KR20050016340A - 씨티엘에이-４ 항체를 사용한 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 CTLA-4에 대한 인간 서열 항체를 사용한 치료 방법을 제공하며, 특히 암의 치료 방법을 제공한다.

Description

씨티엘에이-４ 항체를 사용한 치료 방법{METHODS OF TREATMENT USING CTLA-４ ANTIBODIES}

본 출원은 35 U.S.C. 119(e)조 하에서 2002년 4월 12일자로 출원된 미국 가특허출원 제 60/372,284호 및 2002년 5월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 제 60/381,274호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 일반적으로 분자 면역 및 인간 질환의 치료에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 CTLA-4에 대한 항체를 사용한 신규한 치료 방법에 관한 것이다.

척추동물의 면역계는 최적의 면역 활성화를 달성하기 위하여 다수의 신호가 필요하다{예를 들어, 문헌(Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1989;54:1-14; Paul William E., ed. Raven Press, N.Y., Fundamental Immunology, 4th edition(1998)), 특히 12 및 13장, 411 내지 478면을 참조}. T 림프구(T 세포) 및 항원 표시 세포(APC) 간의 상호작용은 면역 반응에 필수적이다. 면역 반응동안 T 세포 및 APC 상에서 발견된 많은 응집 분자의 수준이 증가한다(Springer et al., A.Rev. Immunol. 1987;5:223-252; Shaw and Shimuzu, Current Opinion in Immunology, 1988 Eds. Kindt and Long, 1:92-97; 및 Hemler, Immunology Today 1988;9:109-113). 이들 분자의 증가된 수준은, 활성화된 APC가 휴지 APC보다 항원-특이적 T 세포 증식을 자극함에 있어서 보다 효과적인 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있다(Kaiuchi et al., J. Immunol. 1983;131:109-114; Kreiger et al., J. Immunol. 1985;135:1937-2945); Mckenzie, J. Immunol. 1988;141:2907-2911; 및 Hawrylowicz and Unanue, J. Immunol. 1988;141:4083-4088).

T 세포 면역 반응은, 세포-세포 상호작용, 특히 T 및 APC와 같은 부속(accessory) 세포 간의 세포-세포 상호작용(Springer et al., A. Rev. Immunol. 1987;223-252) 및 가용성 면역 매개자(시토킨 또는 림포킨)의 생산(Dinarello, New Engl. J. Med 1987;317:940-945; Sallusto, J.Exp. Med. 1997;179:1109-1118)을 포함하는 복잡한 과정이다. 이 반응은 T-세포 수용체 착체(Weiss, Ann. Rev. Immunol. 1986;4:593-619) 및 다른 "부속" 표면 분자(Allison, Curr. Opin. Immunol.1994;6:414-419; Springer, 1987, 상기됨)를 포함하는 몇가지 T-세포 표면 수용체에 의해 조절된다. 많은 이들 부속 분자는, 세포의 표면 상의 모노클로날 항체의 반응성으로 정의되는 자연 발생 세포 표면 분화(CD) 항원이다(McMichael, Ed., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y., 1987).

T 헬퍼 세포(Th) 항원 반응은 APC에 의해 제공된 신호가 필요하다. 최초 신호는, T 세포 수용체 착체(Weiss, J. Clin. Invest. 1990, 86:1015)와 APC 상의 클래스 II 주요 조직적합성 착체(MHC) 분자 부분에 제시된 항원(Allen, Immunol. Today 1987;8:270)과의 상호작용에 의해 개시된다. 이 항원-특이적 신호는 완전한 반응을 일으키기에는 충분하지 못하고, 이차 신호의 부재시에 실질적으로 클론의 불활성화(clonal inactivation) 또는 면역성 결여(anergy)를 일으킬 수 있다(Schwartz, Science 1990;248:1349). 다수의 실험 시스템에서, MHC에 의해 제공된 이차 "공동자극" 신호의 요건이 증명되었다(Schwartz, 상기됨; Weaver and Unanue, Immunol. Today 1990;11:49). 이 이차 신호의 분자 특성은, 인터류킨(IL)-1(Weaver and Unanue, 상기됨) 및 세포간 부착과 관련있는 막 수용체(Springer, Nature 1990; 346:425)와 같은 두 가용성 분자가 모두 공동자극 신호를 제공할 수 있는 몇몇 경우에 있어 명백하지만, 완전히 이해되지 않는다.

CD28 항원, 면역글로불린 상과(superfamily)의 동종이량체 당단백질(Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 1987;84:8573-8577)은 대부분의 성숙한 인간 T 세포에서 발견된 부속 분자이다(Damle et al., J. Immunol. 1983;131:2296-2300). 현재까지의 증거에 따르면, T-세포 수용체 착체에 의해 개시된 선택적인 T 세포 활성화 경로에서 이 분자가 작용하는 것으로 제시된다(June et al., Mol. Cell. Biol. 1987;7:4472-4481). CD28 항원과 반응성인 모노클로날 항체(MAbs)는 다양한 폴리클로날 자극에 의해 개시되는 T 세포 반응을 증가시킬 수 있다(June et al. 검토, 상기됨). 이러한 자극 효과는 증가된 mRNA 안정화의 결과(Lindsten et al., 1989, 상기됨)로서 MAb-유도된 시토킨의 생산에 기인할 수 있다(Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci 1989;86:1333-1337; 및 Lindsten et al., Science 1989; 244:339-343). 항-CD28 mAbs는 저해 효과도 가질 수 있다, 즉 이들은 자가유래의 혼합된 림프구 반응(Damle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1981;78:5096-6001) 및 항원-특이적 T 세포 클론의 활성화(Lesslauer et al., Eur. Immunol. 1986;16:1289-1296)를 차단할 수 있다.

CTLA-4는 원래 쥐의 세포용해 T 세포 cDNA 라이브러리의 분별 스크리닝에 의해 확인되었던 T 세포 표면 분자이다(Brunet et al., Nature 328:267-270(1987)). CTLA-4는 또한 면역글로불린(Ig) 상과에 속한다; CTLA-4는 단일 세포외 Ig 도메인을 포함한다. 세포독성 활성을 갖는 T 세포 집단에서 CTLA-4 전사가 발견되었으며, 이를 통해 CTLA-4가 세포용해 반응에서 작용할 수 있는 것으로 제시되었다(Brunet et al., 상기됨; Brunet et al., Immunol. Rev. 103-36(1988)). 연구자들은 CD28(Lafage-Rochitaloff et al., Immunogenetics 31:198-201(1990))과 동일한 염색체 영역(2q33-34)에 CTLA-4의 인간 대조물(counterpart)의 유전자(Dariavach et al., Eur.J. Immunol. 18:1901-1905(1988))를 클로닝 및 매핑(mapping)하였음을 보고하였다. 이 인간 CTLA-4 DNA 및 암호화 CD 28 단백질 간의 서열 비교를 통해, 서열의 상동성이 크며, 가까이 있는 막(juxtamembrane) 및 세포질 영역에서 상동성이 가장 크다는 것이 밝혀졌다(Brunet et al., 1988, 상기됨; Dariavach et al., 1988, 상기됨).

CTLA-4는 CD28 활성을 저지하고 T 세포 활성화를 막는 것으로 믿어졌다(Krummel, J. Exp. Med. 1995;182:459-465; Krummel et al., Int'l Immunol. 1996;8:519-523; Chambers et al., Immunity. 1997;7:885-895). CTLA-4 결핍 마우스는 광범성(massive) 림프증식이 일어난다(Chambers et al., 상기됨). CTLA-4 차단은 시험관내(Walunas et al., Immunity. 1994;1:405-413) 및 생체내(Kearney, J. Immunol. 1995;155:1032-1036) T 세포 반응을 증가시키고, 항암 면역성을 악화시키고(Leach, Science 1996;271:1734-1736), 유도된 자가면역 질환을 증진시키는 것으로(Luhder, J Exp. Med. 1998;187:427-432) 보고되었다. CTLA-4는 T 세포 면역 반응의 최초 특징에 대하여 선택적이거나 추가적인 효과(impact)를 갖는 것으로 또한 보고되었다(Chambers, Curr. Opin. Immunol. 1997;9:396-404; Bluestone, J. Immunol. 1997; 158:1989-1993; Thompson, Immunity 1997;7:445-450). 이는 몇몇 자가면역 환자가 CTLA-4에 대한 자가항체를 갖는다는 관찰결과와 일치한다. CTLA-4 차단 자가항체는 이들 환자에게 병원체 역할을 할 수 있다(Matsui, J. Immunol. 1999;162:4328-4335).

상기 논의된 다양한 연구에서 비-인간 CTLA-4 항체가 사용되었다. 또한, 인간 CTLA-4에 대한 인간 항체는 바이러스 및 박테리아 감염의 치료 또는 예방과 같은 다수의 질환 상태에서와 암을 치료하기 위하여 면역자극 조절자로서 기재되어 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 01/14424 및 PCT 공개 WO 00/37504). 미국 특허 제 5,855,887호는, T 세포를 CTLA-4 차단제와 결합시킴으로써 포유동물의 T 세포의 항원 자극에 대한 반응을 증가시키는 방법을 개시한다. 미국 특허 제 5,811,097호는 CTLA-4 차단제를 투여함으로써 비-T 세포 종양의 성장을 감소시키는 방법을 개시한다. 미국 특허출원 제 09/644,668호 및 09/948,939호는 인간 CTLA-4 항체를 개시하며, 본 명세서의 참조문헌으로 포함되어 있다.

명세서의 이 섹션 또는 다른 부분에서 임의의 참조문헌을 인용 및 논의하는 것은, 본 발명의 상세한 설명을 명확히 하기 위한 것일 뿐이며, 임의의 이러한 참조문헌이 본 명세서에 기재된 임의의 발명에 대한 "종래 기술"임을 자인하는 것은 아니다.

도 1은 흑색종 백신 및 항-TLA-4 항체 10D1으로 치료된 동물에서의 흑색종-특이적 항체 반응을 나타낸다. 처리된 동물로부터의 풀(pooled) 혈장 시료의 항체 반응성을 플로우 사이토메트리로 측정하였다.

도 2는 영장류의 만성 투여 동안의 항-CTLA-4 항체 10D1의 약물동력학 프로파일을 나타낸다. 항체는 0, 28, 56, 84 및 140일에 투여하였고, 10D1 의 투여 농도는 ELISA로 분석하였다. 치료된 여섯마리 동물의 평균+/- SEM을 나타낸다.

도 3은 0일에 단일 투여량의 10D1으로 치료한 전립선암 환자의 항-CTLA-4 항체 10D1의 약물동력학 프로파일을 나타낸다. 혈장 농도(㎍/㎖)를 나타낸다. 14명의 치료 환자의 평균+/- SEM을 나타낸다.

도 4는 0일에 항-CTLA4 항체의 주입 후 여러 시점에서의 두명의 인간 환자의 전립선 특이적 항원(PSA) 수준을 ng/㎖으로 나타낸다.

본 발명은 항-CDLA 4 항체를 사용하여 이차 또는 기억 면역 반응을 촉진시키거나 상승시키는 방법을 제공한다. 항-CTLA-4 항체는, 병원체로부터의 보호 항원, 예를 들어 암 항원 또는 감염성 병원체로부터의 항원에 대해 이미 면역된 대상에게 보호 면역성의 크기를 증가시키는 능력이 증명된다. 이러한 종래의 면역화는 예를 들어 절제된 종양의 암 세포에 대해 자연 노출시킨 결과로서, 또는 감염성 병원체를 사용한 소산(resolved) 또는 억제(suppressed) 감염으로 가능하다. 이러한 노출의 증거에 대하여, 즉 병원체의 보호 항원에 대한 면역성에 대하여 이러한 환자를 시험할 수 있다. 선택적으로, 환자를 병원체에 대해 예방접종할 수 있으며, 이러한 경우에 면역성을 기대하거나 시험할 수 있다.

일실시형태에서, 본 발명의 CTLA4 항체는, 환자가 이전에 암 백신을 접종받았거나 종양에 대한 자연 보호 면역성 수준이 다소 증명되는 경우에, 악성종양의 치료에 사용할 수 있다. 항체는 단일 약제로 사용되거나, 하나 이상의 다른 약제, 예를 들어 화학요법, 방사선 요법, 시토킨, 케모킨 및 다른 생물학적 신호 분자, 종양 특이적 백신, 자가유래 및 동종이계 줄기 세포 레스큐(rescue)(예를 들어 이식물 대 종양 효과를 증가시키기 위하여), 다른 치료 항체, 분자 표적화 요법, 항-맥관형성성 요법, 치료의 의도를 갖는 감염성 약제(종양 국부화 박테리아 등) 및 유전자 요법와 조합하여 사용될 수 있다. 항체는 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 항체는 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 요법으로, 단독으로 또는 상기된 요법과 함께 사용될 수 있다.

항-CTLA4 항체를 사용한 치료는, 암 백신으로 치료한 환자에게 이미-존재하는(pre-existing) 기억 반응을 활성화하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 항-CTLA4 항체로 추가 치료하기 위하여 백신-치료한 환자를 선택할 수 있으며, 이를 통해 면역 반응을 추가로 유도하거나 증진시킬 수 있다.

일실시형태에서, 항체는 암 항원이며, 환자는 이전에 항-암 백신으로 치료되었다. 암 항원은 예를 들어 흑색종 항원 또는 전립선 암 항원이 될 수 있다. 다른 실시형태에서 항원은 바이러스 항원이고, 환자는 이전에 바이러스 백신으로 치료되었다. 바이러스 항원은 예를 들어 간염 항원이 될 수 있다. 일실시형태에서, 환자는 인간이다. 바람직한 실시형태에서, 항-CTLA4 항체는 인간 항-CTLA4 항체이다. 본 발명의 바람직한 인간 항-CTLA4 항체는 10D1이지만, 본 발명의 방법은 임의의 인간 CTLA-4 항체와 사용가능하다. 다른 실시형태에서, 항-CTLA4 항체는 키메라 또는 인간화(예를 들어 CDR-이식된) 항-CTLA4 항체와 같은 재조합 항체이다.

본 발명의 항체는, 박테리아, 마이코박테리아, 스피로큐트, 진균류, 바이러스, 기생 유기체, 및 프리온을 포함하는 병원성 유기체에 의한 병원체 감염의 조절에 사용할 수도 있다. 항체는 단일 약제로 사용하거나, 하나 이상의 다른 약제, 예를 들어 항생제, 백신, 항체, 시토킨, 수용체 저해제 및 독성 차단제와 조합하여 사용할 수 있다. 항체는 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여할 수 있다.

이차 또는 기억 면역 반응을 자극하기 위하여 디자인된 본 발명의 치료 방법은 특히, 질환 합병증의 위험이 클 수 있는 면역 억제(suppressed) 환자의 치료에 적절할 수 있다. 이러한 면역 억제 환자의 예로는, HIV를 포함하는 레트로바이러스 감염 환자, 선천적, 유전적, 자가면역 또는 약제학적으로-유도된 면역 결핍 환자(당뇨 및 노인 환자 포함), 및 상처, 외상 또는 심각한 화상 환자가 포함된다.

항-CTLA4 항체를 투여함으로써 면역 반응을 자극하는 본 발명의 방법은 항원(예를 들어, 노출 환자가 이전에 이 병원체에 대해 예방접종 받았던, 탄저병 또는 천연두와 같은 생물테러제(bioterrorism agent))에 대한 급성 노출 경우에, 또는 부스터(booster) 예방접종의 대신에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 항-CTLA4를 사용하여 자가면역 등의 비-특이적 T 세포 활성화와 같은 해로운 부작용 없이 연장된 기간동안 환자가 치료될 수 있다는 것을 증명한다.

항-CTLA4의 혈장 농도는 검출가능한 수준보다 높게 1, 2, 3, 4 또는 5개월 이상, 원하지 않는 면역학적 결과 없이 유지될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 항-CTLA4 항체의 혈장 농도가 1, 2, 3, 4 또는 5개월 이상 검출가능한 수준보다 높게 유지되도록 환자에게 항-CTLA4 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에게 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 방법을 제공한다. 일실시형태에서, 혈장 농도가 1, 2, 3, 4 또는 5개월 이상 검출가능한 수준보다 높게 유지되도록 항-CTLA4 항체를 여러번 투여한다. 다른 실시형태에서, 환자의 항-CTLA4 항체의 혈장 농도가 1, 2, 3, 4 또는 5개월 이상 2㎍/㎖ 이상이 되는 양 및 간격으로 항-CTLA4 항체를 투여한다. 다른 실시형태에서, 환자의 항-CTLA4 항체의 혈장 농도가 1, 2, 3, 4 또는 5개월 이상 5㎍/㎖ 이상이 되는 양 및 간격으로 항-CTLA4 항체를 투여한다. 다른 실시형태에서, 환자의 항-CTLA4 항체의 혈장 농도가 1, 2, 3, 4 또는 5개월 이상 10㎍/㎖ 이상이 되는 양 및 간격으로 항-CTLA4 항체를 투여한다. 바람직한 실시형태에서, 항-CTLA4 항체로 연장된 기간동안 치료된 환자는 흑색종 또는 전립선암과 같은 악성종양에 걸린다. 다른 바람직한 실시형태에서, 환자는 항-CTLA4 항체로 치료하는 것에 추가하여 백신으로 치료되었거나 치료된다.

본 발명의 다른 측면은, 세포독성제에 결합된 항-CTLA4를 사용하는 방법과 관련있다. 세포독성제의 예로는 세포독성 약물(예를 들어, 독시루비신, 칼리케마이신 등) 및 방사성 동이원소가 포함된다. 세포독성제에 결합된 항-CTLA-4 항체는 CTLA4⁺ 세포를 고갈시키기 위하여 사용될 수 있다. 고갈시킬 수 있는 CTLA4⁺ 세포의 예로는 CTLA4⁺ 악성종양 및 T 세포 매개 자가면역 질환의 항원-특이적 활성화된 T-세포 발현 CTLA4가 포함된다. 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은, T 세포 악성종양에 대해 환자가 치료되도록 환자에게 세포독성제에 결합된 항-CTLA4 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, CTLA4⁺ 악성종양에 대하여 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, T 세포 매개 자가면역 질환에 대해 환자가 치료되도록 환자에게 세포독성제에 결합된 항-CTLA4 항체를 투여하는 것을 포함하는, T 세포 매개 자가면역 질환에 대해 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항-CTLA-4 항체는 WO 01/14424에 기재된 바와 같은 인간 모노클로날 항체 10D1이다.

본 명세서에 인용된 모든 공개문헌, 도면, 유전자은행 등록 참조물(GenBank Accession references)(서열), ATCC 기탁물, 특허 및 특허출원은 이로써 모든 목적을 위해, 각각 개별적으로 표시된 것과 동일한 범위로 참조문헌으로 포함된다.

본 발명은 이차 또는 기억 면역 반응을 촉진 또는 상승시키기 위한, 및 보다 효과적인 암치료를 위한 신규한 CTLA-4 항체-계 방법을 제공한다. 또한, 항-CTLA-4 항체의 바람직한 혈장 농도가 개시된다. 본 발명의 방법은 암, 감염 및 다른 질환의 치료 방법 또는 면역 반응에 반응성인 상태를 제공한다.

본 발명은 부분적으로, 하기된 바와 같은, 암의 면역요법에서 인간 서열 항-CTLA-4 항체의 임상 시험동안 만들어진 관찰 결과에 기초한다. 시험은, 이전에 종양 항원에 노출된 대상의 치료에 항-CTLA 항체의 유효성을 증명한다. 또한, 단일 또는 다중 투여 후 항-CTLA-4 항체가 검출가능한 혈장 수준으로 지속되는 것을 보여준다.

A. 이전에 암 백신으로 예방접종한 환자에 대한 임상 시험

진전된 흑색종 또는 진전된 난소암인 9명의 환자를 3mg/kg의 CTLA-4 모노클로날 항체 10D1(Medarex)를 투여하는 연구에 참여시켰다. 환자들은 면역요법(세 환자는 α-인터페론을 투여, 한 환자는 QS-21과 혼합된 GM2 강글리오사이드를 투여), 수술(네 환자), 방사선(두 환자), 화학요법(세 환자) 및 프로테아솜 저해제(한 환자)를 포함하는 초기 단계 흑색종 치료를 이전에 받았다. 두명의 난소암 환자는 다중 화학요법을 받았다. 또한, 모든 환자는 상 I 백신 연구에 참여하였다. 세명의 흑색종 및 두명의 난소암 환자를 GM-CSF를 분비하도록 유전자조작된 자가유래 세포로 면역화하였다. 이들 환자 중 한명에는 MUC-1 백신도 투여하였다. gp100 및 MART-1을 발현하도록 유전자조작된 자가유래 모수석상 세포로 세명의 흑색종 환자를 면역화하였다. 한명의 흑색종 환자를 gp100 펩티드 및 높은 투여량의 IL-2로 예방접종하였다.

이전에 GM-CSF 분비 종양 세포로 예방접종받았던 세명의 흑색종 환자는 10D1으로 치료 후 강한 종양 괴사가 나타났다. 세 환자 모두로부터의 조직병리학 절제된 조직은, 종양 근처에 림프구 및 과립구 침윤을 갖는 심하게 손상된 종양 혈관을 보여주었다. 한명의 환자는 10D1으로 치료한 3개월 후 종격 괴(mass)가 완전히 절제되었다. 이전에 멜라노솜 항원으로 예방접종한 네명의 환자는 종양 근처에 림프구 침윤이 나타났으나 종양 괴사는 없었다. 난소암 환자는 절제 또는 생검을 받지 않았으나, 10D1 치료 후에 두 환자는 모두 CA-125(난소암에 대한 종양 표지) 혈액 수준에 유리한 변화가 나타났다.

B. 종양 항원에 대한 자연 노출을 통한 환자의 시험

단계 IV 흑색종의 환자 14명 에게, 한번 이상의 치료 사이클로 두 gp100 펩티드를 사용한 예방접종과 함께 항-CTLA-4 항체 10D1을 투여하였다. 모든 환자는 일차 종양에 대하여 이전에 수술을 받았다. 여섯명의 환자는 이전에 화학요법을 받았다. 일곱명의 환자는 이전에 면역요법을 받았다. 컴퓨터 축 단층촬영(computed axial tomography)(CT) 및 자기 공명(MR) 이미지화를 통해 임상 반응을 측정하였다. 이전에 수술 및 화학요법을 받은 한 환자는 5번의 치료 사이클 후 폐, 뇌 및 피하 종양이 완전히 소산되었다. 두명의 다른 환자는 부분적으로 반응하였다. 두명의 환자는 병소 중 일부가 줄어드는 반면 다른 일부는 크기가 증가하였으므로, "혼합되어(mixed)" 비-반응하였다. 조직 생검을 실시하지 않았으므로, 혼합되어 비-반응한 환자의 병소가 확대된 것은 암에 기인한 것이 아니었을 수 있다. 예를 들어, 한 환자(환자 3)는 예를 들어 몇몇 폐 병소가 소산되었으나 종격 림프절이 확대되었다. 폐로부터의 림프관은 종격 림프절로 배액되며(drain)(Schwartz, et al., Principles of Surgery,1984, 4th ed., p. 661); 림프절의 배액 유역(basin) 내 조직의 염증의 결과로 림프절이 확대될 수 있다. 환자 3은 암 때문이 아니라 염증 때문에 확대된 림프절을 갖는 완전히 반응한 환자였다.

상기 논의된 결과에 기초하여, 본 발명은 항-CTLA-4 항체의 다수의 유리한 용도를 제공한다. 이러항 항체는 이차 또는 기억 면역 자극을 제공하며, 이는 이전에 면역화 또는 노출된 암 환자에게서 증명된 바와 같다. 따라서, 항-CTLA-4 항체는 부스터로 사용할 수 있으며, 이는 특히 면역타협 환자에게 유용하다. 면역계 억제는 다수의 원인에 의해 발생할 수 있으며, 질병(HIV와 같은 면역결핍 질환 포함), 노화, 암의 존재량 증가, 암 치료(예를 들어 화학요법 및 방사선조사)와 다른 원인이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 항-CTLA-4 항체 요법은 면역타협 대상에게 면역성을 부스트(boost)하도록 지시된다.

C. CTLA-4 항체 및 흑색종 백신을 사용한 원숭이의 시험

사이노몰거스 원숭이를 흑색종 백신 단독 또는 흑색종 백신 및 항-CTLA-4 항체 10D1 중 하나로 0, 28, 56, 84 및 140일에 치료하였다. 항-CTLA-4 항체를 백신과 조합하여 사용하면, 백신을 단독으로 사용하는 것보다 흑색종 세포에 대해 훨씬 더 큰 항체 반응이 얻어졌다. 또한, T 세포 증식 연구를 통해, 항-CTLA-4 항체 및 백신으로 치료하면 CD8⁺ 및 CD4⁺ 세포의 항원-특이적 증식이 일어나는 것으로 증명되었다. 항-CTLlA-4 항체의 혈장 수준은 160일의 전체 기간동안 검출가능한 수준보다 높게 유지되었다. 평균 혈장 농도는 6개월 연구하는 동안 20㎍/㎖보다 높게 유지되었다.

이 연구를 통해, 영장류에서 항-CTLA-4 항체를 만성투여해도 안전하며, 검출가능한 혈장 수준이 6개월보다 오래 유지될 수 있는 것으로 나타났다.

D. 항-CTLA-4 항체를 사용한 진전된 흑색종 환자의 시험

진전된 흑색종 환자 17명에게 단일 투여량의 항-CDLA-4 항체 10D1를 3mg/kg 정맥내 투여하였다. 9명의 환자는 이전에 면역요법을 받았고, 6명은 이전에 방사선요법을 받았으며, 다섯명은 이전에 화학요법을 받았다. 항-CTLA-4 항체의 혈장 수준은 4개월까지 검출가능하게 유지되었다. 두명의 환자는 부분적으로 반응하였으며, 세개의 연조직괴의 소산(resolution) 및 이전에 예방접종된 환자의 50%를 초과하는 폐 괴의 감소가 포함되었다.

이 연구를 통해, 혈장 수준은 항-CTLA-4 항체의 단일 투여 후 인간 환자에게 4개월까지 검출가능한 수준보다 높게 유지될 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 이전에 예방접종된 환자에게서 폐 괴가 감소하는 것을 통해, CTLA-4 항체가 이미-존재하는 종양에 대한 기억 반응을 활성화시킬 수 있다는 것이 증명되었다.

E. 항-CTLA-4 항체를 사용한 진전된 전립선 암 환자의 시험

진전된 전립선 암에 걸린 환자 14명에게 단일 투여량의 인간 모노클로날 항-CTLA-4 항체 10D1을 3.0mg/kg 정맥내 투여하였다. 항-CTLA-4 항체의 혈장 수준은 4개월까지 존재하였다. 전립선 특이 항원(PSA) 감소 및 증후 경감이 주목되었다. 가역성있는 발진 및 가려움증을 제외하고는, 면역 역효과는 없었다.

본 발명의 이러한 장점 및 다른 장점은 이하에서 및 실시예에서 보다 상세히 설명한다.

특별히 언급될 때를 제외하고는, "환자" 또는 "대상" 이라는 용어는 호환가능하게 사용되며, 인간 환자 및 비-인간 영장류와 같은 포유동물과, 래빗, 래트 및 마우스와 같은 실험 동물, 및 다른 동물을 나타낸다. 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류와 같은 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다.

"치료"라는 용어는, 증후를 경감시키거나, 질환, 상태 또는 질병(예를 들어 자가면역 질환)이 더 진전되는 것을 저해하거나 정지시키면서, 질환의 증후, 합병증 또는 생화학적 증후가 개시되는 것을 막거나 지연시키기 위하여, 본 발명의 화합물 또는 약제를 투여하는 것을 포함한다. 치료는, 예방적(질환의 개시를 막거나 지연시키기 위하여, 또는 임상적 또는 부임상적(subclinical) 증후의 발현을 막기 위하여) 또는 치료적 억제 또는 질환이 발현된 후 증후의 경감이 될 수 있다.

"진전된 암"이라는 용어는, 더이상 일차 암 부위에 국부화되지 않는 암, 즉 AJCC(American Joint Committee on Cancer)에 따른 단계 III 또는 IV인 암을 의미한다.

일반적으로, "우수하게 면역관용된"이라는 용어는 치료의 결과로 발생하며 치료 결정에 영향을 주는 건강 상태의 불리한 변화가 없다는 것을 의미한다.

"림프구"라는 용어는 본 명세서에서 이 기술분야에서 일반적인 의미를 가지며, 혈액, 림프 및 림포이드 조직, 즉 B 및 T 림프구에서 발견된 임의의 단핵, 비식균성 백혈구를 나타낸다.

"T 림프구의 아집단(subpopulations)" 또는 "T 세포 서브세트(들)"는, 특정 세포 표면 표지의 발현에 의해 특징지워지는 T 림프구 또는 T 세포를 나타낸다{문헌(Barclay, A.N. et al.(eds.), 1997, The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd, edition, Academic Press, London, United Kindom)을 참조}. T 세포를 참조하여 "안정한"이라는 용어는, 약제의 투여 과정 또는 기간에 걸쳐 T 세포 서브세트의 빈도 또는 퍼센트가 변화되지 않는다는 사실을 나타낸다.

"세포독성 T 림프구-관련 항원-4", "CTLA-4", "CTLA4", "CTLA-4 항원" 및 "CD152"와 같은 용어{예를 들어 문헌(Murata(1999) Am.J. Phthol. 155:453-460) 참조}는 호환가능하게 사용되며, 변이체, 아이소형태, 인간 CTLA-4의 종 상동체, 및 CTLA-4와 하나 이상의 공통 에피토프를 갖는 상동체를 포함한다{예를 들어 문헌(Balzano(1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:28-32) 참조}. CTLA-4의 완전한 서열은 유전자은행(GenBank) 등록 번호 L15006에서 찾는다.

"에피토프"라는 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기(determinant)를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그루핑(grouping)으로 구성되며, 일반적으로 특이적 삼차원 구조의 특성과 특이적 전하 특성을 가진다. 배좌 및 비배좌 에피토프는, 변성 용매의 존재 하에서 비배좌 에피토프가 아닌 배좌 에프토프에 대한 결합이 손실된다는 점에서 구별된다.

손상되지 않은 "항체"는, 디설파이드 결합으로 내부-결합된 적어도 두개의 중쇄(H) 및 두개의 경쇄(L)를 포함하여 이루어진다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 또한, 골격 영역(FR)이라고 하는 보다 더 보존되는 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)이라 하는 초가변성 영역으로 나뉠 수 있다. 각각의 VH 및 VL은, 아이소-말단으로부터 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 카르복실-말단까지 배열되어 있는 세개의 CDRs 및 네개의 FRs로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은, 면역계의 다양한 세포(예를 들어 효과기 세포) 및 고전적인 보체 계의 일차 성분(Clq)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체라는 용어는, CTLA-4와 결합하는 능력을 갖는 손상되지 않은 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 결합의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fab 단편, 일가 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술파이드 브릿지에 의해 결합된 두개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2 단편, 이가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 암호화된다 하더라도, 이들을 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자{단일쇄 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어 문헌(Bird et al.(1988) Science 242:423-426; 및 문헌(Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)을 참조)}를 형성하는 단일 단백질 쇄로 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 이들은 재조합 방법으로 결합될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 "항체"라는 용어에 참조적으로 포함된다. 단편은 재조합 기술 또는 손상되지 않은 항체의 효소적 또는 화학적 분해를 통해 제조할 수 있다.

"인간 서열 항체"라는 용어는 (존재한다면) 인간의 생식세포 계열(germ line) 면역글로불린 서열에서 유래하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 서열 항체는 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 유도되는 돌연변이 또는 생체내 체성 돌연변이)를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 비-인간 형질전환 동물에서, 즉 PCT 공개 WO 01/14424 및 WO 00/37504에 개시된 바와 같이 만들어질 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 "인간 서열 항체"라는 용어는, 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포 계열에서 유래하는 CDR 서열이 인간 골격 서열에 이식된 항체(즉, 인간화된 항체)를 포함하도록 의도되지 않는다.

"모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 구성물"이라는 용어는 단일 분자 구성의 항체 분자 제조물을 나타낸다. 모노클로날 항체 구성물은 특정 에피토프에 대한 친화도 및 단일 결합 특이성을 나타낸다. 따라서, "인간 모노클로날 항체"라는 용어는 (존재한다면) 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에서 유래하는 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성의 항체를 나타낸다. 일실시형태에서, 인간 모노클로날 항체는, 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 형질전환 및 경쇄 형질전환을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비-인간 동물, 예를 들어 형질전환 마우스에서 얻은 B 세포를 유도하는 하이브리도마에 의해 생산된다.

"폴리클로날 항체"라는 용어는 인간 CTLA-4에 대해 하나 이상(둘 이상) 다른 항체 제조물을 나타낸다. 이러한 제조물은 다른 에피토프 부류에 결합하는 항체를 포함한다.

CTLA-4 항체는 인간 CTLA-4 상의 에피토프에 결합하여 CTLA-4가 인간 B7 대수용체(counterreceptor)와 상호작용하는 것을 막을 수 있다. 인간 CTLA-4와 인간 B7과의 상호작용은 인간 CTLA-4 수용체를 갖는 T-세포를 불활성화시키는 신호를 형질도입하므로, 상호작용의 길항작용은 인간 CTLA-4 수용체를 갖는 T-세포의 활성화를 효과적으로 유도하거나 증가시키거나 연장시켜, 면역 반응을 증가시키거나 연장시킨다. 바람직한 항-CTLA-4 항체는 예를 들어 미국 특허 제 5,811,097호, 5,855,887호; 6,051,227호; PCT 공개 WO 01/14424 및 WO 00/37504; 및 미국 공개 2002/0039581 A1에 기재되어 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 이들 항체 및 다른 항체는 본 기술분야에 주지되고 및/또는 여기에 인용된 참조문헌에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 사용된 항-CTLA-4 항체는 "인간 항체"-즉 인간으로부터 분리된 항체이거나, "인간 서열 항체"(앞서 정의됨)이다. 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 01/14424에는 인간 서열 항-CTLA-4 항체를 인간 항체 유전자로 변형시킨 형질전환 마우스로부터 분리하는 방법이 기재되어 있다. 따라서, 이러한 항체는, 비-인간 동물로부터 분리된다 할지라도, 인간 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열(불변 및 가변 도메인 서열 포함)을 갖는다. 이하 실시예에서 사용되는 특히 바람직한 항체를 본 명세서에서 항체 10D1으로 나타낸다. 이 인간 서열 항체는 이전에 기재되었으며, 예를 들어 WO 01/14424에 완전히 특징지워져 있다.

"면역 세포 반응"이라는 용어는, 면역 세포 이동, 표적 세포의 사멸, 식균작용, 항체의 생산, 면역 반응의 다른 가용성 효과기 등의 원인이 되는, 면역 세포에서 생화학적 변화를 일으키는 외부 또는 내부 자극(예를 들어, 항원, 시토킨, 케모킨 및 다른 세포)에 대한 면역계 세포의 반응을 나타낸다.

"T 림프구 반응" 및 "T 림프구 활성"이라는 용어는 본 명세서에서 T 림프구에 의존성인 면역 반응의 성분(즉, 림프구의 헬퍼, 세포독성 킬러 또는 서프레서 T 림프구로의 증식 및/또는 분화, 항체 생산을 일으키거나 막는 B 림프구로의 헬퍼 T 림프구에 의한 신호의 공급, 세포독성 T 림프구에 의한 특이적 표적 세포의 사멸, 및 다른 면역 세포의 기능을 조절하는 시토킨과 같은 가용성 인자의 방출)을 나타내기 위하여 호환가능하게 사용된다.

"면역 반응"이라는 용어는, 병원체, 암 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직으로 감염된 침입 병원체, 세포 또는 조직을 인체로부터 제거하거나, 이를 파괴하거나, 또는 이에 대한 선택적 손상을 일으키는 림프구, 항원 제시 세포, 식균 세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(항체, 시토킨 및 보체 포함)의 일치된 작용(concerted action)을 나타낸다.

면역 반응의 성분은 시험관내에서 당업자에게 주지된 다양한 방법으로 검출될 수 있다. 예를 들어, (1) 세포독성 T 림프구는 방사성 표지된 표적 세포와 배양시켜, 방사능 방출에 의해 이들 표적 세포의 용균을 검출할 수 있고, (2) 헬퍼 T 림프구를 항원 및 항원 제시 세포와 함께 배양시켜, 표준 방법으로 시토킨의 합성 및 분비를 측정할 수 있고(Windhagen A; et al., Immunity 2(4):373-80), (3) 항원 제시 세포를 전체 단백질 항원과 함께 배양시켜, 이 항원이 MHC 상에서 제시되는 것을 T 림프구 활성화 어세이 또는 생물 물리학적 방법으로 검출할 수 있고(Harding et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86:4230-4), (4) 비만 세포를 이의 Fc-엡실론 수용체와 가교결합하는 시약과 배양시켜, 효소 면역어세이로 히스티딘 방출을 측정할 수 있다(Siraganian, et al., 1983, TIPS 4:432-437).

유사하게, 모델 유기체(예를 들어 마우스) 또는 인간 환자에서의 면역 반응 생성물을 또한 당업자에게 주지된 다양한 방법으로 검출할 수 있다. 예를 들어, (1) 백신에 반응하는 항체의 생성물을 임상 실험실에서 현재 사용되는 표준 방법, 예를 들어 ELISA로 쉽게 검출할 수 있고, (2) 면역 세포의 염증 부위로의 이동은 피부 표면을 스크래칭하고 무균 용기를 위치시켜 스크래치 부위 상으로의 이동 세포를 포획하고(Peters et al., 1988, Blood 72:1310-5); (3) 미토젠 또는 혼합된 림프구 반응에 반응하여 말초 혈액 단핵 세포가 증식하는 것은 ³H-티미딘을 사용하여 측정할 수 있고; (4) 과립구, 마크로파지, 및 다른 식균 세포의 PBMCs에서의 식균 능력은 표지된 입자와 함께 웰 안에 PMBCs를 위치시켜 측정할 수 있고(Peters et al., 1988); (5) 면역계 세포의 분화는 CD4 및 CD8과 같은 CD 분자에 대한 항체를 사용하여 PBMCs를 표지하고, 이들 표지를 발현시키는 PBMCs의 분획을 측정함으로써 측정할 수 있다.

편의상, 본발명에서 면역 반응을 "일차" 또는 "이차" 면역 반응으로 기재하는 경우가 많다. "보호" 면역 반응이라고도 기재하는 일차 면역 반응은, 특정 항원에 대한 어떤 최초 노출(예를 들어, 최초의 "면역화")의 결과로 개체에서 일어나는 면역 반응을 나타낸다. 이러한 면역화는 예를 들어 항원에 대한 어떤 자연 노출의 결과로서(예를 들어, 항원을 나타내거나 제시하는 어떤 병원체에 의한 최초 감염으로부터), 또는 개체 내 어떤 종양(예를 들어 절제된 종양)의 암 세포에 의해 제시되는 항원으로부터 일어날 수 있다. 선택적으로, 면역화는 항원을 함유하는 백신으로 개체를 예방접종한 결과로서 일어날 수 있다. 예를 들어, 백신은 특정 병원체에 대한 백신(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 또는 기생충에 대한 백신)이 될 수 있거나, 암 세포로부터의 하나 이상의 항원을 포함하여 이루어지는 암 백신이 될 수 있다.

일차 면역 반응은 시간 경과에 따라 약화 또는 감소될 수 있으며, 사라지게 되거나 적어도 너무 감소되어 검출이 불가능할수도 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에서 "기억 면역 반응"으로도 기재한 "이차" 면역 반응에 대한 것이다. 이차 면역 반응이라는 용어는, 이미 일차 면역 반응된 후에 개체에서 유도되는 면역 반응을 나타낸다. 따라서, 예를 들어 약화 또는 감소된 기존 면역 반응을 증진시키거나, 사라지거나 더 이상 검출 불가능한 이전의 면역 반응을 다시 일으키기 위하여 이차 또는 면역 반응을 유도할 수 있다. 이차 면역 반응을 유도하기 위하여 투여가능한 약제는, 일차 면역 반응을 "부스트"하기 위하여 언급될 수 있으므로, 이후에 "부스터"로 나타낸다.

제한하기 위한 것이 아니라 실시예로서, 일차 면역 반응을 유도한 항원을 개체에 재-도입함으로써(예를 들어, 백신을 재투여함으로써) 이차 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 항원에 대한 이차 면역 반응은 실제 항원을 포함할 수 없는 다른 약제를 투여함으로써 유도될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명은 항-CTLA-4 항체를 개체에게 투여함으로써 이차 면역 반응을 강화시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 실제 항원은 항-CTLA-4 항체와 함께 반드시 투여될 필요가 없고, 항-CTLA-4 항체를 포함하는 구성물은 항원을 반드시 포함할 필요가 없다. 이차 또는 기억 면역 반응은 체액성(항체) 반응 또는 세포 반응이 될 수 있다. 항원의 일차 제시에서 생산된 기억 B 세포의 자극시에 이차 또는 기억 체액성 반응이 일어난다. 지연형 과민증(delayed type hypersensitivity)(DTH) 반응은 CD4⁺ 세포에 의해 매개되는 세포 이차 또는 기억 면역 반응의 한 형태이다. 항원에 대한 일차 노출은 면역계를 준비시키고(prime), 추가적인 노출(들)은 DTH를 일으킨다.

본 명세서에서 사용된 "세포 표면 수용체"라는 용어는 신호를 수용하고 세포의 원형질막을 가로질러 이러한 신호를 전달할 수 있는 분자 또는 분자 복합체를 포함한다. 본 발명의 "세포 표면 수용체"의 예로는 CTLA-4의 B7 리간드 또는 T 세포 수용체(TCR)가 있다.

"비특이적 T 세포 활성화"라는 용어는 이의 항원 특이성에 비의존적인 T 세포의 자극을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 "효과기 세포"라는 용어는, 면역 반응의 인식 및 활성화 상(phase)에 반대되는, 면역 반응의 효과기 상과 관련있는 면역 세포를 나타낸다. 예시적인 면역 세포는 골수 또는 림프 유래의 세포, 예를 들어 림프구(예를 들어 B 세포 및 세포 용해성 T 세포(CTLs)를 포함하는 T 세포), 킬러 세포, 자연 킬러 세포, 마크로파지, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만세포, 및 호염기구를 포함한다. 효과기 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현하며 특이적 면역 기능을 수행한다. 효과기 세포는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있으며, 예를 들어 ADCC를 유도할 수 있는 호중구가 있다. 예를 들어, FcαR을 발현하는 단핵구, 마크로파지, 호중구, 호산구 및 림프구는, 표적 세포의 특이적 사멸, 면역계의 다른 성분에 대한 항원의 제시, 또는 항원을 제시하는 세포에 대한 결합과 관련이 있다. 효과기 세포는 또한 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물에 식균작용할 수도 있다.

"표적 세포"는, 구성물(예를 들어 본 발명의 인간 서열 항체 또는 인간 모노클로날 항체, 본 발명의 이특이적 또는 다특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는 대상(예를 들어 인간 또는 동물) 중의 임의의 바람직하지 않은 세포를 의미할 것이다. 표적 세포는 세포 발현 또는 과발현 인간 CTLA-4가 될 수 있다. 세포 발현 인간 CTLA-4는 종양세포, 예를 들어 림프종을 포함할 수 있다.

변형된 항체도 본 발명에 포함된다. "변형된 항체"라는 용어는, 예를 들어 항체의 제거, 첨가 또는 치환부에 의해 변형된 모노클로날 항체, 키메라 항체, 및 인간화된 항체와 같은 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체는 불변 영역을 제거하고 이를 반감기(예를 들어 혈청 반감기), 항체의 안정성 또는 친화도를 증가시키기 위한 불변 영역으로 치환함으로써 변형될 수 있다.

본 발명의 항체 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키거나 생물학적 반응을 일으키기 위하여(예를 들어 효과기 세포를 보강하기 위하여) 사용될 수 있다. 약물 잔부는 고전적인 화학적 치료제에 제한되는 것으로 파악되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 잔부는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드가 될 수 있다. 이러한 단백질에는 예를 들어 아브린(abrin), 리신 A, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 또는 디프테리아 독소와 같은 효소적 활성의 독소, 또는 이의 활성 단편; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-알파와 같은 단백질; 또는 예를 들어 림포킨, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자와 같은 생물학적 반응 변형체(modifiers)가 포함된다.

이러한 치료적 잔부를 항체에 접합시키는 기술은 주지되어 있으며, 예를 들어 문헌(Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson et al.(eds.), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84:Biologicla And Clinical Applications, Pinchera et al.(eds.), pp.475-506(1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.(eds.), pp.303-16(Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58(1982))을 참조한다.

암 치료

항체에 의한 CTLA-4의 차단은, 환자의 암 세포에 대한 기억 또는 이차 면역 반응을 증진시킬 수 있다. CTLA-4 에 대한 항체는, 암세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드, 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극 시토킨 및 B7과 같은 세포 표면 항원을 암호화하는 유전자로 트랜스펙션된 세포와 같은 면역원성제와 결합시키거나{예를 들어 문헌(Hurwitz, A. et al.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 198;95:10067-10071) 참조}, 단독으로 사용하여 면역성을 자극할 수 있다.

CTLA-4 차단은 예방접종 프로토콜을 따르는 경우에 효과적이다. 종양에 대해 예방접종하기 위한 많은 실험적 방법이 발명되었다{예를 들어 문헌(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring:60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book SPring:414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring:730-738) 참조; 또한 문헌(Restifo, N. and Sznol, M., Cancer VAccines, Ch.61, pp.3023-3043 in DeVita, V. et al.(eds.), 1997, Cancer: Pronciples and Practice of Oncology, Fifth Edition)도 참조}. 이들 방법 중 하나에서, 백신은 자가유래 또는 동종이계 종양 세포를 사용하여 제조한다. 이들 세포 백신은, 종양 세포가 GM-CSF를 발현하도록 형질도입되는 경우에 가장 효과적인 것으로 나타났다. GM-CSF는 종양 예방접종을 위한 항원 제시의 강력한 활성자(activator)인 것으로 나타났다(Dranoff et al. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 1993;90:3539-43).

GMCSF-변형된 종양 세포 백신을 부스트하기 위한 항-CTLA-4 차단은, 유방 암종(Hurwitz et al., 1998, 상기됨), 일차 전립선암(Hurwitz et al., Cancer Research 2000, 60:2444-8) 및 흑색종(van Elsas et al. J. Exp. Med. 1999, 190:355-66)과 같은 다수의 실험적 종양 모델에서 백신의 효능을 개선한다. 이러한 경우에, B16 흑색종과 같은 비-면역원성 종양은 면역계에 의해 파괴되기 쉽게 만들어졌다. 종양 세포 백신은 또한 IL2와 같은 다른 면역 활성자 및 그중에서도 특히 공동자극 분자를 발현하기 위하여 변형될 수 있다.

다양한 종양에서의 유전자 발현 및 대규모 유전자 발현 패턴의 연구를 통해 소위 "종양 특이적 항원"이 정의되었다(Rosenberg, Immunity 1999;10:281-7). 많은 경우, 이들 종양 특이적 항원은, 종양에서 및 종양이 발생하는 세포에서 발현된 분화 항원, 예를 들어 멜라닌세포 항원 gp100, MAGE 항원, Trp-2이다. 보다 중요하게는, 많은 이들 항원은 숙주 내에서 발견된 종양 특이적 T 세포의 표적인 것으로 나타낼 수 있다. CTLA-4 차단은, 종양에서 발현되는 것으로 밝혀진 단백질 및/또는 펩티드의 재조합 버전에 기초한 백신과 함께 부스팅제로 사용되어, 이들 단백질에 대한 이차 또는 기억 면역 반응을 상승시킬 수 있다. 이들 단백질을 일반적으로 면역계에 의해 자가 항원으로 보여지며, 따라서 이들에 대해 면역관용이다. 종양 항원은 또한, 염색체의 텔로메어(telomeres)의 합성에 필요하며 제한된 수의 체성 조직에서만 인간 암의 85%보다 많이 발현되는 단백질 텔로머라제(telomerase)를 포함할 수 있다(Kim et al., Science 1994;266:2011-2013). 이들 체성 조직은 다양한 방법으로 면역 공격으로부터 보호될 수 있다. 종양 항원은 또한, 단백질 서열을 바꾸거나 관련없는 두 서열 간의 융합 단백질(즉, 필라델피아 염색체의 bcr-abl)을 만드는 체성 돌연변이 때문에 암 세포에서 발현된 "신생-항원(neo-antigens)", 또는 B 세포 종양으로부터의 이디오타입일 수 있다. 다른 종양 백신은, 인체 유두종 바이러스(HPV), 간염 바이러스(HBV 및 HCV) 및 카포시 허피스 육종 바이러스(KHSV)와 같은 인간 암과 관련있는 바이러스로부터의 단백질을 포함할 수 있다. CTLA-4 차단과 함께 사용할 수 있는 다른 형태의 종양 특이적 항원은 종양 조직 자체로부터 분리한, 정제된 열 쇼크 단백질(HSP)이다. 이들 열 쇼크 단백질은 종양 세포로부터의 단백질 단편을 포함하며, 이들 HSPs는 종양 면역성을 유도하기 위해 항원 제시 세포에 전달하기에 매우 효과적이다(Suot and Srivastava, Science 1995; 269:1585-1588; Tamura et al., Science 1997, 278:117-120).

모수석 세포(DC)는 항원-특이적 반응을 준비하기 위하여 사용가능한 강력한 항원 제시 세포이다. DC's는 생체외에서 생산될 수 있으며, 다양한 단백질 및 펩티드 항원과 종양 세포 추출물을 로딩할 수 있다(Nestle et al., Nature Medicine 1998;4:328-332). DCs는 이들 종양 항원을 또한 발현시키기 위하여 유전적인 방법으로 형질도입될 수 있다. DCs는 또한 면역화할 목적으로 종양 세포에 직접 융합되었다(Kugler et al., Nature Medicine 2000; 6:332-336). 예방접종의 방법으로서, 보다 강력한 항-종양 반응을 활성화시키기 위해 CTLA-4 차단을 사용하여 DC 면역화를 효과적으로 부스트할 수 있다.

CTLA-4 차단과 조합할 수 있는 다른 형태의 흑색종 백신은, MELACINE 백신과 같은 면역학적 아쥬반트와 함께 흑색종 세포주 세포용해물, 두가지 인간 흑색종 세포주로부터의 세포용해물+DETOX^TM 면역학적 아쥬반트의 혼합물로부터 제조된 백신이다. 백신 치료는, 추가적인 화학요법 치료와 함께 또는 추가적인 화학요법 치료 없이, 항-CTLA4 로 부스트될 수 있다.

CTLA-4 차단은 또한 표준 암 치료를 통해 유도된 면역성을 부스트하기 위하여 사용될 수 있다. 이 경우에, 투여된 화학요법 시약의 투여량을 감소시킬 수 있다(Mokyr et al., Cancer Reserch, 1998;58:5301-5304). CTLA-4 차단과 화학요법을 조합하여 사용하는 것에 대한 과학적 원리는, 대부분의 화학요법 화합물의 세포독성 작용 의 결과인 세포 사망으로 인해 항원 제시 경로에서 종양 항원의 수준이 증가해야 한다는 것이다. 따라서, CTLA-4는 종양 세포의 화학요법 방출로 준비된 면역 반응을 부스트할 수 있다. 또한, CTLA-4의 면역자극 활성은 화학요법의 면역억제작용을 극복하기 위하여 사용된다. 항-CTLA-4 치료가 함께 조합될 수 있는 화학요법제의 예로는 알데스류킨, 알트레타민, 아미포스틴, 아스파라기나제, 블레오마이신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클라드리빈, 시사프라이드, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(DTIC), 닥트노마이신, 도세탁셀, 독소루비신, 드로나비놀, 에포에틴 알파, 에토포사이드, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루로우라실, 젬시타빈, 그라니세트론, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 인터페론 알파, 이리노테칸, 란소프라졸, 레바미솔, 류코보린, 메제스트롤, 메스나, 메토트렉세이트, 메토클로프라미드, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 오메프라졸, 온단세트론, 파실리탁셀(Taxol), 필로카르핀, 프로클로로페라진, 리툭시맵, 타목시펜, 탁솔,토포테칸 하이드로클로라이드, 트라스튜주맵(tastuzumab), 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈 타르테이트가 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 전립선 암을 치료하기 위해 항-CTLA-4가 함께 조합될 수 있는 바람직한 화학요법제는 파실리탁셀(Taxol)이다. 흑색종 암 치료를 위해 항-CTLA-4가 함께 조합될 수 있는 바람직한 화학요법제는 다카르바진(DTIC)이다.

세포 사망을 통해 준비하는 면역계를 얻을 수 있는 다른 조합 요법은 방사선조사, 수술 및 호르몬 박탈(deprivation)이 있다(Kwon, E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 1999;96(26):15074-9). 이들 프로토콜은 각각 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성한다. 예를 들어, 수술 시에 종양을 임의로 조작하여 혈액 내 암 세포 수를 크게 증가시킬 수 있다(Schwartz, et al., Principles of Usrgery 1984. 4th ed. p. 338). 맥관형성 저해제를 CTLA-4 차단과 조합할 수도 있다. 맥관성형을 저해하면, 종양 항원을 숙주 항원 제시 경로에 공급할 수 있는 종양 세포 사망이 일어난다. 이들은 모두 종양 방출, 및 CTLA-4 차단을 부스트하는 것을 준비하는 가능한 면역계를 일으킨다.

감염 질환

본 발명의 다른 방법을 사용하여 특정 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료한다. 상기된 종양에 대한 이의 적용과 유사하게, 항체 매개된 CTLA-4 차단을 단독으로 사용하거나, 또는 아쥬반트로서 백신과 조합하여 사용하여, 병원체, 독소 및 자가-항원에 대한 이차 또는 기억 면역 반응을 자극할 수 있다. CTLA-4 차단은 니포스트론글리루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)(McCoy, K. et al.(1997) 186(2); 183-187) 및 레이스마니아 도노바니(Leishmania donovani)(Murphy, M. et al.(1998) J. Immunol. 161:4153-4160)의 급성 상의 감염에 효과적인 것으로 나타났다. 이 치료적 접근법이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예로는, 현재 효과적인 백신이 없는 병원체, 또는 통상적인 백신이 완전히 효과적이지는 못한 병원체가 포함된다. 이들에는 HIV, 간염(A, B 및 C), 인플루엔자, 허피스, 지아르디아, 말라리아, 리슈마니아, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)가 포함되며 이에 제한되지 않는다. CTLA-4 차단은, 감염의 과정에 걸쳐 변경된 항원을 제시하는 HIV와 같은 것(agent)을 사용하여 확립된 감염에 대해 면역성을 부스팅함에 있어 특히 유용하다. 이러한 신규한 에피토프는 항-인간 CTLA-4 투여시에 외래물질로 인식되어, CTLA-4 를 통한 음성 신호에 의해 약화되지 않는 강한 T 세포 반응을 일으킨다.

본 발명의 방법에 의해 치료가능한 감염을 일으키는 병원성 바이러스의 몇가지 예로는, 간염(A,B 또는 C), 허피스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II 및CMV, 엡스테인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인프루엔자 바이러스, 프라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키바이러스, 코르노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 몰루스컴(molluscum) 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스가 포함된다.

본 발명의 방법으로 치료가능한 감염을 일으키는 병원성 박테리아의 몇가지 예로는, 클라미디아, 리케차 박테리아, 미코박테리아, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 뉴모노코커스, 수막염균 및 코노코커스, 크렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독증, 탄저, 역병, 렙토스피라병 및 라임병 박테리아가 포함된다.

본 발명의 방법으로 치료가능한 감염을 일으키는 병원성 진균류의 몇가지 예로는, 칸디다(Candida)(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스페르질러스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 니저(niger) 등), 제누스 무코랄레스(Genus Mucorales), (무코르(Mucor), 아브시디아(Absidia), 리조퍼스(Rhizophus)), 스포로트릭스 스켄키(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라코시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코키디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라즈마 캡슐라텀(Histoplasma capsulatum)이 포함된다.

본 발명의 방법으로 치료가능한 감염을 일으키는 병원성 기생충의 몇가지 예로는, 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 나에글레리아 파울레리(Naegleria fowleri), 아칸트아메바 종(Acanthamoeba sp.), 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움 종(Cryptosporodium sp.), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라즈모디윰 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 마이크로티(Babesia microti), 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트립파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 레이스마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondi), 닙포스트론길러스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)가 포함된다.

유리한 "자가면역" 반응의 촉진

자가면역 반응을 일으키고 증폭하는 항-CTLA-4 항체의 능력이 다수의 실험적인 시스템에서 보고되었다{EAE-실험적인 자가면역 뇌척수염, MS에 대해서는 쥐 모델(Perrin et al., J Immunol1996; 157:1333-1336); 당뇨병(Luhder et al., 1998, 상기됨)}. 실제, 종양 세포 및 펩티드 백신을 사용한 항-종양 반응의 유도를 통해, 많은 항-종양 반응이 항-자가 반응성과 관련있는 것으로 나타난다{항-CTLA-4 + GM-CSF 변형된 B16 흑색종에서 관찰되는 탈색소(van Elsas et al. 상기됨); Trp-2 예방접종된 마우스의 탈색소(Overwijk et al., Proc. Natl. Cad. Sci. U.S.A. 1999 96:2982-2987); TRAMP 종양 세포 백신, 흑색종 펩티드 항원 예방접종에 의한 자가면역 전립선염(Hurwitz 2000, 상기됨) 및 인간 임상 시험에서 관찰되는 백반(Rosenberg and White, J Immunother Emphasis Tumor Immunol 1996;19:81-4)}.

따라서, 질환 치료를 위해 이들 자가-단백질에 대한 면역 반응을 효과적으로 일으키기 위한 예방접종 프로토콜을 발명하기 위하여, 다양한 자가-단백질과 함께 항-CTLA-4의 부스팅의 사용을 고려할 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머 질환은 뇌의 아밀로이드 침착의 Aβ 펩티드의 부적절한 축척을 포함하고; 아밀로이드에 대한 항체 반응은 이들 아밀로이드 축척을 명확하게 할 수 있다(Schenk et al., Nature 1999; 400:173-177).

알러지 및 천식을 치료하기 위한 IgE 및 류마티즘성 관절염을 위한 TNF와 같은다른 자가-단백질이 또한 표적으로 사용될 수 있다. 마지막으로, 항-CTLA-4 항체를 사용하여 다양한 호르몬에 대한 항체 반응을 유도할 수 있다. 피임을 위해 생식 호르몬에 대한 중화 항체 반응을 사용할 수 있다. 호르몬 및 특정 종양의 성장에 필요한 다른 가용성 인자에 대한 중화 항체 반응이 또한 가능한 예방접종 표적으로 고려될 수 있다.

알츠하이머 질환의 Aβ를 포함하는 아밀로이드 축척과 같은 다른 자가-항원, TNFα와 같은 시토킨, 및 IgE의 부적절한 축척을 갖는 환자를 치료하기 위한 치료적인 자가면역 반응을 유도하기 위하여, 항-CTLA-4 항체의 사용에 대해 상기된 바와 유사한 방법을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 하기 실시예를 통해 설명한다. 그러나, 명세서에 이들 또는 다른 실시예를 사용하는 것은 단지 설명을 위한 것으로, 본 발명 또는 어떤 예시된 용어의 범위 및 의미를 제한하고자 하는 것이 아니다. 유사하게, 본 발명은 여기 기재된 어떤 특정한 바람직한 실시형태로만 제한되지 않는다. 실제, 본 발명의 다양한 변경 및 변형은, 본 명세서를 읽은 당업자에게 명백할 수 있으며, 이의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 가능하다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 특허청구범위와 특허청구범위에 상응하는 내용의 전 범위에 의해서만 제한될 것이다.

실시예 1-: -항-CTLA-4 치료는 시노몰거스 원숭이의 흑색종 세포 백신에 대한 이차 항체 및 T 세포 반응을 증진시킨다.

본 발명의 인간 항-CTLA-4 항체의 흑색종 세포 백신에 대한 항체 및 T 세포 반응을 증진시키는 방법을 시노몰거스 원숭이(Primate Products, Miami, Florida에서 얻음)에게 실험하였다. 여섯마리 원숭이의 시험 그룹(세마리는 숫놈, 세마리는 암놈)을 각각, 1) 흑색종 세포 백신 단독(SK-mel-3, GM-CSF를 발현하도록 트랜스펙션된 인간의 흑색종 종양 세포주) 또는 2) SK-mel-3 및 WO 01/14424에 기재된 항-CTLA-4 항체 10D1 모두로 처리하였다. 세포 백신이 인간 유래였음에도 불구하고, 전체 세포 백신으로 이 동물 모델에서 다양한 정상 조직에 대한 자가면역 반응을 관찰할 수 있었다.

이 백신을 제조하기 위하여, SK-mel 세포를 융합(confluency) 성장시켜 채집하였다. 세포를 미토마이신 C로 처리하고, 수회 세척하고, 염수에 1×10⁷/㎖로 재현탁하였다. 항체를 1.3㎖/kg에 10mg/kg의 투여용량으로 정맥내 투여하였다. SK-mel-3 세포를 고정된 양(0.5㎖/동물에서 5×10⁶ 세포/동물)으로 피하 투여하였다. 48시간 후에 내독소(<2EU/㎖) 및 GM-CSF 생산(10⁶ 세포 당 2-8ng/㎖)에 대해 각 백신 제제를 시험하였다. 적절한 항체 및/또는 백신을 0, 28, 56, 84 및 140일에 투여하였다. 멜라노마 세포 백신에 대한 항체 반응을 13, 41, 69 및 97일에 플로우 사이토메트리를 사용하여 평가하였다. 원숭이의 건강 상태는 주마다 두번 평가하고, 체중은 매주 기록하였다. 연구 개시 전과 연구 중에 주기적으로 혈액학, 약물동력학적 분석 및 기능 어세이를 실시하였다. 167일에 완전한 거시적 및 미시적 병리 시험을 실시하였다.

흑색종 백신 및 항-CTLA-4 항체로 치료한 동물에서의 항체 반응의 특이성을 확인하였다. SK-mel-3 백신 및 mAb 10D1으로 처리한 6마리의 시노몰거스 원숭이로부터의 혈장을 치료 41일에 얻어 모았다(pooled). 혈장을 1:1000으로 희석하여 플로우 사이토메트리로 다양한 흑색종 및 비-흑색종 세포주에 대한 반응성에 대해 시험하였다. 그 결과를 도 1에 나타내며, 이를 통해 원숭이에서의 항체 반응은 인간 비-흑색종 세포주 또는 비-인간 세포주보다 인간 흑색종 세포주에 대해 큰 특이성을 보인다는 것이 증명되었다.

항체 및/또는 백신으로 치료한 원숭이에 대한 만성 투여의 효과는 140일에 추가적인 투여량을 투여한 후 평가하였다. 항-CTLA-4 항체의 혈장 농도는 ELISA로 재조합 CTLA-4를 사용하여 연구 과정동안 160일까지 여러 시점에서 조사하였다. 10D1 혈장 농도는 표준 곡선에 대해 분석한 시료 희석물로부터 결정하였다. 만성 투여동안 10D1의 혈장 농도에 대한 데이터는 도 2에 나타내며, 여기서 여섯마리의 처리된 동물의 평균 +/- SEM에 제시된다. 결과를 통해, 항-CTLA-4항체의 혈장 수준은 160일의 전과정동안 검출가능한 수준보다 높게 유지되었다는 것이 증명되며, 이는 CTLA4 차단이 처리기간동안 유지되었음을 제시한다. 처리된 원숭이의 mAb 10D1의 평균 혈장 농도는 주입 후 175 내지 315㎍/㎖ 였고, 6개월 연구하는 동안 20㎍/㎖ 보다 높게 유지되었다. 임상 화학, 케이지-사이드(cage-side) 관찰 및 완전한 조직학 분석을 통해, 항체 또는 백신 투여와 관련있는 어떤 큰 변화가 드러나지 않았다. 자가반응성 항-멜라닌세포 반응을 확립하기 위한 CTLA-4 차단의 잠재적인 능력에도 불구하고, 만성투여에 의해, 두마리의 원숭이의 백신 주입 부위에 약간의 염증이 있는 것을 제외하고는 치료-관련 병변은 얻어지지 않았다. 원숭이는 10D1 mAb에 대한 임의의 검출가능한 항체 반응이 발생되지 않았고, 높은 수준의 활성 순환 항체가 연구기간동안 유지되었다. 또한, 이러한 항-CTLA-4 항체를 사용한 만성 투여는 치료 효능과 관련이 있었고 불리한 부작용(예를 들어 비-특이적 T 세포 활성화)과 관련이 없었다. 따라서, 이러한 실험을 통해, 항-CTLA-4항체를 사용하여 심각한 부작용 없이 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개월 또는 그 이상 검출가능한 수준보다 높게 혈장 농도가 유지되도록, 연장된 기간동안 영장류를 효과적으로 치료할 수 있다는 것이 증명되었다.

실시예 2: - 인간의 지연형 과민증(DTH) 실험으로부터의 항원-특이적 T 세포 증식의 증거

절제된 단계 III(2명) 또는 IV(17명) 흑색종 환자 19명에게, CTLA-4 항체 10D1을 단계적으로 확대되는 투여량(0.3, 1 및 3mg/kg)으로, 불완전 프룬드 아쥬반트(incomplete Freund's adjuvant)와 함께 gp100/티로시나제/MART-1 펩티드 백신을 각각 주입하면서 투여하였다. 티로시나제 368-376(370D), MART-1 26-35(17L) 및 gp100209-217(210M) 펩티드는 각각 HLA 결합을 증가시키기 위하여 하나의 아미노산이 변형되어 와일드형과 다르다. 백신을 12개월에 걸쳐 8회 1mg/투여량/펩티드로 투여하였다. DTH 반응성으로 측정한 면역 반응으로, 9명의 환자 중 4명이 gp100에 반응하였고, 9명의 환자 중 2명이 MART-1에 반응한 것으로 나타났다. ELISPOT 어세이를 통해, 신선한 CD8 T 세포를 사용하여 시험한 16명의 환자 중 4명에게서 면역 반응이 보여졌다.

실시예 3:- MAb 10D1 흑색종(MDXCTLA4-02)의 상 I 인간 임상 시험의 결과

MDXCTLA4-02는, 진행성의 절제가능하지 않은 악성 흑색종을 갖는 17명의 환자에게서 Mab 10D1의 안정성 및 약물동력학을 평가하기 위한 상 I 개방-라벨, 멀티센터 임상 시험이었다. 중앙 연령은 59세(29-79세 범위)였다. 9명의 환자는 이전에 면역요법을 받았고, 6명은 이전에 방사선조사를, 5명은 이전에 화학요법을 받았다. 모든 환자는 단일 투여량의 3mg/kg의 10D1을 90분에 걸쳐 정맥내 투여받은 후, 독성, 약물동력학, 순환 T 세포 활성화 및 임상적 결과에 대해 평가되었다. 단지 약한 불리한 결과(mild adverse events)와 함께 주입이 모두 완료되었다. 7명의 환자는 약하고, 가역적인 발진 또는 가려움증이 나타났다. 항체의 혈장 수준은 1 내지 4개월 지속되었다. 활성화된 주변 T 세포는 크게 증가하지 않았고, 약한 발진 이상의 임상적인 자가면역의 증거는 없었다. 두명의 환자는 세 개의 연조직 괴의 소산 및 50%를 초과하는 폐 괴의 감소를 포함하는 부분적인 반응을 경험하였다. 또한, 50%를 초과하는 폐 괴의 감소를 경험한 환자는 이전에 흑색종 백신으로 치료되었던 환자였으며, 이는 항-CTLA-4 항체 치료는 종양에 대해 이미 존재하는 기억 반응을 활성화시킬 수 있었다는 것을 제시한다. 이 연구의 결과는, 면역학적 및 항-종양 활성의 명백한 증거와 함께 항-CTLA-4 치료가 우수하게 면역관용되었다는 것을 나타낸다.

10D1으로 처리한 환자의 림프구 아집단을 플로우 사이토메트리로 항체 치료후 여러 시점에 분석하였다. 결과는 하기 표 1에 요약한다.

전립선 암 환자(하기 실시예 6 참조)에게서 관찰된 결과와 유사하게, 흑색종 연구의 결과를 통해, D101 치료는 시간경과에 따라 CD4/HLA-DR+ 아집단을 약 50% 증가시킨다는 것이 증명된다. 다른 림프구 아집단은 본질적으로 시간경과에 따라 일정하게 유지되었다. 상기된 바와 같이, 항-CTLA4 항체 치료의 시간경과에 따른 CD4/HLA-DR+ 아집단을 증가시키는 능력은, 항-CTLA4 항체를 평가하는 경우에 선택적인 특성으로 사용될 수 있다(즉, D4/HLA-DR+ 아집단을 증가시키는 이들의 능력에 대해 항-CTLA4 항체의 패널을 평가할 수 있으며, 시간경과에 따라 이 아집단을 증가시킬 수 있는 항-CTLA4 항체를 선택할 수 있다). 또한, 시간경과에 따른 림프구 아집단, 특히 CD4/HLA-DR+아집단의 조사를, 항체의 효능에 대한 한 표지로서 항-CDLA4로 치료되는 대상에게 실시할 수 있다.

실시예 4:- 이전에 예방접종된 흑색종 및 난소암 환자에서의 항-CTLA-4 항체 차단에 대한 인간 연구

이전에 면역화된 진전된 암 환자 9명에게 항-CTLA-4 항체 10D1을 투여하였다. 환자 1-6이 외과적으로 절제될 수 없는 단계 III 또는 IV 흑색종, 질환 진행, 12주 이상의 평균 여명, 적절한 말단 장기의 기능, 안정한 진통성 치료, 및 60% 이상의 카르노프스키 성능 상태(Karnofsky performance status)의 자격기준과 함께 상 I 시험 MDXCTLA4-02를 통해 병적에 넣었다. 환자는, 이들이 (치료된 비-흑색종 세포암 또는 표재성 방광암 이외의) 이차 악성종양, 자가면역 질환, 활성 감염, 카나마이신 과민증을 갖는 경우; 또는 이들이 코르티코스테로이드를 사용한 경우에 제외되었다. 환자 7-9는 전이암 흑색종, 전이암 난소 암종, 전이암 비-소형 세포 폐 암종 또는 급성 골수성 백혈병 환자에 대한 상 I 시험을 통해 병적에 넣었다.

네명의 환자는 이전에 초기 단계 흑색종에 대해 치료되었다(세명의 환자는 α-인터페론을 투여, 한 환자는 QS-21과 혼합된 GM2 강글리오사이드의 백신을 투여, 한 환자는 방사선 조사). 전이암 흑색종에 대한 이전의 비-면역학적 치료는 수술(네환자), 방사선조사(두환자), 화학요법(세환자) 및 프로테아솜 저해제(한 환자)를 포함하였다. 두명의 난소암 환자는 연구에 앞서 3 내지 4년에 걸쳐 재발 질환에 대한 다중 화학요법을 받았다.

모든 환자는 이 연구에 들어가기 전 전이암 질환에 대한 상 I 백신 연구에 참가하였다. 세 흑색종 및 두 난소암 환자를 아데노바이러스 매개된 유전자 이동에 의해 GM-CSF를 분비하도록 유전자조작된, 방사선조사된 자가유래 종양 세포로 면역화하였다. 이 환자들 중 하나(환자 8)는 또한 MUC-1 백신을 투여했다. 세 흑색종 환자를, 아데노바이러스 매개된 유전자 이동에 의해 gp100 및 MART-1을 발현하도록 유전자조작된 자가유래 수지상 세포로 면역화하였다. 한 흑색종 환자를 변형된 gp100 펩티드 및 고-용량 인터류킨-2로 예방접종하였다.

처음에, 10D1을 일반적인 염수 10㎖ 중의 0.2mg의 시험 투여량으로 10분에 걸쳐 정맥내 투여하여, 잠재적인 과민증 반응을 확인하였다. 이어서, 3mg/kg 10D1 투여량의 나머지를 90분에 걸쳐 정맥내 투여하였다. 항체 투여 후, 환자를 3일동안 매일, 이어서 4주동안 주마다, 그리고나서 달마다 임상, 실험실 및 라디오그라프 평가하였다.

한 환자는 주입동안 약한 저혈압 및 메스꺼움에 의해 명백한 급성 과민증 반응을 가졌다. 이 반응은 항-히스타민으로 쉽게 조절되었고, 주입은 무사히 완료되었다. 다섯명의 환자는, 주입 후에 근육통, 관절통, 식욕감퇴, 피로, 코 울혈, 및 2 내지 7일동안의 감기를 포함하는 일시적인 등급 I/II 의 체질상 증후군이 나타났다. 한 환자는 간헐적으로 순환하는 증후군을 몇달동안 겪었다. 한 환자는 일시적인 등급 III 간 기능 이상이 명백하였다.

이전에 방사선조사된 자가유래 GM-CSF 분비 종양 세포로 예방접종된 세명의 흑색종 환자는 10D1으로 치료한 후 강한 종양 괴사가 나타났다. 환자 1은 연구에서 병적에 기재시 중추 신경계, 폐, 배 및 연조직 전이암이 나타났다. 10D1 투여 1개월 후, 환자 1은 신경학적 상태에 임상적인 변화가 나타났고, 피하 손상이 급격히 나타났다. 환자 1은 6일 후 사망했다. 부검시 뇌, 경막외 및 내장 전이암의 뚜렷한 출혈성 종양 괴사가 주목되었다. 조직병리학 시험을 통해, 출혈과 함께 강한 종양 파괴(90% 이상)가 나타났다. 종양 혈관이 심하게 손상되어 강한 허혈성 괴사가 일어났다. 각 병소에 남은 생존가능한 종양 세포의 가장자리는 과립구 및 림프구 반응을 동반하였다.

환자 2는 10D1 주입 1개월 후 시작된 순환성 등급 II 체질상 증후군을 가졌다. 종격 병소의 생검을 통해, 림프구 및 과립구 침윤과 함께 강한 종양 괴사가 나타났다. 면역조직화학을 통해 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 및 면역글로불린-생산 CD20⁺ B 림프구가 존재하는 것으로 나타났다. 종격 병소는 2개월 후 완전히 절제되었다. 병소의 병리학적 분석을 통해 농후 섬유증(dense fibrosis), 강한 괴사, 및 진행성 림프구 및 과립구 반응이 나타났다. 폐색된 혈관 벽의 원주 림포이드 침윤을 특징으로 하는 맥관장애도 주목되었다. 종양 괴사는 공간적으로 혈관 손상과 관련이 있었다.

환자 7은 10D1 주입의 3주 후 큰 피하 병소에서 염증이 발달하였다. 주입 2개월 후 병소를 절제하였다. 병소의 병리학적 실험을 통해 강한 종양 괴사 및 섬유증, 현저한 맥관장애, 및 림프구 및 과립구 침윤이 보여졌다.

정의된 멜라노솜 항원으로 이전에 면역화된 네명의 흑색종 환자에게서 덜 극적인 항-종양 효과가 주목되었다. 환자 3은 주입 7개월 후 확대된 종격 병소를 절제하였다. 병리학적 분석을 통해 종양 괴사가 없는 농후한 림프구 침윤이 보여졌다. 면역조직화학을 통해, CD4⁺ 또는 CD20⁺ 세포가 아닌 CD8⁺ 세포가 존재하는 것으로 나타났다. 환자 4는 림프절 전이암에서 종양 괴사가 없는 유사한 CD4+ 세포 침윤을 가졌고, 이는 항체 주입 2개월 후에 절제되었다. 환자 5는 피하 병소에 림포이드 침윤 또는 종양 괴사를 갖지 않았고, 이는 항체 주입 2개월 후 절제되었다. 환자 6은 생검 및 진행된 종양을 갖지 않았다.

항체 주입으로 인해 두명의 난소 암종 환자의 CA-125 수준에 변화가 생겼다. CA-125는 난소 암종 세포의 표면으로부터 나오며 질환 상태의 유용한 표지이다(Jacobs, I.(1994) Gyn. Oncol. 55:S22-27). 환자 8은 항체 주입 2개월 후에 시작된 CA-125 값의 43% 감소(230이 132까지)가 나타났다. 이 반응은 유지되지 않았으나, 10D1의 2차 주입이 CA-125 수준을 2개월동안 안정화시켰다. 환자 9는 항체 주입 1개월 후에 부수적인 복수 감소와 함께 CA-125 값이 떨어졌다. 환자 9는 주입 전에 CA-125가 급속히 상승되었다.

네명의 환자에게서 1-2개월동안 지속된 자가항체(항-핵 항체, 항-티로글로불린 항체, 류마토이드 인자)의 낮은 역가가 주목되었다. 자가면역 질환의 임상적 증거는 전혀 없었다.

모든 흑색종 환자는 항체 주입 3일 내지 3주 후에 간(trunk) 및 단(extremities) 상에 무증후성 등급 I 망상 및 홍반성 발진이 발생했다. 7명의 환자는 피부 생검을 받았다. 생검받은 7명 중 5명의 환자는, 표피로 연장된 표재성 진피에 두드러진 혈관 주위 T 세포 침윤을 가졌다. CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 죽어가는 멜라닌세포에 덧붙어있는 것으로 확인되었다. 백반은 임상적으로 명백하지 않았다. 약한, 망막의 초점 하이포-색소형성(focal hypo-pigmentation)이 한 환자에서 주목되었으나, 시각적인 예민함은 영향받지 않았다. 한 난소 암종 환자는 홍반성 발진이 얼굴 및 간(trunk)에 주입 2주 후에 발생했다. 피부 생검을 통해 표재성 진피에서 혈관 주위 T 세포 침윤이 보였으나, 멜라닌세포에 대한 반응성은 없었다.

10D1은 순환 호중구의 상당한 증가를 유도하였고, 호중구 침윤은 종양 괴사와 관련있었다.

이 결과는, 10D1 항-CTLA-4 항체의 단일 주입은 큰 항-종양 효과를 가질 수 있고, 인간 환자에게 안전하게 투여될 수 있다는 것을 보여준다. 자가항원의 낮은 역가 발생은, 치료가 적어도 부분적으로 전신성 면역관용과 타협할 수 있다는 것을 보여주지만 자가면역 질환의 임상적인 증거는 전혀 주목되지 않았다.

실시예 5: 흑색종 환자에게 펩티드 백신과 함께 항-CTLA-4 항체 10D1을 투여하는 연구

진행성 단계 IV 흑색종 환자 14명에게 두 HLA-A* 0201-제한된 gp100 펩티드를 사용한 예방접종과 함께 항-CTLA-4 항체 10D1를 투여하였다. 환자의 특성을 하기 표 2에 요약한다.

모든 환자는 카르노프스키 성능 상태 ≥60%인 HLA^*0201⁺였다. 여섯명의 환자는 내장 전이암을 가졌다. 환자들은 자가면역 또는 면역결핍 질환의 증거가 전혀 없었다. 모든 환자는 일차 병소에 대해 이전에 수술을 받았다. 여섯명의 환자는 이전에 화학요법을 받았다. 일곱명의 환자는 이전에 인터페론-α(환자 2, 5-8, 10, 12 및 13), 저-투여량 IL-2(환자 2, 5 및 13), 고-투여량 정맥내 IL-2(환자 4, 7 및 8), 전체 세포 흑색종 백신(환자 1, 2 및 6), NY-ESO-1 펩티드 백신(환자 4 및 5), 및 GM-CSF(환자 9)를 포함하는 면역요법을 받았다. 환자들은 이전에 gp100 면역화를 받지 않았고 치료 전 3주 안에는 전신성 치료를 받지 않았다.

항-CTLA-4 항체 10D1를 3mg/kg으로 90분에 걸쳐 정맥 내 투여한 후, 불완전한 프룬드 아쥬반트(IFA)에 에멀젼화된 gp100:209-217(210M) 펩티드(IMDQVPFSV) 1mg을 일차 한도 내에서 피하 주입하고 IFA에 에멀젼화된 gp100:280-288(288V) 펩티드(YLEPGPVTV) 1mg을 이차 한도 내에서 피하 주입하는 것으로 구성되는 치료 사이클을 매 3주마다 투여하였다(합성 펩티드는 국립 암 인스티튜트 암 치료 평가 프로그램(National Cancer Institute Cancer Therapy Evaluation Program)이 제공). 환자는 치료 전 및 두 치료 사이클 후 3주마다 혈장교환(apheresis)을 받았다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜-히파크(Ficoll-Hypaque) 분리로 분리하고, 10% 디메틸 술폭사이드를 포함하는 열-불활성화된 AB 혈청 중에서 냉동저장하고, 추가 사용시까지 -180℃로 저장하였다. 환자는 1 내지 6 치료 사이클을 받았다(표 2).

가슴, 배 및 골반의 컴퓨터 축 단층촬영(CT); 및 뇌의 자기 공명 이미지화(MR)를 통해 임상 반응을 측정하였다. 이 이미지화 연구는 치료를 개시한 4 주 내에 실시한 후, 두 치료 사이클 후에 매번 실시하였다. 질환 부위를 평가하기 위하여 요구되므로 추가적인 방사능 연구를 실시하였다. 각 환자의 종양의 가장 긴 직경의 합(World Health Organization RECIST 기준)을 치료 전 및 후에 계산하였다. 부분적인 반응은 1개월 이상 지속되는 모든 평가가능한 전이암의 가장 긴 직경의 합이 30% 이상 100% 미만으로 감소하고, 새롭거나 확대된 종양이 없는 것으로 정의되었다. 완전한 반응은 1개월 이상 지속되는 모든 평가가능한 전이암의 가장 긴 직경의 합이 100% 감소하고, 새로운 종양이 없는 것으로 정의되었다. 비-반응은 부분적이거나 완전한 반응이 아닌 반응으로 정의되었다.

자가면역 반응에 대해 환자를 평가하였다. 환자는 치료 전 및 치료 개시 3개월 후에 안과학적인 시험을 받았다. 모든 환자는 티로글로불린 Ab, 류마토이드 인자 및 항-핵 항체에 대한 연구를 개시하기 전에 음성 혈청 혈액 시험을 받았다. 인간 항-인간(항-이디오타입) Ab, 적혈구 침전율, 항-핵 Ab, 티로이드 자극 호르몬 및 유리 T4 수준을 연구하는 동안 매 3주마다 측정하였다.

10D1의 혈장 농도는 CTLA-4-Ig로 코팅된 미량역가 웰(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)을 사용하여 표준 ELISA로 측정하였다. 혈장 시료 희석물을 플레이트 상에서 배양하였다. 결합된 항-CTLA-4 Ab를 염기성 포스페타제-표지된 염소 항-인간 IgG F(ab)-특이적 탐침을 사용하여 검출하였고, 이는 p-NPP 기질을 사용하여 개발되었다.

ELISPOT 또는테트라머 어세이보다 감도가 높은 12일의 시험관내 감작 어세이를 사용하여, 시험에 이용가능한 PBMC로 환자 11명 모두의 면역학적 반응성을 평가하였다(Rosenberg, S.A. et al., Nat. Med. 1998;4:321-327). 냉동저장된 PBMC를 녹여, 1μM의 천연 그대로의 gp100:209-217 또는 gp100:280-288 펩티드 및 300IU/㎖ IL-2를 포함하는 10% 열-불활성화된 인간 AB 혈청을 사용하여 완전한 이스코브-계(Iscove's-based) 배지에서 배양하였다. 세포를 배양 개시 11-13일 후에 채집하여 종양 세포 또는 펩티드-펄스된 T2 세포와 함께 밤새 공동 배양하였다. 상등액의 인터페론-γ(IFN-γ) 방출을 시판 ELISA 어세이(Pierce-Endogen, Rockford, Illinois)를 사용하여 측정하였다. 11명의 환자는 모두 1 내지 4 처리 사이클 후에 천연 그대로의 gp100:209-217 펩티드에 대한 성공적인 면역화가 나타났다. 여섯명의 환자는 천연 그대로의 gp100:280-288 펩티드에 대해 성공적으로 면역화되었다.

Fc-수용체 차단 및 항체(BD Biosciences, San Diego, California) 또는 테트라머(Beckman Coulter Immunomics, San Diego, California)를 사용한 염색 후에 플로우 사이토메트리 분석을 실시하였다. 치료의 두 사이클 전 및 후에 9명의 환자의 PBMC 상의 표면 표지 발현을 비교하였다. 치료 후 CD3⁺CD4⁺ 세포(P=0.0004; 쌍을 이룬 T-시험) 및 CD3⁺CD4⁺ (아마도 CD8⁺) 세포(P=0.04) 상에서 HLA-DR(활성화 표지) 발현이 크게 증가하였다. CD3⁺CD4⁺ 세포는 또한 치료 후 CD45RO(기억 세포 표지)의 발현이 크게 증가하였다(P=0.04). CD69, CD25 및 CTLA-4를 발현하는 세포집단의 %는 변하지 않았다.

환자 1, 11 및 13은 반응하였다(표 15). 환자 1은 두 치료 사이클 후에 고립성 폐 병소가 수축되었다. 환자 13은 두 치료 사이클후에 고립성 폐 병소가 수축되었고 피하 병소가 완전히 없어졌다. 환자 11은 31 폐 병소를 가졌고, 두 피하 병소와 하나의 뇌 병소를 가졌다. 뇌 병소는 두 치료 사이클 후에 0.5cm로부터 약 1.0cm까지 성장하였다. 세 추가적인 치료 사이클 후, 환자 11은 뇌 병소를 포함하는 모든 병소가 완전히 소산되었다.

환자 3은, 4 치료 사이클 후에 몇몇 폐 병소가 소산되었으나 전이암 림프절이 확대되는 혼합된 반응이 나타났다. 환자 10은 두 치료 사이클 후 문 병소 및 몇몇 다른 폐 병소가 크게 수축되었으나 다른 폐 병소는 확대되었다.

등급 I/II 불리한 결과에는 설사(환자 3,5 및 14), 피부 발진(환자 14), 폐 침윤 및 약한 융막성 가슴 통증(환자 4) 및 백반(환자 2 및 6)이 포함된다.

여섯 환자는, 피부염(환자 1, 2 및 13), 대장염/전장염(환자 1 및 9), 하수체염(뇌하수체의 염증)(환자 11) 및 간염(환자 12)를 포함하는 일곱가지 등급 III/IV의 불리한 결과가 발생하였다. 모든 환자는 치료의 중단 및 보완 케어 및/또는 스테로이드의 적용 후 회복되었다. 재발 또는 잇따르는 자가면역의 결과는 없었다.

자가면역 스크리닝 혈액 시험은, 항-핵 Ab가 발생된 환자 5 및 12를 제외하고는 정상이었다.

이 연구를 통해, 두 펩티드 백신과 함께 항-CTLA-4 항체 10D1을 투여한 환자에게서 전이암 흑색종 종양이 퇴화되는 실증적인 증거가 증명되었다.

실시예 6: 전립선 암의 MAb 10D1의 상 I 인간 임상 시험(MDXCTL-A4-01)

MDXCTLA4-01은 진행성, 전이암, 호르몬-난치성 전립선 암 환자에서의 항-세포독성 T-림프구-관련 항원-4(항-CTLA-4) 모노클로날 항체 10D1(MAb 10D1)의 개방-라벨 연구였다. 치료는 3.0mg/kg의 투여용량으로 주입액으로서 정맥내 투여하는 MAb 10D1의 단일 투여였다.

전립선의 일차 선암, 안드로겐 박탈 및 하나 이상의 전신성 비-호르몬성 조작 후 전립선의 진행성 전이암 암종의 조직학적 진단을 받은 환자를 선별하여 이 시험에 참여시켰다. 병적에 넣는 기준은: 진행성 측정가능한 질환, 진행성 PSA, PSA, PSA>5ng/㎖, 테스토스테론<50ng/dl, 일차 생식선 안드로겐 억제, 평균 여명>12주 및 카르노프스키 성능 상태≥60%였다.

시험 중인 환자의 면역 상태 조사의 중요성과 항-CTLA-4 항체가 T 세포 활성화에 미치는 일반화된 효과를 조사하는 특정 목적 때문에, 이 연구의 진입 기준에 각각 ≥ 500/㎖ 및 500/㎖의 최소 수준의 CD4 및 CD8 T 세포를 포함시켰다. 그러나, 연구에서 최초 증가시키는 동안에, CD4 및 CD8 T 세포가 명백히 존재하더라도 전립선 암 환자의 T 세포수가 크게 감소하였다는 것이 관찰되었다. 많은 환자가 상기 진입 기준에 근거하여 처음에 거부되었다. 이들 환자에게 암 예방접종하는 것을 포함하는 치료와 관련성을 가질 수 있는 관찰된 T 세포수의 명백한 감소는, 전립선 암 환자에게서 이전에 보고된 바 없는 관찰 결과이다. 이러한 관찰결과에 이어, 진입 기준을 CD4 및 CD8 수가 각각 ≥ 300/㎖ 및 ≥200/㎖인 환자를 포함시키도록 수정하였다.

대상을 혈액학, 생화학 및 면역 기능 평가를 위해 물리적 시험, ECG, 가슴 라디오그라피, 진단 이미지화 및 혈액 샘플링하였다. 치료 6개월 후까지 매달 전화 상담을 실시하여, 질환 진행 후의 자가면역 불리한 결과를 포함하는 다양한 결과의 서브세트에 대하여 정보를 수집 및 기록하였다. PSA(쇠퇴, 쇠퇴 기간, 진행, 진행까지의 시간) 및 질환 반응(완전,부분적, 안정, 진행)을 조사하였다. MAb 10D1의 혈장농도는 주입 전, 중 및 두달 후까지 즉시 평가되었다.

HRPC 환자 14명을 병적에 올렸다. 중앙 연령은 69세였다(56-79세의 범위). 7명의 환자는 이전에 화학요법을 받았다. 모든 환자는 3mg/kg 10D1을 90분에 걸쳐 정맥내 단일 투여한 후, 독성, 약물동력학, 순환성 T 세포 활성화 및 임상적 결과에 대해서 조사하였다. 모든 주입은 계획된 대로 완료되었으며, 주입과 관련된 불리한 결과(AE)는 아주 경미했다. 경미한 가역성 발진 또는 가려움증이 경구 스테로이드 치료에 대해 반응되었다. 어떤 다른 등급 3 이상의 AE도 10D1와 관련되지 않았다. 약물동력학적 프로파일은 도 3에 도시하며, 혈장 농도를 ㎍/㎖로 나타낸다. 평균 +/- SEM은 14 환자(n=14)에 대해 나타낸다. 도 3의 결과를 통해 항체의 혈장 수준은 3개월까지 검출가능한 것으로 증명되며, 추가적인 조사를 통해 혈장 수준이 4개월까지도 검출가능할 수 있다는 것을 알았다. 활성화된 주변 T 세포는 크게 증가되지 않았고, 임상적인 자가면역성은 주목되지 않았다. 단순히 화학요법을 받은 7명의 환자 중 2명은 3 및 5개월 지속되는 PSA 반응(합의 기준)을 가졌고, 한명은 증후가 개선되었다. 다른 환자는 PSA에 대한 곡선의 경사가 크게 변화하는 것을 경험하였다. 환자를 10D1(3mg/kg)의 2차 투여로 재치료하였으며, 재치료시에 이전에 반응했던 환자가 다시 큰 AE 없이 PSA 감소를 경험했다. 치료는 면역학적 및 항-종양 활성의 명백한 증거와 함께 우수하게 면역관용되었다. 따라서, 이 연구를 통해, 항체의 혈장 수준이 불리한 부작용 없이 1, 2, 3 또는 4개월까지도 검출가능한 수준보다 높게 유지되도록 항-CTLA-4 항체를 사용하여 인간 환자를 치료할 수 있다는 것이 증명된다.

항체 치료 후에 10D1으로 치료된 환자의 림프구 아집단을 플로우 사이토메트리로 다양한 시점에서 분석하였다. 결과는 하기 표 3에 요약한다(데이터는 평균 +/- SEM으로 나타낸다).

결과를 통해, 10D1 치료로 시간경과에 따라 CD4/HLA-DR+ 아집단이 약 50% 증가된다는 것이 증명된다. 다른 림프구 아집단은 시간경과에 따라 본질적으로 일정하게 유지되었다.

MAb 10D1을 투여하면 바람직하지 못한 비-특이적 T 세포 활성화가 유도될수 있는지를 평가하기 위하여, 전립선 암 대상으로부터의 말초혈액 림프구를 CD4, CD8, CD25, CD44, CD69 및 HLA-DR 표지 각각에 대해 플로우 사이토메티르로 분석하였다. 여기까지 치료된 각각의 전립선암 대상에 대한 치료 과정동안 이들 임의의 표지의 빈도에 큰 변화가 없었다. 이러한 분석의 예를, 대상 중 둘에게 Mab 10D1 투여하기 전, 중 및 후의 CD4, CD25, CD69-양성 세포 및 CD8, CD25, CD69-양성 세포의 빈도를 나타내는 표 4에 도시한다. 이들 데이터를 통해, MAb 10D1로 인해 비-특이적 T 세포 활성화가 일어나지 않는다는 것이 증명된다.

표 4는 3.0mg/Kg MAb 10D1으로 치료한 전립선 암 대상의 T 세포 활성화 표지의 플로우사이토메트리 분석을 나타낸다.

MDXCTLA4-01 임상 시험의 결과, 주입이 단지 경미한 반응과 함께 면역관용성이라는 것이 증명되었다. 항체의 연장된 혈장 반감기가 관찰되었고, 항체는 약 3 내지 4개월동안 혈장 내에 남아있었다. 큰 비-특이적 T 세포 활성화 없이 면역 효과의 명백한 증거가 관찰되었다. 증후의 완화 및 전립선 특이적 항원(PSA) 수준의 감소가, 항-CTLA-4 항체로 치료된 전립선 암 환자에게서 관찰되었다. PSA 수준의 감소에 대한 대표적인 결과를 도 4에 도시하며, 이는 0일에 3mg/kg 항-CTLA 항체를 주입한후 다양한 시점에서 두 환자(하나는 폐쇄된 원, 다른 하나는 개방된 원으로 표시)의 PSA 수준(ng/㎖)을 보여준다. 결과를 통해, PSA 수준이 항체의 주입 후에 감소되었고, 혈장의 항-CTLA-4 항체의 존재와 상관관계를 가지면서 치료 후 약 3-4개월동안 억제되어 유지되었다는 것이 증명된다. 면역-매개된 발진 및 가려움증, 양성 자가항원에 대한 일시적인 혈청변환, 흑색종 환자에서의 멜라닌 색소 변화, 및 종양 부위의 염증 반응을 포함하는 약간의 다른 경미한 면역 작용도 관찰되었다. 발진 및 가려움증을 제외하고는, 모든 잠재적인 불리한 면역 효과는 무증상이었다. 요약하면, 항-CTLA-4 항체 치료를 사용한 인간 임상 시험으로부터의 진행 결과를 통해, 항체는 우수하게 면역관용되고 수혜자에게 면역 작용을 자극한다는 것이 증명된다.

인용된 참조문헌

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Claims (31)

1. 환자의 항원에 대한 이차 면역 반응을 상승시키는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 항-CTLA-4 항체를 항원에 대한 일차 면역 반응을 발생시킨 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지고, 상기 항-CTLA-4 항체의 유효량은 항원과 접촉시에 환자의 항원에 대한 이차 면역 반응을 증진시키기에 충분한 것을 특징으로 하는, 환자의 항원에 대한 이차 면역 반응을 증가시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 항원은 암 항원이고, 상기 환자는 이전에 항-암 백신으로 치료받은 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 암 항원은 흑색종 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항에 있어서,

   상기 암은 흑색종이고, 상기 환자는 NY-ESO-1 펩티드를 포함하는 항-흑색종 백신으로 치료된 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2항에 있어서,

   상기 암은 흑색종이고, 상기 항-암 백신은 gp100 및 MART-1에서 선택된 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 2항에 있어서,

   상기 암 항원은 전립선 암 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서,

   항-CTLA-4 항체를 투여하기 전에 항원에 대한 면역성에 대하여 환자를 시험하고, 항원에 대한 면역성이 증명된 환자에게만 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7항에 있어서,

   상기 항원이 암 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7항에 있어서,

   상기 항원이 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 7항에 있어서,

    상기 항원이 박테리아 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서,

    상기 항원이 바이러스 항원이고, 상기 환자가 이전에 바이러스 백신으로 치료된 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항에 있어서,

    상기 바이러스 항원이 간염 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항에 있어서,

    상기 환자가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1항에 있어서,

    상기 항-CTLA-4 항체는 인간 항-CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항에 있어서,

    상기 항-CTLA-4 항체는 인간화된 항-CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1항에 있어서,

    상기 항-CTLA-4 항체가 인간 서열 항-CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 항-CTLA-4 항체의 혈장 농도가 4개월 이상 검출가능한 수준보다 높게 유지되도록 환자에게 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 환자의 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 방법.
18. 제 17항에 있어서,

    혈장 농도가 4개월 이상 검출가능한 수준보다 높게 유지되도록 상기 항-CTLA-4 항체를 여러번 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 17항에 있어서,

    환자의 항-CTLA-4 항체의 혈장 농도가 4개월 이상 2㎍/㎖ 이상이 되는 양 및 간격으로 상기 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 17항에 있어서,

    환자의 항-CTLA-4 항체의 혈장 농도가 4개월 이상 5㎍/㎖ 이상이 되는 양 및 간격으로 상기 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 17항에 있어서,

    환자의 항-CTLA-4 항체의 혈장 농도가 4개월 이상 10㎍/㎖ 이상이 되는 양 및 간격으로 상기 항-CTLA4 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 17항에 있어서,

    상기 환자가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 17항에 있어서,

    상기 항-CTLA-4 항체가 인간 항-CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 17항에 있어서,

    상기 항-CTLA-4 항체가 인간화된 항-CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 17항에 있어서,

    상기 항-CTLA-4 항체가 인간 서열 항-CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
26. T 세포 악성종양에 대해 환자가 치료되도록 세포독성제에 결합된 항-CTLA-4 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, CTLA4⁺ T 세포 악성종양에 대해 환자를 치료하는 방법.
27. 제 26항에 있어서,

    상기 세포독성제가 세포독성 약물인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 26항에 있어서,

    상기 세포독성제가 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 방법.
29. T 세포 매개 자가면역 질환에 대해 환자가 치료되도록 세포독성제에 결합된 항-CTLA-4 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, T 세포 매개 자가면역 질환에 대해 환자를 치료하는 방법.
30. 제 29항에 있어서,

    상기 세포독성제가 세포독성 약물인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 29항에 있어서,

    상기 세포독성제가 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 방법.