 도입했다. 또한 FR4 내에 L106I 돌연변이를 도입했다. 이 단계는 작제물 LC03를 수득했다.
2. 위치-유도 돌연변이가 상보적 프라이머 TFLC5s 및 TFLC5as 및 주형으로서 LC03를 이용하여 수행되었다. 이 단계는 FR2 내에 돌연변이 Q37L를 도입하였으며 진단 목적을 위한 PstI 부위를 가했다. 이 새로운 작제물은 LC04로 명명되었다.
3. 주형으로서 LC04 및 프라이머 TFHC2s 및 TFLC2asl를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 이 단계는 단계 6에서 사용될 단편 A를 생성했다. 이 단계는 FR1 내에 Q11L 및 L15V 돌연변이를 도입했다.
4. 주형으로서 LC04 및 프라이머 TFLCls2. 1 및 TFLClasR를 이용하여 PCR 증폭이 수행되었다. 이는 LC 가변 도메인의 말단에 KpnI 부위를 도입했다. pGEM로의 이 PCR 단편의 클로닝은 단계 6에서 사용될 pGEM04K를 수득했다.
5. 주형으로서 LC04 및 프라이머 TFLC2s 및 TFLC4as를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 이 단계는 단계 6에서 사용될 단편 C를 생성했다. FR1 내에서 E17D, S18R 및 FR4 내에서의 A100Q 세 개의 돌연변이가 이 단계에서 도입되었다.
6. 주형으로서 단편 A 및 단편 및 프라이머 TFHC2s 및 TFLC4as를 이용한 PCR-기초 돌연변이가 단편 D를 만들었다. pGEM04K로의 단편 D의 클로닝은 작제물 LC05를 수득했다.
7. 주형으로서 pGEM04K 및 프라이머 TFLCls2.1 및 TFLC4as를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 이 단계는 이후 pGEM04K 내로 클로닝되는 단편 H를 생성시켰다. 이는 FR4 내에 A100Q 돌연변이를 도입하였으며, 작제물은 LC06로 명명되었다.
8. 주형으로서 LC06 및 프라이머 TFLCls2.1 및 TFLC3as를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 이 단계는 단계 10에서 사용될 단편 I를 생성시켰다. 이는 FR3 내에 K70D 및 K74T 돌연변이를 도입했다.
9. 주형으로서 LC06 및 프라이머 TFLC3s2 및 TFLC4as를 이용하여 PCR 증폭를 수행하였다. 이는 FR3 내에 A80P 돌연변이를 도입했다.
10. 주형으로서 단편 I 및 단편 F 및 프라이머 TFLCls2.1 및 TFLC4as를 이용한 PCR은 단편 J를 수득했다. pGEM로의 단편 J의 클로닝은 작제물 LC07를 수득했다.
11. 상보적 프라이머 TFLC08sds 및 TFLC08sdsa 및 주형으로서 LC07를 이용하여 위치-유도 돌연변이가 수행되었다. 이 작제물을 LC08로 명명되었다.
12. 돌연변이 Q11L, L15V, E17D, S18R 및 Q37L를 함유하는 LC05로부터의 Eco01091 단편으로의 AgeI가 LC08 내로 클로닝되었다. 이는 작제물 LC09를 수득했다.
13. 주형으로서 LC09 및 상보적 프라이머 LC105 및 LC103를 이용하여 위치-유도 돌연변이를 수행했다. 이 단계는 FR3 내에 T85N 돌연변이를 도입하였고, 작제물 LC10를 수득했다.
14. 주형으로서 LC10 및 상보적 프라이머 LC 115 및 LC 113를 이용하여 위치-유도 돌연변이가 수행되었다. 이 단계는 FR3 내에 D70K 돌연변이를 도입했다. 이는 작제물 LC11를 수득했다.
15. 주형으로서 LCI1 및 상보적 프라이머 LC125a 및 LC123a를 이용하여 위치-유도 돌연변이를 수행했다. 이 단계는 FR2 내에 K42Q 돌연변이를 도입했다. 이는 작제물 LC12를 수득했다.
각 돌연변이 단계 후, 부분적으로 인간화된 또는 완전히 인간화된 LC 클론들이 시퀀싱되었고, 이들 가변 도메인 중 일부는 이후 발현 벡터 tKMC180 내로 클로닝되었다.
경쇄 인간화에 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머
도 5A는 인간 카파 경쇄 불변 도메인의 서열(서열번호: 97)을 보여준다. 도 5B는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인의 서열(서열번호: 98)을 보여준다. 도 6A는 hFAT (IgG4) 불변 도메인 서열(서열번호: 99)을 보여준다. 도 6B는 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인(서열번호: 100)을 제공한다. 상기 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 관련되는 추가적인 개시에 대해서는 USSN 제 09/990,586호 및 제 60/343,306호를 또한 참조.
실시예 2 - 인간화된 항-TF 항체의 발현 및 정제
부분적으로 인간화된 또는 완전히 인간화된 LC 및 HC 클론을 발현 벡터 내로 클로닝했다. 플라스미드 tKMC18를 이용하여 인간 카파 쇄에 융합된 LC 돌연변이주를 발현시키고, pJRS 355 또는 pLAM 356 벡터를 이용하여 인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc에 융합된 HC 돌연변이주를 발현시켰다. 그 후 HC 및 LC 클론의 일부 배합을 COS 세포 내로 같이 트랜스펙션시켰다. COS 세포 내에서 일시적으로 발현된 IgGs를 전체 IgG 생산 및 TF에의 결합에 대해 ELISA에 의해 분석했다. 이들 특정한 벡터에 관련되는 개시에 대해서는 계류 중인 미국 출원 번호. 제 09/990,586호 및 제 60/343,306호 참조.
최종 완전히 인간화된 형태의 항-TF 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (HC08 및 LC09의 배합)을 메가 발현 벡터 (pSUN34, 도 2 참조)로 언급되는 것 내로 클로닝시키고, IgG 발현을 위해 CHO 및 NSO 세포 내로 트랜스펙션시켰다. IgG4κ 또는 IgG1κ 인간화된 항-TF 항체를 생산하는 안정하게 트랜스펙션된 세포주가 클로닝되었다. 이 후 선택된 안정한 세포주를 이용하여 분석에 충분한 양의 인간화된 항-TF를 생산했다. 생성된 인간화된 버전은 대략 100% 인간 기원이다 (CDR 서열을 고려하지 않을 때). 인간화된 IgG4 카파 버전 (pSUN35에 의해 생산된)을 hFAT (인간화된 IgG 네 개의 항-조직 인자 항체)로 지칭하고, IgGI 카파 버전 (pSUN34에 의해 생산된)을 hOAT (인간화된 IgG 하나의 항-조직 인자 항체)로 지칭했다. cH36의 이들 완전히 인간화된 버전은 암 및 염증질환과 같은 만성적인 징후를 치료하기 위한 것으로 의도된다.
hOAT (HC08 및 LC09의 배합)를 발현하는 NSO 세포주 (OAT-NSO-P10A7) 중의 하나를 녹이고, 15 mL 튜브 내에서 10% FBS로 보충된 10 mL의 IMDM 배지 중에서 확장시키고 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 10 mL의 신선한 배지 중에 재현탁시키고, T25 플라스크를 통과시키고, 37 ℃에서 5% CO2 하에서 배양했다. 공동 섬유 생물 반응기(hollow fiber bioreactor)를 접종시킬 충분한 수의 세포를 제조하기 위해, 세포를 늘려 총 6 x 108 세포를 얻었다. 생물 반응기를 제조자의 지시 메뉴얼에 따라 준비했다. 수확한 세포를 펠렛화하고, 35% FBS를 함유하는 60 mL의 IMDM 중에 재현탁시키고, 생물 반응기의 관외 표면(extracapillary space) 내로 주사했다. 글루코스 및 락테이트의 농도를 매일 관찰하였으며, 수확 물질을 원심분리하고 고이게 했다. ELISA 분석에 의해 수확된 물질을 항-TF 항체 농도에 대해 시험했다. 항-TF 항체(hOAT)를 함유하는 고여진 샘플을 이후 정제하고 하기 기술되는 바와 같이 분석했다.
A. rProtein A 세파로즈 고속 크로마토그래피(rProtein A Sepharose Fast Flow Chromatography)
재조합 인간화된 항-TF 모노클로날 항체는 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄로 구성된다. 중쇄는 마우스 가변 도메인 (상기 기술된 바와 같이 변경되지 않거나 인간화된) 및 인간 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인의 융합인 반면, 경쇄는 마우스 가변 도메인 (상기 기술한 바와 같이 변경되지 않거나 인간화된) 및 인간 K 도메인을 함유한다. 인간 IgG Fc 영역이 단백질 A 또는 재조합 단백질 A (rProtein A)에 대해 높은 친화성을 갖는다는 것이 잘 수립된다.
인간화된 항-TF 항체(hOAT)를 함유하는 수확 풀(Harvest pools)은 샘플 ml 당 0.08 ml의 1 M Tris-HCl를 가하여, pH 8.0로 조정했다. 그 후 샘플을 저 단백질-결합 0.22 미크론 필터를 통해 여과시켰다 (예컨대, Nalge Nunc International로부터의 폴리에테르설폰 막을 갖는 Nalgene 멸균 일회용 조직 배양막 단위, 카탈로그 번호. 167-0020). 샘플 적용 후, rProtein A 컬럼 (Pharmacia)을 5 베드 부피(bed volumes)의 20 mM Tris-HCl, pH 8.0로 세척하여 배지 단백질과 같은 결합되지 않은 물질을 제거했다. 수확 배지는 고농도의 소 혈청을 함유하므로, 단계적인 pH 기울기 세척을 이용하여 컬럼으로부터 소 IgG를 제거했다. 단계적 pH 기울기는 완충액 A (100 mM 소듐 아세테이트) 중의 완충액 B (100 mM 아세트산)의 상대적인 퍼센트를 증가시켜 달성되었다. 일반적인 pH 단계적 세척은 20%, 40%, 및 60% 완충액 B를 사용하였다. 100% 완충액 B로 컬럼을 용리시키고 A280에 기초하여 분획을 수집하였다. 모여진 분획을 1 M Tris 염기를 가하여 pH 8.5로 조정했다.
B. Q 세파로즈 고속 크로마토그래피
음이온 교환 크로마토그래피는 그들의 전하에 따라 분리되는 단백질에 있어서 매우 효과적이다. rProtein A 컬럼으로부터 용리되고 pH-조정된 샘플을 2배의 물로 희석하고, pH를 체크하고 8.5로 조정했다. 그 후 샘플을 20 mM Tris-HCl, pH 8.5로 평형화시킨 5 ml (1.6 x 2. 5 cm) Q 세파로스 패스트 플로우에 로딩하고, 컬럼을 (1) 5 베드 부피의 20 mM Tris-HCl, pH 8.5 ; 및 (2) 100 mM NaCl을 함유하는 4 베드 부피의 20 mM Tris-HCl, pH 8.5로 세척했다. 그 후 IgG 단백질을 500 mM NaCl을 함유하는 베드 부피의 20 mM Tris-HCl, pH 8.5로 용리시켰다. 단백질 피크를 모으고, 초여과 장치를 이용하여 완충액을 PBS로 교환했다.
동일한 트랜스펙션, 세포 배양, 및 정제 방법을 이용하여, hFAT 또한 생산 및 정제되었다.
실시예 3 - 인간화된 항-TF 항체의 특성
A. 인간화된 항-TF 항체에 의한 TF 기능의 저해
항-TF 항체의 중요한 특성 중 하나는 조직 인자-개시 혈액 응고를 저해하는 그의 능력이다. 표준 PT 분석에서 정제된 hOAT 및 hFAT는 TF 활성를 저해하는 그들의 능력에 대해 측정되었다. PT 분석은 조직 인자-의존 혈액 응고 시간을 측정하기 위해 널리 이용된다. 이 분석의 원리는 혈장 중에서 조직 인자 (TF)가 인자 VIIa와의 복합체를 형성하는 것이다. 그 후 이 복합체는 인자 X 를 FXa로 활성화시키고; 이후 FXa는 인자 Va 및 포스포리피드의 존재 하에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킨다. 트롬빈은 놀랍게도 혈액 응고의 형성을 이끈다. 표준 PT 분석에서, 지질화된 TF를 혈장에 가해 혈액 응고를 개시하고, 응고는 Organon Teknika Coag-A-Mate 응고 분석기 또는 균등물에 의해 기록된다.
항-TF 항체, H36는 독특한 메커니즘에 의해 인간 TF 활성을 저해한다. 그것은 TF:FVIIa 복합체에의 인자X 및 IX 결합을 저해하여, TF:FVIIa에 의한 FX 및 FIX의 활성화를 차단하도록 TF (유리 또는 인자 VIIa와의 복합체로)에 결합한다(미국 특허 제 5,986,065호 참조). PT 시험에서, 인간 혈장으로 가해진 항-TF 항체 응고 시간의 연장은 이 TF-의존 응고가 저해된다는 명확한 표시이다. 응고 시간은 TF 활성의 양과 관련된다. TF 표준 곡선은 연속적으로 희석된 TF의 PT 응고 시간을 측정함으로써 생성된다. TF 표준 곡선의 데이터로부터, 항-TF 항체에 의한 TF 활성의 저해가 결정된다.
시약: VWR로부터 얻은 인노빈(Innovin) (카탈로그 번호 68100-392) 및 Ci-Trol 응고 조절, 레벨 I(Ci-Trol Coagulation Control, Level I) (카탈로그 번호 68100-336). 지질화된 재조합 인간 TF는 미국 특허 제 5,986,065호에서의 실시예 3에 기술된 바와 같이 생산되었다.
방법: PT 테스트는 응집 분석기를 이용하여 37 ℃에서 수행되었다. PT 반응은 0.2 ml의 지질화된 재조합 인간 조직 인자 (예컨대,인노빈)를 0.01 ml 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA) 또는 항-TF 항체를 함유하는 0.1 ml의 인간 혈장 (Ci-Trol Control Level1) 내로 가함으로써 개시된다.
1. 제조자의 지시에 따라 인노빈의 바이알로 정제수를 가한다. 시약을 37 ℃로 데운다. 4-8 ℃에서 저장되었다면 시약은 며칠동안 안정하다.
2. Ci-Trol의 각 바이알로 1 ml 정제수를 가한다. 혼합하여 용해화시킨다. 하나 이상의 바이알이 사용된다면, 그들을 하나의 용기 내로 합한다 (예컨대, 10 ml 테스트 튜브). 1 ml Ci-Trol은 5회 분석을 돌릴 수 있다(각 분석은 2 x 0. 1 ml = 0.2ml를 사용한다). Ci-Trol는 얼음 상에 저장될 수 있으며, 몇 시간 동안 지속된다.
3. 항-TF 항체 스톡으로부터, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA를 갖는 항-TF 항체 용액 (200 nM 내지 1600 nM)의 계열을 만든다.
4. 10 ㎕의 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA 또는 10 ㎕의 희석된 항-TF를 0.1 ml의 Ci-Trol을 함유하는 트윈-웰 큐벳의 각각의 웰에 가했다. 0.1 ml 팁을 가진 피렛을 사용하여 각 웰을 혼합했다. 각 웰 내에 공기 방울이 생기지 않도록했다.
항-TF (또는 완충액)을 혈장 (Ci-Trol)과 혼합한 후, 플라즈마로 0.2 ml의 인노빈을 가하여 10 분 내의 응고 시간을 측정했다.
5. TF 표준 곡선에 대해, 먼저 인노빈(100% TF)을 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0. 1% BSA로 20%, 10%, 5% 및 2.5%로 희석한다. 그 후, 희석된 인노빈 샘플을 이용하여 단계 4에서와 같이 PT 분석을 수행했다.
표 3은 PT 응고 시간에 대한 cH36, hOAT, 및 hFAT의 효과의 요약이다. 표 4에서의 데이터와 비교하면, cH36,hFAT, 및 hOAT는 매우 강력한 TF 기능의 저해를 보였다. 12.9 nM 초과의 단백질 농도에서, 모든 항체는 약 95% 저해를 달성했다. 표 3에서의 결과는 또한 hFAT 및 hOAT 모두 cH36에 대해 보여지는 TF-의존 혈액 응고를 저해하는 매우 유사한 활성을 보였으므로 상기 기술된 방법에 의한 항-TF, cH36의 인간화가 cH36 저해적 활성에 대한 어떠한 중요한 효과를 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
표 3. 키메라 (cH36) 및 인간화된) 항-TF 항체(hFAT 및 hOAT)# 에 의한 프로트롬빈 시간에 대한 효과
#모든 분석은 표 4에서와 같은 동일한 100% TF 활성 (농도) 샘플을 사용했다.
표 4. 응고 시간 및 상대적인 조직 인자 활성(농도)
B. 친화성 상수의 결정
TF에 대한 인간화된 항-TF 항체의 친화성을 CM5 센서 칩 상에 공유적으로 고정화된 재조합 인간 조직 인자로 표면 플라스몬 공명(BIAcore from Pharmacia Biosensor)에 의해 측정했다. 친화성 상수는 BIAcore 컴퓨터 소프트웨어에 의해 네 개의 항-TF 모노클로날 항체 농도 (0.125 nM, 0.25 nM, 0.5 nM, 및 1 nM)로부터 계산된 평균 데이터이다. 표 5의 결과는 cH36 및 hFAT 모두가 TF에 대해 유사한 친화성을 가지므로, 상기 기술된 방법에 의한 항-TF, cH36의 인간화가 TF에 대한 cH36 친화성에 대해 어떠한 중요한 효과를 갖지 않음을 나타낸다.
표 5. 항-TF 항체의 뚜렷한 친화성 및 해리 상수
실시예 4 - 항-LTA 항체의 인간화
A. 키메라 항-LTA 항체
B. 항-LTA 항체에 대한 인간화 전략
키메라 항-LTA (리포테코산) 항체, A110의 인간화는 "FR 최적-적합" 방법을 이용하여 달성된다. 이 방법은 공지된 아미노산 서열을 갖는 많은 수의 인간 IgG 가변 도메인을 공중 데이터베이스에서 이용가능하는 사실의 완전한 이점을 갖는다. A110에서의 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 개별적인 프레임워크 영역의 서열을 Kabat 데이터베이스에서 서열 각각의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 또는 인간 프레임워크 (또는 그의 단편)와 비교하였다(http://immun. bme. nwu. edu 참조). 하기 기준을 이용하여 인간화에 대해 원하는 인간 IgG 프레임워크 영역 서브세트를 선택했다: (1) 미스매치된 아미노산의 수가 가능한한 낮게 유지되었다. (2) "버니어" 구역 내의 아미노산(이 구역 내의 아미노산은 CDR 구조를 조절하고, 항원에 맞도록 정밀하게-조정할 수 있다, Foote, J. 및 Winter, G. , J. of Mol. Bio. 224 (2): 487-499 [1992] 참조)이 바뀌지 않은채 남아있다. (3) 보존적 아미노산 치환은 유사한 후보들을 평가할 때 이로움을 얻었다. 이 비교를 위해 사용된 매칭 프로그램은 Kabat의 인터넷 홈페이지에서 찾을 수 있다. 이 독특한 FR 최적-적합 방법을 이용하여, 표적 IgG의 인간화된 LC 또는 HC 가변 도메인이 하나의 인간 IgG 분자만큼 작은 것부터 네 개의 상이한 인간 IgG 분자만큼 많은 것 까지로부터 유래된 네 개의 FRs 모두를 가질 수 있음이 예상된다.
B(i). 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역의 선택
A110 LC의 각각의 프레임워크 영역 내의 아미노산 서열을 Kabat 데이터베이스 중의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인 내의 FRs내의 아미노산 서열과 비교했다. 최적-적합 FR을 상기 기술된 세 가지 기준에 기초하여 선택했다.
Kabat 데이타베이스 제 036047호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 A110 LC FR1 및 FR3의 인간화를 위해 선택했다. Kabat 데이타베이스 제 037658호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 A110 LC FR2의 인간화를 위해 선택하고, Kabat 데이타베이스 제 004763호의 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 A110 LC FR4의 인간화를 위해 선택했다. 선택된 FRs을 갖는 인간 IgG 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 매치시키기 위해 A110 LC 중에서 하기 돌연변이를 만들었다: D1 → Q, L11 → M, M21 → I, S42 → Q, R76 → A, V77 → M 그리고 M102 → K(서열 정보에 대한 표 6 참조).
B(ii). 인간 IgG 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역의 선택
A110의 각각의 프레임워크 영역 중의 아미노산 서열을 Kabat 데이타베이스 내의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인에서의 FRs 내의 아미노산 서열과 비교했다. 최적-적합 FR은 상기 기술된 세 개의 기준에 기초하여 선택되었다.
Kabat 데이터베이스 제 000468호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 A110 HC FR1의 인간화를 위해 선택되었다. Kabat 데이타베이스 제 000565호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 A110 HC FR2의 인간화를 위해 선택되었다. Kabat 데이타베이스 제 000628호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 A110 HC FR3의 인간화를 위해 선택되었다. Kabat 데이타베이스 제 031571호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 A110 HC FR4의 인간화를 위해 선택되었다. Kabat 데이타베이스 제 000468 호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산을 매치시키기 위해 A110 HC FR1 중에서 하기 돌연변이를 만들었다: M3 → Q, 그리고 K15 → G. Kabat 데이타베이스 제 000565호 FR2을 매치시키기 위한 A110 HC FR2에 대한 변화는 필요없었다. A110 HC FR3가 Kabat 데이타베이스 제 000628호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 매치되도록 여섯 개의 돌연변이가 만들어졌다: Q78 → K, S79 → N, M80 → S, N87 → S, M95 → V 그리고 V99 → A. A110 HC FR4가 Kabat 데이타베이스 제 031571호의 인간 IgG 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 매치하도록 하나의 돌연변이 L113 → V를 만들었다 (서열 정보에 대한 표 7 참조).
표 6. A110 (서열번호: 109) 및 인간 경쇄 (LC) (서열번호: 127) FR 서열의 비교
표 7. A110 (서열번호: 118) 및 인간 중쇄 (HC) (서열번호: 123) FR 서열의 비교
원하는 인간 프레임워크 영역 상에서의 결정이 이루어질 때, 하기 세 가지 기술을 이용하여 경쇄 및 중쇄 모두에서의 원하는 아미노산 치환을 수행하였다: (1) 보통의 PCR을 클로닝을 위해 이용하여 클로닝 또는 진단적 제한 엔도뉴클레아제 부위를 도입하고, 가변 도메인의 말단에 위치한 아미노산 잔기를 변화시켰다. (2) PCR-기초 돌연변이를 이용하여, 특히 이들 잔기가 가변 도메인의 중앙에 있을 때, 한번에 다수의 아미노산 잔기를 변경시켰다. (3) 위치-유도 돌연변이를 이용하여 한번에 하나 또는 둘 아미노산 치환을 도입했다. 위치-유도 돌연변이는 Stratagene의 "Quick Change Site-Directed Mutagenensis Kit" (카탈로그 #;200518)에서 기술된 프로토콜을 따라 수행되었다.
각 단계 후, 부분적으로 인간화된 클론을 서열화하고, 이들 가변 도메인 중 일부를 이후 발현 벡터 내로 클로닝했다. IgG1으로서 플라스미드 tKMC180를 이용하여 LC 돌연변이주를 발현시키고, pJRS355를 이용하여 HC 돌연변이주를 발현시켰다. 이후 이들 클론의 일부를 결합시키고, COS 세포 내에서 일시적으로 발현시켰다.
최종의 완전히 인간화된 형태의 항-LTA 중쇄 및 경쇄 가변 도메인를 여기에서 때때로 "메가 벡터"라고 언급되는 것 내로 클로닝하고, IgG 발현 및 LTA 결합 분석을 위해 COS 세포 내로 트랜스펙션시켰다.
C. 인간화된 항-LTA 항체 중쇄의 생성
1. PCR 증폭 및 항-LTA mAb A110 중쇄 (HC) 가변 도메인의 pGEM T-easy(Promega) 내로의 클로닝을 주형으로서 플라스미드 pJRS334(A110에 대한 발현 벡터) 및 프라이머 HChuF1 및 HChuR2를 이용하여 수행하였다. 프라이머 HChuF1은 가변 도메인의 첫번째 코돈의 상류에 BsiW1 부위를 도입하고, 또한 프레임워크(FR) 1 내에 M3에서 Q로의 아미노산 변화를 도입했다. 프라이머 HChuR2는 FR 4내에서 L119에서 V로의 아미노산 변화를 도입하고, 클로닝 목적을 위한 C-말단 EcoRI 제한 부위를 도입했다. 그 후 이 단편은 pJRS370을 생성하는 EcoRI 제한 단편으로 BsiWI로서 발현 벡터 pJRS355 내로 서브 클로닝되었다.
2. 항-LTA mAb A110 중쇄 (HC) 가변 도메인 단편의 PCR 증폭은 주형으로서 플라스미드 pJRS334 (A110에 대한 발현 벡터) 및 N-말단 단편에 대해 프라이머 HChuF1 및 HChuR1 그리고 C-말단 단편에 대해 프라이머 HChuF2 및 HChuR2를 이용하여 수행되었다. PCR은 FR3에 두 개의 추가적인 돌연변이, N87이 S로 그리고 M95가 V로의 돌연변이를 포함하는 가변 도메인 단편을 만들어낸다. 이 단편의 pGEM T-Easy로의 클로닝은 작제물 pJRS364을 만들어낸다.
3. 퀵 체인지 시스템(Quik Change system, Stratagene)을 이용한 위치 유도 돌연변이를 이용하여 중쇄 가변 도메인내로 또다른 돌연변이를 도입했다. 상보적 프라이머 JSS80 및 JSS81의 쌍을 플라스미드 pJRS364와 결합시키고 PfuTurbo DNA 중합효소로 증폭시켰다. DpnI로의 산물 소화 후, DNA를 이용하여 E. coli, XL1B 세포를 형질전환시켰다. 이 조직은 FR3에서 V99에서 A로의 돌연변이를 만들어냈으며, 작제물은 pJRS373로 지칭되었다. EcoRI 제한 단편에 대한 BsiKI로서 이 단편의 발현 벡터 pJRS355로의 클로닝은 플라스미드 pJRS380를 만들어냈다.
4. 그 후 퀵 체인지 시스템(Quik Change system, Stratagene)을 이용한 위치 유도 돌연변이를 이용하여 중쇄 가변 도메인 내로의 또다른 돌연변이를 도입했다. 상보적 프라이머 JSS82 및 JSS83의 쌍을 플라스미드 pJRS373와 결합시키고, PfuTurbo DNA 중합효소로 증폭시켰다. 산물의 소화 후, DNA를 이용하여 E. coli, XL1B 세포를 형질전환시켰다. 이 조작은 FR1에서 K15의 G로의 돌연변이을 만들고, 작제물은 pJRS378로 지칭되었다. EcoRI 제한 단편에 대한 BsiWI로서 발현 벡터 pJRS355로의 이 단편의 클로닝은 플라스미드 pJRS381를 만들어낸다.
5. 항-LTA mAb A110 중쇄 (HC) 가변 도메인 단편의 PCR 증폭은 주형으로서 플라스미드 pJRS381 (A110의 돌연변이된 HCV에 대한 발현벡터)을 이용하여 수행되었다. N-말단 단편에 대해 프라이머 MV-HC 리더 및 JSS87, C-말단 단편에 대해 프라이머 JSS86 및 HCV Back. PCR은 FR3에 Q78이 K로, S79가 N으로, 그리고, M80이 S로의 세 개의 추가적인 돌연변이를 함유하는 가변 도메인 단편을 만들어냈다. EcoRI 제한 단편에 대한 BsiWI로서 pJRS355로의 이 단편의 클로닝은 작제물 pJRS383을 만들어냈다.
중쇄 인간화를 위해 사용된 프라이머
D. 인간화된 항-LTA 항체 경쇄의 생성
1. PCR 증폭 및 항-LTA mAb A110 중쇄 (LC) 가변 도메인의 pGEM T-easy(Promega)로의 클로닝은 주형으로서 플라스미드 pJRS334 (A110에 대한 발현벡터) 및 프라이머 LChuFl 및 LChuR3를 이용하여 수행되었다. 프라이머 LChuF1은 가변 도메인의 첫번째 코돈의 Agel 부위 상류를 도입하고 또한 프레임워크 1에서의 아미노산 변화를 도입했다, D1이 Q로 그리고 S5가 T로. 프라이머 LChuR3는 FR4 내에 iM102의 L로의 아미노산 변화를 도입하고, 클로닝 목적을 위한 C-말단 BstBI 제한 부위를 도입한다. 이 단계는 작제물 pJRS363를 만들어낸다.
2. 항-LTA mAb A110 경쇄 (LC) 가변 도메인 단편의 PCR 증폭은 주형으로서 플라스미드 pJRS334 (A110에 대한 발현 벡터) 및 하나의 N-말단 단편 (LCN1)에 대해 프라이머 LChuF1 및 LChuR1 그리고 제 2 N-말단 단편 (LCN2)에 대해 프라이머LChuF1 및 LChuR2를 이용하여 수행되었다. 두 개의 C-말단 단편은 하나에 대해 프라이머 LChuF2 및 LChuR3 (LCC1) 그리고 제 2 (LCC2)에 대해 LChuF3 및 LChuR3를 이용하여 생성되었다. PCR을 위한 내부 단편 또한 프라이머 LChuF2 및 LChuR2(LCI)를 이용하여 수행되었다.
3. 주형으로서 단편 LCN1 및 LCC1 및 프라이머로서 LChuF1 및 LChuR3을 이용하여 PCR 반응이 수행되었으며, 생성된 산물은 pGEM T-easy 내로 클로닝되어 플라스미드 pJRS365를 생산하였다. 이는 FR2 내에 또다른 돌연변이, S41이 Q로의 돌연변이를 도입했다.
4. 주형으로서 단편 LCN2 및 LCC2 및 프라이머로서 LChuFl 및 LChuR3을 이용하여 PCR 반응이 수행되었으며, 생성된 산물은 pGEM T-easy 내로 클로닝되어 플라스미드 pJRS366를 생산하였다. 이는 FR3 내에 두 개의 돌연변이를 도입했다, R76 가 A로 및 V77이 M로.
5. 주형으로서 단편 LCI 및 LCC2 및 프라이머로서 LChuF1 및 LChuR3를 이용하여 PCR 반응이 수행되었다. 그 후 제 2 PCR이 주형으로서 이 새로운 단편 및 LCN1 그리고 프라이머로서 LChuF1 및 LChuR3을 이용하여 수행되었다. 생성된 산물은 pGEM T-easy 내로 클로닝되어 플라스미드 pJRS367를 생산하였다. 하나의 경쇄 가변 도메인 단편 내로 이들 경쇄 돌연변이 모두를 결합시켰다.
6. 모든 LC 가변 도메인 클론 중 L102를 PCR에 의해 K로 전환시켰다. 주형으로서 플라스미드 pJRS363, 365, 366 및 367를 이용하여, 가변 도메인을 프라이머 LChuF1 및 LChuR4를 이용하여 재-증폭시켰다. 생성된 산물을 다시 pGEM T-easy 내로 클로닝하여 플라스미드 pJRS363K,365K, 366K, 및 367K를 생성시켰다.
7. 인간화된 가변 도메인의 네 개의 모든 버젼을 BstBI 제한 단편에 대해 AgeI로서 계속적으로 경쇄 발현 벡터, tKMC180 내로 클로닝했다. 다양한 돌연변이 경쇄의 포유동물 세포 발현에 대한 최종 작제물을 pJRS374,375, 376, 및 377로 지칭했다.
8. 항-LTA mAb A110 경쇄 (LC) 가변 도메인 단편의 PCR 증폭이 주형으로서 플라스미드 pJRS376 (6 개의 돌연변이를 포함하는 인간화된 A110 경쇄에 대한 발현 벡터) 및 N-말단 단편(LCN1)에 대해 프라이머 MV-LC 리더 및 JSS89 및 C-말단 단편에 대해 프라이머 JSS90 및 LC 리버스를 이용하여 수행되었다. 주형으로서 이들 단편 및 프라이머 MV-LC 리더 및 LC 리버스를 이용한 PCR 반응은 L11이 M으로 및 M21이 I로의 돌연변이를 포함하는 산물을 만들어냈다. 그 후 이들 산물을 BstBI 제한 단편에 대한 AgeI로서 tKMC180, LC 발현 벡터 내로 클로닝하여, 플라스미드 pJRS384를 생성시켰다.
상기 발현 벡터 작제물 모두가 COS 세포를 이용한 같이 트랜스펙션 실험에서 항체를 발현하는 능력에 대해 양성으로 시험되었다. 인간화된 중쇄 및 경쇄 A110 가변 도메인의 배합 모두는 ELISA를 이용하여 테스트할 때 LTA에 결합했다. 계속적으로, 배합 발현 벡터, 즉, 중쇄 및 경쇄 코딩 영역 모두를 갖는 단일한 플라스미드가 구성되었다. pJRS383 및 pJRS384로부터 잘린 가변 도메인으로부터 만들어진 모두 16개의 돌연변이 (8개의 중쇄 및 8개의 경쇄)를 포함하는 최종 발현 플라스미드가 pJRS394로 지칭된다. 이 플라스미드를 이용하여 COS 세포를 트랜스펙션시킬 때, 생산되는 생성된 항체는 ELISA 실험에 의해 보여지는 바와 같이 LTA에 결합할 수 있다.
클로닝을 위해 사용되는 프라이머:
실시예 5 - 인간화된 항-LTA 항체의 특성화
A. 재조합 인간화된c96-110 항체 변이체의 일시적 생산
항-LTA 항체의 인간화된 버전을 특성화시키기 위해, 플라스미드 pJRS334, 391, 392, 393, 및 394 (도 10 참조)를 Superfect (Qiagen)를 이용하여 제조자에 의해 기술된 바와 같이 6 웰 조직 배양 웰 내에서 COS 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 플라스미드 pJRS334는 c96-110 항체를 코딩하고, 플라스미드 pJRS391-4는 c96-110의 인간화된 변이체를 코딩한다. 이틀 후 상청액을 키메라 항체의 생산에 대해 분석했다. 그 후 이들 항체는 S. aureus LTA 항원에 결합하는 발현된 항체에 대해 그 능력을 분석했다.
항체 생산 분석은 염소 항인간 Fc (Pierce)로 1: 500 희석에서 코딩된 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp F8; Nunc, Inc. )로부터 8-웰 스트립 중에서 수행되었다. 플레이트를 압력 민감성 필름으로 덮고 4 ℃에서 밤새 배양했다. 그 후 플레이트를 세척 용액(이미다졸/NaCV0. 4% Tween-20)으로 1회 세척했다. 그리고나서 일시적으로 트랜스펙션된 COS 세포의 배양 상청액 백 마이크로리터를 두 배의 웰에 적용시키고 실온에서 플레이트 로테이터 상에서 60분 동안 배양되도록 했다. 플레이트를 세척 용액으로 7회 세척했다. 염소 항-인간 IgG H+L-HRP (Zymed) 컨쥬게이트를 샘플/컨쥬게이트 희석액 중에서 1 : 4000 희석하고, 백 마이크로리터의 희석액을 각각의 샘플에 가한 후, 실온에서 60분 동안 플레이트 로테이터 상에서 배양했다. 샘플을 상기한 바와 같이 세척한 후, 실온에서 1분 동안 100㎕/웰의 ABTS 전개 기질(BioFx)로 배양했다. 100㎕/웰의 중지 완충액 (BioFx)으로 반응을 중단시키고, 405nm에서의 흡광도 수치를 자동화된 마이크로타이터 플레이트 ELISA 리더를 이용하여 측정했다 (표 8 및 도 11에서의 결과 참조). 이 분석은 이들 플라스미드 작제물로의 COS 세포의 트랜스펙션이 인간 IgG 및 카파 도메인 모두를 포함하는 분자를 생산하는 세포를 만들어낸다는 것을 증명한다. 각각의 세포 상청액 중의 항체 농도의 근사값은 0.5pg/mL 내지 0.04pg/mL에서의 인간 모노클로날 IgGI 를 이용한 표준 곡선 희석 시리즈에 대한 비교에 의해 측정되었다.
표 8. COS 세포에서의 항체 생산 (O.D.405nm)
B. 인간화된 변이체에 의한 LTA에의 항체 결합의 특성화.
그 후, 일시적으로 트랜스펙션된 COS 세포로부터의 배양 상청액을 함유하는 항체가 S. aureus LTA에 결합하는 발현된 항체의 능력에 대해 분석되었다. 활성 분석은 PBS를 이용하여 S. aureus LTA (Sigma)로 1㎍/mL에서 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp F8 ; Nunc, Inc. )로부터 8-웰 스트립 중에서 수행되었다. 플레이트를 덮고, 4 ℃에서 밤새 배양했다. 그리고 나서 플레이트를 PBS로 1회 세척했다. 백 마이크로리터의 배양 상청액 희석액을 두 배의 웰에 적용시키고, 실온에서 플레이트 로테이터 상에서 60분 동안 배양되도록 했다. 플레이트를 세척 용액으로 7회 세척했다. 염소 항- 인간 IgG H+L-HRP (Zymed)를 샘플/컨쥬게이트 희석액 중에서 1 : 4000 희석하고, 백 마이크로리터의 희석액을 각각의 샘플에 가한 후, 실온에서 플레이트 로테이터 상에서 배양했다. 샘플을 상기한 바대로 세척한 후, 실온에서 플레이트 로테이터 상에서 10-15분 동안 100㎕/웰의 ABTS 전개 기질(BioFx)로 배양했다. 100 ㎕/웰의 중단 완충액(BioFx)으로 반응을 중지시키고 405 nm에서의 흡광도를 자동화된 마이크로타이터 플레이트 ELISA 리더를 이용하여 측정하였다(표 9 및 도 1에서의 결과 참조). 이 분석은 이들 플라스미드 작제물로의 세포의 트랜스펙션이 인간화된A110 항체의 비교할만한 수준을 생산하는 세포를 만들어낸다는 것을 증명한다.
표 9. 항체 결합 분석 (O.D.405nm)
C. 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 이용한 c96-110의 친화성 상수 결정.
표면 플라스몬 공명을 이용하여 이들 항체를 계속적으로 시험하여 S. aureus LTA 항원에의 항체 결합을 평가했다. pJRS391에 의해 생산된 인간화된 A110 항체가 모 항체 A110 (또는 c96-110)에의 LTA를 결합시키는 그의 능력에서 비교할만하다는 것이 표 10에서의 이들 결과로부터 명백하다. 그러므로 인간화된 버전은 그의 부모(parent)보다 LTA에 대한 유사한 뚜렷한 결합 친화성을 가질 것이다.
C-1. 베지클(vesicles) 제조 및 고정화.
베지클을 함유하는 리포테코산(LTA)을 Kalb 등, Biochemica et Biophysica Acta (1992) 1103,307-316의 방법에 따라 제조했다. 요약하면, 클로로포름 중의 포스파티딜-에탄올아민리놀레오일-팔미토일 (PE-L-P, SIGMA, St. Louis, MO) 용액을 진공하에서 건조되도록 증발시켰다. BIAcore 용리액(eluent) (HBS) 및 스타필로코쿠스 아우레스 (SIGMA, St. Louis MO)로부터의 LTA를 가하여 HBS 및 PE-L-P 중의 1% LTA 중의 0.2 mM PE-L-P 용액을 만들었다. 격렬한 볼텍싱 후, 용액을 폴리카보네이트 필터(0.1 um pores, Nucleopore Corning)를 통해 8회 통과시켰다. 이 용액을 즉시 BIAcore HPA 칩 (BIAcore Inc. Piscataway, NJ) 상에 대략 1400 RU의 안정 수준이 얻어질 때까지 주입했다. 베지클이 자발적으로 HPA 칩의 표면에 융합된다.
C-2. SPR 분석
결합 역학을 PE-L-P/1% LTA으로 코팅된 HPA 칩으로 피팅된 BIAcore 기구 (BIAcore Inc. , Piscataway, NJ) 상에서 결정했다. 상이한 농도의 c96-110를 표면 사에 주입했다. 칩 표면이 재생성 될 수는 없으므로, 표면 당 오직 1회의 주입이 수행되었다. 결합 및 해리율을 하나의 결합 모델에 대해 하나를 이용하는 BIAevaluation 소프트웨어 2.0 (BIAcore Inc. , Piscataway, NJ)으로 결정했다.
표 10. 상이한 농도의 LTA에 대한 c96-110에 대한 뚜렷한 친화성 상수
실시예 6. 본 발명의 FR 최적 적합 접근법으로의 항-TAC 항체의 인간화의 인 실리코 비교.
접근법을 비교하기 위해, 문헌들에서 인간화가 수행되고 기술된 특이적 항체를 FR 최적 적합 접근법에 의한 인간화의 결과와 비교했다. 과거 본래의 인간화 작업이 수행될 때, Kabat 데이터베이스는 이러한 인 실리코 비교가 수행될 때 만큼 광범위하지 않았다. 데이터베이스의 확대는 최적 적합에 대해 고려될 수 있었던 증가된 수의 프레임워크를 제공한다. 확대된 데이터베이스의 결과로서 도입된 치우침(bias)에 대해 고치기 위해, 수정된 최적 적합 연구가 수행되었고 결과가 주어졌다.
이 실시예에서, 비교는 항-TAC 항체에 대해 수행되었다. 인 실리코 인간화는 표 11 및 12에서 제공된다. 각 표의 첫번째 줄에서는, 출발 뮤린 항체 서열이 기록되며, 제 2째 줄은 최적 적합이 경쇄 가변 도메인에 대해 035921이고 중쇄 가변 도메인에 대해 035918임을 보여주는 프레임워크의 본래의 인간화된 항체의 서열 (Queen, 등 PNAS 86: 10029-10033 (1989) )이다. 각 표의 세번째 줄은 이 비교의 시간에서 결정된 바람직한 최적 적합 프레임워크를 보여준다. 마지막 줄은 FR 최적 적합 접근법을 이용하여 바람직한 서열을 보여준다.
이 비교를 수행함에 있어서, FR 최적 적합 접근법의 이점은 요구되는 아미노산 치환의 전체 수, 변화가 요구되는 버니어 잔기의 수, 및 전체 상동성 스코어를 리뷰함에 의해 보여질 수 있다. 아미노산 치환의 수를 최소시킴으로써, 실제 인간화에 포함되는 시간, 비용 및 노동력이 감소된다. 버니어 잔기가 바람직한 아미노산으로서 유지되는 FRs을 확인함으로써, CDRs의 형태에 대한 유해한 효과를 최소화시켜 항체 결합 친화성에대한 최소의 효과를 이끌어야한다.
경쇄 및 중쇄 프레임워크에 대한 더 나은 전체 상동성 스코어(즉% 상동성(homology))는 다른 프레임워크 기초의 접근법과 비교하여 FR 최적 적합 접근법에 대해 보여진다.
항-TAC 항체에 대해, 본래의 인간화는 경쇄 및 중쇄 각각에 대한 최적 적합을 갖는 프레임워크로서 035921 및 035918의 선택에 기초한다. 이 인간화는 경쇄 프레임워크에서 86개의 아미노산 중 28개(버니어 잔기 중 5개)의 치환 및 중쇄 프레임워크에서 87개의 아미노산 중 29개 (버니어 잔기 중 5개)의 치환을 요구한다. 확대된 Kabat 데이터베이스를 이용하여, CEA4-8A (004752) 프레임워크는 경쇄에 대한 최적 적합을 가졌고, A10 (045903) 항체는 중쇄에 대한 최적 적합을 가졌다(경쇄 및 중쇄 가변 도메인 프레임워크는 동일한 항체로부터 와서는 안된다고 가정한 누그러진 기준을 이용하여). 이는 본래의 인간화된 항-TAC와 비교하여 더 나은 적합을 만들어냈고, 더 적은 수의 총 치환 (57에 대해 30) 및 버니어 구역 잔기에서의 더 적은 변화(10에 대해 4) 및 더 나은 상동성를 요구할 것이다. 그러나 FR 최적 적합은 이중 오직 3개가 버니어 잔기의 것인 오직 23개의 아미노산 치환만을 요구하는 우수한 결과를 준다. 뮤린 항-TAC 및 본래 인간화된 항-TAC간의 전체 상동성은 74.3%였다. 전체 상동성은 확대된 데이터베이스로 86.5%로 개선되나, FR 최적 적합 접근법이 적용될 때는 89.6%로 개선된다.
항-TAC 경쇄에 대한 인간화 접근법의 비교
항-TAC 중쇄에 대한 인간화 접근법의 비교
항-TAC 가변 도메인에 대한 인간화 접근법의 전체 비교
표 11. FR 최적 적합 접근법 (서열번호: 156)을 포함한 접근법에 의한 인간화된 항-TAC 경쇄 (hu항-TAC) (서열번호: 154), mu항-TAC (서열번호: 153) 및 CEA4-8A (서열번호: 155)의 비교
표 12. FR 최적 적합 접근법 (서열번호: 160)을 포함한 접근법에 의한 인간화된 항-TAC 중쇄 (hu항-TAC) (서열번호: 158), mu항-TAC (서열번호: 157) 및 A10 (045903) (서열번호: 159)의 비교
실시예 7. 본 발명의 FR 최적 적합 접근법으로의 Mc3 항체의 인간화의 인 실리코 비교.
이전의 실시예에서와 같이, 제 2 인간화된 항체를 이 실시예에서 인 실리코 재-시험하여 FR 최적 적합 접근법에 의한 인간화에 대해 이 항체에 대해 사용된 인간화 접근법을 비교하였다. 수정된 최적 적합 조사가 수행되었으며, 결과는 확대된 데이터베이스의 결과로서 도입된 치우침을 바로잡기 위해 주어졌다.
이 실시예에서, 비교는 Mc3 항체에 대해 수행되었다. 인 실리코 인간화는 표 13 및 14에서 나타난다. 각 표의 첫번째 줄에서는, 출발 뮤린 항체 서열이 기록되며, 두번째 줄은 본래의 인간화된 항체의 서열이다 (미국 특허 5,639, 641). 각 표의 세번째 줄은 이 비교의 시간에서 결정된 바람직한 최적 적합 프레임워크를 보여준다. 마지막 줄은 FR 최적 적합 접근법을 이용하여 바람직할 서열을 보여준다. Mc3 항체에 대해, 본래의 인간화는 미국 특허 5,639,641에 개시되었다. 이 인간화는 경쇄 프레임워크에서 107개의 아미노산 중 16개의 잔기(버니어 잔기 중 없음)의 치환 및 중쇄 프레임워크에서 117개의 아미노산 중 14개 (버니어 잔기 중 없음)의 치환을 요구한다.
확대된 Kabat 데이터베이스를 이용하여, VL 클론 47 (024300) 프레임워크는 경쇄 가변 도메인에 대한 최적 적합을 가졌고, A 10 (045903) 항체는 중쇄 가변 도메인에 대한 최적 적합을 가졌다(경쇄 및 중쇄 가변 도메인 프레임워크는 동일한 항체로부터 와서는 안된다고 가정한 누그러진 기준을 이용하여).
이들 프레임워크를 이용하였음에도, 생성된 인 실리코 "인간화된" 항체는 본래의 인간화된 항체만큼 좋지 않다. 이는 추가적인 변화가 본래의 인간화된 Mc3에 대해 본래적인 방법에 의해 추천된 사실에 기인한다. 인 실리코 인간화로부터의 최적 적합 프레임워크는 본래의 인간화에서 요구되었던 30개 아미노산 변화에 비교하여, 35개의 아미노산 치환을 요구할 것이다.
버니어 구역 잔기에서의 변화는 인간화에서 또한 요구되지 않는다. 그러나 발명자의 FR 최적 적합 접근법은 오직 26 개의 아미노산 치환 및, 버니어 잔기 변화 없음을 요구하는 우수한 결과를 준다. 뮤린 Mc3 및 인 실리코 인간화된 예 간의 전체 상동성은 82.2%이고 본래 인간화된 Mc3에 대해 85%이다. 최적의 전체는 현재의 FR 최적 적합 접근법에 대해 89.7%이다.
Mc3 경쇄에 대한 인간화 접근법의 비교
Mc3 중쇄에 대한 인간화 접근법의 비교
Mc3 가변 도메인에 대한 인간화 접근법의 전체 비교
표 13. 이뮤노젠의 주형 대 프레임워크 최적 적합 (서열번호: 163) 대 FR 최적 적합 접근법 (서열번호: 164)을 이용한 인간화된 Mc3 경쇄 (HuMc3-LC) (서열번호: 162) 및 Mc3-LC (서열번호: 161)의 비교
표 14. 이뮤노젠의 주형 대 프레임워크 최적 적합 (서열번호: 167) 대 FR 최적 적합 접근법 (서열번호: 168)을 이용한 인간화된 Mc3 중쇄 (HuMc3-HC) (서열번호: 166) 및 Mc3-HC (서열번호: 165)의 비교
실시예 8. 항-TF 항체의 인간화의 인 실리코 비교: 프레임워크 대 FR 최적 적합 접근법.
상기 기술된 실시예 1로부터의 항체를 이용하여 인간화 방법의 또다른 비교를 만들 수 있다. 비교는 전체 프레임워크에 의한 최적 적합 접근법에 대해 만들어졌으며, 항-TF 항체에 대한 FR 최적 적합 접근법과 비교되었다. 다시 이 비교를 인 실리코에서 본래의 인간화에 대해 보다 최근에 비교하여 수행하였으며, 생성된 최적 적합은 더 나은 적합을 갖는 FRs를 제공하는 Kabat 데이터베이스의 확대에 기인하여 실시예 1에서 나타낸 결과에 대해 항상 항동성이지는 않았다.
그럼에도, FR 최적 적합 접근법이 프레임워크 최적 적합 접근법을 넘어서는 이점을 제공한다는 결론이 유지된다.
조사가 수행되어 최적 적합 프레임워크을 확인할 때, 결과는 하기 표 15 및 16에서 보여지는 바와 같다. 표에서의 첫번째 줄은 본래의 뮤린 모노클로날 항체 서열이고, 두번째 줄은 실시예 1로부터의 인간화된 항-TF 항체에 대한 본래의 FR 최적 적합 서열을 보여주며, 세번째 줄은 최적 적합 프레임워크에 대한 서열이고, 네번째 줄은 FR 최적 적합 접근법을 이용하여 보다 최근에 결정된 최적 적합이다. 항-TF 항체 경쇄 (표 15)에 대한 최적 적합 프레임워크는 13개의 아미노산 치환, 1개의 버니어 구역 잔기 변화 및 87.9 %의 상동성을 요구하는 scF11 (041950)이다. 항- TF 항체 경쇄에 대해 업데이트된 FR 최적 적합은 10개의 아미노산 치환, 0개의 버니어 구역 잔기의 변화 및 90.7%의 상동성을 요구하는 FR1에 대해 041950, FR2에 대해 019308, FR3에 대해 038233, 그리고 FR4에 대해 036038이다. 항-TF 항체 중쇄 (표 16)에 대한 최적 적합 프레임워크는 20개의 아미노산 치환, 1개의 버니어 구역 잔기 변화 및 82.9%의 상동성을 요구하는 A10 (045903)이다. 항-TF 항체 중쇄에 대한 FR 최적 적합 접근법은 15개의 아미노산 치환, 0 개의 버니어 구역 잔기 변화 및 87.2 %의 상동성을 요구하는 FR1에 대해 000042, FR2에 대해 023960, FR3에 대해 045903, 및 FR4에 대해 047722이다. 전체 FR 최적 적합 접근법은 프레임워크 최적 적합 접근법이 33개의 아미노산 치환, 2개의 버니어 구역 잔기 변화 및 85.3 %의 상동성을 요구하는 것과 비교하여, 25개의 아미노산 치환, 버니어 구역 잔기 변화 없음 및 88.8 %의 상동성을 요구한다.
항-TF 가변 도메인에 대한 인간화 접근법의 전체 비교
표 15. 프레임워크 최적 적합 (서열번호: 169) 대 FR 최적 적합 접근법 (서열번호: 170)을 이용한 인간화된 항-TF 경쇄 (cH36-LC) (서열번호: 72) 및 (Human-LC) (서열번호: 79)의 비교
표 16. 프레임워크 최적 적합 (서열번호: 171) 대 FR 최적 적합 접근법 (서열번호: 172)을 이용한 인간화된 항-TF 중쇄 (cH36-HC) (서열번호: 83) 및 (Human-HC) (서열번호: 91)의 비교
실시예 9. 항-LTA 항체의 인간화의 인 실리코 비교: 프레임워크 대 FR 최적 적합 접근법.
상기 기술된 실시예 3으로부터의 항체를 이용하여 인간화 방법의 또다른 비교를 만들 수 있다. 비교는 전체 프레임워크에 의한 최적 적합 접근법에 대해 만들어졌으며, 항-LTA 항체(A110)에 대한 FR 최적 적합 접근법과 비교되었다. 실시예 8에서와 같이, 이 비교는 인 실리코에서 본래의 인간화에 대해 보다 최근에 비교하여 수행되었으며, 생성된 최적 적합은 더 나은 적합을 갖는 FRs를 제공하는 Kabat 데이터베이스의 확대에 기인하여 실시예 3에서 나타낸 결과에 대해 항상 항동성이지는 않았다. 이 특정한 경우에서, 최적 적합을 갖는 FRs는 보다 이전의 인간화 및 이 보다 최근의 인 실리코 비교에서 상동성이다. 그러나 결과는 FR 최적 적합 접근법이 프레임워크 최적 적합 접근법을 넘어서는 이점을 제공한다는 결론을 지지한다.
조사가 수행되어 최적 적합 프레임워크을 확인할 때, 결과는 하기 표 17 및 18에서 보여지는 바와 같다. 표에서의 첫번째 줄은 본래의 뮤린 모노클로날 항체 서열이고, 두번째 줄은 실시예 4로부터의 인간화된 항-LTA 항체에 대한 본래의 FR 최적 적합 서열을 보여주며, 이는 FR 최적 적합 연구가 보다 최근에 수행되었을 때 동일한 결과인 것으로 판명되며, 세번째 줄은 최근에 결정된 최적 적합 프레임워크에 대한 서열이다. 항-LTA 항체 경쇄 가변 도메인 (표 17)에 대한 최적 적합 프레임워크는 107개 아미노산 중 13개의 아미노산 치환, 2개의 버니어 구역 잔기 변화 및 87.9 %의 상동성을 요구하는 036047이다. 항-LTA 항체 경쇄에 대한 FR 최적 적합은 9개의 아미노산 치환, 0개의 버니어 구역 잔기의 변화 및 91.6%의 상동성을 요구하는, FR1에 대해 036047, FR2에 대해 037658, FR3에 대해 036047, 그리고 FR4에 대해 004763이다. 항-LTA 항체 중쇄 가변 도메인 (표 18)에 대한 최적 적합 프레임워크는 123개의 아미노산 중 15개의 아미노산 치환, 4개의 버니어 구역 잔기 변화 및 87.8%의 상동성을 요구하는 028897이다. 항-LTA 항체 중쇄에 대한 FR 최적 적합 접근법은 9개의 아미노산 치환, 2개의 버니어 구역 잔기 변화 및 92.7 %의 상동성을 요구하는 FR1에 대해 000468, FR2에 대해 000565, FR3에 대해 000628, 및 FR4에 대해 031571이다. 전체 FR 최적 적합 접근법은 프레임워크 최적 적합 접근법이 28개의 아미노산 치환, 6개의 버니어 구역 잔기 변화 및 87.8 %의 상동성을 요구하는 것과 비교하여, 18개의 아미노산 치환, 2 개의 버니어 구역 잔기 변화 및 92.2 %의 상동성을 요구한다.
표 17. 프레임워크 최적 적합 (서열번호: 173)를 이용한 인간화된 항-LTA 경쇄 (A110-LC) (서열번호: 109) 및 (Human-LC) (서열번호: 127)의 비교
표 18. 프레임워크 최적 적합 (서열번호: 174)을 이용한 인간화된 항-LTA 중쇄(A110-HC) (서열번호: 118) 및 (Human-HC) (서열번호: 123)의 비교
본 발명은 그의 바람직한 구체예를 참고로하여 상세하게 기술되었다. 그러나, 개시의 고려 시, 당업자가 본 발명의 정신 및 범위 내에서 수정 및 개선을 이룰 수 있음이 예상될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> WONG, HING C. STINSON, JEFFREY L. MOSQUERA, LUIS A. <120> METHOD OF HUMANIZING IMMUNE SYSTEM MOLECULES <130> 71758/58066 <140> <141> <150> 09/990,586 <151> 2001-11-21 <150> 60/343,306 <151> 2001-10-29 <150> 09/293,854 <151> 1999-04-16 <160> 174 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 1 gac att cag atg acc cag tct cct gcc tcc cag tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa agt gtc acc atc aca tgc ctg gca agt cag acc att gat aca tgg 96 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct cag ctc ctg att 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 tat gct gcc acc aac ttg gca gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggc aca aaa ttt tct ttc aag atc agc agc cta cag gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile 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Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta aat tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tct 144 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Ser 35 40 45 gcc aca tcc aac ctt ctg gct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Ala Thr Ser Asn Leu Leu Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc atg ctg gaa ata aaa cgt aag 324 Phe Gly Gly Gly Thr Met Leu Glu Ile Lys Arg Lys 100 105 <210> 106 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Ser 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Leu Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Met Leu Glu Ile Lys Arg Lys 100 105 <210> 107 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <400> 107 gaa gtg atg ctg gtg gag tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg 48 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 tca ttg aaa ctc tca tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc aat aac tac 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 gcc atg aat tgg gtc cgc cag gct cca gga aag ggt ttg gaa tgg gtt 144 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gct cgc ata aga agt aaa agt aat aat tat gca aca ttt tat gcc gat 192 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp 50 55 60 tca gtg aaa gac agg ttc acc atc tcc aga gat gat tca caa agc atg 240 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 ctc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa act gag gac aca gcc atg tat 288 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 tac tgt gtg aga cgg ggg gct tca ggg att gac tat gct atg gac tac 336 Tyr Cys Val Arg Arg Gly Ala Ser Gly Ile Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 tgg ggt caa gga acc tca ctc acc gtc tcc tca 369 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 108 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg Arg Gly Ala Ser Gly Ile Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 109 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 20 25 30 Pro Lys Pro Trp Ile Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Met Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 110 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 20 25 30 Pro Lys Pro Trp Ile Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 111 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Lys Pro Trp Ile Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 112 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 20 25 30 Pro Lys Pro Trp Ile Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ala Met Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 113 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Lys Pro Trp Ile Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ala Met Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 114 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Lys Pro Trp Ile Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ala Met Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His 1 5 10 <210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 118 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 35 40 45 Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr 50 55 60 Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val 65 70 75 80 Ser Ser <210> 119 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 35 40 45 Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr 50 55 60 Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 65 70 75 80 Ser Ser <210> 120 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 35 40 45 Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 50 55 60 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 65 70 75 80 Ser Ser <210> 121 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 35 40 45 Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 50 55 60 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 65 70 75 80 Ser Ser <210> 122 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 35 40 45 Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 50 55 60 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 65 70 75 80 Ser Ser <210> 123 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 35 40 45 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 50 55 60 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 65 70 75 80 Ser Ser <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Asn 1 5 10 <210> 125 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Arg Gly Ala Ser Gly Ile Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 127 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Lys Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Lys Pro Trp Ile Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ala Met Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 ggagacccaa gcttgttaac 20 <210> 129 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 cccagaggtg ctcttggag 19 <210> 130 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 tgttttcgta cgtcttgtcc gaagtgcagc tggtggagtc tg 42 <210> 131 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 gaacagcttg aaaactgagg acacagccgt gtattactgt gtgagac 47 <210> 132 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 aatacacggc tgtgtcctca gttttcaagc tgttcatttg cagatagagc atg 53 <210> 133 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 aattctgaat tctgaggaga cggtcactga ggttccttga cccc 44 <210> 134 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 cagccgtgta ttactgtgcg agacgggggg cttc 34 <210> 135 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 gaagcccccc gtctcgcaca gtaatacacg gctg 34 <210> 136 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 ggattggtgc agcctggcgg gtcattgaaa ctctc 35 <210> 137 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 gagagtttca atgacccgcc aggctgcacc aatcc 35 <210> 138 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 gaggctctgc acaaccgctt cacgcagaag agcctctcc 39 <210> 139 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 ggagaggctc ttctgcgtga agcggttgtg cagagcctc 39 <210> 140 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 gattcaaaaa acagcctcta tctgcaaatg aacaacttg 39 <210> 141 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 cagatagagg ctgttttttg aatcatctct ggagatgg 38 <210> 142 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 gagacccaag cttggtacc 19 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 ctgactttaa ctcctaacat g 21 <210> 144 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 aatcatgtct gcatctccag gggaaaaggt cacaatcact tgcagggcca gctc 54 <210> 145 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 caagtgattg tgaccttttc ccctggagat gcagacatga ttgctggaga ctgggag 57 <210> 146 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 acttataccg gtcagatcgt tctcacccag tctccagcaa tc 42 <210> 147 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 accagcagaa gccaggatcc cagcccaaac cctggatttc tg 42 <210> 148 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 cagcgcaatg gaggctgaag atgctgcc 28 <210> 149 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 ttgggctggg atcctggctt ctgctgg 27 <210> 150 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 cttcagcctc cattgcgctg attgtgagag agtaag 36 <210> 151 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 attaccttcg aaaagtgtac ttacgtttta tttccaggtt ggtcccccct ccgaac 56 <210> 152 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 attaccttcg aaaagtgtac ttacgtttta tttccagctt ggtcccccct ccgaac 56 <210> 153 <211> 80 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 153 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser 20 25 30 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 65 70 75 80 <210> 154 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Met Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp 50 55 60 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 65 70 75 80 <210> 155 <211> 80 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: CEA4-8A <400> 155 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 50 55 60 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 65 70 75 80 <210> 156 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Illustrative FR Best Fit peptide <400> 156 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Met Cys Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 50 55 60 Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 65 70 75 80 <210> 157 <211> 87 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 157 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Trp Val 20 25 30 Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Lys Ala Thr Leu 35 40 45 Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu 50 55 60 Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 85 <210> 158 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Trp Val 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Thr Ile 35 40 45 Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 50 55 60 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Gly Glu Tyr Asn Gly 65 70 75 80 Gly Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 159 <211> 87 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: A10 (045903) <400> 159 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Trp Val 20 25 30 Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Lys Ala Thr Leu 35 40 45 Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu 50 55 60 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 160 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Illustrative FR Best Fit peptide <400> 160 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Trp Val 20 25 30 Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Lys Ala Thr Leu 35 40 45 Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu 50 55 60 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 85 <210> 161 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Glu Gly 1 5 10 15 Asp Trp Val Ser Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 50 55 60 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 162 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 50 55 60 Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 163 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Illustrative Framework peptide <400> 163 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 50 55 60 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 164 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Illustrative FR Best Fit peptide <400> 164 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 50 55 60 Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 165 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Trp Val 20 25 30 Lys Gln Ser His Gly Met Asn Leu Glu Trp Ile Gly Lys Ala Thr Leu 35 40 45 Thr Val Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu 50 55 60 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 166 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Trp Val 20 25 30 Lys Gln Ser Pro Gly Met Asn Leu Glu Trp Ile Gly Lys Ala Thr Leu 35 40 45 Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 50 55 60 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 167 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Illustrative Framework peptide <400> 167 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu 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Ser Ser

Claims (41)

  1. a) 비-인간 항체 가변 (V) 도메인의 프레임워크 영역 (FR)의 아미노산 서열을 인간 항체 프레임워크 아미노산 서열, 또는 그의 단편의 수집물과 비교하고,
    b) 비-인간 FR에 최대의 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 FR 서열을 수집물로부터 선택하고,
    c) 비-인간 FR의 DNA를 돌연변이시켜 단계 b)로부터 선택된 인간 FR에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화된 FR (huFR)을 코딩하고,
    d) 비-인간 V 도메인 내의 각각의 FRs에 대해 단계 a) 내지 c)를 반복하여 각각의 DNA 서열이 인간화된 FR을 코딩하는 복수의 DNA 서열을 생산하고,
    e) 적어도 비-인간 항체의 V 도메인을 코딩하는 제 1 벡터 내로, 벡터에 의해 코딩된 상응하는 비-인간 FRs에 대한 단계 d)로부터의 각각의 huFR DNA 서열을 치환시키고(여기에서, 치환은 각각의 huFRs을 그의 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR)에 작동가능하게 연결시킨다);
    f) 인간화된 항체 V 도메인 또는 그의 단편를 만들도록 돕는 조건 하에서 숙주 세포 내에서 제 1 벡터를 발현시키는 것을 포함하는,
    인간화된 항체 가변 (V) 도메인 또는 그의 단편을 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, V 도메인 또는 단편이 비-인간 항체 경쇄로부터인 것인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 단계 a)의 경쇄 V 도메인의 프레임워크 영역 (FR)이 FR1인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 비-인간 항체 경쇄의 FR1 및 선택된 인간 FR 간의 서열 동일성이 적어도 약 70%인 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 단계 d)가 비-인간 경쇄 V 도메인의 제 2 프레임워크 영역 (FR2)을 수집물과 비교하고, 적어도 약 70%의 서열 동일성의 인간 FR을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 단계 d)가 비-인간 경쇄 V 도메인의 제 3 프레임워크 영역 (FR3)을 수집물과 비교하고, 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 인간 FR을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 d)가 비-인간 경쇄 V 도메인의 제 4 프레임워크 영역 (FR4)을 수집물과 비교하고, 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 인간 FR을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법. .
  8. 제 7항에 있어서, 인간화된 경쇄 V 도메인이 공유적으로 결합된 서열: huFRl-CDR1-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4 ; 또는 그의 단편을 포함하는 방법.
  9. 제 2항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 FR 내의 버니어(vernier) 구역 아미노산 잔기가 항체 경쇄 V 도메인의 비-인간 및 인간 FR에서 동일한 방법.
  10. 제 2항에 있어서, 제 1 벡터가 인간화된 경쇄 V 도메인에 공유적으로 결합된 인간 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 인간 경쇄 불변 도메인이 Cκ, Cγ 또는 그의 단편인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 인간화된 경쇄 단편이 약 95개 내지 약 235개 아미노산 의 아미노산 길이를 갖는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, V 도메인 또는 단편이 비인간 항체 중쇄로부터 유래되는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 단계 a)의 중쇄 V 도메인의 프레임워크 영역 (FR)이 FR1인 방법.
  15. 제 14항에 있어서, FR1 및 선택된 인간 프레임워크 FR 간의 서열 동일성이 적어도 약 70%인 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 단계 d)가 비-인간 중쇄 V 도메인의 제 2 프레임워크 영역 (FR2)을 수집물과 비교하고, 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 인간 FR을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 단계 d)가 비-인간 중쇄 V 도메인의 제 3 프레임워크 영역 (FR3)을 수집물에 비교하고, 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 인간 FR을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 단계 d)가 비-인간 중쇄 V 도메인의 제 4 프레임워크 영역 (FR4)을 수집물에 비교하고, 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 인간 FR을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 인간화된 경쇄 V 도메인이 공유적으로 결합된 서열:huFRl-CDRl-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4 또는 그의 단편을 포함하는 방법.
  20. 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 FR 내의 버니어 구역 아미노산 잔기가 항체 중쇄 V 도메인의 비-인간 및 인간 FR에서 동일한 방법.
  21. 제 13항에 있어서, 제 1 벡터가 인간화된 중쇄 V 도메인에 공유적으로 결합된 인간 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 인간 중쇄 불변 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입 중 하나인 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 인간 아미노산 서열의 수집물이 완전히 서열화된 인간 항체를 포함하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 수집물이 부분적으로 서열화된 인간 항체의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제 21항에 있어서, 인간화된 중쇄 단편이 약 95개 내지 약 540개 아미노산의 아미노산 길이를 갖는 방법.
  26. a) 비-인간 항체 경쇄 가변 (V) 도메인 프레임워크의 아미노산 서열(1-FR)을 인간 항체 경쇄 아미노산 서열 또는 그의 단편의 수집물과 비교하고,
    b) 1-FR에 대해 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 수집물로부터 인간 FR 서열을 선택하고,
    c) 1-FR의 DNA를 돌연변이시켜 단계 b)로부터 선택된 인간 FR에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 인간화된 FR (L-huFR)을 코딩하게 하고,
    d) 경쇄 V 도메인 내의 각각의 FRs에 대해 단계 a) 내지 c)를 반복하여 각각의 DNA 서열이 L-huFR을 코딩하는 복수의 DNA 서열을 생산하게 하고,
    e) 적어도 비-인간 항체의 경쇄 V 도메인을 코딩하는 제 1 벡터 내로, 벡터에 의해 코딩되는 상응하는 1-FRs에 대해 단계 d)로부터의 각각의 L-huFR DNA 서열를 치환하고(여기에서, 치환은 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR)에 각각의 L-huFRs를 작동가능하게 연결한다),
    f) 인간 항체 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 단편의 수집물에 대해 비-인간 항체 중쇄 가변 (V) 도메인 프레임워크 영역의 아미노산 서열(h-FR)을 비교하고,
    g) h-FR에 대한 최대의 아미노산 서열 동일성을 갖는 수집물로부터 인간 FR 서열을 선택하고,
    h) h-FR의 DNA를 돌연변이시켜 단계 g)로부터 선택된 인간 FR에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화된 중쇄 FR(H-huFR)을 코딩하게 하고,
    i) 비-인간 중쇄 V 도메인 내의 각각의 h-FRs에 대해 단계 f) 내지 h)를 반복하여 각각의 DNA 서열이 H-huFR을 코딩하는 복수의 DNA 서열을 생산하도록 하고,
    j) 적어도 비-인간 항체의 중쇄 V 도메인을 코딩하는 제 2 벡터 내로, 벡터에 의해 코딩된 상응하는 h-FRs에 대해 단계 i)로부터의 각각의 H-huFR DNA 서열을 치환하고(여기에서, 치환은 상응하는 중쇄 CDR에 각각의 H-huFRs을 작동가능하게 연결시킨다);
    k) 제 1 및 제 2 벡터를 인간화된 경쇄 및 중쇄를 생산하고 인간화된 항체 또는 그의 단편를 만들도록 돕는 조건하에서 동일한 숙주세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는 인간화된 항체 또는 그의 단편을 만드는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 인간화된 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편를 코딩하는 DNAs가 단일한 벡터 상에 함유되고, 동일한 숙주 내에서 같이 발현되는 방법.
  28. 제 26항 및 제 27항에 있어서, 숙주가 포유동물, 식물, 조류 또는 미생물인 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 제 1 벡터가 인간화된 경쇄 V 도메인에 공유적으로 결합된 인간 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 경쇄 불변 도메인이 Cκ, Cγ 또는 그의 단편인 방법.
  31. 제 26항에 있어서, 제 2 벡터가 인간화된 중쇄 V 도메인에 공유적으로 결합된 인간 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 인간 중쇄 불변 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입 중 하나인 방법.
  33. 제 26항 또는 제 27항에 있어서, 숙주 세포로부터 인간화된 항체를 정제하여 항체의 실질적으로 순수한 제조물을 생산하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 실질적으로 정제된 인간화된 항체가 모 비-인간 항체보다 약 10배 이상의 친화성을 가지며 항원에 특이적으로 결합하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 모 비-인간 항체가 키메라인 방법.
  36. 제 33항에 있어서, 항체가 리포테코산을 특이적으로 인식하고 결합하는 방법.
  37. 제 33항에 있어서, 항체가 인간 조직 인자를 특이적으로 인식하고 결합하는 방법.
  38. 제 33항에 있어서, 인간화된 항체가 인간 또는 동물에서의 질환을 치료하기 위한 치료학적 제품으로서 사용되는 방법.
  39. 제 33항에 있어서, 인간화된 항체가 진단 제품으로서 이용되는 방법.
  40. 제 26항에 있어서, 인간화된 V 도메인로부터 인간화된 단일-쇄 항체 (sc-Fv)를 만드는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제 26항, 제 27항 또는 제 33항에 있어서, 인간화된 항체의 단편이 F(ab')2, Fab' 또는 Fab 중 하나인 방법.
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