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KR20040089695A - 내재화 항-ｃｄ74 항체 및 그 이용방법 - Google Patents

내재화 항-ｃｄ74 항체 및 그 이용방법 Download PDF

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KR20040089695A
KR20040089695A KR10-2004-7013665A KR20047013665A KR20040089695A KR 20040089695 A KR20040089695 A KR 20040089695A KR 20047013665 A KR20047013665 A KR 20047013665A KR 20040089695 A KR20040089695 A KR 20040089695A
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슈-온 륭
젱싱 큐
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이뮤노메딕스, 인코오포레이티드
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Abstract

본 발명에서는 B-세포 악성종양, CD74와 반응하는 세포에서의 다른 악성종양 및 자가면역질환과 같은 B-세포 질환의 치료 및 진단에 이용되는 주요 조직적합성 복합체(MHC) Ⅱ종 불변사슬, Ii인 CD74에 결합하는 인간화된, 키메라 및 인간 항-CD74 항체, CD74 항체 융합 단백질, 면역접합체, 백신 및 양특이성 항체, 및 이를 이용한 치료 및 진단 방법을 제공한다.

Description

내재화 항-ＣＤ74 항체 및 그 이용방법{Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use}
면역치료의 주요 목적 중 하나는 종양 세포 또는 감염균에 대한 환자의 면역 시스템에 이용하는 것이다. 암 치료의 목적은 종양 세포에 대한 환자의 면역시스템을 관리하는 것이다. 비호지킨 림프종(Non-Hodgkins lymphoma, NHL), 다발성 골수종(multiple myeloma), 및 만성 및 급성 림프구성 백혈병은 암 사망률에 중요 기여자로 잔존하는 B-세포 악성종양이다. 다양한 치료 형태에서 이들 악성종양의 반응은 혼합된다.
T-림프구 반응의 유도는 숙주의 면역 반응에서 결정적인 초기 단계이다. T-세포의 활성화는 T-세포 증식, T-세포에 의한 사이토카인 생산 및 T 세포 관련 작동체 기능의 생성을 초래한다. T-세포 활성화는 대개 일차 활성화 신호라고 불리는 항원 특이적 신호를 요구하며, T-세포의 표면에 존재하는 클론으로 분포되는 T-세포 수용체(TcR)를 자극한다. 이러한 항원 특이적 신호는 일반적으로 항원제공 세포(antigen-presenting cells, APC)의 표면에 존재하는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) I종 단백질 또는 MHC II종 단백질에 결합하여 항원 펩티드를 생성한다. 인간의 MHC 분자는 HLA(human leukocyte antigen) 분자로 제작된다.
II종 분자는 세포 유형의 수가 한정되지 않으며, 본질적으로 B-세포, 단핵구(monocyte)/대식세포(macrophages) 및 수지상 세포(dendritic cells) 등이 있으며,대부분의 경우에 세포외부 환경으로부터 유입된 단백질에서 유래된 펩티드로 존재한다. MHC II종은 세포외부 환경과 전달되는 세포 구획(cellular compartments)을 요구한다. 인간의 MHC II종 분자는 유전적으로 다양한 대립형질 유전자를 코드하여 획득하는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP 분자를 포함한다. 그러므로, 예를 들면, 세포외부 환경에서의 세균성 항원은 그들의 세포 표면에 항원제공 세포에서 세포내부 처리후 흡수되어 나타날 수 있다. CD4+ T 세포는 II종 분자에 결합하는 펩티드를 인식한다.
방사성핵종 또는 다른 세포독성 제제와 접합된 표적화 단클론항체의 이용은 종양 부위에 직접 상기 제제를 운반하여 그로 인해 독성 제제에서 정상 조직의 노출을 제한하는 가능성을 제공한다(Goldenberg,Semin.Nucl. Med., 19: 332 (1989) ). 최근 몇 년간, 항체를 기초로 한 치료의 잠재력 및 종양 결합 항원의 위치에서의 이들의 정확성이 연구소 및 임상연구를 통해 증명되었다(예를 들면, Thorpe,TIBTECH, 11: 42 (1993); Goldenberg,Scientific American, Science & Medicine,1: 64 (1994); Baldwinet al., 미국특허 제4,925,922호 및 제4,916,213호; Young, 미국특허 제4,918,163호; 제5,204,095호; Irieet al., 미국특허 제5,196,337호; Hellstromet al., 미국특허 제5,134,075호 및 제5,171,665호 참조). 일반적으로, 종양의 위치 결합 지표에 대하여 방사성 동위원소로 라벨된 항체 또는 항체 단편의 이용은 어느 정도 종양에 의해 흡수되는 항체가 주입된 총 복용량의 0.01∼0.001% 의 일반적으로 낮은 범주에 속하므로 치료에 있어서 보다 성공적이었다(Vaughanet al.,Brit. J. Radiol., 60: 567 (1987)). 종양에 대한 복용량을 증가하는 방사성동위원소 라벨의 농도가 증가하는 경우, 건강한 조직이 방사성에 노출되는 것도 증가하게 되므로, 일반적으로 역효과를 낳는다.
뮤린 LL1(mLLI 또는 뮤린 항-CD74 항체)은 CD74, HLA II종 부류의 항원, 예를 들면, B-세포의 림프구, 단핵구 및 조직구(histiocyte), 인간 B-림프종 세포주, 흑색종, T-세포 림프종 및 다른 다양한 종양 세포 유형 표면의 가변 사슬(Ii 유전자)과 반응하는 특이적 단클론항체(mAb)이다(Hansenet al.,Biochem. J.320: 293 (1996)). 세포 표면에 결합하는 LL1은 리소좀 구획에 급속히 내재화되고, 항-CD19 및 항-CD22와 같은 다른 mAbs보다 훨씬 빠르고 신속하게 대사작용으로 분해된다. 이러한 LL1 고유의 특성은 상기에 기재한 면역치료의 어려움의 일부를 극복한다.
뮤린 LL1은 Raji B-림프종 세포주(Pawlak-Byczkowskaet al., Can.Res.,49: 4568 (1989)에서 EPB-1라고 지칭되었다)로부터 제조되어 면역성을 부여한 BALB/c 쥐에서 유래한 비장세포(splenocyte)와 쥐의 골수종 세포를 융합하여 개발하였다. mLL1의 임상적 이용은 대부분의 다른 유망한 쥐 항체와 함께 하여야만 인간 내에서 인간 항-쥐 항체(HAMA) 반응이 발생하므로 제한된다. HAMA 반응은 일반적으로99mTc로 라벨된 mLL1 Fab'를 이용하는 골수 영상 연구에서 명시되는 mLL1 Fab'의 주입에 의해 관찰되지 않는다. Juweidet al.,Nuc. Med Comm. 18: 142-148 (1997). 그러나, 일부 치료용 및 진단용 이용에서 온길이 항-CD74 mAb를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 온길이 항-CD74 mAb의 이용은 잠재적 과민반응 문제뿐만 아니라, 유동 접합체의 주요 부분이 유동 항-쥐 항체에 의해 복합되고 결합되기 때문에 상기항체 및 항체 접합체의 진단 및 치료의 유효성을 제한할 수 있다. mLL1의 항체 단편의 이용이 면역원성(immunogenicity)의 문제를 극복하고는 있지만, 완전한 IgG가 더욱 요구되고, 세포 면역의 유도로 치료를 제공하고 항체 생존시간을 증가하는 부수적인 문제가 있다. 일반적으로 HAMA 반응은 뮤린 항-CD74 mAbs의 충분한 진단 및 치료의 잠재력을 인식하는 잠재적 장애를 일으킨다. 따라서, 키메라, 인간화된 및 인간 항-CD74 mAbs 및 그 단편, 그들의 항체 융합 단백질 및 그 단편, 치료용 및 진단용 면역접합체, 다원자가 및/또는 멀티특이성 mAbs 및 그 단편 및 그들의 백신 접합체 개발이 인간 항-쥐 항체의 감소한 생산으로 치료 및 진단에 매우 유용하다.
본 발명은 인간화된, 키메라 및 인간 항-CD74 항체 또는 그 단편 또는 적어도 하나 이상의 항-CD74를 포함하는 항체 융합 단백질에 관한 것으로서, 특히 인간화, 키메라 및 인간 항-CD74 항체 또는 그 단편의 단클론항체(mAbs), 치료용 및 진단용 CD74 접합체 및 인간화, 키메라 및 인간 항-CD74 항체 또는 그 단편을 사용하는 B 세포 림프종 및 백혈병, CD74 항원 및 여러 가지 자가면역에 대하여 양성인 림프종 및 백혈병 이외의 악성종양 및 면역 조절불량 질환을 치료 및 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 암세포, 기생충 및 감염성 병원체와 같은 병원균 등의 유해 물질에 대한 적어도 하나 이상의 항-CD74 mAbs의 암(arm) 또는 그 단편 및 적어도 하나 이상의 멀티특이성 mAb의 암을 포함하는 다원자가 및/또는 멀티특이성 항-CD74 mAbs 및 그 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항원 펩티드에 접합되는 항-CD74 mAb 또는 그 단편에 관한 것이다. 인간화된, 키메라 및 인간 항-CD74 mAbs, 그 단편 및 이들의 접합체는 단독 또는 다원적인 치료요법의 일부로 투여된다. 본 발명은 인간화된, 키메라 및 인간 항-CD74 항체 및 다원자가 및/또는 멀티특이성 항-CD74 mAb 및 그 단편 및 그들의 치료용, 진단용 및 항원용 접합체를 인코딩하는 DNA 서열; 및 상기 DNA 서열을 함유하는 벡터 및 숙주 세포; 및 인간화된, 키메라 및 인간 항-CD74 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 뮤린 LL1의 중쇄 및 경쇄 변이부의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. 도 1A는 RT-PCR에 의해 증폭한 LL1VH의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. 도1B는 5'-RACE에 의해 획득한 LL1Vk의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. DNA 서열에 일치하여 인코드되는 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열 아래에 하나의 알파벳 코드로 표기하였다. 뉴클레오타이드의 번호는 오른쪽 측면에 있다. CDR 영역의 아미노산 잔기는 굵게 밑줄 그어 표시하였다. Kabat의 Ig 분자 번호는 상기 아미노산 잔기 번호에 의해 보여지는 아미노산 잔기를 이용하였다. 특정 아라비아 숫자로 표기된 알파벳에 의해 번호가 매겨진 잔기는 Kabat 번호표에 의해 정의된 삽입 잔기를 가리킨다. 상기 삽입 잔기는 앞선 아라비아 숫자와 동일한 알파벳으로 번호가 매겨진다. 예를 들면, 도 1A에서 잔기 82A, 82B 및 82C는 82A, B 및 C를 가리킨다.
도 2는 Sp2/0 세포에서 발현되는 키메라 LL1(cLL1)의 중쇄 및 경쇄 변이부의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. 도 2A는 cLL1VH의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. 도 2B는 cLL1Vk의 이중 가닥 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. DNA 서열과 일치하여 인코드되는 아미노산 서열은 하나의 알파벳 코드로 나타내었다. CDR 영역의 아미노산 잔기는 굵게 밑줄 그어 표기하였다. 뉴클레오타이드 및 아미노산의 번호는 상기 도 1과 같다. cLL1을 구성하는데 이용하는 제한효소 부위는 박스로 표시하였다.
도 3은 인간 항체, cLL1 및 hLL1의 경쇄 및 중쇄 변이부의 아미노산 서열을 일렬로 보여준다. 도 3A는 인간 항체 RF-TS3, cLL1 및 hLL1의 VH 아미노산 서열을 일렬로 보여주고, 도 3B는 인간 항체 HF-21/28, cLL1 및 hLL1의 Vk 아미노산 서열을 일렬로 보여준다. 작은 점은 인간 항체에 일치하는 잔기와 동일한 cLL1 잔기를가리킨다. 박스 영역은 CDR 영역이다. cLL1의 N-말단 및 C-말단 잔기(밑줄친)는 모두 스테이징(staging) 벡터를 사용하여 고정되고 인간 항체와 동일하지 않았다. Kabat의 Ig 분자 번호표는 도 1에서와 같이 사용되었다.
도 4는 Sp2/0 세포에서 발현되는 인간화된 LL1(hLL1)의 중쇄 및 경쇄 변이부의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. 도 4A는 hLL1VH의 DNA 및 아미노산 서열을 보여주고, 도 4B는 hLL1Vk의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. DNA 서열과 일치하여 인코드되는 아미노산 서열은 하나의 알파벳 코드로 나타내었다. CDR 영역의 아미노산 잔기는 굵게 밑줄 그어 표기하였다. Kabat의 Ig 분자 번호표는 도 1A 및 도 1B에서와 같은 아미노산 잔기를 사용하였다.
도 5는 hLL1VH 유전자의 구성을 보여주는 모식도이다. 올리고는 템플레이트로 이용되고, 프라이머는 화살표 선으로 보여진다. 화살표 끝은 3-말단을 가리킨다. 센스 DNA 가닥(템플레이트, 프라이머 및 PCR 생성물)은 실선이고, 안티센스 가닥은 점선이다. Vk 유전자는 동일하게 구성된다.
도 6은 뮤린 LL1과 cLL1이 결합하는 친화력을 비교하여 경쟁적 세포 표면에서 결합 정량한 결과를 보여준다. cLL1(삼각형) 또는 mLL1(마름모)의 농도 변화는125I로 라벨된 mLL1의 일정량과 혼합되었고, 4℃에서 1시간동안 Raji 세포로 배양하였다. 세포 표면에 결합하는 방사성 동위원소로 라벨된 mLL1은 세척한 후 계측하였다. cLL1 및 뮤린 LL1은 클론된 V 유전자를 확실하게 확인하는 Raji 세포에 방사성 동위원소로 라벨된 LL1의 결합을 위해 균등하게 잘 경쟁하였다.
도 7은 cLL1과 hLL1이 결합하는 친화력을 비교하기 위해 마이크로웰(microwell)로 코팅된 Raji 세포막에서 경쟁적으로 결합하는 정량 결과를 보여준다. hLL1(삼각형) 또는 cLL1(마름모)의 농도 변화는 HRP 접합된 LL1의 일정량과 혼합되고, 상온에서 1시간동안 추출한 Raji 막으로 코팅된 96-웰 미세역가측정(microtitration) 플레이트에서 배양하였다. 막 결합된 HRP-LL1를 측정하였다. HRP-LL1의 결합을 위해 균등하게 잘 경쟁한 hLL1 및 cLL1은 mAb LL1의 결합 특이성 및 친화력이 인간화된 LL1에서 보존되는 것을 나타낸다.
도 8은 Raji 세포의 기질에 결합하는125I로 라벨된 hLL1 및 mLL1의 섭리를 보여준다. 방사성 라벨된 hLL1(기호를 가지는 실선) 또는 mLL1(기호를 가지는 점선)은 Raji 세포와 배양하였고, 비결합된 항체는 세척하여 제거하였다. 그런 다음 세포를 정상적으로 배양하고, 세포(마름모 선), 배지로 분비된(삼각형 선) 또는 떨어진(원형 선) 세포와 결합된 방사성 라벨된 항체를 지시된 시간에서 측정하였다. 도 8A는 3일 이상 동안에 결합하는 항체의 섭리를 보여준다. 도 8B는 3시간 미만 동안에 결합하는 항체의 섭리를 보여준다. 이 데이터는 두 실험의 평균이다.
도 9는 Raji 세포에서 교차결합된 LL1 항체의 세포독성 효과를 보여준다. 5×105Raji 세포를 5㎍/ml의 mLL1, cLL1 또는 hLL1, 또는 어떠한 항체(Nil) 없이(패널의 맨 위 부분), 50㎍/ml의 α-mFc 또는 α-hFc 항체와 함께, 또는 패널의 오른쪽 끝에 있는 어떠한 항체와의 교차결합 없이 이루어진 배양 배지 1ml에 0일째 접종하였다. 총 세포수 및 생존 세포수는 3일 동안 매일 계측하였다. 생존 세포(사각형)의 비율(%) 및 생존 세포 비/0 시간에서의 생존 세포(마름모)를 계측하여 배양시간에 대한 그래프로 나타내었다.
도 10은 Daudi 세포에서 교차 결합된 hLL1의 세포독성 효과를 보여준다. 5×105Daudi 세포를 5㎍/ml의 hLL1 또는 hLL2(항-CD22, 내재화하는 항체), 또는 어떠한 항체(Nil) 없이(패널의 맨 위 부분), 50㎍/ml의 α-hFc 항체와 함께, 또는 패널의 오른쪽 끝에 있는 어떠한 항체와의 교차결합 없이 이루어진 배양 배지 1ml에 0일째 접종하였다. 총 세포수 및 생존 세포수는 3일 동안 매일 계측하였다. 생존 세포(사각형)의 비율(%) 및 생존 세포 비/0 시간에서의 생존 세포(마름모)를 계측하여 배양시간에 대한 그래프로 나타내었다.
본 발명은 항-CD74 항체 및 그 단편 및 그들의 항체 융합 단백질, 특히, 세포내에 신속히 내재화될 수 있는 키메라, 인간화된 또는 인간 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 항체끼리 서로 및/또는 다른 항체와 융합되는 항체 또는 그 단편을 함유하는 항-CD74 항체 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 부가적으로 진단용 또는 치료용 제제와 결합하는 본 발명에 의한 항-CD74 항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 함유하는 면역접합체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 항원 펩티드에 결합하는 본 발명에 의한 항-CD74 항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 함유하는 항체 접합체를 포함하는 백신에 관한 것이다.
또 본 발명은 암 지표 기질, 감염성 질환 세균 표면의 에피토프, 또는 혈액 또는 다른 체액내의 유해 물질에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 결합하는 본 발명에 의한 항-CD74 항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 함유하는 항체 접합체를 포함하는 양특이성 또는 멀티특이성 항체에 관한 것이다.
본 발명은 부가적으로 본 발명에 의한 CD74 항체 및 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질을 이용하여 질병을 치료 및 진단하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 CD74 항체 또는 그 단편 또는 그들의 융합 단백질, 면역접합체 및 항체 접합체 및 그들의 멀티특이성 항체를 인코딩하는 DNA 서열 및 상기 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터 및 숙주세포, 및 본 발명에 의한 이들 CD74 항체를 발현하는 방법에 관한 것이다.
1. 개요
본 발명은 단독, 접합체 또는 다원적인 치료(multimodal therapy) 요법의 일부로 다른 항체 자체 및 항체 치료용 접합체를 포함하는 다른 치료용 제제와 조합하여 투여하는 인간화된, 키메라 및 인간 항-CD74 mAb, 그 단편, 항체 융합 단백질 및 포유동물 환자, 인간 및 가축의 치료에 유용한 그들의 치료용 및 진단용 접합체를 제공한다. B-세포 악성 종양, 다른 CD74 양성 악성 종양 및 자가면역질환의 치료 및 진단 방법이 개시되어 있다.
2. 용어정의
이어지는 설명에서, 많은 수의 용어들이 사용되었고, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 상기 용어들을 아래와 같이 정의하였다.
본 발명에 기재된 "항체"는 온-길이(자연적으로 발생하거나 또는 정상 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 생성된 것이다) 면역글로불린 분자(IgG 항체 등) 또는 면역글로불린 분자의 면역적인 활성(특이적으로 결합) 부분, 이러한 항체의 단편을 말한다.
"항체 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv 및 scFv와 같은 항체의 일부이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인지되는 동일 항원과 결합한다. 예를 들면, 항-CD74 단클론항체 단편은 CD74의 에피토프에 결합한다. 또한 용어 "항체 단편"은 복합체를 생성하기 위하여 특이 항원과 결합하여 항체와 같은 역할을 하도록 어떤 합성적 또는 유전적으로 제조한 단백질을 포함한다. 예를 들면, 항체 단편은 중쇄 및 경쇄의 변이부를 구성하는 "Fv" 단편; 경쇄 및 중쇄 변이부가 펩티드 연결기("scFv 단백질")에 의해 연결되는 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자; 및 과변이부(hypervariable region)에 유사한 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인지부와 같이 변이부를 구성하는 분리 단편을 포함한다.
"항체 자체"는 일반적으로 치료용 제제와 접합하지 않는 항체 전체를 말한다. 항체 분자의 Fc 부분이 상보적 고착 및 ADCC(항체 의존 세포 독성) 등의 작동체 기능을 제공하기 때문에, 항체 자체가 세포를 용해하는 활성으로 대사한다. 그러나, Fc 부분은 세포 자가사멸과 같은 다른 대사작용으로 인한 치료적 기능을 요구하지 않는다. 항체 자체는 키메라, 인간화된 또는 인간 항체와 같은 특정한 재조합 항체뿐만 아니라, 다클론 및 단클론항체를 모두 포함한다.
"키메라 항체"는 하나의 종에서 유래되는 항체, 바람직하게는 설치류 항체의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions; CDRs)을 포함하는 변이 도메인을 가지는 재조합 단백질이다. 반면에 항체 분자의 특정 도메인은 인간 항체로부터 유래된다. 수의사가 이용할 경우, 키메라 항체의 일정한 도멘인은 고양이 또는 개와 같은 다른 종으로부터 유래된 것이 될 수 있다.
"인간화된 항체"는 하나의 종에서 유래된 항체의 CDRs(설치류 항체를 예로 들면)는 설치류 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 인간의 중쇄 및 경쇄 변이 도메인으로 전달되는 재조합 단백질이다. 항체 분자의 일정한 도메인은 인간 항체로부터 유도된다.
"인간 항체"는 항원성 콜라겐과 반응하는 특이 인간 항체를 제조하기 위해 "제작"된 형질전환 마우스로부터 획득한 항체이다. 이러한 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 자리의 성분은 내생적인 중쇄 및 경쇄 자리의 표적화된 분열을 가지는 배아 줄기 세포주로부터 유도된 마우스의 세포주로 도입된다. 상기 형질전환 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있으며, 인간 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하는데 사용할 수 있다. 형질전환 마우스로부터 인간 항체를 획득하는 방법은 Greenet al., Nature Genet.7: 13 (1994), Lonberget al., Nature368: 856 (1994), 및 Tayloret al., Int. Immun.6:579 (1994)에 기재되어 있다. 또한 온전한 인간 항체는 파지 전시 기술(phage display technology) 및 유전자 또는 염색체 형질감염 방법 등 당업계에 알려진 방법에 의해 제작된다. 생체 밖에서 비면역화된 도너(donor)에서 유래하는 면역글로불린 변이 도메인 유전자로부터 인간 항체 및 그 단편을 제조하는 방법은 McCaffertyet al., Nature348: 552-553 (1990)에 기재되어 있다. 상기 기술에서, 항체 변이 도메인 유전자는 필라멘트 박테리오파지의 주요한 또는 부수적 외피단백질(coat protein) 유전자에 프레임내에서 클론화되고, 파지 입자의 표면에서 기능성 항체 단편으로 전시된다. 필라멘트 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 복사본을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 이러한 특성을 보이는 항체를 인코딩하는 유전자의 선택으로 인한 것이다. 이런 방법으로 파지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 전시는 전체 구성의 다양성으로 수행될 수 있으며, Johnson and Chiswell,Current Opinion in Structural Biology3: 5564-571 (1993)에 개시되어 있다.
또한 인간 항체는 생체 밖에서 B 세포를 활성화함으로써 생성된다. 미국특허등록 제5,567,610호 및 제5,229,275호에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다.
"치료용 제제"는 항체 또는 항체 단편 또는 하부단편과 같은 항체의 부분과 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여되거나 또는 항체의 부분에 접합되는 분자 또는 원자이며, 질병을 치료하는데 이용된다. 치료용 제제의 예로는 항체, 항체 단편, 약물, 독소, 효소, 뉴클라아제, 호르몬, 면역조절제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 킬레이트, 붕소 화합물, 광활성 제제 또는 염료 및 방사성핵종을 포함한다.
"진단용 제제"는 항체 또는 항체 단편 또는 하부단편과 같은 항체의 부분에 접합하여 투여되는 분자 또는 원자이며, 항원을 함유하는 세포에 위치하여 질병을 진단하는데 이용된다. 유용한 진단용 제제로는 방사성 동위원소, 염료(바이오틴-스트렙타비딘(streptavidin) 복합체), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 자기공명영상(Magnetic resonance imaging, MRI)을 위한 증강제(파라마그네틱 이온 등)가 있으며, 이에 한정되는 아니다. 미국특허등록 제6,331,175호에는 MRI 기술 및 MRI 증강제와 접합된 항체의 제조방법이 기재되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. 바람직하게는 상기 진단용 제제는 방사성 동위원소, 자기공명영상에 이용되는 증강제 및 형광 화합물로 이루어진 군에서 선택된다. 항체 화합물을 방사성 금속 또는 파라마그네틱 이온과 제공하기 위하여, 이온결합 킬레이팅기 다수에 부착하는 긴 꼬리를 가지는 시약과 반응하는데 필요하다. 이러한 꼬리는 폴리리신, 다당류, 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 포르피린, 폴리아민, 왕관형 에테르(crown ether), 비스-티오세미카르바존(bis-thiosemicarbazones), 폴리옥심(polyoximes) 및 이러한 용도로 통상적으로 사용되는 알려진 그룹과 같은 킬레이팅기에 결합될 수 있는 곁가지(pendant group)를 가지는 다른 유도된 사슬 또는 유도될 수 있는 사슬 등의 폴리머가 될 수 있다. 킬레이트는 표준 화학반응을 이용하여 펩티드 항원과 커플된다. 상기 킬레이트는 일반적으로 면역반응성의 최소 손실 및 최소 집합체 및/또는 내부의 교차 결합을 가지는 분자와의 결합을 생성할 수 있는 그룹에 의해 항체와 결합한다. 항체에 킬레이트를 접합하는 다른 보다 특별한 방법 및 시약은 1989년 4월25일 등록된 미국특허등록 제4,824,659호(Hawthorne, "항체 접합체")에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. 특히 본 발명에서 사용하는 금속 킬레이트 조합은 2-벤질-DTPA 및 이들의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체를 포함하고, 방사능 영상용125I,131I,123I,124I,62Cu,64Cu,18F,111In,67Ga,68Ga,99mTc,94mTc,11C,13N,15O,76Br와 같이 60-4,000 keV의 일반적 에너지 범위에서 진단용 동위원소와 함께 사용된다. MRI에서 사용되는 망간, 철 및 가돌리늄 등의 비방사성 금속으로 복합체화되는 동일한 킬레이트는 본 발명에 의한 항체와 함께 사용된다. NOTA, DOTA 및 TETA와 같은 거대고리 킬레이트는 다양한 금속 및 방사성 금속과 함께 사용되고, 가장 바람직하게는 각각 갈륨, 이트륨 및 구리와 함께 사용된다. 이러한 금속 킬레이트 화합물은 해당 금속에 고리 크기가 맞추어져서 매우 안정하게 제조된다. 거대고리 폴리에테르와 같은 다른 고리형 킬레이트는 본 발명의 범주에 속하는 RAIT를 위한223Ra와 같이 핵종에 안정하게 결합하는데 중요하다.
"면역접합체"는 치료용 또는 진단용 제제를 가지는 항체 구성성분의 접합체이다. 진단용 제제는 방사성 또는 비방사성 라벨, 조영제(자기공명영상, 전산화 단층촬영술(Computed Tomography) 또는 초음파 등)을 포함하고, 상기 방사성 라벨은 감마-, 베타-, 알파-, 오거 전자 또는 양성자 방출 동위원소를 들 수 있다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 일반적으로, 유전자 발현은 경쟁적 또는 유도적 프로모터, 조직 특이적 조절인자 및증강제를 포함하는 일정한 조절 요소의 조절하에 수행된다. 이러한 유전자는 "실시가능하게 연결되는" 조절 요소가 된다.
"재조합 숙주"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 가지는 원핵세포 또는 진핵세포가 될 수 있다. 또한 상기 용어는 세균, 효모 및 포유동물과 같은 원핵세포 또는 진핵세포뿐만 아니라, 염색체, 숙주세포의 게놈 또는 숙주세포의 세포 내에 복제된 유전자를 가지도록 일반적으로 제작된 형질전환 동물을 포함한다. 적당한 포유동물 숙주세포는 SP2/0 세포 및 NS0 세포와 같은 골수종 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, 하이브리도마 세포주 및 항체를 발현하는데 사용되는 다른 포유동물 숙주 세포를 포함한다. 또한 본 발명에서 MAbs 및 다른 융합 단백질을 발현하기 위하여 CHO, COS, Vero, Hela, BHK 및 SP2 세포주와 같은 통상적인 포유동물 세포주에 비교하여 2-200배 이상의 재조합 단백질을 생산하는 PER.C6 인간세포주를 사용하였으며, 이는 국제공개특허 제WO 0063403 A2호에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용한 용어 "항체 융합 단백질"은 같은 또는 다른 종인 둘 이상의 같은 또는 다른 단일사슬 항체 또는 항체 단편 부분이 연결되도록 재조합하여 제조한 항원 결합 분자를 말한다. 융합 단백질의 원자가는 일원자가, 이원자가, 삼원자가 또는 사원자가와 같이, 융합 단백질이 단일 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 암(arm) 또는 부위의 수를 나타낸다. 항체 융합 단백질의 다원자가는 항원에 결합하는 다수의 상호작용의 이점을 가지고, 항원에 결합하려는 욕구를 증가시킨다. 특이성은 단일특이성, 양특이성, 삼특이성, 멀티특이성과 같이, 항체 융합 단백질이 항원 또는 에피토프와 결합할 수 있는 수를 의미한다. 이들 정의에 사용하는 천연 항체인 IgG를 예로 들면, IgG는 두 개의 결합 암(arm)을 가지고 있기 때문에 이원자가이지만, 하나의 에피토프와 결합하기 때문에 단일특이성이다. 단일특이성, 다원자가 융합 단백질은 에프토프를 위한 하나 이상의 결합 부위를 가지지만, 하나의 에피토프에만 결합하는 것으로, 동일한 항원과 작용하는 두 개의 결합 부위를 가지는 디아바디(diabody)가 여기에 속한다. 융합 단백질은 단일 항체 구성성분, 다른 항체 구성성분의 다원자가 또는 멀티특이성 조합 또는 같은 항체 구성성분의 멀티플 복제물을 포함한다. 상기 융합 단백질은 항체 또는 항체 단편 및 치료용 제제를 부가적으로 포함한다. 상기 융합 단백질에 적절한 치료용 제제로는 면역조절제("항체-면역조절제 융합 단백질") 및 독소("항체-독소 융합 단백질")을 포함한다. 바람직한 독소는 리보뉴클라아제(RNase), 바람직하게는 재조합 RNase를 포함한다.
"멀티특이성 항체"는 같은 항원, 또는 헵텐 및/또는 항원 또는 에피토프에서 두 개의 다른 항원, 두 개의 다른 에피토프와 같이 다른 구조를 가지는 적어도 두 개 이상의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 하나의 특이성은 B 세포, T 세포 골수종-, 플라즈마- 및 비만세포(mast-cell) 항원 또는 에피토프에 관여한다. 또 다른 특이성은 B-세포의 CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74 및 CD22와 같이 동일한 세포 유형에서 다른 항원에 작용한다. 멀티특이성, 다원자가 항체는 하나 이상의 결합 부위를 가지는 구조물이며, 상기 결합 부위는 다른 특이성을 가진다. 예를 들면, 디아바디는 하나의 결합 부위가 하나의 항원과 반응하고,다른 결합 부위가 다른 항원과 반응한다.
"양특이성 항체"는 다른 구조를 가지는 두 개의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 양특이성 항체(bsAb) 및 양특이성 항체 단편(bsFab)은 B 세포, T 세포 골수종-, 플라즈마- 및 비만세포(mast-cell) 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 암(arm) 및 치료용 또는 진단용 제제를 생산하는 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 다른 암(arm)을 가진다. 다양한 양특이성 융합 단백질은 분자공학(molecular engineering)을 이용하여 제조될 수 있다. 하나의 형태에서, 양특이성 융합 단백질은 하나의 항원과 결합하는 단일 결합 부위를 가지는 scFv 및 두 번째 항원과 결합하는 단일 결합 부위를 가지는 Fab 단편과 같은 것들로 이루어지는 일원자가이다. 또 다른 형태에서, 양특이성 융합 단백질은 하나의 항원에 결합하는 결합 부위를 가지는 IgG 및 두 번째 항원에 결합하는 두 개의 결합 부위를 가지는 두 개의 scFv로 이루어진 이원자가이다.
"개화된(caninized) 또는 고양이화된(felinized) 항체"는 단클론항체의 설치류(또는 다른 종)에서 상보적으로 결정하는 영역이 설치류(또는 다른 종) 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 변이 사슬에서 각각 개 또는 고양이의 면역글로불린 변이 도메인으로 형질전환된 재조합 단백질이다.
"가축"은 말, 소, 양, 염소, 라마(llamas), 알파카(alpacas), 돼지 및 반려동물 등의 큰 동물을 포함한다.
"반려동물(伴侶動物:companion animal)"은 애완동물로 기르는 동물을 포함한다. 우선 강아지와 고양이 등이 포함되고, 기니아 피그, 햄스터, 쥐 및 흰족제비 등의 작은 설치류 및 원숭이와 같은 유인원의 영작류도 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 반려동물로 개 또는 고양이를 이용하였다.
3. 키메라, 인간화된 및 인간 항체를 포함하는 단클론항체의 제조
단클론항체(MAbs)는 특정 항원에 대한 항체의 동종 집단이며, 상기 항체는 한가지 유형의 항원 결합 부위를 포함하고, 항원결정부위(antigenic determinant)에서 하나의 에피토프에만 결합한다. 특이 항체에 대한 설치류의 단클론항체는 당업계에 잘 알려진 방법으로 획득하였다. Kohler and Milstein,Nature256: 495 (1975) 및 Coliganet al.(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, 2.5.1-2.6.7 쪽(John Wiley & Sons 1991)[이하 "Coligan"이라 한다] 참조. 간단하게, 단클론항체는 항원을 포함하는 조성물을 마우스에 주사하고, 혈청 검체를 제거하여 항체 생산의 유무를 확인한 후, B 림프구를 얻기 위하여 비장을 제거하고, 하이브리도마를 제조하기 위하여 B 림프구와 골수종 세포를 융합한 다음, 하이브리도마를 클로닝하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선택한 후, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양한 다음, 및 배양한 하이브리도마로부터 항체를 분리하는 과정을 통해 제조할 수 있다.
MAbs는 다양하게 알려진 기술에 의해 배양한 하이브리도마로부터 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 분리 기술은 단백질-A 세파로오스(Sepharose)를 이용한 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 및이온교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들면, Coligan 2.7.1-2.7.12쪽 및 2.9.1-2.9.3쪽 참조. 또한 Baineset al., "Purification of Immunoglobulin G(IgG)", in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, 79-104쪽(The Humana Press, Inc. 1992) 참조.
면역원에 대한 항체의 초기 상승 후, 항체는 서열화되고, 순차적으로 재조합 기술에 의해 제조된다. 뮤린 항체 및 항체 단편의 인간화된 및 키메라화는 당업계에 잘 알려진 통상적인 기술로 수행하였다. 예를 들면, 인간화된 단클론항체는 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 변이 사슬로부터 인간 변이 도메인으로 마우스의 상보적으로 결정하는 영역을 형질전환한 다음, 뮤린 대조물(counterparts)의 구조영역에 인간 잔기를 치환하여 생산한다. 인간화된 단클론항체로부터 유래된 항체 구성성분의 이용은 뮤린의 일정한 영역의 면역원성(immunogenicity)과 연관된 잠재적 문제를 방지하였다.
뮤린 면역글로불린 변이 도메인을 클로닝하는 일반적인 기술은 Orlandiet al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA86: 3833 (1989)에 공개되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. Leunget al., Hybridoma13: 469(1994) 에서는 LL2 단클론항체인 항-CD22 항체의 VK및 VH도메인을 인코딩하는 DNA 서열을 각각 인간의 κ 및 IgG1일정한 영역 도메인과 조합하여 LL2 키메라를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 또한 상기 논문에서는 LL2 경쇄 및 중쇄 변이부, VK및 VH각각의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 인간화된 MAbs를 생산하는 기술은 Joneset al., Nature321: 522(1986), Riechmannet al., Nature332: 323 (1988), Verhoeyenet al., Science239: 1534(1988), Carteret al., Proc Nat'l Acad. Sci. USA89:4285 (1992), Sandhu,Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), 및 Singeret al., J. Immun.150:2844 (1993)에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 각각을 참고문헌으로 통합하여 수록하였다.
이 부분에서, 본 발명은 CD74에 결합하고, 진단법 및 치료법으로 사용할 수 있는 키메라, 인간화된 및 인간 항체 및 그 단편을 기재한다. 인간화된 항체 및 항체 단편은 "항-CD20 항체 및 그 융합 단백질 및 그 이용방법"이라는 제목 미국 가출원, 대리인 처리번호 제18733/1073호, 미국가출원번호 제60/356,132호, 미국가출원번호 제60/416,232호 및 대리인 처리번호 제18733/1155호에 개시되어 있으며; III 종 항-암태아성 항원 항체(anti-carcinoembryonic antigen antibody; 항-CEA 항체)인 hMN-14 항체는 미국특허 제5,874,540호에 기재되어 있고; Mu-9 항체는 미국특허출원 제10/116,116호에 기재되어 있으며; AFP 항체는 미국가출원번호 제60/399,707호에 기재되어 있고; PAM4 항체는 "단클론항체 cPAM4"라는 제목의 대리인 처리번호 제18733/1102호인 미국가출원에 기재되어 있으며; RS7 항체는 미국가출원번호 제60/360,229호에 기재되어 있고; 및 CD22 항체는 미국특허 제5,789,554호 및 제6,187,287호 및 미국특허출원 제09/741,843호 및 제09/988,013호에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 전부 참고문헌으로 통합 수록하였다.
키메라 항체는 설치류 항체와 같은 동물의 한 종으로부터 유래된 CDRs를 포함하는 변이 도메인을 가지는 재조합 단백질이다. 반면에, 일정한 도메인 등의 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래된다. 따라서, 키메라 단클론항체는 키메라 MAb의 변이 도메인내 뮤린 FR의 서열을 하나 이상의 다른 인간 FR과 교체하여 인간화될 수 있다. 특히, 마우스 CDRs는 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 변이 사슬을 인간 항체의 일치하는 변이 도메인으로 전달된다. 마우스 CDRs이 인간 FRs로 간단히 전달되어 종종 항체 친화력의 감소 또는 손실이 발생하기 때문에, 뮤린 항체의 근본 친화력을 회복하기 위하여 부가적 조작이 요구된다. FR 영역내 하나 또는 그 이상의 일부 인간 잔기를 그들의 뮤린 대조물과 교환하여 에피토프에 대한 우수한 결합 친화력을 가지는 항체를 획득할 수 있다. Tempestet al., Biotechnology9:266(1991) 및 Verhoeyenet al., Science239:1534 (1998) 참조. 특이적 에피토프에 대한 인간화된, 키메라 및 인간 MAb의 친화력은 CDRs의 돌연변이로 증가하고, 항체의 저용량은 돌연변이 이전의 낮은 친화력 MAb의 고용량으로 효과를 나타낼 수 있다. 국제공개특허 제WO 0029584 A1호 참조.
본 발명에 의한 항체를 제조하는 또 다른 방법은 형질전환 가축의 모유에서 생성할 수 있다. Colman, A.,Biochem. Soc. Symp., 63: 141-147, 1998; 미국특허등록 제5,827,690호를 참조; 모두 명세서에서 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. 각각 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 쌍을 인코딩하는 DNA 단편을 가지는 두 개의 DNA 구조물을 제조한다. 상기 DNA 단편은 포유동물 상피 세포에서 선택적으로 발현하는 프로모터 서열을 가지는 발현 벡터에서 복제된다. 실시예에서는 토끼, 소 및 양 카제인 유전자 유래의 프로모터, 소의 α-락토글로불린 유전자, 양의 β-락토글로불린 유전자 및 쥐의 유청 산 단백질 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 삽입 단편은 포유동물 특이 유전자 유래의 동종 게놈 서열에 의해 3' 측면에 위치한다. 이것은 폴리아데닐화 부위 및 전사 안정화 서열을 제공한다. 상기 발현 카세트를 포유동물 난자의 수정된 전핵(pronuclei)으로 보조주사한 다음, 수령 암컷의 자궁으로 이식한 후 잉태된다. 출생 후 자손은 써던(Southern) 정량에 의해 이식유전자 존재하에 스크리닝된다. 항체가 존재하기 위해서는, 중쇄 및 경쇄 유전자가 모두 같은 세포에서 동시에 발현되어야 한다. 이식유전자의 암컷에서 유래된 모유는 당업계에 알려진 표준 면역학적 방법으로 항체 또는 항체 단편의 존재 및 기능성이 분석된다. 상기 항체는 당업계에 알려진 표준 면역학적 방법을 이용하여 모유로부터 정제할 수 있다.
인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD74 항체를 가지는 조합 치료를 위한 본 발명에 의한 온전한 인간 항체는, 예를 들면, 인간 항-CD74 MAb 또는 항-CD22, 항-CD19, 항-CD23, 항-CD20 또는 항-CD21 MAbs와 같은 다른 인간 항체는 형질전환 비인간 동물에서 얻을 수 있다. Mendezet al., Nature Genetics,15:146-156 (1997); 미국특허등록 제5,633,425호 참조; 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. 예를 들면, 인간 항체는 인간 면역글로불린 부위를 가지는 형질전환 마우스에서 재생된다. 마우스 체액성 면역 시스템은 내재적 면역글로불린의 불활성화 및 인간 면역글로불린 부위 도입으로 인해 인간화된다. 인간 면역글로불린 부위는 엄청난 복합체이고, 인간 게놈의 거의 0.2%를 차지하는 많은 수의 분리성 단편을 포함한다. 항체의 적절한 레퍼토리를 생성하는 특성이 있는 형질전환 마우스를 확보하기 위하여, 인간 중쇄 및 경쇄 부위의 큰 부분은 마우스 게놈으로 도입되어야 한다. 생식세포주(germline) 내에 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 부위를 가지는 효모 인공 염색체(YACs)의 생성을 시작으로 순차적 과정을 거쳐 수행한다. 각각 약 1Mb 크기로 삽입되기 때문에, YAC 구조물은 면역글로불린 부위의 겹쳐지는 단편의 동종 재조합을 요구한다. 중쇄 부위를 갖는 것과 경쇄 부위를 갖는 두 개의 YACs를 마우스의 배아 줄기 세포와 함께 YAC를 함유하는 효모 등형질체(spheroplast)의 융합을 통해 개별적으로 마우스에 도입한다. 배아 줄기 세포 복제물은 마우스 배반포(blastocyst)로 미세주입된다. 결과적으로 키메라 수컷은 그들의 생색세포주를 통해 YAC를 전이하는 능력으로 스크린되고, 뮤린 항체 생성에서 마우스 결함을 낳는다. 중쇄 부위를 갖는 것과 경쇄 부위를 갖는 두 개의 형질전환 균주가 생성되어, 면역반응을 하는 인간 항체를 생산하는 자손을 창출한다.
게다가 최근 양특이성 MAb를 제조하는 방법은 일반적인 면역글로불린 동위원소 보다 더 강한 교차결합을 위하여 부가적 시스테인 잔기를 가지는 재조합 MAbs 기술을 포함한다. FitzGeraldet al., Protein Eng.10(10):1221-1225, 1997 참조. 또 다른 접근은 이중 특이성을 필요로 하는 둘 또는 그 이상의 다른 단일 사슬 항체 또는 항체 단편에 결합하는 재조합 융합 단백질 기술이다. Colomaet al., Nature Biotech.15: 159-163, 1997 참조. 양특이성 융합 단백질의 변이성은 분자 공학을 이용하여 제조한다. 또 하나의 형태로, 양특이성 융합 단백질은 하나의 항원과 결합하는 단일 결합 부위를 가지는 scFv 및 두 번째 항원과 결합하는 단일 결합 부위를 가지는 Fab 단편과 같은 것들로 이루어지는 일원자가이다. 또 다른 형태에서, 양특이성 융합 단백질은 하나의 항원에 결합하는 결합 부위를 가지는 IgG 및두 번째 항원에 결합하는 두 개의 결합 부위를 가지는 두 개의 scFv로 이루어진 이원자가이다.
둘 또는 그 이상의 다른 단일 사슬 항체 또는 항체 단편에 연결하는 양특이성 융합 단백질은 동일한 방법으로 제조한다. 재조합 방법은 융합 단백질 변이체를 만드는데 사용된다. 예를 들면, 인간화된 단클론항체 항-CD74 항체에서 유래된 Fab 단편 및 뮤린 항-diDTPA에서 유래된 scFv를 포함하는 융합 단백질를 제조할 수 있다. GGGS와 같은 유동성 연결기는 scFv를 항-CD74 항체 중쇄의 일정한 영역에 연결한다. 선택적으로 scFv는 또 다른 인간화된 항체의 경쇄의 일정한 영역에 연결될 수 있다. scFv에서 Fd 중쇄의 프레임내 연결을 위하여 적절한 필수 연결기 서열이 PCR 반응을 통해 Vλ 및 Vκ 도메인으로 도입된다. scFv를 인코딩하는 DNA 단편은 CH1 도메인을 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 스테이징 벡터(staging vector)와 결찰된다. 생성된 scFv-CH1 구조물은 절단된 후 항-CD74 항체의 VH 도메인을 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 벡터와 결찰된다. 생성된 벡터는 양특이성 융합 단백질의 발현을 위한 포유동물 세포와 같이 적당한 숙주 세포를 형질감염하는데 사용된다.
4. 항체 단편의 제조
특이적 에피토프를 인지하는 항체 단편은 알려진 기술에 의해 제조할 수 있다. 항체 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv와 같이 항원에 결합하는 항체의일부이다. 다른 항체 단편은 항체 분자의 펩신 소화로 인해 생성되는 F(ab')2및 F(ab')2의 이황화물 결합이 환원되어 생성되는 Fab' 단편을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택적으로 Fab'발현 라이브러리는 요구되는 특이성을 가지는 단클론 Fab' 단편의 빠르고 쉽게 동정하여 제조된다(Huseet al., 1989,Science, 246: 1274-1281). 본 발명에서는 항체 및 항체 단편을 포함한다.
단일 사슬 Fv 분자(scFv)는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함한다. VL 및 VH 도메인은 표적 결합 부위를 생성하기 위해 연결된다. 이들 두 도메인은 펩티드 연결기(L)에 의해 공유결합으로 연결된다. scFv 분자는 VL 도메인이 scFv 분자의 N-말단 부분이면 VL-L-VH로 표시되고, VH 도메인이 scFv 분자의 N-말단 부분이면 VH-L-VL로 표시된다. scFv 분자를 제조하고 적당한 펩티드 연결기를 제작하는 방법은 미국특허등록 제4,704,692호 및 제4,946,778호, R. Raag and M. Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB Vol 9:73-80(1995) 및 R.E. Bird and B.W. Walker,"Single Chain Antibody Variable Region", TIBTECH, Vol 9:132-137(1991)에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다.
항체 단편은 온길이 항체를 단백질 가수분해 또는E. coli또는 상기 단편을 코딩하는 DNA의 또 다른 숙주에서 발현하여 제조할 수 있다. 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 온길이 항체를 펩신 또는 파파인 소화하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 F(ab')2로 표시되는 5S 단편을 생성하기 위해 펩신과 항체를 효소분해하여 제조할 수 있다. 이 단편은 티올 환원제를 사용하여 더 분해할 수 있으며, 임의로 설피드릴(sulfhydryl)기를 위한 차단기가 다이설파이드 결합을 분해하여 3.5S Fab' 일원자가 단편을 제조한다. 선택적으로 파파인을 사용하는 효소 분해는 두 개의 일원자가 Fab 단편 및 하나의 Fc 단편을 직접 제조한다. 이러한 방법은 Goldenberg에 의한 미국특허 제4,036,946호 및 제4,331,647호에 기재되어 있으며, 본 발명에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. Nisonoffet al.,Arch Biochem. Biophys.89: 230(1960); Porter,Biochem. J.73:119(1959), Edelmanet al.,in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422(Academic PRess 1967), 및 Coligan 2.8.1-2.8.10쪽 및 2.10.-2.10.4쪽.
항체 단편의 또 다른 형태는 단일 상보성 결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR은 항체와 결합하고 변이부의 잔여부분 보다 더 많은 가변적인 에피토프에 구조적으로 상보적인 항체 변이부의 단편이다. 따라서, CDR을 때때로 고도 변이부(hypervariable regions)라고 일컫는다. 변이부는 CDRs를 포함한다. CDR 펩티드는 대상 항체의 CDR을 인코딩하는 구조 유전자에 의해 제조할 수 있다. 이러한 유전자는 항체 생성 세포의 RNA로부터 변이부를 합성하는 중합효소연쇄반응을 이용하여 제조할 수 있다. Larricket al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology2: 106(1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritteret al.(eds.), pages 166-179(Cambridge University Press 1995); 및 Wardet al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: RPINCIPLES AND APPLICATIONS, Birchet al., (eds.),pages 137-185(Wiley-Liss, Inc. 1995) 참조.
일원자가 경쇄-중쇄 단편을 생성하기 위하여 중쇄를 분리하는 것과 같이 항체를 분해하는 다른 방법은 단편을 분해하거나, 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술을 사용할 수 있으며, 상기 단편은 항체 상호작용에 의하여 인지된 항원에 결합한다.
5. 항-CD74 항체
본 발명에 의한 항-CD74 mAbs는 CD74 항원에 대한 특이성을 가지는 특이적 뮤린 CDRs를 함유한다. 본 발명의 항-CD74 mAbs는 인간화된, 키메라 또는 인간 mAbs이고, 뮤린 항-CD74 mAb, 뮤린 LL1 mAb의 CDR 아미노산을 함유한다. 인간화된 항-CD74 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS을 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT을 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 CDR을 포함한다. 또한 인간화된 항-CD74 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG을 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY을 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함하는 상기 인간화된 mAb의 중쇄 변이부를 포함한다. 인간화된 mAb는 B-림프구, 단핵구 및 조직구, B-세포 림프종 및 백혈병, 이들 mAbs의 신속한 내재화 및 대사분해로 생성되는 골수종 세포, 그 단편 또는 mAb 접합체와 같이 실제로 MHC II종 가변 사슬인 Ii가 세포표면에 존재하는 CD74에 대한 특이성을 보유한다.
하나의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 CD74 항체는 뮤린 항-CD74(mLL1)의 상보성 결정 영역(CDRS) 및 인간 항체의 구조영역(FR)을 포함하는 경쇄 및 중쇄 변이부를 포함하는 인간화된 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편이며, 인간화된 mAb의 경쇄 변이부는 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS을 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT을 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 CDR을 포함하고, 상기 인간화된 mAb의 중쇄 변이부는 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG을 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY을 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함한다. 뮤린 CDR의 중쇄 및 경쇄 변이부는 각각 도 1A 및 도 1B에 도시하였다. 인간 FR의 경쇄 및 중쇄 변이부는 뮤린 mAb의 일치하는 FR로부터 하나 이상의 아미노산이 치환되어 CD74에 대한 특이성을 유지하도록 변형된다. 보다 특이적으로, 뮤린 mAb에서 유래한 하나 또는 그 이상의 특이 아미노산은 도 3B의 cLL1Vk 서열의 뮤린 경쇄 변이부의 아미노산 잔기 2, 3, 4, 46, 87 및 100에 의해 동정되고, 도 3A의 cLL1VH 서열의 뮤린 중쇄 변이부의 아미노산 잔기 5, 37, 38, 46, 68, 91 및 93는 특이성을 유지하기 위하여 인간화된 항-CD74의 인간 FR에서 유지된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 도 4A의 중쇄 변이부 및 도 4B의 경쇄 변이부를 가지는 인간화된 항-CD74 mAb, 인간화된 LL1(hLL1) 또는 그 단편은 본 발명에서 개시된 방법에서 이용된다. 보다 특이적으로, 인간화된 항-CD74 mAb 또는 그 단편은 인체 또는 그 일부의 경쇄 및 중쇄 특정부를 가진다. 부가적으로, 본 발명에기재된 인간화된 항-CD74 mAb 또는 인간화된 항-CD74 mAb 또는 그 단편 중 하나의 단편이 인간화된 IgG1이 될 수 있다.
인간화된 항-CD74 mAb가 바람직하지만, 키메라 항-CD74(cCD74) mAb 또는 그 단편도 또한 본 발명의 범위에 속한다. 바람직한 실시예에서, 키메라 항-CD74(cCD74) 단클론항체, 또는 그 단편은 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 키메라 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편은 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 키메라 항-CD74 mAb는 뮤린 항-CD74 mAb의 상보성 결정 영역(CDR) 및 뮤린 항-CD74 mAb의 구조영역(FR)을 포함하는 경쇄 및 중쇄 변이부 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 특정부를 포함하며, 상기 키메라 mAb의 경쇄 변이부는 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 CDR을 포함하며, 상기 키메라 mAb의 중쇄 변이부는 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함한다. 바람직한 키메라 항-CD74 mAb 또는 그 단편은 도 2A의 중쇄 변이부 및 도 2B의 경쇄 변이부를 포함한다.
또한 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 인간 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부를 포함하는 인간 항-CD74(huCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 본 발명에 범주에 속한다. 또한 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함하는 상기 인간 mAb의 중쇄 변이부를 포함하는 인간 항-CD74(huCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편도 본 발명에 범주에 속한다. 보다 바람직하게는 본 발명에서는 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 변이부 및 특정부를 포함하는 인간 항-CD74(huCD74) 단클론항체 또는 그 단편을 개시하고 있다. 여기에서, 인간 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 huCD74 CDR은 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하며, 중쇄 변이부는 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함한다.
본 발명에 의한 각 인간, 키메라 또는 인간화된 항-CD74 mAb는 바람직하게는 특정부가 인간 IgG1이지만, 상기 IgG1이 각각 인간 IgG1, 키메라 IgG1 또는 인간화된 IgG1으로 간주되는 IgG1이 바람직하다. 특히, 인간화된 CD74 mAb인 hLL1은 인간 IgG1 유래의 일정 도메인 및 경첩 부위를 가진다. 바람직하게는, 키라메 및 인간 LL1 mAb 모두 같은 일정 도메인 및 경첩 부위를 가진다. 그러나, IgG1의 특정부를만들기 위해서 인간 IgG2a, IgG3 또는 IgG4의 인간 특정부로 교체하여 변형시킬 수 있다.
또한 본 발명은 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 CDR을 포함하는 뮤린 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편에 관한 것이다. 또한 상기 뮤린 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편은 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 뮤린 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편은 뮤린 항-CD74(mLL1)의 상보성 결정 영역(CDRs) 및 뮤린 항-CD74 항체의 구조영역(FR)을 포함하며, 여기에서, 상기 뮤린 mAb의 경쇄 변이부는 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하며, 상기 뮤린 mAb의 중쇄 변이부는 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함한다.
본 발명에 의한 인간, 키메라, 인간화된 또는 뮤린 항-CD74 mAbs 또는 그 단편은 다음과 같은 특성을 하나 이상 가진다: 항원 CD74와 특이적으로 결합하고 반응하며, CD74와의 결합이 CD74에 특이적이거나 CD74와 반응하는 그 단편의 항체에 의해 차단되고; 배양시 Raji 림프종 세포에 의해 내재화되며; 및 염소의 항혈청과교차결합하여 뮤린 IgG1 mAb의 Fc와 반응하는 경우, 세포 배양에서 Raji 세포의 자가 사멸을 유도한다.
인간, 키메라 또는 인간화된 항-CD74 mAb의 단편은 F(ab')2, Fab, scFv, Fv, 또는 상기 F(ab')2, Fab, scFv 또는 Fv의 경쇄 및 중쇄를 일부 또는 전부 사용한 융합 구조물이 될 수 있다. 상기 단편이 CD74에 결합하는 것이 가장 중요하다.
6. 멀티특이성 및 다원자가 항체
본 발명에 기재된 항-CD74 항체 및 조합 치료에서 사용하기 위하여 다른 특이성을 가지는 다른 항체는 또한 멀티특이성 항체(CD74 에피토프 또는 항원에 결합하는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 CD74의 다른 에피토프 또는 또 다른 항원에 결합하는 적어도 하나 이상의 결합부위를 포함) 및 다원자가 항체(같은 에피토프 또는 항원에 다수의 결합 부위를 포함), 또한 다원자가 및 멀티특이성이 모두 될 수 있는 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 인간화된, 키메라, 인간 또는 뮤린 항-CD74 mAb 또는 그 단편의 넷 또는 그 이상의 Fvs 또는 Fab's를 함유한다. 부가적으로, 또 다른 바람직한 항체 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 인간화된, 키메라, 인간 또는 뮤린 항-CD74 mAb 또는 그 단편의 하나 또는 그 이상의 Fvs 또는 Fab's 및 B-세포 악성종양을 치료하기 위한 CD19, CD20 또는 CD22와 같이 B-세포계 항원으로부터 선택된 종양 지표; 흑색종의 S100 등의 다른유형의 악성종양을 유발하는 다른 CD74 양성 세포와 같이 CD74 항원이 아닌 종양 세포 지표에 특이적인 또 다른 항원에 특이적인 항체에서 유래하는 하나 또는 그 이상의 Fvs 또는 Fab's를 함유한다. 또한 상기 종양 세포 지표는 HLA-DR, CD30, CD33, CD52, MUC1 및 TAC로 이루어진 군에서 선택된 비-B-세포계 항원이 된다.
또한 본 발명은 양특이성 또는 멀티특이성 항체를 제공한다. 여기에서, 본 발명의 항-CD74 mAbs 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질은 암 지표 기질, 감염성 질환균 표면의 에피토프 또는 혈액 또는 체액의 유해 물질에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 결합된다. 본 발명의 양특이성 및 멀티특이성 항체는 다양한 유해 물질의 제거를 유도하는 방법에 유용하며, 여기에서, 양특이성 항체는 병원성균과 같은 유해 물질에 대하여 적어도 하나 이상의 특이성을 가지고, CD74, HLA II종 가변 사슬(Ii)에 대하여 적어도 하나 이상의 특이성을 가지며, 상기 HLA II종 가변 사슬은 1999년 5월 19일자로 출원된 "양특이성 항체를 이용한 치료"라는 제목의 미국특허출원 제09/314,135호에 자세히 기재되어 있으며, 본 명세서에서는 전체를 참고문헌으로 통합 수록하였다.
본 발명에서는 표적화된 세포 지표에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 결합부위 및 표적화할 수 있는 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하는 이상의 결합부위를 가지는 양특이성 항체 또는 그 단편을 제공한다. 상기 표적화할 수 있는 접합체는 양특이성 항체 또는 항체 단편의 적어도 하나 이상의 결합 부위에 의해 인지되는 적어도 하나 이상의 에피토프를 포함하거나 또는 생산하는 담체 부분을 포함한다.
상기에 기재된 양특이성 항체 및 항체 단편을 제조하는데 다양한 재조합 방법을 사용할 수 있다.
또한 항-CD74 다원자가 항체 역시 본 발명의 예상 범주에 속한다. 상기 다원자가 표적 결합 단백질은 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드의 결합으로 구성된다. 첫 번째 폴리펩티드는 첫 번째 단일 사슬 Fv 분자가 첫 번째 면역글로불린류의 도메인에 공유적으로 연결되는 것을 포함하며, 바람직하게는 면역글로불린 경쇄 변이부 도메인에 연결되는 것을 포함한다. 두 번째 폴리펩티드는 두 번째 단일 사슬 Fv 분자가 두 번째 면역글로불린류의 도메인에 공유적으로 연결되는 것을 포함하며, 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 변이부 도메인에 연결되는 것을 포함한다. 첫 번째 및 두 번째 단일 사슬 Fv 분자는 각각 표적 결합 부위를 생성하고, 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린류의 도메인은 세 번째 표적 결합 부위를 생성하는데 관여한다.
VL-L-VH 접합을 가지는 단일 사슬 Fv 분자는 VH-L-VL 접합을 가지는 또 다른 단일 사슬 Fv 분자와 결합하여 이원자가 다이머를 생성한다. 이 경우, 첫 번째 scFv의 VL 도메인 및 두 번째 scFv 분자의 VH 도메인이 결합하여 하나의 표적 결합 부위를 생성하는 반면에, 첫 번째 scFv의 VH 도메인 및 두 번째 scFv 분자의 VL 도메인이 결합하여 다른 표적 결합 부위를 생성한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 두 개가 하나의 표적에 대한 친화력을 가지고 하나는 진단용 및/또는 치료용 제제를 위한 담체를 제조 및 부착할 수 있는 헵텐에 대한 친화력을 가지는 세 개의 결합부위를 생성하기 위해 비공유로 결합된 두 개의 이종 폴리펩티드 사슬을 포함하는 CD74 양특이성, 삼원자 표적화 단백질에 관한 것이다. 바람직하게, 결합 단백질은 두 개의 CD74 결합 부위 및 하나의 CD22 결합부위를 가진다. 양특이성, 삼원자가 표적화 제제는 두 개의 다른 scFvs를 가지며, 하나의 scFv는 또 다른 항체의 VL도메인과 짧은 연결기로 결합되는 하나의 항체에서 유래하는 두 개의 VH도메인(VH-사슬)을 가지고, 두 번째 scFv는 또 다른 항체의 VH도메인과 짧은 연결기로 결합되는 첫 번째 항체에서 유래하는 두 개의 VL도메인(VH-사슬)을 가진다. VH및 VL도메인에서 유래하는 다원자가, 멀티특이성 제제를 생산하는 방법은 다원자가 및 멀티특이성 제제가 하나의 VH사슬이 하나의 VL-사슬과 비공유 결합하여 제조할 수 있는 방법에 따라, 숙주 조직의 DNA 플라스미드에서 합성된 각 사슬이 VH도메인(VH-사슬)의 전부 또는 VL도메인(VL-사슬)의 전부로 이루어지도록 하였다. 예를 들면, 삼원자가, 삼특이성 제제를 생성하는 VH-사슬은 각각 다른 특이성을 가지는 항체에서 유래하고, 가변 길이의 펩티드 연결기에 의해 결합되는 세 개의 VH도메인의 아미노산 서열로 이루어질 것이며, VL-사슬은 VH-사슬에 사용되는 것과 동일한 펩티드 연결기에 의해 결합되는 상보적인 VL도메인으로 이루어질 것이다. 항체의 VH및 VL도메인은 역평행형(antiparallel fashion)으로 결합하기 때문에, 본 발명에서는 VL-사슬에서 VH도메인이 VH-사슬에서 VL도메인의 역순으로 배열되는 것이 바람직하다.
6. 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디
또한 본 발명에 의한 항-CD74 항체는 "디아바디"라 불리는 기능적 양특이성 단일 사슬 항체(bscAb)를 제조하여 사용할 수 있으며, 재조합 방법을 이용하여 포유동물 세포에서 제조할 수 있다. Macket al., Proc. Natl. Acad. Sci.,92:7021-7025, 1995, 참조. 예를 들며, bscAb는 재조합 방법을 이용한 글리신-세린 연결기를 통해 두 개의 단일 사슬 Fv 단편을 결합하여 제조한다. 두 개의 항체의 V 경쇄(VL) 및 V 중쇄(VH) 도메인은 표준 PCR 법으로 분리된다. 각 하이브리도마로부터 얻어지는 VH및 VLcDNA는 두 단계 융합 PCR에서 단일 사슬 단편을 생성한다. 첫 번째 PCR 단계는 (Gly4-Ser1)3연결기를 도입하고, 두 번째 단계는 VH및 VL산물을 결합한다. 각 단일 사슬 분자는 세균 발현 벡터에서 클론된다. 증폭에 의하여 단일 사슬 분자 하나는 제거되고, 두 번째 단일 사슬 분자를 함유하는 다른 벡터로 서브클론된다. 생성된 bscAb 단편은 진핵세포 발현 벡터에서 서브클론된다. 기능성 단백질 발현은 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포에서 벡터를 형질감염하여 획득한다. 양특이성 융합 단백질은 동일한 방법으로 제조한다. 양특이성 단일 사슬 항체 및 양특이성 융합 단백질은 본 발명의 범주에 포함된다.
예를 들면, 인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD74 단클론항체는 항원 특이적 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 제조하는데 사용된다. 단일특이성 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디는 선택적으로 표적화된 항원에 결합하고, 분자의 결합부위의 수가 증가하여 표적세포의 친화력이 증가하고 잔류 시간이 길어져 요구되는 위치에서 관찰된다. 디아바디에서, 5개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 인간화된 CD74 MAb의 VK폴리펩티드에 결합되는 인간화된 CD74 MAb의 VH폴리펩티드를 포함하는 두 개의 사슬이 이용된다. 각 사슬은 인간화된 CD74 디아바디의 절반을 형성한다. 트리아바디의 경우는, 연결기 없이 인간화된 CD74 MAb의 VK폴리펩티드에 결합되는 인간화된 CD74 MAb의 VH폴리펩티드를 포함하는 세 개의 사슬이 이용된다. 각 사슬은 인간화된 hCD74 트리아바디의 삼분의 일을 형성한다.
양특이성 디아바디의 궁극적인 용도는 진단용 또는 치료용 제제의 순차적 특이 운반을 위하여 CD74 양성 종양을 예비표적화하는 것이다. 이들 디아바디는 표적화된 항체에 선택적으로 결합하고, 친화력을 증가시켜 원하는 위치에서의 잔류시간을 길게 해준다. 더욱이, 비항원 결합 디아바디는 인체로부터 빠르게 제거되고, 정상 조직의 노출을 최소화한다. 진단용 치료용 제제는 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 성장인자, 접합체, 방사성핵종 및 금속을 포함한다. 방사성핵종의 예로는225Ac,18F,68Ga,67Ga,90Y,86Y,111In,131I,125I,123I,99mTc,94mTc,186Re,188Re,177Lu,62Cu,64Cu,67Cu,212Bi,213Bi,32P,11C,13N,15O,76Br 및211At을 들 수 있다. 또한 다른 방사성핵종, 특히 60-4,000 keV 에너지 범위내의 진단용 제제 및 60-700 에너지 범위내의 치료용 제제가 사용가능하다.
보다 최근에는 이중 특이성을 가지는 테트라바디 탄뎀(tandem) 디아바디(탄다브(tandab)라고도 함)가 보고되었다(Cochlovius et al., Cancer Research(2000) 60: 4336-4341). 양특이성 탄타브는 두 개의 동일한 폴리펩티드 다이머로서, 스스로 결합하여 각각 두 개의 다른 특이성을 위한 두 개의 잠재적 결합부위 생성을 촉진하는 배위에 연결되는 각각 두 개의 다른 항체(VH1, VL1, VH2, VL2)의 네 개의 변이 도메인을 함유한다.
7. 접합된 다원자가 및 멀티특이성 항-CD74 항체
본 발명의 또 다른 실시예는 접합된 다원자가 항-CD74 항체에 관한 것이다. 부가적 아미노산 잔기를 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드의 N- 또는 C- 말단에 첨가한다. 부가적 아미노산 잔기는 펩티드 테그, 단일 펩티드, 사이토카인, 효소(예를 들면, 프로드럭(prodrug) 활성화 효소), 호르몬, 슈도모나스 외독소와 같은 펩티드 독소, 펩티드 약물, 세포독성 단백질 또는 다른 기능성 단백질을 포함한다. 여기에서, 기능성 단백질은 생물학적 기능을 가지는 단백질이다.
또 다른 실시예에서, 약물, 독소, 방사성 화합물, 효소, 호르몬, 세포독성 단백질, 킬레이트, 사이토카인 및 다른 기능성 제제는 다원자가 표적 결합 단백질과 접합되고, 바람직하게는 아민, 카르복실, 페닐, 티올 그룹의 다원자가 표적 결합 단백질의 아미노산 잔기의 측쇄에 공유 부착한다. 본 발명에서는 다양한 통상적인 연결기가 사용되며, 예로 들면, 디이소시아네이트, 디이소티오시아네이트, 비스(히드록시숙신이미드) 에스테르, 카르보디이미드, 말레이미드-히드록시숙신이미드에스테르, 글루타르알데히드 등이 있다. 다원자가 단백질에서 접합 제제는 그 표적에 대한 단백질의 결합 특이성 및 친화력에 현저하게 영향을 주지 않는다. 본 명세서에서 기능적 제제는 생물학적 기능을 가지는 제제이다. 바람직한 기능적 제제는 세포독성제이다.
다른 실시예에서, 생체내 표적으로의 치료용 또는 프로드럭 폴리머의 양특이성 항체의 직접 운반은 방사성핵종의 양특이성 항체 운반과 조합될 수 있으며, 조합 화학치료요법 및 방사성면역치료법이 완성된다. 각 치료는 표적화할 수 있는 접합체에 접합되고, 동시에 투여되며, 또는 핵종이 첫 번째 표적화할 수 있는 접합체의 일부로 주어지고, 약물이 나중 단계에서 두 번째 표적화할 수 있는 접합체의 일부로 주어진다.
또 다른 실시예에서, 세포독성 제제는 폴리머 담체와 접합되고, 상기 폴리머 담체는 순차적으로 다원자가 표적 결합 단백질과 접합된다. 이러한 방법은 Ryseret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 3867-3870, 1978, 미국특허 제4,699,784호 및 제4,046,722호에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다.
8. 인간화된, 키메라 및 인간 항체의 치료용 및 진단용 용도
본 발명에 의한 인간화된, 키메라 및 인간 단클론항체인 항-CD74 MAb 및 다른 MAbs는 치료 및 진단 방법에서 적절하게 사용된다. 따라서, 본 발명에 의한 인간화된, 키메라 및 인간 항체를 항체 자체로 단독 투여하거나 또는 복용량 투여에의해 일시적이긴 하지만 치료용 제제와 접합하지 않는 다원적 치료로 투여하는 방법도 본 발명의 범주에 속한다. 면역접합체는 CD74와 결합하고, 진단용 또는 치료용 제제와 결합하는 본 발명에 기재된 인간화된, 키메라 또는 인간 Cd74 mAbs 중 적어도 하나 이상의 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질을 포함하는 항체 구성성분을 포함하는 접합체이다.
항-CD74 MAb 자체의 효능은 하나 또는 그 이상의 다른 항체 자체를 보충해 줌으로써 증가된다. 즉, 특이 항원에 결합하는 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUC1, Ia, 테나신(tenascin), HM1.24 또는 HLA-DR, 바람직하게는 성숙한 HLA-DR 다이머를 하나 또는 그 이상의 항-CD74 면역접합체 또는 약물, 독소, 면역조절제, 호르몬, 효소, 치료용 방사성핵종 등을 포함하는 치료용 제제와의 접합되는 상기 인용된 항원에 대한 항체와 함께 동시에 또는 순차적으로 기재된 복용량으로 투여하여 증가시킨다. 바람직한 B 세포 항원은 인간 CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD46, CD52, CD74, CD80 및 CD5 항원과 등가인 것들을 포함한다. 바람직한 T 세포 항원은 인간 CD4, CD8 및 CD25(IL-2 수용체) 항원과 등가인 것들을 포함한다. HLA-DR와 등가인 항원 B 세포 및 T 세포 질환의 치료에 사용된다. 특히, 바람직한 B 세포 항원은 CD19, CD22, CD21, CD23, CD74, CD80 및 HLA-DR 항원과 등가인 것들을 포함한다. 바람직한 T 세포 항원은 인간 CD4, CD8 및 CD25 항원과 등가인 것을 포함한다. CD46은 상보적 의존 세포용해(CDC)를 차단하는 암세포 표면에 있는 항원이다. 바람직한 악성종양 흑색종 관련 항원은 MART-1, TRP-1,TRP-2 및 gp100과 등가인 것이다. 또한 바람직한 다발성 골수종 관련 항원은 MUC1 및 CD38과 동일한 것이다.
또한 B 세포 림프구 및 다른 질병 또는 질환에서 사용하는 진단용 및 치료용 면역접합체의 투여하는 방법도 본 발명의 범주에 속한다. 본 발명에 의한 면역접합체는 항체 구성성분 및 진단용 또는 치료용 제제를 생성하는 펩티드를 포함하는 치료용 또는 진단용 제제를 포함하는 분자이다. 면역접합체는 항체 구성성분의 면역활성을 유지한다. 예를 들면, 항체 부분은 접합 전보다 접합 후에 동종항원에 결합하는 능력이 같거나 또는 약간 감소된 활성을 가진다.
다양한 진단용 및 치료용 제제는 본 발명의 항체와 유리하게 접합된다. 치료용 제제는 상기에 기재된 항체 자체와 분리하여 투여하기 위해 사용되는 제제이다. 치료용 제제로는 빈카 알카로이드, 안트라사이클린, 에피도필로톡신, 탁산, 항대사물질, 알킬화제, 항생물질, Cox-2 억제제, 유사분열억제(antimitotic), 항혈관형성제 및 세포자가사멸 제제, 특히, 독소루비신, 메토트렉세이트, 탁솔, CPT-11, 캄토테칸 및 이들의 다른 형태 및 항암제의 다른 종과 같은 화학요법 약물을 포함한다. 면역접합체 및 항체 융합 단백질의 제조를 위한 다른 유용한 암 화학치료요법 약물로는 질소겨자(nitrogen mustard), 알킬 설포네이트, 니트로소우레아(nitrosourea), 트리아젠(triazenes), 엽산 유사체, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 백금 배위 복합체 및 호르몬 등을 들 수 있다. 적절한 화학치료요법 제제는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed.(Mack Publishing Co. 1995), 및 GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACEUTICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7thEd.(MacMillan Publishing Co. 1985) 및 이들의 개정판에 공개되어 있다. 다른 적절한 화학치료요법 제제는 당업계에 잘알려진 실험적 약물이 있다.
부가적으로 DTPA, DOTA, TETA, 또는 NOTA와 같은 킬레이터 또는 적절한 펩티드는 형광물질과 같은 검출용 라벨, 또는 중금속 또는 방사성핵종과 같은 세포독성 제제에 접합될 수 있다. 예를 들면, 치료적으로 유용한 면역접합체는 광활성 제제 또는 염료를 항체 구성성분과 접합하여 획득한다. 형광크롬과 같은 형광 조성물 및 다른 색원체 또는 가시광에 민감한 포르피린과 같은 염료는 병변에 적절한 빛을 조사하여 병변을 검출 및 치료하는데 사용된다. 치료에서, 광방사성, 광치료 또는 광역학요법(Photodynamic Therapy)(Joriet al.,(eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMOR AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985); van den Bergh,Chem. Britain22: 430 (1986))이라는 용어가 존재한다. 더욱이 단클론항체는 광치료 완성을 위한 광활성 염료와 커플된다. Mewet al., J. Immunol.130: 1473 (1983);idem., Cancer Res. 45: 4380 (1985); Oseroffet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83: 8744(1986);idem.,Photochem. Photbiol.46: 83(1987); Hasanet al., Prog. Clin. Biol. Res.288: 471 (1989); Tatsutaet al., Lasers Surg. Med.9: 422(1989); Pelegrinet al., Cancer67: 2529(1991). 그러나, 이러한 초기 연구는 내시적 치료 적용의 용도를 포함하지 않았으며, 특히 항체 단편 또는 하부 단편의 이용을 포함하지 않았다. 따라서, 본 발명은 광활성 제제 또는 염료를 포함하는 면역접합체의 치료용 용도를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 진단용 제제로 방사성 및 비방사성 제제의 용도를 제공하고자 한다. 적절한 비방사성 진단용 제제는 자기공명영상, 전산화 단층촬영술(Computed Tomography) 또는 초음파 등을 위한 적절한 조영제이다. 자기공명영상은 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비방사성 금속, 2-벤질-DTPA 및 그들의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체를 포함하는 금속 킬레이트 화합물과의 복합체를 포함하며, 본 발명에 의한 항체와 함께 사용된다. 2001년 10월 10일자로 출원된 미국특허출원 제09/921,290호 참조; 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다.
또한, 방사성 라벨된 항체 또는 면역접합체는 진단용 영상에 사용하는 감마 방출 방사성 동위원소 또는 양성자 방출기를 포함한다. 적절한 방사성동위원소는 60-4,000 keB의 에너지 범주를 가지는 것으로,131I,123I,124I,86Y,62Cu,64Cu,111In,67Ga,68Ga,99mTc,94mTc,18F,11C,13N,15O,75Br 등이 있다. 미국특허 제목"Labeling Targeting Agents with Gallium-68" - 발명자 G. L. Griffiths 및 W. J. McBride(미국 가출원번호 제60/342,104호)에는18F,68Ga,94mTc와 같은 양성자 방출기가 개시되어 있다. 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다.
또한 슈도모나스 외독소와 같은 독소는 본 발명의 항-CD74 항체의 항체 융합 부분의 치료용 제제 부분을 생성하기 위해 복합된다. 다른 독소는 리신, 아브린, 리보뉴클라아제(RNase), DNase I,Staphylococcal내독소-A, 미국자리공 항바이러스성 단백질(pokeweed antiviral protein), 겔로닌(gelonin), 디프테린(diphtherin) 독소,Pseudomonas외독소(exotoxin) 및Pseudomonas내독소(endotoxin)를 포함하는 접합체 또는 다른 융합 단백질의 제조에 적절하게 사용된다. Pastanet al., Cell47:641 (1986) 및 Goldenberg,CA-A Cancer Journal for Clinicians44: 43 (1994) 참조. 본 발명에 의한 부가적 독소의 적절한 사용은 당업계에 잘 알려진 기술이며, 미국특허등록 제6,077,499호에 개시되어 있고, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다.
또한 사이토카인과 같은 면역조절제는 항체 융합 단백질의 치료용 제제 부분을 생성하거나 또는 본 발명의 인간화된 항-CD20 항체와 함께 투여되어 접합될 수 있다. 본 발명에 의한 적절한 사이토카인은 아래에 기재된 인터페론 및 인터류킨을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명에서는 인간화된, 키메라 또는 인간 CD74 mAbs 또는 그 단편 또는 항체 접합체를 생성하는 I종 또는 II 종 MHC 항원 펩티드와 공유 결합된 그들의 항체 융합 단백질을 포함하는 백신을 제공하고 있으며, 상기 백신은 암 또는 감염성 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 것이다. 상기 항체 접합체가 CD74 지표를 함유하는 세포에 의해 내재화되는 경우, I종 또는 II종 항원 펩티드는 보다 큰 펩티드 또는 mAb 또는 그 단편에 결합된 부분으로부터 수지상 세포 등의 항원 제공 세포에 의해 가수분해되어 방출된다. 이러한 항체 접합체는 mAb 또는 그 단편을 코딩하는 cDNA와 항원 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 cDNA와 융합하고, 세균, 효모 또는 포유동물에서 상기 융합 단백질을 발현하여 제조한다. 본 발명의 인간화된, 키메라 또는 인간 CD74 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질을 함유하는 항체 접합체는 1995년 12월 22일자로 출원된 "다단계 계단식 상승화 백신의 효능을 증가하는 면역접합체의 이용"이라는 제목의 미국특허출원 제08/577,106호에기재된 처리 방법을 이용하였으며, 본 명세서에서 전부 참고문헌으로 통합 수록하였다. 본 발명의 인간화된 항-CD74 mAb는 실시예 5의 뮤린 LL1에 특히 유용하다.
9. 면역접합체의 제조
본 발명의 항체 또는 항체 융합 단백질은 하나 또는 그 이상의 치료용 또는 진단용 제제와 접합될 수 있다. 일반적으로, 하나의 치료용 또는 진단용 제제는 각각의 항체 또는 항체 단편에 부착되지만, 하나 이상의 치료용 또는 진단용 제제는 동일한 항체 또는 항체 단편에 부착될 수 있다. 본 발명의 항체 융합 단백질은 둘 이상의 항체 또는 그 단편을 포함하며, 상기 각 항체는 치료용 제제 또는 진단용 제제를 함유할 수 있는 하나 이상의 상기 융합 단백질을 포함한다. 부가적으로, 항체 융합 단백질의 하나 또는 그 이상의 항체는 진단용 제제가 부착된 하나 이상의 치료용 제제를 가질 수 있다. 또한 치료용 제제가 동일할 필요는 없으며, 다른 치료용 제제가 될 수도 있다. 예를 들면, 하나가 같은 융합 단백질에서 약물 및 방사성 동위원소에 부착할 수 있다. 특히, IgG는 방사성 동위원소인131I로 라벨될 수 있고, 약물에 부착될 수도 있다.131I는 IgG의 타이로신에 결합할 수 있고, 약물은 IgG 리신의 엡실론 아미노기에 부착될 수 있다. 또한 치료용 및 진단용 제제 모두 환원된 SH기 및 탄수화물 측쇄에 부착될 수 있다.
본 발명의 양특이성 항체는 예비표적화하는 방법에 사용되고, 환자에게 두 개의 치료용 제제 또는 두 개의 진단용 제제를 운반하는 바람직한 방법을 제공한다. 미국특허출원 제09/382,186호에는125I로 라벨된 양특이성 항체가99mTc로 라벨된 이원자가 펩티드에 의해 환자에게 운반되는 양특이성 항체를 이용한 예비표적화 방법이 개시되어 있다. 상기 운반은125I 및99mTc에 대한 종양/정상 조직 비율로 우수하게 나타나고, 따라서, 두 가지 진단용 방사성 동위원소의 사용을 보여준다. 알려진 치료용 제제 또는 진단용 제제의 임의의 조합은 항체 및 항체 융합 단백질을 라벨하는데 사용될 수 있다. MAb 접합체의 항체 구성성분의 결합 특이성, 치료용 제제 또는 진단용 제제의 유효성 및 항체의 Fc 단백질의 작동체(effector) 활성은 접합체의 표준시험을 통해 결정될 수 있다.
치료용 또는 진단용 제제는 이황화물 결합 생성을 통한 환원된 항체 구성성분의 경첩 부위(hinge region)에 부착될 수 있다. 선택적으로, 이러한 펩티드는N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-succinyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP) [Yuet al., Int. J. Cancer56: 244(1994)] 등의 이종이작용기성(heterobifunctional) 교차결합을 이용하여 항체의 구성성분에 부착될 수 있다. 이러한 접합을 위한 일반적인 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991); Upeslaciset al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birchet al.(eds), 187-230쪽(Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritteret al.(eds), 60-84쪽(Cambridge University Press 1995) 등이 있다. 선택적으로, 치료용 또는 진단용 제제는 항체의 Fc 영역에서 탄수화물 부분을 통해 접합될 수 있다. 상기 탄수화물기는 티올기에 결합하는 동일한 펩티드의 공급을 증가시키는데 사용할 수 있으며, 또는 상기 탄수화물 부분은 다른 펩티드에 결합하는데 사용할 수도 있다.
항체 탄수화물 부분을 통하여 항체 구성성분에 펩티드를 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Shihet al.,Int. J. Cancer41: 832(1988); Shihet al.,Int. J. Cancer46: 1101(1990); 및 Shihet al., 미국특허 제5,057,313호 등이 있으며, 모두 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. 상기 일반적인 방법은 산화된 탄수화물 부분을 가지는 항체 구성성분이 적어도 하나 이상의 자유 아민기를 가지고 펩티드의 다원성(plurality)을 제공하는 담체 폴리머와 반응하는 것과 연관된다. 상기 반응은 최종 접합체를 생성하기 위하여 두 번째 아민을 환원하는 것으로 안정화되는 초기의 시프염기(Schiff Base)(이민) 결합에서 발생한다.
상기 Fc 영역은 면역접합체의 항체 구성성분으로 이용되는 항체가 항체 단편일 경우에는 존재하지 않는다. 그러나, 상기 Fc 영역은 온길이(full length) 항체 또는 항체 단편의 경쇄 변이부(light chain variable region)에서 탄수화물 부분으로 도입할 수 있다. 예를 들면, Leunget al.,J. Immunol.154: 5919(1995); Hansenet al., 미국특허등록 제5,443,953호(1995) 및 Leunget al., 미국특허등록 제6,254,868호 등이 있으며, 모두 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. 상기 제작된 탄수화물 부분은 치료용 또는 진단용 제제에 부착하는데 사용될 수 있다.
10. 약제학적으로 허용가능한 부형제
환자에게 운반되기 위해 인간화된, 키메라 및 인간 항-CD74 mAbs는 단독 MAb, 면역접합체, 융합 단백질로 구성될 수 있고, 또는 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 적절한 부형제, 하나 또는 그 이상의 부가적 성분 또는 이들의 일부 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 면역접합체 또는 항체 자체는 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는 당업계에 알려진 방법으로 제형화할 수 있으며, 그로 인해 접합체 또는 항체 자체가 약제학적으로 적절한 부형제를 가지는 혼합물과 결합한다. 상기 약제학적으로 적절한 부형제의 한 예로 멸균한 인산완충 식염수를 들 수 있다. 다른 적절한 부형제로는 당업계에 알려진 것들을 사용할 수 있다. 예를 들면 Anselet al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition(Lea & Febiger 1990), Gennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICALS SCIENCES, 18th Edition(Mack Publishing Company 1990) 및 이들의 개정판 등이 있다.
본 발명에 의한 면역접합체 또는 항원 자체는 순간 주사(bolus injection) 또는 지속적 주입(continuous infusion) 등을 통한 정맥내 투여를 위하여 제형화 될 수 있다. 주사용 제형은 방부제를 첨가하여 앰플(ampules) 또는 다용량 용기 등의 단일 제제로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 유성의 또는 수성의 운반제 내에서현탁액, 용액 또는 유화액(emulsion) 형태로 유지될 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제 등의 제형화제를 함유할 수 있다. 선택적으로, 상기 활성성분은 사용 전에 멸균한 초순수 수용액 등의 적절한 운반제와 함께 구성성분을 생성하는 파우더 형태가 될 수 있다.
부가적인 조제방법은 치료용 또는 진단용 접합체 또는 항체 자체의 활성의 지속을 조절하기 위하여 이용된다. 조절 유리 제제(control release preparation)는 면역접합체 또는 항체 자체를 복합체로 만들거나 흡착하기 위한 폴리머를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 생체친화성(biocompatible) 고분자들은 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 기질 및 스테아르산 이합체 및 세바신산(Sebacic acid)의 무수물 공중합체의 기질을 포함한다(Sherwoodet al., Bio/Technology10:1446(1992)). 이러한 기질로부터 면역접합체 또는 항체 자체가 유리되는 비율은 상기 면역접합체 또는 항체의 분자량, 기질내 면역접합체 또는 항체의 양 및 분산된 입자의 크기에 의존한다(Saltzmanet al., Biophys, J.55: 163 (1989); Sherwoodet al., supra). 다른 고형 제제의 형태는 Anselet al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEM, 5th Edition(Lea & Febiger 1990) 및 Gennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition(Mack Publishing Company 1990) 및 이들의 개정판에 기재되어 있다.
또한 면역접합체, 항체 융합 단백질, 또는 항체 자체는 포유동물에 동시에 투여되거나 또는 다른 비경구형 루트를 통해 투여된다. 게다가 투여는 지속적인 주입으로 또는 단일 또는 멀티플 환약으로 이루어진다. 일반적으로, 인간에 대하여투여된 면역접합체의 복용량, 융합 단백질 또는 항체 자체는 환자의 나이, 몸무게, 키, 성별, 일반적 조절 조건 및 이전의 조절 내력과 같은 인자에 의존하여 변화할 것이다. 전형적으로, 비록 낮거나 또는 높은 복용량이 부수적 지령으로 투여되지만, 1-20mg/kg의 복용량에서 단일 정맥내 주입하는 면역접합체의 복용량, 융합 단백질 또는 항체 자체의 복용량으로 수용성(recipient)을 제공한다. 이 복용량은 필요에 의해 반복되며, 예를 들면, 4-10 주 동안 일주일에 한번, 바람직하게는 8주 동안 일주일에 한번, 보다 바람직하게는 4주 동안 일주일에 한번 반복투여한다. 또한 여러 개월 동안 이주일에 한 번씩과 같이 빈번하지 않게 투여할 수도 있다. 복용량은 복용량과 일정의 적절한 조절로 인해 다수의 비경구형 루트를 통해 주입될 것이다.
치료의 목적을 위해서, 면역접합체, 항체 융합 단백질, 또는 항체 자체는 치료학적으로 유효한 양으로 포유동물에 투여된다. 비인간 동물 환자도 포함이 되기는 하지만, 본 발명에 의한 적절한 환자는 일반적으로 인간이다. 항체 제조는 상기 투여된 양이 생리학적으로 현저할 경우, "치료학적으로 유효한 양"으로 투여된다. 수용 포유동물의 생리가 검출가능하게 변화하는 결과를 나타내는 경우, 약물은 생리학적으로 현저한 것이다. 특히, 그 존재가 항종양 반응을 유발하거나 또는 자가면역 질환 상태의 표지 및 징후를 완화하는 경우, 본 발명의 항체 제조는 생리학적으로 현저한 것이다. 또한 생리학적으로 현저한 효과는 수용 포유동물에서 인간 및/또는 세포 면역 반응의 작용되는 것이다.
11. 치료 방법
본 발명은 CD74를 발현하는 악성종양을 치료하기 위한 일차 조성물로서 본 발명에 의한 항-CD74 항체 자체의 용도를 제공한다. 상기 질환 또는 질병은 면역 조절불량 질환, 자가면역 질환, 장기 이식 거부반응 및 이식편-숙주 반응질환(graft versus host disease)으로 이루어진 군에서 선택된 것이다. CD74를 발현하는 악성종양은 고형암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 또 다른 B-세포 악성종양 및 T-세포 악성종양으로 이루어진 군에서 선택된 것이다. 상기 고형암은 흑색종(melanoma), 암종(carcinoma) 및 육종(sarcoma)으로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 상기 암종은 신장암(renal carcinoma), 폐암(lung carcinoma), 장암(intestinal carcinoma), 위암(stomach carcinoma) 및 흑색종으로 이루어진 군에서 선택된 것이다. B-세포 악성종양은 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, B-세포 림프종의 무통 형태(indolent form), B-세포 림프종의 침투 형태, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 다발성 골수종, B-세포 질병 및 다른 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것이다. 특히, 본 명세서에 기재된 조성물은 여러 가지 자가면역 질환뿐만 아니라, B-세포 림프종의 무통 형태, B-세포 림프종의 침투 형태, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종 및 왈덴스트롬 거대 글로브린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia)을 치료하는데 유용하다. 예를 들면, 인간화된 항-CD74 항체 구성 및 면역접합체는 비호지킨 림프종의 무통 및 침투적 형태를 치료하는데 모두 이용할 수 있다.
보다 특이적으로, 본 발명은 B-세포 관련 악성종양을 앓는 환자에게 약제학적으로 허용가능한 담체 및 적어도 하나 이상의 본 발명에 의한 인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD74 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질을 포함하는 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 B-세포 악성종양의 치료방법을 제공한다. 상기 B-세포 악성종양은 림프종 또는 백혈병이다. 보다 특이적으로, B-세포 악성종양은 비호지킨 림프종, B-세포 림프종의 무통 형태, B-세포 림프종의 침투 형태, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 다발성 골수종이다. CD74 mAb 또는 그 단편은 20-2000mg의 복용량으로 정맥내로 또는 근육내로 투여된다. 또한 본 발명은 B-세포 악성종양을 치료하기 위해 사용되는 적어도 하나 이상의 치료용 제제를 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여한 후에 항-CD74 mAb 또는 그 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 치료용 제제는 항체 자체, 면역조절제, 호르몬, 세포독성 제제, 효소, 하나 이상의 면역조절제, 방사성 라벨, 호르몬, 효소 또는 세포독성 제제에 접합된 항체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 면역조절제로는 사이토카인이 바람직하고, 상기 세포독성 제제로는 약물 또는 독소가 바람직하다. 항체 자체로 또는 보조 면역접합체로 비결합하여 투여되는 항체는 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUC1, Ia, HM1.24, 테나신(tenascin) 및 HLA-DR와 반응하며, 바람직하게는 성숙한 HLA-DR 다이머와 결합하여 약제학적으로 허용가능한 운반제 내로 제형화된다.
또한 본 발명은 림프종 및 백혈병 이외에 CD74 항원 양성 악성종양을 앓는 환자에게 약제학적으로 허용가능한 담체 및 적어도 하나 이상의 본 발명에 기재된인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD74 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질을 포함하는 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 B-세포 악성종양의 치료방법을 제공한다. 항-CD74 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질은 20-2000mg의 복용량으로 정맥내로 또는 근육내로 투여된다. 또한 본 발명은 악성종양을 치료하기 위해 사용되는 적어도 하나 이상의 치료용 제제를 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여한 후에 항-CD74 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 명세서에 전반적으로 기재된 치료용 제제는 항체, 면역조절제, 호르몬, 세포독성 제제, 하나 이상의 면역조절제, 방사성 라벨, 효소, 호르몬 또는 세포독성 제제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합에 접합된 항체를 포함하며, 상기 면역조절제는 사이토카인이고, 상기 세포독성 제제는 약물 또는 독소이다. 항체를 B-세포 악성종양이 아닌 악성종양을 치료하기 위하여 항-CD74 mAb 또는 그 단편과 조합하여 투여하는 경우, 치료되는 악성종양을 포함하는 세포에 의해 발현되는 CD74 이외의 종양 지표와 반응하게 되며, 약제학적으로 허용가능한 운반제 내로 제형화하였다. 항원과 결합하는 악성 흑색종에 투여할 수 있는 항체의 예로는 MART-1, TRP-1, TRP-2 및 gp100과 반응하는 항체들을 들 수 있다. 또한 다발성 골수종과 결합하는 항원에 대한 항체로는 MUC1 및 CD38와 반응하는 항체가 바람직하다.
치료용 조성물은 적어도 하나 이상의 인간화된, 키메라 또는 인간 단클론 항-CD74 항체를 함유하며, 이를 단독 또는 다른 인간화된, 키메라, 또는 인간 항체, 치료용 제제 또는 면역조절제와 같은 다른 항체와 조합하여 사용한다. 특히, 온전한 인간 항체를 가지는 조합 치료가 의도되며, 상기와 같은 방법으로 제조된다.
또한 같은 혹은 다른 에피토프 또는 항원에서 항체 자체 또는 접합된 항체는 본 발명의 항체를 하나 또는 그 이상으로 조합한 것이다. 예를 들면, 인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD74 항체 자체는 또 다른 인간화된 자체, 키메라 자체 또는 인간 항-CD74 항체 자체와 조합하게 되고, 인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD74 항체 자체는 항-CD74 면역접합체와 조합하게 되며, 인간 항-CD74 항체 자체는 항-CD22 방사성접합체와 조합하게 되고, 또는 항-CD22 항체 자체는 동위원소, 또는 하나 또는 그 이상의 화학치료요법 제제, 사이토카인, 독소 또는 이들의 조합에 접합하는 인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD74 항체 자체와 조합하게 된다. 인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체의 융합 단백질 및 독소 또는 면역조절제, 또는 적어도 둘 이상의 다른 B 세포 항체(CD74 및 CD22 mAb, CD20 mAb 또는 CD19 mAb)의 융합 부분이 본 발명에서 사용된다. 참고문헌은 미국특허 제6,306,393호의 계속 출원이며, "항-CD22 항체를 이용한 B-세포 악성종양의 면역치료"라는 제목으로 2001년 10월 1일 출원된 미국특허출원 제09/965,796호에서 계류중이며, 본 명세서에서 다른 항체 자체와 조합된 항-CD22 항체의 처리가 개시된 상기 두 특허 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. B 세포 질환과 결합하는 적어도 둘 이상의 다른 항원을 표적화하는 많은 다른 항체 조합은 항체 자체로 또는 일부 자체로 및 치료용 제제 또는 면역조절제와 일부 접합되어 구성될 뿐만 아니라, 세포독성 약물 등이 다른 치료용 제제 또는 방사능과의 조합으로 구성된다.
여기에서 용어 "면역 조절제"는 사이토카인, 줄기 세포 성장인자, 종양 괴사인자(TNF)와 같은 림프독소(lymphotoxin) 및 인터류킨(interleukin-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-21 및 IL-18) 등의 조혈인자, 콜로니 촉진 인자(과립구-콜로니 촉진 인자(G-CSF) 및 과립구 대식세포-콜로니 촉진 인자(GM-CSF)), 인터페론(인터페론-α, -β 및 -γ ), "S1 인자"로 제작되는 줄기 세포 성장 인자, 에리트로포이에틴(erythropoietin) 및 트롬보포이에틴(thrombopoietin)을 포함한다. 적절한 면역조절 부분의 실시예에서는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론-γ 및 TNF-α를 사용한다. 선택적으로, 환자는 항-CD74 항체 자체 및 항-CD74 항체 자체의 투여하기 전, 투여와 동시에, 또는 투여한 후가 될 수 있으며, 개별적으로 투여된 사이토카인을 수용한다. 또한 상기 항-CD74 항체는 면역조절제와 접합된다. 면역조절제는 또한 다른 항원에 결합하는 하나 또는 그 이상의 항체로 이루어진 하이브리드 항체에 접합된다.
본 발명에 의한 다원적 치료는 항-CD22, 항-CD19, 항-CD21, 항-CD20, 항-CD80, 항-CD23, 항-CD46 또는 HLA-DR, 바람직하게는 성숙한 HLA-DR 다이머 항체를 항체 자체, 융합 단백질 또는 면역접합체의 형태로 투여하여 보충되는 항-CD74 항체 자체를 이용한 면역치료법을 포함한다. 이러한 항체는 적어도 하나 이상의 항원 결정 부위인 에피토프를 인지하는 다클론, 단클론, 키메라, 인간 또는 인간화된 항체를 포함한다. 항-CD19 및 항-CD22 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. Ghetieet al., Cancer Res.48: 2610 (1988); Hekmanet al., Cancer Immunol. Immunother.32: 364 (1991); Longo,Curr. Opin. Oncol.8:353(1996) 및 미국특허등록 제5,798,554호 및 제6,187,287호 참조; 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여수록하였다.
다원적 치료의 또 다른 형태는 환자에게 항-CD74 항체 자체, 및/또는 면역접합체, 표준 암 화학치료요법과의 결합으로 제공한다. 예를 들면, "CVB"(1.5g/㎡ 사이클로포스파미드, 200-400 mg/㎡ 에피토프, 및 150-200mg'㎡ 카르무스틴(Carmustine))는 비호지킨 림프종을 치료하는데 사용되는 방법이다. Pattiet al., Eur. J. Haematol.51:18(1993). 다른 적절한 조합 화학치료요법은 당업계에 잘 알려져 있다. Freedmanet al., "Non-Hodgkin's Lymphomas" in CANCER MEDICINE, VOLUME 2, 3rd Edition, Hollandet al.(eds.), pages 2028-2068(Lea & Febiger 1933). 중간 등급의 비호지킨 림프종(NHL) 치료를 위한 첫 번째 일반 화학치료요법은 C-MOPP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프로카르바진 및 프레드니손) 및 CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)을 포함한다. 유용한 두 번째 일반 화학치료요법은 m-BACOD(메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린)이고, 반면에 세 번째 일반 화학치료요법은 MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린)이다. 부가적으로 유용한 약물은 페닐 부티레이트 및 브로스타틴-1을 포함한다. 바람직한 다원적 치료에서, 화학치료용법 및 사이토카인은 모두 본 발명에 의한 항체, 면역접합체 또는 융합 단백질과 함께 투여된다. 상기 사이토카인, 화학치료요법 약물 및 항체 또는 면역접합체는 어떠한 주문 또는 혼용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, NHL은 4주 연속 또는 2주에 한번씩(정맥내로 2-8 시간 이상) 일주일에 200-400mg/㎡의 복용량으로 인간화된 항-CD74 항체의 4주간 주입하고 다음달/년은 필요에 따라 반복하는 것으로 치료한다. 또한 바람직하게는, NHL은 상기와 같이 한달에 두 번씩 4회로 치료하지만, 같은 날에 이프라투줌Ab(항-CD22 인간화된 항체)를 360mg/㎡의 복용량으로 항-CD74 단클론항체 주입하기 전, 주입하는 동안 또는 주입한 후 1시간 이상 주입하여 치료한다. 더욱 바람직하게는, NHL은 이트륨-90(5-35mCi/meter-square 사이의 Y90복용량으로 몇주 또는 몇달 간 하나 또는 그 이상 주사하여)과 같은 치료용 동위원소로 방사성 라벨된 CD22 mAb 하나 또는 그 이상의 주사의 조합으로, 상기와 같이 항-CD74 항체를 4주간 주입하여 치료한다.
게다가, 본 발명의 치료용 조성물은 다른 비블록화 CD74 에피토프로 보내는 단클론 항-CD74 항체 자체의 혼합물 또는 하이브리드 분자를 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 둘 이상의 CD74 에피토프에 결합하는 단클론 항-CD74 항체의 혼합물을 포함하는 치료용 조성물을 제공한다. 부가적으로, 본 발명에 기재된 치료용 조성물은 가변하는 CDR 서열을 가지는 항-CD74 항체의 혼합물을 함유한다.
항-CD74 항체가 B 세포 림프종 및 자가면역 질환의 치료를 위한 일차 치료용 조성물이기는 하지만, 이러한 항체 치료의 효능은 IFN-α, IFN-β, 및 IFN-γ를 포함하는 인터페론, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21를 포함하는 인터류킨 및 이들의 조합, 및 G-CSF 및 GM-CSF를 포함하는 사이토카인과 같은 면역조절제 등의 보조제(補助劑, supplement agent)와 함께 항체 자체를 제공하여 증가시킬 수 있다. 따라서, CD74 항체는 항체 및 사이토카인 뿐만 아니라 혼합물(단독으로 주어지거나 또는 일부 예비결정된 복용 요법으로)로 또는 항-CD74 항체에 대한 접합체 또는 융합 단백질로 조합될 수 있으며, 또한 약물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와의 조합으로 주어질 수 있다. 예를 들면, 항-CD74 항체는 4-약물 화학치료 요법으로 CHOP와 결합될 수 있다. 부가적으로 항-CD74 항체 자체는 NHL 치료를 위한 약물 조합으로 항-CD22 항체 자체 및 CHOP 또는 플루다라빈(Fludarabine)과 조합될 수 있다. 보조치료 조성물은 항-CD74 항체의 투여하기 전, 투여와 동시에 또는 투여한 후에 투여될 수 있다. 또한 항-CD74 mAb 자체는 안티센스 bcl 올리고뉴클레오타이드와 조합될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명에 의한 항체는 B 세포 림프종 및 백혈병, 다른 B 세포 질병 또는 질환뿐만 아니라 CD74와 반응하는 악성종양 세포에 영향을 주거나 또는 결합하는 다른 악성 종양을 치료하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 항-CD74 항체는 급성 특발성혈소판감소성자반병(acute idiopathic thrombocytopenic purpura) 및 만성 특발성혈소판감소성자반병 등의 급성 면역과 관련된 혈소판감소증(thrombocytopenias), 피부근염(dermatomyositis), 쉐그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 시덴함씨 무도병(Sydenham's chorea), 중증성 근무력증(myasthenia gravis), 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 낭창 신염(lupus nephritis), 류마티스 열 (rheumatic fever), 다선증후군(polyglandular syndromes), 수포성 유청포창(bullous pemphigoid), 당뇨병(diabetes mellitus), 헨녹-쇈라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 연쇄상구균-감염후 신염(post-streptococcal nephritis), 결절홍반(erythema nodosum), 다가야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 애디슨병(Addison's disease), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 육아종(sarcoidosis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 다형성 홍반(erythema multiforme), IgA 신병증(IgA nephropathy), 다발성 결절성 동맥염(polyarteritis nodosa), 강직성척추염(ankylosing spondylitis), 굿파스튜어증후군(Goodpasture's syndrome), 폐쇄성 혈전혈관염(閉鎖性血栓血管炎 : Thromboangitis obliterans), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 갑상선 중독증(thyrotoxicosis), 경피증(scleroderma), 만성 활동성 간염(chronic active hepatitis), 다발성 근염/피부근염(polymyositis/dermatomyositis), 다발성 연골염(polychondritis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 웨게너육아종증(Wegener's granulomatosis), 막성 신증(membranous nephropathy), 신경 위축성 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수로(tabes dorsalis), 거대세포동맥염/다발성근육통(giant cell arteritis/polymyalgia), 악성빈혈(pernicious anemia), 급성 진행성 사구체신염(rapidly progressive glomerulonephritis) 및 섬유성 폐렴(fibrosing alveolitis)과 같은 III종 자가면역 질환을 포함하는 면역 조절불량 질환 및 관련된 자가면역 질환을 치료하는데 이용할 수 있다.
특히, 본 발명에 의한 인간화된, 키메라 또는 인간 항-CD74 mAbs 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질은 하나 또는 그 이상의 상기 자가면역 질환을 앓는 환자에게 투여된다. 본 발명에 의한 항-CD74 항체는 특히 자가면역 질환을 치료하는 방법에 유용하며, 2000년 6월 9일자로 출원된 "B-세포를 표적하는 항체를 이용한 자가면역 질환의 면역치료"라는 제목의 미국특허출원 제09/590,284호에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 통합 수록하였다. 바람직하게는 항-CD74 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질은 20-2000mg의 복용량으로 정맥내로 또는 근육내로 투여된다. 또한 항-CD74 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질은 질병을 치료하기 위해 사용되는 하나 이상의 치료용 제제의 투여하기 전, 투여와 동시에 또는 투여한 후에 투여한다. 본 명세서에 전반적으로 기재된 상기 치료용 제제는 항체, 면역조절제, 호르몬, 효소, 세포독성 제제, 하나 이상의 면역조절제, 방사성 라벨, 호르몬, 효소 또는 세포독성 제제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합에 접합된 항체를 포함하며, 여기에서 면역조절제는 사이토카인이고, 상기 세포독성 제제는 약물 또는 독소이다. 항체 자체로 또는 보조 면역접합체로 투여되는 항체는 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20,CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUC1, Ia, HM1. 24, 테나신(tenascin), 및 성숙한 HLA-DR과 반응하며, 바람직하게는 성숙한 HLA-DR 다이머와 반응하여 약적학적으로 허용가능한 운반제로 제형화된다.
림프종, 백혈병, 골수종, 다른 CD74 발현 악성종양, 면역 조절불량 질환, 자가면역 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 질병 중 하나를 치료하기 위한 방법은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 적어도 하나 이상의 본 발명에 의한항-CD74 mAb 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질을 포함하는 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 적어도 하나 이상의 치료용 제제는 mAb 또는 그 단편 또는 화학적 접합 또는 유전적 융합에 의한 그들의 항체 융합 단백질의 Fvs 또는 Fab's에 결합한다. 상기 치료용 제제는 면역조절제, 방사성 라벨, 호르몬, 효소 또는 세포독성 제제이며, 상기 면역조절제는 사이토카인이고, 상기 세포독성 제제는 약물 또는 독소이다.
또한 항-CD74 항체는 CD74 항원을 발현하는 세포에서 자가사멸을 유도한다. 상기의 증거는 본 발명의 실시예에서 제공한다. 다른 항체들은 Fc 수용체를 가지는 임파구 세포가 교차결합된 CD20 MAbs의 IgG1-Fc와 반응하는 것을 이용하여 자가사멸을 유도하는 것을 증명하였다. Shanet al., Cancer Immunol. Immunother.48 (12): 673-683 (2000) 참조. 또한, 자가사멸을 유도하는 동종중합체와 같은 키메라 CD20 MAb의 집합이 보고되었다. Ghetie et al., Blood97 (5): 1392-1398 (2000) 및 Ghetieet al., Proc.Natl. Acad. Sci USA94 (14): 7509-7514 (1997) 참조.
B 세포의 CD74 항원 표면에 특이적 항체는 포유동물 환자에게 투여할 수 있으며, 그런 다음 정상세포 및 악성종양 B 세포 모두의 CD74 세포 표면 항원에 결합한다. 포유동물 환자는 인간 및 개와 고양이 같은 애완동물을 포함하는 가축을 포함한다. 본 발명에 의한 항-CD74 mAb, 예를 들면, 인간화된, 키메라, 인간, 개화된 및 고양이화된, 및 뮤린 항-CD74 mAbs는 CD74 항원에 대한 종간의 교차반응성이 있는 경우, 비인간 포유동물 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 인간의 면역성을 가지는 뮤린 mAbs는 일반적으로 비인간 포유동물 환자의 면역성이 거의 없다. CD74표면 항원에 결합하는 항-CD74 항체는 종양 B 세포의 파괴 및 방혈(放血: depletion)을 유도한다.
12. 진단방법
본 발명은 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 골수종(myeloma), 다른 CD-74-발현 악성종양(malignancy), 면역조정장애증(immune dysregulation disease), 자가면역질환(autoimmune disease) 및 이들이 결합된 질병으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 질병을 갖는 것으로 진단되거나 의심되는 대상에 대한 진단방법을 제공한다. 또한 본 발명은 진단학적으로 효과적인 분량의 진단 접합체, 즉 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 및 진단제가 화학적인 접합에 의해 mAb 또는 이들의 단편 또는 이들의 항체 융합 단백질의 Fvs 또는 Fabs와 연결된 적어도 하나의 항-CD74mAb 또는 이들의 단편 또는 이들의 항체 융합 단백질을 상기 대상에 투여하는 것; 및 상기 진단제를 검출하는 것을 포함한다. 본 발명에서 유용한 진단제로는 광자(photon)가 라디오신티그라피(radioscintigrapy) 또는 PET에 의해서 검출되는 방사성 동위원소, 또는 MRI에 의해서 검출될 수 있는 금속, 또는 초음파 스캐닝 장치에 의해 검출될 수 있는 리포좀(liposome) 또는 개스 충전 리포좀이 있다.
형광 라벨링 후에, 생쥐 항-CD74mAb, 키메라 항-CD74mAb 및 인간화 항-CD74mAb는 참고부분에 포함되어 있는 Pirker et al., J. Clin. Invest., 76: 1261(1985)의 방법에 필수적으로 따라 표적 세포로 내재화(internalization)될 수있다. 배양된 라지(Raji) 세포는 원심분리되어, 새로운 배지에 5×106cells/ml의 농도로 재현탁된다. 96-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에 100㎕의 세포 현탁액이 첨가된다. 모든 반응을 동시에 종료시키기 위하여 부피 100㎕인 40㎍/㎖의 항체가 일정한 간격으로 첨가된다. 플레이트는 C02세포배양 인큐베이터에서 37℃로 배양된다. 결합되지 않은 항체는 배양 말미에 차가운 1%FCS/PBS로 3회 세척하여 제거된다. 그리고 나서, 세포는 1㎖의 Formaid-Fresh[10% 포르말린 용액(Fisher, Fair Lawn, NJ)]으로 4℃에서 15분 동안 처리된다. 세척 후, 세포 표면 및 세포 내부에 존재하는 항체는 생쥐, 키메라, 인간화 항체 각각에 대하여 FITC-라벨링된 염소 항-생쥐 항체(Tago, Burlingame, CA), 또는 FITC-라벨링된 염소 항-인간 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)로의 처리에 의해 검출된다. 형광 분포는 BH-2 형광 현미경(Olypus, Lake Success, NY)을 사용하여 측정된다.
관련 혈관에서, 골수 암의 검색과 진단 방법은 Juweid et al., 1999에 서술되어 있으며, 이는 본 발명에 의한 우수한 항-CD74mAb에 의하여 이익을 얻을 수 있다. 따라서,99mTc-라벨링된 인간화 또는 키메라 항-CD74mAb를 포함하는 방법이 예상된다.
13. 발현 벡터
인간화, 키메라 또는 인간 항-CD74mAb를 코딩하는 DNA 서열, 더 구체적으로 상기 DNA 서열은 (a) 여기에 기재된 항-CD74mAb 또는 그들의 단편; (b) 여기에 기재된 항-CD74mAb 또는 그들의 단편 중 어느 하나를 포함하는 면역접합체(immunoconjugate); (c) 여기에 기재된 상기 항-CD74mAbs 또는 단편들 중 적어도 두개를 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그들의 단편; (d) 여기에 기재된 항체 융합 단백질 또는 그들의 단편; (e) 여기에 기재된 백신; 및 여기에 기재된 양쪽특이적(bispecific) 또는 다중특이적(multispecific) 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 mAb 또는 그들의 단편을 코딩하는 핵산을 함유한다. 본 발명의 임의의 DNA 서열은 핵산의 복제를 위해 제공되는 다양한 종류의 알려진 숙주 벡터로 재조합 될 수 있다. 이러한 벡터들은 세포 내에서 전달되는 핵산의 전사, 번역, 또는 양쪽 모두를 지시하는데 필요한 요소들을 포함하여 알려진 방법을 사용하여 제작된다. 알려진 방법론은 적당한 전사/번역 조절 신호와 인위적으로 결합된 댄박질 코딩 서열을 갖는 발현 구조체를 생산하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관 재조합 DNA 기술 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory(New York); Ausubel et al., 1997, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons(New York). 본 발명은 또한 벡터와 결합되지 않은 폴리뉴클레오타이드의 전달을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 적당한 벡터는 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 바이러스성 벡터의 특정한 예로는 아데노바이러스, AAV, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 렌티바이러스(lentivirus), 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 비-바이러스성 벡터의 예는 플라스미드이다. 바람직한 실시예에서, 벡터는플라스미드이다.
여기 기재된 발현 벡터는 숙주 세포에서 발현된 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 전형적으로, 유전자 발현은 구조 프로모터 또는 유도 프로모터, 조직-특이적 조절 요소, 및 인헨서(enhancer)를 포함하는 어떠한 조절 요소의 통제하에 있다. 그러한 유전자는 조절 요소에 "조작가능하도록 결합되었다"라고 한다. 바람직한 발현 벡터는 pdHI2 및 GS 벡터이다.
바람직하게, 본 발명의 발현 벡터는 가변영역 및 불변영역에 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)를 모두 포함한 인간, 키메라, 인간 항-CD74mAb를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 그러나, 중쇄 가변영역 또는 불변영역을 포함한 벡터 및 경쇄 가변영역 또는 불변영역을 포함한 다른 벡터, 이렇게 두 개의 발현 벡터가 사용될 것이다. 여기에, 바람직하게 발현 벡터는 프로모터를 더 함유한다. 임의의 강력한 프로모터가 사용될 수 있으며, 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열, 인간 IgG1 중쇄 불변영역을 코딩하는 게놈 서열, 이뮤노글로블린 인헨서(Ig enhancer) 요소, 및 선별 마커를 코딩하는 적어도 하나의 DNA를 함유한다.
본 발명에 의한 항-CD74mAb 또는 이들의 단편, 또는 항체 융합 단백질 또는 이들의 단편은 (a) 항-CD74mAb 또는 이들의 단편 또는 면역접합체 융합 단백질 또는 이들의 양쪽특이성 또는 다중특이성 항체를 코딩하는 DNA 서열이 트랜스펙션(transfection)된 숙주 세포; 및 (b) 항-CD74mAb 또는 이들의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 이들의 단편을 분비하는 세포의 배양을 포함한다. 숙주세포는 박테리아, 효모, 포유류로부터 얻어진다. 더욱 바람직하게는 포유류의 골수 세포와 같은림프세포가 실시예로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 (ⅰ) 인간, 키메라, 또는 인간화 항-CD74mAb를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터의 직선화, (ⅱ)상기 직선화된 벡터 중 적어도 하나의 포유류 세포로의 트랜스펙션(transfection), (ⅲ) 마커 유전자를 발현하는 트랜스펙션된 세포의 선별, (ⅳ) 트랜스펙션된 세포로부터 인간화 항-CD74mAb를 분비하는 세포의 확인을 포함하는 인간화 항-CD74mAb의 발현 방법을 제공한다.
본 발명자들은 생쥐 항-CD74 단일클론 항체(mLL1 mAb) VL 및 VH 도메인을 코딩하는 분리된 cDNA를 분리하고 그들을 인간 항체의 kappa 및 IgG1불변영역 각각을 코딩하는 유전자를 포함하는 포유류 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 이러한 두개의 재조합 DNA의 포유류 세포로의 동시 트랜스펙션은 모(parent) mLL1 mAb1처럼 B-림프종(B-lymphoma) 세포에 강하게 결합하어 신속히 내재화되는 키메라 항-CD74mAb(cLL1)를 발현하였다.
VK 및 VH DNA의 CDR들은 포유류 세포에서 상기 기재된 인간 항-CD74mAb(hLL1)를 발현하기 위하여 인간 kappa 및 IgG1불변 영역에 각각 순차적으로 결합된 인간 VK 및 VH 도메인의 프레임워크(Framework; FR) 서열에 각각 유사하게 재조합되어 결합되었다.
1가의 경쇄-중쇄 단편을 만들기 위한 중쇄의 분리, 단편의 부가적인 절단, 또는 다른 효소적, 화학적, 또는 유전적 기술과 같은 항체를 결합하는 다른 방법들은 단편이 온전한 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한 역시 사용될 수 있다.
여기에 기재된 항체는 단일클론 항체(mAb)이다. 단일클론 항체는 특정 항원에 대한 동종의 항체 군이며, 상기 항체는 핵산이 특이적으로 결합하는 오직 한 가지 형태의 항원 결합 위치를 갖는다. 특정 항원에 대한 설치류의 단일클론 항체는 당업계에서의 알려진 방법, 예를 들면, Kohler 및 Milstein, Nature 256:495(1975), 및 Coligan et al.(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL.1, page 2.5.1-2.6.7(John Wiley & Sons 1991)[hereinafter "Coligan"] 등에 의해 얻어질 수 있다. 간략하게, 단일클론 항체는 생쥐에 항원을 함유하는 조성물의 투여, 혈청 샘플의 제거에 의한 항체 생성의 확인, B-림프세포를 얻기 위한 간의 제거, 하이브리도마(hybridoma)를 생산하기 위한 B-림프세포와 골수 세포의 융합, 하이브리도마스의 클로닝, 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론의 선별, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론의 배양, 및 하이브리도마 배양군으로부터 항체의 분리에 의해 얻어질 수 있다.
MAbs는 다양한 확립된 기술에 의해 하이브리도마 배양군으로부터 분리, 정제될 수 있다. 그러한 분리 기술은 단백질-A 세파로즈(Protein-A Sepharose)와의 친화 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography), 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, Coligan 2.7.1~2.7.12 및 2.9.1~2.9.3 페이지를 참고하거나, 또한 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(The Humana, Inc. 1992), VOL. 10, 79~104 페이지의 Baines et al., "이뮤노글로블린 G(Ig G)의 정제"를 참고할 수 있다.
14. 제조방법
키메라 또는 인간화 항-CD74mAb에 대한 VK 및 VH 서열은 참고부분에 기재된 Orlandi et al.,(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:3833(1989))에 기재된대로 PCR에 의해 증폭될 수 있다. VK 서열은 프라이머 CK3BH 및 VK5-3(Leung et al., BioTechniques, 15: 286(1993), 참고부분에 기재)를 사용하여 증폭될 수 있으며, VH 서열은 프라이머 생쥐 IgG의 CH1 지역을 어닐링하는 프라이머 CH1B, 및 VHIBACK(Orlandi et al., 1989)를 사용하여 증폭될 수 있다. 10㎕의 첫번째 주형 cDNA 산물, 9㎕의 10×PCR 버퍼[500 mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH 8.3), 15 mM MgCl2, 및 0.01%(w/v) 젤라틴]를 포함하는 PCR 반응 혼합물(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)이 30 사이클의 PCR에 적용될 수 있다. 각 PCR 사이클은 바람직하게 1분 동안 94℃에서의 변성, 1.5분 동안 50℃에서의 어닐링(annealing), 및 1.5분 동안 72℃에서의 중합(polymerization)과정으로 구성된다. 증폭된 VK 및 VH 단편은 2% 아가로스(BioRad, Richmond, CA)에서 정제될 수 있다. 인간화 V 유전자의 제조에 사용하기 위하여, 자동화 사이클론 플러스 DNA 합성기[Cyclone Plus DNA synthesizer(Milligan-Biosearch)]상에서 올리고 A(149-mer) 및 올리고 B(140-mer)의 합성 방법은 실시예 3에 기재하였다.
VK에 대한 PCR 산물은 단일 펩타이드 서열인 Ig 프로모터 및 VK PCR 산물의 프레임내 결찰(ligation)을 촉진하는 알맞은 제한 위치(restriction site)를 포함하는 pBR327-기반 중간 벡터 VKpBR과 같은 중간 단계 벡터(staging vector)로 서브 클로닝될 수 있다. VH에 대한 PCR 산물은 pBluescript-기반 VHpBS와 같은 유사한 중간 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 각 PCR 산물을 포함하는 각각의 클론들은 예를 들면, 참고부분에 기재된 Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463(1997)의 방법에 의해 시퀀싱될 수 있다.
여기에 기재된 DNA 서열은 모든 대립 형질 유전자(alleles), 자연적 또는 인위적인 돌연변이 및 이들의 변종을 포함한다.
두 개의 플라스미드는 골수종 Sp2/0-Ag14와 같은 적당한 세포로 함께 트랜스펙션될 수 있고, 콜로니들은 하이그로마이슨(hygromycin) 저항성에 의해 선별되며, 상층액은 하기에 기재된 것과 같이 예를 들어 ELISA에 의해 키메라 또는 인간화 항-CD74mAb의 생산에 대하여 모니터링 될 수 있다.
트랜스펙션, 및 ELISA에 의한 항체 분비 클론의 분석은 하기와 같이 수행될 수 있다. 약 10㎍의 hLL1 pKh(경쇄 발현 벡터) 및 20㎍dml hLL1pG1g(중쇄 발현 벡터)는 참고예에 기재된 Co et al., J. Immunol., 148: 1149(1992)에 따라 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 5×106SP2/0 골수세포의 트렌스펙션에 사용될 수 있다. 트렌스펙션에 이어, 세포들은 37℃, 5% CO2의 완전 HSFM 배지(GIBCO, Gaithersburg, MD)에서 96-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에서 성장될 것이다. 선별 과정은 2일 후, 최종 농도 500㎍/㎖의 하이그로마이신(hygromycin)을 가진 하이그로마이신 선별 배지(Calbiochem, San Diego, CA)의 첨가에 의해 초기화될 수 있다. 콜로니는 일반적으로 전기영동에 나타난다. 배양 배지는 다음 분석을 위하여 증대 배양될 수 있다.
키메라 또는 인간화 중쇄의 선별에 양성인 트렌스펙토마 클론들은 ELISA 분석에 의해 확인될 수 있다. 간략하게, 트랜스펙토마 배양 배지의 상층액 샘플(100㎕)은 염소 항-인간(GAH)-IgG, F(ab′)2단편-특이적 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)로 미리 코팅된 ELISA 마이크로타이터 플레이트에 3중으로 첨가된다. 플레이트는 상온에서 1시간 동안 배양된다. 결합되지 않은 단백질들은 세척 버퍼(0.05% 폴리소르베이트 20함유 PBS)로 3회 세척에 의해 제거된다. GAH-IgG, Fc 단편-특이적 항체(Jackson ImmunoReserch, West Grove, PA)와 접합된 고추냉이 페록시다제[Horseradish peroxidase(HRP)]가 웰에 첨가된다((104배 희석된 100㎕의 항체에 최종농도 1.0㎍/㎖이 되도록 비접합 항체를 첨가). 1시간 동안의 배양 후에, 플레이트는 일반적으로 3회 세척된다. 반응 용액[100㎕, 167㎍의 오르소페닐렌-디아민(orthophenylene-diamine; OPD)(Sigma, St. Louis, MO) 함유, PBS 내 0.025% 하이드로겐 페록사이드(hydrogen peroxide)]이 웰에 첨가된다. 색은 30분 동안 암흑에서 현상된다. 반응은 자동화 ELISA 리더(reader)(Bio-Tek instruments, Winooski, VT)로 490nm에서 흡광도를 측정하기 전에, 각 웰로 4N HCL 용액 50㎕를 첨가함으로써 정지된다. 결합된 키메라 항체는 관련이 없는 키메라 항체 스탠다드(Scotgen, Ltd., Edinburg, Scotland)와 비교하여 결정된다.
항체는 세포 배양 배지로 부터 다음과 같이 분리될 수 있다. 트랜스펙토마배지는 혈청이 없는 배지에 적응시킨다. 키메라 항체의 생산을 위하여, 세포는 HSFM을 사용한 롤러 병에서 500㎖ 배지로 성장된다. 배지는 원심분리되고 상층액은 0.2 마이크론 막을 통해 여과된다. 여과된 배지는 1㎖/min의 유속으로 단백질 A 컬럼(1×3cm)에 통과된다. 수지(resin)는 약 10 컬럼 부피의 PBS로 세척되고, 단백질 A-결합 항체는 10mM EDTA를 포함한 0.1M의 글라이신(glycine) 버퍼(pH 3.5)와 함께 컬럼을 통해 용출된다. 0.1㎖의 분액이 3M 트리스(Tris)(pH 8.6) 10㎕를 포함한 튜브로 모아지고, 단백질 농도는 280/260 nm에서 흡광도에 의해 결정된다. 피크 분액은 모아서 PBS에 대해 투석하고, 항체는 예를 들어, 센트리콘(Centricon) 30(Amicon, Beverly, MA)로 농축한다. 항체 농도는 상기와 같이 ELISA에 의해 결정되며, 그 농도는 PBS를 사용하여 약 1㎍/㎖로 맞춘다. 소듐 아자이드(sodium azide), 0.01%(w/v),는 방부제로서 샘플에 적절하게 첨가된다.
여기에 인용된 등록특허 뿐만 아니라 모든 출간된 논문 및 특허는 참고부분에 모두 기재되어 있다. 발명은 단지 실례로서 제공되는 다음의 실시예를 참고로 하여 더욱 상세히 설명된다. 본 발명은 이들 실시예에만 국한되지 않으며 여기에서 제공되는 기술로부터 명백한 모든 다양한 기술을 포함한다.
[실시예 1] LL1 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 분자 클로닝 및 서열 해석
mLL1의 VK유전자는 Leung et al. 1993 및 Orlandi et al.(PNAS 86:3833-3837(1989))에 기재된 프라이머로 VK5'-4 및 VK1FOR을 각각 이용한 RT-PCR에 의해 획득하였으며, pCR2.1 AT-클로닝 벡터(Invitrogen)으로 클로닝하였다. 다중 클론은 PCR 반응으로부터 나올 수 있는 에러를 제거하기 위하여 시퀀싱되었다. 다수의 클론(6)은 LL1VK로 명시되고 그 서열이 도 1B에 표시된 동일한 생쥐 VK서열을 포함하였다. 다른 생쥐 VK와의 비교는 LL1VK가 카파(kappa) 경쇄 서브클래스 Ⅱ의 일종이라는 것을 나타낸다.
RT-PCR이 생쥐 VH 유전자를 코딩하는 전체길이의 서열을 생산하는데 실패하였기 때문에, cDNA 5'-말단(5'-RACE)의 급속한 증폭을 수행하였다. LL1 하이브리도마 세포로부터 분리한 어댑터-결찰 cDNA는 일반적인 앵커(anchor) 프라이머(Life Technologies) 및 유전자 특이적 프라이머인 생쥐 중쇄의 CH1 지역에 어닐링된 CH-1B(Leung et al. 1994)를 사용한 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 산물인 ~650bp의 다수 PCR 종은 pCR2.1 AT-클로닝 벡터로 클로닝되고 다중 클론은 DNA 시퀀싱에 의해 서열분석되었다. PCR 산물은 비코딩 서열 옆에 위치한 전체길이의 VH 서열(도 1A)을 포함하고, 5'-말단에서의 분비신호 펩타이드 및 γ1 사슬의 CH1 영역에 대한 부분적인 코딩 서열을 포함하였다. LL1VH로 명시된 VH를 코딩하는 서열 내에서는 어떠한 결함 돌연변이도 발견되지 않았다. 다른 생쥐에 VH 서열과 hLL1VH의 비교는 hLL1VH가 생쥐 중쇄의 다양한 하위그룹에 속한다는 것을 나타낸다(Kabat et al., 1991). VK및 LL1VH의 아미노산 서열과 카밧(Kabat) 데이터베이스 내의 생쥐 Ab V 유전자 및 카밧의 정의와의 비교에 의해, VK및 hLL1VH의 CDR 지역은 도 1A 및 B에서 각각 보여지는 것과 같이 확인되었다. VK및 LL1VH의 아미노산 서열과 카밧 데이터베이스내의 생쥐 Ab V 유전자 및 카밧의 정의와의 비교에 의해, VK및 hLL1VH의 CDR 지역은 도 1A 및 B에서 각각 보여지는 것과 같이 확인되었다.
[실시예 2] 키메라 LL1 발현 벡터의 제조
LL1에 대해 클로닝된 FV의 신빙성을 평가하기 위하여, 키메라 LL1(cLL1)이 제조되고 발현되었다. LL1Vk의 뉴클레오타이드 잔기 7~12는 프라이머로 LL1VK-PvuⅡ 및 VK1FOR를 사용한 PCR에 의해 PvuⅡ 제한 위치, CAGCTG로 변형되었다. PCR 산물은 PvuⅡ 및 BglⅡ로 절단되고(부분적으로, Vk에서 내부의 BglⅡ 위치의 존재에 기인함), 같은 Ig 프로모터, 신호 펩타이드 서열 및 Orlandi et al.(1989) 및 Leung et al.(1994)에 의해 사용된 것과 같은 VK PCR 산물의 프레임 내 결찰을 촉진하기 위한 알맞은 제한 위치를 포함하는 pBR327-기반 중간 단계 벡터(PvuⅡ 및 BclⅠ으로 절단), VKpBR2로 클로닝시켰다.
이와 마찬가지로, LL1VH의 10~15 및 345~351 위치에서의 뉴클레오타이드 서열은 프라이머로 LL1B-1 및 LL1F-1를 사용한 PCR에 의해 PstⅠ 및 BstEⅡ로 각각 전환되었다. 그 다음, VH PCR 산물은 PstⅠ 및 BstEⅡ로 절단되고, 단일 펩타이드 서열 및 VHpBS로 부터 변형된 VH PCR 산물{Orlandi, Gussow, et al. 1987 741 /id}의 프레임 내 결찰을 촉진하기 위한 알맞은 제한 위치를 포함하는 pBluescript-기반 중간 단계 벡터인, PstⅠ 및 BstEⅡ에 의해 절단된 VHpBS2로 결찰되었다(Leung, S.O., Shevitz, J., Pellegrini, M.C., Dion, A.S., Shih, L.B., Goldenberg, D.M., 및 Hansen, H.J.(1994)).
cLL1VH 및 Vk 양쪽의 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인되고, 도 2A 및 2B에 각각 표시하였다.
cLL1의 Vk 서열을 포함하는 단편은 신호 펩타이드 서열과 함께 XbaⅠ 및 BamHⅠ으로 중복 절단에 의해 LL1VKpBR2으로부터 제거되었다. 그 다음, ~550bp의 Vk 단편은 포유류 박현 벡터인 pdHL2의 Xbal/BamHⅠ으로 서브클로닝되었다. 결과 벡터는 cLL1VkpdHL2로 명시되었다. 이와 유사하게, LL1VH를 포함하는 ca. 750bp 단편은 신호 펩타이드 서열과 함께 XhoⅠ 및 BamHⅠ 절단에 의해 LL1VHpBS2로부터 제거되고, 아가로스 겔 내의 전기영동에 의해 분리되었다. 단편은 BamHⅠ 및 HindⅢ 말단에 대응하는 링커의 도움으로 cLL1VkpdHL2의 XholⅠ 및 HindⅢ 위치로 서브클로닝되어, cLL1pdHL2로 명시된 최종 발현 벡터를 얻었다.
[실시예 3] cLL1의 트랜스펙션 및 발현
대략 30㎍의 cLL1pdHL2은 SalⅠ로의 절단에 의해 직선화되고 일렉트로포레이션에 의해 Sp2/0-Ag14 세포로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션된 세포는 96-웰 플레이트에 2일 동안 처리되고, 그 다음 MTX 저항성에 대하여 선별되었다. 살아남은 콜로니로부터의 상층액은 키메라 항체 분비에 대하여 ELISA에 의해 모니터링되었다. 양성 세포 클론은 증대 배양되고, cLL1은 단백질 A 컬럼상에서 친화 크로마토그래피에 의하여 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다.
[실시예 4] 결합 활성 분석
모(parent) mLL1과 관련된 cLL1의 면역활성을 평가하기 위하여 경쟁 세포 결합 분석이 수행되었다.125I-라벨링된 mLL1(100,000cpm)의 일정량을 다양한 농도의 cLL1 또는 mLL1의 존재 하, 4℃에서 1~2시간 동안 라지(Raji) 세포와 함께 배양되었다. 세포와 결합된 방사능활성은 세척 후에 측정되었다. 도 5에서 보는 바와 같이, cLL2 항체는 mLL1과 비교할만한 결합 활성을 나타내며, 클로닝된 V 유전자의 존재를 확인할 수 있었다.
상기 결과는 플로우 사이토메트리(flow cytometry)에 기초한 두 번째 경쟁 분석에 의해 확인되었다. 간략하게, 앞서와 마찬가지로 라지 세포를 사용하고, 다른 것과 관련된 하나의 항체 농도를 다양하게 하여, 결합된 mLL1 또는 cLL1의 양이 플로우 사이트로메트리를 사용한 분석에 의해 FITC-라벨링된 항-생쥐 Fc 또는 항-인간 Fc 항체로서 결정되었다.
ELISA 경쟁 결합 분석이 모(parent) mLL1에 관련된 cLL1의 면역활성을 평가하기 위하여 라지 세포 막 코팅된 플레이트에서 수행되었다. 라지 세포의 막 분획은 초음파 및 원심분리에 의해 준비되었다. 천연 막 추출물은 원심분리에 의해서96-웰의 편평한 바닥 PVC 플레이트에 코팅되고, 0.1% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 고정되었다. 다양한 농도의 mLL1 또는 cLL1과 혼합된 바이오틴 부착(biotinylated) mLL1의 일정 양이 막 코팅된 웰에 첨가되고, 1~2시간 동안 상온에서 배양되었다. 세척 후, HRP-접합 스트렙타비딘(streptavidin)이 첨가되고, 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 막-결합 바이오틴 부착 mLL1에 결합된 HRP-접합 스트렙타비딘(streptavidin)의 양은 4mM의 오르소-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(ortho-phenylenediamine dihydrochloride) 및 0.04%의 H2O2를 포함하는 기질 용액의 첨가 후에 A490nm을 읽는 것에 의해 나타난다.
[실시예 5] LL1 단클론 항체에 대한 인간 프레임워크 및 서열 디자인의 선택
cLL1의 가변(V) 영역 프레임워크(FR) 서열과 카밧 데이타베이스 내 인간 항체의 가변(V) 영역 구조(FR) 서열의 비교에 의해, Vk 및 cLL1VH의 FRs는 인간 항체, RF-TS3 VH 및 HF-21/28 Vk에 대하여 각각 가장 높은 정도의 서열 상동성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 아미노산 서열은 도 3A 및 3B에 표시하였으며, cLL1VH 및 Vk 서열과 비교된다. 따라서, RF-TS3 VH의 FR 및 HF-21/28 Vk 및 FRs는 Vk 및 LL1 VH에 대한 CDRs가 각각 접합된 인간 프레임워크로서 선택된다. 그러나, NEWM의 FR4 서열이 LL1 중쇄의 인간화에 대한 RF-TS3 FR4 서열을 대체하기 위하여 RF-TS3보다 많이 사용된다. 도 3A를 참고할 수 있다. 추정되는 CDRs에 가까운 LL1 FRs 내의 몇몇 아미노산 잔기는 앞서 기재된 가이드라인에 근거한 hLL1 내에 유지된다(Quet al., Clin. Cancer Rec. 5:3095s-3100s(1990)). 이러한 잔기는 VK의 L46, F87 및 Q100(도 3B) 및 VH의 I36, K37, Q46, A68, F91 및 S93(도 3A) 이다. 도 3A 및 도 3B는 인간, 키메라 및 인간화 VH 및 VK 아미노산 서열을 비교한다. 점들은 사람 VH 및 Vk 서열 내에서의 대응 잔기와 동일한 cLL1 및 hLL1에서의 잔기를 나타낸다. hLL1VH 및 Vk의 DNA 및 아미노산 서열은 도 4A 및 도 4B에 각각 표시하였다.
[실시예 6] 인간화 V 유전자의 PCR/유전자 합성
Leung et al.(Leung et al., 1994)에 기재된 것과 같은 변형된 전략이 도 5에 표시된 긴 올리고뉴클레오타이드 합성체 및 PCR의 조합을 이용하여 hLL1에 대해 디자인된 Vk 및 VH 유전자를 제조하는데 사용되었다. hLL1 VH 도메인을 만들기 위하여, 두 개의 긴 올리고뉴클레오타이드, hLL1VHA(176-mer) 및 hLL1VHB(165-mer)가 자동 DNA 합성기(Applied Biosystem)에서 합성되었다. hLL1VHA 서열은 hLL1VH 도메인의 20~195 위치의 뉴클레오타이드를 나타낸다:
hLL1VHB 서열은 173~337 위치에 상보적인 hLL1VH 도메인의 마이너스 스트랜드(strand)를 나타낸다:
hLL1VHA 및 B의 3'-터미널 시퀀스(22 nt 잔기)는 서로 상보적이다. 정해진 PCR 조건하에서, hLL1VHA 및 B의 3'-말단은 어닐링되어 긴 올리고뉴클레오타이드의 나머지 부분이 옆에 위치한 짧은 이중 스트랜드 DNA를 형성한다. 각각의 어닐링된 말단은 단일 스트랜드 DNA의 전사에 대한 프라이머로서 작용하여, hLL1VH의 20~337 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 이중 스트랜드 DNA가 된다. 이 DNA는 전체길이의 hLL1VH를 형성하기 위하여, 두 개의 짧은 올리고뉴클레오타이드, hLL1VHBACK 및 hLL1VHFOR의 존재하에서 증폭되었다.
최소량의 hLL1VHA 및 B(실험적으로 결정)가 10㎕의 10×PCR 버퍼(500mM KCl,100mM Tris.HCL 버퍼, pH 8.3, 15mM MgCl2), 2 μmol의 hLL1VHBACK 및 hLL1VHFOR, 및 2.5 유닛(units)의 Tag DNA 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct)의 존재하에서 증폭되었다. 이 반응 혼합물에 대해서 94℃에서 1분 동안의 변성, 45℃에서 1분 동안의 어닐링, 및 72℃에서 1.5분 동안의 중합으로 구성된 3 사이클의 PCR 반응, 및 뒤따르는 94℃에서 1분 동안의 변성, 55℃에서 1분 동안의 어닐링, 및 72℃에서 1분 동안의 중합으로 구성된 27 사이클의 PCR 반응이 수행되었다. hLL1VH에 대한 이중-스트랜드 PCR-증폭 산물은 겔-정제되고, PstⅠ 및 BstEⅡ로 제한-절단된 뒤, 중쇄 중간 벡터인 VHpBS2의 상보적인 PstI/BstEⅡ 위치로 클로닝되었다.
전체길이의 인간화 Vk 서열을 만들기 위해, hLL1VKA(159-mer) 및 hLL1VKB(169-mer)가 상기 기재된 바와 같이 합성되었다. hLL1VKA 및 B는 상기에 기재된 두 개의 짧은 올리고뉴클레오타이드 hLL1VKBACK 및 hLL1VKFOR에 의해 증폭되었다.
hLL1VHA 서열은 hLL1VH 도메인의 16~174 위치를 나타낸다.
hLL1VHB 서열은 153~321 위치에 상보적인 hLL1VH 도메인의 마이너스 스트랜드를 나타낸다.
hLL1Vk에 대한 겔-정제된 PCR 산물은 PvuⅡ 및 BglⅢ로 제한-절단되고, 경쇄 중간 벡터인 VKpBR2의 상보적인 PvuⅠ/BclⅠ 위치로 클로닝되었다. 최종 발현 벡터인 hLL1pdHL2는 hLL1Vk 및 VH의 XbaⅠ-BamHⅠ 및 Xhol/BamHⅠ단편을 각각 상기 기재된 바와 같이 pdHL2로 연속적으로 서브클로닝하여 제조되었다.
[실시예 7] hLL1에 대한 트랜스펙션, 발현 및 결합 활성 분석
hLL1에 대한 발현 및 결합 활성 분석 방법은 cLL1에 기재된 것과 같다.
라지 세포 막 추출 코팅 플레이트를 이용한 ELISA 경쟁 결합 분석은 hLL1의 면역활성을 평가하기 위하여 수행되었다. 라지 세포 막 분획은 초음파 및 원심분리에 의해 만들어졌다. 천연의 막 추출물은 원심분리에 의해 96-웰의 편평한 바닥을 가진 PVC 플레이트 내에 코팅되고 0.1%의 글루타알데하이드로 고정되었다. 다양한 농도의 mLL1 또는 cLL1과 혼합된 일정량의 바이오틴 부착 mLL1는 웰에 코팅된 막에 첨가되고, 상온에서 1~2시간 동안 배양되었다. 세척 후에, 막-결합 바이오틴 부착 mLL1에 결합된 HRP-부착 스트렙타비딘(streptavidin)은 4mM의 오르소-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 및 0.04%의 H2O2를 포함한 기질용액의 첨가 후에, A490을 읽음으로써 나타났다. 도 6의 경쟁 분석에 의해 보여진 바와 같이, mLL1 및 cLL1 항체는 유사한 결합 활성을 나타냈다. 이와 마찬가지로, 도 7의 경쟁 분석에서, hLL1 및 cLL1 항체는 유사한 결합 활성을 나타냈다.
[실시예 8] hLL1의 내재화(Internalization)
표준 항체 프로세싱 분석은 라지 세포에서의 내재화 및 물질대사를 평가하는데 사용되었다(Hansen et al., 1996). 세포(107)는123I-라벨링된 hLL1 또는 LL1(107cpm)을 함유하는 조직 배양 배지 1㎖에서 37℃로 1시간 동안 배양되었다. 항체 결합의 특이성(specificity)를 확인하기 위하여, 1/10 샘플 크기(세포, 방사능 및 배지)의 대조군이 라벨링되지 않은 항체(최종 농도 100㎍/㎖)를 첨가하거나 혹은 첨가하지 않고 각 실험에 사용되었다. 결합 배양 후, 결합하지 않은 방사능은 세척에 의하여 제거되었다. 특이성 대조군은 산출되었다. 모든 실험에서 방사능의 세포에의 결합은 라벨링되지 않은 항체에 의해 적어도 90%가 차단되었다. 그 다음, 세포는 새로운 배지 30㎖에 재현탁되었고, 1.5㎖/웰의 24-웰 플레이트에 분배되었다. 1.5㎖의 샘플은 초기 결합 cpm인 방사능 결정을 위해 보존되었다. 플레이트는 CO2인큐베이터 내에서 배양되었다. 3, 24, 48, 및 72시간에서, 다음과 같이 세포가 수집되었다. 세포는 반복된 피펫팅(pipetting)에 의해 재현탁되고, 코니컬 튜브로 옮겨졌다. 웰 및 피펫은 수집된 초기 세포 현탁액에 첨가된 1㎖의 새로운 배양 배지에 헹구어졌다. 튜브는 10분 동안 600×g로 원심분리되고, 현탁액 1㎖는 조심스럽게 수집되어(전체 상층액의 40%), 방사능에 대해 산출되었다. BSA는 담체 단백질에 최종농도 1%로 첨가되었고, 단백질은 5㎖의 차가운 10%(w/v) 트리클로로아세트산(TCA)으로 침전되었다. 4℃에서 30분 동안의 배양 및 5000×g로 15분 동안의 원심분리 후, 상층액은 폐기되고 침전된 단백질은 방사능에 대해 산출되었다. TCA에 의해 침전되지 않은 방사능 라벨링된 단백질은 감성된(degraded) 것으로 판단되었고, 침전된 방사능성 단백질은 완전한 것으로 판단되었다. 세포 펠렛은 세척 후에 세포 내에 남아있는 방사능에 대해 산출되었다. 각 분획에서의 방사능은 초기 결합 방사능의 백분율로 표시되었다. 도 8A에 표시된 바와 같이, hLL1은 라지 세포의 표면에 결합한 후에 생쥐 LL1과 유사하게 신속한 내재화 및 이화(異化) 방법을 보여주었다. 즉, 거의 모든 결합 방사능이 이화(異化)되어 3시간 내에 상층액으로 방출되었다. 이것은 항-CD22 및 항-CD19(Hansen et al., 1996)와 같은 다른 내재화 항체보다 훨씬 빠른 것이다. 초기 시점에서의 연구는 hLL1 및 mLL1의 유사한 프로세싱 패턴을 확인시켜 주었다. 대부분의 이화(異化)과정은 1시간 내에 이루어졌다(도 8B).
[실시예 9] hLL1의 세포독성
hLL1의 세포독성 효과에 대하여 인간 림프종(lymphoma) 세포주(cell line)인 라지 세포에서 mLL1 및 cLL1의 세포독성 효과와 비교하였다. 염소 항-인간 IgG Fc 단편 특이적 항체(α-hFc)는 hLL1 및 cLL1에 대한 교차결합제로 사용되었고, 염소 항-생쥐 IgG Fc 특이적 항체(α-mFc)는 mLL1에 대하여 사용되었다. 배양 전, 5×105라지 세포는 5㎍/㎖의 LL1 항체 및 50㎍/㎖의 적절한 교차결합제를 포함한 1㎖의 배양 배지 내로 살포되었다. 3일 동안, 전체 생육가능한 세포의 수가 매일 측정되었다. 도 9에서 보는 바와 같이, 일반적인 라지 세포의 수는 3일 동안 4~5배 증가하였고, 세포 생육도는 3일 말미에 80% 이상이었다. 교차결합제만으로, LL1 항체만으로, 또는 비교할 수 없는 교차결합제(예를 들어, hLL1 및 염소 항-생쥐 IgG Fc 특이적 항체)와 함께 LL1 항체를 처리한 세포는 일반적인 라지 세포로부터는 구별할 수 없었다. 그러나, hLL1과 항-인간 IgG Fc 특이적 항체의 조합은 효과적으로 세포 치사를 유도했다: 하루에 세포 생육도 40%이상 감소, 및 3일 내에 거의 모든 세포 치사. hLL1의 효과는 mLL1 및 cLL1의 효과와 비교되었다. 다우디(Daudi) 세포를 사용하였을 때에도 유사한 결과가 관찰되었다(도 10). 다른 내재화 항체, hLL2(인간화 항-CD22 항체)에서는 그러한 결과가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 림프종 세포주에서의 hLL1의 세포독성 효과가 세포 표면 상에서 항체의 교차결합에 특이적으로 의존함을 입증하였다.
<110> IMMUNOMEDICS, INC. <120> INTERNALIZING ANTI-CD-74 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> 018733/1162 <140> PCT/GB03/00890 <141> 2003-03-03 <150> 60/360,259 <151> 2002-03-01 <160> 36 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 1 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag gtc acc tgc aag act tct gga tat acc ttc aca aac tat 96 Thr Val Lys Val Thr Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga gtg aac tgg ata aag cag act cca gga gag ggt tta cag tgg atg 144 Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Glu Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac ccc aac act gga gag cca aca ttt gat gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cga ttt gcc ttc tct ttg gaa tcc tct gcc agc act gcc ttt 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 ttg cag atc agc aac ctc aaa aat gag gac atg ggt aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 tca aga tcg agg ggt aaa aac gaa gcc tgg ttt gct tat tgg ggc caa 336 Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggg act ctg gtc act gtc tct gaa 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Glu 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Val Thr Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Glu Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Glu 115 120 <210> 3 <211> 337 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 3 gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt gta cac aga 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agt aga gtg gag gct gag gat ctg gga ctt tat ttc tgc tct caa agt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 tca cat gtt cct ccc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc 333 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 taac 337 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 <210> 5 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 5 cag gtc caa ctg cag cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag gtc acc tgc aag act tct gga tat acc ttc aca aac tat 96 Thr Val Lys Val Thr Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga gtg aac tgg ata aag cag act cca gga gag ggt tta cag tgg atg 144 Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Glu Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac ccc aac act gga gag cca aca ttt gat gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cga ttt gcc ttc tct ttg gaa tcc tct gcc agc act gcc ttt 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 ttg cag atc agc aac ctc aaa aat gag gac atg ggt aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 tca aga tcg agg ggt aaa aac gaa gcc tgg ttt gct tat tgg ggc caa 336 Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggg act ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Val Thr Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Glu Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 7 gac atc cag ctg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt gta cac aga 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agt aga gtg gag gct gag gat ctg gga ctt tat ttc tgc tct caa agt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 tca cat gtt cct ccc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 336 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgt 339 Arg <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Ser Asn Gly Tyr Lys Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct cLL1VH <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Val Thr Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Glu Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 <210> 13 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Construct cLL1Vk <400> 13 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Asp 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 15 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 15 cag gtc caa ctg cag caa tct ggg tct gag ttg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act aac tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga gtg aac tgg ata aag cag gcc cct gga caa ggg ctt cag tgg atg 144 Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac ccc aac act gga gag cca aca ttt gat gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cga ttt gcc ttc tcc ttg gac acc tct gtc agc acg gca tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctc cag atc agc agc cta aag gct gac gac act gcc gtg tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 tca aga tcg agg ggt aaa aac gaa gcc tgg ttt gct tat tgg ggc caa 336 Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggg acc ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 17 gac atc cag ctg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc ctt gga 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 cag ccg gcc tcc atc tcc tgc aga tca agt cag agc ctt gta cac aga 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 aat gga aac acc tat tta cat tgg ttt cag cag agg cca ggc caa tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca agg ctc ctg atc tac aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac aga ttc agc ggc agt ggg tca ggc act gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc agg gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat ttc tgc tct caa agt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 tca cat gtt cct ccc acg ttc ggt gct ggg aca cga ctg gag atc aaa 336 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgt 339 Arg <210> 18 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Ser Gln Ser Ser His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Asn Tyr Gly Val Asn 1 5 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gatgttcagc tgacccaaac tccactctcc 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 cagatccagc tgcagcagtc tggacctgag 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 gagacggtga ccagagtccc ttggccccaa 30 <210> 29 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 ggtctgagtt gaagaagcct ggggcctcag tgaaggtttc ctgcaaggct tctggataca 60 ccttcactaa ctatggagtg aactggataa agcaggcccc tggacaaggg cttcagtgga 120 tgggctggat aaaccccaac actggagagc caacatttga tgatgacttc aaggga 176 <210> 30 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 tcccttggcc ccaataagca aaccaggctt cgtttttacc cctcgatctt gaacagaaat 60 acacggcagt gtcgtcagcc tttaggctgc tgatctggag atatgccgtg ctgacagagg 120 tgtccaagga gaaggcaaat cgtcccttga agtcatcatc aaatg 165 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 gtggtgctgc agcaatctgg gtctgagttc aagaagcc 38 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 aagtggatcc tataatcatt cctaggatta atg 33 <210> 33 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 cagtctccac tctccctgcc cgtcaccctt ggacagccgg cctccatctc ctgcagatca 60 agtcagagcc ttgtacacag aaatggaaac acctatttac attggtttca gcagaggcca 120 ggccaatctc caaggctcct gatctacaca gtttccaac 159 <210> 34 <211> 169 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 tgtcccagca ccgaacgtgg gaggaacatg tgaactttga gagcagaaat aaaccccaac 60 atcctcagcc tccaccctgc tgattttcag tgtgaaatca gtgcctgacc cactgccgct 120 gaatctgtct gggaccccag aaaatcggtt ggaaactgtg tagatcagg 169 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 gatgttcagc tgactcagtc tccactctcc ctg 33 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 gttagatctc cagtcgtgtc ccagcaccga acg 33

Claims (100)

  1. 인간화된, 인간 또는 키메라 항-CD74 항체 또는 그 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인간화된 항-CD74 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 인간화된 항-CD74 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY을 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 인간화된 항-CD74 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 뮤린 항-CD74(mLL1)의 상보성 결정 영역(CDRs) 및 인간 항체의 구조 영역(FR)을 포함하는 경쇄 및 중쇄 변이부를 포함하는 것이며, 여기에서, 상기 인간화된 mAb의 경쇄 변이부는 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 CDR을 포함하고, 상기 인간화된 mAb의 중쇄변이부는 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 인간화된 항체의 경쇄 및 중쇄 변이부의 상기 구조 영역은 상기 뮤린 mAb와 일치하는 구조 영역으로부터 치환된 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 뮤린 단클론항체에서 유래한 아미노산은 도 3B에 도시된 cLL1Vk 서열의 뮤린 경쇄 변이부의 아미노산 잔기 2, 3, 4, 46, 87 및 100, 및 도 3A에 도시된 cLL1VH 서열의 뮤린 중쇄 변이부의 아미노산 잔기 5, 37, 38, 46, 68, 91 및 93으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편은 도 4A에 도시된 중쇄 변이부 및 도 4B에 도시된 경쇄 변이부를 포함하는 것임을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  8. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편은 인간 항체 또는 그 일부의 경쇄 및 중쇄 특정부를 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  9. 제 2항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편은 인간화된 IgG1 임을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 키메라 항-CD74(cCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 키메라 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편은 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 키메라 항-CD74(cCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 뮤린 항-CD74 mAb의 상보성 결정 영역(CDRs) 및 뮤린 항-CD74 mAb의 구조 영역(FR)을 포함하는 경쇄 및 중쇄 변이부 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 특정부를 포함하는 것이며, 여기에서, 상기 키메라 mAb의 경쇄 변이부는 아미노산 서열RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 CDR을 포함하고, 상기 키메라 mAb의 중쇄 변이부는 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 키메라 항-CD74(cCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 도 2A에 도시된 중쇄 변이부 및 도 2B에 도시된 경쇄 변이부를 포함하는 것임을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 키메라 항-CD74(cCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 키메라 IgG1임을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 인간 항-CD74(huCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 인간 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 인간 항-CD74(huCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 아미노산 서열 NYGVN를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함하는 인간 mAb의 중쇄 변이부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 인간 항-CD74(huCD74) 단클론항체(mAb) 또는 그 단편은 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 변이부 및 특정부를 포함하는 것이며, 여기에서, 상기 인간 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부인 huCD74 CDRs는 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하고, 상기 인간 mAb의 중쇄 변이부는 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 인간 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편은 인간 IgG1 임을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 의한 인간, 키메라 또는 인간화된 항-CD74 mAb 또는 그 단편은
    (a) 상기 항체 또는 그 단편과 CD74의 결합이 CD74에 특이적인 그 단편 항체에 의하여 차단되는 특성;
    (b) 배양시 상기 mAb 또는 그 단편이 Raji 림프종 세포에 의해 내재화되는 특성; 및
    (c) 상기 mAb 또는 그 단편이 염소 항혈청과 교차결합되고 뮤린 IgG1 mAb의 Fc와 반응하여 세포 배양에서 Raji 세포의 자가사멸을 유도하는 특성;
    중 적어도 하나 이상의 특성을 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 의한 인간, 키메라 또는 인간화된 항-CD74 mAb 또는 그 단편에 있어서, 상기 단편은 F(ab')2, Fab, scFv, Fv 또는 상기 F(ab')2, Fab, scFv 또는 Fv 의 경쇄 및 중쇄의 일부 또는 전부를 이용하는 융합 구조물이며, CD74에 결합하는 것임을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 융합 단백질은 다원자가 또는 다원자가 및 멀티특이성임을 특징으로 하는 인간, 키메라 또는 인간화된 항-CD74 mAb 또는 그 단편.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1의 특정부는 인간 IgG2a, IgG3 또는 IgG4의 인간 특정부와 교체된 것임을 특징으로 하는 인간, 키메라 또는 인간화된 항-CD74 mAb 또는 그 단편.
  23. 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 경쇄 변이부의 CDR을 포함하는 뮤린 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편.
  24. 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함하는 뮤린 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편.
  25. 뮤린 mAb의 경쇄 변이부는 아미노산 서열 RSSQSLVHRNGNTYLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 TVSNRFS를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SQSSHVPPT를 포함하는 CDR3을 포함하고, 상기 뮤린 mAb의 중쇄 변이부는 아미노산 서열 NYGVN을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 WINPNTGEPTFDDDFKG를 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열 SRGKNEAWFAY를 포함하는 CDR3을 포함하는 뮤린 항-CD74 mAb의 중쇄 변이부의 CDR을 포함하며, 뮤린 항-CD74(mLL1)의 상보성 결정 영역(CDRs) 및 뮤린 항-CD74 항체의 구조 영역(FR)을 포함하는 뮤린 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 의한 단클론항체 또는 그 단편의 Fvs 또는 Fab's를 넷 또는 그 이상으로 함유하는 항체 융합 단백질.
  27. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 의한 단클론항체 또는 그 단편의 Fvs 또는 Fab's 를 하나 이상 포함하고, CD74 항원이 아닌 종양 세포 지표에 특이적인 항체 유래의 Fvs 또는 Fab's를 하나 이상 포함하는 항체 융합 단백질.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 종양 세포 지표는 B-세포계 항원으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 항체 융합 단백질.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 종양 세포 지표는 CD19, CD20 및 CD22로 이루어진 군에서 선택된 항원임을 특징으로 하는 항체 융합 단백질.
  30. 제 27항에 있어서, 상기 종양 세포 지표는 HLA-DR, CD30, CD33, CD52, MUC1 및 TAC로 이루어진 군에서 선택된 항원임을 특징으로 하는 항체 융합 단백질.
  31. CD74에 결합하는 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 의한 단클론항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질을 적어도 하나 이상 포함하고, 진단용 또는 치료용 제제에 결합하는 항체 구성성분을 포함하는 면역접합체.
  32. 약제학적 허용가능한 담체 및 적어도 하나 이상의 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질 또는 면역접합체를 포함하는 치료용 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는질병을 치료하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 질환 또는 질병은 CD74가 발현하는 악성종양임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 질환 또는 질병은 면역 조절불량 질환, 자가면역질환, 장기 이식 거부반응 및 이식편-숙주 반응질환으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 상기 CD74가 발현하는 악성종양은 고형암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 또 다른 B-세포 악성종양 및 T-세포 악성종양으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 고형암은 흑색종, 암종 및 육종으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 암종은 신장암(renal carcinoma), 폐암(lung carcinoma), 장암(intestinal carcinoma), 위암(stomach carcinoma) 및 흑색종으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 35항에 있어서, 상기 B-세포 악성종양은 비호지킨 림프종, B-세포 림프종의 무통 형태, B-세포 림프종의 침투 형태, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질은 20-2000mg의 복용량으로 정맥내로 또는 근육내로 투여됨을 특징으로 하는 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  40. 제 32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나 이상의 치료용 또는 진단용 제제를 투여하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편은 적어도 하나 이상의 치료용 제제를 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여한 후에 투여됨을 특징으로 하는 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 치료용 제제는 항체, 면역조절제, 호르몬, 세포독성 제제, 효소 및 적어도 하나 이상의 면역조절제, 방사성핵종, 효소, 호르몬, 세포독성 제제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합이 접합된 항체로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 세포독성 제제는 약물 또는 독소임을 특징으로 하는 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  44. 제 42항에 있어서, 상기 면역조절제는 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소(lymphotoxin), 조혈인자, 콜로니 촉진 인자, 인터페론, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 조혈인자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 44항에 있어서, 상기 림프독소는 종양괴사 인자임을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 44항에 있어서, 상기 인터페론은 알파-인터페론, 베타-인터페론 및 감마-인터페론으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 44항에 있어서, 상기 콜로니 촉진 인자는 과립구-콜로니 촉진 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포-콜로니 촉진 인자(GM-CSF)임을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 42항에 있어서, 상기 항체는 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUC1, 테나신(tenascin), Ia, HM1.24 및 HLA-DR과 반응하는 단클론항체 또는 그 단편으로 이루어진 군에서 선택되어 약제학적으로 허용가능한 운반제로 제형화되는 것임을 특징으로 하는 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  50. 약제학적 허용가능한 담체 및 적어도 하나 이상의 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질 또는 면역접합체를 포함하는 치료용 조성물을 림프종 또는 백혈병 이외의 CD74 항원 양성 악성종양을 앓고 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 악성종양을 치료하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질은 20-2000mg의 복용량으로 정맥내로 또는 근육내로 투여됨을 특징으로 하는 악성종양을 치료하는 방법.
  52. 제 50항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편은 적어도 하나 이상의 치료용 제제를 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여한 후에 투여됨을 특징으로 하는 악성종양을 치료하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 치료용 제제는 항체, 면역조절제, 호르몬, 세포독성 제제, 효소 및 적어도 하나 이상의 면역조절제, 방사성핵종, 효소, 호르몬, 세포독성 제제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합이 접합된 항체로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 악성종양을 치료하는 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 세포독성 제제는 약물 또는 독소임을 특징으로 하는 악성종양을 치료하는 방법.
  55. 제 53항에 있어서, 상기 면역조절제는 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소(lymphotoxin), 조혈인자, 콜로니 촉진 인자, 인터페론, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 상기 조혈인자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 55항에 있어서, 상기 림프독소는 종양괴사 인자임을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 55항에 있어서, 상기 인터페론은 알파-인터페론, 베타-인터페론 및 감마-인터페론으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 55항에 있어서, 상기 콜로니 촉진 인자는 과립구-콜로니 촉진 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포-콜로니 촉진 인자(GM-CSF)임을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 53항에 있어서, 상기 항체는 치료되는 악성종양을 포함하는 세포에 의해 발현되는 CD74 이외의 종양 지표와 반응하는 단클론항체 또는 그 단편으로 이루어진 군에서 선택되고, 약제학적으로 허용가능한 운반제로 제형화됨을 특징으로 하는 방법.
  61. 약제학적 허용가능한 담체 및 적어도 하나 이상의 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질 또는 면역접합체를 포함하는 치료용 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 면역 조절불량 질환 및 자가면역 질환으로 진단된 적어도 하나 이상의 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  62. 제 61항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질은 20-2000mg의 복용량으로 정맥내로 또는 근육내로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 61항 또는 제62항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 단편은 적어도 하나 이상의 치료용 제제를 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여한 후에 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 상기 치료용 제제는 항체, 면역조절제, 호르몬, 세포독성 제제, 효소 및 적어도 하나 이상의 면역조절제, 방사성핵종, 효소, 호르몬, 세포독성 제제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합이 접합된 항체로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 세포독성 제제는 약물 또는 독소임을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 64항에 있어서, 상기 면역조절제는 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소(lymphotoxin), 조혈인자, 콜로니 촉진 인자, 인터페론, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 상기 조혈인자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 66항에 있어서, 상기 림프독소는 종양괴사 인자임을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 66항에 있어서, 상기 인터페론은 알파-인터페론, 베타-인터페론 및 감마-인터페론으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 66항에 있어서, 상기 콜로니 촉진 인자는 과립구-콜로니 촉진 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포-콜로니 촉진 인자(GM-CSF)임을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 64항에 있어서, 상기 항체는 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUC1, 테나신(tenascin), Ia, HM1.24, 및 HLA-DR과 반응하는 단클론항체 또는 그 단편으로 이루어진 군에서 선택되어 약제학적으로 허용가능한 운반제로 제형화되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  72. 적어도 하나 이상의 치료용 제제가 화학적 접합에 의해 또는 유전적 융합에 의해 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질의 Fvs 또는 Fab's에 결합되고, 약제학적 허용가능한 담체 및 적어도 하나 이상의 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질 또는 면역접합체를 포함하는 치료용 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 림프종, 백혈병, 다른 CD-74가 발현하는 악성종양, 면역 조절불량 질환, 자가면역 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 질환 중 하나를 치료하는 방법.
  73. 제 72항에 있어서, 상기 치료용 제제는 면역조절제, 방사성 라벨, 호르몬, 효소 또는 세포독성 제제를 포함함을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 상기 세포독성 제제는 약물 또는 독소임을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 73에 있어서, 상기 면역조절제는 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소(lymphotoxin), 조혈인자, 콜로니 촉진 인자, 인터페론, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 75항에 있어서, 상기 조혈인자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 75항에 있어서, 상기 림프독소는 종양괴사 인자임을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 75항에 있어서, 상기 인터페론은 알파-인터페론, 베타-인터페론 및 감마-인터페론으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 75항에 있어서, 상기 콜로니 촉진 인자는 과립구-콜로니 촉진 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포-콜로니 촉진 인자(GM-CSF)임을 특징으로 하는 방법.
  80. 적어도 하나 이상의 진단용 제제가 화학적 접합에 의해 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질의 Fvs 또는 Fab's에 결합되고, 약제학적 허용가능한 담체 및 적어도 하나 이상의 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질 또는 면역접합체를 포함하는 진단용 조성물을 림프종, 백혈병, 다른 CD-74가 발현하는 악성종양, 면역 조절불량 질환, 자가면역 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 질환 중 하나를 가지거나 의심되는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질환을 진단하는 방법.
  81. 제 80항에 있어서, 상기 진단용 제제는 방사성동위원소의 광자(光子)가 방사능섬광촬영술(radioscintigrapy)에 의해 검출되는 방사성핵종 또는 PET임을 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법.
  82. 제 80항에 있어서, 상기 진단용 제제는 MRI에 의해 검출될 수 있는 금속임을 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법.
  83. 제 80항에 있어서, 상기 진단용 제제는 초음파 주사 장치에 의해 검출될 수 있는 리포좀 또는 가스 충진 리포좀임을 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법.
  84. 항체 접합체를 생성하는 I종 또는 II종 MHC 항원 펩티드와 비공유 결합된 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 의한 단클론항체 또는 그 단편을 포함하고, 암 또는 감염성 질환의 환자를 치료하는데 이용되는 백신.
  85. 제 84항에 있어서, 상기 I종 또는 II종 항원 펩티드는 상기 단클론항체 또는 그 단편에 항원제공 세포에 의해 결합되는 보다 큰 펩티드 또는 단백질로부터 가수분해 소화되어 방출되는 것임을 특징으로 하는 백신.
  86. 제 84항 또는 제 85항에 있어서, 상기 항체 접합체는 단클론항체 또는 그 단편을 코딩하는 cDNA를 항원 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 cDNA와 융합한 다음, 세균, 효모 또는 포유동물에서 상기 융합 단백질을 발현하여 제조된 것임을 특징으로 하는 백신.
  87. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 의한 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질이 암 또는 염증 세포 지표 기질, 감염성 질환균 표면의 에피토프 또는 혈액 또는 체액 내의 유해 물질에 특이적인 항체 또는 항체 단편과결합하는 양특이성 또는 멀티특이성 항체.
  88. 아래와 같이 이루어진 군에서 선택된 단클론항체 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 서열:
    (a) 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 의한 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편;
    (b) 제 31항의 면역접합체;
    (c) 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 의한 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편을 둘 이상 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편;
    (d) 제 26항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 의한 항체 융합 단백질 또는 그 단편;
    (e) 제 84항 내지 제 86항 중 어느 한 항에 의한 백신; 및
    (f) 제 87항의 양특이성 또는 멀티특이성 항체.
  89. 제 88항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  90. 제 89항에 있어서, 상기 벡터는 pdHL2 또는 GS 임을 특징으로 하는 발현 벡터.
  91. 제 90항에 있어서, 상기 pdHL2 또는 GS 벡터는 IgG1의 중쇄 및 경쇄 특정부를 코드하여 키메라, 인간화된 또는 인간 IgG를 발현하는데 사용되는 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.
  92. 제 88항의 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포.
  93. 제 92항에 있어서, 상기 숙주 세포는 세균, 효모 또는 포유동물임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  94. 제 93항에 있어서, 상기 포유동물은 림프구 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  95. 제 94항에 있어서, 상기 림프구 세포는 골수종 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  96. 하기 단계를 포함하는 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 발현시키는 방법:
    (a) 제 88항의 DNA 서열로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; 및
    (b) 상기 항-CD74 단클론항체 또는 그 단편 또는 그들의 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 분비하도록 상기 숙주 세포를 배양하는 단계.
  97. 제 96항에 있어서, 상기 숙주 세포는 세균, 효모 또는 포유동물임을 특징으로 하는 방법.
  98. 용도 CD74를 발현하는 악성종양, 면역 조절불량 질환, 자가면역 질환, 장기 이식 거부반응 및 이식편-숙주 반응질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 질병을 치료하기 위한, 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 의한 항-CD74 항체 자체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 자체 또는 그 단편의 용도.
  99. CD74를 발현하는 악성종양, 면역 조절불량 질환, 자가면역 질환, 장기 이식 거부반응 및 이식편-숙주 반응질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 질병을 치료하기 위한 적어도 하나 이상의 치료용 제제에 결합하는 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 의한 항-CD74 항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편 또는 면역접합체를 포함하는 치료용 접합체의 용도.
  100. CD74를 발현하는 악성종양, 면역 조절불량 질환, 자가면역 질환, 장기 이식 거부반응 및 이식편-숙주 반응질환을 진단하기 위한 적어도 하나 이상의 치료용 제제에 결합하는 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 의한 항-CD74 항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편 또는 면역접합체를 포함하는 진단용 접합체의 용도.
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