KR20040097406A

KR20040097406A - 현장검사용 마이크로시스틴 바이오센서 및 측정장치

Info

Publication number: KR20040097406A
Application number: KR1020030029682A
Authority: KR
Inventors: 김영민; 최의열; 오상욱; 정소영; 유진수
Original assignee: 바디텍메드 주식회사
Priority date: 2003-05-12
Filing date: 2003-05-12
Publication date: 2004-11-18

Abstract

본 발명은 개량된 면역분석법을 이용하여 환경독성물질을 고감도로 정량할 수 있는 측방 유동 정량 검정 스트립 및 이 스트립과 본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치가 일체로 구성된 패키지에 관한 것이다. 보다 상세하게는 물 안에 녹아있는 환경독성물질, 특히 마이크로시스틴(Microsystins, MCs, MCLR)에 대한 단일클론 항체를 이용하여 측방유동 경합식 면역형광 크로마토그라피법을 사용하여 피검체의 액체시료와 반응시켜 그 결과를 전용 레이저 형광 판독기를 통하여 pg/ml 농도까지 정량적으로 측정하는 방법; 상기 선별된 단일클론 항체와 형광으로 표지된 피검체를 사용하여 경합식 판별법으로 액체시료 내에 존재하는 피검체를 정량하는 법과 선별된 단일클론 항체를 형광으로 표지하여 측정용 스트립 내부에 고정된 피검체에 대하여 경합식 판별법으로 액체시료 내의 피검체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다. 또한 본 방법은 상기한 방법으로 마이크로시스틴을 정량할 때 시료를 실험실이 아닌 현장에서 빠른 시간 내에 직접 검출할 수 있게 함으로 수질 검사시의 용이성과 효율성을 높일 것으로 예상된다.

Description

현장검사용 마이크로시스틴 바이오센서 및 측정장치{ON-SITE BIOSENSOR AND INSTRUMENT FOR THE DETECTION OF MICROSYSTINS}

본 발명은 면역분석법을 이용한 환경독성물질의 정량적 측정방법 및 이 방법을 이용한 수질 검사방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 마이크로시스틴(Microsystins, MCs, MCLR) 에 대한 단일클론 항체를 이용하여 측방유동 경합식 면역형광 크로마토그라피법을 사용하여 피검체의 액체시료와 반응시켜 그 결과를 전용 레이저 형광 판독기를 통하여 pg/ml 농도까지 정량적으로 측정하는 방법; 상기 선별된 단일클론 항체와 형광으로 표지된 피검체를 사용하여 경합식 판별법으로 액체시료 내에 존재하는 피검체를 정량하는 법과 선별된 단일클론 항체를 형광으로 표지하여 측정용 스트립 내부의 피검체에 대하여 경합식 판별법으로 액체시료 내의 피검체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.

마이크로시스틴은 담수에 서식하는 시아노박테리아가 합성하는 폴리펩티드 형상의 환경독성물질이다. 마이크로시스티스(Microcystis),아나베이나(Anabaena), 오실라토리아(Oscillatoria), 노스토크(Nostoc)를 포함하는 녹조류가 생산하며, 60여 종의 다양한 유도체가 존재함이 알려졌다. 이 유도체들은 20-카보 아미노산, 3-아미노-9-메독시-2,6,8-트리메틸-10-페닐데카-4,6-디에노익산 (ADDA)라는 독특한 구조의 공통부분을 가지고 있으며, 이 곳이 독성을 나타내는 부위가 된다.

이 환경독성물질은 사람과 동물에게 매우 위험하며, 이 물질을 합성하는 시아노박테리아는 부영양화된 물에서 쉽게 번식하므로 이 환경독성물질이 음용수에 오염될 위험성이 항시 존재한다. 일례로 1966년 브라질에서는 60여명의 사람이 마이크로시스틴에 노출되어 사망한 경우가 있다. 사람이 이 환경독성물질에 급성으로 노출될 경우 충분히 치명적이라는 증거가 될 것이다. 현재 에프디에이의 음용수 관리기준에서 허가하는 마이크로시스틴의 농도는 1000 pg/ml농도 이하이며, 이를 초과시 음용수로 사용할 수 없다.

이 1000달톤 정도의 작은 펩타이드는 주 공격목표인 간세포 내부에서 세린/쓰레오닌 포스파타제나 단백질 포스파타제 I (PP I), II (PP II)등과 비가역적으로 결합한다. 이 인산화/탈인산화 효소들은 세포의 기능 조절에 핵심이 되는 효소이므로, 효소 기능이 저해됨으로 세포는 심각한 손상을 받게 된다. 고농도의 MCs에 단기간 노출될 경우에는 MCs와 단백질 인산화효소의 결합은 세포내 활성산소의 양을 증가시키며, 그 결과로 세포골격의 파괴와 대량의 탈수소효소의 유출을 가져온다. 세포막의 파괴 및 염색체의 위축, 절단 등을 포함하는 세포사멸 기작이 일어나서 급성 간 출혈을 유발하게 된다. 저농도로 음용수에 포함되어 사람이나 동물이 장기간 섭취할 때에는 간암을 유발하게 된다.

사람이나 동물의 건강을 보호하기 위하여 음용수 및 표층수의 관리에 있어서 이 환경독성물질의 빠르고 정확한 검사는 매우 중요한 일이다. 현재 국내에서는 조류 발생시 3단계에 거친 대응을 하고 있는데, 1단계에서는 원수에서 마이크로시스틴 발견시 하류의 정수장에서도 정량검사를 하도록 되어 있으며, 2단계에 해당하는 '조류경보'시에는 마이크로시스틴의 분석을 항상 실시하도록 되어있다 (낙동강 취수원 기준).

과거 이 환경독성물질에 대한 여러가지 분석방법이 개발되었다. 동물 바이오에세이, 인산화효소 저해도 검사, 고성능 액체크로마토그라피(HPLC), 후 고정화 검출법 등 많은 방법이 있으며, 각각의 장점들을 가지고 있다. 특히 70년대와 80년대에 개발되고 발전된 엘리자 면역분석법(ELISA)은 가장 많이 사용되고 있는 방법 중의 하나이며 의학이나 생명과학의 연구에서 필수적인 도구가 되었다. 항체 제작기술의 발달에 따라 검출 한도와 민감도, 특이도를 검출 결과를 크게 향상시킬 수 있었고, 현재는 변형된 엘리자 분석법으로 96-웰 내부에 다수의 항체를 고정화하여 한꺼번에 많은 수의 시료를 분석하는 방법이 가장 일반적인 방식이다. 그러나 엘리자를 포함하는 전형적인 면역진단법에서는 대개 시료 당 한 종류의 분석물을 복잡하고, 다단계과정을 거치며, 실험실에서만 구비된 고가의 분석기기를 사용하여 정량화할 수 있고, 매우 숙련된 실험자가 수행해야 한다는 단점이 있다. 따라서, 이러한 시설이나 설비가 갖추어 지지 않은 소규모의 병원, 응급실, 가정, 등에서 사용하기 용이하지 않다. 또한 엘리자 방법은 결과를 얻을 때까지 적어도 2시간 가량의 시간이 필요하게 된다.

면역크로마토그라피법을 이용한 간편진단 키트는 결과를 얻기까지 약 15분 가량의 짧은 시간이 소요되는 편리성 때문에 전혈, 혈청, 소변 등을 이용한 각종 감염성 질환이나 암, 환경호르몬 등의 진단이나 검출에 널리 응용되고 있다. 측방유동형 경합식 면역크로마토그라피법은 주로 분석물-금입자 칸주게이트를 탐지자로 하여 방출패드에 흡수시켜 사용하는 방법을 사용한다. 분석물을 포함한 시료를 검사스트립에 처리하면 방출패드를 통하여 니트로셀룰로스막으로 전개된다. 금입자, 라텍스 비드, 탄소 입자 등으로 표지된 탐지자는 검출물과 함께 이동하다가 니트로셀룰로스 막에 고정화된 포획자에 도달하면 경쟁적으로 탐지선에 쌓이게 된다. 포획자에 결합하지 않은 탐지자 및 검출물은 흡수패드에 흡수되게 된다. 그 결과로 시료에 검출물이 많이 포함되어 있으면 포획자와 결합한 탐지자의 양은 상대적으로적어져서 검사선에는 약한 양성 반응이 나타나게 된다. 즉 측방유동형 검사에서 이러한 경합식 방법은 검출물이 적을 경우는 강한 양성반응이 나타나며, 검출물과 상관이 없는 또다른 항체를 기준선에 고정시켜서 검사가 정상적으로 이루어졌는가를 확인한다. 이와 같은 측방 유동 분석법은 임신진단, 암진단, 미생물탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있으나 판단이 육안으로 이루어지는 까닭에 정확한 양을 확인하기 어려운 점이 따른다. 특히, 판단이 컷오프 값(cut-off value) 부근에서 이루어져야 할 경우에는 정확하게 진단하기가 용이하지 않다. 예를 들어, 전립선암의 경우 컷오프 값이 4 ng/ml인데 실제 값이 3.9 ng/ml와 같이 아주 유사한 경우 사용자의 주관이 개입되어 정확한 판단이 어렵다. 또한, 종래의 측방 유동 정량 검정 키트들은 대체로 분석물을 정량하기 보다는 단순히 정성을 위한 수단으로 주로 사용되고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명은 종래의 탐지방법의 장점인 정확도와 정량성을 빠른 시간내에 볼 수 있는 간편진단키트의 장점을 조합함으로써, 엘리자 방법을 보완하거나 대체할 수 있으며, 시료를 채취한 그 장소에서 바로 검출 및 정량이 가능케 함으로 간편하고 정확한 환경독성물질의 검사법을 제공하기 위함이다.

더욱 자세하게는 측방유동 면역크로마토그라피법을 개량한 측방유동 형광면역 크로마토그라피법을 이용한 탐지 키트와 그 전용 레이저 형광판독기에 대하여 이며, 더더욱 자세하게는 상기한 방법을 통한 pg/ml 수준에서의 담수에 녹아있는마이크로시스틴 정량방법을 뜻한다.

(도 1)은 본 발명에 따른 한 양태로써 측방유동 정량 스트립의 측면도이다.

1지지판 2샘플패드 3니트로셀룰로스 막 4탐지선 5기준선 6흡수패드

(도 2)는 본 발명에 따른 한 양태로써 측방유동 정량 스트립의 평면도이다.

(도 3)은 스트립을 하우징 내에 조립해 넣은 사진이다.

(도 4)는 본 발명에 따른 레이저 형광 판독기의 원리를 나타낸 모식도이다.

7레이저 8입사필터 9타원반사경 혹은 구면반사경 10탐지스트립 11공간필터

12평행광학계 13광검출기 14형광필터

(도 5)는 본 발명에 따른 한 양태로써 항체고정식 검출방식의 원리를 나타낸 모식도이다.

(도 6)은 도 5의 원리에 따른 스트립에 시료를 가하여 레이저형광판독기로 읽은 형광의 세기를 그래프화 한 것이다.

(도 7)은 도 5의 원리에 따른 스트립의 유효 검출범위를 산출하기 위한 그래프이다.

(도 8)는 본 발명에 따른 한 양태로써 항원고정식 검출방식의 원리를 나타낸 모식도이다.

(도 9)은 도 8의 원리에 따른 스트립에 시료를 가하여 레이저형광판독기로 읽은 형광의 세기를 그래프화 한 것이다.

(도 10)은 도 9의 원리에 따른 스트립의 유효 검출범위를 산출하기 위한 그래프이다.

(도 11)은 본 발명에 따른 스트립의 재연성을 실험하기 위한 반복실험값의 그래프이다.

본 발명은 첫 번째로 환경독성물질, 특히 마이크로시스틴에 대한 단일클론 항체를 제작하고, 이 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작한 뒤, 이 하이브리도마 세포 배양액으로부터 얻은 항체들 중 마이크로시스틴에 대한 반응성이 우수한 단일클론 항체를 선발, 대량조제하여 측방 유동 경합식 형광면역 크로마토그라피 스트립을 제조하고, 두 번째로는 이 스트립을 사용하여 마이크로시스틴을 정량할 수 있는 전용 판독기에 대한 내용을 제공한다.

본 발명은 하기하는 실시예로 좀 더 구체적으로 예시될 것이다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 구현하기 위한 다양한 방법들 중 하나이며, 이로 인하여 본 발명을 제한하지 않는다.

<실험예 1>

구체적으로는, 본 발명에 사용된 단일클론 항체의 제작 및 경합식 정량법을 위하여 사용될 마이크로시스틴의 대량정제를 선행하였다. 본사는 시아노박테리아로부터 마이크로시스틴을 분리하기 위한 방법으로 아세트산이나 메탄올을 이용한 임계상 액체 크로마토그라피법을 사용하였다. 임계상액체크로마토그라피법을 통하여 순수분리한 마이크로시스틴을 사용하여 본 발명에 이용되는 단일클론 항체를 제작하게 되었다.

단일클론 항체의 제작방법은 단일클론 항체 기술분야의 통상적인 방법을 사용하였다. 간략히 기술하여 상기한 방법으로 얻은 마이크로시스틴 수용액을 동일한부피의 완전 프로인트 면역보조제와 혼합, 유화시켜서 BALB/c 계통의 생쥐의 복강에 주사하였다. 2~3주 정도의 간격을 두고 불완전 프로인트 면역보조제와 혼합한 항원을 2~3회 더 면역한다. 생쥐의 혈액을 조금 채취하여 엘리자 방법으로 마이크로시스틴에 대한 항체가 생성되었음을 확인하면 이 생쥐로부터 지라세포를 분리하여 하이브리도마 세포주를 만들 수 있는 림프종 세포주, 예를들어 에스피투오-에이쥐-14(SP2/o-Ag-14)와 융합시켜 무한 증식성을 가지며 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작한다.

<실험예 2>

마이크로시스틴과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하기 위하여 96-well 마이크로플레이트에 마이크로시스틴-소혈청알부민 칸주게이트를 2ug/ml 농도로 카보네이트 완충액(pH 9.6) 에 희석하여 50ul씩 분주한다. 하룻밤동안 4도씨에서 피복시킨 후 피비에스-트윈 완충액 (PBST)으로 씻어주었다. 비특이적 반응을 방지하기 위하여 5mg/ml 농도로 희석한 물고기 젤라틴 용액을 50ul/ml 가하여 1시간동안 상온에서 블러킹 시킨다. 피비에스-트윈 완충액으로 3회 씻어준 후 하이브리도마 세포주 배양액을 50ul 가하여 2시간동안 상온에서 반응시킨다. 피복된 마이크로시스틴과 반응한 세포주 배양액에 있는 생쥐 유래 항-마이크로시스틴 항체는 염소 유래 항-생쥐 면역글로불린쥐-에치알피 표지 항체를 사용하여 티엠비 발색을 시킨다. 발색반응이 진행되고 15분 전후에 10mM 황산용액을 가하여 발색반응을 중단시킨 후 그 결과를 엘리자 판독기(Bio-Rad model 550)를 사용하여 가장강하게 반응하는 배양액의 하이브리도마 세포주들을 선별하였다.

<실험예 3>

항-마이크로시스틴 단일클론 항체, 마이크로시스틴 및 비오틴의 칸주게이트 제작

단일클론 항체를 형광표지하기 위하여서 1M 염화 카보네이트 완충액 10 ul (pH 8.3)를 정제된 항 마이크로시스틴 단일클론 항체가 1mg/ml로 녹아있는 인산염 완충액 100ul와 혼합한다. 여기에 1 μl 의 형광물질인 알렉사 플루오 (Alexa Fluor 647) 10 mg/ml을 가하여 4도씨에서 하룻밤 반응시킨다. 이를 세파덱스 쥐25 (Sephadex G25) 컬럼을 사용하여 2500 rpm, 2분간 원심분리하여 표지되지 않은 여분의 형광물질을 제거한다.

마이크로시스틴-소혈청알부민 칸주게이트의 제작은 각각의 단백질을 1.2mg/ml 농도로 1ml의 인산염 완충액에 희석한다. 둘을 화학적 결합 시키기 위하여 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이모드 (이디에이씨, EDAC) 11.5mg을 가하여 4도씨에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 인산염 완충액으로 투석하여준다. 마이크로시스틴-소혈청알부민 칸주게이트에 형광표지를 하기 위하여 염화 카보네이트 완충액에 녹아있는 마이크로시스틴-소혈청알부민 칸주게이트(1mg/ml) 100 ul를 취하여 1M 염화 카보네이트 완충액 10 ul를 가한다. 여기에 1 μl 의 형광물질인 알렉사 플루오 647 (Alexa Fluor 647) 10 mg/ml을 가하여 4도씨에서 하룻밤 반응시킨다. 이를 세파덱스 쥐25 (Sephadex G25) 컬럼을 사용하여 2500 rpm, 2분간 원심분리하여 표지되지 않은 여분의 형광물질을 제거한다.

비오틴-소혈청알부민의 형광표지를 위하여 우선 50 μg의 비오틴 과 500 μg 의 소혈청알부민을 500 μl의 인산염완충액에 희석하였다. 여기에 화학적결합을 위한 이디에이씨 5 mg을 가하여 4도씨에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이를 인산염 완충액으로 투석한다.

비오틴-소혈청알부민의 형광표지는 상기한 마이크로시스틴-소혈청알부민의 형광표지와 동일한 과정을 통하여 제작하였다.

<실험예 4>

레이저 형광판독기에 적용하기 위한 분석용 스트립을 내장한 키트의 제작은 다음과 같다. 스트립의 주재료는 니트로셀룰로스막, 샘플패드, 흡수패드, 지지판으로 이루어져 있다 (도 1, 도 2). 폴리스티렌 지지판(1)의 접착면에는 니트로셀룰로스 막(3), 샘플패드(2) 및 흡수패드(6)가 놓여진다. 얇은 플라스틱 필름으로 하부가 피복된 니트로셀룰로스 막(Millipore HF 180)이 탐지부위가 된다. 표준선(5)과 탐지선(4)은 이 탐지부위 안에 분주하게 된다. 표준선은 내부표준으로 이용하게 될 스트렙타비딘을 2.5mg/ml의 농도로 분주하며, 탐지선은 항 마이크로시스틴 단일클론 항체 (350ug/ml)을 사용하는 형태와 마이크로시스틴-소혈청알부민 칸주게이트 (80ug/ml)을 사용하는 형태 두 가지가 존재할 수 있다. 각각의 선의 분주는 분주기를 이용하여 1mm의 굵기로 cm 당 1ul의 부피를 분주하였다.

표준선과 탐지선은 샘플패드로부터 각각 31mm과 33.5mm의 위치에분주하였다. 샘플패드(S&S 903, 4X25mm)를 니트로셀룰로스 막에 위치시키기 전에 전처리 과정으로 샘플패드를 1% 소혈청알부민, 0.05% 트윈 20 이 녹아있는 인산염 완충액에 완전히 적셔준다. 이를 50도씨의 진공건조기에서 1시간 동안 수평을 유지하며 건조시킨다. 흡수패드(S&S 470 4X20mm)는 니트로셀룰로스 막의 끝부분에 위치시킨다. 지지판 위에 조립이 끝난 스트립은 전용 형광 판독기에 삽입되도록 디자인 된 플라스틱 하우징에 넣어 키트의 조립을 마친다 (도3). 판독부분에는 장방형의 창이 나 있고 시료 투입구는 15mm 지름의 원형으로 구성되어 있으며 깊이는 5mm로 약 100 ul의 시료를 넣을 수 있는 부피이다. 이 키트의 시료 투입구에 검체와 탐지액을 혼합하여 탐지를 개시한다.

<실험예 5>

본 발명의 레이저 형광판독기는 레이저, 여기필터(exciter filter), 타원반사경 또는 구면경, 표면형광이 발광되는 시료 제어 수단, 공간필터, 평행광학계, 형광필터 및 광검출기로 구성되며 이러한 구성에 의한 표면형광의 포집 원리는 도 4를 참고로 한다

도 4는 본 발명에 따라 타원반사경, 또는 구면경의 제1초점에 집속된 입사광선과 시료를 배치하고 제2초점에 집속된 후 발산하는 형광을 평행광으로 가공하여 표면형광을 검출하는 시스템을 보여준다. 레이저는 특정 형광단의 여기 밴드 최대치와 일치하는 파장을 방출한다. 한 가지 양태로서, 레이저(7)은 형광물질 표지 Alexa의 흡수 최대치에 근접하는 파장 594 nm에서 방출하는 2 mW He-Ne 레이저이다. 예를 들면, He-Ne 레이저 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 레이저로 사용할 수 있다. 레이저(7)의 빛은 입사필터(8)를 통과하고 입사필터와 탐지 스트립(10)사이에 배치되어 있는 타원반사경(9)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 이때 레이저의 빛이 입사필터(8)를 지나 타원반사경(9)의 구멍을 적절히 통과할 수 있도록 레이저, 입사필터와 타원반사경은 일렬로 나란히 배치되는 것이 바람직하다. 타원반사경을 통과한 빛은 탐지스트립(10)에 고정되어 있는 시료면에 적절한 크기로 집속된다. 시료는 빛이 최적으로 집속될 수 있도록 제어 수단에 의하여 위아래 혹은 전후(지면에 수직한 방향)로 이동하여 위치를 변경할 수 있다. 이 집속점은 타원반사경(9)의 제1초점에 위치하고 있다. 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경(9)에 의해 반사되어 타원거울의 제2초점으로서 공간필터(11)로 집속된다. 공간필터는 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈(noise)를 제거하는 작용을 한다. 그러나, 공간필터는 사용하지 않을 수 있다. 공간필터를 통과한 빛은 평행광학계(collimator)(12)에 의하여 평행광으로 변형된다. 만일 공간필터를 사용하지 않은 경우는 타원거울의 제2초점이 평행광학계가 되어 이곳으로 집속되고 바로 평행광으로 변형된다. 평행광학계를 지나면서 형성된 평행광은 형광필터(14)를 지나면서 산란광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(13)로 입사한다.

표준선의 내부표준 형광의 세기와 탐지선의 형광의 세기는 면적비로 환산되며, 이 면적비는 표준곡선과 대비되어 농도값으로 환산된다.

<실험예 6>

본 발명에 있어서 포함된 키트 및 탐지액의 조성과 계산원리의 예를 아래에 보인다. 이하의 조성예는 반드시 한정될 필요는 없으며 키트의 성능 향상의 이유로 변경될 수 있다. 하기하는 예에서는 항체 부착형 키트와 항원 부착형 키트를 설명한다.

항체 부착형 탐지키트의 경우에는 탐지선에 항 마이크로시스틴 단일클론 항체를 분주하며, 탐지액 조성은 다음과 같다. 마이크로시스틴-형광 칸주게이트와 바오틴-형광 칸주게이트가 각각 1.18ug/ml, 92ng/ml의 농도로 인산염 완충액에 혼합하여 사용한다.

항원 부착형 탐지키트의 경우에는 마이크로시스틴-BSA 칸주게이트를 탐지선에 분주하며, 탐지액 조성은 항 마이크로시스틴-형광 칸주게이트와 비오틴-형광 칸주게이트가 각각 4.6ug/ml, 46 ng/ml의 농도로 인산염 완충액에 혼합되어 사용한다. 완충액은 동결건조하여 보관이 가능하며 증류수로 재환원하여 사용할 수 있다

각각 다른 농도의 마이크로시스틴을 포함한 담수를 20ul 취하여 검체로 하여 각 검체마다 80ul의 완충액을 잘 혼합하여 키트의 샘플 투입구에 투입한다. 15분 경과 후 키트를 레이저 형광 판독기에 삽입하여 탐지선과 표준선에서의 형광의 세기를 면적값으로 환산하였다. 탐지선에서의 면적값을 A_T, 표준선에서의 면적값을 AC로 하였다. A_T/A_C의 비는 마이크로소프트 액셀 프로그램을 사용하여 표준곡선과 함께 대비하여 정량하였다.

도 5는 항체고정식 키트를 사용할 때의 검출원리를 도식화 한 것이다. 도 6은각각 다른 농도의 검체를 판독한 형광의 세기를 도표로 나타내었으며, 도 7은 농도에 따른 형광의 감소값을 나타낸 도표이다. 형광의 세기는 125pg/ml 부터 2000pg/ml까지 매우 급격하게 감소함을 볼 수 있다. 이 항체고정식 키트의 유효 측정 범위는 125 ~ 2000pg/ml이며 측정 하한선은 125pg/ml이다. 에프디에이 음용수 관리기준 1000 pg/ml은 이 범위에 포함되게 된다. 도 7에서 유도한 표준곡선식은 Y=2.00433-0.34622X 이며, 회귀계수 R은 0.98717이다.

도 8은 항원고정식 키트를 사용할 때의 검출원리를 도식화 한 것이다. 도 9는 각각 다른 농도의 검체를 판독한 형광의 세기를 도표로 나타내었으며, 도 10은 농도에 따른 형광의 감소값을 나타낸 도표이다. 형광의 세기는 62.5pg/ml 부터 125pg/ml까지 매우 급격하게 감소함을 볼 수 있다. 이 항원고정식 키트의 유효 측정 범위는 62.5 ~ 125pg/ml이며 측정 하한선은 62.5pg/ml이다. 이 키트는 높은 범위 보다는 매우 낮은 범위의 마이크로시스틴의 정량이 요구될 때 이용할 수 있다. 도 10에서 유도한 표준곡선식은 Y=0.99692-0.33744X 이며, 회귀계수 R은 0.98922 이다.

도 11은 각 키트를 10 회씩 검사하여 재연성을 나타낸 도표이다. 항체고정식과 항원고정식 각각에서의 CV 값은 4.63%와 7.45%였다.

판매되는 엘리자 키트의 경우의 측정가능 범위는 대략 20 ~ 4000 pg/ml이며, 본 발명에서의 측정가능 범위는 62.5~2000 pg/ml이다. 에프디에이의 기준인 1000pg/ml과 비교하여 충분히 엘리자 키트를 대체할 수 있으며, 분석시간에 있어서 우위를 점하고 있다

상기한 바와 같이 본 발명은 실험실에서 사용 가능한 엘리자키트와 동등한 정밀도를 가지고 있으면서도 센서 및 측정장치의 휴대성으로 인하여 원하는 장소 어디에서나 마이크로시스틴의 측정을 가능하게 함으로써 환경오염이나 수질관리 등에 관련된 실험을 시료를 채취한 그 장소에서 바로 측정할 수 있게 하거나, 혹은 시료를 가지고 와서 실험을 수행할 때에도 빠른 시간 안에 그 결과를 알 수 있게 함으로써 빠른 검사 및 예측에 도움을 줄 수 있을 것이다.

Claims

담수에 서식하는 시아노박테리아가 생성하는 마이크로시스틴 (microsystin, MCLR)에 대한 단일클론 항체를 제조하고, 이 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작한 뒤, 이 하이브리도마 세포 배양액으로부터 수득되고 마이크로시스틴과 반응성이 우수한 단일클론 항체를 선발하여 측방유동 면역크로마토그라피법을 개량한 측방유동 경합식 면역형광 크로마토그라피법으로 피검체가 포함된 담수 시료와 반응시킴으로써, 탐지스트립에서 레이저에 의해 유발되는 형광을 측정할 수 있는 판독기를 사용하여 탐지선에서 발하는 형광의 세기와 내부표준선에서 발하는 형광의 세기를 측정, 비교함으로써 액체 시료 중의 원하는 피검체인 마이크로시스틴을 탐지, 정량하는 방법
스트립 내부의 방출패드가 아닌 탐지액에 탐지자로의 항체나 경합자로써의 표지된 피검체를 포함시켜서 안정성을 높이는 방법
청구항 1과 2에서 시료 안의 피검체와 형광표지된 경합자가 경쟁적으로 탐지선에 반응하여 피검체의 농도와 반비례하여 탐지선에서 발생하는 형광을 내부표준과 비교하여 그 양을 역산할 수 있는 방법
청구항 1과 2에서 탐지액 내부의 형광표지된 탐지항체와 탐지선 내의 비표지탐지항체가 경쟁적으로 시료 내의 피검체와 반응하여 피검체의 농도와 반비례하여 탐지선에서 발생하는 형광을 내부표준과 비교하여 그 양을 역산할 수 있는 방법
상기한 모든 항에 있어서, 상기 분석물의 측정 하한선이 수십pg/ml 임을 특징으로 하는 방법
제1항에 있어서, 탐지항체로써 항 마이크로 시스틴 염소항체, 토끼항체, 생쥐항체를 포함하는 것으로 담수내의 마이크로시스틴을 경합식으로 정량하는 방법
제1항에 있어서, 비표지된 표준 포획자가 고정된 표준선이 검사창의 전방에 단일 선으로 위치하거나 전후방 모두에 각각 단일선으로 위치하는 방법.
제 2, 3, 4항에 있어서 피검체가 마이크로시스틴인 방법
제 1항과 2항에서 검출 가능한 신호가 형광인 방법
제 1, 2, 3, 4항에 있어서 측정장치가 광검출기인 방법