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KR20050024397A - 리간드 - Google Patents

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KR20050024397A
KR20050024397A KR10-2004-7021231A KR20047021231A KR20050024397A KR 20050024397 A KR20050024397 A KR 20050024397A KR 20047021231 A KR20047021231 A KR 20047021231A KR 20050024397 A KR20050024397 A KR 20050024397A
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KR
South Korea
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ligand
domain
binding
specific
mutable
Prior art date
Application number
KR10-2004-7021231A
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Inventor
윈터그렉
톰린슨이안
이그나토비치올가
홀트루시
드안젤리스엘레나
Original Assignee
도만티스 리미티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 첫 번째 결합 특이성을 지닌 첫 번째 면역글로불린 변이가능 도메인 및 두 번째 결합 특이성을 지닌 상보성 또는 비-상보성 면역글로불린 변이가능 도메인을 포함한 이중-특이적 리간드를 제공한다.

Description

리간드{Ligand}
본 발명은 이중 특이적 리간드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 첫 번째 항원 또는 에피토프(epitope)에 결합하는 첫 번째 면역글로불린 단일 변이가능 도메인 및 두 번째 항원 또는 에피토프에 결합하는 두 번째 면역글로불린 단일 변이가능 도메인을 포함한 이중-특이적 리간드의 제조방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 생체 내에서 리간드 반감기를 증가시키도록 작용하는 적어도 하나 이상의 첫 번째 및 두 번째 항원 또는 에피토프(epitope)에 결합하는 이중-특이적 리간드에 관한 것이다. 하나 이상의 결합 특이성을 포함한 개방 및 폐쇄 형태 리간드가 기술된다.
항체의 항원 결합 도메인은 2가지 별개의 구역을 포함한다 : 헤비 변이가능 도메인(VH) 및 라이트 체인 변이가능 도메인(VL : Vκ 또는 Vλ가 될 수 있음). 항원 결합 사이트 자체는 6개 폴리펩타이드 루브(loop)에 의해 형성된다 : 3개는 VH 도메인으로부터(H1, H2 및 H3), 3개는 VL 도메인으로부터(L1, L2 및 L3). VH 및 VL 도메인을 인코드하는 V 유전자의 다른 1차 레퍼토리(repertory) 유전자 세그먼트의 조합성 재배열에 의해 제조된다. VH 유전자는 3개의 세그먼트, VH, D 및 JH 의 재조합에 의해 제조된다. 인간의 경우 하플로타입(haplotype)에 따라 다르게 약 51개의 기능성 VH 세그먼트(Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today, 16: 237), 25개 기능성 D 세그먼트(Corbett et al., (1997) J. Mol. Biol., 268: 69) 및 6개 기능성 JH 세그먼트(Ravetch et al., (1981) Cell, 27:583)가 존재한다. VH 세그먼트는 VH 도메인의 첫 번째 및 두 번째 항원 결합 루프(H1 및 H2)을 형성하는 폴리펩타이드 체인의 구역을 인코드하고, VH, D 및 JH 세그먼트는 결합하여 VH 도메인의 세 번째 항원 결합 루프(H3)를 형성한다. VL 유전자는 단지 2개의 유전자 세그먼트, VL 및 JL의 재조합에 의해 제조된다. 인간의 경우 하플로타입에 따라 다르게 약 40개의 기능성 Vκ 세그먼트(Schable and Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31개의 기능성 Vλ 세그먼트(Williams et al., (1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al., (1997) Genome Res., 7: 250), 5개의 기능성 Jκ 세그먼트(Hieter et al., (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516) 및 4개의 기능성 J λ 세그먼트(Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med., 172: 609)가 존재한다. VL 세그먼트는 VL 도메인의 첫 번째 및 두 번째 항원 결합 루프(L1 및 L2)을 형성하는 폴리펩타이드 체인의 구역을 인코드하고, VL 및 JL 세그먼트는 결합하여 VL 도메인의 세 번째 항원 결합 루프(L3)를 형성한다. 이러한 1차 레퍼토리로부터 선택된 항체는 적어도 보통 정도의 친화력으로 거의 모든 항원에 결합하기에 충분히 다양한 것으로 여겨진다. 높은 친화력 항체는 증가된 결합에 기초한 면역 시스템에 의해 점돌연변이가 생성되고 선택되는, 재배열된 유전자의 "친화력 성숙"에 의해 생성된다.
항체의 구조 및 서열의 분석은 6개의 항원 결합 루프 중 5개(H1, H2, L1, L2, L3)는 제한된 수의 메인-체인 형태(conformation) 또는 규범적(canonical) 구조를 보유하는 것으로 나타났다(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol, 196: 901; Chothia et al., (1989) Nature, 342: 877). 메인-체인 형태는 항원 결합 루프 및 항체 프레임워크(framework) 내의 특정 주요 위치에서의 (ⅰ) 항원 결합 루프의 길이 및 (ⅱ) 특정 잔기 또는 잔기 타입에 의해 특정된다. 루프 길이 및 주요 잔기의 분석은 대부분의 인간 항체 서열에 의해 인코드되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 메인-체인 형태를 예측할 수 있게 하였다(Chothia et al., (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al., (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al., (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). H3 구역이 서열, 길이 및 구조면에서 훨씬 더 다양하나(D 세그먼트의 이용에 기인하여) 이는 또한 루프 및 항체 프리엠워크 내의 주요한 위치에서 특정 잔기의 길이 및 존재 또는 잔기 형태에 따라 달리 짧은 루프 길이에 대한 제한된 수의 메인-체인 형태를 형성한다(Martin et al., (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al, (1996) FEBS Letters, 399: 1).
VH 및 VL 구역의 상보적 쌍을 포함한 이중특이적 항체는 당분야에 알려져 있다. 이들 이중특이적 항체는 각각의 VH/VL 쌍이 단일 항원 또는 에피토프에 결합하는 2쌍의 VH 및 VL을 포함해야 한다. 기술된 방법은 하이브리드 하이브리도마스(hybrid hybridomas)(Milstein & Cuello AC, Nature 305:537-40), 미니바디스(minibodies)(Hu et al., (1996) Cancer Res 6448:3055-3061), 디아바디스(diabodies)(Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; WO 94/13804), 킬레이팅 재조합 항체(CRAbs; (Neri et al., (1995) J. Mol. Biol. 246:367-373), biscFv(즉, Atwell et al., (1996) Mol. Immunol. 33:1301-1312), 항체 내에서 안정화된 "knobs in holes"(Carter et al., (1997) Protein Sci. 6:781-788)을 포함한다. 각각의 경우 각각의 항체 종류는 2개의 항원-결합 사이트를 포함하고, 각각은 VH 및 VL 도메인 상보적 쌍에 의해 형성된다. 따라서 각 항체는 VH 및 그의 상보적 VL 도메인에 의해 매개된 각 항원 또는 에피토프에 결합하면서 동시에 2개의 다른 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 이들 기술의 각각은 특정한 단점을 제공한다; 하이브리드 하이브리도마스의 경우 불활성 VH/VL 쌍은 이중특이적 IgG의 프랙션을 크게 감소시킬 수 있다. 더욱이 대부분의 이중특이적 접근은 2개의 다른 VH/VL 결합 사이트를 재현하는 다른 VH/VL 쌍의 결합 또는 VH 및 VL 체인의 결합에 따라 다르다. 따라서 집합된 분자 내 각 항원 또느 에피토프에 대한 결합 사이트의 비율을 조절하는 것이 불가능하고 따라서 많은 집합된 분자는 다른 것이 아닌 하나의 항원 또는 에피토프에 결합할 것이다. 일부의 경우 둘 모두의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 사이트를 지닌 분자의 수를 증가시키기 위해 서브-유니트 인터페이스에서(Carter et al., 1997) 헤비 또는 라이트 체인을 설계하는 것이 가능하였으나 이는 둘 모두의 항원 또는 에피토프에 결합한 모든 분자를 유발하지는 않았다.
2개의 다른 항체 결합 특이성이 동일한 결합 사이트에 통합될 수 있다는 일부 증거가 있으나, 이들은 일반적으로 구조적으로 관련된 항원 또는 에피토프 또는 광범위하게 교차-반응성 항체에 반응하는 2 이상의 특이성을 나타낸다. 예를 들어 교차-반응성 항체가 기술되었고, 일반적으로 2개의 항원은 암탉 계란 백색 리소자임 및 칠면조 리소자임(McCafferty et al., WO 92/01047)과 같이 서열 및 구조면에서 또는 자유 합텐(hapten) 및 담체에 컨쥬게이트된 합텐(Griffiths AD et al., EMBO J (1994) 13:143245-60)에 관련된다. 또다른 예로 WO 02/02773(Abbott Laboratories)은 "이중 특이성"을 지닌 항체 분자를 기술한다. 항체 분자는 다수의 항원에 대해 생성거나 선택된 항체이고, 이들 특이성은 단일 이상의 항원을 스팬(span)한다. WO 02/02773의 항체 내 각각의 상보적 VH/VL 쌍은 2 이상의 구조적으로 관려된 항원에 대한 단일 결합 특이성을 명시한다; 이러한 상보적 쌍 내의 VH 및 VL 도메인은 각각 별개의 특이성을 보유하지 않는다. 따라서 항체는 구조적으로 관련된 2개 항원을 포함하는 광범위한 단일 특이성을 지닌다. 더욱이 구조적으로 관련되지 않은 적어도 2 이상(일반적으로 그 이상)의 다른 항원 또는 에피토프와 반응하는 다중반응성(Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7:515-531) 자연적 자가항체가 기술된다. 단일클론 항체 상의 파지 디스플레이 기술을 이용한 무작위 펩타이드 레퍼토리의 선택이 항원 결합 사이트에 맞는 펩타이드 서열 범위를 확인할 것임이 나타났다. 일부의 서열은 매우 관련되어 컨센서스 서열과 맞은 반면, 다른 것은 매우 다르고 미모토프(mimotope)로 불린다(Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology (1993), 5:268-271). 따라서 결합되고 상보적인 VH 및 VL 도메인을 포함한 자연적 4개-체인 항체가 다수의 알려진 항원으로부터의 많은 다른 항원에 결합하는 잠재력을 지님이 분명하다. 동일한 항체 내에서 주어진 다른 항원에 대한 결합 사이트를 어떻게 생성하는지는 아직 분명하지 않고, 특히 이들이 항상 구조적으로 관련되지 않는다.
단백질 공학 방법은 이러한 문제를 지님을 나타내었다. 예를 들어 촉매 항체가 하나의 변이가능 도메인을 통한 금속 이온에 대한 결합 활성 및 금속 이온 및 상보적 변이가능 도메인에 대한 접촉을 통한 합텐(hapten)(기질)에 대한 결합 활성을 지니면서 생성될 수 있음이 제안되었다(Barbas et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6385-6389). 그러나 이러한 경우 기질(첫번째 항원)의 결합 및 촉매는 금속 이온(두번째 항원)의 결합을 필요로함이 제안된다. 따라서 VH/VL 쌍의 결합은 단일이나 다수-성분 항원에 관련된다.
하나의 항원에 대한 결합 접촉이 하나의 변이가능 도메인 내에서 생성되고 두 번째 항원의 경우 두 번째 변이가능 도메인 내에서 생성되는 카멜 항체 헤비 체인 단일 도메인으로부터의 이중특이적 항체 생성에 대한 방법이 기술되었다. 그러나 변이가능 도메인은 상보적이지 않았다. 따라서 첫 번째 헤비 체인 변이가능 도메인은 첫 번째 항원에 대해, 두 번째 헤비 체인 변이가능 도메인은 두 번째 항원에 대해 선택된 후, 이 둘 모두의 도메인은 동일한 체인 상에서 함께 결합하여 이중 항체 단편을 제공한다(Conrath et al., J. Biol. Chem. 270:27589-27594). 그러나 카멜 헤비 체인 단일 도메인은 라이트 체인을 지니지 않는 자연적 카멜 항체와 다르다는 점에서 특이적이고, 실제로 헤비 체인 단일 도메인은 상보적 VH 및 VL 쌍을 형성하기 위해 카멜 라이트 체인과 결합할 수 없다.
일반적으로 라이트 체인과 결합된 자연적 항체와 다른 단일 헤비 체인 변이가능 도메인이 기술되었다(단일클론 항체로부터 또는 도메인의 레퍼토리로부터; EP-A-0368684 참조). 이들 헤비 체인 변이가능 도메인은 하나 이상의 관련된 항원과 특이적으로 상호작용하나 2 이상의 다른 항원에 대한 특이성을 지닌 리간드를 생성하기 위해 다른 헤비 또는 라이트 체인 변이가능 도메인과 결합하여하지는 않는 것으로 나타났다. 더욱이 이들 단일 도메인은 매우 짧은 생체 내 반감기를 지니는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 도메인은 제한된 치료적 가치를 지닌다.
다른 특이성의 헤비 체인 변이가능 도메인을 함께 결합시킴으로서(상기 기술된 바와 같이) 이중특이적 항체 단편을 제조하는 것이 제안되었다. 이러한 접근의 단점은 분리된 항체 변이가능 도메인이 일반적으로 라이트 체인과의 상호작용을 유발하고 용매에 노출되는 소수성 인터페이스를 지니고, "끈적"거려서 단일 도메인이 소수성 표면에 결합할 수 있게 하는 것이다. 더욱이파트너 라이트 체인의 부재시 2 이상의 다른 헤비 체인 변이가능 도메인의 조합 및 그들의 결합은 가능하게는 소수성 인터페이스를 통해 분리되어 결합할 수 있는 리간드 모두가 아닌 하나에 결합하는 것을 방지한다. 더욱이 이러한 경우 헤비 체인 변이가능 도메인은 상보성 라이트 체인 변이가능 도메인과 결합될 것이고 따라서 덜 안정적이고 용이하게 언폴드(unfold)된다(Worn & Pluckthum, 1998 Biochemistry 37:13120-7).
발명의 요약
본 발명은 국제 특허 출원번호 WO 03/002609호 뿐만 아니라 상응하는 공보되지 않은 영국 특허 출원번호 제0230203.2호에서 각각 다른 특이성을 지닌 면역글로불린 단일 변이가능 도메인을 포함한 이중 특이적 면역글로불린 리간드를 기술하였다. 도메인은 서로 경쟁하거나 독립적으로 작용하여 타겟 분자 상의 항원 또는 에피토프에 결합한다.
첫 번째 형상에서 본 발명은 본 발명자에 의해 개발된 더욱 개선된 이중 특이적 리간드를 제공하고, 본 리간드의 하나의 특이성은 이에 결합함으로서 리간드의 반감기를 증가시키는 작용을 할 수 있는 생물체 내의 생체 내에 존재하는 단백질 또는 펩타이드를 향해 지시된다.
따라서 첫 번째 관점에서 첫 번째 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닌 첫 번째 면역글로불린 단일 변이가능 도메인 및 두 번째 항원 또는 에피토프에 대한 결합 활성을 지닌 두 번째 상보적 면역글로불린 단일 변이가능 도메인을 포함하는 이중-특이적 리간드가 제공되고, 상기 이중 특이적 리간드가 항-HSA VH 도메인 및 항-β갈락토시다제 Vκ도메인으로 구성되지 않은 경우 상기 항원 또는 에피토프의 하나 또는 둘 모두는 생체 내에서 리간드의 반감기를 증가시키는 작용을 함을 특징으로 하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 도메인은 동일한 특이성을 공유하는 상호 상보적 도메인을 지니지 않음을 특징으로 한다. 바람직하게는, 첫 번째 및 두 번째 변이가능 도메인 모두 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)에 결합하지 않는다.
여기에 기술된 바와 같이 리간드의 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프는 유리하게는 생체 내 생물체 내에서 발견된 단백질 또는 폴리펩타이드 상에 제공된다. 예는 세포외 매트릭스 단백질, 혈액 단백질 및 생물체의 다양한 조직 내에 존재하는 단백질을 포함한다. 본 단백질은 예를 들어 벌킹제(bulking agent)로서 작용함으로서 또는 리간드를 작용 목적 사이트에 고착시킴으로서 혈액으로부터 리간드 제거(clearance) 속도를 감소시키는 작용을 한다. 생체 내 반감기를 증가시키는 항원/에피토프의 예는 하기 부록 1에 나타나 있다.
증가된 반감기는 면역글로불린의 생체 내 적용, 특히 항체 및 가장 특별하게는 작은 크기의 항체 단편에 유용하다. 이러한 단편(Fvs, 2황화물 결합된 Fvs, Fabs, scFvs, dAbs)은 신체로부터의 빠른 제거가 진행되고, 따라서 대부분의 신체 부위에 빠르게 도달하고 신속하게 제조되고 조작이 용이하고, 생체 내 적용이 생체 내 간단한 지속성에 의해서만 제한된다. 본 발명은 생체 내 리간드의 증가된 반감기를 제공함으로서 이러한 문제점을 해결하고 결과적으로 리간드의 기능적 활성의 신체 내 더 긴 지속 시간을 제공한다.
약물 동력학 분석 방법 및 리간드 반감기 측정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상세한 설명은 Kenneth A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 및 Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)에 나타나 있다. 참고문헌은 t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선 아래 면적(area under curve, AUC)와 같은 약물 동력학적 파라미터를 기술한 "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published Marcel Dekker, 2nd Rev. ex eddition (1982)이다.
반감기(t1/2 알파 및 t1/2 베타) 및 AUC는 시간에 대한 리간드의 혈청 농도 곡선으로부터 측정될 수 있다. 예를 들어 WinNonlin 분석 팩키지(Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA)가 곡선을 모델링하는데 사용될 수 있다. 첫 번째 페이스(phase)에서(알파 페이스) 리간드는 일부 배출되고 주로 환자에 분포된다. 리간드가 분포되면 두 번째 페이스(베타 페이스)는 말단 페이스이고 혈청 농도는 리간드가 환자로부터 제거됨에 따라 감소된다. t 알파 반감기는 첫 번째 페이스의 반감기이고 t 베타 반감기는 두 번째 페이스의 반감기이다. 따라서 유리하게는 본 발명은 15 분 이상의 범위의 tα반감기를 지닌 본 발명에 따른 리간드를 포함한 리간드 또는 조성물을 제공한다. 하나의 실시태양에서 범위의 하위 말단은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 더욱이 또는 대안으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12시간까지를 포함한 범위의 tα반감기를 지닐 것이다. 하나의 실시태양에서 범위의 상위 말단은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적당한 범위의 예는 1∼6시간, 2∼5시간 또는 3∼4시간이다.
유리하게는, 본 발명은 2.5 시간 이상의 범위의 tβ반감기를 지닌 본 발명에 따른 리간드를 포함한 리간드 또는 조성물을 제공한다. 하나의 실시태양에서 범위의 하위 말단은 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 더욱이 또는 대안으로 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 21일까지를 포함한 범위의 tβ반감기를 지닐 것이다. 하나의 실시태양에서 범위의 상위 말단은 5시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 또는 20일이다. 유리하게는 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12∼60시간 범위의 tβ반감기를 지닐 것이다. 또다른 실시태양에서 12∼48시간 범위일 것이다. 또다른 실시태양에서 12∼26시간이다.
상기 기준에 더하여 또는 대안으로 본 발명은 1 mg.min/ml 또는 그 이상의 범위의 AUC(area under curve) 수치를 지닌 본 발명에 따른 리간드를 포함한 리간드 또는 조성물을 제공한다. 하나의 실시태양에서 범위의 하위 말단은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg.min/ml이다. 더욱이 또는 대안으로 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 600 mg.min/ml까지의 범위 내 AUC를 지닌다. 하나의 실시태양에서 범위의 상위 말단은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg.min/ml이다. 유리하게는 본 발명에 따른 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 범위의 AUC를 지닐 것이다: 15∼150 mg.min/ml, 15∼75 mg.min/ml 및 15∼50 mg.min/ml.
첫 번째 실시태양에서 이중 특이적 리간드는 2개의 상보적 변이가능 도메인을 포함한다, 즉 본 발명의 배경 내에서 동족(congate) 에피토프에 개별적으로 결합하더라도 자연적 환경 내에서 2개의 변이가능 도메인은 동족 쌍 또는 그룹으로서 함께 작용할 수 있다. 예를 들어 상보적 변이가능 도메인은 면역글로불린 헤비 체인 및 라이트 체인 변이가능 도메인(VH 및 VL)이다. VH 및 VL 도메인은 scFv 또는 Fab 항체 단편에 의해 유리하게 제공된다. 변이가능 도메인은 함께 결합하여: 예를 들어 각 V 도메인의 C-말단에서의 힌지(hinge) 구역 및 힌지 구역 내 시스테인 사이의 2황화물 결합의 공급; 또는 도메인의 C-말단에서 각각 시스테인을 지닌 dAbs의 공급, 시스테인은 함께 2황화물 결합됨; 또는 Fab 포맷을 위한 V-CH & V-CL의 생성; 또는 이량체, 삼량체 및 더한 다량체를 생성하는 펩타이드 링커(예를 들어 하기 기술된 Gly4Ser 링커)에 의해 다가의 리간드를 형성한다.
본 발명자는 상보적 변이가능 도메인의 이용은 2개의 도메인 표면이 함께 팩킹되고 용매로부터 분리될 수 있음을 발견하였다. 더욱이 상보적 도메인은 서로 안정화할 수 있다. 더욱이 이는 선행기술에서 사용되는 하이브리드 하이브리도마스의 단점없이 이중-특이적 IgG 항체의 생성 또는 서브-유니트 인터페이스에서의 헤비 또는 라이트 체인 설계의 필요성을 가능하게 한다. 본 발명의 첫 번째 관점의 이중-특이적 리간드는 적어도 하나 이상의 VH/VL 쌍을 지닌다. 따라서 본 발명에 따른 이중특이적 IgG는 2개의 쌍을 포함할 것이고, 한 쌍은 Y-형태 분자의 각 팔(arm) 상에 있다. 따라서 통상의 이중특이적 항체 또는 디아바디스(diabodies)와 달리 이용되는 체인의 비율은 그의 제조 성공에 따라 결정되고 실행적 어려움을 이끌고, 본 발명의 이중 특이적 리간드는 체인 균형의 이슈로부터 자유롭다. 통상의 이중-특이적 항체 내의 체인 불균형은 2개의 다른 VL 체인과 2개의 다른 VH 체인의 결합을 유발하고, VH 체인 1과 함께 VL 체인 1은 항원 또는 에피토프 1에 결합할 수 있고, VH 체인 2와 함께 VL 체인 2는 항원 또는 에피토프 2에 결합할 수 있고, 2개의 정확한 쌍 형성은 서로 결합되는 방식이다. 따라서 단일 분자 내에서 VL 체인 1이 VH 체인 1과 쌍을 이루고, VL 체인 2가 VH 체인 2와 쌍을 이룰 때만 이중-특이성이 생성된다. 이러한 이중-특이적 분자는 2개의 다른 방식으로 생성될 수 있다. 먼저, 이들은 다른 항원 또는 에피토프에 각각 결합하는 2개의 현존하는 VH/VL 쌍의 결합에 의해 생성될 수 있다(예를 들어 이중-특이적 IgG 내에서). 이러한 경우 VH/VL 쌍 형성은 모두 이중-특이적인 분자의 집단을 생성하기 위해 1 : 1의 비율로 함께 나타나야 한다. 이는 결코 발생하지 않고(상보적 CH 도메인이 "knobs into holes" 공학에 의해 강화되더라도) 이중-특이적 분자와 다른 것이 아닌 하나의 항원 또는 에피토프에만 결합할 수 있는 분자의 혼합물을 이끈다. 이중-특이적 항체를 생성하는 두 번째 방법은 2개의 다른 VH 체인과 2개의 다른 VL 체인의 동시 결합에 의한 것이다(예를 들어 이중-특이적 디아바디(diabody)). 이러한 경우 VH 체인 1과 쌍을 이루는 VL 체인 1 및 VH 체인 2와 쌍을 이루는 VL 체인 2에 대한 선호도가 존재하더라도(VL 및 VH 도메인의 "knobs into holes" 공학에 의해 강화될 수 있음) 이러한 쌍 형성은 모든 분자에서 달성될 수 없고, 이는 항원 또는 에피토프에 결합할 수 없는 부정확한 쌍 형성이 발생하는 혼합된 포뮬레이션을 이끈다.
본 발명의 첫 번째 관점에 따른 이중-특이적 리간드 접근에 다라 구조된 이중-특이적 항체는 항원 또는 에피토프 1에 대한 결합이 VH 또는 VL 도메인 내에 존재하고, 항원 또는 에피토프 2에 대한 결합이 상보적인 VH 또는 VL 도메인 내에 존재하기 때문에 이들 문제점을 극복한다. 모든 VH/VL 쌍 형성에 기초하여 1 : 1 비율의 VH 및 VL 도메인 쌍이 이중-특이적이고, 따라서 이들 VH/VL 쌍 형성을 이용하여 구조된 모든 포맷(Fv, scFvs, Fabs, 미니바디(minibodies), IgGs 등)은 100% 이중-특이적 활성을 지닐 것이다.
본 발명의 배경 내에서 첫 번째 및 두 번째 "에피토프"는 동일하지 않고 단일 단일특이적 리간드에 의해 결합되지 않은 에피토프로 이해된다. 본 발명의 첫 번째 형상에서 이들은 유리하게는 다른 항원이고, 이들의 하나는 생체 내에서 리간드 반감기를 증가시키는 작용을 한다. 이와 달리, 첫 번째 및 두 번째 항원은 유리하게는 동일하지 않다.
본 발명의 이중 특이적 리간드는 WO 02/02773에 기술된 바와 같이 리간드를 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 리간드는 어떠한 하나 이상의 항원 또는 에피토프에도 동시-실시가능하게 결합하는 상보적 VH/VL 쌍을 포함하지 않는다. 대신에 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 리간드는 VH/VL 상보적 쌍을 포함하고, V 도메인은 다른 특이성을 지님을 특징으로 한다.
더욱이 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 리간드는 비-구조적으로 관련된 에피토프 또는 항원에 대해 다른 특이성을 지닌 VH/VL 상보적 쌍을 포함한다. 구조적으로 관련된 에피토프 또는 항원은 항원 또는 에피토프에 결합하도록 동시-실시가능 형태로 작용하는 통상의 VH/VL 상보적 쌍에 의해 결합되는 충분한 구조적 유사성을 지닌 에피노프 또는 항원이고; 구조적으로 관련된 에피토프의 경우 에피토프는 VH/VL 이량체의 항원 결합 사이트에서 형성된 동일한 결합 포켓 내에 "꼭 맞는" 충분히 유사한 구조이다.
두 번째 관점에서 본 발명은 첫 번째 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 지닌 첫 번째 면역글로불린 변이가능 도메인 및 두 번째 항원 또는 에피토프 결합 특이성을지닌 두 번째 면역글로불린 변이가능 도메인을 포함한 리간드를 제공하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 변이가능 도메인의 하나 또는 둘 모두는 생체 내 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 결합하고, 변이가능 도메인은 서로 상보적이지 않음을 특징으로 한다.
하나의 실시태양에서 하나의 변이가능 도메인에 대한 결합은 두 번째 변이가능 도메인에 대한 리간드의 결합을 조절한다.
이러한 실시태양에서 변이가능 도메인은 예를 들어 VH 도메인 쌍 또는 VL 도메인 쌍이다. 첫 번째 사이트에서의 항원 결합은 두 번째 사이트에서의 항원 결합을 증가시키거나 억제하는 것과 같이 조절한다. 예를 들어 첫 번째 사이트에서의 결합은 두 번째 사이트에서의 항원 결합을 적어도 부분적으로 억제한다. 이러한 실시태양에서 리간드는 예를 들어 두 번째 타겟 항원에 결합하게 되고 반감기 증가 단백질로부터 분리됨에 따라 이러한 시간까지 리간드의 반감기를 증가시키는 단백질에 결합함으로서 생체 내 피험 생물체의 신체 내에서 유지된다.
상기 배경 내 결합 조절은 서로에 대한 항원 결합 사이트의 구조적 근접성의 결과로서 달성된다. 이러한 구조적 근접성은 2 이상의 항원 결합 사이트를 결합시키는 자연적인 구조적 성분 즉, 밀접한 근접성으로 항원 결합 사이트를 보유하는 매우 견고한 구조를 지닌 리간드의 공급에 의해 달성될 수 있다. 유리하게는, 2 이상의 항원 결합 사이트는 서로 물리적으로 밀접한 근접성이어서 면역글로불린 분자 내 입체적 방해 및/또는 형태적 변화를 포함한 과정에 의해 하나의 사이트가 다른 사이트에서의 항원 결합을 조절하게 된다.
첫 번째 및 두 번째 결합 도메인은 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합된다. 도메인이 공유결합으로 결합된 경우 결합은 예를 들어 2황화물 결합에 의해 또는 (Gly4Ser) n=1∼8 즉, 2, 3, 4, 5 또는 7과 같은 폴리펩타이드 링커에 의해 매개된다.
본 발명에 따른 리간드는 비-면역글로불린 다중-리간드 구조에 결합되어 다가의 복합체를 형성하고, 이는 동일한 항원을 지닌 타겟 분자에 결합하여 우수한 화합력(avidity)을 제공하고, 적어도 하나 이상의 변이가능 도메인이 항원에 결합하여 다량체의 반감기를 증가시킨다. 예를 들어 SpA와 같은 자연적 박테리아성 수용체는 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드를 생성하기 위해 CDRs의 이식을 위한 뼈대로서 이용되었다. 이러한 절차의 상세한 설명은 미국특허 제5,831,012호에 기술되어 있다. 다른 적당한 뼈대는 피브로넥틴(fibronectin) 및 어피바디(affibody)에 기초한 것을 포함한다. 적당한 절차의 상세한 설명은 WO 98/58965에 기술되어 있다. 다른 적당한 뼈대는 van den Beuken et al., J Mol. Biol. (2001) 310:591-601에 기술된 리포칼린(lipocallin) 및 CTLA4을 포함하고, 박테리아 GroEL 또는 다른 샤프롱(chaperone) 폴리펩타이드의 고리 구조 상에 기초한 WO 0069907(Medical Research Council)에 기술된 것과 같은 뼈대를 포함한다.
단백질 뼈대는 결합된다; 예를 들어 CDRs는 CTLA4 뼈대 상에 이식되고 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인과 함께 사용되어 리간드를 형성한다. 이와 유사하게 피브로넥틴, 리포칼린 및 다른 뼈대가 결합된다.
여기에 기술된 바와 같이 파지 디스플레이 기술을 이용할 때 변이가능 도메인은 V-유전자 레퍼토리로부터 선택된 경우 이들 변이가능 도메인은 보편적인 프레임워크 구역을 포함할 수 있어서 여기에 논의된 바와 같이 특이적 일반적 리간드에 의해 인식되게 된다. 보편적 프레임워크, 일반적 리간드 등의 이용은 WO 99/20749에 기술되어 있다. 본 발명에서 파지 디스플레이에 대한 참조는 파지 및/또는 파지미드(phagemid)의 모두의 이용을 포함한다.
V-유전자 레퍼토리가 폴리펩타이드 서열 내에 다양하게 사용되는 곳은 바람직하게는 변이가능 도메인의 구조적 루프 내에 위치한다. 변이가능 도메인의 폴리펩타이드 서열은 각 변이가능 도메인의 상보적 쌍과의 상호작용을 증가시키기 위해 DNA 셔플링(shuffling) 또는 돌연변이에 의해 변화된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 '이중-특이적 리간드'는 단일 체인 Fv 단편이다. 본 발명의 대안적 실시태양에서 '이중-특이적 리간드'는 항체의 Fab 구역으로 구성된다. "Fab 구역"이라는 용어는 2개의 VH 또는 2개의 VL 도메인이 사용된 Fab-유사 구역을 포함한다.
변이가능 구역은 타겟 항원 또는 에피토프에 대해 지시된 항체로부터 유래된다. 대안으로, 이들은 섬질성 박테리오파지 표면 상에 발현된 것과 같은 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유도된다. 선택은 하기 기술된 바와 같이 수행된다.
세 번째 관점에서 본 발명은 첫 번재 결합 특이성을 지닌 첫 번째 면역글로불린 단일 변이가능 도메인 및 두 번째(다른) 결합 특이성을 지닌 두 번째 단일 면역글로불린 단일 변이가능 도메인을 포함한 리간드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 결합 특이성의 하나 또는 둘 모두는 생체 내에서 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 대해 특이적임을 특징으로 하고, 상기 방법은 :
(a) 첫 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 첫 번째 변이가능 도메인을 선택하는 단계;
(b) 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 두 번째 변이가능 구역을 선택하는 단계;
(c) 변이가능 도메인을 결합하는 단계; 및
(d) 상기 첫 번째 에피토프 및 상기 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 리간드를 선택하는 단계로 구성된다.
리간드는 첫 번째 및 두 번째 에피토프에 동시에 결합할 수 있거나, 에피토프 결합을 위한 결합 도메인 사이의 경쟁시 하나의 도메인의 결합이 그의 동족 에피토프에 대한 다른 도메인의 결합을 방해한다. 따라서 하나의 실시태양에서 상기 단계 (d)는 첫 번째 및 두 번째(및 가능한 더욱) 에피토프에 대한 동시 결합을 필요로하고; 또다른 실시태양에서 첫 번째 및 두 번째 에피토프에 대한 결합은 동시에 발생하지 않는다.
에피토프는 바람직하게는 별개의 항원 상에 있다.
리간드는 유리하게는 상기 기술된 바와 같이 면역글로불린 변이가능 도메인의 VH/VL 결합 또는 VH/VH 또는 VL/VL 결합을 포함한다. 더욱이 생체 내에서 리간드 반감기를 증가시키는 항원에 대한 특이성의 이용을 기술하지 않은 Conrath et al.,(2001) JBC 276:7346-7350 및 WO99/23221에 기술된 바와 같이 생체 내에서 리간드 반감기를 증가시키는 항원에 대해 특이적인 VHH 도메인이 암탉 계란 백색 리소자임(HEL), 돼지 췌장 알파-아밀라제 또는 NmC-A; hcg, BSA-결합된 RR6 아조 염료 또는 S. mutans HG982 세포와 결합하지 않은 경우 리간드는 카멜리드(camelid) VHH 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 첫 번째 변이가능 도메인은 상보적 변이가능 도메인의 부재시 상기 첫 번째 에피토프로의 결합에 대해 선택된다. 또다른 실시태양에서 상기 첫 번째 변이가능 도메인은 세 번째 변이가능 도메인이 두 번째 변이가능 도메인과 다르고 첫 번째 도메인에 상보적인 경우 세 번째 변이가능 도메인의 존재시 상기 첫 번째 에피토프/항원으로의 결합에 대해 선택된다. 유사하게는, 두 번째 도메인은 상보적인 변이가능 도메인의 존재 또는 부재에 대해 선택된다.
반감기 증가 단백질 외에 본 발명의 리간드에 의해 타겟된 항원 또는 에피토프는 어떠한 항원 또는 에피토프도 되나 유리하게는 치료적 가치에 타겟된 항원 또는 에피토프가 된다. 본 발명은 어떠한 타겟 특히 여기서 확인된 타겟에 특이적인 개방 형태, 폐쇄 형태 및 분리된 dAb 단량체 리간드를 포함한 리간드를 제공한다. 이러한 타겟은 폴리펩타이드, 단백질 또는 핵산 또는 그의 일부이고, 이는 자연 발생적이거나 합성적인 것이다. 이러한 관점에서 본 발명이 리간드는 에피토프 또는 항원에 결합하고 길항제(antagonist) 또는 작용제(agonist)로서 작용한다(즉, EPO 수용체 작용제). 당업자는 선택이 크고 다양함을 인식할 것이다. 이들은 인간 또는 동물 단백질의 경우 사이토카인, 사이토카인 수용체, 효소에 대한 효소 동시-인자 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 적당한 사이토카인 및 생장 인자는 : ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소더스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 생장인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈카인 (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-10, 카라티노사이트 생장 인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬레리안 억제 물질, 단핵 세포 콜로니 억제 인자, 단핵 세포 유인 단백질, M-CSF, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수 프로제니터 억제 인자-1(MPIF-1), NAP-2, Neurturin, 신경 생장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스탄틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TLIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 및 HER 4를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 사이토카인 수용체는 전술된 사이토카인에 대한 수용체를 포함한다. 이는 본 목록은 소모적인 것은 아님이 인식될 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 변이가능 도메인은 항원 또는 에피토프에 대해 지시된 반응성 항체로부터 유도된다. 바람직한 실시태양에서 변이가능 도메인은 단일 변이가능 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유도된다.
또다른 관점에서 본 발명은 여기에 논의된 바와 같은 적어도 이중-특이적인 리간드를 인코드하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다. 이중 특이적 리간드는 단일 핵산 분자 상에서 인코드되고; 대안으로는, 각 도메인은 개별적 핵산 분자에 의해 인코드된다. 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 인코드될 때 도메인은 scFv 분자의 방식으로 융합 폴리펩타이드로서 발현되거나 개별적으로 발현되고 이후에 예를 들어 화학 결합제를 이용하여 함께 결합된다. 개별적 핵산으로부터 발현된 리간드는 적당한 방법에 의해 함께 결합된다.
핵산은 발현후 숙주 세포로부터의 폴리펩타이드 유출을 위한 신호 서열을 더욱 인코드하고, 발현 후 섬질 박테리오파지 입자의 표면 성분(또는 다른 선택 디스플레이 시스템 성분)과 융합된다.
또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따른 이중 특이적 리간드를 인코드하는 핵산 분자를 포함한 벡터를 제공한다.
또다른 실시태양에서 본 발명은 본 발명에 따른 이중 특이적 리단드를 인코드하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
이러한 벡터로부터의 발현은 예를 들어 박테리오파지 입자의 표면 상에서 선택용 변이가능 도메인을 생성하도록 형상화된다. 이는 디스플레이된 변이가능 구역의 선택을 가능하게 하고 따라서 본 발명의 방법을 이용한 '이중-특이적 리간드'의 선택을 가능하게 한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 이중 특이적 리간드를 포함한 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 이중-특이적 리간드는 바람직하게는 헤비 및 라이트 체인 도메인의 결합을 포함한다. 예를 들어 이중 특이적 리간드는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 이는 scFv의 형태로 함께 결합된다. 더욱이 리간드는 하나 이상의 CH 또는 CL 도메인을 포함한다. 예를 들어 리간드는 CH1 도메인 C H2 또는 CH3 도메인 및/또는 CL 도메인, Cμ1, Cμ2, Cμ3 또는 Cμ 4 도메인 또는 이들의 결합을 포함한다. 또한 힌지 구역 도메인이 포함된다. 이러한 도메인 결합은 예를 들어 IgG 또는 IgM과 같은 의사 자연 항체 또는 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자와 같은 이의 단편이다. VH, VL, CH1 및 CL 도메인을 포함한 IgG 분자의 단일 암(arm)과 같은 다른 구조가 관찰된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 변이가능 구역은 단일 도메인 V 유전자 레퍼토리로부터 선택된다. 일반적으로 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬질 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이된다. 바람직한 실시태양에서 각각의 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 각각의 단일 변이가능 도메인은 상보적 변이가능 구역의 부재시 타겟 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 선택된다. 대안적 실시태양에서 단일 변이가능 도메인은 상보적 변이가능 구역의 존재시 타겟 항원 또는 에피토프으로의 결합에 대해 선택된다. 따라서 첫 번째 단일 변이가능 도메인은 세 번째 상보적 변이가능 도메인의 존재시 선택되고, 두 번째 변이가능 도메인은 네 번째 상보적 변이가능 도메인의 존재시 선택된다. 상보적인 세 번째 또는 네 번째 변이가능 도메인은 시험되는 단일 도메인과 동일한 특이성을 지닌 자연적인 동족 변이가능 도메인이거나 "모형(dummy)" 변이가능 도메인과 같은 비-동족 상보성 도메인이다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 특이적 리간드는 이들 일부 리간드가 동일한 단백질 내로 함께 통합되더라도 예를 들어 IgG 또는 IgM과 같은 다중결합성 면역글로불린 내로 2개의 리간드가 통합될 수 있다하더라도 2개의 변이가능한 도메인만을 포함한다. 대안으로, 또다른 실시태양에서 다수의 이중 특이적 리간드는 결합하여 다량체를 형성한다. 예를 들어 2개의 다른 이중 특이적 리간드가 결합하여 사중-특이적 분자를 생성한다.
당업자에 의해 본 발명의 방법에 따라 제조된 이중-특이적 리간드 라이트 및 헤비 변이가능 구역이 동일한 폴리펩타이드 체인 상에 존재하거나, 대안으로 다른 폴리펩타이드 체인 상에 존재할 수 있음이 인식될 것이다. 변이가능 구역이 다른 폴리펩타이드 체인 상에 존재하는 경우 이들은 링커(linker), 일반적으로 유연성 있는 링커(폴리펩타이드 체인과 같은), 화학 결합제 그룹 또는 다른 당분야 알려진 방법에 의해 결합된다.
또다른 관점에서 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 이중 특이적 리간드 및 약제적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한 조성물을 제공한다.
더욱이 본 발명은 본 발명에 따른 '이중-특이적 리간드' 또는 조성물을 이용한 질병 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
두 번째 형상에서 본 발명은 적어도 2 이상의 비-상보성 변이가능 도메인을 포함한 다중특이적 리간드를 제공한다. 예를 들어 리간드는 한 쌍의 VH 도메인 또는 한 쌍의 VL 도메인을 포함한다. 유리하게는, 도메인은 비-카멜리드 기원이고; 바람직하게는 이들은 인간 도메인이거나 인간 프레임워크 구역(FWs) 및 하나 이상의 이형성 CDRs를 포함한다. CDRs 및 프레임워크 구역은 Kabat database of Sequence of Proteins of Immunological Interest 내에 정의된 면역글로불린 변이가능 도메인의 구역이다.
바람직한 인간 프레임워크 구역은 생식세포계 유전자 세그먼트 DP47 및 DPK9에 의해 인코드된 것이다. 유리하게는, VH 또는 VL 도메인의 FW1, FW2 및 FW3는 DP47 또는 DPK9로부터의 FW1, FW2 또는 FW3 서열을 지닌다. 인간 프레임워크는 선택적으로 예를 들어 약 5개 아미노산까지 또는 약 10개 아미노산까지 본 발명의 리간드 내에 사용된 인간 프레임워크 내에 집합적으로 변화하는 돌연변이를 포함한다.
본 발명이 두 번째 형상에 따른 다중특이적 리간드 내의 변이가능 도메인은 개방 또는 폐쇄 형태로 배열된다; 즉, 이들은 변이가능 도메인이 독립적으로 및 동시에 이들의 동족 리간드에 결합할 수 있거나 변이가능 도메인 중에 단 하나만이 그의 동족 리간드에 결합하도록 배열된다.
본 발명자는 특정한 구조적 조건 하에서 비-상보성 변이가능 도메인(예를 들어 2개의 라이트 체인 변이가능 도메인 또는 2개의 헤비 체인 변이가능 도메인)이 리간드 내에 존재하여 이러한 비-상보성 도메인이 동족 쌍으로서 함께 작용하지 않더라도 첫 번째 변이가능 도메인에 대한 첫 번째 에피토프의 결합이 두 번째 변이가능 도메인에 대한 두 번째 에피토프의 결합을 억제하게 됨을 이해하였다.
유리하게는, 리간드는 2쌍 이상의 변이가능 도메인을 포함한다; 즉, 적어도 4개 이상의 변이가능 도메인을 포함한다. 유리하게는 4개의 변이가능 도메인은 인간 기원의 프레임워크를 포함한다.
바람직한 실시태양에서 인간 프레임워크는 인간 생식세포계 서열과 동일하다.
본 발명자는 이러한 항체가 치료 및 다른 이용에 대한 리간드 결합 에세이에서 특별하게 사용될 것으로 고려한다.
따라서 두 번째 형상의 첫 번째 관점에서 본 발명은 :
a) 첫 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 첫 번째 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계;
b) 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 두 번째 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계;
c) 에피토프 결합 도메인을 결합하는 단계; 및
d) 상기 첫 번째 에피토프 및 상기 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 폐쇄 형태 다중특이적 리간드를 선택하는 단계로 구성된 다중특이적 리간드를 제조하는 방법을 제공한다.
두 번째 형상의 또다른 관점에서 본 발명은 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함한 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁하여 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드가 양쪽 에피토프에 동시에 결합함을 특징으로 하고, 상기 방법은 :
a) 첫 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 첫 번째 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계;
b) 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 두 번째 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계;
c) 도메인이 폐쇄 형태가 되도록 에피토프 결합 도메인을 결합하는 단계; 및
d) 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 에피토프 둘 모두 동시가 아닌 상기 첫 번째 에피토프 및 상기 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력에 의해 폐쇄 형태 다중특이적 리간드를 선택하는 단계로 구성된다.
더욱이 본 발명은 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁하여 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드가 둘 모두의 에피토프에 동시에 결합하지 않는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 제공한다.
본 발명의 두 번째 형상의 상기 관점의 대안적 실시태양은 선택적으로 세 번째 또는 그 이상의 에피토프 결합 도메인을 선택하는 것으로 구성된 부가 단계 (b1)를 포함한다. 이러한 방법에서 개방 또는 폐쇄 형태에 관계없이 생성된 다중-특이적 리간드는 2 이상의 에피토프 결합 특이성을 포함한다. 본 발명의 두 번째 형상의 바람직한 관점에서 다중-특이적 리간드가 2 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 경우 적어도 2 이상의 상기 도메인이 폐쇄 형태이고 결합에 대해 경쟁하고; 다른 도메인이 결합에 대해 경쟁하거나 그의 동족 에피토프(들)와 독립적으로 자유롭게 결합한다.
본 발명에 따라 '다중-특이적 리간드'라는 용어는 여기에 정의된 바와 같은 하나 이상의 에피토프 결합 특이성을 보유한 리간드를 나타낸다.
여기서 정의된 '폐쇄 형태'(다중-특이적 리간드)이라는 용어는 선택적으로는 단백질 골격에 의해 리간드의 에피토프 결합 도메인이 서로 부착되거나 결합되어 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하게 됨을 의미한다. 즉, 동족 에피토프는 각각의 에피토프 결합 도메인에 의해 개별적이나 동시에 결합된다. 리간드의 폐쇄 형태는 여기에 기술된 방법에 의해 달성될 수 있다.
"개방 형태"은 선택적으로는 단백질 골격에 의해 리간드의 에피토프 결합 도메인이 서로 부착하거나 결합하여 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하게 됨을 의미한다.
여기에 나타난 '경쟁한다'라는 용어는 그의 동족 에피토프 결합 도메인에 대한 첫 번째 에피토프의 결합은 두 번째 에피토프가 그의 동족 에피토프 결합 도메인에 결합될 때 억제됨을 의미한다. 예를 들어 결합은 예를 들어 결합 도메인의 물리적 차단 또는 구조의 변화 또는 결합 도메인의 환경에 의해 입체적으로 억제되어 에피토프에 대한 그의 친화력 또는 화합력이 감소된다.
본 발명의 두 번째 형상의 또다른 실시태양에서 에피토프는 결합상에 서로 디스플레이한다. 예를 들어 첫 번째 에피토프는 그의 동족 첫 번째 결합 도메인에 대한 결합시 두 번째 결합 도메인의 입체 방해 또는 형태적 변화를 유발하고, 두 번째 결합 도메인에 결합된 에피토프를 디스플레이하는 항원 상에 제공된다.
대안으로, 결합은 25% 이상, 대안으로는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 및 바람직하게는 100% 가까이까지 감소되어 결합이 완전하게 억제된다. 에피토프의 결합은 ELISA와 같은 통상의 항원 결합 에세이, FRET를 포함한 형광 기반 기술 또는 분자량을 측정하는 표면 플라스몬 공명과 같은 기술에 의해 측정될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 방법에 따라 각각의 에피토프 결합 도메인은 다른 에피토프 결합 특이성이다.
본 발명의 배경 내에서 첫 번째 및 두 번째 "에피토프"는 동일하지 않고 단일 단일특이적 리간드에 의해 결합되지 않는 에피토프로 이해된다. 이는 다른 항원 상에 또는 동일한 항원 상에 존재하나 충분한 거리에 의해 분리되어 통상의 항체의 단독 단일-특이적 VH/VL 결합 쌍에 의해 결합될 수 있는 단일 실체를 형성하지 않는다. 실험적으로는, 단일 체인 항체 형태(도메인 항체 또는 dAbs) 내의 개별적인 변이가능 도메인 둘 모두가 2개의 에피토프에 대해 단일-특이적 VH/VL 리간드에 의해 개별적으로 경쟁되면 이들 2개의 에피토프는 본 발명에 따른 개별적 에피토프로 고려되기에 충분히 멀리 있지 않다.
본 발명의 폐쇄 형태 다중특이적 리간드는 WO 02/02773에 기술된 바와 같은 리간드를 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 리간드는 어떠한 하나 이상의 항원 또는 에피토프에 동시-실시적으로 결합하는 상보성 VH/VL 쌍을 포함하지 않는다. 대신에 본 발명에 따른 리간드는 바람직하게는 비-상보성 VH\-VH 또는 VL-V L 쌍을 포함한다. 유리하게는, 각각의 VH\-VH 또는 VL-VL 쌍 내의 각각의 VH 또는 VL 도메인은 다른 에피토프 결합 특이성을 지니고, 에피토프 결합 사이트는 하나의 사이트에서의 에피토프 결합이 다른 사이트에서의 에피토프 결합과 경쟁하도록 배열된다.
유리하게는, 본 발명에 따라 각각이 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 변이가능 도메인을 포함한다. 더욱 유리하게는, 각각의 면역글로불린 변이가능 도메인은 변이가능 라이트 체인 도메인(VL) 또는 변이가능 헤비 체인 도메인(VH)이 될 것이다. 본 발명의 두 번째 형상에서 면역글로불린 도메인이 본 발명에 따른 리간드 상에 존재시 비-상보성이다, 즉 VH/VL 항원 결합 사이트를 형성하도록 결합하지 않는다. 따라서 본 발명의 두 번째 형상에 정의된 다중-특이적 리간드는 동일한 서브-타입의 면역글로불린 도메인을 포함한다, 즉 변이가능 라이트 체인 도메인(VL) 또는 변이가능 헤비 체인 도메인(VH)이다. 더욱이 본 발명에 따른 리간드는 폐쇄 형태내에 존재시 면역글로불린 도메인은 카멜리드 VHH 타입이다.
대안적 실시태양에서 본 발명에 따른 리간드(들)는 카멜리드 VHH 도메인을 포함하지 않는다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 리가드(들)는 인간 VH 도메인과 비교시 카멜리드 VHH 도메인에 특이적인 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
유리하게는, 단일 변이가능 도메인은 다른 항원 또는 에피토프로의 결합 능력에 대해 선택된 항체로부터 유도된다. 예를 들어 변이가능 도메인은 인간 면역에 의해 적어도 부분적으로 분리된다. 인간 항체 라이브러리 및 인공 항체 유전자 합성으로부터의 분리를 포함한 대안적 방법이 알려져 있다.
변이가능 도메인은 유리하게는 단백질 A 또는 단백질 L과 같은 수퍼항원에 결합한다. 수퍼항원으로의 결합은 정확하게 폴드된 항체 변이가능 도메인의 성질이고 이러한 도메인이 예를 들어 재조합 또는 돌연변이 도메인의 라이브러리로부터 분리되게 한다.
본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 단백질 뼈대 및 에피토프 상호작용 사이트를 포함한다(이는 유리하게는 단백질 뼈대의 표면 상에 있음).
또한 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 도메인 이외의 단백질 뼈대 또는 골격 상에 기초한다. 예를 들어 SpA와 같은 자연적 박테리아성 수용체가 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드를 생성하는 CDRs의 이식을 위해 뼈대로서 사용되었다. 이러한 절차의 상세한 설명은 미국특허 제5,831,012호에 기술되어 있다. 다른 적당한 뼈대는 피브로넥틴 및 항체에 기초한 것을 포함한다. 적당한 절차의 상세한 설명은 WO 98/58965호에 기술되어 있다. 다른 적당한 뼈대는 van den Beuken et al., J. Mol. Biol. (2001) 310:591-601에 기술된 리포칼린과 CTLA4 및 박테리아 GroEL의 고리 구조 또는 다른 샤프롱 폴리펩타이드 상에 기초한 WO0069907호(Medical Research Council)에 기술된 바와 같은 뼈대를 포함한다.
단백질 뼈대는 결합된다; 예를 들어 CDRs는 CTLA4 뼈대 상에 이식되고 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인과 함께 사용되어 다가의 리간드를 형성한다. 유사하게는 피브로넥틴, 리포칼린 및 다른 뼈대가 결합된다.
당업자에 의해 본 발명의 방법에 따라 제조된 폐쇄 형태 다중특이적 리간드의 에피토프 결합 도메인이 동일한 폴리펩타이드 체인 상에 존재하거나, 대안으로, 다른 폴리펩타이드 존재함이 인식될 것이다. 변이가능 구역이 다른 폴리펩타이드 체인 상에 존재하는 경우 이는 링커, 유리하게는 유연성 있는 링커(폴리펩타이드 체인과 같은), 화학 결합제 그룹 또는 다른 당분야 알려진 방법에 의해 결합된다.
첫 번째 및 두 번째 에피토프 결합 도메인은 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합된다. 도메인이 공유결합으로 결합된 경우 결합은 예를 들어 2황화물 결합에 의해 중개된다.
본 발명의 두 번째 형상에서 첫 번째 및 두 번째 에피토프는 바람직하게는 다르다. 이는 자연발생적이거나 합성적인 폴리펩타이드, 단백질 또는 핵산 또는 그의 일부이다. 이러한 관점에서 본 발명의 리간드는 에피토프 또는 항원에 결합하고 길항제 또는 작용제(즉, EPO 수용체 작용제)로서 작용한다. 하나의 실시태양에서 리간드의 에피토프 결합 도메인은 동일한 에피토프 특이성을 지니고, 예를 들어 동일한 항원 상에 다수의 에피토프 카피가 제공되면 그의 에피토프에 동시에 결합한다. 또다른 실시태양에서 이들 에피토프는 다른 항원 상에 제공되어 리간드가 에피토프에 결합하고 항원을 교락할 수 있다. 당업자는 에피토프 및 항원의 선택이 크고 다양함을 인식할 것이다. 이는 인간 또는 동물 단백질의 경우 사이토카인, 사이토카인 수용체, 효소에 대한 효소 동시-인자 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 적당한 사이토카인 및 생장 인자는 : ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소더스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 생장인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈카인 (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-10, 카라티노사이트 생장 인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬레리안 억제 물질, 단핵 세포 콜로니 억제 인자, 단핵 세포 유인 단백질, M-CSF, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수 프로제니터 억제 인자-1(MPIF-1), NAP-2, Neurturin, 신경 생장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스탄틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TLIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 및 HER 4, TACE 인식 사이트, TNF BP-I 및 TNF BP-II 뿐만 아니라 부록에 나타나 것의 조합, 다른 조합 또는 개별적인 것에 관계없이 부록 2 또는 부록 3에 개시된 어떠한 타겟을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 사이토카인 수용체는 전술된 사이토카인에 대한 수용체 즉, IL-1 R1; IL-6R; IL-10R 뿐만 아니라 부록 2 또는 부록 3에 나타난 사이토카인에 대한 수용체 및 부록 2 및 3에 개시된 수용체를 포함한다. 이는 본 목록은 소모적인 것은 아님이 인식될 것이다. 다중특이적 리간드가 2개의 에피토프에 결합시(동일하거나 다른 항원 상에서) 항원(들)은 본 목록으로부터 선택된다.
유리하게는 이중 특이적 리간드는 사이토카인 및 생물체의 신체 내에서 치료적 상황에서 상승적으로 협조하는 다른 분자를 타겟하는데 사용된다. 따라서 본 발명은 상기 2 이상의 사이토카인을 결합하는 것이 가능한 이중 특이적 리간드를 투여하는 것을 포함한 2 이상의 사이토카인의 활성을 상승시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 관점에서 이중 특이적 리간드는 상보성 및/또는 비-상보성 도메인으로 구성된 리간드, 개방 형태의 리간드 및 폐쇄 형태의 리간드를 포함한 어떠한 이중 특이적 리간드도 된다. 예를 들어 본 발명의 이러한 관점은 VH 도메인 및 VL 도메인의 결합, VH 도메인만 및 VL 도메인만에 관한 것이다.
치료적 환경에서의 상승작용은 많은 방법으로 달성된다. 예를 들어 타겟 결합은 둘 모두의 타겟이 리간드에 의해 타겟될 때만 치료적올 활성인 반면, 하나의 타겟 단독을 타겟하는 것은 치료적으로 효과적이지 않다. 또다른 실시태양에서 하나의 타겟 단독은 낮거나 최소한의 치료적 효과를 제공하나 두 번째 타겟과 함께된 결합은 치료 효과면에서 상승적 증가를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 본 관점의 이중 특이적 리간드에 의해 결합된 사이토카인은 부록 2에 나타낸 목록으로부터 선택된다.
더욱이, 이중 특이적 리간드는 종양학 적용에 사용될 수 있고, 하나의 특이성이 CD89를 타겟할 때 이는 세포파괴성 세포에 의해 발현되고 다른 것은 종양 특이적이다. 타겟된 종양 항원의 예는 부록 3에 제공된다.
본 발명의 두 번째 형상의 하나의 실시태양에서 변이가능 도메인은 첫 번째 및/또는 두 번째 항원 또는 에피토프에 대해 지시된 항체로부터 유도된다. 바람직한 실시태양에서 변이가능 도메인은 변이가능 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유도된다. 하나의 예로 레퍼토리는 동물 또는 합성 레퍼토리에서 생성된 것이 아닌 레퍼토리이다. 또다른 예로 단일 변이가능 도메인은 동물 면역에 의해 분리되지 않는다(적어도 부분적으로). 따라서 단일 도메인은 고유의 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
또다른 관점에서 본 발명의 두 번째 형상은 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함한 다중-특이적 리간드를 제공한다. 첫 번째 및 두 번째 결합 특이성은 동일하거나 다르다.
또다른 관점에서 본 발명은 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁가능하여 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드가 둘 모두의 에피토프에 동시에 결합할 수 없게 되는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 비-상보성 결합 도메인을 포함하고, 상기 도메인은 동일한 타겟 상에서 다른 에피토프에 대해 특이적임을 특징으로 하는 개방 형태 리간드를 제공한다. 이러한 리간드는 증가된 화합력으로 타겟에 결합한다. 유사하게는, 본 발명은 동일한 에피토프에 대해 특이적인 비-상보성 결합 도메인을 포함하고 IL-5, PDGF-AA, PDGF-BB, TGF 베타, TGF 베타2, TGF 베타3 및 인간 TNF 수용체 1 및 인간 TNFα와 같은 상기 에피토프의 다수 카피를 포함한 타겟에 지시된 다가의 리간드를 제공한다.
유사한 관점에서 본 발명에 따른 리간드는 낮은 친화력으로 개별적 에피토프에 결합하도록 형상화될 수 있어서 개별적 에피토프로의 결합은 치료적으로 유의적이지 않으나; 2개의 에피토프로의 결합으로부터 유발된 증가된 화합력은 치료적 가치를 제공한다. 특정한 예로 정상 세포 타입 상에 개별적으로 제공되나 종양 세포와 같은 비정상 또는 질병에 걸린 세포 상에서만 함께 제공된 에피토프가 타겟된다. 이러한 상황에서 비정상 또는 질병에 걸린 세포만이 본 발명에 따른 이중특이적 리간드에 의해 효과적으로 타겟된다.
또한 동일한 타겟 상에서 동일한 에피토프 또는 인접 에피토프의 다수의 카피에 대해 특이적인 리간드는 삼량체 또는 다량체(사량체 이상)가 되고, 리간드는 3개, 4개 이상의 비-상보성 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어 3개 또는 4개 VH 도메인 또는 VL 도메인을 포함한 리간드가 구조된다.
더욱이 각각의 결합 도메인이 상기 타겟의 서브유니트에 특이적인 다중특이적 타겟에 결합하는 리간드가 제공된다. 리간드는 이량체, 삼량체 또는 다량체이다.
바람직하게는 본 발명의 상기 관점에 따른 다중-특이적 리간드는 본 발명의 첫 번째 관점의 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 두 번째 형상의 상기 관점에 따라 유리하게는 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 도메인은 여기에 논의된 바와 같이 비-상보성 면역글로불린 변이가능 도메인이다. 즉, VH-VH 또는 VL-VL 변이가능 도메인이다.
특히, 킬레이팅 dAbs가 본 발명의 바람직한 관점에 따라 제조된다, 즉 이량체, 삼량체 또는 다량체 dAbs의 라이브러리가 링커 서열의 일정한 dAb 업스트림 또는 다운스트림을 포함한 벡터를 이용하여 두 번째 및 세 번째의 레퍼토리와 함께 구조되고, 또한 dAbs가 링커의 다른면 상에 삽입되는 앵커 dAb의 이용. 예를 들어 앵커 또는 가이드 dAb는 TAR1-5(Vκ), TAR1-27(Vκ), TAR2h-5(VH) 또는 TAR2h-6(V κ)이다.
대안적 방법론에서 링커의 이용은 예를 들어 비-공유결합성 결합 또는 VH 및 Vκ와 같은 결합 도메인 사이의 자연적 친화력의 이용에 의해 회피된다. 따라서 본 발명은 :
(a) 타겟 상에 첫 번째 에피토프에 대해 특이적인 단일 결합 도메인을 인코드하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 제공하는 단계;
(b) 에피토프는 첫 번째 에피토프와 동일하거나 다르고, 상기 두 번째 에피토프는 상기 첫 번째 에피토프에 인접한, 상기 타겟 상에서 두 번째 에피토프에 대해 특이적인 두 번째 결합 도메인을 포함한 레퍼토르를 인코드하는 벡터를 제공하는 단계;
(c) 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인을 발현하는 단계; 및
(d) 함께 결합하여 타겟-결합 이량체를 생성하는 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인의 결합을 분리하는 단계로 구성된 킬레이팅 다량체 리간드를 제조하는 방법을 제공한다.
첫 번째 및 두 번째 에피토프가 인접하여 다량체 리간드는 둘 모두의 에피토프에 동시에 결합하는 것이 가능하다. 이는 결합시 증가된 화합력의 장점을 지닌 리간드를 제공한다. 에피토프가 동일할 때 증가된 화합력은 타겟 상에 에피토프의 다수 카피의 존재에 의해 수득되고, 증가된 화합력 효과를 수득하기 위해 적어도 2 이상의 카피가 동시에 결합되게 된다.
결합 도메인은 일부 방법 뿐만 아니라 링커의 이용에 의해 결합된다. 예를 들어 결합 도메인은 cys 잔기, 아비딘 및 스트렙트아비딘 그룹 또는 비-공유결합성 부착 후-합성의 방법을 포함한다; 결합하여 효과적으로 타겟하는 이들 결합이 분리될 것이다. 대안으로, 링커는 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인 사이에 존재하고, 이는 단일 벡터로부터 단일 폴리펩타이드로서 발현되고, 상기 기술된 경우 첫 번째 결합 도메인, 링커 및 두 번째 결합 도메인의 레퍼토리를 포함한다.
바람직한 관점에서 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인은 항원에 결합시 자연적으로 결합한다; 예를 들어 VH 및 Vκ 도메인은 인접 에피토프에 결합시 3-방식 상호작용으로 자연적으로 결합하여 적당한 이량체를 형성한다. 이러한 결합된 단백질은 타겟 결합 에세이 내에서 분리될 수 있다. 이러한 절차의 장점은 정확한 형상으로 인접 에피토프에 가까이 결합한 결합 도메인만이 결합할 것이고 따라서 타겟에 대해 증가된 화합력의 결과로서 분리된다는 것이다.
본 발명의 두 번째 형상의 상기 관점의 대안적 실시태양에서 적어도 하나 이상의 에피토프 결합 도메인은 여기에 논의된 비-면역글로불린 '단백질 뼈대' 또는 '단백질 골격'을 포함한다. 적당한 비-면역글로불린 단백질 뼈대는 : 상기 나타난 바와 같이 SpA, 피브로넥틴, GroEL 및 다른 샤프롱, 리포칼린, CCTLA4 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함하나 이에 한정적이지 않다.
본 발명의 두 번째 형상의 상기 관점에 따라 유리하게는 에피토프 결합 도메인은 '단백질 골격'에 부착된다. 유리하게는, 본 발명에 따른 단백질 골격은 면역글로불린 골격이다.
본 발명에 따라 '면역글로불린 골격'이라는 용어는 여기에 정의된 바와 같이 적어도 하나 이상의 면역글로불린 폴드를 포함하고 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 대한 핵으로서 작용하는 단백질을 나타낸다.
여기에 논의된 바람직한 면역글로불린 골격은 하나 이상의 하기로부터 선택된 것을 포함한다 : 적어도 (ⅰ) 항체의 CL(카파 또는 람다 서브클래스) 도메인; 또는 (ⅱ) 항체 헤비 체인의 CH1 도메인; 항체 헤비 체인의 CH1 및 CH2 도메인을 포함한 면역글로불린 분자; 또는 항체 헤비 체인의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함한 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL(카파 또는 람다 서브클래스) 도메인과 컨쥬게이션된 서브세트 (ⅱ). 또한 힌지 구역 도메인도 포함된다. 예를 들어 이러한 도메인의 결합은 IgG 또는 IgM와 같은 의사 자연적 항체 또는 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자와 같은 그의 단편이다. 당업자는 본 목록이 소모적이지 않음을 인식할 것이다.
여기에 논의된 바와 같은 에피토프 결합 도메인에 대한 골격의 결합은 폴리펩타이드 수준에서 달성된다, 즉 골격 및/또는 에피토프 결합 도메인을 인코드하는 핵산의 발현 후이다. 대안으로, 결합 단계는 핵산 수준에서 수행된다. 본 발명에 따른 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 대한 단백질 골격의 결합 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고 여기에 기술된 단백질 화학 및/또는 분자생물학적 기술의 이용을 포함한다.
유리하게는 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드는 타겟 분자에 결합하는 것이 가능한 첫 번째 도메인 및 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 그룹에 결합하는 것이 가능한 두 번째 도메인을 포함한다. 예를 들어 분자 또는 그룹은 HSA 또는 세포 매트릭스 단백질과 같은 벌킹제이다. 여기에 사용된 "리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 그룹"이라는 문구는 여기에 기술된 바와 같은 이중 특이적 리간드에 의해 결합시 동물에 투여되면 이러한 이중 특이적 리간드의 생체 내 반감기를 분자 또는 그룹에 결합하지 않은 리간드에 비해 증가시키는 분자 또는 화학 그룹을 나타낸다. 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 그룹의 예는 하기에 기술된다. 바람직한 실시태양에서 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드는 반감기 증가 분자 또는 그룹의 퇴거시에만 타겟 분사에 결합할 수 있다. 따라서 예를 들어 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드는 HSA와 같은 거대 분자에 의해 피험자의 혈액 순환 내에서 유지된다. 타겟 분자와 마주치면 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드의 결합 도메인 사이의 경쟁은 HSA의 퇴거 및 타겟의 결합을 유발한다.
본 발명의 관점에 따른 리간드 뿐만 아니라 이러한 리간드를 구조하는데 유용한 aAb 단량체는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 유리하게는 300 nM 내지 5 pM(즉, 3 ×10-7 내지 5 ×10-12 M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM 또는 5 nM 내지 200 pM 또는 1 nM 내지 100 pM, 1 ×10-7 M 이하, 1 ×10-8 M 이하, 1 ×10-9 M 이하, 1 ×10-10 이하, 1 ×10-11 이하의 Kd; 및/또는 5 ×10-1 내지 1 ×10-7 S-1, 바람직하게는 1 ×10-2 내지 1 ×10-6 S-1 또는 5 ×10-3 내지 1 ×10 -5 S-1 또는 5 ×10-1 S-1 이하, 또는 1 ×10-2 S-1 이하 또는 1 ×10-3 S-1 이하 또는 1 ×10 -4 S-1 이하 또는 1 ×10-5 S-1 이하 또는 1 ×10-6 S-1 이하의 Koff 속도 상수를 지닌 그의 동족 타겟(들)으로부터 해리된다. Kd 속도 상수는 Koff/Kon으로 정의된다.
특히, 본 발명은 각각의 dAb가 TNFα에 결합하는 항-TNFαdAb 단량체(또는 dAb를 포함한 이중 특이적 리간드), 상동이량체, 이형이량체 또는 상동삼량체 리간드를 제공한다. 리간드는 300 nM 내지 5 pM(즉, 3 ×10-7 내지 5 ×10-12 M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 더욱 바람직하게는 5 nM 내지 200 pM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM의 Kd로 TNFα에 결합하고; 대안적 방식으로 결합되어 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 Kd는 1 ×10-7 M 이하, 바람직하게는 1 ×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1 ×10-9 M 이하, 유리하게는 1 ×10-10 이하, 가장 바람직하게는 1 ×10-11 이하이고; 및/또는 5 ×10-1 내지 1 ×10-7 S-1, 바람직하게는 1 ×10-2 내지 1 ×10-6 S-1, 더욱 바람직하게는 5 ×10-3 내지 1 ×10-5 S-1, 예를 들어 5 ×10-1 S-1 이하, 바람직하게는 1 ×10-2 S-1 이하, 더욱 바람직하게는 1 ×10-3 S-1 이하, 유리하게는 1 ×10-4 S-1 이하, 더욱 유리하게는 1 ×10-5 S-1 이하, 가장 바람직하게는 1 ×10-6 S-1 이하의 Koff 속도 상수로 TNFα에 결합한다.
바람직하게는 리간드는 TNFα500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 유리하게는 10 nM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 유리하게는 500 pM 이하, 더욱 바람직하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 ND50으로 표준 L929 에세이로 TNFα를 중화한다.
바람직하게는 리간드는 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 IC50으로 TNF 알파 수용체 I(p55 수용체)에 대한 TNF 알파의 결합을 억제한다. 바람직하게는 TNFα는 인간 TNFα이다.
더욱이, 본 발명은 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 유리하게는 300 nM 내지 5 pM(즉, 3 ×10-7 내지 5 ×10-12 M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM 더욱 바람직하게는 5 nM 내지 200 pM 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM, 예를 들어 1 ×10-7 M 이하, 바람직하게는 1 ×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1 ×10-9 M 이하, 유리하게는 1 ×10-10 이하, 가장 바람직하게는 1 ×10-11 이하의 Kd; 및/또는 5 ×10-1 내지 1 ×10-7 S-1, 바람직하게는 1 ×10-2 내지 1 ×10-6 S -1, 더욱 바람직하게는 5 ×10-3 내지 1 ×10-5 S-1, 예를 들어 5 ×10-1 S-1 이하, 바람직하게는 1 ×10-2 S-1 이하, 유리하게는 1 ×10-3 S-1 이하, 더욱 바람직하게는 1 ×10-4 S-1 이하, 훨씬 더 바람직하게는 1 ×10-5 S-1 이하, 가장 바람직하게는 1 ×10-6 S-1 이하의 Koff 속도 상수로 TNF 수용체 I에 결합하는 항-TNF 수용체 I dAb 단량체 또는 이러한 aAb를 포함한 이중 특이적 리간드를 제공한다.
바람직하게는 dAb 단량체 리간드는 TNFα500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 ND50으로 표준 에세이(즉, 여기에 기술된 L929 또는 HeLa 에세이)로 TNFα를 중화한다.
바람직하게는 dAb 단량체 또는 리간드는 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 IC50으로 TNF 알파 수용체 I(p55 수용체)에 대한 TNF 알파의 결합을 억제한다. 바람직하게는 TNFα수용체 I 타겟은 인간 TNFα이다.
더욱이 본 발명은 1 nM 내지 500 μM(즉, ×10-9 내지 5 ×10-4), 바람직하게는 100 nM 내지 10 μM의 Kd로 혈청 알부민(SA)에 결합하는 dAb 단량체(또는 이러한 dAb를 포함한 이중 특이적 리간드)를 제공한다. 바람직하게는 첫 번째 항-SA dAb 및 다른 타겟에 대한 두 번째 dAb를 포함한 이중 특이적 리간드에 있어서, 그이 타겟에 대한 두 번째 dAb의 친화력(즉, BiaCore를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 Kd 및/또는 Koff)은 SA에 대한 첫 번째 dAb의 친화력의 1∼100000배(바람직하게는 100∼100000배, 더욱 바람직하게는 1000∼100000배, 또는 10000∼100000배)이다. 예를 들어 첫 번째 dAb가 약 10 μM의 친화력으로 SA에 결합하는 반면 두 번째 dAb는 100 pM의 친화력으로 그의 타겟에 결합한다. 바람직하게는 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
하나의 실시태양에서 첫 번째 dAb(또는 dAb 단량체)는 약 50, 바람직하게는 70 및 더욱 바람직하게는 100, 150 또는 200 nM의 Kd로 SA(즉, HSA)에 결합한다.
더욱이 본 발명은 본 발명의 전술된 관점에 따라 전술된 dAb 단량체의 이량체, 삼량체 및 중합체를 제공한다.
dAb 단량체, 이량체 및 삼량체를 포함한 본 발명에 따른 리간드는 CH2 및 CH3 도메인의 하나 또는 둘 모두 및 선택적으로는 힌지 구역을 포함한 항체 Fc 구역에 결합될 수 있다. 예를 들어 단일 뉴클레오타이드 서열로서 Fc 구역에 결합된 리간드를 인코드하는 벡터는 이러한 폴리펩타이드를 제조하는데 사용된다.
본 발명의 두 번째 형상의 또다른 관점에서 본 발명은 여기서 논의된 적어도 하나 이상의 다중 특이적인 리간드를 인코드하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다. 하나의 실시태양에서 리간드는 폐쇄 형태 리간드이다. 또다른 실시태양에서 이는 개방 형태 리간드이다. 다중 특이적 리간드는 단일 핵산 분자 상에서 인코드된다; 대안으로, 각각의 에피토프 결합 도메인은 개별적 핵산 분자에 의해 인코드된다. 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 인코드되면 도메인은 융합 폴리펩타이드로서 발현되거나 개별적으로 발현되고 이후에 예를 들어 화학 결합제를 이용하여 함께 결합된다. 개별적 핵산으로부터 발현된 리간드는 적당한 방법으로 함께 결합될 것이다.
핵산은 발현후 숙주 세포로부터의 폴리펩타이드 유출을 위한 신호 서열을 더욱 인코드하고, 발현 후 섬질 박테리오파지 입자의 표면 성분(또는 다른 선택 디스플레이 시스템 성분)과 융합된다. 박테리아 발현 및/또는 파지 또는 파지미드 디스플레이에 사용되는 리더 서열은 pelB, stII, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다.
본 발명의 두 번째 형상의 또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함한 벡터를 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
이렇나 벡터로부터의 발현은 예를 들어 박테리오파지 입자 상에서 선택을 위한 에피토프 결합 도메인을 제조하도록 형상화된다. 이는 디스플레이된 도메인의 선택 및 본 발명의 방법을 이용한 '다중 특이적 리간드'의 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 두 번째 형상의 바람직한 실시태양에서 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 변이가능 구역이고 단일 도메인 V 유전자 레퍼토리로부터 선택된다. 일반적으로 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬질 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이된다. 바람직한 실시태양에서 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선택된다.
또한 본 발명은 개방 형태 또는 폐쇄 형태 리간드인, 본 발명에 따른 적어도 하나 이상의 다중 특이적 리간드를 포함한 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 예를 들어 진단 키트, 치료 키트, 화학 종류 또는 생물 종류의 검출용 키트 등이다.
본 발명의 두 번째 형상의 또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따른 리간드를 이용한 상동적 면역에세이를 제공한다.
본 발명의 두 번째 형상의 또다른 관점에서 본 발명은 본 발명이 방법에 의해 수득가능한 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드 및 약제적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한 조성물을 제공한다.
더욱이 본 발명은 본 발명에 따른 '폐쇄 형태 다중 특이적 리간드' 또는 조성물을 이용한 질병 치료방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 질병은 암 또는 염증성 질환 즉, 류마티즘성 관절염, 천식 또는 크론병이다.
본 발명의 두 번째 형상의 또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따른 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드 또는 조성물을 이용한 질병의 진단을 포함한 진단방법을 제공한다. 따라서 일반적으로 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드에 대한 분석물의 결합은 약제를 치환하도록 이용되고, 이는 치환 상에 신호의 생성을 이끈다. 예를 들어 효소가 활성 사이트를 통해 항체에 유지되는 경우 분석물(두번째 항원)의 결합은 면역에세이에 대한 기초를 제공하는 항체에 결합된 효소(첫번째 항원)를 치환할 수 있다.
따라서 두 번째 형상의 마지막 관점에서 본 발명은 :
(a) 리간드가 타겟 분자 및 약제에 특이적이고, 리간드에 의해 결합된 약제는 리간드로부터의 치환 상에 검출가능한 신호의 생성을 이끄는 것이 특징인 약제에 결합된 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드을 제공하고;
(b) 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드를 타겟 분자에 노출시키고;
(c) 약제의 치환의 결과로서 생성된 신호를 검출하는 것으로 구성된
타겟 분자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 두 번째 형상의 상기 관점에 따라 유리하게는, 약제는 효소이고, 이는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드에 의해 결합시 불활성이다. 대안으로, 약제는 하나 또는 그 이상의 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것이다: 효소에 대한 기질 및 리간드에 의해 결합시 불활성 또는 억제되는 형광성, 발광성 또는 색원성 분자.
또한 여기에 개시된 서열과 유사하거나 상동적인(즉, 적어도 약 70% 이상의 서열 동일성) 서열은 본 발명의 일부이다. 일부 실시태양에서 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 될 수 있다. 핵산 수준에서 서열 동일성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 될 수 있다. 대안으로 실질적 동일성은 핵산 세그먼트가 선택적 하이브리디제이션 조건(즉, 매우 높은 스트린전시 하이브리디제이션 조건) 하에서 스트랜드 전체에 하이브리다이즈할 때 존재한다. 핵산은 전체 세포 내, 세포 용해질 내 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재한다.
2개의 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "유사성"(용어는 상호교환가능하게 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 서열은 최적 비교 목적으로 정렬된다(즉, 갭은 최적 정렬을 위해 첫 번째 및 두 번째 아미노산 또는 핵산의 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고 비-상동성 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 바람직한 실시태양에서 비교 목적으로 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30% 이상, 바람직하게는 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 60% 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 이후, 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에 상응하는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 첫 번째 서열 내 위치는 두 번째 서열 내 상응하는 위치로서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 확보된 후 그 위치에서 분자는 동일하다(아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동일하게 사용됨). 2개 서열 사이의 백분율 동일성은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 기능이고, 갭 수 및 각 갭의 길이를 고려하고, 이는 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있다.
유리하게는, BLAAST 알고리즘(버전 2.0)이 디폴트 수치에 셋팅된 파라미터로 서열 정렬에 사용된다. BLAST 알고리즘은 "blst_help.html" 파일 내 "/Blast/" 디렉토리 내 미국정부(".gov")의 국립보건원("nih")의 생명공학 정보 국립 센터(".ncbi")의 월드 와이드 웹 사이트("www")에 상세하게 기술되어 있다. 검색 파라미터는 하기와 같이 정의되고 유리하게는 정의된 디폴트 파라미터로 셋팅된다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blas수, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용된 발견적(heuristic) 검색 알고리즘이다; 이러한 프로그램은 약간의 등귀(enhancement)로 Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8(상기 기술된 "blast_help.html" 파일 참고)의 통계적 방법을 사용한 그들의 발견에 유의성을 둔다. BLAST 프로그램은 예를 들어 의문의 서열에 대한 상동성을 증명하기 위해 서열 유사성 검색을 위해 만들어졌다. 서열 데이터베이세스의 유사성 검색 내의 기본 이슈(issue)의 토론을 위해 Altschul et al(1994)를 참고하시오.
생명공학 정보 국립 센터 웹 사이트에서 유용한 5개의 BLAST 프로그램은 하기 태스크를 수행한다:
"blastp" 단백질 서열 데이터베이세스에 대한 아미노산 질문 서열을 비교한다;
"blastn" 뉴클레오타이드 서열 데이터베이세스에 대한 뉴클레오타이드 질문 서열을 비교한다;
"blastx" 단백질 서열 데이터베이세스에 대한 뉴클레오타이드 질문 서열(두가닥 모두)의 6-프레임 개념적 번역을 비교한다;
"tblastn: 모든 6 리딩(reading) 프레임(두가닥 모두) 내에서 다이나믹하게 번역된 뉴클레오타이드 데이터베이세스에 대한 단백질 질문 서열을 비교한다;
"tblastx" 뉴클레오타이드 서열 데이터베이세스의 6-프레임 번역에 대한 뉴클레오타이드 질문 서열의 6-프레임 번역을 비교한다.
BLAST는 하기의 검색 파라미터를 사용한다 :
HISTOGRAM(막대그래프) 각각의 검색에 대한 점수의 히스토그램을 표시한다; 디폴트는 yes이다(BLAST 책자 내의 파라미터 H를 참고하시오).
DESCRIPTIONS(설명) 특성화된 숫자로 리포트되는 매치된 서열의 간단한 디스크립션(description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100 디스크립션이다(책자 페이지 내의 파라미터 V를 참고하시오). 또한 EXPECT(예상) 및 CUTOFF(컷오프)를 참조하시오.
ALIGNMENTS(정렬) 높은-득점 세그먼트(HSPs)가 보고되는 특정화된 숫자에 데이터베이세스 서열을 제한함; 디폴트 한계는 50이다. 이 보다 더 많은 데이터베이세스 서열이 리포팅을 위한 통계적 유의성 역치를 만족시키게 될 경우(하기의 EXPECT 및 CUTOFF를 참조하시오) 가장 큰 통계적 유의성의 매치만이 리포트된다(BLAST 책자 내의 파라미터 B를 참고하시오).
EXPECT(예상) 리포트를 위한 통계적 유의성 역치는 데이터베이세스 서열에 대해 매치된다; 디폴트 값은 10이고, Karlin and Altschul(1990)의 추계학적 모델에 따라 10 매치는 단지 우연히 발견되는 것으로 기대된다. 매치의 통계적 유의성이 EXPECT 역치보다 클 경우 매치는 리포트되지 않을 것이다. 더 낮은 EXPECT 역치가 더 엄격하고, 리포트되는 매치 기회를 더 적게 한다. 분수 값이 수용될 수 있다(BLAST 책자내의 파라미터 E를 참고하시오).
CUTOFF(컷오프) 높은-득점 세그먼트(segment) 쌍을 리포팅하기 위한 점수를 차단함. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)으로부터 산출된다. HSP는 통계적 유의성이 적어도 CUTOFF 값과 동일한 점수를 지닌 고립 HSP의 크기와 같을 때 데이터베이세스 서열에 대해 리포트된다. CUTOFF 값이 높을수록 더 엄격하여, 리포트되는 매치의 기회를 적게 한다(BLAST 책자 내의 파라미터 S를 참고하시오). 일반적으로 유의성 역치는 EXPECT를 사용하여 더욱 강력하게 관리될 수 있다.
MATRIX(매트릭스) BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX를 위한 다른 득점 매트릭스를 특성화함. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62(Henikoff & Henikoff, 1992)이다. 유효한 다른 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 유용한 다른 득점 매트릭스는 없다; BLASTN 리퀘스트(request) 내에서 MATRIX 지시를 특성화시키는 것은 오류 반응으로 나타난다.
STRAND(스트랜드) TBLASTN 검색을 데이터베이세스 서열의 상부 또는 하부로만 한정함; 또는 LASTP, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 질문 서열의 상부 또는 하부 상의 리딩 프레임에만 한정함.
FILTER(필터) Wootton & Federhen(1993) Computers and Chemistry 17:149-163의 SEG 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 낮은 구성 복잡성을 지닌 질문 서열의 세그먼트 또는 Claverie & States(1993) Computers and Chemistry 17:191-201의 XNU 프로그램 또는 BLASTN의 경우 Tatusov and Lipman (http://www.ncbi.nih.gov.를 참고하시오)의 DUST 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 짧은-주기성 간격 반복으로 구성된 세그먼트를 마스크 오프(mask off)함. 필터링(filtering)은 blast 출력으로부터 통계적으로는 유의적이나 생물학적으로는 흥미없는 리포트를 제거하고(즉, 공통의 산성-, 염기성- 또는 프롤린-풍부 구역), 데이터베이세스 서열에 대한 특정 매칭에 유용한 질문 서열의 생물학적으로 흥미 있는 더 많은 구역을 남긴다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 뉴클레오타이드 서열 내에서 문자 "N"을 사용하여(즉, 13번 반복된 "N"), 단백질 서열 내에서 문자 "X"를 사용하여(즉, 9번 반복된 "X") 대치된다.
필터링은 데이터베이세스 서열이 아니라 질문 서열(또는 그의 번역 생성물)에만 적용된다. 디폴트 필터링은 BLASTN의 경우 DUST, 다른 프로그램의 경우는 SEG이다. SWISS-PROT 내의 서열에 적용될 경우 SEG 또는 XNU 또는 이 둘 모두에 의해마스크된 어떤 것에도 전혀 특별하지 않아서 필터링이 항상 효과를 나타내지 않는다. 더욱이 일부의 경우 서열이 완전히 마스크되어 여과되지 않은 질문 서열에 대해 리포트된 어떤 매치의 통계적 유의성이 의심받을 수 있다는 것을 나타낸다.
NCBI-gi NCBI-gi 확인자가 접근 및/또는 로커스(locus) 명칭에 부가하여 출력 내에 나타나도록 유발한다.
가장 바람직하게는 서열비교는 "/BLAST" 디렉토리 내 상기 기술된 NCBI 월드 와이드 웹 사이트에서 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리즘을 사용하여 수행된다.
도 1은 VH HSA의 항원 결합 사이트 내에 있는 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98(각각 인코드된 DVT 또는 NNK) 위치에서 VH/HSA의 다양화를 나타낸다.
도 2는 파지 디스플레이/ScFv 포맷 내에서
라이브러리 1 : 생식세포계 Vκ/DVT VH,
라이브러리 2 : 생식세포계 Vκ/NNK VH,
라이브러리 3 : 생식세포계 VH/DVT Vκ,
라이브러리 4 : 생식세포계 VH/NNK Vκ,
를 나타낸다. 이들 라이브러리는 일반 리간드 단백질 A 및 단백질 L로의 결합에 대해 미리-선택되어 대부분의 클론 및 선택된 라이브러리가 기능적이었다. 라이브러리는 HSA(첫번째 라운드) 및 β-gal(두번째 라운드) 또는 HSA β-gal 선택 또는 β-gal(첫번째 라운드) 및 HSA(두번째 라운드)β-gal HSA 선택 상에서 선택되었다. 이들 PCR 클론으로부터의 용해성 scFv는 서열 내에서 증폭되었다. 이중 특이적 항체 K8을 인코드하는 하나의 클론이 다른 작업을 위해 선택되었다.
도 3은 VH 체인 및 Vκ 체인의 정렬을 나타난다.
도 4는 K8 항체의 결합 성질의 특성을 나타낸다. K8 항체의 결합 성질은 단일클론 파지 ELISA에 의해 특성화되고, 이중 특이적 K8 항체는 HSA 및 β-gal에 결합되는 것으로 나타났고 1.0 이상의 흡광 신호로 파지 표면 상에 디스플레이되었다. 다른 단백질과의 교차 반응성은 검출되지 않았다.
도 5는 K8 항체 단편의 알려진 농도를 이용하여 수행된 용해성 scFv ELISA를 나타낸다. 96-웰 플레이트가 10 ㎍/ml 농도로 100 ㎍의 HSA, BSA 및 β-gal 및 1 ㎍/ml 농도로 100 ㎍/ml의 단백질 A로 코팅되었다. K8 scFv의 연속적 희석 50 ㎍이 도포되었고 결합된 항체 단편은 단백질 L-HRP로 검출되었다. ELISA 결과는 K8 항체의 이중 특이성을 확인한다.
도 6은 용해성 scFv ELISA를 이용하여 분석된 클론 K8 Vκ/모형 VH의 결합 특성을 나타낸다. 용해성 scFv 단편의 생성은 Harrison et al, Methods Enzymol 1996; 267:83-109에 의해 기술된 IPTG에 의해 도입되었고 scFv를 함유한 상청액이 직접 분석되었다. 용해성 scFv ELISA는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었고 결합된 scFvs는 단백질 L-HRP로 검출되었다. ELISA 결과는 이러한 클론이 여전히 β-gal에 결합할 수 있는 반면 BSA 결합은 제거되었음을 나타내었다.
도 7은 변이가능 도메인 벡터 1 및 2의 서열을 나타낸다.
도 8은 VH1/VH2 다중 특이적 리간드를 구조하는데 사용된 CH 벡터의 지도이다.
도 9는 Vκ1/Vκ2 다중 특이적 리간드를 구조하는데 사용된 Vκ 벡터의 지도이다.
도 10은 TAR1-5 이량체 4, TAR1-5-19 이량체 4 및 TAR1-5-19 단량체를 비교하는 TNF 수용체 에세이를 나타낸다.
도 11은 TAR1-5 이량체 1-6을 비교한 TNF 수용체 에세이를 나타낸다. 모든 이량체는 FPLC 정제되었고 최적 이량체 종류의 결과가 나타나 있다.
도 12는 다른 포맷의 TAR1-5-19 상동이량체의 TNF 수용체 에세이를 나타낸다 : 3U, 5U 또는 7U 링커를 니닌 dAb-링커-dAb 포맷, Fab 포맷 및 시스테인 힌지 링커 포맷.
도 13은 라이브러리 1에 대한 모형 VH 서열을 나타낸다. 생식세포계 서열 DP47 - JH4b에 기반한 VH 프레임워크의 서열. NNK 무작위화(N = A 또는 T 또는 C 또는 G 뉴클레오타이드; K = G 또는 T 뉴클레오타이드)가 라이브러리 1에 통합시 위치는 굵은 밑줄친 문자로 표시되어 있다.
도 14는 라이브러리 2에 대한 모형 VH 서열을 나타낸다. 생식세포계 서열 DP47 - JH4b에 기반한 VH 프레임워크의 서열. NNK 무작위화(N = A 또는 T 또는 C 또는 G 뉴클레오타이드; K = G 또는 T 뉴클레오타이드)가 라이브러리 2에 통합시 위치는 굵은 밑줄친 문자로 표시되어 있다.
도 15는 라이브러리 3에 대한 모형 Vκ 서열을 나타낸다. 생식세포계 서열 DPκ9 - Jκ1에 기반한 Vκ 프레임워크의 서열. NNK 무작위화(N = A 또는 T 또는 C 또는 G 뉴클레오타이드; K = G 또는 T 뉴클레오타이드)가 라이브러리 3에 통합시 위치는 굵은 밑줄친 문자로 표시되어 있다.
도 16은 항 MSA dAbs MSA 16 및 MSA 26의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 17은 MSA 16 및 26의 억제 비아코어(biacore)를 나타낸다. 정제된 dAb MSA16 및 MSA26은 Kd를 측정하기 위해 억제 비아코어에 의해 분석되었다. 간단히, dAb는 높은 밀도의 MSA로 코팅된 비아코어 CM5 칩 상에서 200RUs의 반응을 달성하는데 요구되는 dAb의 농도를 측정하는데 시험되었다. dAb의 요구 농도가 측정되면 예측된 Kd의 주변 농도 범위에서 MSA 항원이 dAb와 미리 혼합되었고 밤새 인큐베이트되었다. 각각의 예비 혼합물 내의 MSA 코팅된 dAb의 비아코어 칩에 대한 결합이 30 ㎕/분의 높은 유속에서 측정되었다.
도 18은 주입 후 MSA16의 혈청 수준을 나타낸다. dAb MSA16의 혈청 반감기는 마우스에서 측정되었다. MSA16은 CD1 마이tm 내로 약 1.5 mg/kg으로 단일 i.v. 주사 투여되었다. 2 구획 모델로의 모델링은 MSA16이 0.98시간의 t1/2α, 36.5시간의 t1/2β 및 913 hr.mg/ml의 AUC를 지녔다. MSA16은 0.06시간의 t1/2α 및 0.34시간의 t1/2β를 지닌 HEL4(항-암탉 백색 리소자임 dAb)와 비교시 매우 연장된 반감기를 지녔다.
도 19는 MSA26Ck 및 TAR1-5-19CH를 포함한 Fab-유사 단편과 결합하는 TNF 결합 억제를 나타내는 LISA(a) 및 TNF 수용체 에세이(b)을 나타낸다. Fab-유사 단편으로의 MSA 첨가는 억제 수준을 감소시킨다. 1 ㎍/ml의 TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트는 ELISA 상에 유사한 신호를 제공하도록 계산된 농도에서 이중 특이적 VκCH 및 VκCκ Fab 유사 단편 및 대조군 TNFα결합 dAb로 프로브되었다. 이중 특이적 및 대조군 dAb 모두는 2 mg/ml이 MSA의 존재 및 부재시에 ELISA 플레이트를 프로브하는데 사용되었다. 이중 특이적 웰 내의 신호는 50% 이상까지 감소되었으나 dAb 웰 내의 신호는 전혀 감소되지 않았다(도 19a 참조). 또한 동일한 이중 특이적 단백질은 MSA로 또는 MSA 없이 수용체 에세이되었고 MSA에 의한 경쟁이 나타나 있다(도 19c 참조). 이는 이중 특이적에 대한 MSA 결합은 TNFα로의 결합에 경쟁적임을 증명한다.
도 20은 TAR1-5-19 dAb 및 MSA16 dAb의 2황화물 결합된 이형이량체와 TNF 결합의 억제를 나타내는 TNF 수용체 에세이를 나타낸다. 이량체 내로의 MSA의 첨가는 투여량 의존적인 형태로 억제 수준을 감소시킨다. TNF 수용체 에세이(도 19b)는 이형이량체의 일정 농도(18 nM) 및 MSA 및 HSA 희석 시리즈 존재시 수행되었다. 농도 범위에서(2 mg/ml까지) HSA의 존재는 TNFα를 억제하는 이량체의 능력 감소를 유발하지 않았다. 그러나 MSA의 첨가는 TNFα를 억제하는 이량체의 투여량 의존적 능력 감소를 유발하였다(도 19a). 이는 MSA 및 TNFα가 cys 결합된 TAR1-5-19, MSA16 이량체에 대한 결합에 대해 경쟁함을 증명한다. MSA 및 HSA 단독은 에세이 내 TNF 결합 수준에 어떠한 효과도 나타내지 않았다.
정의
상보성
2개의 면역글로불린 도메인은 이들이 동족 쌍 또는 그룹을 형성하는 구조의 패밀리를 보유하거나 이러한 패밀리로부터 유도되고 이러한 특징으로 보유하면 "상보적"이다. 예를 들어 항체의 V H 도메인 및 V L 도메인 상보적이다; 2개의 V H 도메인은 상보적이지 않고, 2개의 V L 도메인은 상보적이지 않다. 상보적 도메인은 T-세포 수용체의 Vα 및 Vβ(또는 γ 및 δ) 도메인과 같이 면역글로불린 수퍼패밀리의 다른 멤버 내에서 발견된다. 본 발명의 두 번째 형상의 배경 내에서 비-상보성 도메인은 타겟 분자에 동시 실시가능하게 결합하지 않으나 동일하거나 다른 분자에 기반한 다른 타겟 에피토프 상에 독립적으로 작용한다. 그렇게 되도록 설계되지 않으면 에피토프에 결합하지 않는 단백질 뼈대에 기반한 도메인과 같은 인공적인 도메인은 비-상보성이다. 유사하게는, 면역글로불린 도메인에 기반한(예를 들어) 2개의 도메인 및 피브로넥틴 도메인은 상보적이지 않다.
면역글로불린
이는 항체 분자의 특성을 포함한 면역글로불린을 보유한 폴리펩타이드의 패밀리를 나타내고, 이는 2개의 β 시트 및 일반적으로 보존된 2황화물 결합을 포함한다. 면역글로불린 수퍼패밀리의 멤버는 면역 시스템 내 광범위한 역할(예를 들어 항체, T-세포 수용체 분자 등), 세포 부착 내 관련(예를 들어 ICAM 분자) 및 세포내 신호(예를 들어 PDGF 수용체와 같은 수용체 분자)를 포함한 많은 생체 내 세포성 및 비-세포성 상호작용에 관련된다. 본 발명은 결합 도메인을 보유한 모든 면역글로불린 수퍼패밀리에 적용가능하다. 바람직하게는 본 발명은 항체에 관한 것이다.
결합
본 발명에 따른 변이가능 도메인은 결합하여 도메인 그룹을 형성한다; 예를 들어 VL 도메인 VH 도메인과 결합되는 바와 같이 상보성 도메인이 결합된다. 또한 비-상보성 도메인도 결합된다. 도메인은 공유결합 또는 비-공유결합 방식에 의한 도메인의 결합을 포함하여 다수의 방법으로 결합된다.
도메인
도메인은 단백질 레스트(rest)의 4차 구조를 독립적으로 보유한 폴드된 단백질 구조이다. 일반적으로 도메인은 단백질의 분리된 기능성 성질에 중요하고, 많은 경우 단백질 및/또는 도메인의 잔여 기능의 손실 없이 다른 단백질로 첨가되거나 제거되거나 이동된다. 단일 항체 변이가능 도메인에 의해 항체 변이가능 도메인의 서열 특성을 포함한 폴드된 폴리펩타이드 도메인이 된다. 따라서 예를 들어 하나 이상의 루프가 항체 변이가능 도메인의 특성이 아닌 서열 또는 절단된 항체 변이가능 도메인에 의해 대체되거나 N- 또는 C-말단 확장뿐만 아니라 전체-길이 도멘이의 적어도 부분적인 결합 활성 및 특이성을 보유한 변이가능 도메인의 폴드된 단편을 포함한 완전한 항체 변이가능 도메인 및 변형된 변이가능 도메인 또는 항체를 포함한다.
레퍼토리
예를 들어 1차 서열이 다른 폴리펩타이드 변이체와 같은 다양한 변이체의 집합. 본 발명에 사용된 라이브러리는 적어도 1000 멤버 이상을 포함한 폴리펩타이드의 레퍼토리를 포함할 것이다.
라이브러리
라이브러리라는 용어는 이형성 폴리펩타이드 또는 핵산의 혼합물을 나타낸다. 라이브러리는 각각이 단일 폴리펩타이드 또는 핵산 서열을 지닌 멤버로 구성된다. 이러한 관점에서 라이브러리는 레퍼토리와 동의어이다. 라이브러리 멤버 사이의 서열 차이는 라이브러리 내에 존재하는 다양성에 중요하다. 라이브러리는 폴리펩타이드 또는 핵산의 단순 혼합물의 형태를 취하거나 핵산의 라이브러리로 형질전환된 생물체 또는 세포, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태이다. 바람직하게는 각 생물 개체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 멤버를 포함한다. 유리하게는 핵산에 의해 인코드된 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하기 위해 핵산이 발현 벡터 내로 도입된다. 따라서 바람직한 관점에서 라이브러리는 숙주 생물체 집단의 형태를 취하고, 각 생물체는 상응하는 폴리펩타이드 멤버를 생성하도록 발현될 수 있는 핵산 형태 내의 라이브러리의 단일 멤버를 포함한 발현 벡터의 하나 이상의 카피를 포함한다. 따라서 숙주 생물체 집단은 유전적으로 다양한 폴리펩타이드 변이체의 많은 레퍼토리를 인코드하는 잠재력을 지닌다.
'폐쇄 형태 다중-특이적 리간드'는 여기서 논의된 적어도 2 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함한 여기서 논의된 다중-특이적 리간드를 나타낸다. '폐쇄 형태'(다중-특이적 리간드)라는 용어는 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하도록 리간드의 에피토프 결합 도메인이 배열됨을 의미한다. 즉, 동족 에피토프는 개별적이나 동시에 각 에피토프 결합 도메인에 의해 결합된다. 리간드의 폐쇄 형태는 여기에 기술된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
항체
자연적으로 생성된 항체로부터 유도되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성되거나 혈청, B-세포, 하이브리도마스, 트랜스펙토마스(transfectomas), 효모 또는 박테리아로부터 분리되는 것에 관계없이 항체(예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE) 또는 단편(Fab, F(ab')2, Fv, 2황화물 결합된 Fv, scFv, 폐쇄 형태 다중 특이적 항체, 2황화물-결합된 scFv, 디아바디(diabody)와 같은).
이중-특이적 리간드
여기에 정의된 바와 같은 첫 번째 면역글로불린 단일 변이가능 도메인 및 두 번째 면역글로불린 단일 변이가능 도메인을 포함하고, 상기 변이가능 구역은 단일 특이적 면역글로불린에 의해 정상적으로 결합되지 않은 동일한 항원 상에 2개의 다른 항원 또는 2개의 에피토프에 결합하는 것이 가능함을 특징으로 하는 리간드. 예를 들어 2개의 에피토프는 동일한 합텐(hapten) 상에 존재하나 동일한 에피토프가 아니거나 단일 특이적 리간드에 의해 결합되기에 충분히 인접해 있다. 본 발명에 따른 이중 특이적 리간드는 다른 특이성을 지닌 변이가능 도메인으로 구성되고, 동일한 특이성을 지닌 상호 상보성 변이가능 도메인을 포함하지 않는다.
항원
본 발명에 따른 리간드에 의해 결합된 분자. 일반적으로 항원은 항체에 의해 결합되고 생체 내에서 항원 반응을 야기하는 것이 가능하다. 이는 폴리펩타이드, 단백질, 핵산 또는 다른 분자이다. 일반적으로 본 발명에 따른 이중 특이적 리간드는 특정 항원에 대한 타겟 특이성에 대해 선택된다. 통상의 항체 및 그의 단편의 경우 변이가능 루프(L1, L2, L3 및 H1, H2, H3)에 의해 한정된 항체 결합 사이트는 항원에 결합하는 것이 가능하다.
에피토프
면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 통상적으로 결합된 구조의 유니트. 에피토프는 항체에 대한 최소한의 결합 사이트를 정의하고, 따라서 항체의 특이성 타겟을 나타낸다. 단일 도메인 항체의 경우 에피토프는 분리시 변이가능 도메인에 의해 결합된 구조의 유니트를 나타낸다.
일반 리간드
레퍼토리의 모든 멤버에 결합하는 리간드. 일반적으로 상기 기술된 항원 결합 사이트를 통해 결합되지 않는다. 비-제한적 예는 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G를 포함한다.
선택
스크리닝에 의해 유도되거나 결합 상호작용이 도메인과 항원 또는 에피토프 사이에서 또는 항체와 항원 또는 에피토프 사이에서 이루어지는 다윈 선택 방법에 의해 유도됨. 따라서 첫 번째 변이가능 도메인은 상보성 변이가능 도메인의 존재 또는 부재시 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 선택된다.
보편적 프레임워크
Kabat("Sequence of Protein of Immuological Interest", US Department of Health and Human Services)에 의해 정의된 서열 내에서 보존된 항체 구역에 상응하거나 Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917에 의해 정의된 인간 생식세포계 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응한 단일 항체 프레임워크 서열. 본 발명은 단일 프레임워크 또는 이러한 프레임워크의 세트의 이용을 제공하고, 이는 과도 변이가능 구역 내의 변이가 단독이더라도 실질적으로 어떠한 결합 특이성의 유도를 가능하게 함을 나타내었다.
반감기
예를 들어 리간드 분해 및/또는 제거 또는 자연적 메카니즘에 의한 리간드의 격리에 의해 리간드의 혈청 농도를 생체 내에서 50%까지 감소시키는데 소요되는 시간. 본 발명의 리간드는 생체 내에서 안정화되고 분해 및/또는 제거 또는 격리를 저지시키는 분자에 결합함으로서 그의 반감기가 증가된다. 일반적으로 이러한 분자는 생체 내 긴 반감기를 지닌 자연 발생적 단백질이다. 반감기 증가 분자에 대해 특이적이지 않은 유사한 리간드보다 더 긴 기간동안 그의 기능성 활성이 생체 내에서 유지되면 리간드의 반감기가 증가된다. 따라서 HSA 및 타겟 분자에 특이적인 리간드는 HSA에 대한 특이성이 존재하지 않는, 즉 HSA에 결합하지 않으나 또다른 분자에 결합하는 동일한 리간드와 비교된다. 예를 들어 이는 타겟 분자 상에서 두 번째 에피토프에 결합한다. 일반적으로 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상까지 증가된다. 반감기의 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x 또는 그 이상의 범위의 증가가 가능하다. 대안으로, 또는 이에 더하여 반감기의 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x 범위의 증가가 가능하다.
상동성 면역에세이
결합되고 결합되지 않은 반응물을 분리하는 단계를 필요로 하지 않고 분석물이 검출되는 면역에세이.
실질적으로 동일한(또는 "실질적으로 상동적")
첫 번째 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열이 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에 대해 동일하거나 등가인(즉, 유사한 사이드 체인, 즉, 보존된 아미노산 치환) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 포함하여 첫 번째 및 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열이 유사한 활성을 지님. 항체의 경우 두 번째 항체는 동일한 결합 특이성을 지니고 적어도 50% 이상의 동일한 친화력을 지닌다.
여기에 사용된 "낮은 스트린전시", "중간 스트린전시", "높은 스트린전시" 또는 "매우 높은 스트린전시"라는 용어는 핵산 하이브리디제이션 및 세척에 대한 조건을 나타낸다. 하이브리디제이션 반응을 수행하기 위한 지침은 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 발견할 수 있고, 이는 전체로 참고문헌으로 통합된다. 수성 및 비수성 방법이 참고로 기술되어 있고 어떠한 것도 사용될 수 있다. 여기에 나타난 특이적 하이브리디제이션 조건은 하기와 같다 : (1) 약 45℃에서 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC) 내의 낮은 스트린전시 하이브리디제이션 후 적어도 50℃ 이상에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 내에서 2회 세척 조건(세척 온도는 낮은 스트린전시 조건 동안 55℃로 증가될 수 있음); (2) 약 45℃에서 6X SSC 내의 중간 스트린전시 하이브리디제이션 후 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 내에서 1회 이상 세척 조건; (3) 약 45℃에서 6X SSC 내의 높은 스트린전시 하이브리디제이션 후 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 내에서 1회 이상 세척 조건; (4) 65℃에서 0.5 M 인산나트륨, 7% SDS 내의 매우 높은 스트린전시 하이브리디제이션 후 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS 내에서 1회 이상 세척 조건. 매우 높은 스트린전시 조건 (4)는 바람직한 조건이고 특별히 명시되지 않으면 사용되어야 한다.
본 발명의 상세한 설명
정의되지 않은 경우 여기에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 지닌다(즉, 세포 배양 내에서 분자 유전학, 핵산 화학, 하이브리디제이션 기술 및 생화학). 표준 기술은 분자적, 유전적 및 생화학적 방법(일반적으로 참고문헌으로 통합된 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausuble et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed. John Wiley & Sons, Inc.을 참조) 및 화학적 방법으로 사용된다
면역글로불린 기반 다중-특이적 리간드의 제조
본 발명에 따른 이중 특이적 리간드는 본 발명의 바람직한 형상에 따른 개방 또는 폐쇄 형태에 관계없이 앞서 성립된 기술에 따라 제조되고 항체 공학 분야에서 scFv, "파지" 항체 및 다른 설계된 항체 분자의 제조에 사용된다. 항체, 특히 이중 특이적 항체의 제조 기술은 예를 들어 인용된 하기 리뷰 및 참고문헌 내에 기술되어 있다: Winter & Milstein (1991) Nature 349:293-299; Plueckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al., (1992) Crti. Rev. Immunol. 12:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4:446-449; Carter et al., (1995) J. Hematother. 4:463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13:294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15:125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15:618-619; Pluckthun, A. & Pack, P.(1997) Immunotechnology 3:83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:449-454; Holliger P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45:128-130.
본 발명은 2개의 다른 항원 또는 에피토프에 대한 변이가능 도메인 및 변이가능 도메인의 하위 결합의 선택을 제공한다.
변이가능 도메인의 선택에 사용되는 기술은 당분야에 알려진 라이브러리 및 선택 기술을 사용한다. 인간 B 세포로부터 배양된 재배열된 V 유전자를 이용한 자연적 라이브러리(Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581; Vaughan et al., (1996) Nature Biotech., 14:309)는 당업자에게 잘 알려져 있다. 합성 라이브러리(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. 227:381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13:692; Griffiths et al. 91994) EMBO J., 13:3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248:97)는 일반적으로 PCR을 이용하여 면역글로불린 V 유전자를 클로닝함으로서 제조된다. PCR 과정에서이 오류는 높은 정도의 무작위화를 이끌 수 있다. VH 및/또는 VL 라이브러리는 케이스 단일 도메인 결합이 직접적으로 또는 함께 선택된 타겟 항원 또는 에피토프에 대해 개별적으로 선택된다.
본 발명에 따른 이중 특이적 리간드를 제조하는 바람직한 방법은 변이가능 도메인의 레퍼토리가 첫 번째 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 선택되고 변이가능 도메인의 레퍼토리가 두 번째 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 선택되는 선택 시스템을 이용하는 것을 포함한다. 이후 선택된 변이가능 첫 번째 및 두 번째 변이가능 도메인은 결합되어 첫 번째 및 두 번째 항원 또는 에피토프 모두로의 결합에 대한 이중-특이적 리간드가 선택된다. 폐쇄 형태 리간드는 첫 번째 및 두 번째 항원 또는 에피토프에 분리되나 동시에 결합하는 것에 대해 선택된다.
A. 라이브러리 벡터 시스템
본 발명에 사용하기에 적당한 다양한 선택 시스템이 당분야에 알려져 있다. 이러한 시스템의 예는 하기에 기술된다.
박테리오파지 람다 발현 시스템은 박테리오파지 플라크로서 또는 리소겐(lysogen)의 콜로니로서 직접 스크린되고, 이 둘 모두는 앞서 기술되어 있고(Huse et al. (1989) Science, 246:1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2432), 본 발명에 이용된다. 이러한 발현 시스템이 라이브러리의 106 다른 멤버까지 스크린하는데 사용될 수 있으나 이들은 더 큰 수(106 멤버 이상)의 스크린에는 실제로 적당하지 않다.
특히, 라이브러리의 구조에 사용되는 것은 선택 디스플레이 시스템이고, 이는 핵산이 그가 발현하는 폴리펩타이드에 결합될 수 있게 한다. 여기에 사용된 선택 디스플레이 시스템은 적당한 디스플레이 방법에 의해 일반적 및/또는 타겟 리간드에 결합함으로서 라이브러리의 개별적 멤버의 선택을 가능하게 하는 시스템이다.
큰 라이브러리의 바람직한 멤버를 분리하기 위한 선택 프로토콜은 파지 디스플레이 기술에 의해 예시되어 당분야에 알려져 있다. 다양한 펩타이드 서열이 섬질 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이되는 이러한 시스템(Scott and Smith (1990) Science 249:386)은 생체 내 선택을 위한 항체 단편의 리이브러리(및 이들을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열) 및 타겟 항원에 결합하는 특이적 항체 단편의 증폭에 유용한 것으로 증명되었다(McCafferty et al., WO 92/01047). VH 및 VL 구역을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 이들을 대장균의 세포질 주변 공간으로 이끄는 리더 신호를 인코드하는 유전자 단편에 결합되고, 그 결과로서 수득된 항체 단편은 일반적으로 박테리오파지 외피 단백질(즉, pIII 또는 pVIII)에 융합되어 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이된다. 대안으로 항체 단편은 람다 파지 캡시드(파지바디) 상에 외부적으로 디스플레이된다. 파지-기반 디스플레이 시스템의 장점은 이들이 생물적 시스템이기 때문에 선택된 라이브러리 멤버가 박테리아 세포 내 선택된 라이브러리 멤버를 포함한 파지를 생장시킴으로서 간단하게 증폭될 수 있다는 점이다. 더욱이 폴리펩타이드 라이브러리 멤버를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열이 파지 또는 파지미드 벡터 내에 포함되기 때문에 시퀀싱, 발현 및 하위 유전적 조작이 매우 수월하다.
박테리오파지 항체 디스플레이 라이브러리 및 람다 파지 발현 라이브러리의 구조 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(McCafferty et al. (1990) Nature, 348:552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363; Clackson et al., (1991) Nature 352:624; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30:10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133; Chang et al. (1991) J. Immunol. 147:3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104:147; Marks et al. (1991) 상동; Barbas et al. (1992) 상동; Hawkins and Winter (1992) Science, 258:1313).
특히 유리한 접근의 하나는 scFv 파지-라이브러리를 이용하는 것이다(Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Chaudhary et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070; McCafferty et al. (1990) 상동; Clackson et al. (1992) Nature 352:624; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. Chem. 267). 박테리오파지 외피 단백질 상에 디스플레이된 scFv 라이브러리의 다양한 실시태양이 기술되어 있다. 파지 디스플레이 접근의 상세한 설명도 알려져 있고, 예를 들어 WO 96/06213 및 WO 92/01047(Medicla Research Counci8l et al.) 및 WO 97/08320에 기술되어 있다
폴리펩타이드의 라이브러리를 생성하는 다른 시스템은 라이브러리 멤버의 생체 내 합성에 대한 무-세포 효소적 기계의 이용을 포함한다. 하나의 방법에서 RNA 분자는 타겟 리간드에 대한 선택의 대안적 라운드 및 PCR 증폭에 의해 선택된다(Tuerk and Gold (1990) Science 249:505; Ellington and Szostak (1990) Nature 346:818). 유사한 시스템이 미리측정된 인간 전사 인자에 결합하는 DNA 서열을 확인하는데 사용된다(Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res. 18:3203; Beaudry and Joyce (1992) Science 257:635; WO 92/05258 및 WO 92/14843). 유사한 방법으로 생체 내 번역이 큰 라이브러리를 생성하는 방법으로서 폴리펩타이드를 합성사는데 사용될 수 있다. 일반적으로 안정화된 폴리솜 복합체를 포함한 이들 방법은 WO 88/08453, WO 90/05785, WO 90/07003, WO 91/02076, WO 91/05058 및 WO 92/02536에 기술되어 있다. WO 95/22625 및 WO 95/11922(Affymax)에 개시된 파지-기반이 아닌 대안적 디스플레이 시스템은 선택을 위한 폴리펩타이드를 디스플레이하기 위해 폴리솜을 이용한다.
기술의 또다른 카테고리는 유전자와 유전자 생성물과의 결합을 가능하게 하는 인공적 구획 내 레퍼토리의 선택을 포함한다. 예를 들어 원하는 유전자 생성물을 인코드하는 핵산이 워터-인-오일 에멀젼에 의해 형성된 마이크로캡슐 내에서 선택되는 선택 시스템이 WO 99/02671, WO 00/40712 및 Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7):652-6에 기술되어 있다. 원한는 활성을 지닌 유전자 생성물을 인코드하는 유전적 요소는 마이크로캡슐 내에 구획된 후 전사되고/또는 번역되어 마이크로캡슐 내에서 그의 반응적 유전자 생성물(RNA 또는 단백질)을 생성한다. 원하는 활성을 지닌 유전자 생성물을 생성하는 유전적 요소는 이후에 분류된다. 이러한 접근은 다양한 방법으로 원하는 활성을 검출함으로서 목적 유전자 생성물을 선택한다.
B. 라이브러리 구조
선택되는 라이브러리는 예를 들어 상기에 나타난 당분야에 알려진 기술에 의해 구조되거나 일반 출처로부터 구입된다. 본 발명에 유용한 라이브러리는 예를 들어 WO 99/20749에 김술되어 있다. 벡터 시스템이 선택되고 목적 폴리펩타이드를 인코드하는 하나 이상의 핵산 서열이 라이브러리 벡터 내로 클론되면 발현 전에 돌연변이화를 착수함으로서 클론된 분자 내에 다양성을 생성한다; 대안으로, 인코드된 단백질은 상기에 기술된 바와 같이 돌연변이화 및 부가적인 선택 라운드가 수행되기 전에 발현되고 선택된다. 구조적으로 최적화된 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산 서열의 돌연변이화는 표준 분자 방법에 의해 수행된다. 특히 중합효소 연쇄 반응, PCR이 이용된다(Mullins and Faloona (1987) Methods Enzymol., 155:335, 참고문헌에 통합됨). 목적 타겟 서열을 증폭시키는 열안정적인 DNA-의존적 DNA 중합효소에 의해 촉매된 DNA 복제의 다수 사이클을 이용하는 PCR은 당분야에 잘 알려져 있다. 다양한 항체 라이브러리의 구조는 Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12:433-55 및 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.
PCR은 주형 DNA(적어도 1 fg 이상, 더욱 유용하게는 1-1000 ng) 및 적어도 25 pmol 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 수행되고; 프라이머 풀(pool)이 매우 이형적이고, 각 서열이 풀의 분자의 작은 프랙션에 의해서만 표현되고, 양이 후기 증폭 사이클 내로 제한되면 많은 양의 프라이머를 이용하는 것이 유리하다. 일반적인 반응 혼합물은 : 25 ㎕의 총 부피에 2 ㎕의 DNA, 25 pmol의 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 2.5 ㎕의 10X PCR 완충액 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 ㎕의 1.25 μM dNTP, 0.15 ㎕(또는 2.5 유니트)의 Taq DNA 중합효소(Perkin-Elmer, Foster City, CA) 및 탈이온수를 포함한다. 미네랄 오일이 도포되고 PCR이 프로그램가능한 열 사이클을 이용하여 수행된다. PCR 사이클의 각 단계의 길이 및 온도뿐만 아니라 사이클 횟수는 효가적인 스트린전시 필요조건에 따라 조정된다. 어닐링 온도 및 타이밍은 프라이머가 주형에 어닐된 것으로 예측되는 효율 및 견디는 미스매치의 정도에 의해 결정되고; 분명하게는 핵산 분자가 동시에 증폭되고 돌연변이될 때 적어도 합성의 첫 번째 라운드 내에서 미스매치가 요구된다. 프라이머 어닐링 조건의 스트린전시를 최적화하는 능력은 당업자에게 잘 알려져 있다. 30℃와 72℃ 사이의 어닐링 온도가 사용된다. 주형 분자의 초기 변성은 일반적으로 92℃와 99℃ 사이에서 발생하고 변성(15초 내지 1분간 94∼99℃), 어닐링(상기 기술된 바와 같이 결정된 온도; 1-2분) 및 확장(1-5분간 72℃, 증폭된 생성물의 길이에 따라 다름)으로 구성된 20-40 사이클이 뒤따른다. 최종 확장은 일반적으로 72℃에서 4분간 이루어지고 4℃에서 정해지지 않은 단계(0-24시간)이 뒤따른다.
C. 단일 변이가능 도메인의 결합
선택된 후 본 발명에 유용한 도메인은 공유결합 및 비-공유결합 방법을 포함한 다양한 방법에 의해 결합된다.
바람직한 방법은 기술된 바와 같이 scFv 분자에 연결된 폴리펩타이드 링커의 이용을 포함한다(Bird et al., (1988) Science 242:423-426). 적당한 링커의 논의는 Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Hudson et al., Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al., Proc. Nat. Acad. Scid. USA 85:5879-5883에 제공된다. 링커는 바람직하게는 유연성이 있고, 2개의 단일 도메인이 상호작용할 수 있게 한다. 하나의 링커 예는 (Gly4Ser)n 링커 n = 1∼8, 즉 2, 3, 4, 5 또는 7 이다. 덜 유연한 디아바디에 사용된 링커가 사용될 수 있다(Holliger et al. (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448).
하나의 실시태양에서 사용된 링커는 면역글로불린 힌지 구역이 아니다.
변이가능 도메인은 링커 이외의 방법을 이용하여 결합된다. 예를 들어 자연-발생적이거나 설계된 시스테인 잔기를 통한 경우 2황화물 브리지의 이용이 VH-VH, VL-VL 또는 VH-VL 이량체를 안정화하는데 이용되거나(Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7:697-704) 변이가능 도메인 사이의 인퍼페이스를 리모델링함으로서 "피트"를 증가시켜 상호작용의 안정성을 증가시킨다(Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6:781-788).
면역글로불린 특히 항체 VH 도메인의 변이가능 도메인을 결합시키거나 안정화시키는 다른 기술은 적당하게 사용된다.
본 발명에 따라 이중 특이적 리간드가 용액 내 "폐쇄" 형상이 될 수 있다. "폐쇄" 형상은 결합 사이트를 형성하는 결합된 VH-VL 쌍과 같이 2개의 도메인(예를 들어 VH 및 VL)이 결합된 형태로 존재하는 것이다. 예를 들어 scFv는 VH 및 VL 도메인을 결합시키는데 사용되는 링커의 배열에 따라 다르게 폐쇄 형태가 된다. 이것이 도메인이 결합하게 하도록 충분히 유연성이 있는 경우 또는 결합된 위치로 이를 견고하게 유지시키는 경우 도메인은 폐쇄 형태를 채택하기 쉽다.
유사하게는 VH 도메인 쌍 및 VL 도메인 쌍은 폐쇄 형태으로 존재한다. 일반적으로 이는 리간드 분자 내에서 견고한 링커와 같은 것에 의해 도메인의 폐쇄 형태의 기능이 될 것이다. 폐쇄 형태의 리간드는 리간드의 반감기를 증가시키는 분자 및 두 번째 타겟 분자 모두에 결합할 수 없을 것이다. 따라서 리간드는 일반적으로 리간드의 반감기를 증가시키는 분자로부터 해리된 후 두 번째 타겟 분자에만 결합할 것이다.
더욱이 링커가 없는 VH/VH, VL/VL 또는 VH/VL 이량체의 구조는 도메인 사이에서의 경쟁을 제공한다.
더욱이 본 발명에 따른 리간드는 개방 형태이다. 이러한 형상에서 리간드는 리간드의 반감기를 증가시키는 분자 및 두 번째 타겟 분자 모두에 동시에 결합할 것이다. 일반적으로 개방 형태의 변이가능 도메인은 (VH-VL 쌍의 경우) 도메인이 항체 결합 사이트와 상호작용하고 이를 형성하지 않고 그의 반응적 에피토프에 대한 결합에 경쟁하지 않도록 충분히 떨어지게 한다. VH/VH 또는 VL/V L 이량체의 경우 도메인은 견고한 링커에 의해 함께 결합되지 않는다. 자연히 이러한 도메인 쌍은 항원 결합에 대해 경쟁하지 않고 항체 결합 사이트를 형성하지 않을 것이다.
개방 및 폐쇄 이중 특이적 리간드가 다른 환경하에서 다양한 평형으로 존재하기 쉬운 것으로 여겨지나 Fab 단편 및 전체 항체는 아미도 폐쇄 형태로 존재할 것이다. 타겟에 대한 리간드의 결합은 개방 형태를 향해 평형 균형을 쉬프트하기 쉽다. 따라서 본 발명에 따른 특정 리간드는 용액 내에서 2개의 형상으로 존재할 수 있고, 이중 하나는(개방 형태) 2개의 항원 또는 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있는 반면 대안적 형상은(폐쇄 형태) 하나의 항원 또는 에피토프에만 결합할 수 있다; 따라서 항원 또는 에피토프는 이의 형상으로 리간드에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
따라서 이중 특이적 리간드의 개방 형태가 용액 내에서 폐쇄 형태와 평형으로 존재하더라도 평형은 폐쇄 형태를 선호할 것으로 인식된다; 더욱이 개방 형태는 타겟 결합에 의해 폐쇄 형태로 격리될 수 있다. 따라서 바람직하게는 본 발명의 특정 이중 특이적 리간드는 2개(개방 및 폐쇄) 형상 사이에서 평형으로 존재한다.
본 발명에 따른 이중 특이적 리간드는 개방 또는 폐쇄 형태를 선호하기 위해 변형된다. 예를 들어 2황화물 결합과의 VH-VL 상호작용의 안정화는 폐쇄 형태를 안정화시킨다. 더욱이 VH 도메인 및 VL 도메인 쌍을 포함한 도메인을 결합시키는데 사용된 링커는 개방 형태가 선호되도록 구조된다; 예를 들어 링커는 적절한 위치에서 큰 아미노산 잔기의 통합에 의해서와 같이 도메인의 결합을 입체적으로 방해하거나, 도메인을 물리적으로 떨어뜨릴 적당히 견고한 구조의 고안을 입체적으로 방해한다.
D. 이중-특이적 리간드의 특성
특이적 항원 또는 에피토프에 대한 이중-특이적 리간드의 결합은 ELISA를 포함한 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 시험될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서 결합은 단일클론 파지 ELISA를 이용하여 시험된다.
파자 ELISA는 적당한 절차에 따라 수행된다; 예시적인 프로토콜은 하기에 나타나 있다.
각각의 선택 라운드에서 제조된 파지 집단은 "폴리클론" 파지 항체를 확인하기 위해 선택된 항원 또는 에피토프에 대한 ELISA에 의한 결합에 의해 스크린될 수 있다. 이후 이들 집단으로부터의 단일 감염된 박테리아 콜로니로부터의 파지는 "단일클론" 파지 항체를 확인하기 위해 ELISA에 의해 스크린될 수 있다. 또한 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 용해성 항체 단편을 스크린하는 것이 바람직하고, 또한 이는 예를 들어 C- 또는 N-말단 tag에 대해서와 같은 반응물을 이용한 ELISA에 의해 착수될 수 있다(Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12:433-55 및 인용 참고문헌 참조).
또한 선택된 파지 단일클론 항체의 다양성은 PCR 생성물의 겔 전기영동(Marks et al., 1991, 상동; Nissim et al., 1994 상동), 프로빙(Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776) 또는 벡터 DNA의 시퀀싱에 의해 에세이된다.
E. '이중-특이적 리간드'의 구조
상기에 기술된 바와 같이 항체는 적어도 하나 이상의 헤비 및 라이트 체인 변이가능 도메인, 적어도 2 이상의 헤비 체인 변이가능 도메인 또는 적어도 2 이상의 라이트 체인 변이가능 도메인을 포함한 항체(예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgE) 또는 단편(Fab, Fv, 2황화물 결합된 Fv, scFv, 디아바디)으로서 정의된다. 이는 자연적으로 생성된 항체 종류로부터 적어도 부분적으로 유도되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다; 혈청, B-세포, 하이브리도마스, 트랜스펙토마스, 효모 또는 박테리아로부터 분리되는 것에 관계없이.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 이중-특이적 리간드는 적어도 하나 이상의 항체의 단일 헤비 체인 변이가능 도메인 및 하나 이상의 항체의 단일 라이트 체인 변이가능 도메인 또는 2 이상의 단일 헤비 또는 라이트 체인 변이가능 도메인을 포함한다. 예를 들어 리간드는 VH/VL 쌍, VH 도메인 한 쌍 또는 VL 도메인 한 쌍을 포함한다.
이러한 리간드의 첫 번째 및 두 번째 변이가능 도메인은 동일한 폴리펩타이드 체인 상에 존재한다. 대안으로, 이들은 개별적인 폴리펩타이드 체인 상에 존재한다. 이들이 동일한 폴리펩타이드 체인 상에 존재하는 경우 이들은 상기 기술된 바와 같이 우선적으로는 펩타이드 서열인 링커에 의해 결합된다.
첫 번째 및 두 번째 변이가능 도메인은 공유결합 또는 비-공유결합으로 결합된다. 공유결합으로 결합된 경우 공유결합은 2황화물 결합이다.
변이가능 도메인이 여기에 기술된 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선택된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우 이들 변이가능 도메인은 보편적인 프레임워크 구역을 포함하여 여기에 논의된 특이적 일반 리간드에 의해 인식되게 된다. 보편적 프레임워크의 이용, 일반 리간드 등은 WO 99/20749에 나타나 있다.
V-유전자 레퍼토리가 폴리펩타이드 서열 내 변이되어 사용되는 곳은 바람직하게는 변이가능 도메인의 구조적 루프 내에 위치한다. 각 변이가능 도메인과 그의 상보성 쌍의 상호작용을 증가시키기 위해 변이가능 도메인의 폴리펩타이드 서열은 DNA 셔플링 또는 돌연변이에 의해 변화된다. DNA 셔플링은 당분야에 알려져 있고, Stemmer, 1994 Nature 370:389-391 및 미국특허 제6,297,053호에 나타나 있고, 모두 참고문헌에 포함된다. 돌연변이화의 다른 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 '이중-특이적 리간드'는 단일 체인 Fv 단편이다. 본 발명이 대안적 실시태양에서 '이중-특이적 리간드'는 Fab 포맷으로 구성된다.
또다른 관점에서 본 발명은 여기서 논의된 적어도 '이중-특이적 리간드'를 인코드하는 핵산을 제공한다.
당업자는 본 발명의 관점에 따라 항원 또는 에피토프 모두가 동일한 항체 분자에 동시에 결합함을 인식할 것이다. 대안으로, 이들은 동일한 항체 분자에 대한 결합을 경쟁할 것이다. 예를 들어 둘 모두의 에피토프가 동시에 결합될 때 이중 특이적 리간드 둘 모두의 변이가능 도메인은 그의 타겟 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있다. 도메인이 경쟁할 때 하나의 변이가능 도메인은 그의 타겟에 결합할 수 있으나 다른 변이가능 도메인이 그의 동족 타겟에 결합할 때와는 동시가 아니다; 또는 첫 번째 변이가능 도메인은 그의 타겟에 결합할 수 있으나 두 번째 변이가능 도메인이 그의 동족 타겟에 결합할 때와 동시가 아니다.
변이가능 구역은 타겟 항원 또는 에피토프에 대해 지시된 항체로부터 유도된다. 대안으로 이는 섬질 박테리이오파지의 표면 상에서 발현된 것과 같은 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유도된다. 선택은 하기에 기술된 바와 같이 수행된다.
일반적으로 본 발명의 수행에 요구되는 핵산 분자 및 벡터 컨스트럭트는 Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA와 같은 표준 실험 매뉴얼에 나타난 바와 같이 구조되고 조작된다.
본 발명에 유용한 핵산 조작은 일반적으로 재조합 벡터 내에서 수행된다.
따라서 또다른 관점에서 본 발명은 여기에 논의된 적어도 '이중-특이적 리간드'를 인코드하는 핵산을 포함한 벡터를 제공한다.
여기에 사용된 벡터는 그의 발현 및/또는 복제를 위해 이형성 DNA를 세포 내로 도입시키는데 사용되는 별도의 요소를 나타낸다. 벡터를 선택하고, 구조하고, 이용하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 다수의 벡터는 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 인공 염색체 및 에피솜 벡터를 포함하여 공적으로 유용하다. 이러한 벡터는 간단한 클로닝 및 돌연변이화에 사용된다; 대안으로 유전자 발현 벡터가 사용된다. 본 발명에 따른 벡터는 일반적으로 0.25 킬로베이스(kb) 내지 40 kb 이상의 길이의 원하는 크기의 폴리펩타이드 코딩 서열을 수용하도록 선택된다. 적당한 숙주 세포는 시험관 내 클로닝 조작 후 벡터로 형질전환된다. 각각의 벡터는 다양한 기능성 성분을 포함하고, 이는 일반적으로 클로닝(또는 "폴리링커") 사이트, 복제 오리진(origin) 및 적어도 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 제공된 벡터가 발현 벡터인 경우 이는 본 발명에 따른 리간드를 인코드하는 유전자에 실시가능하게 결합되도록 부가적으로 하나 이상의 하기를 보유한다: 각각 클로닝 사이트에 인접 위치한 인핸서 요소, 프로모터, 전사 종결 및 신호 서열.
일반적으로 클로닝 및 발현 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로 클로닝 벡터 내에서 이는 벡터가 숙주 염색체 DNA를 독립적으로 복제할 수 있게 하고, 복제 오리진 또는 자발적 복제 서열을 포함한 것이다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다.
플라스미드 pBR322로부터의 복제 오리진은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적당하고, 2 마이크론 플라스미드 오리진은 효모에 적당하고, 다양한 바이러스 오리진(즉, SV40, 아데노바이러스)은 포유류 세포 내 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로 복제 오리진은 이들이 COS 세포와 같은 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유류 세포 내에 사용되지 않는다면 포유류 발현 벡터에 사용될 필요는 없다.
유리하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 선택가능 마커로 표현되는 선택 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 선택성 배양 배지 내에서 생장된 형질전환 숙주 세포이 생존 또는 생장에 필수적인 단백질을 인코드한다. 따라서 선택 유전자를 포함한 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지 내에서 생존하지 않을 것이다. 일반적 선택 유전자는 항생제 및 다른 독소 즉, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 테트라사이클린(tetracycline), 보조 영양 결핍에 대한 저항성을 부여하거나 생장 배지 내 유용하지 않은 중요한 영양분을 공급한다.
본 발명에 따른 리간드를 인코드하는 벡터의 복제가 E. coil 내에서 통상적으로 수행되기 때문에 및 E. coli-선택가능 마커, 예를 들어 항생제 암피실린에 대한 저항성을 부여한 β-락타마제(lactamase) 유전자가 사용된다. 이들은 pBR322 또는 pUC18 또는 pUC19와 같은 pUC 플라스미드와 같은 E. coil 플라스미드로부터 수득될 수 있다.
발현 벡터는 일반적으로 숙주 생물체에 의해 인식되고 목적 코딩 서열에 실시가능하게 결합되는 프로모터를 포함한다. "실시가능하게 결합된"이라는 용어는 기술된 성분이 의도된 방식으로 이들이 기능하게 하는 관계에 있는 병렬을 나타낸다. 코딩 서열에 "실시가능하게 결합된" 대조군 서열은 코딩 서열의 발현이 대조군 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다.
원핵세포성 숙주의 이용에 적당한 프로모터는 예를 들어 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 또한 박테리아 시스템에 사용되는 프로모터는 일반적으로 코딩 서열에 실시가능하게 결합된 Shine-Delgarno 서열을 포함할 것이다.
바람직한 벡터는 폴리펩타이드 라이브러리 멤버에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서 첫 번째 및/또는 두 번째 항원 또는 에피토프의 선택은 폴리펩타이드 라이브러리 멤버를 발현하는 단일 클론의 개별적 증식 및 발현에 의해 또는 어떠한 선택 디스플레이 시스템의 이용에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 바람직한 선택 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이이다. 따라서 pIT1 또는 pIT2와 같은 파지 또는 파지미드 벡터가 사용된다. 본 발명에 유용한 리더 서열은 pelB, stII, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다. 하나의 예는 E. coli 복제 오리진(이중나선 복제의 경우) 및 파지 복제 오리진(단일-나선 DNA의 생성의 경우)을 지닌 파지미드 벡터이다. 이러한 벡터의 조작 및 발현은 당분야에 잘 알려져 있다(Hoogenboom and Winter (1992) 상동; Nissim et al. (1994) 상동). 간단히, 벡터는 파지미드 상에 특이성을 부여하는 β-락타마제 유전자 및 pelB 리더 서열(세포질 주변 공간에 발현된 폴리펩타이드를 지시하는)로 구성된(N부터 C 말단까지) 발현 카세트의 lac 프로모터 업스트림, 다수의 클로닝 사이트(라이브러리 멤버의 뉴클레오타이드 버전을 클로닝용), 하나 이상의 펩타이드 tag(삭제용), 선택적으로는 하나 이상의 TAG 정지 코돈 및 파지 단백질 pIII를 포함한다. 따라서 E. coli의 다양한 억제자 및 비-억제자 균주를 이용하고 글루코스, 이소-프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG) 또는 VCS M13과 같은 헬퍼 파지가 더욱 첨가되어 벡터는 발현하지 않고 플라스미드로서 복제할 수 있고, 다량의 폴리펩타이드 라이브러리 멤버만을 생성하거나 파지를 생성할 수 있고, 이들 일부는 그의 표면 상에 적어도 하나 이상의 폴리펩타이드-pIII 융합 카피를 포함한다.
본 발명에 따른 리간드를 인코드하는 벡터의 구조는 통상의 리간드 기술을 이용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편은 원하는 형태로 분열되고, 테일러되고(tailored), 재결찰되어(regligate) 필요한 벡터를 생성한다. 원하는 경우 정확한 서열이 구조된 벡터 내에 존재하는지를 확인하는 분석이 알려진 방식으로 수행될 수 있다. 발현 벡터를 구조하고, 시험관 내에서 전사체를 제조하고, DNA를 숙주 세포 내로 도입시키고 발현 및 기능을 평가하기 위한 분석을 수행하는 적당한 방법은 당업자에게 알려져 있다. 표본 내 유전자 서열의 존재가 검출되거나 DNA, RNA 또는 단백질의 서던 또는 노던 분석, 웨스턴 블럿팅, 도트(dot) 블럿팅, 원 위치에서의 하이브리디제이션, 핵산 또는 단백질 분자의 면역세포화학 또는 서열 분석과 같은 통상의 방법에 의해 그의 증폭 및/또는 발현이 정량화된다. 당업자는 원하는 경우 이들 방법이 어떻게 변형되는지는 용이하게 인식될 것이다.
폐쇄 형태 다중 특이적 리간드의 구조
본 발명의 두 번째 형상의 하나의 관점에 따라 2 이상의 비-상보성 에피토프 결합 도메인이 여기에 논의된 폐쇄 형태가 되도록 결합된다. 대안으로, 이들은 여기에 논의된 링커의 첨가 후 서로와의 에피토프 결합 사이트의 폐쇄 형태의 형성 및/또는 유지를 촉진시키는 골격에 더욱 부착된다.
(Ⅰ) 골격
골격은 면역글로불린 분자 상에 기반하거나 상기 나타난 기원의 비-면역글로불린이다. 여기에 논의된 바람직한 면역글로불린 골격은 하나 이상의 하기로부터 선택된 것을 포함한다: 적어도 (ⅰ) 항체의 CL(카파 또는 람다 서브클래스) 도메인; 또는 (ⅱ) 항체 헤비 체인의 CH1 도메인; 항체 헤비 체인의 CH1 및 CH2 도메인을 포함한 면역글로불린 분자; 또는 항체 헤비 체인의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함한 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL(카파 또는 람다 서브클래스) 도메인과 컨쥬게이션된 서브세트 (ⅱ). 또한 힌지 구역 도메인도 포함된다. 예를 들어 이러한 도메인의 결합은 IgG 또는 IgM와 같은 의사 자연적 항체 또는 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자와 같은 그의 단편이다. 당업자는 본 목록이 소모적이지 않음을 인식할 것이다.
(Ⅱ) 단백질 뼈대
각 에피토프 결합 도메인은 단백질 뼈대 및 하나 이상의 에피토프와 도메인의 특이적 상호작용에 연관된 하나 이상의 CDRs를 포함한다. 대안으로, 본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 3개의 CDRs를 포함한다. 적당한 단백질 뼈대는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것이다: 면역글로불린 도메인에 기반한 것, 피브로넥틴에 기반한 것, 어피바디(affibody)에 기반한 것, CTLA4에 기반한 것, GroEL과 같은 샤프롱에 기반한 것, 리포칼린에 기반한 것, 박테리아 Fc 수용체 SpA 및 SpD에 기반한 것. 당업자는 본 목록이 소모적인 것이 아님을 인식할 것이다.
F : 이중 특이적 리간드를 구조하는데 사용되는 뼈대
ⅰ. 메인-체인 형태의 선택
면역글로불린 수퍼패밀리의 멤버는 모두 폴리펩타이드 체인에 대한 유사한 폴드를 공유한다. 예를 들어 항체가 그의 1차 서열면에서 매우 다양하더라도 서열 비교 및 결정학적 구조는 예측에 반하여 항체의 6개 항원 루프 중 5개(H1, H2, L1, L2, L3)은 제한된 수의 메인-체인 형태 또는 규범적 구조를 채택하는 것으로 나타났다(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 227:799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14:4628; Williams at al. (1996) J. Mol. Biol., 264:220). H3 구역이 서열, 길이 및 구조면에서 훨씬 더 다양하나(D 세그먼트의 이용에 의해) 이는 또한 루트 및 항체 프레임워크 내 중요한 위치에서 특정 잔기의 길이 및 존재 또는 잔기의 타입에 따라 달리 짧은 루프 길이에 대한 제한된 수의 메인-체인 형태를 형성한다(Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263:800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399:1).
본 발명의 이중 특이적 리간드는 유리하게는 VH 도메인 라이브러리 및/또는 VL 도메인 라이브러리와 같은 도메인 라이브러리로부터 집합된다. 더욱이 본 발명의 이중 특이적 리간드는 그 자체가 라이브러리 형태로 제공된다. 본 발명의 하나의 관점에서 이중 특이적 리간드 및/또는 도메인의 라이브러리는 특정 루프 길이 및 중요한 잔기가 멤버의 메인-체인 형태가 알려져 있는지 여부를 확인하도록 선택되도록 고안된다. 유리하게는, 이들은 상기 기술된 바와 같이 비-기능성인 기회를 최소화하기 위해 자연 내에서 알려진 면역글로불린 수퍼패밀리 분자의 실제 형태이다. 생식세포계 V 유전자 세그먼트는 항체 또는 T-세포 수용체를 구조하기 위한 적당한 기본 프레임워크로서 작용한다; 다른 서열도 이용된다. 변이는 낮은 빈도로 발생하여 적은 수의 기능적 멤버가 변화된 메인-체인 형태를 보유하고, 이는 그의 기능에 영향을 미치지 않는다.
리간드 서열에 기반한 메인-체인 형태를 예측하고 규범적 구조에 영향을 미치지 않는 다양화를 위한 잔기를 선택하기 위해 규범적 구조 이론이 리간드에 의해 인코드된 많은 다른 메인-체인 형태를 평가하는데 이용된다. 인간 Vκ 도메인 내에서 L1 루프는 4개중 1개의 규범적 구조를 채택하고, L2 루프는 단일 규범적 구조를 지니고, 인간 Vκ 도메인의 90%가 L3 루프에 대한 4개 또는 5개의 규범적 구조 중 하나를 채택함이 알려져 있다(Tomlinson et al. (1995) 상동); 따라서 단독의 Vκ 도메인 내에서 다른 규범적 구조가 결합하여 다른 메인-체인 형태의 범위를 생성할 수 있다. Vλ 도메인이 L1, L2 및 L3 루프에 대한 다른 범위의 규범적 구조를 인코드하고 Vκ 및 Vλ 도메인이 H1 및 H2 루프에 대한 여러 규범적 구조를 인코드할 수 있는 VH 도메인과 쌍을 이룰 수 있는 경우 이들 5개 루프에 대해 관찰된 많은 규범적 구조 결합은 매우 크다. 이는 메인-체인 형태 내 다양한 생성이 광범위한 결합 특이성의 생성에 필수적임을 의미한다. 그러나 알려진 단일 메인-체인 형태에 기반한 항체 라이브러리를 구조함으로서 예측에 반하여 다양한 메인-체인 형태가 모든 항원을 실질적으로 타겟하기에 충분한 다양성을 생성하는데 필요하지 않다는 점이 발견되었다. 더욱 놀랍게는, 단일 메인-체인 형태는 컨센서스 구조일 필요가 없다 - 단일 자연 발생적 형태는 전체 라이브러리에 대한 기초로서 사용될 수 있다. 따라서 바람직한 관점에서 본 발명의 이중-특이적 리간드는 알려진 단일 메인-체인 형태를 보유한다.
선택된 단일 메인-체인 형태는 바람직하게는 의문의 면역글로불린 수퍼패밀린 타입의 분자 중 평범하다. 유의적인 수의 자연 발생적 분자가 이를 채택한 것으로 관찰되면 형태는 평범하다. 따라서 본 발명의 바람직한 관점에서 면역글로불린 도메인의 각 결합 루프에 대한 다른 메인-체인 형태의 자연적 발생은 개별적으로 여겨지고 이후 자연 발생적 변이가능 도메인은 어떤 것이 다른 루프에 대한 메인-체인 형태의 원하는 결합을 보유하는지 선택된다. 어떠한 것도 이용가능하지 않으면 가장 동등한 것이 선택된다. 다른 루프에 대한 메인-체인 형태의 원하는 결합이 원하는 메인-체인 형태를 인코드하는 생식세포계 유전자 세그먼트를 선택함으로서 생성되는 것이 바람직하다. 선택된 생식세포계 유전자 세그먼트가 자연적으로 빈번하게 발현되는 것이 더욱 바람직하고, 이들이 모든 자연적 생식세포계 유전자 세그먼트 중 가장 빈번하게 발현되는 것이 가장 바람직하다.
이중-특이적 리간드 또는 그의 라이브러리의 고안시 6개의 항원 결합 루프 각각에 대한 다른 메인-체인 형태의 발생률은 개별적으로 고려된다. H1, H2, L1, L2 및 L3의 경우 자연 발생적 분자의 항원 결합 루프의 20%와 100% 사이에 의해 채틱된 제공된 형태가 선택된다. 일반적으로 관찰된 발생률은 35% 이상(즉, 35%와 100% 사이)이고, 이상적으로는 50% 이상 또는 65% 이상이다. 광대한 H3 루프가 규범적 구조를 지니지 않기 때문에 규범적 구조를 디스플레이하는 루프 중 평범항 메인-체인 형태를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서 각 루프의 경우 자연적 레퍼토리 내에서 가장 빈번하게 관찰되는 형태가 선택된다. 인간 항체의 경우 각 루프에 대한 가장 일반적인 규범적 구조(CS)는 하기와 같다: H1 - CS 1(발현된 레퍼토리의 79%), H2 - CS 3(46%), Vκ의 L1 - CS 2(39%), Vκ의 L2 - CS 1(100%), V κ의 L3 - CS 1(36%)(계산은 κ: λ 비율을 70 : 30으로 가정한다, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 48:133). 규범적 구조를 지닌 H3 루프의 경우 94개 잔기 내지 101 잔기의 염-브리지를 지닌 7개의 잔기의 CDR3 길이(Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immuological interest U.S. Department of Health and Human Services)는 가장 일반적인 것으로 보인다. 그의 형태를 형성하는데 필요한 H3 길이 및 주용한 잔기를 지닌 EMBL 데이터 라이브러리 내에 적어도 16개 이상의 인간 항체 서열이 있고, 항체 모델링에 대한 기초로서 사용될 수 있는 단백질 데이터 뱅크 내에 적어도 2개 이상의 결정학적 구조가 있다(2cgr 및 1tet). 가장 빈번하게 발현되는 생식세포계 유전자 세그먼트는 규범적 구조의 이러한 결합이 VH 세그먼트 3-23(DP-47), JH 세그먼트 JH4b, Vκ 세그먼트 O2/O12(DPK9) 및 Jκ 세그먼트 Jκ1이다. VH 세그먼트 DP-47 및 DP38이 적당하다. 따라서 이들 세그먼트는 원하는 단일 메인-체인 형태를 지닌 라이브러리를 구조하는데 기초로서 결합되어 사용된다.
대안으로 용액 내 각 결합 루프에 대한 다른 메인-체인 형태의 자연적 발생에 기반하여 단일 메인-체인 형태를 선택하는 대신 메인-체인 형태 결합의 자연적 발생이 단일 메인-체인 형태를 선택하는 기초로서 사용된다. 항체의 경우 예를 들어 항원 결합 루프 6개 중 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모두에 대한 규범적 구조 결합의 자연적 발생이 측정될 수 있다. 여기서 선택된 형태는 자연 발생적 항체 내에서 평범한 것이 바람직하고, 자연적 레퍼토리 내에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이 가장 바람직하다. 따라서 인간 항체의 경우 예를 들어 5개 항원 루프, H1, H2, L1, L2 및 L3의 자연적 결합이 고려될 때 규범적 구조의 가장 빈번한 결합이 측정된 후 단일 메인-체인 형태를 선택하는 기초로서 H3 루프에 대한 가장 일반적인 형태로 결합된다.
ⅱ. 규범적 서열의 다양화
여러 알려진 메인-체인 형태 또는 바람직하게는 알려진 단일 메인-체인 형태를 선택시 구조적 및/또는 기능적 다양성을 지닌 레퍼토리를 생성하기 위해 본 발명에 따른 이중-특이적 리간드 또는 본 발명에 사용되는 라이브러리가 분자의 결합 사이트를 변화시킴으로서 구조될 수 있다. 이는 광범위한 활성을 제공할 수 있도록 그의 구조 및/또는 그의 기능 내에 충분한 다양성을 보유하도록 변이체가 생성됨을 의미한다.
원하는 다양성은 일반적으로 하나 이상의 위치에서 선택된 분자를 변이시킴으로서 생성된다. 변화되는 위치는 무작위로 선택될 수 있고 또는 바람직하게는 선택된다. 이후 변이는 잔여 아미노산이 자연적, 합성적 다른 아미노산 또는 그의 아날로그에 의해 대체되는 동안 무작위화되어 많은 변이체를 생성함으로서 또는 하나 이상의 정의된 아미노산 서브세트로 잔여 아미노산을 대체시켜 더욱 제한된 수의 변이체를 생성함으로서 달성된다.
이러한 다양성을 도입하는 다양한 방법이 보고되었다. 오류-경향 PCR(Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889), 화학적 돌연변이화(Deng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9533) 또는 박테리아 돌연변이 유발유전자 스트레인(Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260:359)이 분자를 인코드하는 유전자 내로 무작위 돌연변이를 도입시키는데 사용될 수 있다. 또한 선택된 위치를 돌연변이시키는 방법은 당분야에 잘 알려져 있고 PCR을 이용하여 또는 이용 없이 미스매치된 올리고뉴클레오타이드 또는 퇴보한 올리고뉴클레오타이드의 이용을 포함한다. 예를 들어 일부 합성 항체 라이브러리는 항원 결합 루프에 돌연변이를 타겟함으로서 생성되었다. 인간 파상풍 독소-결합 Fab의 H3 구역은 무작위화되어 신규한 결합 특이성 범위를 생성한다(Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4457). 무작위 또는 반-무작위 H3 및 L3 구역은 생식세포계 V 유전자 세그먼트에 부가되어 돌연변이화되지 않은 프레임워크 구역을 지닌 큰 라이브러리를 생성한다(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. 227:381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4457; Nissim et al. (1994) EMBO J. 13:692; Griffiths et al. (1994) AEMBO J 13:3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol. 248:97). 이러한 다양화는 다른 항원 결합 루프의 일부 또는 모두를 포함하는데 연장된다(Crameri et al. (1996) Nature Med. 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology 13:475; Morphosys, WO 97/08320, 상동).
루프 무작위화가 H3 단독의 약 1015개 이상의 구조 및 다른 5개 루프에 대한 유사하게 많은 변이체를 생성하는 잠재력을 지니기 때문에 현재 형질전환 기술을 이용하거나 모든 가능한 결합을 나타내는 라이브러리를 생성하는 세포 없는 시스템을 이용하는 것은 불가능하다. 예를 들어 현재 구조된 가장 큰 라이브러리 중 하나에서 이러한 고안의 라이브러리에 대한 잠재력 다양성의 단지 프랙션인 6 ×1010개 다른 항체가 생성된다(Griffiths et al. (1994) 상동).
바람직한 실시태양에서 분자의 원하는 기능을 생성하거나 변형시키는데 직접적으로 관련된 잔기만이 다양화된다. 많은 분자에 있어서 기능은 타겟에 결합하는 것이 될 것이고, 따라서 다양성은 타겟 결합 사이트 내에 집중되고, 분자의 전체 팩킹에 중요한 잔기를 변화시키거나 선택된 메인-체인 형태를 유지하는 것을 방지한다.
항체 도메인에 적용시 규범적 서열의 다양화
항체 이중-특이적 리간드의 경우 타겟에 대한 결합 사이트는 가장 빈번한 항원 결합 사이트이다. 따라서 매우 바람직한 관점에서 본 발명은 항원 결합 사이트 내 잔가기 변화된 항체 이중-특이적 리간드의 라이브러리 또는 그의 집합을 제공한다. 이들 잔기는 인간 항체 레퍼토리 내에서 매우 다양하고, 높은-레졸루션 항체/항원 복합체 내에서의 접촉을 야기하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 L2 내에서 위치 50 및 53은 자연 발생적 항체 내에서 다양하고 항원으로의 접촉을 야기하는 것으로 관찰됨이 알려져 있다. 반대로 통상의 접근은 Kabat et al. (1991, 상동)에 의해 정의된 Complementarity Determining Region(CDR1)에 상응하는 모든 잔기를 다양화시키고, 일부 7개 잔기는 본 발명에 따라 이용되는 라이브러리 내에서 2개의 다양화된 것과 비교된다. 이는 항원 결합 특이성 범위를 생성하는데 필요한 기능적 다양성면에서의 유의적인 개선을 나타낸다.
자연 상태에서 항체 다양성은 2개의 과정의 결과이다: 고유의 1차 레퍼토리(생식세포계 및 접합성 다양성으로 불림)를 생성하는 생식세포계 V, D 및 J 유전자 세그먼트 및 재배열된 V 유전자를 유발하는 체세포성 과돌연변이. 인간 항체 서열의 분석은 1차 레퍼토리 내의 다양성이 항원 결합 사이트의 중심으로 초점이 맞춰지는 반면 체세포성 과돌연변이는 1차 레포토리 내 매우 보존된 항원 결합 사이트의 주변에서 구역으로 다양성을 연장시킨다(Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256:813 참조). 이러한 상보성은 서열 공간을 검색하기 위한 효과적인 전략으로서 발달되었고, 분명히 항체에 유일하나 이는 다른 폴리펩타이드 레퍼토리에 용이하게 적용될 수 있다. 타겟 결합 사이트 내 잔기의 다른(중복을 포함) 서브세트는 원하는 경우 선택 동안 다른 단계에서 다양화된다.
항원 결합 사이트 내 잔기의 전부가 아닌 일부가 다양화될 때 항체 레퍼토리의 경우 초기 "고유의" 레퍼토리가 생성된다. 여기에 사용된 "고유의"라는 용어는 미리-측정된 타겟을 지닌 항체 분자를 나타낸다. 이들 분자는 태아 또는 신생아의 경우와 같이 면역 다양화를 겪지 않고, 면역 시스템이 다양한 항원 자극에 의해 도전되지 않은 개인의 면역글로불린 유전자에 의해 인코드된 것과 유사하다. 이후 이러한 레퍼토리는 항원 또는 에피토프 범위에 대해 선택된다. 이후 필요한 경우 다양성은 초기 레퍼토리 내에서 다양화된 구역 외로 도입될 수 있다. 이러한 성숙된 레퍼토리는 변형된 기능, 특이성 또는 친화력에 대해 선택될 수 있다.
본 발명은 항원 결합 사이트 내 일부 또는 모든 잔기가 변이된 이중-특이적 리간드의 구조를 위한 결합 도메인의 2개의 다른 고유 레퍼토리 또는 이중-특이적 리간드이 고유의 레퍼토리를 제공한다. "1차" 라이브러리는 생식세포계 V 유전자 세그먼트(생식세포계 다양성) 내에서 다양한 항원 결합 사이트의 중심에서 잔기에 국한되거나 재조합 과정(접합성 다양성) 동안 다양화된 다양성을 지닌 자연적 1차 레퍼토리를 모방한다. 다양화된 이들 잔기는 H50, H52, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. "체세포성" 라이브러리 내에서 다양성은 재조합 과정 동안 다양화되거나(접합성 다양성) 매우 체세포적으로 돌연변이된 잔기에 국한된다. 다양화된 이들 잔기는 H31, H32, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 및 L96을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이들 라이브러리 내 다양화에 적당한 상기 목록된 모든 잔기는 하나 이상의 항체-항원 복합체 내 접촉을 야기하는 것으로 알려져 있다. 둘 모두의 라이브러리 내에서 항원 결하 사이트 내의 어떤 잔기도 변이되지 않기 때문에 그렇게 하는 것이 바람직한 경우 부가적인 다양성은 잔여 잔기를 변이시킴으로서 선택 동안 통합된다. 이들 잔기의 어떠한 서브세트도(또는 항원 결합 사이트를 포함한 부가 잔기) 항원 결합 사이트의 초기 및/또는 하위 다양화에 사용될 수 있음은 당업자에게 명확해진다.
본 발명에 사용되는 라이브러리의 구조시 선택된 위치의 다양화는 일반적으로 핵산 수준에서 많은 가능한 아미노산(20개 모두 또는 그의 서브세트)이 그 위치에 통합될 수 있도록 폴리펩타이드의 서열을 명기하는 코딩 서열을 변화시킴으로서 달성된다. IUPAC 목록을 이용하여 가장 다목적인 코돈은 NNK이고, 이는 모든 아미노산 뿐만 아니라 TAG 정지 코돈을 인코드한다. 바람직하게는 필요한 다양성을 도입시키기 위해 NNK 코돈이 사용된다. 부가적 정지 코돈 TGA 및 TAA의 생성을 이끄는 NNN 코돈을 포함한 동일한 결과를 달성하는 다른 코돈도 이용된다.
인간 항체의 항원 결합 사이트 내 사이드-체인 다양성의 특징은 특정 아미노산 잔기를 선호하는 뚜렷한 성향이다. 각각의 VH, Vκ 및 Vλ 구역 내 10개의 가장 다양한 위치의 아미노산 조성물이 합계되면 76% 이상의 사이드-체인 다양성은 단지 7개의 다른 잔기로부터 유래하고, 이들은 세린(24%), 티로신(14%), 아스파라긴(11%), 글리신(9%), 알라닌(7%), 아스파테이트(6%) 및 트레오닌(6%)이다. 메인-체인 유연성을 제공할 수 있는 친수성 잔기 및 작은 잔기를 향한 이러한 성향은 광범위한 항원 또는 에피토프를 결합하도록 미리 처분되는 표면의 진화를 반영하고 1차 레퍼토리의 항체의 필요한 난잡성을 설명하는데 도움이 된다.
이러한 아미노산 분포를 모방하는 것이 바람직하기 때문에 변이되는 위치에서의 아미노산 분포는 바람직하게는 항체의 항원 결합 사이트 에 나타난 것을 모방한다. 타겟 항원의 범위에 대한 특정 폴리펩타이드(항체 폴리펩타이드만이 아닌)의 선택을 가능하게 하는 아미노산의 치환의 이러한 성향은 어떠한 폴리펩타이드 레퍼토리에도 용이하게 적용된다. 변이되는 위치에서 아미노산 분포를 한쪽으로 치우치게 하는 다양한 방법이 존재하고(트리-뉴클레오타이드 돌연변이화를 포함, WO 97/08320 참조), 이중에 바람직한 방법은 합성의 용이성으로 인해 통상의 퇴화된 코돈을 이용하는 것이다. 모든 퇴화된 코돈에 의해 인코드된 아미노산 프로파일(각 위치에서의 동일한 비율의 단일, 이중, 삼중 및 사중 퇴화)을 자연적 아미노산과 비교함으로서 가장 대표적인 코돈을 계산하는 것이 가능하다. 코돈 (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C 및 (AGT)(AGC)(CT) - 즉, 각각 IUPAC 목록을 이용한 DVT, DVC 및 DVY -은 원하는 아미노산 프로파일에 가장 근접한 것이다; 이들은 22% 세린 및 11% 티로신, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파테이트, 트레오닌 및 시스테인을 인코드한다. 바람직하게는 라이브러리는 각각의 다양화된 위치에서 DVT, DVC 또는 DVY 코돈을 이용하여 구조된다.
G. 리간드 반감기를 증가시킬 수 있는 항원
하나의 형상의 본 발명에 따른 이중-특이적 리간드는 생체 내에서 리간드의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 일반적으로 이러한 분자는 생체 내에서 자연적으로 발생하고, 생물체로부터 원치 않는 물질을 제거하는 내생적 메카니즘에 의한 분해 또는 제거에 저항하는 폴리펩타이드이다. 예를 들어 생물체의 반감기를 증가시키는 분자는 하기로부터 선택된다 :
세포외 매트릭스로부터의 단백질; 예를 들어 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주요한 단백질이다. 약 15개 타입의 콜라겐 분자가 현재 알려져 있고 신체의 다른 부위에서 발견된다 즉, 타입 I 콜라겐(신체 콜라겐의 90%)는 뼈, 피부, 건, 인대, 각막, 내부 기관 내에서 발견되고, 타입 II 콜라겐은 연골, 무척추동물 디스크, 척삭, 눈 유리액 내에서 발견된다.
피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브로겐 A, 피브로겐 B, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우네로글로불린 및 β-2-마이크로글로불린과 같은 플라스마 단백질을 포함한;
혈액 내에서 발견되는 단백질.
플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티티로신 및 췌장 티로신 억제제와 같은 효소 및 억제제. 플라스미노겐은 티로신-유사 세린 프로테아제 플라스민의 불활성 전구체이다. 이는 혈류를 통한 순환 내에서 발견된다. 플라스미노겐이 활성화되고 플라스민으로 전환되면 이는 응혈 내 혈액 세포를 어색하게 움직이게 하는 피브로겐 섬유를 분해시키는 유능한 효소 도메인을 펼쳐지게 한다. 이는 섬유소 분해로 불린다.
IgE, IgG, IgM과 같은 면역 시스템 단백질.
레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린과 같은 이동 단백질.
베타-디펜신(defensin) 1, 뉴트로필 디펜신 1, 2 및 3과 같은 디펜신.
멜라노콜틴 수용체, 마이엘린, 아스코르베이트 운송자와 같은 혈액 뇌벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질.
리간드-신경약품 융합 단백질에 특이적인 트랜스페린(transferrin) 수용체(미국특허 제5,977,307호 참조).
뇌 모세혈관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 생장 인자 1(IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 생장 인자 2(IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체.
폴리시스틴, 타입 Ⅳ 콜라겐, 유기 음이온 운송자 K1, 헤이만(Heymann') 항원과 같은 신장에 위치하는 단백질.
알코올 탈수소효소, G250과 같은 간에 위치하는 단백질.
혈액 응고 인자 X
α1 안티티로신
HNF 1α
분비 성분(IgA에 결합)과 같은 폐에 위치하는 단백질.
HSP 27과 같은 심장에 위치하는 단백질. 이는 팽창된 심근증에 관련된다.
케라틴과 같은 피부에 위치하는 단백질.
오스테오제닉(osteogenic) 활성을 증명하는 생장 인자 β 수퍼패밀리를 형질전환하는 서브세트인 뼈 형태발생적 단백질(BMPs)과 같은 뼈 특이적 단백질. 예는 BMP-2, -4, -5, -6, -7(오스테오제닉 단백질(OP-1)으로도 표기됨) 및 -8(OP-2)을 포함한다.
인간 트로포블라스트(trophoblast) 항원, 헤르셉틴(herceptin) 수용체, 오에스트로겐 수용체, 카텝신(carthepsin) 즉, 카텝신 B(간 및 비장에서 발견)를 포함한 종양 특이적 단백질.
활성화된 T-세포 상에서만 발현되는 항원과 같은 질병-특이적 단백질; LAG-3(림포사이트 활성 유전자), 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 리간드(OPGL), Nature 402:304-309; 1999 참조, OX40(불활성화된 T 세포 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 타입-Ⅰ(HTLV-Ⅰ)-생성 세포 내에서 특이적으로 상향-조절되는 것으로 알려진 동시 자극 T 세포 분자 상에서만 발현되는 TNF 수용체 패밀리 멤버), J. Immunol. 2000 Jul 1;165(1):263-70 참조; CG6512 초파리, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 쥐 ftsH를 포함한 메탈로프로테아제(metalloprotease)(관절염/암과 관련); 산성 피브로블라스트 생장 인자(FGF-1), 염기성 피브로블라스트 생장 인자(FGF-2), 혈관 내피 생장 인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF), 형질전환 생장 인자-a(TGF a), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 안지오게닌, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판-유도된 내피 생장 인자(PD-ECGF), 태반 생장 인자(P1GF), 미드킨 혈소판-유도 생장 인자-BB(PDGF), 프랙탈킨을 포함한 안지오게닉 생장 인자.
스트레스 단백질(열 충격 단백질)
HSPs는 일반적으로 세포내적으로 발견된다. 이들이 세포외적으로 발견되면 이는 세포가 죽었고 그의 내용물이 쏟아졌다는 지표이다. 이러한 프로그램화되지 않은 세포 사멸(괴사)은 외상, 질병 또는 상체의 결과로서만 발생하고, 따라서 생체 내에서 세포외 HSP는 감염 및 질병에 저항하는 면역 시스템으로부터의 반응을 시작시킨다. 세포외 HSP에 결합하는 이중 특이성은 질병 사이트에 위치될 수 있다.
Fc 운송에 관련된 단백질.
브램벨(brambell) 수용체(FcRB로 알려짐)
이러한 Fc 수용체는 2개의 기능을 지니고, 이 둘 모두는 운반에 잠재적으로 유용하다.
기능은
(1) 모친으로부터 자식으로 태반을 가로질러 IgG를 운반
(2) 분해로부터 IgG를 보호하여 IgG의 혈청 반감기를 증가시킴. 이는 수용체가 엔도솜으로부터 IgG를 재활용하는 것으로 판단됨.
Holliger et al., Nat Biotechnol 1997 Jul;15(7):632-6 참조.
본 발명에 다른 리간드는 생체 내 반감기의 증가를 필요로하지 않거나 이를 증가시키지 않고 상기 타겟에 특이적이도록 고안된다. 예를 들어 본 발명에 따른 리간드는 조직-특이적인 전술된 것으로부터 선택된 타겟에 특이적일 수 있어서 이것이 유발되더라도 반감기 증가에 관계없이 이중-특이적 리간드 또는 조직-특이적 치료적으로 관련된 타겟에 결합하는 dAb 단량체의 조직-특이적 타겟팅을 가능하게 한다. 더욱이 리간드 또는 dAb 단량체가 신장 또는 간에 타겟시 이는 대안적인 생체 내 제거(clearance) 경로로 리간드 또는 dAb 단량체를 재지시한다(예를 들어 리간드는 간 제거에서 멀리 떨어져서 신장 제거로 지시된다).
H : 본 발명의 두 번째 형상에 따른 다중 특이적 리간드의 이용
본 발명의 두 번째 형상의 방법에 따른 다중 특이적 리간드는 생체 내 치료적 및 예방적 적용, 시험관 내 및 생체 내 진단적 적용, 시험관 내 에세이 및 반응물 적용에 이용된다. 예를 들어 항체 분자는 당업자에게 알려진 기술에 따라 ELISA 기술과 같은 항체 기반 에세이 기술에 사용된다.
상기 논의된 바와 같이 본 발명에 따른 다중 특이적 리간드는 진단, 예방 및 치료 절차에 사용된다. 본 발명에 따른 다중 특이적 항체는 표준 면역조직화학적 절차에 따라 웨스턴 분석 및 원 위치에서의 단백질 검출에 진단적으로 사용된다; 이들 적용에서의 이용에 있어서, 리간드는 당분야에 알려진 기술에 따라 표지된다. 더욱이 이러한 항체 폴리펩타이드는 수지와 같은 크로마토그래프 서포트에 결합시 친화력 크로마토그래피 절차에 예비적으로 사용된다. 이러한 모든 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드의 진단적 이용은 경쟁하여 2개의 타겟에 결합하는 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드의 능력을 개발하는 분석물에 대한 상동적 에세이를 포함하여 2개의 타겟이 동시에 결합할 수 없거나(폐쇄 형상), 대안으로, 2개의 타겟에 동시에 결합할 수 있게 된다(개방 형태).
진정한 상동적 면역에세이 포맷이 약물 발견 및 개발에 이용되는 진단 및 연구 에세이의 제조자들에 의해 연구되었다. 주요한 진단 시장은 병원, 의사 사무실 및 진료실, 일반 참고 실험실, 혈액 은행 및 집, 비-인간 진단학(예를 들어 식품 테스팅, 수질 테스팅, 환경 테스팅, 생물-방어 및 수의학 테스팅) 및 최종적으로 연구(약물 개발; 기본 연구 및 학문적 연구를 포함)를 포함한다.
현재 이들 모두의 시장은 화학발광, ELISA, 형광 주위에 건조된 면역에세이 시스템 또는 드문 경우 방사성동위원소-면역에세이 기술을 이용한다. 이들 에세이 포맷 각각은 분리 단계(비-결합된 반응물로부터 결합된 것을 분리)를 요구한다. 일부의 경우 여러 분리 단계가 요구된다. 이들 부가적 단계를 첨가하는 건은 반응물, 자동화 및 수행 시간을 첨가하고, 에세이의 절대 결과에 영향을 미친다. 인간 진단의 경우 분리 단계는 자동화되고, 이는 문제점을 감추나 이를 제거하지 않는다. 로봇을 이용한 부가적 반응물, 부가적 인큐베이션 시간 등은 상당한 비용 및 복잡성을 부가한다. 높은 작업처리량 스크리닝과 같은 약물 개발시 실제 백만개의 표본이 매우 낮은 수준의 시험 분자로 한번에 시험시 부가적 분리 단계를 추가하는 것이 스크린을 수행살 수 있는 능력을 제거시킬 수 있다. 그러나 분리 제거는 판독시 너무 많은 소음을 생성시킨다. 따라서 현재 에세이 포맷으로부터 수득가능한 범위에서 민감도를 제공하는 진정한 상동적 포맷에 대한 필요성이 있다. 유리하게는 에세이는 고 민감도를 지닌 충분히 정량적인 판독 및 큰 역동적 범위를 보유한다. 민감도는 필요한 표본의 양을 감소시키면 중요한 필요조건이다. 이들 특징 모두는 상동적 시스템이 제공하는 특징이다. 이는 표본이 고가일 때 케어 테스팅 및 약물 개발에 매우 중요한 포인트이다. 당분야에 현재 이용되는 이형적 시스템은 많은 양의 표본 및 고비용의 반응물을 요구한다.
가장 큰 에세이가 전립선 특이적 항원을 위한 것일 때 상동적 에세이에 대한 적용은 전립선 암에 대해 남성을 스크린하는데 사용된다. 다른 적용은 수정능력 테스팅을 포함하고, 이는 임신에 대한 베타-hcg를 포함한 것을 이해하는 시도를 하는 여성에게 테스트 시리즈를 제공한다. 간염, HIV, 풍진 및 다른 바이러스 및 미생물 및 성적으로 전달된 질병을 포함한 전염성 질환에 대한 시험. 시험은 혈액 은행에 의한 시험, 특히 HIV, 간염 A, B, C, 비 A 비 B에 대한 시험이 이용된다. 치료적 약물 모니터링 시험은 환자에게 효율적이고 부정맥용 디작신과 같은 독성을 방지하기 위한 처방 약물에 대한 수준 및 정신병의 경우 페노바르비탈 수준 - 천식용 티오필린 - 을 모니터링하는 것을 포함한다. 더욱이 진단 시험은 코카인, 마리화나 등의 시험과 같은 약물 남용 시험에 유용하다. 대사작용 시험은 갑상선 기능, 빈혈증 및 다른 생리적 장애 및 기능을 측정하는데 이용된다.
더욱이 상동적 면역에세이 포맷은 표준 임상 화학 에세이의 제조에 유용하다. 동일한 기구 내 면역에세이와 화학 에세이의 포함은 진단 시험에 매우 유리하다. 적당한 화학 에세이는 글루코스, 콜레스테롤, 칼륨 등에 대한 시험을 포함한다.
상동적 면역에세이에 대한 또다른 주요 적용은 약물 발견 및 개발이다: 높은 작업처리량 스크리닝은 극도로 높은 부피 내에서 타겟에 대한 결합적 화학 라이브러리의 시험을 포함한다. 신호가 검출된 후 양성 그룹이 더 작은 그룹 내로 분열되고, 최종적으로 세포 및 동물 내에서 시험된다. 상동적 에세이는 이들 모든 타입의 시험에 사용된다. 약물 개발시 특히 면역에세이의 거대한 이용의 동물 연구 및 임상 시험이 이루어진다. 다른 적용은 식품 및 음료 시험을 포함한다: E. coli, 살모넬라 등에 대한 육류 및 다른 식품 시험; E. coli를 포함한 모든 타입의 오염물에 대한 식수 공장에서의 수질 시험; 및 수의학 시험.
광범위한 실시태양에서 본 발명은 본 발명에 따른 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드에 결합된 검출가능한 약제를 포함한 결합 에세이를 제공하고, 이의 검출가능 성질은 상기 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드에 대한 반응물의 결합에 의해 변화된다. 이러한 여러 다른 방법에 의해 형상화되고, 각각은 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드의 상기 성질을 이용한다.
에세이는 반응물에 의한 약제의 직접적 또는 간접적 이동에 따라 달라지고, 이는 약제의 검출가능 성질 내 변화를 야기한다. 예를 들어 약제가 검출가능한 종료점을 지닌 반응을 촉매할 수 있는 효소인 경우 상기 효소는 그의 활성 사이트를 차단하는 것과 같이 리간드에 의해 결합될 수 있어서 효소를 불활성화시킨다. 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드에 의해 결합되는 반응물은 효소를 이동시키고, 이를 활성 사이트의 해방을 통해 활성이게 한다. 이후 효소는 기질과 반응할 수 있게 하여 검출가능한 이벤트를 제공한다. 대안적 실시태양에서 리간드는 활성 사이트 외부에서 효소에 결합하고 효소의 형태에 영향을 미치고 그의 활성을 변화시킨다. 예를 들어 활성 사이트의 구조는 리간드의 결합에 의해 억제되거나 활성에 필요한 공동 인자의 결합이 방지된다.
에세이의 물리적 이행은 당분야에 알려진 어떠한 형태도 취한다. 예를 들어 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드/효소 복합체가 시험 스트립에 제공된다; 기질은 시험 스트립의 다른 구역 내에 제공되고, 반응물을 함유한 용매가 리간드/효소 복합체를 통해 이동하게 되고, 효소를 이동시키고 신호를 생성하는 기질 구역 내로 이를 운반한다. 대안으로, 리간드/효소 복합체는 시험 스틱 또는 다른 고형상 상에 제공되고 반응물/기질 용액 내로 담기고, 반응물의 존재에 반응하여 효소를 용액 내로 해리시킨다.
반응물의 각 분자가 잠재적으로 하나의 효소 분자를 해리시키기 때문에 에세이는 용액 내 반응물의 농도에 따라 다르게 제공된 시간 내에서 생성된 신호의 강도를 지닌 양적인 것이다.
폐쇄 형태 내 반응물을 이용한 또다른 형상이 가능하다. 예를 들어 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드는 알로스테릭한 사이트 내에서 효소에 결합하도록 형상화되어; 효소를 활성화시킨다. 이러한 실시태양에서 효소는 반응물의 부재시 활성이다. 반응물의 첨가는 효소를 이동시키고 알로스테릭 활성을 제거하여 효소를 불활성화시킨다.
반응물 농도의 측정으로서 효소 활성을 이용하는 상기 실시태양의 배경 내에서 효소의 활성화 또는 불활성화는 신호-생성 반응을 촉매하는 효소의 능력으로서 측정된 효소 활성의 증가 또는 감소를 나타낸다. 예를 들어 효소는 비검출가능 기질의 그의 검출가능 형태로의 전환을 촉매한다. 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제가 색원성 또는 화학발광성 기질로 당분야에 널리 사용되고 상업적으로 통용된다. 효소 활성의 증가 또는 감소 수준은 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%와 같이 10%와 100% 사이이다; 활성 감소의 경우 감소는 100% 이상, 즉 200%, 300%, 500% 이상이고 또는 억제된 효소의 베이스라인 활성이 검출가능하지 않은 경우 백분율로서 측정가능하지 않다.
또다른 형상에서 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드는 효소보다는 효소/기질 쌍 기질에 결합한다. 따라서 기질은 반응물의 결합을 통해 폐쇄 형태 다중 특이적 리간드로부터의 해리될 때까지 효소에 사용될 수 없다. 이러한 형상의 이해는 효소에 결합하는 형상과 마찬가지이다.
더욱이 에세이는 리간드에 결합 후 형광이 제거되는 형태로 플루오로세인 또는 다른 플루오로포어와 같은 형광 분자에 결합하도록 형상화된다. 이러한 경우 리간드에 대한 반응물의 결합은 형광 분자를 이동시켜 신호를 생성한다. 본 발명에 유용한 형광 분자의 대안은 HRP와 같은 면역에세이에 일반적으로 사용되는 약제를 포함하여 루시페린/루시페라제와 같은 발광제를 포함한다.
본 발명에 따라 제조된 다중 특이적 리간드의 치료적 및 예방적 이용은 인간과 같은 수용 포유류로의 본 발명에 따른 리간드의 투여를 포함한다. 다중-특이성은 항체가 큰 화합력으로 다중 결합성 항원에 결합하게 할 수 있다. 다중 특이적 리간드는 예를 들어 종양 세포주의 사멸을 중개하는 세포파괴성 T-세포를 모집하여 2개 항원의 교차-결합을 가능하게 할 수 있다.
적어도 90∼95% 상동성의 실질적으로 순수한 리간드 또는 그의 결합 단백질, 예를 들어 dAb 단량체가 포유로 투여에 바람직하고, 포유류가 인간인 경우 98∼99% 이상의 상동성이 약제적 사용에 바람직하다. 부분적으로 또는 상기 기술된 바와 같은 상동성으로 정제되면 리간드는 진단적으로 또는 치료적으로(체외적으로를 포함) 사용되고 또는 에세이 절차, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용된다(Lefkovite and Pernis (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
본 발명의 리간드 또는 그의 결합 단백질, 예를 들어 dAb 단량체는 일반적으로 염증성 상태, 알레르기성 과민성, 암, 박테리아성 또는 바이러스성 감염 및 자가면역 장애(타입 I 당뇨병, 천식, 다발성경피증, 류머티즘성 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 크론병 및 중증근무력증을 포함하나 이에 한정적이지 않음)를 예방하거나 억제하거나 치료하는데 사용될 것이다.
즉각적 적용시 "예방"이라는 용어는 질병 유도 전 보호성 조성물의 투여를 포함한다. "억제"는 유도성 이벤트 후이나 질병의 임상적 출현 전 조성물의 투여를 나타낸다. "치료"는 질병 징후가 나타난 후 보호성 조성물의 투여를 포함한다.
질병에 대해 보호 또는 이에 대한 치료시 항체 또는 그의 결합 단백질의 효율성을 스크린하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용될 수 있다. 민감성 마우스 내 전신성 홍반성 낭창(SLE)의 치료 방법은 당분야에 알려져 있다(Knight et al. (1987) J. Exp. Med. 147:1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med. 299:515). 중증근무력증(MG)은 다른 종으로부터의 용해성 AchR 단백질로 질병을 유도함으로서 SJL/J 암컷 마우스에서 시험되었다(Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol. 42:233). 관절염은 타입 II 콜라겐의 주입에 의해 마우스의 민감성 스트레인 내에서 유도된다(Stuart et al. (1984) Ann, Rev. Immunol. 42:233). 보조 관절염이 마이코박테리아성 열 충격 단백질의 주입에 의해 민감성 래트에서 유도되는 모델이 기술되어 있다(Van Eden et al. (1988) Nature 331:171). 갑상선염은 기술된 바와 같이 티로글루불린의 투여에 의해 마우스 내에서 유도된다(Maron et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1115). 제1형 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM)은 자연적으로 발생할 수 있거나 Kanasawa et al. (1984) Diabetologia 27:113에 기술된 바와 같은 마우스의 특정 스트레인 내에서 유도될 수 있다. 마우스 및 래트 내 EAE는 인간 내 MS에 대한 모델로 작용한다. 이러한 모델에서 미엘린파괴 질환은 미엘린 기초 단백질의 투여에 의해 유도된다(Paterson (1986) Textbook of Immunology, Mischer et al., eds, Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; MaFarlin et al. (1973) Science, 179:478; 및 Satoh et al. (1987) J. Immunol. 138:179 참조).
일반적으로 본 리간드는 약제적으로 적당한 담체와 함께 정제되어 사용될 것이다. 일반적으로 이들 담체는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 식염수 및/또는 완충 보존액을 포함한 것을 포함한다. 비경구성 부형약은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 텍스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트 링거를 포함한다. 폴리펩타이드 복합체를 현탁액 내에 유지시킬 필요가 있는 경우 적당한 생리적으로-수용가능한 보조제가 카르복실메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 농축제로부터 선택된다.
정맥주사 부형약은 링거 덱스트로스에 기반한 것과 같은 유체 및 영양 공급제 및 전해질 공급제를 포함한다. 또한 향균제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체와 같은 방부제 및 다른 첨가제가 존재한다(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition).
본 발명의 리간드는 개별적으로 투여되는 조성물로서 또는 다른 약제와 결합하여 사용된다. 이들은 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리마이신 또는 시스플라티넘 및 면역독소와 같은 다양한 면역치료성 약물을 포함한다. 약제적 조성물은 투여전에 공동으로 모이는 것에 관계없이 본 발명의 리간드와 결합하거나 다른 타겟 항원 또는 에피토프를 이용하여 선택된 리간드와 같은 다른 특이성을 지닌 본 발명에 따른 리간드와 결합하여 다양한 세포독성 또는 다른 약제의 "칵테일"을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제적 조성물의 투여 루트는 당업자에게 일반적으로 알려진 것에 의해 이루어진다. 면역치료의 제한없는 것을 포함하여 치료의 경우 본 발명의 선택된 리간드는 표준 기술에 따라 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 비경구적으로, 정맥 주시로, 근육 내로, 복막 내로, 경피적으로, 폐 루트를 통해 또한 적당히 카테테르와의 직접적 주입에 의해 적당한 모드가 될 수 있다. 투여의 투여량 및 빈도는 환자의 연령, 성별 및 조건, 다른 약물의 투여, 카운터인디케이션, 임상에 의해 고려되는 다른 파라미터에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 리간드는 보관을 위해 동결건조될 수 있고 사용 전 적당한 담체 내에 재구조될 수 있다. 이러한 기술은 사용될 수 있는 통상의 면역글로불린 및 당분야에 알려진 동결건조 및 재구조 기술과 효과적인 것으로 나타났다. 당업자에 의해 동결건조 및 재구조가 항체 활성 손실 정도를 변화시킬 수 있고(즉, 통상의 면역글로불린으로 IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 지니는 경향이 있음) 사용 수준은 보상을 향해 조정된다.
본 리간드들 포함한 조성물 또는 그의 칵테일은 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 특정 치료 적용시 선택된 세포 집단의 적어도 부분적 저해, 억제, 조절, 사멸 또는 일부 다른 측정가능한 파라미터를 달성하는 적당한 양은 "치료적으로-효과적인 투여량"으로 정의된다. 이러한 투여량을 달성하는데 필요한 양은 질병의 민감도 및 환자 자신의 면역 시스템의 일반적 상태에 따라 달라지나 일반적으로 체중의 킬로그램 당 0.005∼5.0 mg의 리간드 즉, 항체, 수용체(즉, T-세포 수용체) 또는 그의 결합 단백질의 범위이고, 0.05∼2.0 mg/kg/투여량의 투여량이 더욱 일반적으로 사용된다. 또한 예방적 적용의 경우 본 리간드를 포함한 조성물 또는 그의 칵테일은 유사하거나 다소 낮은 투여량으로 투여된다.
여기에 기술된 조성물을 이용하여 수행된 치료는 치료전에 나타난 징후에 비해 또는 이러한 조성물로 치료되지 않은 개체(인간 또는 모델 동물) 내 이러한 징후에 비해 하나 이상의 징후가 제거되면(즉, 적어도 10% 이상 또는 임상 평가 규모 상의 적어도 하나의 포인트 이상까지) "효과적인"것으로 고려된다. 징후는 분명히 타겟된 질병 또는 장애에 따라 매우 다르게 될 것이나 임상학자 또는 기술자에 의해 측정될 수 있다. 이러한 징후는 예를 들어 질병 또는 질환의 하나 이상의 생화학적 지표 수준을 모니터링함으로서(즉, 질병에 연관되거나 세포 수에 영향을 미치는 효소 또는 대사물질의 수준), 물리적 징후를 모니터링함으로서(즉, 염증, 종양 크기 등) 또는 수용된 임상 평가 규모 예를 들어 Expanded Disability Status Scale(다발성 경화증의 경우), Irvine Inflammatory Bowel Disease Questionnarie(32 포인트 평가는 창자 기능, 전신 징후, 사회적 기능 및 감정적 상태에 관한 삶의 질을 평가함 - 점수는 32∼224까지의 범위이고 더 높은 점수는 더 좋은 삶의 질을 나타냄), Quality of Life Rheumatoid Arthritis Scale 또는 다른 당분야에 알려진 수용된 임상 평가 규모에 의해 측정될 수 있다. 제공된 임상적 규모 상에서 적어도 10% 이상까지 또는 하나 이상의 포인트까지 질병 또는 장애 내 유지된(즉, 1일 이상, 바람직하게는 그 이상) 감소는 "효과적인" 치료의 지표이다. 유사하게는, 하나 이상의 징후의 착수 또는 고통이 조성물로 처리되지 않은 유사한 개체(인간 또는 동물 모델)에서의 이러한 징후에 비해 지연되거나 감소되거나 제거되면 여기에 사용된 조성물을 이용하여 수행된 예방은 "효과적"이다.
본 발명에 따른 조성물을 포함한 조성물 또는 그의 칵테일은 동물 내 선택 타겟 세포 집단의 변화, 불활성화, 사멸 또는 제거를 돕는 예방적 및 치료적 셋팅에 사용된다. 더욱이 여기에 기술된 폴리펩타이드의 선택된 레퍼토리는 세포의 이형적 집합으로부터의 타겟 세포 집단을 사멸시키거나 고갈시키거나 그렇지 않은 경우 효과적으로 제거시키기 위해 체외적으로 또는 시험관 내에서 선택적으로 사용된다. 포유류로부터의 혈액은 리간드 즉, 항체, 세포-표면 수용체 또는 그의 결합 단백질과 체외적으로 결합되어 표준 기술에 따라 포유류로 귀환하기 위한 혈액으로부터 원치 않는 세포가 사멸되거나 그렇지 않은 경우 제거된다.
I : 본 발명에 따른 반감기가 증가된 이중-특이적 리간드의 이용
본 발명의 방법에 따른 이중-특이적 리간드는 생체 내 치료적 및 예방적 적용, 생체 내 진단적 적용 등으로 사용된다.
본 발명에 따라 제조된 이중-특이적 리간드의 치료적 및 예방적 이용은 인간과 같은 수용 포유류로의 본 발명에 따른 리간드의 투여를 포함한다. 본 발명에 따른 이중-특이적 리간드는 적어도 하나 이상의 반감기 증가 분자의 특이성을 포함한다; 하나 이상의 또다른 특이성은 타겟 분자에 대해 지시된다. 예를 들어 이중-특이적 IgG는 4개의 에피토프에 대해 특이적이고, 이중 하나는 반감기 증가 분자 상에 있다. 이중-특이성은 항체가 큰 화합력으로 다중 결합성 항원에 결합하게 할 수 있다. 이중-특이적 항체는 예를 들어 종양 세포주의 사멸을 매개하는 세포분해성 T-세포의 모집시 2개의 항원의 교차-결합을 가능하게 할 수 있다.
실질적으로는 적어도 90∼95% 이상의 상동성의 순수 리간드 또는 dAb 단량체 그의 결합 단백질이 포유류에 대한 투여에 바람직하고, 특히 포유류가 인간인 경우 98∼99% 이상의 상동성의 약제적 이용에 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 상기 기술된 바와 같은 상동성으로 정제되면 리간드는 진단적으로 또는 치료적으로(체외적으로를 포함) 사용되고 또는 에세이 절차, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용된다(Lefkovite and Pernis (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
본 발명의 리간드는 일반적으로 염증성 상태, 알레르기성 과민성, 암, 박테리아성 또는 바이러스성 감염 및 자가면역 장애(타입 I 당뇨병, 천식, 다발성경피증, 류머티즘성 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 크론병 및 중증근무력증을 포함하나 이에 한정적이지 않음)를 예방하거나 억제하거나 치료하는데 사용될 것이다.
즉각적 적용시 "예방"이라는 용어는 질병 유도 전 보호성 조성물의 투여를 포함한다. "억제"는 유도성 이벤트 후이나 질병의 임상적 출현 전 조성물의 투여를 나타낸다. "치료"는 질병 징후가 나타난 후 보호성 조성물의 투여를 포함한다.
질병에 대해 보호 또는 이에 대한 치료시 항체 또는 그의 결합 단백질의 효율성을 스크린하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용될 수 있다. 민감성 마우스 내 전신성 홍반성 낭창(SLE)의 치료 방법은 당분야에 알려져 있다(Knight et al. (1987) J. Exp. Med. 147:1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med. 299:515). 중증근무력증(MG)은 다른 종으로부터의 용해성 AchR 단백질로 질병을 유도함으로서 SJL/J 암컷 마우스에서 시험되었다(Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol. 42:233). 관절염은 타입 II 콜라겐의 주입에 의해 마우스의 민감성 스트레인 내에서 유도된다(Stuart et al. (1984) Ann, Rev. Immunol. 42:233). 보조 관절염이 마이코박테리아성 열 충격 단백질의 주입에 의해 민감성 래트에서 유도되는 모델이 기술되어 있다(Van Eden et al. (1988) Nature 331:171). 갑상선염은 기술된 바와 같이 티로글루불린의 투여에 의해 마우스 내에서 유도된다(Maron et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1115). 제1형 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM)은 자연적으로 발생할 수 있거나 Kanasawa et al. (1984) Diabetologia 27:113에 기술된 바와 같은 마우스의 특정 스트레인 내에서 유도될 수 있다. 마우스 및 래트 내 EAE는 인간 내 MS에 대한 모델로 작용한다. 이러한 모델에서 미엘린파괴 질환은 미엘린 기초 단백질의 투여에 의해 유도된다(Paterson (1986) Textbook of Immunology, Mischer et al., eds, Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; MaFarlin et al. (1973) Science, 179:478; 및 Satoh et al. (1987) J. Immunol. 138:179 참조).
본 발명에 따른 이중-특이적 리간드 및 dAb 단량체는 이중-특이적 리간드가 엔토사이토스되는 것을 가능하게 하는 엔도시토시스에 관련된 세포외 타겟(즉, 클라트린)에 결합할 수 있고, 세포내 타겟에 결합할 수 있는 또다른 특이성이 세포내 환경에 전달될 수 있게 한다. 이러한 전략은 세포 내에서 기능적이도록 유지시킬 수 있게 하는 물리적 성질을 지니고 이중-특이적 리간드를 필요로 한다. 대안으로, 최종 목적지가 세포내 구획이 산화되면 잘 폴드된 리간드가 2황화물 없는 것이 될 필요는 없다.
일반적으로, 본 이중-특이적 리간드는 약제적으로 적당한 담체와 함께 정제된 형태로 사용될 것이다. 일반적으로 이들 담체는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 식염수 및/또는 완충 보존액을 포함한 것을 포함한다. 비경구성 부형제는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 텍스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트 링거를 포함한다. 폴리펩타이드 복합체를 현탁액 내에 유지시킬 필요가 있는 경우 적당한 생리적으로-수용가능한 보조제가 카르복실메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 농축제로부터 선택된다.
정맥주사 부형제는 링거 덱스트로스에 기반한 것과 같은 유체 및 영양 공급제 및 전해질 공급제를 포함한다. 또한 향균제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체와 같은 방부제 및 다른 첨가제가 존재한다(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition).
본 발명의 리간드는 개별적으로 투여되는 조성물로서 또는 다른 약제와 결합하여 사용된다. 이들은 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리마이신 또는 시스플라티넘 및 면역독소와 같은 다양한 면역치료성 약물을 포함한다. 약제적 조성물은 투여전에 공동으로 모이는 것에 관계없이 본 발명의 리간드와 결합하거나 다른 타겟 항원 또는 에피토프를 이용하여 선택된 리간드와 같은 다른 특이성을 지닌 본 발명에 따른 리간드와 결합하여 다양한 세포독성 또는 다른 약제의 "칵테일"을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제적 조성물의 투여 루트는 당업자에게 일반적으로 알려진 것에 의해 이루어진다. 면역치료의 제한없는 것을 포함하여 치료의 경우 본 발명의 선택된 리간드는 표준 기술에 따라 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 비경구적으로, 정맥 주시로, 근육 내로, 복막 내로, 경피적으로, 폐 루트를 통해 또한 적당히 카테테르와의 직접적 주입에 의해 적당한 모드가 될 수 있다. 투여의 투여량 및 빈도는 환자이 연령, 성별 및 조건, 다른 약물의 투여, 카운터인디케이션, 임상에 의해 고려되는 다른 파라미터에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 리간드는 보관을 위해 동결건조될 수 있고 사용 전 적당한 담체 내에 재구조될 수 있다. 이러한 기술은 사용될 수 있는 통상의 면역글로불린 및 당분야에 알려진 동결건조 및 재구조 기술과 효과적인 것으로 나타났다. 당업자에 의해 동결건조 및 재구조가 항체 활성 손실 정도를 변화시킬 수 있고(즉, 통상의 면역글로불린으로 IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 지니는 경향이 있음) 사용 수준은 보상을 향해 조정된다.
본 리간드들 포함한 조성물 또는 그의 칵테일은 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 특정 치료 적용시 선택된 세포 집단의 적어도 부분적 저해, 억제, 조절, 사멸 또는 일부 다른 측정가능한 파라미터를 달성하는 적당한 양은 "치료적으로-효과적인 투여량"으로 정의된다. 이러한 투여량을 달성하는데 필요한 양은 질병의 민감도 및 환자 자신의 면역 시스템의 일반적 상태에 따라 달라지나 일반적으로 체중의 킬로그램 당 0.005∼5.0 mg의 리간드 즉, 항체, 수용체(즉, T-세포 수용체) 또는 그의 결합 단백질의 범위이고, 0.05∼2.0 mg/kg/투여량의 투여량이 더욱 일반적으로 사용된다. 또한 예방적 적용의 경우 본 리간드를 포함한 조성물 또는 그의 칵테일은 유사하거나 다소 낮은 투여량으로 투여된다.
본 발명에 따른 조성물을 포함한 조성물 또는 그의 칵테일은 동물 내 선택 타겟 세포 집단의 변화, 불활성화, 사멸 또는 제거를 돕는 예방적 및 치료적 셋팅에 사용된다.
더욱이 여기에 기술된 폴리펩타이드의 선택된 레퍼토리는 세포의 이형적 집합으로부터의 타겟 세포 집단을 사멸시키거나 고갈시키거나 그렇지 않은 경우 효과적으로 제거시키기 위해 체외적으로 또는 시험관 내에서 선택적으로 사용된다. 포유류로부터의 혈액은 리간드 즉, 항체, 세포-표면 수용체 또는 그의 결합 단백질과 체외적으로 결합되어 표준 기술에 따라 포유류로 귀환하기 위한 혈액으로부터 원치 않는 세포가 사멸되거나 그렇지 않은 경우 제거된다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 기술된다. 여기에 사용된 바와 같이 dAb 명명의 목적으로 인간 TNFα는 TAR1로 표기되고, 인간 TNFα 수용체 I(p55 수용체)는 TAR2로 표기된다.
(실시예 1) 인간 혈청 알부민(HSA) 및 β-갈락토시다제(β-gal)에 대해 지시된 이중-특이적 scFv 항체(K8)의 선택
본 실시예는 생식세포계(모형) VH 도메인에 결합된 Vκ 변이가능 도메인의 레퍼토리가 β-gal로의 결합에 대해 선택되고, 생식세포계(모형) Vκ 도메인에 결합된 VH 변이가능 도메인의 레퍼토리가 HSA로의 결합에 대해 선택되는 β-gal 및 HSA에 대해 지시된 이중-특이적 항체를 제조하는 방법을 설명한다. 이후, 선택된 변이가능 VH HSA 및 Vκ HSA 및 β-gal 도메인이 결합되고 β-gal 및 HSA에 대해 항체가 선택된다. HSA는 인간 혈액 내에서 발견된 반감기 증가 단백질이다.
4개의 인간 파지 항체 라이브러리가 본 실험에서 사용되었다.
라이브러리 1 생식세포계 Vκ/DVT VH 8.46 ×107
라이브러리 2 생식세포계 Vκ/NNK VH 9.64 ×107
라이브러리 3 생식세포계 VH/DVT Vκ 1.47 ×108
라이브러리 4 생식세포계 VH/NNK Vκ 1.45 ×108
모든 라이브러리는 상보성 측정 구역(CDR2 및 CDR3) 내에 통합된 사이드 체인 다양성을 지닌 VH(V3-23/DP47 및 JH4b) 및 Vκ(O12/O2/DPK9 및 Jκ1)에 대한 단일 프레임워크에 기반한다.
라이브러리 1 및 라이브러리 2는 모형 Vκ 서열을 포함하는 반면, VH 서열은 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97 및 H98 위치에서 다양화된다(각각 DVT 또는 NNK 인코드됨)(도 1). 라이브러리 3 및 라이브러리 4는 모형 VH 서열을 포함하는 반면, Vκ 서열은 L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96 위치에서 다양화된다(각각 DVT 또는 NNK 인코드됨)(도 1). 라이브러리는 파지미드 pIT2/scFv 포맷 내에 존재하고(도 2), 일반 리간드, 단백질 A 및 단배질 L로의 결합에 대해 미리 선택되어 선택되지 않은 라이브러리 내의 대다수의 클론이 기능성이 된다. 상기 나타난 라이브러리의 크기는 미리 선택 후 크기에 상응한다. 라이브러리 1 및 라이브러리 2는 선택 전에 항원 상에서 혼합되어 단일 VH/모형 Vκ라이브러리를 산출하고, 라이브러리 3 및 라이브러리 4는 혼합되어 단일 Vκ/모형 VH라이브러리를 형성한다.
선택의 3개 라운드가 Vκ/모형 VH라이브러리를 이용하여 β-gal 상에서 수행되었고, 선택의 3개 라운드가 VH/모형 Vκ라이브러리를 이용하여 HSA 상에서 수행되었다. β-gal의 경우 파지 적정농도는 첫 번째 라운드 내 1.1 ×106에서 세 번째 라운드 내 2.0 ×108까지 되었다. HSA의 경우 파지 적정농도는 첫 번째 라운드 내 2 ×104에서 세 번째 라운드 내 1.4 ×109까지 되었다. 선택은 KM13 헬퍼 파지(D2와 D3 사이의 프로테아제 분열 사이트를 지닌 pⅢ 단백질을 포함한)가 사용되고 파지가 PBS 내의 1 mg/ml 트립신으로 용출되는 것을 제외하고는 Griffith et al. (1993)에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. 트립신의 첨가는 헬퍼 파지로부터 유도된 pⅢ 단백질을 분열시키고(파지미드로부터의 것이 아닌) c-myc tag 내 분열에 의해 결합된 scFv-파지 융합을 용출시켜(도 2), 기능성 scFv를 발현하는 파지에 대한 풍부화 및 백그라운드 내 상응하는 감소를 더욱 제공한다(Kristensen & Winter, Folding & Design 3:321-328, Jul 9, 1998). 선택은 100 ㎍/ml 농도에서 HSA 또는 β-gal로 코팅된 면역시험관을 이용하여 수행되었다.
결합에 대해 점검하기 위해 각 선택의 세 번째 라운드로부터의 24개 콜로니가 단일클론 파지 ELISA에 의해 스크린되었다. 파지 입자는 Harrison et al. Method Enzymol. 1996, 267:83-109에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. 96-웰 ELISA 플레이트는 4℃에서 밤새 10 ㎍/ml 농도에서 100 ㎕의 HSA 또는 β-gal로 코팅되었다. 항-M13-HRP 컨쥬게이트로의 결합된 파지의 검출을 이용하여 표준 ELISA 프로토콜이 수행되었다(Hoogenboom et al. 1991). 선택 콜로니는 50 ㎕ 상청액으로 1.0 이상의 ELISA 신호를 제공하였다.
다음으로, 예비 DNA는 QIAprep Spin Miniprep 키트(Quiagen)을 이용하여 HSA 상에서 선택된 VH/모형 Vκ라이브러리 및 β-gal 상에서 선택된 Vκ/모형 VH라이브러리로부터 제조되었다. 대부분의 다양성을 평가하기 위해 예비 DNA가 3개 라운드의 선택 각각으로부터 제조된 후 각각의 항원과 함께 끌렸다. 이후 예비 DNA는 37℃에서 밤새 SalI/NotI로 분해되었다. 단편의 겔 정제 후 β-gal 상에서 선택된 Vκ/모형 VH라이브러리로부터의 Vκ 체인이 HSA 상에서 선택된 VH/모형 Vκ라이브러리의 모형 Vκ 체인의 위치에서 결찰되어 3.3 ×109 클론의 라이브러리를 생성하였다.
이후 본 라이브러리는 HSA(첫 번째 라운드) 및 β-gal(두 번째 라운드) 상에서 선택, HSA/β-gal 선택 또는 β-gal(첫 번째 라운드) 및 HSA(두 번째 라운드) 상에서, 선택, β-gal/HSA 선택되었다. 선택은 상기 기술된 바와 같이 수행되었다. 각각의 경우 두 번째 라운드 후 48개 클론이 단일클론 파지 ELISA에 의해(상기 기술된 바와 같이) 및 용해성 scFv 단편의 ELISA에 의해 HSA 및 β-gal로의 결합에 대해 시험되었다. 용해성 항체 단편은 Harrison et al., (1996)에 기술된 바와 같이 제조되었고, 표준 ELISA 프로토콜은 2% Tween/PBS가 차단 완충액으로 사용되고 결합된 scFv가 단백질 L-HRP로 검출된 것을 제외하고는 Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133을 따랐다. HSA/β-gal 선택으로부터의 3개 클론(E4, E5 및 E8) 및 β-gal/HSA 선택으로부터의 2개 클론(K8 및 K10)은 항원 둘 모두에 결합할 수 있었다. 이들 클론으로부터의 scFv는 프라이머 LMB3 및 pHENseq를 이용하여 Ignatovich et al., J. Mol. Biol. 1999 Nov 26;294(2):457-65에 의해 기술된 바와 같이 PCR 증폭되고 시퀀스되었다. 서열 분석은 모든 클론이 동일함을 나타내었다. 따라서 이중-특이적 항체(K8)를 인코드하는 하나의 클론만이 다른 작업에 선택되었다(도 3).
(실시예 2) K8 항체의 결합 성질의 특성
먼저, K8 항체의 결합 성질이 단일클론 파지 ELISA에 의해 특성화되었다. 96-웰 ELISA 플레이트는 4℃에서 밤새 PBS 내 10 ㎍/ml 농도에서 알칼리성 포스파타제(APS), 소 혈청 알부민(BSA), 땅콩 아글루티닌, 리소자임 및 사이토크롬 c(교차-반응성을 점검하기 위해)를 지닌 100 ㎕의 HSA 또는 β-gal로 코팅되었다. K8로부터의 파지미드는 Harrison et al. (1996)에 의해 기술된 바와 같이 KM13으로 해방되었고 파지를 포함한 상청액(50 ㎕)이 직접 분석되었다. 항-M13-HRP 컨쥬게이트로의 결합 파지의 검출을 이용한 표준 ELISA 프로토콜이 뒤따랐다(Hoogenboon et al. 1991). 이중-특이적 K8 항체가 1.0 이상의 흡광 신호로 파지 표면상에 디스플레이될 때 HSA 및 β-힘에 결합하는 것으로 나타났다(도 4). BSA에 대한 강한 결합도 관찰되었다(도 4). HSA 및 BSA가 아미노산 수준에서 76% 상동적이기 때문에 이들 구조적으로 관련된 단백질 둘 모두를 K8 항체가 인식한다는 것은 놀라운 것이 아니다. 다른 단백질과의 교차-반응성은 검출되지 않았다(도 4).
두 번째로 K8 항체의 결합 성질은 용해성 scFv ELISA 내에서 시험되었다. 용해성 scFv 단편의 제조는 Harrison et al. (1996)에 의해 기술된 바와 같이 IPTG에 의해 유도되었다. K8 scFv의 발현 수준을 측정하기 위해 용해성 항체 단편이 Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor에 의해 기술된 바와 같이 단백질 A 세파로스 컬럼을 이용하여 50 ml 유도 상청액으로부터 정제되었다. 이후, OD280이 측정되었고 Sambrook et al., (1989)에 의해 기술된 바와 같이 단백질 농도가 계산되었다. K8 scFv는 19 mg/ml로 상청액 내에서 제조되었다.
이후, 용해성 scFv ELISA는 알려진 농도의 K8 항체 단편을 이용하여 수행되었다. 96-웰 ELISA 플레이트는 4℃에서 밤새 PBS 내 10 ㎍/ml 농도에서 100 ㎕의 HSA, BSA 및 β-gal 및 1 ㎍/ml 농도에서 100 ㎕의 단백질 A로 코팅되었다. K8 scFv의 연속 희석 50 ㎕가 도포되었고 결합된 항체 단편이 단백질 L-HRP로 검출되었다. ELISA 결과는 K8 항체의 이중-특이적 성질을 확인하였다(도 5).
β-gal에 대한 결합이 K8 scFv 항체의 Vκ 도메인에 의해 결정되고, HSA/BSA에 대한 결합이 VH 도메인에 의해 결정된다는 것을 확인하기 위해 Vκ 도메인이 SalI/NotI 분해에 의해 K8 scFv DNA로부터 절단되었고 모형 VH 도메인을 포함한 pIT2 벡터로 분해된 SalI/NotI 내로 결찰되었다(도 1 및 2). 수득된 클론 K3Vκ/모형 VH의 결합 특성은 용해성 scFv ELISA에 의해 분석되었다. 용해성 scFv 단편의 생성은 Harrison et al. (1996)에 의해 기술된 바와 같이 IPTG에 의해 유도되었고 scFv를 함유한 상청액(50 ㎕)이 직접 에세이되었다. 용해성 scFv ELISA는 실시예 1에 나타난 바와 같이 수행되었고, 결합된 scFv는 단백질 L-HRP로 검출되었다. ELISA 결과는 본 클론이 β-gal에 여전히 결합할 수 있는 반면, BSA로의 결합은 제거되었음을 나타내었다(도 6).
(실시예 3) 항원 A 및 B에 대해 지시된 단일 VH 도메인 항체 및 항원 C 및 D에 대해 지시된 단일 Vκ 도메인 항체의 선택
본 실시예는 항원 A 및 B에 대해 지시된 단일 VH 도메인 항체 및 항원 C 및 D에 대해 지시된 단일 Vκ 도메인 항체를 상보성 변이가능 도메인의 부재시 이들 항원에 대한 결합에 대해 버진(virgin) 단일 항체 변이가능 도메인의 레퍼토리를 선택함으로서 제조하는 방법에 대해 기술한다.
결합 클론의 선택 및 특성은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다(실시예 5, PCT/GB02/003014 참조). 4개의 클론이 다음 작업을 위해 선택되었다 :
VH1 - 항 A VH
VH2 - 항 B VH
VK1 - 항 C Vκ
VK2 - 항 D Vκ
상기 실시예 1-3에 기술된 절차가 VH 도메인의 결합(즉, VH-VH 리간드) 및 Vκ 도메인의 결합(즉, Vκ-Vκ 리간드)를 포함한 이량체 분자를 생성하는데 사용된다.
(실시예 4) 이중-특이적 ScFv 항체의 생성 생성 및 특성(항원 A 및 B에 대해 지시된 VH1/VH2 항체 및 항원 C 및 D에 대해 지시된 VK1/VK2)
본 실시예는 이중-특이적 ScFv 항체(항원 A 및 B에 대해 지시된 VH1/VH2 항체 및 항원 C 및 D에 대해 지시된 VK1/VK2)가 ScFv 벡터 내의 각각의 항원에 대해 선택된 Vκ 및 VH 단일 도메인을 결합시킴으로서 생성될 수 있다.
이중-특이적 항체 VH1/VH2를 생성하기 위해 VH1 단일 도메인이 NcoI/XhoI 분해에 의해 변이가능 도메인 벡터 1로부터 절제되고(도 7), NcoI/XhoI 분해된 변이가능 도메인 벡터 2 내로 결찰되어(도 7) VH1/변이가능 도메인 벡터 2를 생성한다. VH2 단일 도메인은 SalI 제한 사이트를 5' 말단으로 및 NotI 제한 사이트를 3' 말단으로 도입시키는 프라이머를 이용하여 변이가능 도메인 벡터 1로부터 PCR 증폭된다. 이후, PCR 생성물은 SalI/NotI 분해된 VH1/변이가능 도메인 벡터 2 내로 결찰되어 VH1/VH2 변이가능 도메인 벡터 2를 생성한다.
VK1/VK2 변이가능 도메인 벡터 2는 유사한 방법으로 생성된다. 생성된 VH1/VH2 ScFv 및 VK1/VK2 ScFv의 이중-특이적 성질은 앞서 기술된 바와 같이 용해성 ScFv ELISA 내에서 시험된다(실시예 6, PCT/GB02/003014 참조). ELISA 경쟁은 앞서 기술된 바와 같이 수행된다(실시예 8, PCT/GB02/003014 참조).
가능한 결과 :
-VH1/VH2 ScFv는 항원 A 및 B에 동시에 결합할 수 있다.
-VK1/VK2 ScFv는 항원 C 및 D에 동시에 결합할 수 있다.
-VH1/VH2 ScFv 결합은 경쟁적이다(항원 A에 결합시 VH1/VH2 ScFv는 항원 B에 결합할 수 없다).
-VK1/VK2 ScFv 결합은 경쟁적이다(항원 C에 결합시 VK1/VK2 ScFv는 항원 D에 결합할 수 없다).
(실시예 5) 이중-특이적 VH1/VH2 Fab 및 VK1/VK2 Fab의 구조 및 이들의 결합 성질의 분석
VH1/VH2 Fab을 생성하기 위해 VH1 단일 도메인이 NcoI/XhoI 분해된 CH 벡터 내로 결찰되어(도 8) VH1/CH을 생성하고, VH2 단일 도메인이 SalI/NotI 분해된 CK 벡터 내로 결찰되어(도 9) VH2/CK를 생성한다. VH1/CH 및 VH2/CK로부터의 플라스미드 DNA는 앞서 기술된 바와 같이 유능한 E. coil 세포를 동시-형질전환시키는데 사용된다(실시예 8, PCT/GB02/003014 참조).
VH1/CH 및 VH2/CK 플라스미드를 포함한 클론이 앞서 기술된 바와 같이 IPTG 내로 도입되어 용해성 VH1/VH2 Fab를 생성한다(실시예 8, PCT/GB02/003014 참조).
VK1/VK2 Fab은 유사한 방법으로 생성된다.
생성된 Fab의 결합 성질은 앞서 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 시험된다(실시예 8, PCT/GB02/003014 참조).
가능한 결과 :
-VH1/VH2 Fab는 항원 A 및 B에 동시에 결합할 수 있다.
-VK1/VK2 Fab는 항원 C 및 D에 동시에 결합할 수 있다.
-VH1/VH2 Fab 결합은 경쟁적이다(항원 A에 결합시 VH1/VH2 Fab는 항원 B에 결합할 수 없다).
-VK1/VK2 Fab 결합은 경쟁적이다(항원 C에 결합시 VK1/VK2 Fab는 항원 D에 결합할 수 없다).
(실시예 6)
킬레이팅 dAb 이량체4
요약
VH 및 VK 상동-이량체는 유연성 있는 폴리펩타이드 링커를 이용하여 dAb-링커-dAb 포맷으로 생성된다. 벡터는 다른 길이 3U:(Gly4Ser)3, 5U:(Gly4Ser) 5, 7U:(Gly4Ser)7의 글리신-세린 링커를 포함한 dAb-링커-dAb 포맷으로 생성되었다. 이량체 라이브러리는 링커 업스트림으로 dAb를 가이드하여 생성되었다: TAR-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) 또는 TAR2-6(VK) 및 두 번째 dAb에 상응하는 라이브러리는 링커 후 클론됨. 본 방법을 이용하여 신규한 이량체 dAb가 선택되었다. 항원 결합 상의 이량체화의 효과는 ELISA 및 BIAcore 연구 및 세포 중화 및 수용체 결합 에세이에 의해 측정되었다. TAR1-5 및 TAR1-27 모두는 결합 친화력 및 중화 수준에서 유의적인 증가를 나타냈다.
1.0 방법
1.1 라이브러리 생성
1.1.1 벡터
pEDA3U, pEDA5U, pEDA7U 벡터는 dAb-링커-dAb 포맷과 양립가능한 다른 링커 길이 내로 도입되도록 고안되었다. pEDA3U의 경우 센스 및 안티센스 73-염기쌍 올리고 링커는 0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4를 함유한 완충액 내에서 느린 어닐링 프로그램을 이용하여 어닐되었고(95℃-5분, 80℃-10분, 70℃-15분, 사용전까지 42℃), XhoI 및 NotI 제한 사이트를 이용하여 클론되었다. 링커는 3(Gly4Ser) 유니트를 포함하였고 서터퍼(stuffer) 구역은 SalI과 NotI 클로닝 사이트 사이에서 하우스되었다(도표 1). 파지 디스플레이에 의해 선택되는 단량체 dAb의 가능성을 감소시키기 위해 서터퍼 구역은 3개 정지 코돈을 포함하도록 고안되었고, 2번째 dAb가 존재하지 않으면 Sacl 제한 사이트 및 프레인 쉬프트 돌연변이가 프레임 외부 구역 내로 도입되도록 고안되었다. pEDA5U 및 pEDA7U의 경우 필요한 링커의 길이에 의해 중복 올리고-링커가 각 벡터에 대해 어닐되고 Klenow를 이용하여 신장되도록 고안되었다. 이후 단편은 정제되었고 XhoI 및 NotI 제한 사이트를 이용한 클로닝 전에 적당한 효소를 이용하여 분해되었다.
도표 1
1.1.2 라이브러리 제조
가이딩 dAb에 상응하는 N-말단 V 유전자가 Nco1 및 Xho1 제한 사이트를 이용하여 f이커의 업스트림으로 클론되었다. VH 유전자는 현존하는 양립성 사이트를 지니나 VH 유전자 클로닝은 적당한 제한 효소의 도입을 필요로 한다. 이는 SuperTaq(HTBiotechnology Ltd) 및 pfu 터보(Stratagene)의 2:1 혼합물을 이용한 30 사이클의 PCR 증폭 내에서 PCR 프라이머(VK-DLIBF: 5' cggccatggcgtcaacggact; VKXho1R: 5' atgtgcgctcgagcgtttgattt 3')의 변형을 이용함으로서 달성된다. 이는 인접 Sal1 사이트를 파괴시키는 동안 5' 말단에서 Nco1 사이트를 유지시키고 3' 말단에서 Xho1 사이트를 도입시킨다. 5개 가이딩 dAb는 3개의 이량체 벡터 각각으로 클론되었다: TAR1-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH), TAR2-6(VK) 및 TAR2-7(VK). 모든 컨스트럭트는 서열 분석에 의해 증명되었다.
각각의 벡터(pEDA3U, 5U 및 7U) 내에 링커의 가이딩 dAb 업스트림을 클론할 때 : TAR1-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) 또는 TAR2-6(VK), 두 번째 dAb에 상응하는 라이브러리는 링커 후 클론되었다. 이를 달성하기 위해 상보성 dAb 라이브러리는 TAR1-5 또는 TAR1-27이 가이딩 dAb인 경우 인간 TNFα에 대한 VK 라이브러리(라운드 1 후 약 1 ×106 다양성) 또는 TAR2-5 또는 TAR2-6이 각각 가이딩 dAb인 경우 인간 p55 TNF 수용체에 대한 VH 또는 VK 라이브러리(둘 모두 라운드 1 후 약 1 ×105 다양성)의 라운드 1 선택으로부터 회수된 파지로부터 PCR 증폭되었다. VK 라이브러리의 경우 PCR 증폭은 SuperTaq 및 pfu 터보의 2:1 혼합물을 이용한 30 사이클의 PCR 증폭 내에서 프라이머를 이용하여 수행되었다. VH 라이브러리는 유전자의 5' 말단에서 Sal1 제한 효소를 도입시키기 위해 프라이머를 이용하여 PCR 증폭되었다. dAb 라이브러리 PCR은 적당한 제한 효소로 분해되었고, Sal1/Not1 제한 사이트를 이용하여 링커의 다운스트림의 상응하는 벡터 내로 결찰되었고, 신선하게 제조된 유능한 TG1 세포 내로 일렉트로포레이트(electroporate)되었다.
각 라이브러리에 대해 달성된 적정농도는 하기와 같다 :
TAR1-5: pEDA3U = 4 ×108, pEDA5U = 8 ×107, pEDA7U = 1 ×108
TAR1-27: pEDA3U = 6.2 ×108, pEDA5U = 1 ×108, pEDA7U = 1 ×109
TAR2h-5: pEDA3U = 4 ×107, pEDA5U = 2 ×108, pEDA7U = 8 ×107
TAR2h-6: pEDA3U = 7.4 ×108, pEDA5U = 1.2 ×108, pEDA7U = 2.2 ×108
1.2 선택
1.2.1 TNFα
선택은 면역시험관 상에 수동적으로 코팅된 인간 TNFα를 이용하여 수행되었다. 간단하게, 면역시험관은 1∼4 ml의 필요한 항원으로 밤새 코팅된다. 면역시험관은 PBS로 3회 세척되고 PBS 내에서 1∼2시간 동안 2% 우류 분말로 블록되고 PBS로 3회 더 세척된다. 파지 용액은 PBS 내 2% 우유 분말로 희석되고 2시간 동안 상온에서 인큐베이트된다. 시험관은 PBS로 세척되고 파지는 1 mg/ml의 트립신-PBS로 희석된다. 3개 선택 전략이 TAR1-5 이량체 라이브러리에 대해 조사되었다. 첫 번째 라운드 선택은 1 ㎍/ml 또는 20㎍/ml로 코팅되고 PBS 내의 0.1% Tween으로 20회 세척된 인간 TNFα를 이용한 면역시험관 내에서 수행되었다. TG1 세포는 용출된 파지로 감염되고 적정농도가 측정된다(즉, Marks et al. J. Mol. Biol. 1991, Dec 5;222(3)581-97, Richmann et al. Biotchemistry. 1993 Aug 31;32(34)8848-55).
회수된 적정농도는 :
pEDA3U = 2.8 ×107(1 ㎍/ml TNF) 1.5 ×108(20 ㎍/ml TNF),
pEDA5U = 1.8 ×107(1 ㎍/ml TNF) 1.6 ×108(20 ㎍/ml TNF),
pEDA7U = 8 ×106(1 ㎍/ml TNF) 7 ×107(20 ㎍/ml TNF).
두 번째 라운드 선택은 3개의 다른 방법을 이용하여 수행되었다.
1. 면역시험관 내에서 밤새 인큐베이션으로 20회 세척 후 10회 더 세척.
2. 면역시함관 내에서 상온에서 1시간 인큐베이션으로 세척 완충액(1 ㎍/ml TNFα)으로 20회 세척 후 10회 더 세척.
3. 33 pmole 비오틴화 인간 TNFα를 이용한 스트렙타비딘 비드 상에서의 선택(Henderikx et al. 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press). 라운드 2 선택으로부터의 단일 클론은 96 웰 플레이트 내로 픽업되었고 예비 비가공 상청액은 2 ml의 96 웰 플리이트 포맷 내로 이루어졌다.
라운드 1인간 TNFα면역시험관코팅 농도 라운드 2선택 방법 1 라운드 2선택 방법 2 라운드 2선택 방법 3
pEDA3U 1 ㎍/ml 1 ×109 1.8 ×109 2.4 ×100
pEDA3U 20 ㎍/ml 6 ×109 1.8 ×1010 8.5 ×1010
pEDA5U 1 ㎍/ml 9 ×108 1.4 ×109 2.8 ×1010
pEDA5U 20 ㎍/ml 9.5 ×109 8.5 ×109 2.8 ×1010
pEDA7U 1 ㎍/ml 7.8 ×108 1.6 ×108 4 ×1010
pEDA7U 20 ㎍/ml 1 ×1010 8 ×109 1.5 ×1010
TAR1-27의 경우 선택은 하기 변형을 포함하여 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. 첫 번째 라운드 선택은 1 ㎍/ml 또는 20㎍/ml로 코팅되고 PBS 내의 0.1% Tween으로 20회 세척된 인간 TNFα를 이용한 면역시험관 내에서 수행되었다. 두 번째 라운드 선택은 밤새 인큐베이션으로 20회 세척을 이용한 면역시험관 내에서 수행된 후 20회 세척이 뒤따랐다. 라운드 2 세척으로부터의 선택 클론은 96 웰 플레이트 내로 픽업되었고 예비 비가공 상청액은 2 ml의 96 웰 플레이트 포맷 내로 이루어졌다.
TAR1-27 적정농도는 하기와 같다 :
인간 TNFα면역시험관코팅 농도 라운드 1 라운드 2
pEDA3U 1 ㎍/ml 4 ×109 6 ×109
pEDA3U 20 ㎍/ml 5 ×109 4.4 ×1010
pEDA5U 1 ㎍/ml 1.5 ×108 1.9 ×1010
pEDA5U 20 ㎍/ml 3.4 ×109 3.5 ×1010
pEDA7U 1 ㎍/ml 2.6 ×108 5 ×109
pEDA7U 20 ㎍/ml 7 ×109 1.4 ×1010
1.2.2 TNF 수용체 1(p55 수용체; TAR2)
선택은 TAR2h-5 라이브러리에 대해서만 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. 선택의 3개 라운드가 밤새 인큐베이션으로 PBS 내의 0.1% Tween으로 20회 세척되고 이후 20회 더 세척된 1 ㎍/ml의 인간 p55 TNF 수용체 또는 10 ㎍/ml의 인간 p55 TNF 수용체를 이용하여 면역시험관 내에서 수행되었다. 라운드 2 및 3 선택으로부터의 단일 클론은 96 웰 플레이트 내로 픽업되었고 예비 비가공 상청액이 2 ml의 96 웰 플레이트 포맷으로 이루어졌다.
TAR2h-5 적정농도는 하기와 같다 :
라운드 1인간 p55 TNF수용체면역시험관코팅 농도 라운드 1 라운드 2 라운드 3
pEDA3U 1 ㎍/ml 2.4 ×106 1.2 ×107 1.9 ×109
pEDA3U 10 ㎍/ml 3.1 ×107 7 ×107 1.5 ×109
pEDA5U 1 ㎍/ml 2.5 ×106 1.1 ×107 5.7 ×108
pEDA5U 10 ㎍/ml 3.7 ×107 2.3 ×108 2.9 ×109
pEDA7U 1 ㎍/ml 1.3 ×106 1.3×107 1.4 ×109
pEDA7U 10 ㎍/ml 1.6 ×107 1.9 ×107 3 ×1010
1.3 스크리닝
라운드 2 또는 3 선택으로부터의 단일 클론이 적당한 다른 선택 방법으로부터의 3U, 5U 및 7U 라이브러리 각각으로부터 픽업되었다. 클론은 100 ㎍/ml의 암피실린 및 1% 글루코스를 포함한 2xTY 내에서 37℃로 밤새 생장되었다. 이러한 배양액의 1/100 희석은 2 ml 내 100 ㎍/ml의 암피실린 및 1% 글루코스를 포함한 2ml, 96 웰 플레이트 포맷의 2xTY 내로 접종되었고 OD600이 약 0.9가 될 때까지 37℃에서 진탕하면서 생장되었다. 이후 배양액은 1 mM IPTG로 30℃에서 밤새 유도되었다. 상청액은 소발(sorval) 플레이트 원심분리기 내에서 15분간 4000 rmp으로 원심분리에 의해 정화되었다. 예비 상청액은 초기 스크리닝에 사용되었다.
1.3.1 ELISA
이량체 재조합 단백질의 결합 활성은 단백질 A/L ELISA 또는 항원 ELISA에 의해 단량체와 비교되었다. 간단히, 96 웰 플레이트가 4℃에서 밤새 항원 또는 단백질 A/L로 코팅되었다. 플레이트는 0.05% Tween-PBS로 세척되었고, 2% Tween-PBS로 2시간 동안 블록되었다. 표본이 플레이트에 첨가되어 상온에서 1시간 동안 인큐베이트되었다. 플레이트는 세척되었고 2차 시약으로 1시간 동안 상온에서 인큐베이트되었다. 플레이트는 세척되고 TMB 기질로 현색되었다. 단백질 A/L-HRP 또는 인디아-HRP가 2차 시약으로 사용되었다. 항원 ELISA의 경우 사용된 항원 농도는 인간 TNFα 및 인간 THF 수용체 1에 대해 PBS 내에 1 ㎍/ml이었다. 대부분의 경우 가이딩 dAb의 존재에 의해 이량체는 양성의 ELISA 신호를 제공하고, 따라서 오프(off) 속도 측정은 BIAcore로 조사되었다.
1.3.2 BIAcore
BIAcore 분석은 TAR1-5 및 TAR2h-5 클론에 대해 수행되었다. 스크리닝을 위해 경우 인간 TNFα가 높은 밀도로(약 10000 RUs) CM5 칩에 결합되었다. 50 ㎕의 인간 TNFα(50 ㎍/ml)가 아세트산 완충액 - pH 5.5 - 내에서 5 ㎕/분으로 칩에 결합되었다. 칩 재생 후 표준 방법을 이용한 분석은 인간 TNF㎕의 불안정성에 의해 불가능하고, 따라서 각 표본이 분석된 후 칩은 완충액으로 10분간 세척되었다.
TAR1-5의 경우 라운드 2로부터의 클론 상청액은 BIAcore에 의해 스크린되었다. 48개 클론이 하기 선택 방법을 이용하여 수득된 3U, 5U 및 7U 라이브러리 각각으로부터 스크린되었다 :
R1 : 1 ㎍/ml 인간 TNFα 면역시험관, R2 1 ㎍/ml 인간 TNFα 면역시험관, 밤새 세척.
R1 : 20 ㎍/ml 인간 TNFα 면역시험관, R2 20 ㎍/ml 인간 TNFα 면역시험관, 밤새 세척.
R1 : 1 ㎍/ml 인간 TNFα 면역시험관, R2 33 pmoles 인간 TNFα 면역시험관, 밤새 세척.
R1 : 비드 상에서 20 ㎍/ml 인간 TNFα 면역시험관, R2 33 pmole 인간 TNFα 면역시험관.
스크리닝을 위해 인간 p55 TNF 수용체가 높은 밀도로(약 4000 RUs) CM5 칩에 결합되었다. 100 ㎕의 인간 p55 TNF 수용체(10 ㎍/ml)가 아세트산 완충액 - pH 5.5 - 내에서 5 ㎕/분으로 칩에 결합되었다. 표준 재생 조건이 조사되었으나 각각의 경우 항원은 칩의 표면으로부터 제거되었고, 따라서 각 표본이 분석된 후 칩은 완충액으로 10분간 세척되었다.
TAR2-5의 경우 라운드 2 선택으로부터의 클론 상청액이 스크린되었다.
48개 클론이 하기 선택 방법을 이용하여 수득된 3U, 5U 및 7U 라이브러리 각각으로부터 스크린되었다 :
R1 : 1 ㎍/ml 인간 pp55 TNF 수용체 면역시험관, R2 1 ㎍/ml 인간 p55 TNF 수용체 면역시험관, 밤새 세척.
R1 : 10 ㎍/ml 인간 pp55 TNF 수용체 면역시험관, R2 10 ㎍/ml 인간 p55 TNF 수용체 면역시험관, 밤새 세척.
1.3.3 수용체 및 세포 에세이
수용체 에세이 내에서의 이량체의 중화 능력이 하기와 같이 수행되었다 :
수용체 결합
항-TNF dAb가 재조합 TNF 수용체 1(p55)로의 TNF의 결합을 억제하는 능력에 대해 시험되었다. 간단히, Maxisorp 플레이트가 30 mg/ml의 항-인간 Fc 마우스 단일클론 항체(Zymed, San Francisco, USA)로 밤새 인큐베이트되었다. 웰은 0.05% Tween-20을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된 후 100 ng/ml의 TNF 수용체 1 Fc 융합 단백질(R&D Systems, Minneapolis, USA)로 인큐베이트되기 전에 PBS 내의 1% BSA로 블록되었다. 항-TNF dAb는 10 ng/ml의 최종 농도로 세척된 웰 내로 첨가된 TNF와 혼합되었다. TNF 결합은 0.2 mg/ml의 비오틴호된 항-TNF 항체(HyCult biotechnology, Uben, Netherlands) 및 양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 스트렙타비딘(Amersham Biosciences, UK)의 1/500 희석으로 검출된 후 TMB 기질(KPL, Gaithersburg, USA)로 인큐베이트되었다. 반응은 HC의 첨가에 의해 정지되었고 흡광도는 450 nm에서 판독되었다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 결합의 감소를 이끌었고, 따라서 흡광도의 감소가 TNF 만의 대조군과 비교되었다.
L929 세포독성 에세이
또한 항-TNF dAb는 마우스 L929 섬유아세포 상의 TNF의 세포독성 활성을 중화하는 능력에 대해 시험되었다(Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15:243-248). 간단히, 마이크로타이터 플레이트 내에 플레이트된 L929 세포가 항-TNF dAb, 100 pg/ml의 TNF 및 1 mg/ml의 악티노마이신 D(Sigma, Poole, UK)로 밤새 인큐베이트되었다. 세포 생존력은 490 nm에서의 흡광도를 판독하고 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸리움(Promega, Madison, USA)으로 인큐베이션함으로서 측정되었다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 세포독성의 감소를 이끌었고, 따라서 흡광도의 증가가 TNF 만의 대조군과 비교되었다.
초기 스크린에서 BIAcore 분석용으로 제조된 상청액은 상기 기술된 바와 같이 수용체 에세이에도 사용되었다. 선택된 이량체의 부가적 분석이 정제된 단백질을 이용하여 수용체 및 세포 에세이 내에서 수행되었다.
HeLa IL-8 에세이
항-TNFR1 또는 항-TNF 알파 dAb는 HeLa 세포 내에서 TNF에 의한 IL-8 분비의 유도를 중화시키는 능력에 대해 시험되었다(Akeson, L. et al. (1996) Journal of Biological Chemistry 271:30517-30523으로부터 개조된 방법, HUVEC 내 IL-1에 의한 IL-8의 유도의 감소; 여기서 인간 TNF 알파에 의한 유도를 관찰하고 HUVEC 세포주 대신 HeLa 세포를 사용함). 간단히, 마이크로타이터 플레이트 내에 플레이트된 HeLa 세포가 dAb 및 300 pg/ml의 TNF로 밤새 인큐베이트되었다. 유도 후 상청액은 세포로부터 흡입되었고 IL-8 농도가 샌드위치 ELISA(R&D Systems)를 통해 측정되었다. 항-TNFR1 dAb 활성은 TNF 만의 대조군과 비교시 상청액 내로의 IL-8 분비 감소를 이끌었다.
L929 에세이는 하기 실험을 통해 이용된다; 그러나 HeLa IL-8 에세이의 이용은 항-TNF 수용체 1(p55) 리간드를 측정하는 것이 바람직하다; L929 에세이 내의 마우스 p55 존재는 조직 내 특정 제한을 취한다.
1.4 서열 분석
BIAcore 및 수용체 에세이 스크린 내의 목적 성질을 지닌 것으로 판명된 이량체가 시퀀스되었다. 서열은 서열목록 내에 상세하게 설명된다.
1.5 포매팅(Formatting)
좋은 중화 성질을 지닌 것으로 나타난 TAR1-5 이량체는 세포 및 수용체 에세이 내에서 포맷되었고 분석되었다. TAR1-5 가이딩 dAb는 친화력 성숙된 클론 TAR1-5-19와 치환되었다. 이를 달성하기 위해 TAR1-5이 개별적 이량체 쌍으로부터 클론되었고 PCR에 의해 증폭된 TAR1-5-19로 치환되었다. 더욱이 TAR1-5-19 상동이량체는 3U, 5U 및 7U 벡터 내에서 구조되었다. 유전자의 N 말단 카피는 PCR에 의해 증폭되었고 상기에 기술된 바와 같이 클론되었고 C-말단 유전자 단편은 존재하는 Sal1 및 Not1 제한 사이트를 이용하여 클론되었다.
1.5.2 돌연변이화
TAR1-5 이량체 쌍 내의 C-말단 dAb 중의 하나인 dAb 내에 존재하는 호박 정지 코돈이 자리-지정 돌연변이에 의해 돌연변이되었다.
1.5.3 Fabs
TAR1-5 또는 TAR1-5-19를 포함한 이량체가 FAb 발현 벡터 내로 재-포맷되었다. dAb는 Sfi1 및 Not1 제한 사이트를 이용하여 CK 또는 CH 유전자를 포함한 발현 벡터 내로 클론되었고 서열 분석에 의해 증명되었다. CK 벡터는 pUC 기초 암피실린 저항성 벡터로부터 유도되었고, CH 벡터는 pACYC 클로람페니콜(chlroamphenicol) 저항성 벡터로부터 유도되었다. Fab 발현을 위해 dAb-CH 및 dAb-CK 컨스트럭트가 HB2151 내로 동시-형질전환되었고 0.1% 글루코스, 100 ㎍/ml 암피실린 및 10 ㎍/ml 클로람페니콜을 포함한 2xTY 내에서 생장되었다.
1.5.3 힌지 이량체화
시스테인 결합 형성을 통한 dAb의 이량체화가 조사되었다. 아미노산 EPKSGDKTHTCPPCP의 짧은 서열 인간 IgGC1 힌지로부터의 변형 형태가 dAb 상의 C 말단 구역에서 설계되었다. 이러한 서열을 인코드하는 올리고 링커가 앞서 기술된 바와 같이 합성되었고 어닐되었다. 링커는 Xho1 및 Not1 제한 사이트를 이용한 TAR1-5-19를 포함한 pEDA 벡터 내로 클론되었다.
1.6 발현 및 정제
1.6.1 발현
상청액은 앞서 기술된 바와 같이 초기 스크리닝을 위해 2 ml, 96-웰 플레이트 포맷 내에서 제조되었다. 초기 스크리닝 과정 후 선택된 이량체가 더욱 분석되었다. 이량체 컨스트럭트는 상청액으로서 TOP10F' 또는 HB2151 세포 내에서 발현되었다. 간단히, 신선하게 스트리크된 플레이트로부터의 개별적 콜로니가 100 ㎍/ml 암피실린 및 1% 글루코스를 지닌 2xTY 내에서 37℃로 밤새 생장되었다. 100 ㎍/ml 암피실린 및 1% 글루코스를 지닌 2xTY 내로 접종되었고 이러한 배양액의 1/100 희석이 OD600이 약 0.9가 될 때까지 37℃에서 진탕하면서 생장되었다. 배양액은 30℃에서 밤새 1 mM IPTG로 유도되었다. 세포는 원심분리에 의해 제거되었고 상청액은 단백질 A 또는 L 아가로스로 정제되었다.
Fab 및 시스테인 힌지 이량체는 HB2152 세포 내 세포질 주변 단밸질로서 발현되었다. 배양액의 밤새 1/100 희석은 0.1% 글루코스 및 적당한 항생제를 지닌 2xTY 내로 접종되었고, OD600이 약 0.9가 될 때까지 30℃에서 진탕하면서 생장되었다. 이후 배양액은 25℃에서 3∼4시간 동안 1 mM IPTG로 인큐베이트되었다. 세포는 원심분리에 의해 수집되었고 펠렛은 세포질 주변 제조 완충액(30 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 20% 슈크로스) 내에 재현탁되었다. 원심분리 후 상청액이 정치되었고 펠렛은 5 mM MgSO4 내에 재현탁되었다. 상청액은 원심분리에 의해 수집되었고 풀되었고 정제되었다.
1.6.2 단백질 A/L 정제
단백질 L 아가로스(Affitech, Norway) 또는 단백질 A 아가로스(Sigma, UK)로부터의 이량체 단백질 정제의 최적화가 조사되었다. 단백질은 배치(batch)에 의해 또는 연동성 펌프를 이용한 컬럼 용출에 의해 용출되었다. 0.1 M 인산염-구연산 완충액 pH 2.6, 0.2 M 글리신, pH 2.5 및 0.1 M 글리신 pH 2.5의 3개의 완충액이 조사되었다. 최적 조건은 10 컬럼 부피 이상에 0.1 M 글리신 pH 2.5를 이용한 연동성 펌프 조건 하인 것으로 측정되었다. 단백질 A로부터의 정제는 0.1 M 글리신 pH 2.5를 이용한 연동성 펌프 조건이 수행되었다.
1.6.3 FPLC 정제
정제는 AKTA Explorer 100 시스템(Amersham Biosciences Ltd) 상에서의 FPLC 분석에 의해 수행되었다. TAR1-5 및 TAR1-5-19 이량체는 50 mM 아세트산 완충액 pH 4 내의 0-1 M NaCl 기울기로 용출되는 양이온 교환 크로마토그래피(1 ml Resource S - Amersham Biosciences Ltd)에 의해 분획화되었다. 힌지 이량체는 25 mM Tris-HCl pH 8.0 내의 0-1 M NaCl 기울기로 용출되는 이온 교환(1ml Resource Q - Amersham Biosciences Ltd)에 의해 정제되었다. Fab는 0.05% Tween을 지닌 PBS 내에서 0.5 ml/분의 유속으로 작동하는 superose 12(Amersham Biosciences Ltd)를 이용한 컬럼 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제 후 표본은 vivaspin 5K 컷 오프 농축기(Vivascience Ltd)를 이용하여 농축되었다.
2.0 결과
2.1 TAR1-5 이량체4
6 ×96 클론이 모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함한 라운드 2 선택으로부터 취해졌다. 예비 상청액이 제조되었고 항원 및 단백질 L ELISA, BIAcore 및 수용체 에세이에 의해 에세이되었다. ELISA에서 양성 결합 클론은 각 선택 방법으로부터 확인되었고 3U, 5U 및 7U 라이브러리 사이에서 분포되었다. 그러나 가이딩 dAb가 항상 존재하기 때문에 이러한 방법에 의해 높은 친화력 바인더와 낮은 친화력 바인더 사이에서 판별되는 것이 불가능하고 따라서 BIAcore 분석이 수행되었다.
BIAcore 분석은 2 ml 상청액을 이용하여 수행되었다. BIAcore 분석은 이량체 Koff 속도가 단량체 TAR1-5와 비교시 매우 증가되었음을 나타내었다. 단량체 Koff 속도는 10-3∼10-4 M 범위인 이량체 Koff 속도와 비교시 10-1 M의 범위이었다. 매우 느린 off 속도를 지닌 것으로 나타난 16개 클론이 선택되었고, 이들은 3U, 5U 및 7U 라이브러리로부터 유래하였고 시퀀스되었다. 더욱이 상청액이 수용체 에세이 내에서 인간 TNFα를 중화시키는 능력에 대해 분석되었다.
6개 리드 클론(하기 d1-d6)이 이들 분석 내에서 중화되고 시퀀스되었다. 결과는 수득된 6개 클론 중에 3개만이 다른 두 번째 dAb(dAb1, dAb2 및 dAb3)이 있었으나 두 번째 dAb는 다른 길이 링커와 결합되면 더 많이 발견된다.
TAR1-5d1 : 3U 링커 2nd dAb = dAb1 - 1 ㎍/ml Ag 면역시험관 밤새 세척
TAR1-5d2 : 3U 링커 2nd dAb = dAb2 - 1 ㎍/ml Ag 면역시험관 밤새 세척
TAR1-5d3 : 5U 링커 2nd dAb = dAb2 - 1 ㎍/ml Ag 면역시험관 밤새 세척
TAR1-5d4 : 5U 링커 2nd dAb = dAb3 - 20 ㎍/ml Ag 면역시험관 밤새 세척
TAR1-5d5 : 5U 링커 2nd dAb = dAb1 - 20 ㎍/ml Ag 면역시험관 밤새 세척
TAR1-5d6 : 7U 링커 2nd dAb = dAb1 - R1:1 ㎍/ml Ag 면역시험관 밤새 세척, R2: 비드
6개 리드 클론은 더욱 조사되었다. 단백질은 세포질 주변 및 상청액으로부터 생성되었고 단백질 L 아가로스로 정제되었고 세포 및 수용체 에세이 내에서 조사되었다. 중화 수준은 변화가능하였다(표 1). 단백질 제조를 위한 최적 조건이 측정되었다. 상청액으로서 HB2151 세포로부터 제조된 단백질이 가장 높은 수율을(배양액의 약 10 mgs/L) 제공하였다. 상청액은 상온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 단백질 L 아가로스로 인큐베이트되었다. 비드는 PBS/NaCl로 세척되었고 연동성 펌프를 이용하여 FPLC 컬럼 상으로 팩킹되었다. 비드는 PBS/NaCl의 100 컬럼 부피로 세척되었고 0.1 M 글리신 pH 2.5로 용출되었다. 일반적으로 이량체 단백질은 단량체 후 용출된다.
TAR1-5d1-6 이량체는 FPLC에 의해 정제되었다. FPLC에 의해 3개의 종류가 수득되었고, SDS PAGE에 의해 확인되었다. 하나의 종은 단량체에 상응하고, 다른 2개 종은 다른 크기의 이량체에 상응한다. 2개의 종 중 더 큰 것은 C 말단 tag의 아마도 존재에 의한 것이다. 이들 단백질은 수용체 에세이에서 조사되었다. 표 1에 나타난 데이터는 2개의 이량체 종으로부터 수득된 최적 결과를 나타낸다(도 11).
이량체 쌍으로부터의 3개의 두 번째 dAb(즉, dAb1, dAb2 및 dAb3)가 단량체로서 클론되었고 세포 및 수용체 에세이 내에서 ELISA에 의해 분석되었다. 3개 dAb 모두는 항원 ELISA에 의해 TNF에 특이적으로 결합하고 플리스틱 또는 BSA와 교차 반응하지 않는다. 단량체로서 dAb는 세포 내 또는 수용체 에세이 내에서 중화하지 않는다.
2.1.2 TAR1-5-19 이량체
TAR1-5-19는 6개 리드 클론 내에서 TAR1-5에 대해 치환되었다. 세포 및 수용체 에세이 내의 모든 TAR1-5-19 이량체의 분석은 언급되지 않는한 총 단백질(정제만 된 단백질 L)을 이용하여 수행되었다(표 2). TAR1-5-19d4 및 TAR1-5-19d3은 세포 및 수용체 에세이 내에서 최상의 ND50(∼5 nM)을 지녔고, 이는 수용체 에세이 결과와 일치하고, TAR1-5-19 단량체(ND50∼30 nM)보다 증가된 것이다. 정제된 TAR1-5 이량체가 수용체 및 세포 에세이 내에서 변화가능한 결과를 제공하더라도 TAR1-5-19 이량체는 더욱 일정하다. 변이성은 단백질 정제 동안 다른 용출 완충액을 이용할 때 나타났다. 대부분의 경우 단백질 L 아가로스로부터 모든 단백질을 제거하더라도 0.1 M 인산염-구연산 완충액 pH 2.6 또는 0.2 M 글린신 pH 2.5를 이용한 용출이 덜 기능적이게 한다.
TAR1-5-19d4는 발효조 내에서 발현되었고 양이온 교환 FPLC 상에서 정제되어 완전한 순수 이량체를 산출하였다. TAR1-5d4의 경우 FPLC 정제에 의해 단량체 및 2개이 이량체 종에 상응하는 3개 종류가 수득되었다. 이러한 이량체는 아미노산 서열화되었다. TAR1-5-19 단량체 및 TAR1-5-19d4는 수용체 에세이에서 조사되었고 단량체에 대한 수득된 IC50은 30 nM이었고, 이량체의 경우 8 nM이었다. TAR1-5-19 단량체, TAR1-5-19d4 및 TAR1-5d4를 비교하는 수용체 에세이 결과는 도 10에 나타나 있다.
TAR1-5-19 상동이량체는 3U, 5U 및 7U 벡터로부터 제조되었고, 발현되었고, 단백질 L 상에서 정제되었다. 단백질은 세포 및 수용체 에세이 내에서 조사되었고 수득된 IC50(수용체 에세이의 경우) 및 ND50(세포 에세이의 경우)이 측정되었다(표 2, 도 12).
2.2 Fabs
TAR1-5 및 TAR1-5-19 이량체는 Fab 포맷 내로 클론되었고, 발현되었고, 단백질 L 아가로스 상에서 정제되었다. Fab는 수용체 에세이로 평가되었다(표 4). 결과는 TAR1-5 및 TAR1-5-19 이량체 모두의 경우 중화 수준이 유도된 본래의 Gly4Ser 링커 이량체와 유사함을 나타내었다. TAR1-5-19이 CH 및 CK 모두의 위에서 디스플레이된 TAR1-5-19 Fab가 발현되었고 단백질 L 정제되었고 수용체 에세이 내에서 평가되었다. 수득된 IC50은 약 1 nM이었다.
2.3 TAR1-27 이량체
3 ×96 클론은 모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함한 라운드 2 선택으로부터 취해졌다. 2 ml의 예비 상청액이 ELISA 및 바이오에세이 내의 분석을 위해 제조되었다. 항원 ELISA는 71개 양성 클론을 제공하였다. 비가공 상청액의 수용체 에세이는 억제 성질을 지닌 42 클론을 산출하였다(TNF 결합 0-60%). 대부분의 경우 억제 성질은 강한 ELISA 신호와 연관되었다. 42개 클론은 시퀀스되었고 이 중 39개가 독특한 두 번째 dAb 서열을 지닌다. 최상의 억제 성질을 지닌 12개 이량체가 더욱 분석되었다.
12개 중화 클론이 200 ml 예비 상청액으로서 발현되었고 단백질 L 상에서 정제되었다. 이들은 단백질 L 및 항원 ELISA, BIAcore 및 수용체 에세이에 의해 평가되었다. 강한 양성 ELISA 신호는 모든 경우에서 수득되었다. BIAcore 분석은 모든 클론이 빠른 온 오프 속도를 지님을 나타내었다. 오프 속도는 단량체 TAR1-27과 비교하여 증가되었으나 TAR1-27 이량체의 오프 속도는 앞서 조사된 TAR1-5 이량체(Koff는 약 10-3∼10-4 M 범위이다)보다 더 빨랐다(Koff는 약 10-1∼10 -2 M 범위이다). 정제된 이량체의 안정성은 의문시되고 따라서 안정성을 증가시키기 위해 5% 글리세롤, 0.5% Triton X100 또는 0.5% NP40(Sigma) 상의 첨가가 2개 TAR1-27 이량체(d2 및 d16)의 정제시 포함되었다. NP40 또는 Triton X100의 첨가는 약 2배로 정제된 생성물 수율을 증가시켰다. 이량체 둘 모두는 수용체 에세이 내에서 평가되었다. TAR1-27d2는 모든 정제 조건 하에서 ∼30 nM의 IC50을 제공하였다. TAR1-27d16은 안정화제의 이용 없이는 중화 효과를 나타내지 않은 반면 안정화 조건 하에서 정제시 ∼50 nM의 IC50을 제공하였다. 부가적 분석은 수행되지 않았다.
2.4 TAR2-5 이량체
3 ×96 클론이 모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함한 두 번째 라운드 선택으로부터 취해졌다. 2 ml의 예비 상청액은 분석을 위해 제조되었다. 단백질 A 및 항원 ELISA는 각 플레이트에 대해 수행되었다. 30개 목적 클론이 BIAcore에 의해 좋은 오프-속도를 지닌 것으로 확인되었다(Koff 범위는 10-2∼10-3 M 범위이다). 클론은 시퀀스되었고 13개 독특한 이량체가 서열 분석에 의해 확인되었다.
TAR1-5 이량체
이량체 세포 타입 정제 단백질분획 용출조건 수용체/세포 에세이
TAR1-5d1 HB2151 단백질 L +FPLC 작은 이량체 종류 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼30 nM
TAR1-5d2 HB2151 단백질 L +FPLC 작은 이량체 종류 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼50 nM
TAR1-5d3 HB2151 단백질 L +FPLC 큰 이량체 종류 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼300 nM
TAR1-5d4 HB2151 단백질 L +FPLC 작은 이량체 종류 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼3 nM
TAR1-5d5 HB2151 단백질 L +FPLC 큰 이량체 종류 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼200 nM
TAR1-5d6 HB2151 단백질 L +FPLC 큰 이량체 종류 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼100 nM
* 이량체 2 및 이량체 3은 동일한 두 번째 dAb(dAb2로 명명)을 지니나 다른 링커 길이를 지닌다(d2 = (Gly4Ser)3, d3 = (Gly4Ser)3). dAb1은 이량체 1, 5 및 6에 대한 파트너 dAb이다. dAb3은 이량체 4에 대한 파트터 dAb이다. 파트너 dAb단독으로 중화시키지 않는다. FPLC 정제는 언급하지 않는한 양이온 교환에 의한다. FPLC에 의해 수득된 최적 이량체 종류는 이들 에세이 내에서 측정되었다.
TAR1-5-19 이량체
이량체 세포 타입 정제 단백질분획 용출조건 수용체/세포 에세이
TAR1-5-19d1 TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.0 RA∼15 nM
TAR1-5-19d2(정지 코돈 없음) TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.0 +0.05% NP40 RA∼2 nM
TAR1-5-19d3(정지 코돈 없음) TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.5 +0.05% NP40 RA∼8 nM
TAR1-5-19d4 TOP10F' 단백질 L +FPLC FPLC 정제된 분획 0.1 M 글리신pH 2.0 RA∼2-5 nM
TAR1-5-19d5 TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.0 +NP40 RA∼8 nM
TAR1-5-19d6 TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.0 RA∼10 nM
TAR1-5-19 상동이량체
이량체 세포 타입 정제 단백질분획 용출조건 수용체/세포 에세이
상동이량체 nMCA∼30 nM
TAR1-5-19 5U상동이량체 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼2 nMCA∼3 nM
TAR1-5-19 7U상동이량체 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼8 nMCA∼15 nM
TAR1-5-19cys 힌지 HB2151 단백질 L +FPLC FPLC 정제된 분획 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼2 nM
TAR1-5-19CH/TAR1-5-19CK HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼1 nM
TAR1-5/TAR1-5-19 Fab
이량체 세포 타입 정제 단백질분획 용출조건 수용체/세포 에세이
TAR1-5CH/dAb1 CK HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.6 RA∼90 nM
TAR1-5CH/dAb2 CK HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.5 RA∼30 nMCA∼60 nM
dAb3CH/TAR1-5CK HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.6 RA∼100 nM
TAR1-5-19CH/dAb1 CK HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.0 RA∼6 nM
dAb1 CH/TAR1-5-19CK HB2151 단백질 L 총 단백질 Myc/flag RA∼6 nM
TAR1-5-19CH/dAb2 CK HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.0 RA∼8 nMCA∼12 nM
TAR1-5-19CH/dAb3CK HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신pH 2.0 RA∼3 nM
TAR1-5-19CYS 이량체의 PCR 구조
dAb 삼량체를 기술한 실시예 8 참조. 삼량체 프로토콜은 단량체, 이량체 및 삼량체의 혼합물을 제공한다.
TAR1-5-19CYS 이량체의 발현 및 정제
이량체는 실시예 8에서 수득된 바와 같이 단백질 L 아가로스 상의 캡쳐에 의해 배양액의 상청액으로부터 정제되었다.
TAR1-5-19CYS 이량체로부터의 TAR1-5-19CYS 단량체 분리
양이온 교환 분리 전에 혼합된 단량체/이량체 표본은 제조사의 지침에 따라 PD-10 컬럼(Amersham Pharmacia)을 이용하여 50 mM 아세트산 완충액 pH 4.0으로 완충액 교환되었다. 이후 표본은 1 mL Resource S 양이온 교환 컬럼(Amersham Pharmacia)으로 적용되었고, 이는 50 mM 아세트산 완충액 pH 4.0으로 평형되었다. 단량체 및 이량체는 50 mM 아세트산 완충액 pH 4.0 내의 하기 염 기울기를 이용하여 분리되었다.
15 컬럼 부피 이상 150 내지 200 mM 염화나트륨
10 컬럼 부피 이상 200 내지 450 mM 염화나트륨
15 컬럼 부피 이상 450 내지 1000 mM 염화나트륨
이량체만을 포함한 분획이 SDS-PAGE를 이용하여 확인되었고 풀되었고 1 M Tris pH 8.0의 1/5 부피의 첨가에 의해 pH가 8까지 증가되었다.
시험관 기능성 결합 에세이: TNF 수용체 에세이 및 세포 에세이
인간 TNFα를 위한 이량체 친화력이 TNF 수용체 및 세포 에세이를 이용하여 측정되었다. 수용체 에세이 내 IC50은 약 0.3∼0.8 nM이었고; 세포 에세이 내 ND50은 약 3∼8 nM이었다.
다른 가능한 TAR1-5-19CYS 이량체 포맷
PEG 이량체 및 맞춤 합성 말레이미드 이량체
Nektar(Shearwater)는 단량체가 이량제로 포맷되게하고, 작은 링커로 dAb를 분리하고 둘 모두는 5∼40 kDa의 크기 범위로 PEG에 결합된 바이-말레이미드(bi-maleimide) PEG[m-PEG2-(MAL)2 또는 mPEG(MAL)2]를 제공한다. 이는 5 kDa mPEG-(MAL)2 (즉,[TAR1-5-19]-Cys-말레이미드-PEG ×2, 말레이미드는 이량체로 함께 결합됨)가 ∼1-3 nM의 TNF 수용체 에세이 내에 친화력을 지닌 것으로 나타났다. 또한 이량체는 TMEA(Tris[2-말레이미도에틸]아민)(Pierce Biotechnology) 또는 다른 이중-기능성 링커를 이용하여 제조될 수 있다.
또한 2,2'-디티오디피리딘(Sigma Aldrich) 및 치환된 단량체를 이용한 화학 결합 절차를 이용하여 2황화물 이량체를 제조하는 것도 가능하다.
dAb의 C-말단으로의 폴리펩타이드 링커 또는 힌지의 첨가
작은 링커, (Gly4Ser)n, n = 1∼10, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 면역글로불린(즉, IgG 힌지 구역 또는 무작위 펩타이드 서열(즉, 무작위 펩타이드 서열 라이브러로부터 선택됨))이 dAb와 말단 시스테인 잔기 사이에 설계될 수 있다. 이는 상기 나타난 바와 같이 이량체를 제조하는데 사용될 수 있다.
(실시예 8)
dAb 삼량체화
요약
dAb 삼량체에 있어서, 자유 시스테인이 단백질 C-말단에서 요구된다. 치환되어 자유 티올을 제공하는 시스테인 잔기가 단백질을 삼량체 말레이미드 분자, 예를 들어 TMEA(Tris[2-말레이미도에틸]아민)에 특이적으로 결합시키는데 사용될 수 있다.
TAR1-5-19CYS의 PCR 구조
하기 올리고뉴클레오타이드는 클로닝을 위한 SalI 및 BamHI 사이트로 특이적으로 사용되었고 C-말단 시스테인 잔기를 도입하는데 사용되었다 :
(* TAR1-5-19CYS 서열의 시작)
전방 프라이머
5'-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3'
역방 프라이머
5'-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3'
PCR 반응(50 ㎕ 부피)은 하기와 같이 셋팅되었다 : 200 μM dNTPs, 0.4 μM의 각 프라이머, 5 ㎕의 10x PfuTurbo 완충액(Stratagene), 100 ng의 주형 플라스미드(TAR1-5-10를 인코드), 1 ㎕의 PfuTurbo 효소(Stratagene) 및 부피는 멸균수를 이용하여 50 ㎕로 조정됨. 하기 PCR 조건이 사용되었다: 초기 출발 단계 94℃ 2분, 94℃ 30초, 64℃ 30초 및 72℃ 30초의 25 사이클. 최종 연장 단게는 72℃ 5분에 포함된다. PCR 생성물은 정제되었고 SalI 및 BamHI로 분해되었고 동일한 제한 효소로 절단된 벡터 내로 결찰도었다. 정확한 클론이 DNA 시퀀싱에 의해 증명되었다.
TAR1-5-19CYS의 발현 및 정제
TAR1-5-19CYS 벡터는 제조사의 프로토콜에 따라 BL21(DE3)pLysS 화학적으로 유능한 세포(Novagen) 내로 형질전환되었다. dAb 플라스미드를 지닌 세포는 100 ㎍/mldml 카르베니실린 및 37 ㎍/ml의 클로람페니콜을 이용하여 선택되었다. 배양액은 500 ml의 강한 브로쓰(broth)(Sigma Aldrich), 100 ㎍/mldml 카르베니실린 및 37 ㎍/ml의 클로람페니콜을 포함한 2 L 배플된(baffled) 플라스크 내에서 셋팅되었다. 배양액은 1∼1.5의 OD600까지 200 rmp에서 30℃로 생장되었고 1 mM IPTG(이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드, Melford Laboratories)로 유도되었다. dAb의 발현은 30℃에서 12∼16시간 동안 계속되었다. 대부분의 dAb가 배양액 배지 내에 존재하는 것으로 나타났다. 따라서 세포가 원심분리(8,000xg 30분간) 배지로부터 분리되었고 상청액은 dAb를 정제하는데 사용되었다. 상청액 리터 당 30 ml의 단백질 L 아가로스(Affitech)가 첨가되었고 dAb는 2시간 동안 교반하면서 뱃치(batch)되었다. 이후 수지는 상청액이 흡입되기(siphoned off) 전에 1시간 동안 중력 하에 정치되었다. 이후 아가로스가 10 컬럼 부피의 XK 50 컬럼(Amersham Phamacia) 내로 팩킹되었고 10 컬럼 부피의 PBS로 세척되었다. 결합된 dAb가 100 글리신 pH 2.0으로 용출되었고 단백질 함유 분획이 1/5 부피의 1 M Tris pH 8.0의 첨가에 의해 중화되었다. 배양액 상청액의 리터 당 20 mg의 정제수가 분리되었고 이는 이량체에 대한 단량체의 50 : 50 비율을 포함한다.
TAR1-5-19CYS의 삼량체화
2.5 ml의 100 μM TAR1-5-19CYS이 5 mM 디티오트레이톨로 치환되었고 상온에 20분간 정치되었다. 표본은 PD-10 컬럼(Amersham Pharmacia)을 이용하여 완충액 교환되었다. 컬럼은 5 mM EDTA, 50 mM 인산나트륨 pH 6.5로 예비-평형화되었고, 표본이 적용되었고 하기 제조사 지침에 따라 용출되었다. 표본은 필요시까지 얼음 위에 놓였다. TMEA(Tris[2-말레이미도에틸]아민)는 Pierce Biotechnology로부터 구입되었다. TMEA의 20 mM 저장 용액이 100% DMSO(디메틸술폭사이드) 내에서 제조되었다. 3 : 1(dAb : TMEA의 몰 비율) 이상의 TMEA의 농도는 빠른 침전 및 단백질의 교차-결합을 유발하는 것으로 나타났다. 또한 침전 속도 및 교차-결합은 pH가 증가함에 따라 더욱 커졌다. 따라서 100 μM의 치환된 TAR1-5-19CYS를 이용하여 25 μM의 TMEA가 단백질을 삼량체화하는데 첨가되었고 치환은 2시간 동안 상온에서 진행되었다. 20%(v/v)까지의 글리세롤 또는 에틸렌글리콜과 같은 첨가제의 첨가는 결합 반응 진행에 따라 삼량체의 침전을 유의적으로 감소시킨 것으로 나타났다. 결합 후 SDA-PAGE 분석은 용액 내 단량체, 이량체 및 삼량체의 존재를 나타내었다.
삼량체TAR1-5-19CYS의 정제
TMEA-TAR1-5-19cys 반응의 리터 당 40μM의 40% 빙초산이 첨가되어 pH를 ∼4로 감소시켰다. 이후 표본은 50 mM의 아세트산나트륨 pH 4.0으로 예비-평형화된 1 ml의 Resource S 양이온 교환 컬럼(Amersham Pharmacia)으로 적용되었다. 이량체 및 삼량체는 30 컬럼 이상의 340∼450 mM 염화나트륨, 50 mM 아세트산나트륨 pH 4.0의 염 기울기를 이용하여 부분적으로 분리되었다. 삼량체를 포함한 분획만이 SDS-PAGE를 이용하여 확인되었고 이후 풀되었고 1/5 부피의 1 M Tris pH 8.0의 첨가에 의해 pH가 8까지 증가되었다. 농축 단계 동안 삼량체의 침전을 방지하기 위해(5K 컷 오프 Viva spin 농축기; Vivascience를 이용) 10% 글리세롤이 표본 내로 첨가되었다.
인간 TNFα에 대한 삼량체의 친화력이 TNF 수용체 및 세포 에세이를 이용하여 측정되었다. 수용체 에세이 내 IC50는 0.3 nM이었다; 세포 에세이 내 ND50은 3∼10 nM 범위이었다(즉, 3 nM).
다른 가능한 TAR1-5-19CYS 삼량체 포맷
또한 TAR1-5-19CYS이 하기 반응물을 이용하여 삼량체 내로 포맷된다.
PEG 삼량체 및 맞춤 합성 말레이미드 삼량체
Nektar(Shearwater)는 PEG의 말단에서 화학적으로 변형될 수 있는 다수 암(arm) PEG를 제공한다. 따라서 각각의 암의 말단에 말레이미드 기능성 그룹을 지닌 PEG 삼량체를 이용하여 상기 나타난 TMEA를 이용하는 방법과 유사하게 dAb의 삼량체화를 가능하게 한다. PEG는 삼량체의 용해성을 증가시키는 장점을 지니고 따라서 집합의 문제점을 방지한다. 따라서 각 dAb가 말레이미드 기능성 그룹에 결합된 C-말단 시스테인을 지니고, 말레이미드 기능성 그룹은 PEG 삼량체에 결합하는 dAb 삼량체를 제조할 수 있다.
dAb의 C-말단으로의 폴리펩타이드 링커 또는 힌지의 첨가
작은 링커, (Gly4Ser)n, n = 1∼10, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 면역글로불린(즉, IgG 힌지 구역 또는 무작위 펩타이드 서열(즉, 무작위 펩타이드 서열 라이브러로부터 선택됨))이 dAb와 말단 시스테인 잔기 사이에 설계될 수 있다. 다량체를 제조시(즉, 이량체 또는 삼량체) 이는 다시 개별적 단량체사이에 더 큰 정도의 유연성 및 거리를 도입하고, 이는 타겟 즉, 인간 TNFα와 같은 멀티서브유니트 타겟으로의 결합 특성을 증가시킨다.
(실시예 9)
인간 혈청 알부민(HSA) 및 마우스 혈청 알부민(MSA)에 대해 지시된 단일 도메인 항체(dAb) 수집의 선택
본 실시예는 혈청 알부민에 대해 지시된 단일 도메인 항체(dAb)를 제조하는 방법을 설명한다. 마우스 혈정 알부민(MSA) 및 인간 혈청 알부민(HSA) 모두에 대한 dAb의 선택이 기술된다. 3개의 인간 파지 디스플레이 항체 라이브러리가 본 실험에 사용되었고, 사이드 체인 다양성을 지닌 각각의 VH에 대한 단일 인간 프레임워크(도 13: V3-23/DP47 및 JH4b에 기반한 모형 VH의 서열) 또는 Vκ에 대한 단일 인간 프레임워크(도 15: o12/o2/DPK9 및 Jk1에 기반한 모형 Vκ의 서열)는 상보성 측정 구역(CDR1, CDR2 및 CDR3) 내에 통합된 NNK 코돈에 의해 인코드된다.
라이버러리 1(VH)
위치에서의 다양성: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98.
라이브러리 크기: 6.2 ×109
라이버러리 2(VH)
위치에서의 다양성: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b.
라이브러리 크기: 4.3 ×109
라이버러리 3(Vκ)
위치에서의 다양성: L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96.
라이브러리 크기: 2 ×109
VH 및 Vκ 라이브러리는 일반 리간드 단백질 A 및 단백질 L 각각으로의 결합에 대해 미리 선택되어 선택되지 않은 라이브러리 내의 대부분의 클론이 기능적이다. 상기 나타난 라이브러리의 크기는 예비선택 후 크기에 상응한다.
선택의 2개 라운드가 각각의 라이브러리를 개별적으로 이용하여 혈처 알부민 상에서 수행되었다. 각 선택에 대해 항원은 100 ㎍/ml 농도로 4 ml의 PBS 내에서 면역시험관(nunc) 상에서 코팅되었다. 선택의 첫 번째 라운드에서 각각의 3개 라이브러리는 HSA(Sigma) 및 MSA(Sigma)에 대해 개별적으로 작동되었다. 선택의 두 번째 라운드에서 각각의 6개 첫 번째 라운드 선택으로부터의 파지가 (ⅰ) 다시 동일한 항원(즉, 1st 라운드 MSA, 2nd 라운드 MSA) 및 (ⅱ) 상반된 항원(즉, 1st 라운드 MSA, 2nd 라운드 HSA)에 대해 작동되어 총 12개 2nd 라운드 선택이 수득되었다. 각각의 경우 선택의 두 번째 라운드 후 48개 클론이 HSA 및 MSA로의 결합에 대해 시험되었다. 용해성 dAb 단편은 Harrison et al., Methods Enzymol. 1996, 267:83-109에 의해 scFv 단편에 대해 기술된 바와 같이 제조되었고, 2% Tween PBS가 블록킹 완충액으로 사용되었고 결합된 dAb가 단백질 L-HRP(Sigma)(Vκ의 경우) 또는 단백질 A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(VH의 경우)로 검출된 것을 제외하고는 표준 ELISA 프로토콜이 뒤따랐다(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133).
플라스틱 단독 모두로의 결합에 있어서 MSA, HSA 또는 둘 모두로의 결합이 ELISA 불용성 형태 내에서 시험되었음을 나타내는 백그라운드 이상의 신호를 제공하는 dAb는 혈청 알부민에 대해 특이적이었다. 이후 클론은 시퀀스되었고(하기 표 참조) 이는 21개 독특한 dAb 서열이 확인되었음을 나타내었다. Vκ dAb 클론 사이에서의 최소 유사성(아미노산 수준에서의)은 86.25%이었다((69/80) ×100; 모든 다양화된 잔기가 다를 때 즉, 클론 24 및 34의 결과). VH dAb 클론 사이에서의 최소 유사성은 94%이었다((127/136) ×100).
다음으로, 혈청 알부민 결합 항체는 용액으로부터 비오틴화된 항원을 포착하는 능력에 대해 시험되었다. ELISA 플레이트가 1 ㎍/ml의 단백질 L(Vκ 클론의 경우) 및 1 ㎍/ml의 단백질 A(VH 클론의 경우)로 코팅된 것을 제외하고는 ELISA 프로토콜(상기와 같은)이 수행되었다. 용해성 dAb가 프로토콜 내에서와 같이 용액으로부터 포획되었고 검출은 비오틴화된 MSA 또는 HSA 및 스트렙타비딘 HRP로 이루어졌다. 비오틴화 MSA 및 HSA는 혈청 알부민 분자 당 평균 2개 비오틴을 달성하는 목적으로 제조사의 지침에 따라 제조되었다. ELISA 내 용액으로부터 포획된 비오틴화 MSA 24개 클론이 확인되었다. 다음으로, dAb는 CM5 biacore 칩 상에서 코팅된 MSA에 결합하는 능력에 대해 시험되었다. 8개 클론이 biacore 상에서 MSA에 결합된 것으로 나타났다.
모든 경우에서 프레임워크는 상기 표에 나타난 바와 같이 CDR 내 다양성으로 상응하는 모형 서열 내 프레임워크와 동일하였다.
bicore 상에서 MSA에 한 8개 클론 중 E. coli 내에서 높게 발현된 2개 클론(클론 MSA16 및 MSA26)이 또다른 연구를 위해 선택되었다(실시예 10 참조). MSA16 및 26에 대한 전체 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 도 16에 나타난다.
(실시예 10)
dAbs MSA16 및 MSA26에 결합하는 마우스 MSA의 친화력 및 혈청 반감기의 측정
dAbd MSA16 및 MSA26은 E. coli의 세포질 주변 내에서 발현되었고 단백질 L-아가로스 친화력 수지(Affitech, Norwary)로의 흡수 배치를 이용하여 정제되었고 pH 2.2의 글리신으로 용출되었다. 이후 정제된 dAb는 Kd를 측정하기 위해 억제 biacore에 의해 분석되었다. 간단히, 정제된 MSA16 및 MSA26은 고밀도의 MSA로 코팅된 biacore CM5 칩 상에서의 200RU의 반응을 달성하는데 필요한 dAb 농도를 측정하기 위해 시험되었다. dAb의 필요 농도가 측정되면 농도 범위의 MSA 항원 및 예측된 kd가 dAb와 미리 혼합되었고 밤새 인큐베이트되었다. 이후 각각의 예비믹스 내에서 dAb의 biacore로 코팅된 칩 MSA로의 결합은 30 ㎕/분의 높은 유속으로 측정되었다. 수득된 곡선은 Klotz 플롯을 생성하는데 사용되었고, 이는 MSA16에 대한 200 nM 및 MSA26에 대한 70 nM의 추정된 Kd를 제공하였다(도 17A 및 B).
다음으로, 클론 MSA16 및 MSA26은 HA tag(핵산 서열: TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA 및 아미노산 서열: YPYDVPDYA)로 발현 벡터 내로 클론되었고 2∼10 mg 양이 E. coli 내에서 발현되었고 단백질 L-아가로스 친화력 수지(Affitech, Norwary)로 상청액으로부터 정제되었고 pH 2.2의 글리신으로 용출되었다. dAb의 혈청 반감기가 마우스에서 측정되었다. MSA26 및 MSA16은 약 1.5 mg/kg으로 CD1 마우스에 단일 i.v. 주사로서 투여되었다. 혈청 수준 분석은 염소 항-HA(Abcam, UK) 및 4% Marvel로 블럭된 단백질 L-HRP(invitrogen) 검출 ELIA에 의해 이루어졌다. 세척은 0.05% Tween PBS로 되었다. dAb의 알려준 농도의 표준 곡선은 시험 표본과의 동등성을 확인하기 위해 1x마우스의 존재시 셋팅되었다. 2 구획 모델로의 모델링은 MSA-26이 16시간의 t1/2α, 14.5시간의 t1/2β 및 465 hr.mg/ml의 곡선 아래 면적(area under the curve, AUC)을 지녔고(데이터는 나타내지 않음), MSA-16이 0.98시간의 t1/2α, 36.5시간의 t1/2β 및 913 hr.mg/ml의 AUC를 지님을 나타내었다(도 18). 항-MSA 클론 둘 모두는 0.06시간의 t1/2α 및 0.34시간의 t1/2β를 지닌 HEL4(항-암탉 계란 백색 리소자임 dAb)와 비교시 매우 연장된 반감기를 지녔다.
(실시예 11)
V H -V H 및 V κ -V κ 이중-특이적 Fab 유사 단편의 생성
본 실시예는 VH-VH 및 Vκ-Vκ 이중-특이적 Fab 유사 단편을 제조하는 방법을 기술한다. 기술된 각각의 Fab 유사 단편의 구조 전에 선택 타겟에 결합하는 dAb는 먼저 실시예 9에 기술된 것과 유사한 dAb 라이브러리로부터 선택되었다. 또한암탉 계란 리소자임(Sigma)에 결합하는 VH dAb, HEL4가 분리되었고, TNFα수용체(R and D systems)에 결합하는 두 번째 VH dAb(TAR2h-5)도 분리되었다. 이들의 서열은 서열목록 내에 제공된다. TNFα(TAR1-5-19)에 결합하는 Vκ dAb이 선택 및 친화력 성숙에 의해 분리되었고 서열도 서열목록 내에 나타나 있다. 서열이 도 17B에 나타난 실시예 9에 기술된 두 번째 Vκ dAb(MSA 26)도 이들 실험에 사용되었다.
상기 기술된 4개 dAb를 포함한 발현 벡터로부터의 DNA는 dAb를 코드하는 DNA를 절제하기 위해 효소 SalI 및 NotI로 분해되었다. 예측된 크기(300∼400 bp)의 밴드는 아가로스 겔 상에서 분해를 실행하고 밴드를 절제한 후 Qiqgen 겔 정제 키트(Qiagen, UK)를 이용한 겔 정제를 행함으로서 정제되었다. 이후 dAb를 코드한 DNA는 하기 표에 나타난 바와 같이 CH 또는 Cκ 벡터(도 8 lc 9) 내로 삽입되었다.
dAb 타겟 항원 dAb VH 또는dAb Vκ 벡터 내로 삽입 tag(C 말단) 항생제저항성
HEL4 암탉 계란 리조자임 VH CH myc 클로람페니콜
TAR2-5 TNF 수용체 VH Cκ flag 암피실린
TAR1-5-19 TNFα Vκ CH myc 클로람페니콜
MSA 26 마우스 혈청 알부민 Vκ Cκ flag 암피실린
VHCH 및 VHCκ 컨스트럭트는 HB2151 세포 내로 동시 형질전환되었다. 별도로, VκCH 및 VκCκ 컨스트럭트는 HB2151 세포 내로 동시 형질전환되었다. 동시 형질전환된 세포주의 각각의 배양액은 밤새 생장되었다(CH 및 Cκ 플라스미드 모두에 대한 항생제 선택을 유지하기 위해 5% 글루코스, 10 ㎍/ml 클로람페니콜 및 100 ㎍/ml 암피실린을 함유한 2xTY 내에서). 밤새 배양액은 신선한 배지(2xTY, 10 ㎍/ml 클로람페니콜 및 100 ㎍/ml 암피실린)를 접종시키는데 사용되었고, CH 및 Cκ 컨스트럭트를 발현하기 위해 IPTG 첨가에 의한 유도 전에 OD0.7-0.9로 생장되었다. 발현된 Fab 유사 단편은 단백질 A 정제(동시 형질전환된 VHCH 및 VHCκ 의 경우) 및 MSA 친화력 수지 정제(동시 형질전환된 VκCH 및 VκCκ의 경우)에 의해 세포질 주변으로부터 정제되었다.
V H -V H 이중-특이적
VHCH 및 VHCκ 이중 특이적 Fab 유사 단편의 발현은 겔 상에서 단백질을 진행시킴으로서 시험되었다. 겔은 블럿되었고 Fab 단편에 대한 기대 크기의 밴드는 myc tag 및 flag tag 모두를 통한 웨스턴 블럿 상에서 검출될 수 있었고, 이는 Fab 유사 단편의 VHCH 및 VHCκ 부분 모두가 존재함을 나타내었다. 다음으로, 2개의 이중 특이적 반이 동일한 Fab-유사 단편 내에 존재하는지 여부를 측정하기 위해 중탄산나트륨 완충액 내의 3 mg/ml에서 ELISA 플레이트가 암탉 계란 리소자임(HEL)의 웰 당 100 ㎕로 4℃에서 밤새 코팅되었다. 이후 플레이트는 2% Tween PBS로 블록된 후(실시예 2에 기술된 바와 같이) VHCH/VHCκ 이중 특이적 Fab 유사 단편과 인큐베이션되었다. HEL로의 이중 특이적의 결합 검출은 9e10(myc tag에 결합하는 단일클론 항체) 및 항 마우스 IgG-HARP(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 비 동족 체인을 통해 행해졌다. VHCH/VHCκ 이중 특이적 Fab 유사 단편에 대한 신호는 VHCκ체인 단독으로 발현된 백그라운드 신호 0.069와 비교시 0.154이었다. 이는 Fab 유사 단편이 타겟 항원에 대한 결합 특이성을 지님을 증명한다.
V κ -V κ 이중-특이적
MSA 친화력 수지 상에서 동시 형질전환된 VHCH 및 VHCκ 이중 특이적 Fab 유사 단편을 정제한 후, 수득된 단백질은 1 ㎍/ml TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트 및 10 ㎍/ml MSA로 코팅된 ELISA 플레이트를 프로브하는데 사용되었다. 예측된 바와 같이 양 ELISA 플레이트 상에서 단백질 L-HRP로 검출시 백그라운드 이상의 신호가 존재하였다(데이터는 나타내지 않음). 또한 이는 MSA에 결합할 수 있는(따라서 MSA 친화력 컬럼 상에서 정제된) 단백질 분획이 이후의 ELISA 내에서 TNFα에 결합할 수 있음을 나타내고, 이는 항체 단편의 이중 특이성을 확인시켰다. 단백질의 이러한 분획은 2개의 하위 실험에 사용되었다. 먼저, 1 ㎍/ml TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트는 ELISA 상의 유사한 신호를 제공하는 것으로 계산된 농도로 이중 특이적 VκCH 및 VκCκ Fab 유사 단편 및 대조군 TNFα 결합 dAb로 프로브되었다. 이중 특이적 및 대조군 dAb 모두는 2 mg/ml MSA의 존재 및 부재시 ELISA 플레이트를 프로브하는데 사용되었다. 이중 특이적 웰 내의 신호는 50% 이상까지 감소되었으나 dAb 내의 신호는 전혀 감소되지 않았다(도 19a 참조). 동일한 단백질이 MSA로 또는 그 없이 수용체 에세이 내에 놓였고 MSA에 의한 경쟁이 나타났다(도 19c). 이는 MSA의 이중 특이적에 대한 결합이 TNFα로의 결합과 경쟁적임을 증명한다.
(실시예 12)
마우스 혈청 알부민 및 TNFα에 대한 특이성을 지닌 Vκ-Vκ 이중 특이적 cys 결합된 이중 특이적의 생성
본 실시예는 2황화물 결합을 통한 화학적 결합에 의해 마우스 혈청 알부민 및 TNFα모두에 대해 특이적인 이중 특이적 항체 단편을 제조하는 방법을 기술한다. MSA16(실시예 1) 및 TAR1-5-19 dAb 모두는 C 말단 시스테인을 지니고 tag가 없는 pET 기반 벡터 내로 재클론되었다. 2개 dAb는 4∼10 mg 수준으로 발현되었고 단백질 L-아가로스 친화력 수지(Affitech, Norway)를 이용하여 상청액으로부터 정제되었다. 시스테인 태그된 dAb는 디티오트레이톨로 치환되었다. TAR1-5-19 dAb는 PEP 1-5-19 상동이량체의 형성을 유발하는 2황화물 결합의 재형성을 차단하기 위해 디티오디피리딘과 결합되었다. 2개의 다른 dAb가 pH 6.4에서 혼합되어 2황화물 결합 형성 및 TAR1-5-19, MSA16 cys 결합된 이형이량체의 생성을 증가시켰다. 2개의 다른 단백질의 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 King et al.에 의해 처음으로 기술되었다(King TP, Li Y Kochoumian L Biochemistry. 1978 17:1499-506 Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation). 이형상동체는 양이온 교환에 의해 단량체 종류로부터 분리되었다. 분리는 SDS 겔 상에서의 예측된 크기의 밴드의 존재에 의해 확인되었다. 수득된 이형이량체 종류는 TNF 수용체 에세이 내에서 시험되었고 약 18 nM의 중화를 위한 IC50을 지니는 것으로 나타났다. 다음으로, 수용체 에세이는 이형이량체이 일정 농도(18 nM) 및 MSA 및 HSA의 희석 시리즈로 반복되었다. 농도 범위에서의(약 2mg/ml까지) HSA의 존재는 이량체의 TNFα억제 능력의 감소를 유발하지 않았다. 그러나 MSA의 첨가는 이량체의 TNFα억제 능력의 투여량 의존적 감소를 유발하였다(도 20). 이는 MSA 및 TNFα가 cys 결합된 TAR1-5-19, MSA16 이량체로의 결합에 대해 경쟁함을 증명한다.
데이터 요약
전술된 실시예에 나타난 실험에서 수득된 데이터의 용약은 부록 4에 나타나 있다.
본 명세서 내에 언급된 모든 간행물 및 상기 간행물에 인용된 문헌은 참고문헌에 포함되어 있다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 정신에서 벗어남 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 연결되어 기술되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시태양에 한정적이지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 또는 관련 분야에서 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있게 된다.
부록 1; 생체 내에서 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드
알파-1 글리코프로테인(오로뮤코이드)(AAG)
알파-1 안티키로모티로신(ACT)
알파-1 안티티로신(AAT)
알파-1 마이크로글로불린(단백질 HC)(AIM)
알파-2 마크로글로불린(A2M)
안티트롬빈 Ⅲ(AT Ⅲ)
아폴리포프로테인A-1(Apo A-1)
아폴리프로테인 B(Apo B)
베타-2-마이크로글로불린(B2M)
세룰로플라스민(Cp)
보충 성분(Complement Component)(C3)
보충 성분(C4)
C1 에스테라제 저해제(C1 INH)
C-반응성 단백질(CRP)
시스타틴 C(Cys C)
페리틴(FER)
피브리노겐(FIB)
피브로텍틴(FN)
하프토글로빈(Hp)
헤모펙신(HPX)
면역글로불린 A(IgA)
면역글로불린 D(IgD)
면역글로불린 E(IgE)
면역글로불린 G(IgG)
면역글로불린 M(IgM)
면역글로불린 라이트 체인(카파/람다)
리포프로테인(a)[Lp(a)]
만노스-결합 단백질(MBP)
미오글로빈(Myo)
플라스미노겐(PSM)
프리알부민(트랜스티레틴)(PAL)
레티놀-결합 단백질(RBP)
레노마토이드 인자(RF)
혈청 아밀로이드 A(SAA)
용해성 트랜스페린 수용체(sTfR)
트랜스페린(Tf)
부록 2
부록 3: 종양학 결합
부록 4
<110> Domantis Limited <120> Ligand <150> PCT/GB02/03014 <151> 2002-06-28 <150> GB0230202.4 <151> 2002-12-27 <160> 72 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Gallus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> HEL4 <400> 1 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttt agg att agc gat gag 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu 20 25 30 gat atg ggc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gta 144 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca agc att tat ggc cct agc ggt agc aca tac tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgt gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tat tgc 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agt gct ttg gag ccg ctt tcg gag ccc ctg ggc ttt tgg ggt cag 336 Ala Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg agc 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Gallus sp. <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu 20 25 30 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <223> TAR2-5 <400> 3 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt gat ctt tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30 aat atg ttt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca ttt att agt cag act ggt agg ctt aca tgg tac gca gac tcc gtg 192 Ser Phe Ile Ser Gln Thr Gly Arg Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa acg ctg gag gat ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Lys Thr Leu Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcg agc 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30 Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Gln Thr Gly Arg Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Leu Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> TAR1-5-19 <400> 5 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc gtt aag gag ttt 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe 20 25 30 tta tgg tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat atg gca tcc aat ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag aag ttt aag ctg cct cgt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe 20 25 30 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 722 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (363)..(722) <223> TAR2-10 <400> 7 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag tggtattgga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagttaag 300 ttgggggggg ggcctaattt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 gc gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct 404 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 ggg ggg tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt gag 452 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu 15 20 25 30 tgg tat tgg atg ggt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag 500 Trp Tyr Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg gtc tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac gca gac 548 Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 tcc gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg 596 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 ctg tat ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat 644 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 80 85 90 tac tgt gcg aaa gtt aag ttg ggg ggg ggg cct aat ttt gac tac tgg 692 Tyr Cys Ala Lys Val Lys Leu Gly Gly Gly Pro Asn Phe Asp Tyr Trp 95 100 105 110 ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcg agc 722 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Trp Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Lys Leu Gly Gly Gly Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> TAR1-5-19 <400> 9 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tct ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att gat agt tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr 20 25 30 tta cat tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat agt gca tcc gag ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gtt gtg tgg cgt cct ttt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgc 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> TAR1-5 <400> 11 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att ttt atg aat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Met Asn 20 25 30 tta ttg tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat aat gca tcc gtg ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gtt gtg tgg cgt cct ttt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Met Asn 20 25 30 Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> Monomer - dAb1: Partner dAb in TAR1-5d1 (3Ulinker), d5 (5U linker), d6 (7U linker) <400> 13 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att tat gat gcg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala 20 25 30 tta gag tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat act gca tcc cgg ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gtt atg cag cgt cct gtt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 15 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> Monomer - dAb2: Partner dAb in TAR1-5d2 (3U linker), d3 (5U linker) <400> 15 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att tat gat gct 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala 20 25 30 tta cag tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat act gca tcc cgg ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac cac tgt caa cag gtt atg cag cgt cct gtt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 17 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> Monomer - dAb3: Partner dAb in TAR1-5d4 (5U linker) <400> 17 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc gtt aag gag ttt 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe 20 25 30 tta tgg tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat atg gca tcc aat ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag aag ttt aag ctg cct cgt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe 20 25 30 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 19 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> TAR1-27 <400> 19 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att tgg acg aag 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Trp Thr Lys 20 25 30 tta cat tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat atg gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Met Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag tgg ttt agt aat cct agt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Phe Ser Asn Pro Ser 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgc 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Trp Thr Lys 20 25 30 Leu His 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agt ggg gtc cca tca 180 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 15 20 25 30 cgt ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc 228 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 35 40 45 agt ctg caa cct gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag att cag 276 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Gln 50 55 60 cat att cct gtg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 His Ile Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 65 70 75 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Pro Ile Leu 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Gln His Ile Pro Val Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 23 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d2 (3U linker) <220> <221> CDS <222> (94)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d2 (3U linker) <400> 23 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att ggg 90 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly 20 25 30 tag gat tta cat tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag 135 Asp Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 1 5 10 ctc ctg atc tat acg gca tcc ctt ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt 183 Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 15 20 25 30 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt 231 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 35 40 45 ctg caa cct gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag cag agt gct 279 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Ser Ala 50 55 60 ttt cct aat acg ctc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Phe Pro Asn Thr Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 65 70 75 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Thr Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Ser Ala Phe Pro Asn Thr 85 90 95 Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 25 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(147) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d7 (3Ulinker) <220> <221> CDS <222> (151)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d7 (3Ulinker) <400> 25 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tcc gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc ata acg aag aat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Lys Asn 20 25 30 tta ctt tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat tagggca tcc tct ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 1 5 10 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 15 20 25 30 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag ctt cgt cat aag cct ccg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Arg His Lys Pro Pro 35 40 45 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 50 55 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Lys Asn 20 25 30 Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Arg His Lys Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 27 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(87) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d8 (3Ulinker) <220> <221> CDS <222> (91)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d8 (3Ulinker) <400> 27 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att taga 87 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 20 25 tagaaag tct tta agg tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct 132 Lys Ser Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 1 5 10 aag ctc ctg atc tat cat gca tcc gat ttg caa agt ggg gtc cca tca 180 Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 15 20 25 30 cgt ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc 228 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 35 40 45 agt ctg caa cct gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag atg gtt 276 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Val 50 55 60 aat agt cct gtt acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Asn Ser Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 65 70 75 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Ser Leu 20 25 30 Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 His Ala Ser Asp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Val Asn Ser Pro Val Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 29 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(87) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d12 (3Ulinker) <220> <221> CDS <222> (91)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d12 (3Ulinker) <400> 29 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att taga 87 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 20 25 tagaacg gcg tta cat tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct 132 Thr Ala Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 1 5 10 aag ctc ctg atc tat tct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca 180 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 15 20 25 30 cgt ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc 228 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 35 40 45 agt ctg caa cct gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag tcg agt 276 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser 50 55 60 ttt ttg cct ttt acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Phe Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 65 70 75 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ala Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Phe Leu Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 31 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d16 (3U linker) <400> 31 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att ggg ccg aat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Pro Asn 20 25 30 tta gag tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag cag atg ggg cgt cct cgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Met Gly Arg Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Pro Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Met Gly Arg Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 33 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(93) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d23 (5U linker) <220> <221> CDS <222> (97)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d23 (5U linker) <400> 33 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att aag cat 93 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys His 20 25 30 tag tta gct tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc 138 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 1 5 10 ctg atc tat aag gca tcc gtg ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc 186 Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 15 20 25 30 agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg 234 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 35 40 45 caa cct gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag ctt agg cgt cgt 282 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Arg Arg Arg 50 55 60 cct act acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 65 70 75 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys His Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Lys Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Arg Arg Arg Pro Thr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 35 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(93) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d30 (7U linker) <220> <221> CDS <222> (97)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d30 (7U linker) <400> 35 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc gtt aag gct 93 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Ala 20 25 30 tag tta act tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc 138 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 1 5 10 ctg atc tat aag gca tcc act ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc 186 Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 15 20 25 30 agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg 234 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 35 40 45 caa cct gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag cat agt tct agg 282 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Ser Arg 50 55 60 cct tat acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 65 70 75 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Ala Leu 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Ser Arg Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 37 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(147) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d31 (7U linker) <220> <221> CDS <222> (151)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d31 (7U linker) <400> 37 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att gag aat cgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Glu Asn Arg 20 25 30 tta ggt tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat tagggcg tcc ttg ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 1 5 10 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 15 20 25 30 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gat tcg tat ttt cct cgt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Tyr Phe Pro Arg 35 40 45 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 50 55 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Glu Asn Arg 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Tyr Phe Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 39 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(147) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d36 (7U linker) <220> <221> CDS <222> (151)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d36 (7U linker) <400> 39 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att atg gat aag 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Met Asp Lys 20 25 30 tta aag tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat tagggca tcc att ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 1 5 10 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 15 20 25 30 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gat agt ggg ggt cct aat 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Gly Gly Pro Asn 35 40 45 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 50 55 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Met Asp Lys 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Gly Gly Pro Asn Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 41 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d37 (7U linker) <400> 41 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att ggg agg aat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Asn 20 25 30 tta gag tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc cat ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag tcg cgt tgg ctt cct cgt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Trp Leu Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 42 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Trp Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 43 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> Partner dAb monomer in TAR1-27d39 (7U linker) <400> 43 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agg aag atg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Lys Met 20 25 30 tta gtt tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat cgg gca tcc tat ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Arg Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gct ttt cgg cgg cct agg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Phe Arg Arg Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 44 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Lys Met 20 25 30 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Phe Arg Arg Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 45 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <223> TAR2h-5 <400> 45 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt gat ctt tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30 aat atg ttt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca ttt att agt cag act ggt agg ctt aca tgg tac gca gac tcc gtg 192 Ser Phe Ile Ser Gln Thr Gly Arg Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa acg ctg gag gat ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Lys Thr Leu Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcg 345 Thr Val Ser 115 <210> 46 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30 Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Gln Thr Gly Arg Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Leu Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 47 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d1 (3U linker) <400> 47 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt ccg gtt tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Val Tyr 20 25 30 atg atg ggt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Met Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca tcg att gat gct ctt ggt ggg cgg aca ggt tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ser Ile Asp Ala Leu Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa act atg tcg aat aag acg cat acg ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Thr Met Ser Asn Lys Thr His Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 48 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Val Tyr 20 25 30 Met Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Ala Leu Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Met Ser Asn Lys Thr His Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 49 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(168) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d2 (3U linker) <220> <221> CDS <222> (172)..(345) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d2 (3U linker) <400> 49 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt gtg gct tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Ala Tyr 20 25 30 aat atg act tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca agt att aat act ttt ggt aat ta g aca agg tac 180 Ser Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asn Thr Arg Tyr 50 55 1 gca gac tcc gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag 228 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 5 10 15 aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg 276 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 20 25 30 35 gta tat tac tgt gcg aaa ggt agt agg cct ttt gac tac tgg ggc cag 324 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ser Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 40 45 50 gga acc ctg gtc acc gtc tcg 345 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 55 <210> 50 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Ala Tyr 20 25 30 Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asn Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Ser Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser <210> 51 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(87) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d3 (3U linker) <220> <221> CDS <222> (91)..(357) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d3 (3U linker) <400> 51 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt tagg 87 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 taggggg tat cgt atg ggt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt 132 Gly Tyr Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 1 5 10 cta gag tgg gtc tca tgg att acg cgt act ggt ggg acg aca cag tac 180 Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Thr Arg Thr Gly Gly Thr Thr Gln Tyr 15 20 25 30 gca gac tcc gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag 228 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 35 40 45 aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg 276 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60 gta tat tac tgt gcg aaa ccg gcg aag ctt gtt ggg gtt ggg ttt gac 324 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Ala Lys Leu Val Gly Val Gly Phe Asp 65 70 75 tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 80 85 <210> 52 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Arg 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 35 40 45 Trp Ile Thr Arg Thr Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Pro Ala Lys Leu Val Gly Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 53 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d4 (3U linker) <220> <221> CDS <222> (100)..(357) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d4 (3U linker) <400> 53 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt cgg aag tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr 20 25 30 tag atg ggg tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg 141 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 1 5 10 gtc tca cag att ggt gcg aag ggt cag tct aca gat tac gca gac tcc 189 Val Ser Gln Ile Gly Ala Lys Gly Gln Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 15 20 25 30 gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg 237 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 35 40 45 tat ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac 285 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 50 55 60 tgt gcg aaa aag aag agg ggg gag aat tat ttt ttt gac tac tgg ggc 333 Cys Ala Lys Lys Lys Arg Gly Glu Asn Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly 65 70 75 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 80 85 <210> 54 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 35 40 45 Gln Ile Gly Ala Lys Gly Gln Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Lys Lys Arg Gly Glu Asn Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 55 <211> 357 <212> DNA 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ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Arg Ile Asp Ser Ser Gln Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 56 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Ser Arg Ser Gly Arg Tyr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Ile Asp Ser Ser Gln Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 57 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(87) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d6 (3U linker) <220> <221> CDS <222> (91)..(345) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d6 (3U linker) <400> 57 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt tagg 87 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 taggggg tat aag atg ttt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt 132 Gly Tyr Lys Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 1 5 10 cta gag tgg gtc tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac 180 Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 15 20 25 30 gca gac tcc gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag 228 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 35 40 45 aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg 276 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60 gta tat tac tgt gcg aaa cag aag gag aat ttt gac tac tgg ggc cag 324 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Lys Glu Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 65 70 75 gga acc ctg gtc acc gtc tcg 345 Gly Thr Leu Val 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Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 gct atg tgg tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Ala Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca gtg att agt tcg aat ggt ggg agt aca ttt tac gca gac tcc gtg 192 Ser Val Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa cgt gtt cgt aag agg act cct gag ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Arg Val Arg Lys Arg Thr Pro Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 60 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 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aag aca aat tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Thr Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa att tat acg ggg aag cct gct gcg ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Ile Tyr Thr Gly Lys Pro Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 62 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Leu His Val Asp Asn Leu Arg Pro Pro Pro Asn His Val Gly Pro Pro 1 5 10 15 Arg Asp Ala Glu Arg Thr Arg Arg Arg Pro Lys Trp Lys Ser Ser Ile 20 25 30 Phe Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Thr Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Tyr Thr Gly Lys Pro Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 63 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d9 (3U linker) <220> <221> CDS <222> (100)..(357) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d9 (3U linker) <400> 63 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt aag aag tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Lys Tyr 20 25 30 tag atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg 141 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 1 5 10 gtc tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac gca gac tcc 189 Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 20 25 30 gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg 237 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 35 40 45 tat ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac 285 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 50 55 60 tgt gcg aaa atg ctg agg act aag aat aag gtg ttt gac tac tgg ggc 333 Cys Ala Lys Met Leu Arg Thr Lys Asn Lys Val Phe Asp Tyr Trp Gly 65 70 75 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 80 85 <210> 64 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Lys Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 35 40 45 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Met Leu Arg Thr Lys Asn Lys Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 65 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d10 (5U linker) <400> 65 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt agg agg tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 aag atg ggt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca gcg att ggg agg aat ggt acg aag aca aat tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Thr Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa att tat acg ggg aag cct gct gcg ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Ile Tyr Thr Gly Lys Pro Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 66 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Thr Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Tyr Thr Gly Lys Pro Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 67 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(87) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d11 (5U linker) <220> <221> CDS <222> (91)..(357) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d11 (5U linker) <400> 67 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt taga 87 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 tagaagt tat cgg atg ggt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt 132 Ser Tyr Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 1 5 10 cta gag tgg gtc tca agt att tcg tcg agg ggt agg cat aca tct tac 180 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg His Thr Ser Tyr 15 20 25 30 gca gac tcc gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag 228 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 35 40 45 aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg 276 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60 gta tat tac tgt gcg aaa agg gtt ccg ggt cgg ggg cgt tct ttt gac 324 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Val Pro Gly Arg Gly Arg Ser Phe Asp 65 70 75 tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 80 85 <210> 68 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Arg 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 35 40 45 Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg His Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Val Pro Gly Arg Gly Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 69 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d12 (5U linker) <400> 69 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc ccc ttt cgt cgg tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 cgg atg agg tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Arg Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca ggt att tct ccg ggt ggt aag cat aca acg tac gca gac tcc gtg 192 Ser Gly Ile Ser Pro Gly Gly Lys His Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa ggt gag ggg ggg gcg agt tct gcg ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ser Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 70 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 Arg Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Pro Gly Gly Lys His Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ser Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 71 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(87) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d13 (5U linker) <220> <221> CDS <222> (91)..(357) <223> Partner dAb monomer in TAR2h-5d13 (5U linker) <400> 71 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt tagc 87 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 tagccgg tat ggg atg gtt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt 132 Arg Tyr Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 1 5 10 cta gag tgg gtc tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac 180 Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 15 20 25 30 gca gac tcc gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag 228 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 35 40 45 aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg 276 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60 gta tat tac tgt gcg aaa cgg cat agt tct gag gct agg cag ttt gac 324 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg His Ser Ser Glu Ala Arg Gln Phe Asp 65 70 75 tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcg 357 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 80 85 <210> 72 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Tyr Gly 20 25 30 Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 35 40 45 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Arg His Ser Ser Glu Ala Arg Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115

Claims (117)

  1. 첫 번째 에피토프 또는 항원에 대한 결합 특이성을 지닌 첫 번째 면역글로불린 단일 변이가능 도메인 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 대한 결합 특이성을 지닌 두 번째 상보성 면역글로불린 단일 변이가능 도메인을 포함하고, 상기 항원 또는 에피토프의 하나 또는 둘 모두는 생체 내에서 리간드의 반감기를 증가시키는 작용을 하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 도메인은 상기 이중-특이적 리간드가 항-HSA VH 도메인 및 항-β 갈락토시다제 Vκ 도메인으로 구성되지 않는 경우 동일한 특이성을 공유하는 상호 상보성 도메인을 지니지 않음을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  2. 제 1항에 있어서, 항체의 적어도 하나 이상의 단일 헤비 체인 변이가능 도메인 및 항체의 하나의 상보성 단일 라이트 체인 변이가능 도메인을 포함하여 두 구역이 결합하여 상보성 VH/VL 쌍을 형성할 수 있음을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  3. 제 2항에 있어서, 상기 VH 및 VL은 항체 scFv 단편에 의해 제공됨을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  4. 제 2항에 있어서, 상기 VH 및 VL은 항체 Fab 구역에 의해 제공됨을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  5. 제 2항의 이중-특이적 리간드를 포함한 4개 체인 IgG 면역글로불린 리간드
  6. 제 5항에 있어서 상기 IgG는 2개의 이중-특이적 리간드를 포함하고, 상기 이중-특이적 리간드는 그의 변이가능 도메인과 동일함을 특징으로 하는 4개 체인 IgG 면역글로불린 리간드
  7. 제 5항에 있어서, 상기 IgG는 이중-특이적 리간드를 포함하고, 상기 이중-특이적 리간드는 그의 변이가능 도메인과 상이함을 특징으로 하는 4개 체인 IgG 면역글로불린 리간드
  8. 첫 번째 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 지닌 첫 번째 면역글로불린 변이가능 도메인 및 두 번째 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 지닌 두 번째 면역글로불린 변이가능 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 변이가능 도메인의 하나 또는 둘 모두는 생체 내에서 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 결합하고, 변이가능 도메인은 서로 상보적이지 않음을 특징으로 하는 리간드
  9. 제 8항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 변이가능 도메인은 헤비 체인 변이가능 도메인(VH)임을 특징으로 하는 리간드
  10. 제 8항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 변이가능 도메인은 라이트 체인 변이가능 도메인(VL)임을 특징으로 하는 리간드
  11. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프는 독립적으로 결합하여 이중-특이적 리간드가 첫 번째 및 두 번째 에피토프 또는 항원 모두에 동시에 결합함을 특징으로 하는 리간드
  12. 제 11항에 있어서, 상기 이중-특이적 리간드는 용액 내에서 평형으로 첫 번째 형태 및 두 번째 형태를 포함하고, 상기 에피토프 또는 항원 둘 모두는 첫 번째 형태에 독립적으로 결합하나 두 번째 형태로의 결합에 대해 경쟁함을 특징으로 하는 리간드
  13. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 변이가능 구역은 상기 에피토프 또는 항원에 대해 지시된 면역글로불린으로부터 유도됨을 특징으로 하는 리간드
  14. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프는 개별적 항원 상에 존재함을 특징으로 하는 리간드
  15. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프는 동일한 항원 상에 존재함을 특징으로 하는 리간드
  16. 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유도된 변이가능 도메인을 포함한 상기 어느 한 항에 따른 리간드
  17. 제 16항에 있어서, 상기 레퍼토리는 섬질의 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이되고, 상기 단일 항체 도메인은 박테리오파지 레퍼토리의 항원에 대한 결합에 의해 선택됨을 특징으로 하는 리간드
  18. 상기 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나 이상의 변이가능 도메인의 서열은 돌연변이 또는 DNA 셔플링(shuffling)에 의해 변형됨을 특징으로 하는 리간드
  19. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 변이가능 구역은 비-공유결합으로 결합됨을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  20. 제 1항 내지 제18항의 어느 한 항에 있어서, 상기 변이가능 구역은 공유결합으로 결합됨을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  21. 제 20항에 있어서, 상기 공유결합은 2황화물 결합에 의해 매개됨을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  22. 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd) 및 5 ×10-1 내지 1 ×10-7s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFα로부터 해리되는, TNFα에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  23. 제 22항에 있어서, 상기 dAb는 Vκ임을 특징으로 하는 TNFα에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  24. 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd) 및 5 ×10-1 내지 1 ×10-7s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNF 수용체 1로부터 해리되는, TNF 수용체 1(p55)에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  25. 제 22항 내지 제 24항에 있어서, 상기 단량체는 500 nM 내지 50 pM의 ND50로 표준 세포 에세이 내에서 인간 TNFα 또는 TNF 수용체 1을 중화시킴을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드
  26. dAb는 ≤100 nM의 ND50로 표준 세포 에세이 내에서 TNF 수용체 1의 활성에 길항작용하고, ≤10 μM의 농도에서 dAb는 에세이 내에서 ≤5%까지 TNF 수용체 1의 활성을 방해하는 TNF 수용체(p55)에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  27. 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 1 nM 내지 500 μM의 해리 상수(Kd)로 혈청 알부민(SA)으로부터 해리되는 혈청 알부민에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  28. 제 27항에 있어서, 상기 단량체는 1 nM 내지 500 μM의 IC50으로 표준 리간드 결합 에세이 내에서 SA에 결합함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드
  29. dAb가 TAR1-5의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 TNFα에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  30. dAb가 TAR1-5의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 TNFα에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  31. dAb가 TAR1-27의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 TNFα에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  32. dAb가 TAR2-10의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 TNF 수용체 1에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  33. dAb가 TAR2-10의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 90% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 TNF 수용체 1에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  34. dAb가 TAR2-5의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 TNF 수용체 1에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  35. dAb가 TAR2-5의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 90% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 TNF 수용체 1에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  36. dAb가 MSA-16의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 SA에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  37. dAb가 MSA-26의 아미노산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 SA에 특이적인 dAb 단량체 리간드
  38. 제 29항 내지 제 37항의 어느 한 항에 있어서, 상기 TNFα, TNF 수용체 1 또는 SA는 인간 형태임을 특징으로 하는 dAb 단량체
  39. 말단 Cys 잔기를 더욱 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체
  40. 제 29항 내지 제 38항의 어느 한 항에 있어서, 말단 Cys 잔기를 더욱 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체
  41. 제 22항 내지 제 40항의 어느 한 항에 따른 적어도 하나 이상의 dAb 단량체를 포함한 이중-특이적 리간드
  42. 제 41항에 있어서, 이량체임을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  43. 제 42항에 있어서, 상기 이량체는 제 22항, 제 23항 및 제 28항 내지 제 30항의 어느 한 항에 따른 항-인간 TNF 알파 dAb 및 제 26항, 제27항 및 제 28항 내지 제30항의 어느 한 항에 따른 항-SA dAb를 포함함을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  44. 제 42항에 있어서, 상기 이량체는 첫 번째 및 두 번째 항-인간 TNF 알파 dAb를 포함한 상동- 또는 이형-이량체이고, 각각의 dAb는 제 22항, 제 23항 및 제 28항 내지 제 30항의 어느 한 항에 따른 것임을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  45. 제 41항에 있어서, 삼량체임을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  46. 제 45항에 있어서, 제 22항, 제 23항 및 제 29항 내지 제 31항의 어느 한 항에 따른 항-인간 TNF 알파 dAb의 3개 카피를 포함한 상동삼량체임을 특징으로 하는 이중-특이적 리간드
  47. 상기 어느 한 항에 있어서, 보편적 프레임워크를 포함함을 특징으로 하는 리간드
  48. 제 47항에 있어서, 상기 보편적 프레임워크는 DP47, DP45 및 DP38로 구성된 군으로부터 선택된 VH 프레임워크를 포함하고; 및/또는 VL 프레임워크는 DPK9임을 특징으로 하는 리간드
  49. 상기 어느 한 항에 있어서, 일반 리간드에 대한 결합 사이트를 포함한 리간드
  50. 제 49항에 있어서, 상기 일반 리간드 결합 사이트는 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 리간드
  51. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열 또는 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상기 상응하는 프레임워크의 아미노산 서열에 비해 5개까지의 아미노산 차이를 집합적으로 포함한 하나 이상의 상기 프레임워크 구역의 아미노산 서열을 포함한 하나 이상의 프레임워크 구역을 지닌 변이가능 도메인을 포함함을 특징으로 하는 리간드
  52. 제 1항 내지 제 51항에 있어서, 상기 리간드는 변이가능 도메인을 포함하고, 상기 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열과 동일하거나 상기 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 상기 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열에 비해 10개까지의 아미노산 차이를 집합적으로 포함함을 특징으로 하는 리간드
  53. 제 51항 또는 제 52항에 있어서, 상기 리간드는 FW1, FW2 및 FW3 구역을 포함한 항체 변이가능 도메인을 포함하고, 상기 FW1, FW2 및 FW3의 아미노산 서열은 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열과 동일함을 특징으로 하는 리간드
  54. 제 51항 내지 제 53항이 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트는 DP47, DP45, DP48 및 DPK9로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 리간드
  55. 상기 어느 한 항에 있어서, 카멜리드(Camelid) 면역글로불린 변이가능 도메인이 아닌 VH 도메인을 포함함을 특징으로 하는 리간드
  56. 제 55항에 있어서, 인간 VH 도메인과 비교시 카멜리드 면역글로불린 변이가능 도메인에 특이적인 하나 이상의 아미노산을 포함하지 않은 VH 도메인을 포함함을 특징으로 하는 리간드
  57. (a) 첫 번째 에피토프에 결합하는 능력에 의해 첫 번째 변이가능 도메인을 선택하는 단계;
    (b) 두 번째 에피토프에 결합하는 능력에 의해 두 번째 변이가능 도메인을 선택하는 단계;
    (c) 변이가능 구역을 결합하는 단계; 및
    (d) 상기 변이가능 도메인이 상보적인 경우 상기 도메인은 HSA에 특이적인 VH 도메인이 아님을 특징인; 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프에 결합하는 능력에 의해 리간드를 선택하는 단계로 구성된:
    첫 번째 결합 특이성을 지닌 첫 번째 면역글로불린 단일 변이가능 도메인 및 두 번째 결합 특이성을 지닌 두 번째 단일 면역글로불린 단일 변이가능 도메인을 포함하고, 결합 특이성의 하나 또는 둘 모두는 생체 내에서 리간드의 반감기를 증가시키는 단백질에 특이적임을 특징으로 하는 리간드의 제조 방법
  58. 제 57항에 있어서, 상기 첫 번째 변이가능 도메인은 상보성 변이가능 도메인의 부재시 상기 첫 번째 에피토프로의 결합에 대해 선택됨을 특징으로 하는 방법
  59. 제 57항에 있어서, 상기 첫 번째 변이가능 도메인은 상기 세 번째 변이가능 도메인이 상기 두 번째 변이가능 도메인과 다른 세 번째 상보성 변이가능 도메인의 존재시 상기 첫 번째 에피토프로의 결합에 대해 선택됨을 특징으로 하는 방법
  60. 제 1항 내지 제 56항의 어느 한 항에 따른 이중-특이적 리간드를 인코드하는 핵산
  61. 제 60항에 있어서, TAR1-5-19의 핵산 서열 또는 그에 적어도 70% 이상 상동적인 서열을 포함한 TNFα에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  62. 제 60항에 있어서, TAR1-5의 핵산 서열 또는 그에 적어도 70% 이상 상동적인 서열을 포함한 TNFα에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  63. 제 60항에 있어서, TAR1-27의 핵산 서열 또는 그에 적어도 70% 이상 상동적인 서열을 포함한 TNFα에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  64. 제 60항에 있어서, TAR2-10의 핵산 서열 또는 그에 적어도 70% 이상 상동적인 서열을 포함한 TNF 수용체 1에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  65. 제 60항에 있어서, TAR2-10의 핵산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함한 TNF 수용체 1에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  66. 제 60항에 있어서, TAR2h-5의 핵산 서열 또는 그에 적어도 70% 이상 상동적인 서열을 포함한 TNF 수용체 1에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  67. 제 60항에 있어서, TAR2h-5의 핵산 서열 또는 그에 적어도 80% 이상 상동적인 서열을 포함한 TNF 수용체 1에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  68. 제 60항에 있어서, MSA-16의 핵산 서열 또는 그에 적어도 70% 이상 상동적인 서열을 포함한 SA에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  69. 제 60항에 있어서, MSA-26의 핵산 서열 또는 그에 적어도 70% 이상 상동적인 서열을 포함한 SA에 특이적임을 특징으로 하는 핵산
  70. 제 60항 내지 제 69항의 어느 한 항에 따른 핵산을 포함한 벡터
  71. 제 70항에 있어서, 이중-특이적 리간드의 발현에 필요한 구성성분을 더욱 포함함을 특징으로 하는 벡터
  72. 제 71항에 따른 벡터로 트랜스펙트된 숙주 세포
  73. (a) 첫 번째 에피토프에 결합하는 능력에 의해 첫 번째 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계;
    (b) 두 번째 에피토프에 결합하는 능력에 의해 두 번째 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계;
    (c) 도메인이 폐쇄 형태가 되도록 에피토프 결합 도메인을 결합하는 단계; 및
    (d) 상기 첫 번째 에피토프 및 상기 두 번째 에피토프에 결합하나 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프에 동시에 결합하지 않는 능력에 의해 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 선택하는 단계로 구성된:
    첫 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 첫 번째 단일 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함한 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드의 제조 방법에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁할 수 있어서 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드가 에피토프 둘 모두에 동시에 결합하지 않음을 특징으로 하는 제조 방법
  74. 제 73항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 변이가능 헤비 체인 도메인(VH)임을 특징으로 하는 방법
  75. 제 73항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 변이가능 라이트 체인 도메인(VL)임을 특징으로 하는 방법
  76. 제 73항 내지 제 75항의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 도메인은 상기 에피토프에 대해 지시된 면역글로불린으로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  77. 제 73항 내지 제 76항의 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프는 개별적 항원 상에 존재함을 특징으로 하는 방법
  78. 제 73항 내지 제 76항의 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 에피토프는 동일한 항원 상에 존재함을 특징으로 하는 방법
  79. 제 73항 내지 제 78항의 어느 한 항에 있어서, 상기 변이가능 도메인은 단일 항체 도메인 레퍼토리로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  80. 제 79항에 있어서, 상기 레퍼토리는 섬질의 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이되고, 상기 단일 항체 도메인은 박테리오파지 레퍼토리의 항원으로의 결합에 의해 선택됨을 특징으로 하는 방법
  81. 제 73항 내지 제 80항의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 면역글로불린 변이가능 도메인의 서열은 돌연변이 또는 DNA 셔플링에 의해 변형됨을 특징으로 하는 방법
  82. 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 지닌 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함한 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인은 에피토프 결합에 대해 경쟁할 수 있어서 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드가 둘 모두의 에피토프에 동시에 결합할 수 없음을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  83. 제 82항에 있어서, 제 73항 내지 제 80항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능함을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  84. 제 82항 또는 제 83항에 있어서, 항체의 하나 이상의 헤비 체인 변이가능 도메인 또는 항체이 하나 이상의 라이트 체인 변이가능 도메인을 포함함을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  85. 제 84항에 있어서, 상기 VH 및 VL은 펩타이드 링커에 의해 결합됨을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  86. 제 84항에 있어서, 상기 VH 및 VL은 항체 Fab-유사 구역에 의해 제공됨을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  87. 제 82항 내지 제 84항의 어느 한 항에 있어서, 상기 변이가능 구역은 비-공유결합으로 결합됨을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  88. 제 82항 내지 제 84항의 어느 한 항에 있어서, 상기 변이가능 구역은 공유결합으로 결합됨을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  89. 제 87항에 있어서, 상기 공유결합은 2황화물 결합에 의해 매개됨을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  90. 제 82항 내지 제 89항의 어느 한 항에 있어서, 보편적 프레임워크를 포함함을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  91. 제 82항 내지 제 90항의 어느 한 항에 있어서, 일반적 리간드에 대한 결합 사이트를 포함함을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  92. 제 91항에 있어서, 상기 일반적 리간드 결합 사이트는 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  93. 제 82항 내지 제 92항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열와 동일한 아미노산 서열 또는 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상기 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열에 비해 5개까지의 아미노산 차이를 집합적으로 포함한 하나 이상의 상기 프레임워크 구역의 아미노산 서열을 포함한 하나 이상의 프레임워크 구역을 지닌 변이가능 도메인을 포함함을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  94. 제 93항에 있어서, 상기 리간드는 변이가능 도메인을 포함하고, 상기 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열과 동일하거나 상기 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열에 비해 10개까지의 아미노사 차이를 집합적으로 포함함을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  95. 제 93항 또는 제 94항에 있어서, 상기 FW1, FW2 및 FW3 구역을 포함한 항체 변이가능 도메인을 포함하고, 상기 FW1, FW2 및 FW3의 아미노산 서열은 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트에 의해 인코드된 상응하는 프레임워크 구역의 아미노산 서열과 동일함을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  96. 제 92항 내지 제 95항의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 생식세포계 항체 유전자 세그먼트는 DP47, DP45, DP48 및 DPK9로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  97. 제 92항 내지 제 96의 어느 한 항에 있어서, 카멜리드 면역글로불린 변이가능 도메인이 아닌 VH 도메인을 포함함을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  98. 제 97항에 있어서, 상기 VH 도메인은 인간 VH 도메인과 비교시 카멜리드 면역글로불린 변이가능 도메인에 특이적인 하나 이상의 아미노산을 포함하지 않음을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  99. 제 82항 내지 제 98항의 어느 한 항에 있어서, 그의 하나의 특이성은 리간드의 반감기를 증가시키는데 효과적인 작용제에 대한 것임을 특징으로 하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드
  100. 제 82항 내지 제 99항의 어느 한 항에 따른 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드르 포함한 키트
  101. 제 82항 내지 제 99항의 어느 한 항에 따른 적어도 하나 이상의 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 인코드하는 핵산
  102. 제 101항에 따른 핵산을 포함한 벡터
  103. 제 102항에 있어서, 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드의 발현에 필요한 구성성분을 더욱 포함함을 특징으로 하는 벡터
  104. 제 103항에 따른 벡터로 트랜스펙트된 숙주 세포
  105. (a) 리간드가 타겟 분자 및 작용제에 특이적이고, 리간드에 의해 결합된 작용제는 리간드로부터의 이동시 검출가능한 신호의 생성을 유발함을 특징으로 하는, 작용제에 결합된 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 제공하고;
    (b) 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 타겟 분자에 노출시키고;
    (c) 작용제의 이동 결과로서 생성된 신호를 검출하는 것을 포함한
    타겟 분자 존재의 검출 방법
  106. 제 105항에 있어서, 상기 작용제는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드에 의해 결합시 불활성인 효소임을 특징으로 하는 방법
  107. 제 105항에 있어서, 상기 작용제는 효소에 대한 기질임을 특징으로 하는 방법
  108. 제 107항에 있어서, 상기 작용제는 리간드에 의해 결합시 불활성화되거나 억제되는 형광성, 발광성 또는 색원성 분자임을 특징으로 하는 방법
  109. 타겟 분자에 결합할 수 있는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드 및 선택적으로는 적당한 작용제 및 완충액을 포함한 제 105항 내지 제 108항의 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트
  110. 제 105항 내지 제 108항의 어느 한 항에 따른 방법을 도입시키는 상동성 면역에세이
  111. 치료에 사용되기 위한 제 1항 내지 제 56항의 어느 한 항에 따른 리간드
  112. 제 1항 내지 제 56항에 따른 리간드 및 약제적으로 수용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함한 약제적 조성물
  113. (a) 타겟 상의 첫 번째 에피토프에 특이적인 단일 결합 도메인을 인코드하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 제공하는 단계;
    (b) 에피토프가 첫 번째 에피토프와 동일하거나 다르고, 두 번째 에피토프는 상기 첫 번째 에피토프에 인접함을 특징으로 하는, 상기 타겟 상의 두 번째 에피토프에 특이적인 두 번째 결합 도메인을 포함한 레퍼토리를 인코드하는 벡터를 제공하는 단계;
    (c) 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인을 발현하는 단계; 및
    (d) 함께 결합하여 타겟-결합 이량체를 생성하는 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인의 결합을 분리하는 단계로 구성된:
    킬레이팅 다중 결합 리간드의 제조 방법
  114. 제 113항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인은 링커를 통해 공유결합으로 결합됨을 특징으로 하는 방법
  115. 제 113항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인은 비-공유결합으로 결합됨을 특징으로 하는 방법
  116. 제 113항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 도메인은 도메인의 자연적 결합을 통해 결합됨을 특징으로 하는 방법
  117. 제 116항에 있어서, 상기 결합 도메인은 VH 도메인 및 Vκ 도메인을 포함함을 특징으로 하는 방법
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