KR20040022430A - 혼합 연속/뱃치 발효 공정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 음용 알코올의 생산 방법에 있어서, 발효 가능한 당을 함유하는 맥아즙을 초기에 발효시키거나 또는 핏칭하는 것을 적용한다. 예시적 연속 단계는 수퍼 부유 응집 이스트와 엄격한 산소 제어를 적용하는 가스 부양 바이오리엑터의 사용을 포함한다. 연소 단계는 연속 방법으로부터 배출된 "적어도 부분적으로 발효된"것을 마무리용 뱃치 공정으로 이송함을 특징으로 하는 방법.

Description

혼합 연속/뱃치 발효 공정{COMBINATION CONTINUOUS/BATCH FERMENTATION PROCESSES}

이 분야의 수많은 최근 공보는 고정에 관한 양조 산업의 큰 관심을 예시하고 있다. 양조산업의 일반적인 상태에 관한 몇 개의 리뷰(Enari, 1995; Iserentant, 1995; Masschelein, 1997; Mensour et al,, 1997; Stewart, 1996; Virkajarvi & Linko, 1999)에서 맥주 생산의 고정화에 가능한 혁신적 역할이 주목되었다. 3.1 내지 3.5장에 언급된 그룹이외에 많은 다른 기관이 양조 적용에 고정화 세포 연구 개발에 관여하고 있다. 미국의 밀러 부루잉 컴패니(Duncombe, et al., 1996; Tata et al., 1999)은 미우라 델타(Meura Delta) 테스트 유니트 및 숏 엔지니어링(Schott Engineering)에 의해 배포된 유동상 바이오리엑터에 관한 1차적 평가를 수행하였다. 또한 쿠어즈 부루잉도 미우라 델타 시스템으로 기초 실험을 수행하였다.

하이네켄 협력자인 슬로백(Slovak) 공대는 맥주 생산용 공기 부양시스템(air lift system)에서 팩틴산칼슘(calcium pectate)의 사용을 조사하였다(Domeny, 1996). 더 최근에, 슬로백 공대의 한 그룹은 그들의 진행중인 연구에 관한 몇 개의 논문을 발표했다(Smogrovicova et al., 1997; Smogrovicova & Domeny, 1999). 기니스(Guinness)는 고정을 위한 각종 흡착 담체의 사용 및 유동상 바이오리엑터에서의 후속 발효를 조사하였다(Donnelly, 1998). 1999년에 도넬리(Donnelly)와 동료들은 유동상 바이오리엑터 내에서의 당대사의 동역학에 관한 논문을 발표했다. 그들의 실험적 구성은 정부 발효 이스트용 고정화 담체로서 시란(Siran) 다공성 유리 비드의 사용을 포함한다.

독일의 홀스텐 부라우에레이 아게(Hosten Brauerei AG) 및 루르기 아게(Lurgi AG)는 무주정 맥주의 연속 생산에 관한 파이롯트 플랜트를 공동 개발하여 운전하였다(Dziondzizk, 1995). 발효에 단일 단계 루프 유동상 발효기(130ℓ)내에 알긴산칼슘 비드를 사용하고, 맥주의 비알코올화에 시이브 바텀 컬럼(7 시이브 바텀)을 사용하였다. 이 공정에 요하는 총 생산 시간을 8.5시간이었다.

일본 삿포로 양조 주식회사 연구소 팀은 맥주의 주된 발효용 유동상 반응기중 고정화 세포의 사용을 연구하였다. 그들의 연구는 고정화 메트릭스로서 폴리비닐 알코올 겔 비드(Shindo & Kamimur, 1990), Ca-알기네이트 겔 비드(Shindo et al., 1994a), 복층 겔 파이버(Shindo et al., 1994a) 및 키토산 겔 비드(Shindo et al., 1994c)를 사용하는 것이었다. 후자의 연구에서, Chitopearl^??타입 II 비드(키토산 비드)를 25용량%을 함유하는 1리터 작업 용량 바이오리엑터를 글루코아밀라제로 처리한 맥이즙으로 연속 가동하는 것이다. 이 효소 처리는 통상의 뱃치 발효와 유사하게 고정 세포 시스켐중 아세테이트 에스테르 형성을 허여하여 제품 매칭에 더 밀접한 1단계로 된다.

사포로 연구팀은 반복 뱃치 모드중 가동되는 키토산 비드 유동 비드 발효기의 개발에 초점을 맞췄다. 이 시스템은 큰 문제없이 75일간 가동되었고, 생성된 맥주는 시판품과 그 품질이 유사하였다. 비응집 균주가 응집 균주보다 훨씬 효과적으로 나타났다(Maeba et al., 2000; Umemoto et al., 1998).

디아세틸 환원에 관한 2개의 다른 접근은 1997년 마스트리히트에서 개최된 EBC 콩그레스에서 제시되었다. 프랑스 연구자들(Dulieu et al., 1997)은 엔캡슐된 □-아세토락테이트 데카르복실라제를 사용하여 □-아세토락테이트를 아세토인으로 신속하게 전환시킴을 제시하였다. 미우라 델타는 아세토락테이트를 아세토인으로 냉각 및 직접 전환에 촉매로서 알루미노실리케이트 제올라이트의 사용에 관한 기초 결과를 강조하였다(andries et al., 1997). 이와 같은 처리가 효과적이고, 소비자에게 받아드려지게 되면, 쿨터 및 말파 라발(Cultor and Alfa Laval)에 의해 제안된 숙성 시스쳄에 더 저렴한 선택이 될 것이다.

맥주 생산용 고정 분야에서 다른 비산업적 연구는 싱가포르 표준산업연구소를 들 수 있으며, 그들은 충전된 베드 반응기중에 사용되는 알기네이트 겔 입자의 쓰레드 타입의 사용을 연구하였으며, 그 결과, 알기네이트 비드보다 더 풍미가 높은 것이었다(Que, 1993). 포르투갈의 도 민호 대학의 마프라(Mafra)와 그의 동료는 맥주의 연구 숙성에 초응집 이스트를 사용하는 것을 발표했다(Mafra et al.,1997). 또한, 이들은 에탄올 생산에 공기부양 바이오리엑터 중에서 응집 이스트를 사용하는 것에 대하여 공표하였다(Vecente et al., 1999; Domingues et al., 2000).

또한, 각종 학술단체의 연구자들은 최근 맥주 생산용 고정의 사용을 조사하였다(Argiriou et al,, 1996; Bardi et al., 1996; Moll & Duteurtre, 1996; Nedovic et al., 1996a; Nedovic et al, 1996b; Norton et al., 1995; Scott et al., 1995; Wackerbauer et al., 1996a; Wackerbauer et al, 1996b). 또한, 중국의 연구팀(Chao et al., 1990; Yuan, 1987; Zhang et al., 1988), 러시아의 연구팀(Kolpachki et al, 1980; Sinitsyn et al., 1986) 및 체코스로바키아의 연구팀(Chladek et al., 1989; Curin et al,, 1987; Oolednikova et al., 1981)도 1980년대에 고정 세포 기술에 관여하고 그 결과를 공표하였다.

본 발명의 기초가 되는 연구에 대한 종래기술에 관한 수많은 참고 문헌으로 하기 것을 들 수 있다:

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본 발명은 음용 알코올 제품, 특히 맥주의 생산 및 특히 혼합 연속 및 뱃치 발효 공정 및 이 공정을 사용하여 음용 알코올의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 발효 가능한 당을 함유하는 맥아즙을 고정하거나 또는 최초로 초기에 발효시킴을 적용하는 연속 발효단계로 이루어진 음용 알코올 제품의 생산방법에 관한 것이다.

특히, 연속 발효방법을 가스 부양 타입 바이오리엑터의 사용, 부유 응집(특히, 고 부유응집, 수퍼 부유응집) 이스트 균주의 적용 및 엄격한 산소 제어의 적용을 수행하는 바람직한 방법을 제공한다.

본 발명의 특히 바람직한 형태에서, 연속방법에서 배출되는 "적어도 일부 발효"는 종료를 위한 뱃치법 단계로 이송된다(본 발명의 청구범위의 내용에 탄화수소를 알코올로 발효하는 것을 통해 발효 완결을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아님).

본 발명은 맥주(특히, 저알코올 맥주, 라거 및 특히 북아메리카 스타일의 맥주를 포함)의 생산에 관한다. 이와 관련하여, the Essentials of Beer Styl- F. Eckhardt 참조.

본 발명에 따라 각종 실시에 유용한 연속 단계에 따라, 가스 부양 바이오리엑터중에서 연속 단계를 수행하는 청구범위 제 1항의 방법에서 고정화 세포를 이용하는 것이 바람직하고, 또한 고정화된 담체 또는 부유 응집 이스트의 어느 하나를 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 세포를 고정화하는 담체 대신에 부유 응집 이스트를 사용하고, 특히 이 목적을 위해 수퍼 부유 응집 이스트를 사용하는 것이 바람직하다. 이하, 본 발명의 상세한 설명중에서 연속법이 제공되는 것과 관련한 바람직한 실시예 및 이점을 설명할 것이다. 이들은 인공(예, 제어) 가스 혼합물의 사용, 질소, 이산화탄소 및 질소 그리고 공기의 사용을 포함한다. 또한, 여기에 뱃치 저장 프로세싱 단계에 관하여 더 상세히 설명될 것이다. 본 발명의 어떤 구체예에서 뱃치 저장 프로세스의 초점을 발효 가능한 탄화수소의 알코올로의 전화의 "완료"의 주제를 넘는다(즉, 이는 가공의 연속 단계에서 실질적으로 완료되는 경우이다). 이와 같은 구체예에서, 뱃치 저장 프로세싱의 기초 포커스는 특히 디아세틸 및 아세트알데히드와 관련한 향미 매칭(맛의 보정)이다. 본 발명의 바람직한 구체예은 복수의 뱃치 저장 탱크중 분배 집합체(고정 배수 또는 선택적으로 도관의 연결 및 분리)를 통해, 고정된 및/또는 일부 발효된 맥아즙의 포스트-연속 단계 분배를 제공하는 것이다. 연속 분배 방법에 있어서, 하나의 탱크가 채워지고, 이어서 다음 것이, 그리고 그 다음 것이 채워진다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 연속 반응기 처리량과 뱃치 보관량은 용량 및 반응기/뱃치 보관 용기의 수에 따라 일치되어 생산 유동 속도는 시간과 용량의 단위로 일치된다. 이상적으로는 뱃치 보관 용기는 세척되는 시간에 완료된 제품이 배출되고, 연속 발효 단계로부터 나온 것으로 연결 및 재충전되는 것이다.

본 발명의 다른 실시예에 따라, 어떤 구체예에는 특히 맥아즙/맥주의 산소 함량에 관련하여 관리된다. 이는 이 방법의 연속 및 뱃치 보관 단계에 적용된다. 연속단계에 있어서, 산소 농도는 여러 가지의 효과를 가지나, 더 높은 알코올을 향미 활성 에스테르로 전환을 최적화하기 위하여 산소 농도는 최소로 되어야 한다. 이와 관련하여, 퓨젤 에스테르 향미 밸런스를 관리하기 위하여 요구되는 엄격한 산소 제어가 이루어진다면 고농도 알코올은 뱃치 보관 가공 단계에 의해 크게 영향 받지 않음을 주목할 수 있다. 이와 관련하여 연속 발효전에 이산화탄소로 맥아즙을 미리 퍼지할 수 있다.

본 발명의 1 구체예에서, 이 프로세스의 연속 단계의 기본 목적은 하류 뱃치발효의 핏칭을 제공하여 뱃치 보관 프로세스를 일으키는 것이다.

더 명백하게 하기 위하여, 종래의 기술의 내용을 전체적으로 결합하여 본 명세서의 일부를 형성할 수 있다.

상세한 설명

이하, 본 발명의 관점의 2부분 설명이다.

설명은 그래프, 식, 도면 등을 포함하거나 언급하며, 이들은 특정 번호에 따라오는 "그림(Figure)라는 용어에 의해 언급되며, 첨부 도면의 각각은 특정 번호에 따라오는 "도(FIG)라는 용어에 의해 언급될 것이다. 이들 도면에서, 예시된 항은 정확한 스케일이 아닐 수 있다.

첨부도면에서:

도 1은 파이롯트 스케일 연속 발효 시스템의 프로세스 유동도이며, 여기서, 장치의 각 부분은 표 5.1에 요약되어 있다.

도 2는 50ℓ 파이롯트 스케일 가스 부양 흡출관(GLDT) 바이오리엑터의 개략도이다.

도 3은 내주 흡출관 및 내부 분리기의 위치을 포함한 도 2의 반응기의 횡단면도이다.

도 4는 도 2의 바이오리엑터의 헤드 플레이트의 상세도이다.

도 5는 도 2의 바이오리엑터의 바디의 상세도이다.

도 6은 도 2의 원뿔형 저부의 상세도이다.

도 7은 도 2의 바이오리엑터의 가스 파이프 살포기의 상세도이다. 중심에 대하여 0.8 cm의 중심의 길이 방향 공간과 0.6cm의 세로 방향 공간을 갖는 1.27 cm 직경 파이프 살포기에 총 160개의 구멍(0.16 cm 직경)이 형성되어 있다.

도 8은 스테이튜 믹서(라바트 미국 특허 출원 제 2,133,789)를 사용하여 연속 비드 생산 다이어그램을 나타낸다.

도 9는 Schott Engineering에 의해 공급된 Siran(상품명) 글래스 비드의 사진이다.

도 10은 World Minerals에 의해 공급된 Celite(상품명) 규조토 비드의 사진이다.

도 11은 라바트 부루잉 컴패니 리미티드("라바트") 실험실에서 제조한 k-카라기난 겔 비드의 사진이다.

도 12는 비 부유응집 이스트; 사슬 형성 이스트 및 부유응집 이스트의 각각을 나타내는 사진이다. 이들 이미지는 현미경 100X 이다.

도 13은 배지 부유 이스트 균주 LCC3021의 현미경 100X 사진이다.

도 14는 수퍼 부유 이스트 균주 LCC290의 현미경 100X 사진이다.

도 15는 카파-카라기난 겔 비드를 제조하기 위한 정전 믹서의 계통도이다. 정전 믹서에서, 유체를 믹서를 통해(믹서보다는 유체를 통해) 이동하여 이들이 파이프 라인을 통해 펌프된 것 같이 유체 혼합이 이루어진다.

도 16은 1차 발효의 가스 부양 흡출관 바이오리엑터 시스템의 또 다른 계통도이다.

도 17은 도 15의 가스 부양 흡출관 바이오리엑터 용기의 사진이다.

도 18은 도 16의 13ℓ(즉, 8ℓ의 작업 용량)의 가스 부양 튜브 반응 용기의 상세도이다.

도 19는 바이오리엑터 헤드 플레이트의 상세도로서, 여기에는 산소 센서용 1-액체 배출 포트; 2-써모스태틱 제어기에 연결된 온도 센서용 써모웰; 3-온도 프로우브; 4-산소 센서용 액체 리턴 포트; 5-접종 포트; 6-스테인레스 스틸 캡을 갖는 맴브레인 샘플 포트가 도식화되어 있다.

도 20은 바이오리엑터 액상중에 잠긴 필러 유니트를 갖는 산소 센서용 액체 취출 포트의 프로파일이다.

도 21은 가스 부양 바이오리엑터 시스템(상세한 장치 설명은 표 5.1 참조)을 사용하여 연속 1차 맥추 발효용 상세도 및 정면도이다.

도 22는 카라기난의 겔화 메카니즘(Rees로부터 적용, 1972)의 개략도이다.

도 23은 1차 발효동안 고정화 이스트에 의한 맥아즙 구성의 이용 개략도이다.

도 24는 제로 타임 발효에서 고정화 라거를 함유하는 카파-카라기난 겔 비드의 사진이다.

도 25는 각각의 이스트 세포상에 발아 흔적을 나타내는 뱃치 발효 2일 후의 카파-카라기난 겔 비드에 포촉된 라거 이스트의 꼬투리의 사진이다.

도 26은 연속 발효 2개월 후의 라거 이스트 세포를 나타내는 카파-카라기난 겔 비드의 외부 가장자리의 사진이다.

도 27은 연속 발효 2개월 후의 카파-카라기난 겔 비드의 외부 영역에서 라거이스트 세포의 사진이다.

도 28은 연속 발효 2개월 후의 카파-카라기난 겔 비드의 중심에서 라거 이스트 세포의 사진이다.

도 29는 연속 발효 6개월 후의 카파-카라기난 겔 비드의 전체 사진을 나타내며; 많은 분쇄된 비드가 속빈 센터를 가졌다.

상세한 기술 - 1 부:

이스트 균주 및 접종 조제

이 과제에서 수행되는 발효는 사카로마이세스 세르비자에 족(또한, 사카로마이세스 우바룸 및/또는 사카로마이세스 칼르베르젠시스로 불리기도 한다)으로부터의 배수성 이스트를 사용한다. 양조 업계는 이 이스트를 라거 타입 맥주 발효 생산 이스트로 일반적으로 불릴 것이다. 이것의 특징은 발효 종류에 의해 액체 배지로부터 정착되는 라거 이스트능에 부여된다. 라거 이스트와 달리, 에일(Ale) 이스트는 발효 용기의 정부까지 올라가므로 정부 발효 균주로 알려졌다. 정착 또는 상승하는 이스트의 능력은 이스트가 라거냐 또는 에일 타입이냐에 필수적으로 의존하는 것이 아니라, 균주 특성에 의한다. 라거 이스트는 전형적으로 34℃ 이상에서는 발효하지 않으나, 에일 이스트는 멜리비오즈를 발효시킬 수 없다. 과학자들은 이 특성을 에일 이스트로부터 라거 균주를 차별화하는 것으로 사용할 것이다(McCabe, 1999).

라바트 배양 콜렉션으로부터 매지 붕 응집 이스트 균주 사카로마이세스 세레비자에 균주 3021이 유리 세포 자가 응집 발효 및 카라기간 고정 발효에 사용되었다. 고정화제로서 수퍼 부유 응집 이스트의 사용을 포함하는 이 목적을 위하여, LCC3021 균주의 변이종, 즉, LCC290을 사용하였다. 순수한 이스트 배지를 라바트 기술 개발부에 위치한 -80℃의 냉장고에 극저온으로 저장하였다. 필요에 따라, 이스트 배양의 살균 루프를 PYG 한천 플레이트(펩톤 3.5g, 이스트 추출물 3.0g, KH₂PO₄2.0g, MgSO₄·7H₂O, 1.0g, (NH₄)₂SO₄, 1.0g, 글루코오즈 20.0g, 및 1ℓ의 증류수에 용해한 한천 20.0g)상에서, 21℃에서 호기적으로 예비 성장시켰다. 분리한 이스트 콜로니를 저온 살균한 맥아즙 10㎖을 함유하는 시험관에 옮기고, 21℃에서 24시간 진탕하였다. 이 접종을 적당한 맥아즙 용량으로 전술한 배지를 첨가함(190㎖에 10㎖, 300㎖에 200㎖ 및 4ℓ에 1ℓ)으로서 점진적으로 5ℓ까지 규모를 늘렸다. 이스트 접종을 원심분리 자에 이송하고 10000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리했다. 모든 후속 발효용 요구되는 이스트 덩어리는 얻어진 ?? 이스트 펠렛(30% v/v)으로부터 취하였다.

발효 배지

라바트 런던 부루하우스에서 생산한 산업용 라거를 모든 발효용 영양 배지로 사용하였다. 맥아즙 비중을 플레이토(^oP)로 표시하였다. 식 4.1은 비중과^oP사이의 관P를 나타낸다.

^oP=135.977·SG³-630.272·SG²＋ 1111.14·SG ­616.868 (4.1)

이 과제를 통한 맥아즙은 17.5^oP이며, 이는 비중 1.072에 상응한다.

표 4.1은 섹션 4.7.2에 기술된 고속 액체크로마토그래피(HPLC)로 측정한 맥아즙의 전형적 탄화수소의 프로파일을 제공한다. 이 맥아즙의 탄화수소의 약 73%가 발효된 반면, 이 연구에 사용된 양조 이스트는 더 긴 사슬의 탄화수소 27%이상 취할 수 없었다.

표 4.1 발효에 이용된 맥아즙의 전형적 탄화수소 조성. 맥아즙은 라바트 런던 부루하우스에서 생산되었고, 비중이 17.5^oP이었다.

	평균(g/ℓ)	변화 편차(%)	발효(%)	미발효(%)
프락토오즈	3.3	18.0	1.9
글루코오즈	16.5	4.3	9.3
말토오즈	87.7	10.1	47.8
말토트리오즈	25.2	10.8	14.2
말토테트로오즈	6.4	18.3		3.6
폴리사카라이드	41.1	9.1		23/2
es
합계	177.2		73.2	26.8

분석된 물질의 대부분의 변화 계수는 10%와 20%의 범위이다. 이 생존율은 이용되는 산업용 생산 공정의 대부분 및 원료 물질의 생존율에 기인하다.

고정 타입

3종의 고정, 즉, 포촉, 흡착 및 자가 응집의 고정이 이 Ph.D. 연구시에 시험되었다. 산업적 원료 담체로서, 우선 공급자 데이터가 제시되고 실험실 분석으로 보충되었다. 조사된 담체의 사진과 사이즈 분포는 어느 곳에서도 제시된다. 2종의 흡착 메트릭스를 파리롯트 스케일 가스 부양 흡착 튜브 바이오리엑터에서 시험되었다. 이들 담체의 사진이 제시되었다. Schott Engineering은 소성 글래스 비드 담체, Siran(상품명)을 제공하였다. 선택된 입자는 1-2mm이었고, 55-60%의 기공율, 60 내지 300 □m의 공극 사이즈를 갖는 이스트 고정용 개구 공극을 갖는다. 이러한 종류의 담체는 생물학적으로나 화학적으로 안정하고, 세정, 재사용하기 용이하고, 스팀으로 살균할 수 있으며, 맛에서 중성이어서 식품으로 인정되는 것이다.

World Mineal of California는 규조토로 이루어진 구형 담체를 공급하였다. 이 담체는 열 및 화학적 안정성, 기게적 강도 및 강도의 이점을 제공한다. 기초 원료 물질로서 규조토가 맥주 여과용 양조 산업에서 일반적으로 사용되고 있다. Celite R-632(상품명)이 세포 고정용으로 특별하게 설계된 것이다.

공급자 스펙은 다음과 같다.

사이즈 범위:0.595mm 내지 1.41mm (14.30 메쉬)

평균 공극 직경: 7.0 □m

총 공극 량: 1.19 ㎤/g

충진된 베드 밀도:0.334 kg/㎥

라바트 부루잉 컴패니 리미티드 실험실에서 담체로 포촉된 카파-카라기난 겔 비드를 생산하였다. 생산 공정은 섹션 5.2에 기술되고, 이 생산공정의 결과는 섹션 6.2.1에 제시되었다.

고정, 자가 응집의 간단한 모드는 응집력이 있는 이스트 균주의 선택에 의해 가능하다. 산업적 라거 이스트 LCC3021은 부유 응집의 자연능를 가지며, 배지 부유응집으로서 고려된다. 발효 진행으로서, 0.5 mm 내지 1.0 mm의 이스트의 작은 덩어리는 액체 배지를 형성할 것이다. LCC3021 라거 이스트의 변종이 LCC290은 훨씬 큰 플록(진탕도에 따라 1.0 mm 내지 5.0mm)을 형성할 것이므로, 수퍼 부유응집으로 분류된다. 각종 이스트 플록의 이미지를 여기에 제시한다.

샘플링 프로토콜

발효가 진행함에 따라, 많은 간격으로 발효 액체로부터 샘플을 꺼낼 필요가 있다. 이 과제를 수행하기 위하여, 살균 샘플링 밸브를 Scandi-brew에서 구입하였다. 이 밸브는 스테인레스 스틸로 만들어졌으며, 무균 환경을 유지하기 위하여 에탄올을 저장하는 챔버(상부 및 저부 포트에 의해 한계를 정함)를 갖춰 있다. 신선한 에탄올(75용량%)를 챔버를 통해 운전하고, 캡을 밸브의 정부 포트에 위치시켰다. 이 밸브 레버를 당기고, 약 50㎖의 액체 샘플을 멸균 용기에 수집한다. 제 2 샘픔을 수퍼 부유응집 이스트를 함유하는 발효액에서 수집하여 세포를 계측하기 전에 적당한 탈응집을 수행할 수 있다. 샘플링이 완료되면, 밸브 챔버를 뜨거운 물 및 과아세트산으로 린스하고, 마지막으로 에탄올로 린스한다. 보유 캡을 바닥 분수공에 위치시키고, 챔버를 다음 샘플링을 위해 에탄올로 채운다.

미생물학적 모니터링

유리 이스트 세포 계측 및 메틸렌 블루법에 의한 생존율

현탁시킨 이스트 세포를 함유하는 액체 샘플을 우선 상기 샘플링법으로 발효배지로부터 모은다. 10^-4㎖의 Hause Scientific Company Hemacytometer를 사용하여 세포 계측을 광 현미경으로 수행하였다. 계수 필드에서 150 내지 200 세포의 총 이스트 계수를 달성하기 위하여 액체 샘플을 증류수로 희석하였다. Heggart et al.(1999)는 이스트의 생존율 및 활성도 특성에 영향을 주는 모든 인자를 기술하였다. 샘플중의 생존도를 평가하기 위하여 미국 양조 화학자 협회(American Society of Brewing Chemists)에 의해 규정된 메틸렌 블루 스테이닝 기술을 사용하였다(Technical Committee and Ediorial Committee of the ASBC, 1992). 생세포는 메틸렌 블루에 넣어 산화시키면 무색으로 된다. 한편, 사멸 세포는 청색을 띈다. 생존 평기를 위한 메틸렌 블루의 제제에 다음 시약이 사용되었다:

용액 A: 500㎖ 증류수중 메틸렌 블루 0.1g

용액 B: 500㎖ 증류수중 KH₂PO₄13.6g.

용액 C: 100㎖ 증류수중 Na₂HPO₄·12H₂O 2.4g.

Fink-Kuhles 버퍼 메틸렌 블루는 500㎖의 용액 A, 498.75㎖의 용액 B 및 1.25㎖의 용액 C를 혼합하고 pH를 4.6으로 조정하여 제조하였다.

희석 세포 현탁액 및 메틸렌 블루의 혼합물을 시험관에 제조하고, 충분히 혼합했다. 이 혼합물을 수분간 방치(세포와 염료의 접촉 확보)하고, 액체 한 방울을 hemacytometer 계수 글래스와 커버 슬립(정해진 양) 사이에 떨어뜨렸다. 생존 세포의 백분율은 계수에서 생세포 및 사멸세포를 계측하고, 생세포를 총 세포수로 나누어 얻었다.

4.5.2 고정화 이스트 세포 계측 자가 응집

플록을 형성하는 이스트 세포를 사용할 때, 세포가 샘플 자에 정착하는 경향이 있기 때문에, 액체 샘플중에 존재하는 세포의 수를 정확히 산출하는 것은 어렵다. 대표적인 샘플을 얻기 위하여 탈응집제를 사용하였다. 이 실험에서 0.5용량 %의 황산용액을 응집 이스트 세포를 불안정하게 하는 데 사용하여 대표적인 이스트 세포를 계측하였다. 섹션 4.5.1에 설명한 동일한 계수 및 생존율 절차를 희석액으로 증류수 대신에 황산을 사용하였다.

고정화 이스트 세포 계측 겔 비드

이스트 계측을 겔 포촉 세포에서 수행하기 전에, Polytron (등록상표) 장치(Brinkmann Instruments)을 사용하여 겔 메트릭스를 분쇄할 필요가 있다. 우선 비드 샘플을 멸균 시이브(500 □m 메쉬 사이즈)을 통해 통과시키고, 멸균수로 씻어냈다. 겔-포촉-세포 비드 1 ㎖와 증류수 19 ㎖를 50㎖의 샘플 용기에 첨가했다. Polytron을 물리적으로 겔을 분쇄하는 데 사용하여 이스트를 용액에 방출했다. 섹션 5.5.1에 기술된 계측 및 생존도 법은 겔-분쇄 샘플에서 수행하였다.

오염 모니터링

이 과제를 통해 수행된 모든 발효는 오염을 정규적으로 모니터했다. 모니터링 프로그램은 50ℓ 연속 발효기중의 액체 및 저장 용기중의 맥아즙을 적어도 1주일에 1회로 이루어진다. 액체 샘플을 무균적으로 꺼내, Universal Beer Agar(UVA, Difco Laboratories) 및 10mg/ℓ의 시클로헥스이미드로 이루어진 배지 플레이트 상에 놓는다. 이들 시험 샘플을 28℃에서 10일 호기 및 혐기 조건에서 인큐베이트한다. 자르 중에 잔존하는 산소를 제거한 AnaeroGen(상품명) packet(Oxoid)를 함유하는 자르 선택된 플레이트를 놓아 소망의 혐기성 성장 환경을 만든다. 지시 스트립(산소가 존재하면 핑크로 변함)을 사용하여 환경이 진정 혐기성 조건인지 확인한다. 만일 액체 샘플에 세균 오염이 있으면, 이 방법에 의해 검출될 수 있다.

야생 또는 비양조 이스트 검출은 세균 및/또는 양조 이스트 성장을 좋아하지 않는 분리 성장 배지가 요구된다. 0.4 g/ℓ CuSO₄로 보충된 이스트 배지(YM, Difco Laboratories)로 제도된 유출 플레이트를 야생 이스트의 성장(25℃에서, 7일간)시키는데 이용하였다. 액체 샘플을 37℃에서 7일간 PYN 한천(펩통 이스트-추출 영양소, Difco Laboratories)에서 인규베이트하면 비라거 양조 이스트를 검출할 수 있다. 라거 이스트 성장은 34℃에서 저해되어 이 플레이트에서 어떠한 성장도 에일 이스트 오염을 나타낸다.

분석 방법

적절한 눈금 매기기가 표준 산업 작동 공정에 설명된 대로 모든 관련 장치에 행해졌다.

에탄올

맥주와 발효 샘플에 있는 에탄올 농도가 Tenical Committee and EditorialCommittee of the Amenrican Society of Brewing Chemists(1992)에 의하여 설명된 가스 크로마토그래피 방법을 사용하여 분석되었다. 가스가 제거된 액체 샘플은 5% v/v 이소프로패놀 내부 표준과 함께 섞인 후 0.2 □ℓ의 이 혼합물은 Perkin Elmer 8500 가스 크로마토그래프 안으로 주입되었다. 다음의 리스트는 GC의 정확한 셋업에 관하여 보다 상세한 설명을 나타낸다.

불꽃 이온화 검출기(FID)

Dynatech 오토샘플러

크로모조브 102, 80-100 메쉬 서포트 패킹

20㎖/min 흐름의 헬륨 캐리어 가스

등온으로 주입기 온도 175℃, 검출기 온도 250℃ 및 컬럼 온도 185℃

탄수화물

글루코오스, 프락토오즈, 말토우즈, 말토트리오즈, 다당류 및 글리세롤 농도가 고성능 액체 크로마토그래피(Spectra-Physics SP8199XR HPLC) 시스템을 이용하여 측정되었다. 탄수화물이 시스템을 통하여 용출됨에 따라 유동화 상태로서의 2염기의 인산 칼륨과 함께 양이온 교환 컬럼(Bio-Ras Aminex HPX-87K)이 이들 탄수화물을 분리하기 위하여 사용되었다. 이후 화합물의 양이 적절한 화합물의 피크를 생성하기 위하여 유동 인덱스 검출기를 이용하여 측정되었다. HPLC는 800psi의 후압, 85℃의 컬럼 온도, 40℃의 검출기 온도에서 작동되었다. 샘플은 가스가 제거되었고 적정 수중으로 희석되었다. 이후 10 □ℓ가 0.6㎖/min의 유속으로 시스템 내에 주입되었다.

양조업계는 일반적으로 액체 전체의 탄수화물 수준을 평가하기 위하여 다른 측정치를 사용한다. 플레이토(Plato) 등급으로 표현되는 액체 특정 중량은 Anton Parr DMA-58 밀도계를 이용하여 측정되었다. 여과되고 가스가 제거된 샘플은 특별한 u-유리병 안으로 이동되었고, 이후 전자적으로 진동되었다. 액체를 통한 진동수가 측정된 후 액체 특정 중량(g/100g 또는 。P)과 연관되었다. 이 측정치는 샘플의 전체 탄수화물 농도(또는 특정 중량)의 근사치임이 중요한데, 이는 특정 중량이 문제의 맥아즙과 동일한 20℃의 슈크로오즈 수용액의 눈금 측정이 행해지기 때문이다.

비시널 디케톤

전체 디아세틸(2,3-부타네디온) 및 전체 2,3-펜타네디온 농도는 전자 포촉 검출기가 구비된 Perking Elmer 8310 가스 크로마토그래프를 사용하여 결정되었다. 1.0㎖/min 흐름의 아르곤 캐리어 가스 내의 5% 메탄이 캐리어 가스로 사용되었고, 샘플은 J&W DB-Wax 컬럼을 통과하였다. 검출기 온도가 120℃로 고정되는 동안 주입기 온도는 105℃로 유지되었다. Hewlett-Packard 7694E 헤드스페이스 오토샘플러는 분석을 촉진시켰다. 양 결정은 선택된 샘플 구성성분이 가장 많은 지역의 측정한 후 이를 2,3-헥사네이드 내부 표준 눈금측정치에 교차-참고하여 계산되었다.

이 화합물의 "전체" 농도를 평가하기 위하여, 우선 이들 샘플을 65℃에서 평형시킨 후 이 온도에서 30분간 보관하는 것이 필요하였다. 이 선-분석 샘플 처리는□-아세트락테이트와 □-하이드로부틸레이트가 각각 그들의 디케톤, 디아세틸 및 2,3-부타네디온으로의 변화가 가능하게 해 주었다.

에스테르와 고급 알코올

맥주에서 검출된 가장 중요한 향 화합물의 일부는 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피 방법을 이용하여 측정되었다. 아세트알데히드, 에틸아세테이트, 이소부탄올, 1-프로판올, 이소아밀아세테이트, 이소아밀알코올, 에틸헥사노에이트 및 에틸옥타노에이트는 내부 표준으로서 n-부탄올을 이용하여 양이 측정되었다. 불꽃 이온화 검출기, HP 7994 헤드스페이스 오토샘플러 및 J&W DB-Wax 모세관 컬럼이 구비된 Hewlwtt-Packard 5890 가스 크로마토그래프가 사용되었다. 주입기 온도는 200℃에 맞춰졌고, 검출기 온도는 220℃였다. 오븐 온도 프로파일은 다음과 같다: 40℃에서 5분, 40℃에서 200℃까지 10℃/min의 비율로 상승, 200℃에서 220℃까지 50℃/min의 비율로 상승, 마지막으로 220℃에서 5분간 유지. 30㎖/min(28psig)의 헬륨 구성 가스, 50㎖/min(25psig)의 수소 흐름 및 300㎖/min(35psig)의 공기 증기가 6.0㎖/min의 헬륨 담체 가스 흐름을 보충하였다. 1㎖의 샘플 루프에 대한 전체 GC 사이클은 40분이었다.

기타 분석

많은 기타 분석이 숙성되고 포장되는 발효 액체에 대하여 필요에 따라 수행되었다. 완제품 분석은 Labatt Quility Control 부서에 의하여 완성된 맥주 표준에따라서 수행되었다. Tenical Committee and Editorial Committee of the Amenrican Society of Brewing Chemists(1992)에 의하여 설명된 방법이 이들 측정의 기초가 되었다. 이들 측정과 관련한 간단한 설명 및 분석 리스트는 표 4.2에 제공된다.

표 4.2 품질 관리 분석 및 설명

분류	설명
공기	패키징 공정동안 운반된 총 공기; 상세하게는 1 ㎖보다 적다.
이산화탄소	생성물 내에 함유된 탄산가스 정도; 2.75%의 설명과 같이 %로 기록하였다.
이산화황	GC에 의해 측정된 맥주 내에 포함된 이산화항의 양; 목표는 10mg/ℓ 이하
디메틸 황화물	GC에 의해 측정된 맥주 내에 포함된 디메틸 황화물(콘 냄새 발생)의 양; 목표는 70□g/ℓ 이하
쓴 맛	맥주에 쓴맛을 내는 홈 열매에 의해 가미된 맥주의 쓴맛 정도; 맥주 내의 알파-애시드의 측정; 1 쓴맛 단위(BU)는 알파-애시드 1 mg/ℓ에 상당한다.
색	측광기에 의해 측정된 맥주의 색; 0.5인치 빛 경로에 대한 430 nm 샘플의 흡광도
pH	pH 미터 눈금을 이용한 측정; pH = -log10[H+]
표본 증류	액체의 상대적 비중에서 알코올 효과를 위한 보충 없이 액체 내의 매스가 녹게 할 수 있는 정도; 하이드로미터에 의하여 측정되고oP와 같이 기록된다; AE
실제 증류	표본 증류와 같이 알코올이 제외된 것은 이 측정에 의하여 계산되고 있다.
원증류 계산	2.0665g 증류가 1.000g 알코올을 생산하는 볼링의 실험에 기초한다; COE = 100*[(2.0665*(%w/w 알코올)＋RE)/100＋1.0665*(%w/w 알코올))]
웜 헤이즈	교란시키는 침전물 없이 실내온도(21℃)에서 맥주에 존재하는 헤이즈; 빛 산란에 기초한 탁도 측정방법을 이용하여 평가되고 포마진 혼탁도 단위(FTU)로 기록된다; 200 FTU 이하 스펙
초기 냉각 헤이즈	교란시키는 침전물 없이 실내온도(21℃)에서 0℃까지 냉각되었을 때 맥주에 있는 헤이즈 거품; 위와 같은 방법으로 측정; 100 FTU 이하 스펙
거품	NIBEM 기구를 이용하여 맥주의 거품을 내는 능력을 측정; 거품은 억제된 물질에서 발생되고 거품 제거비율은 기록된다; 170초 이하 스펙

이스트 침전 프로토콜 - LCC290

이스트 실험 샘플의 준비

슈퍼 부유응집 이스트(LCC290)는 4.1절에서 기술한 바와 같이 맥아즙으로 성장된다. 그 후 당해 접종물을 추가 접종용 이스트 팰럿을 얻기 위해 4℃, 10000rpm에서 15분간 원심분리한다. 4.2절에서 기술한 바와 같이, 맥아즙을 60분간 100℃에서 저온살균한 후, 1리터를 6×2L의 무균처리된 쉐이크 플라스트에 무균적으로 옮긴다. 각각의 쉐이크 플라스크를 원심분리된 이스트 4g으로 접종한다. 플라스크를 135rpm(순환 상온 21℃ )로 작동하는 쉐이커에 놓고 발효시킨다. 하나의 플라스크를 24시간, 40시간, 48시간, 64시간, 71시간, 192시간 간격으로 제거하고, 하나의 작은 액체 샘플을 이스트 농도 및 생존률 측정(4장에서 기술된 실제 측정), 및 탄산염 분석을 위해 취하였다. 나머지 액체/이스트 혼합물은 4.7.2절에서 기술된 이스트 침전 프로토콜하기로 하였다.

이스트 침전 프로토콜

LCC290 슈퍼 부유응집 이스트 스트레인의 침전율을 다음 방법으로 측정하였다. 각각의 샘플은 4.7.1절에서 기술한 바와 같이 소망하는 간격으로까지 발효시켰다. 상술한 시간에서 적당한 샘플 플라스크를 제거하였다. 샘플들은 소립자 발효 정지를 확실하게 하기 위해 교반하였다. 그 후 플라스크의 내용물을 눈금이 그려진 실린더 1000㎖로 즉시 옮겼다. 플록이 생기면, 액체 표면 및 플록-액체의 접촉면 사이의 거리를 30초 단위로 측정하였다. 침전율을 다음 방정식으로 계산하였다.

표준 Kynch 방법(1952)을 이용하여, 침전율 대 셀 농도 커브를 각각의 농도 간격으로 얻어진 침전 커브로부터 발생시켰다.

순환 및 혼합율 방법

3단계 가스 부양 흡출관 바이오리액터 내의 혼합시간 및 순환율을 측정하기 위해, 데이터 취득 시스템에 연결된 산 주입 시스템을 이용하였다. 바이오리액터에의 강산의 펄스를 적용함으로써, pH 초과 시간 변화 관찰에 따른 농도 및 혼합시간을 계산할 수 있었고, 이들은 3.2.2절에 있는 방정식에 관련이 있다. 데이터 취득 시스템은,

Ingold Microprocessor-Based pH에 결합된 Ingold pH 프로브

(Cole-Parmer, cat. #P-05990-90)

트랜스미터 (모델 2300)

데이터 번역 DT2805 카드

386DX 컴퓨터

Quick Basic data acquisition 프로그램 (1994 Hudson and J. Beltrano에 의해 만들어지고 1998 N. Mensour에 의해 변경)으로 이루어져 있다.

10 ㎖ 10N 염화수소산은, pH 프로브 위치 바로 아래에서 가스 부양 흡출관 바이오리액터(그림은 도 5.5로 제공된다) 환형 섹션으로 주입된다. 당해 거리는 26㎝ 높이 이하 헤드 플레이트와 관련이 있다. pH 프로브는 모든 혼합 실험을 하기전에 보증된 표준 완충제를 갖는 2 지점 눈금측정(Beckman pH 7.0 녹색 완충제 및 Beckman pH 4.0 적색 완충제)이었다. pH 미터로 만들어진 전류 4 내지 40 ㎃는 스크류 터미널 보드와 연결되었고, 여기에서 전류는 전압으로 바뀌어, 컴퓨터 내의 데이터 취득 카드로 측정되었다. 데이터 취득 프로그램은 산 주입과 동시에 시작되었다. 데이터 수집은 50 Hz의 샘플링 빈도로 5분 걸렸다. 프로그램의 배열 규격은 데이터 취득 카드용 1 세트로 3750이었다(수집된 포인트 전체 15000).

수집된 데이터는 추가로 연구하기 위해 실험실에서 더 강력한 컴퓨터(마이크로프로세서 펜티엄 II)로 옮겨졌다. TableCurve 2D(Jandel Scientific Software, Labtronics, Canada)는 내재된 수많은 데이터 처리 기능(데이터 가공, 커브 피딩 등)뿐만 아니라 대량 데이터 세트를 다루기 위한 능력 때문에 데이터 분석을 위해 광범위하게 이용되었다. 윈도우 무빙을 피팅하는 최소 제곱법 4차 다항식에 기초한 시간-도메인 가공 방법인 Savitzky-Golay 알고리즘은 잡음을 제거하는 본래의 데이터에 적용된다. 그 후 가공 데이터는 실제의 pH 측정치 보다 pH의 변화를 반영하는데 맞추어졌다. 쇠퇴하는 사인곡선 기능은 적합한 데이터에 피트되었다. 그 후 혼합 시간 및 순환율은 피팅된 매개변수로부터 계산되었다.

이들 혼합 실험은, 1/3 고정화 담체가 존재하는 50L 가스 부양 바이오리액터 내의 실제 발효에서 수행되었다(또는 슈퍼 부유응집 이스트 LCC290, 중간 부유응집 이스트 LCC3021 또는 □-카라기난 겔 비드). 액상은 2.5。P 특정 비중을 가진 발효된 맥주였고, 기체상은 이산화탄소 살포 가스로 이루어져 있었다. 발효온도는 15℃로 조절되었다. 살포 가스 표면 속도는 2.0과 6.0 ㎚/s 사이로 다양하였다. 주어진 가스 유동률에서, 시스템은 10분간 평균화되었다. 그 후, 산 주입 실험이 개시되어, 3회 반복될 것이다. 이후의 가스 유동률이 선택되어 리액터 내의 혼합물이 시작 단계에 다시 적합한 pH를 갖게 될 것이다.

파일럿 스케일 가스 부양 흡출관 바이오리액터 시스템의 설계

가스 부양 흡출관 바이오리액터 발효 시스템

흡출관 유동 베드(DTFB) 시스템은 3단계 시스템에서의 사용 값을 나타낸다. 2개의 파일럿 스케일 가스 부양 흡출관 바이오리액터를 설계하여 당해 연구의 실험을 수행하기 위해 Labatt Brewing Company Ltd.사의 맥주 양조 실험에 설치하였다. 또한, 여러 개의 용기를 맥아즙 저장 및 맥주 체취를 위해 변경하였다. 도 1의 플로우시트는 파일럿 스케일 연속 발효 실험에서 사용되는 모든 공정을 묘사하고, 표 5.1은 도 1에서 표시한 장비의 상세한 설명을 열거한다.

맥아즙은 5.08㎝ 스테인레스 스틸의 라인에서 라바트 London Brewing사의 공장에서 공급되고, 1600L 작업 용량의 맥아즙 저장 탱크로 옮겨진다(WT1 및 WT2). 2개의 탱크 시스템으로 말미암아 파일럿 스케일 연속 발효에 영양 배지를 연속적으로 확실하게 공급할 수 있었다(R1 및 R2). 각각의 탱크는 산소 및 동질성 조절용 이산화탄소 살포 시스템, 및 온도 조절용 글리콜 냉각 자켓 시스템을 구비하였다. 영양 배지의 중앙 소스는 밸브 헤더 시스템을 통해 독립될 발효기 3까지 공급하는데 설계되었다(V7, V8 및 V9). 마스터플렉스 연동 펌프(P1 및 P2)는 파일럿 스케일 바이오리액터에 전술한 맥아즙 유동을 이동하는데 이용되었다.

표 5.1 도 5.1에 표시된 개별 장비의 설명

부호

설명

AirCO2F1F2F3F4F5F6F7GLRGLSNV1NV2NV3NV4NV5NV6P1P2PR1PR2PR3PR4PR5PR6R1R2RM1RM2RM3RM4RM5

100 psig 공기는 런던 공장으로부터 공급된다.100 psig 이산화탄소는 런던 공장으로부터 공급된다.이산화탄소 주입구에 있는 살균 필터이산화탄소 주입구에 있는 살균 필터WT1의 배출구에 있는 살균 필터WT2의 배출구에 있는 살균 필터살포가스의 주입구에 있는 살균 필터살포가스의 주입구에 있는 살균 필터WBT1의 출구에 있는 살균 필터글리콜 라인 리턴; 25psig글리콜 라인 공급; 45psig이산화탄소 니들밸브이산화탄소 니들밸브공기 주입구에 있는 니들밸브이산화탄소 주입구에 있는 니들밸브공기 주입구에 있는 니들밸브이산화탄소 주입구에 있는 니들밸브R1을 위한 마스터플랙스 연동 공급 펌프R2를 위한 마스터플랙스 연동 공급 펌프이산화탄소 압력 조절기이산화탄소 압력 조절기공기 압력 조절기이산화탄소 압력 조절기공기 압력 조절기이산화탄소 압력 조절기가스부양 흡출관 바이오리액터 조정 범위; 50L 작업 용량가스부양 흡출관 바이오리액터 조정 범위; 50L 작업 용량이산화탄소 로타미터(측정기); 0 ~ 20 scfh 범위이산화탄소 로타미터(측정기); 0 ~ 20 scfh 범위공기 로타미터(측정기); 0 ~ 2.5 scfh 범위이산화탄소 로타미터(측정기); 0 ~ 10 scfh 범위공기 로타미터(측정기); 0 ~ 2.5 scfh 범위

부호	설명
RM6V1,V2,V3V4,V5,V6V7,V8,V9V10,V11V12V13V14,V15V16V17V18WBT1WT1WT2	이산화탄소 로타미터(측정기); 0 ~ 10 scfh 범위WT1의 입구/출구에 있는 나비밸브WT2의 입구/출구에 있는 나비밸브맥아즙 분배 헤더에 있는 볼밸브R1의 맥아즙 입구에 있는 볼밸브살포가스 주입구에 있는 급속 연결밸브R1의 출구에 있는 나비밸브R2의 맥아즙 입구에 있는 볼밸브살포가스 주입구에 있는 급속 연결밸브R2의 출구에 있는 나비밸브WBT1의 출구에 있는 나비밸브폐맥주 탱크; 200L 저장 용량글리콜 벽 재킷과 절약 능력을 갖춘 맥아즙 저장탱크; 1600L 저장용량글리콜 벽 재킷과 절약 능력을 갖춘 맥아즙 저장탱크; 1600L 저장용량

이산화탄소가스 및 공기는 스테인레스 스틸 가스 파이프 살포기로 가스 부양 시스템으로 살포되었다(도 7). 로타미터(RM3, RM4, RM5 및 RM6)는 시스템에 주입된 유동률을 관찰하는데 사용되었다. 무균 필터(0.2 □m 메쉬)는 바이오리액터로 유입된 오염물질이 없다는 것을 확실하게 하기 위해 가스 라인 상에 설치되었다. 생산물은 오버플로우 시스템을 통해 리액터 밖으로 배출되었다(도 4). 그리하여 공급 펌프 단독으로 액체 잔류 시간을 조절하였다. 양 리액터(R1 및 R2)는 넘치는 액체를 모으기 위한, 버려지는 맥주의 탱크(WBT1)로 연결되었다. 특별히 만들어진 50L 탱크는 필요에 따라 생산물을 모으고 진행하는데 이용되었다.

50L 파일럿 스케일 바이오리액터의 보다 상세한 그림과 정확한 치수는 5.1.1절에서 제공된다. 맥아즙 최급 및 저장 프로토콜은 5.1.절에 나타낼 것이며, 반면에 연속 발효 시스템용 세탁 및 무균화 프로토콜은 5.1.3절에서 논의될 것이다.5.1.4절은 당해 발명 전반에 걸쳐 일어나는 발효 프로토콜을 포함한다.

리액터 설계 및 설명

이 작업을 위하여 설계된 50-L 작업 용량 바이오리액터는 입자와 유체의 운동을 관찰할 수 있도록 리액터 몸체에 4개의 플렉시글라스 룩 윈도우가 설치된 전체 304ℓ 스테인리스 스틸로 제작되었다. 구조 재료는 스팀 살균에의 내구성 및 위생처리 화학제(부식제와 산)에의 저항력을 고려하여 선택되었다. 설계에 있어서 또 다른 중요한 점은 발효 보존액과의 직접적인 접촉시에 실처럼 꿰어지는 피팅의 최소화에 있다. 그 대신, 포트는 용접되었고, 필요한 경우 위생 TriClover 피팅이 사용되었다. 리액터는 가스의 유리가 최대화될 수 있도록 확장된 두부를 가지도록 설계되었고, 이에 따라 액체-고체 대량 이동(Christi와 Moo-Young, 1993)이 더욱 촉진되었다. 리액터 하부는 바닥에 수집된 것으로부터 어떠한 고체도 최소화하기 위하여 90도의 원뿔각을 가지도록 설계되었다. 도 2는 Labatt Experimental Brewery에 설치되었던 50-ℓ 파일럿 스케일 시스템의 구성도이다. 이 도해는 2개의 위생 샘플링 포트의 위치뿐만 아니라 살포 가스, 액체 입구, 글리콜 냉각 자켓, 제품 출구, 온도 감지 및 조절 시스템의 위치를 나타낸다. 도 3은 센티미터로 표시된 동일한 GLDT 바이오리액터의 도해이다. 도4 내지 도6은 50L 가스-부양 흡출관 바이오리액터의 세부 단면도이고, 도7은 이 실험에서 사용된 가스 살포 기구의 도해이다.

내부의 흡출관과 입자 분리기(배플)은 도 3에 도시되어 있다. 리액터 직경에대한 흡출관 직경의 비율 2/3는 문헌 데이터(Christi, 1991)에 근거하여 채택되었다. 입자 분리기는 고체-액체 혼합물로부터 가스를 더 잘 분리하도록 크기가 결정되었다. 이 배플링 장치의 직경(흡출관 직경 10.16㎝에 비하여 20.32㎝)을 늘릴수록, 거품 발생 속도와 액체-고체 유체 하락 속도 사이의 차이를 얻을 수 있다. 흡출관 시스템의 고리 안으로의 가스 투입은 낮아지고 고체-액체 대량 이동은 더 잘 일어난다.

파이프 살포기(도 7)는 흡출관부 안으로 이산화탄소 혼합 가스를 주입하기 위하여 설계되었다. 직경 내에 0.16㎝로 측정되는 전체 160개의 구멍이 1.27㎝ 직경의 살포기에 뚫려있었다. 구멍들은 중앙에 0.8㎝의 간격으로 세로로 또한 중앙에 0.6㎝의 간격으로 가로로(20개씩 8줄) 위치되어 있었다. 혼합은 살포된 가스의 1차 기능이기 때문에, 0.16㎝ 직경의 살포 구멍이 선택되었다.

맥아즙 취급 및 저장 프로토콜

전통적 발효 과정에서는, 이스트의 투입없이는 연장된 기간 동안 맥아즙을 보관하지 않는다. 산소에 노출된 맥아즙은 이스트를 포함한 많은 유기물을 위한 훌륭한 성장 보존액이다. 연속 발효 시스템을 위한 발효 프로토콜은 많은 양의 맥아즙이 보관될 것을 요하기 때문에, 맥아즙의 이동 및 보관 프로토콜을 개발할 필요가 있었다. 만약 맥아즙이 적절히 보관 용기로 이동된다면, 산소에 노출된 맥아즙은 오염에 의한 손상없이 최대 2주간 저장될 수 있다는 것이 연구자들의 견해였다.

또한 일단 맥아즙 보관 용기 내에서 맥아즙의 온도가 적절히 조절되는 것을 보장할 필요가 있었다. Experimental Brewery 내의 이용가능한 탱크는 맥아즙 보관보다는 발효를 위하여 설계된 것이었다. 이들 탱크의 흐르지 않는 액체의 온도 유지 능력에 대한 테스트가 행해졌다. 도 2는 온도가 4℃로 일정하게 유지되면 교반없이는 이들 용기를 사용할 수 없다는 것을 분명히 보여준다. 맥아즙은 초기에 4℃의 온도에서 이들 용기에 투입되었다. 온도 측정은 실제 온도를 더욱 잘 알아내기 위하여 탱크 전반에 걸쳐 어러 곳에서 수행되었다. 액체가 교반 없이 24시간 동안 용기에 남겨졌을 때, 거의 꼭대기의 액체 온도는 약 20℃까지 상승하였다. 탱크 중간의 액체 또한 약간(∼3℃의 □-T) 상승하였고, 반면 탱크 원뿔의 액체는 거의 원래 4℃를 유지하였다.

그림 5.8 원뿔형 원통의 맥아즙 보관 탱크 내의 온도 프로파일에 대한 가스 살포에 의한 교반의 효과. 맥아즙은 4℃온 온도에서 용기 안으로 투입되었다. 측정은 탱크가 충진되는 24시간 동안 행해졌다. 이산화탄소 가스가 용기 안으로 0.113㎤/hr의 유속로 살포되었다.주변의 실온은 19.8℃였다. 측정 위치는: (1) 벽쪽 탱크 위쪽; (2) 가운데 탱크 위쪽; (3) 벽쪽 탱크 중간; (4) 가운데 탱크 중간; (5) 벽쪽 원뿔의 위쪽; (6) 가운데 원뿔의 위쪽; (7) 원뿔의 아래쪽

0.133㎤/hr의 유속으로 이산화탄소의 주입을 통한 약한 교반에 의하여, 보관 용기 내의 맥아즙의 온도는 4℃로 유지될 수 있었다. 이러한 발견 결과, 양 맥아즙 보관 용기는 맥아즙 교반에 사용되는 2.54㎝의 위생 튜브와 함께 원뿔의 하부에 고정되었다.

계속하여 공기에 노출되지 않은 맥아즙은 Labatt London 공장으로부터 5.08㎝ 스테인리스 스틸 라인을 통하여 버퍼 탱크로 이동되었다. 이 탱크로부터, 맥아즙은 순간 살균기를 통하여 2℃에서최대 2주간 저장된 맥아즙 보관 탱크(WT1 또는 WT2) 중 어느 하나로 들어갔다. 이 살균 과정은 전체 보관 기간 중 원하지 않은 미생물이 맥아즙으로부터 제거되었다는 것을 보장하기 위한 예방 측정으로서 들어갔다. 산소에 노출되지 않은 맥아즙을 사용함으로써, (신선하지 않은 알데히드 형태의) 산소에 의한 뜨거운 맥아즙에 미치는 손상이 최소화되었다. 따라서 살포 가스와 함께 유입된 공기는 연속 발효에 대한 산소 조절을 엄격하게 완수한다.

용해된 산소 측정은 맥아즙 보관 용기 안에서 한번 수행되었다. 그림 5.9는 다음 3개의 이동 프로토콜의 경과 시간에 맥아즙의 용해된 산소 농도를 나타낸다. 첫 번째 예에서, 맥아즙은 보관 용기로 이동되었고, 적절한 온도 조절을 위하여 이산화탄소 살포(0.085㎥/hr)가 시작되었다. 맥아즙에 용해된 산소 농도는 하루 이상 증가하여 약 1.3㎎/L에 도달하였고, 계속하여 5일째까지 약 0.1㎎/hr까지 감소하였다. 두 번째 실험에서는, 맥아즙 보관 용기는 충진 전에 3시간 동안 0.85㎥/hr 이산화탄소로 세척되었다. 초기의 산소 픽업은 매우 감소하였고 요망되는 산소량(0.1㎎/ℓ 미만) 내의 맥아즙은 2일째에 도달되었다.

그림 5.9 London 공장으로부터의 운반 동안 맥아즙에 용해된 산소의 조절. 3개의 충진 프로토콜은 이전 두 방법과 결합된 세 번째 샘플로 평가되었다. 맥아즙온도는 4℃에서 유지되었다.

마지막 실험에서, 탱크가 위와 같이 세척되었고 이산화탄소가 보관 기간 동안 및 충진 과정에서 연속 살포(0.085㎥/hr)되었다. 용해된 산소량은 보관 단계 내내 최소(0.1㎎/ℓ)로 유지되었다. 결과적으로, 이 방법은 향후 맥아즙 수집을 위한 프로토콜로 채택되었다.

5.1.2 세척 및 살균 프로토콜

맥아즙 보관 탱크는 뜨거운 물(85℃)로 예비 세척, 뜨거운 물(85℃)로 후-세척 후, 부식 세척(60℃의 40% 부식제)으로 구성된 세척 사이클에 투입되었다. 이들 용기의 세척은 과산 용액(2% w/v)를 벽에 접촉시킴으로써 완성되었다. 맥아즙 이동 파이핑 또한 동일한 세척 및 살균 단계를 거쳤다.

50ℓ 바이오리액터는 다른 세척 및 살균 프로토콜을 따랐다. 시스템은 뜨거운 물(60℃)로 세척된 후, 40℃의 따듯한 물로 꼭대기까지 채워졌다. 산업용 세척제, Diversil CX/A(DiverseyLever, Canada)가 2% w/v 용액을 형성하기 위하여 이 물에 더해졌다. 바이오리액터 내에서의 적절한 용해 및 접촉을 보장하기 위하여 5㎜/s의 표면 가스 속도로 공기가 리액터의 바닥 안으로 살포되었다. 1시간의 접촉 후, 리액터는 비워졌고 신선한 수돗물이 분사되었다. 이 세척 과정은 두 번 반복되었는데, 두 번의 마지막 찬 수돗물이 채워지고 비워지는 사이클에서 정점에 이르렀다.

폐기 맥주 용기는 2% w/v Diversol CX/A 용액으로 세척되었다. 가스-부양 바이오리액터와는 달리, WBT는 살포기와 맞지 않기 때문에 살포는 사용되지 않았다. 기계적 교반은 이 용기를 한쪽면에서 돌림으로써 완성되었다. 사이클은 두 번의 물 채우기-비우기 사이클 이후 두 번 반복되었다.

증기 살균 전, 50ℓ 바이오리액터는 폐기 맥주 용기에 연결되었고, 맥아즙 공급 라인은 가스 살포 라인과 같이 연결 해제되었다. 밸브 V10, V11, V12, V13, V14, V15, V16, V17 및 V18은 개방되었고, 필터 F5, F6 및 F7은 제거되었다. 이들 가스 라인과 필터는 121℃에서 15분간 각각 자동분리되었다. 증기 공급은 밸브 V12와 V16에 연결되었다. 증기 밸브는 장비에의 손상을 최소화하기 위하여 천천히 개방되었고, 리액터 내부 온도는 면밀히 모니터되었다. 내부 온도가 100℃에 도달하였을 때 1시간의 살균이 수행되었다. 밸브 V10, V11, V14, V15 및 V18은 먼저 닫혔다. 이후 증기 공급은 끊겼고 살균된 필터 F7이 연결되었다. 살균된 필터 F5와 F6은 즉시 가스 공급 라인에 연결되었고 3㎜/s의 표면 이산화탄소 가스 속도가 시작되었다. 이 가스 증기는 냉각 동안 리액터가 붕괴되지 않도록 하였을 뿐만 아니라 50-L 가스-부양 바이오리액터 내에 존재하는 어떠한 공기도 배출시켰다.

내부 온도가 20℃에 도달한 후, 맥아즙 공급 라인은 바이오리액터에 연결되었다. 여전히 닫힌 상태의 밸브 V2, V5, V10 및 V14와 열린 밸브 V6, V7, V8, V9, V11 및 V15이 있고, 사용되는 맥아즙 공급에 따라 증기 공급은 V3 또는 V6 중 하나에 연결되었다. 밸브 V9, V11 및 V15가 증기 공급과 동시에 닫힌 후 1시간 동안 증기 사이클이 지속되었다. 일단 라인들이 실온(20℃에 도달하게 되면, 밸브 V3와 V6는 닫히고 증기 공급은 연결 해제된다. 이 시점에서, 맥아즙 공급, 50L 바이오리액터 및 웨이스트 맥주 탱크를 포함한 전체 연속 발효 시스템은 살균되고 발효를 위한 준비를 하게 되었다.

5.1.3 발효 프로토콜

50ℓ 파일럿 스케일 가스-부양 흡출관 바이오리액터가 양조 맥아즙에서 맥주로의 연속 1차 발효에 사용되었다. 글리콜 온도 자켓은 발효 실험 내내 정해진 15℃로 액체 온도를 조절하도록 하였다. 각각의 리액터에는 측정을 위한 온도 탐침과 열전쌍 및 리액터로의 글리콜 공급 조절을 위한 글리콜 솔레노이드 밸브가 구비되었다. 또한 가스-부양 발효조에는 산소 투입을 위한 공기 공급뿐만 아니라 1차 혼합 가스(이산화탄소 또는 질소)가 구비되었다. 요망되는 가스 혼합물은 적절한 로타미터/니들 밸브 조합의 조정 후 이 가스 혼합물을 살균 필터(Millipore, Millex(상표명)-FG₅₀, 0.2□m 필터 단위)에 통과시켜 바이오리액터의 흡출관 안으로 지나게함으로써 선택되었다. 0.39mm/s(0.4 sc로)의 표면 공기 속도가 전 발효동안 리액터 안으로 주입되었고, 반면 1차 혼합 가스 유속은 특정 고정화 타입에 맞도록 조절되었다.

50ℓ 가스-부양 바이오리액터는 연속 작동 모드가 시작되기 전에 전통적인 1회 스타트-업을 따랐다. 5.1.2절에 설명된 세척과 살균 후 가스-부양 바이오리액터는 맥아즙 보관 탱크(WT1 또는 WT2)로부터의 50리터의 맥아즙으로 채워진 후 Scandi-Brew(상표명) 살균 샘플 포트를 통하여 200g의 효모(4g/L)가 주입되었다. 리터당 4 그램의 LCC3021 중간 유모성 효모의 초기 농도를 산출하는 k-카라기난 겔 비드의 경우, 20ℓ의 비드가 리액터 내로 주입되었다. 바이오리액터는 매일 샘플이 추출되었고 디아세틸과 액체 특정 중량은 면밀히 모니터되었다. 일단 특정 중량이 최소값에 도달하고 디아세틸 농도가 30 □g/ℓ 아래로 떨어졌으면, 시스템은 연속 작동으로 착수될 수 있는 것으로 간주되었다.

"신선한" 맥주가 리액터의 상부의 깔때기를 통하여 넘치는 동안 발효 보존액(맥아즙)은 계속하여 리액터의 바닥을 통하여 공급되었다. 리액터의 작업 용량이 고정됨에 따라, 리액터 내부로 신선한 맥아즙을 공급하는 유속의 선택이 평균 액체 체류 시간을 조절하였다. 액체 샘플은 화학적 및 미생물학적 분석(방법은 4장에 기재)을 위하여 살균 샘플링 밸브(Scandi-Brew(상표명))를 통하여 리액터 외부에서 매일 회수되었다.

선택된 시점에서, 연속 발효 제품은 50ℓ 1차 발효 바이오리액터로부터 대량(40ℓ 살균 스테인리스 캔)으로 수집되어 공업적으로 생산된 맥주와의 비교 및 평가를 위하여 완성되고 판매할 수 있는 맥주를 생산하기 위한 후-발효 공정에 투입되었다. 선택된 50ℓ 바이오리액터는 웨이스트 맥주 용기로부터 연결 해제되었고 즉시 맥주 수집 용기에 연결되었다. 일단 요망되는 액체가 수집되면, 바이오리액터는 웨이스트 맥주 용기와 다시 연결되었다. 수집된 "신선한" 맥주는 액체의 디아세틸 수준을 30 □g/ℓ 이하로 줄이기 위하여 후-발효 보관 기간에 투입되었다. 액체와 함께 넘겨진 효모는 침전되었고 액체(1-5백만 세포/㎖의 세포 농도)는 숙성(2℃에서 7일간)을 위한 냉장고에 보관되었다. 숙성기간 경과 후 341-㎖ 맥주병에 포장되기 전에 액체는 여과, 용량 5% 알코올로 희석 및 탄산가스로 포화되었다. 이후 모든 포장된 액체는 Labatt 공장 설비를 통하여 살균되었다.

5.2 연속 겔 비드 생산 공정

이 절의 실험 작업의 목적은 5.1절에 설명된 50ℓ 연속 가스-부양 흡출관 바이오리액터에 고정화된 LCC3021 효모 세포를 공급하기 위하여 효모가 투입된 겔 비드 생산을 위한 연속 비드 생산 공정의 평가에 있다.

생산 공정(도 8)은 우선 공전 믹서를 사용하여 비수성 연속 단계(식물성 오일)과 수성의 분산 단계(효모 세포와 혼합된 k-카라기난 겔 액체) 사이의 에멀젼의형태를 수반하였다. 폴리머 겔화를 줄이기 위한 신속한 냉각이 이 단계를 따랐다. 이후 형성된 비드는 오일 단계로부터 비드의 분리 및 경화를 촉진시키는 염화칼륨 용액에 투입되었다.

□-카라기난 겔 비드 에멀젼의 형성은 카라기난 겔의 미성숙한 겔화 방지를 위하여 37℃의 온도로 조절된 중탕 수조에서 수행되었다. 살균된 폴리머는 온도가 조절된 중탕 수조에서 37℃로 유지되었고, 효모 포자는 고정화 전 20℃에서 유지되었다. Masterflex 연동 펌프(Cole Parmer Company, USA)를 사용하여, 겔을 통해 세포를 고르게 분산시키기 위하여 6.4mm 직경의 공전 믹서의 24개 구성요소를 통하여 겔과 효모 현탁액을 퍼올렸다. 실온에서 저장된 살균된 오일 역시 37℃의 온도에 도달하기 위하여 뜨거운 중탕 수조 안으로 퍼 올려졌다(Masterflex 연동 펌프).

이후 투입된 폴리머(수성 상태)는 요망되는 에멀젼 생성을 위하여 다른 일련의 공전 믹서를 통하여 오일(연속 상태)과 혼합되었다. 이렇게 생긴 에멀젼은 폴리머의 작은 방울이 비드로 겔화하도록 하는 물/얼음 수조 내에서 신속하게 5℃로 냉각되었다. 이후 비드는 살균 22g/ℓ 염화칼륨 용액 내에 투입되는데, 염화칼륨 용액은 이들의 경화를 돕고 오일 상태에서 이들의 분리가 가능하도록 하였다. 가공 오일은 그 공정으로 되돌아갔고, 수성 상태(비드 및 염화칼륨 용액)는 50ℓ 바이오리액터 내부로 들어가기 전에 크기 분류를 위해 별도의 탱크 안으로 운반되었다.

5.2.1 공전 믹서 - Kenics 타입

이 새로운 비드 생산 공정의 중심에는 Kenics 공전 믹서(Cole Parmer Instrument Company, Niles, Illinois, USA)가 있다. 이것들은 공전 믹서의 직경과 동일한 내부 직경을 가진 튜브에 위치하는 일련의 고정 요소로 구성되어있다. 이 요소들은 교차된 채널을 형성하는데, 이는 공전 믹서를 통하여 흐르는 액체의 분할 및 종적 재결합을 촉진시킨다. 나아가 이 혼합 시스템에 의하여 점차 균일한 에멀젼 안으로 정교하게 생성된 이 유선들의 횡적 단절이 야기된다. 표 5.2는 본 연구에서 사용된 세 가지 타입의 공전 믹서 리스트이다.

표 5.2 사용된 Kenics 공전 믹서의 설명.(Cole Parmer 공급)

모델	정전 믹서 직경 D(mm)	요소의 수(Nr)
G-04667-04	6.4	12
G-04667-06	9.5	12
G-04667-08	12.7	12

5.2.2 겔 생산 원료

겔 비드의 생산의 두 가지 주된 원료는 오일과 폴리머였다. 적조류에서 추출된 다당류 폴리머인 k-카라기난(타입은 X-0909, lot 330360, Copenhagen, Denmark)은 Copenhagen Pectin A/S로부터의 관대한 선물이었다. 이 폴리머는 겔화 온도열-겔화라는 독특한 성질을 가지고 있으며, 이는 그 겔화 온도가 K-카라기난([Car])과 염화칼륨([KCl]) 양자의 농도에 달려 있다. 폴리머는 2.0g/ℓ의 KCl을 포함한 80℃의 증류수에 30g/ℓ의 농도로 용해되었다. 그 결과물인 겔 용액은 28℃의 겔화 온도를 가지고 있었다. 겔은 121℃에서 1시간동안 압력이 가해진 후 경화되지 않기 위하여 40℃의 중탕 수조에 위치되었다. 상업용 등급의 옥수수 오일(Pasquale Bros., Inc., Canada) 역시 121℃에서 1시간 동안 살균된 후 사용될 때까지 실온(20℃)에서 저장되었다. 효모 현탁액이 4.1절에서 설명된 바와 같이 준비되었다.

5.2.3 비드 직경의 측정

비드 샘플은 22g"L KCl 용액 100㎖를 포함하는 플라스크 내의 5℃ 열교환기의 출구에서 수집되었다. 비드는 경화를 촉진하기 위하여 2시간동안 이 용액에서 담궈졌다. 염화칼륨 용액으로 계속적으로 세척됨으로써 오일이 액체 상태로부터 제거되었다. 이후 샘플은 분석 전 미생물에 의한 오염을 방지하기 위하여 4℃에서 저장되었다.

비드 직경의 측정은 비디오 카메라(Pentax Macro 50mm)와 연결된 이미지 분석 소프트웨어 Optimas(버전 4.02, BioScan, Inc., USA)를 이용하여 수행되었다. 비드 샘플은 (비드 분리에 사용되는) 정제된 물의 막을 포함하는 페트리 접시 안으로 옮겨진 후 카메라 아래에 위치되었다. 전부 300-400개의 비드가 이 시스템을 이용하여 측정되었다. Optimas 소프트웨어의 능력은 30μm의 최대 절대 오차 내에서 100μm에서 수 mm의 범위에 있다. Optimas로부터 얻은 데이터는 Microsoft Excel을 이용하여 더욱 상세히 분석되었다. 그 결과물인 샘플 사이즈 분포는 샘플 평균 직경(D_B)과 변이 계수(COV)에 의하여 특징지어졌다.

5.2.4 비드 시스템 평가 - 실험 계획

샘플의 평균 비드 직경과 사이즈 분포의 변이 계수에 의하여 측정된 바와 같이 비드 집단의 타입을 평가하기 위하여 모두 3개의 공전 믹서 직경(D_s=6.4㎚, 9.5㎚, 12.7㎚)이 비교되었다. 공전 믹서 요소(N_s)의 수는 12에서 120 요소까지 다양했던 반면, 폴리머 용량 분류(□c)는 오일 용액에서 8.3% v/v와 50% v/v 겔 사이에서 연구되었다. 50%의 □c 이상에서, 분산된 (겔) 그리고 연속된 (오일) 상태가 전화되었다. 즉, 폴리머 매트릭스 내의 오일 방울 함유물은 오일 매트릭스 내의 겔 방울을 대신한 결과였다. 에멀젼 섹션을 통과한 오일/겔 에멀젼의 표면 액체 속도는 3.6㎝/s에서 17.87㎝/s의 범위로 조정되었다. 에멀젼 공전 믹서를 통과한 표면 액체 속도(V_SL)은 다음 식에 의하여 계산되었다:

V_SL=(Q_오일+Q_car)/S

S는 공전 믹서를 포함한 배관의 교차 영역이며, Q_oil은 오일 상태의 용량 측정 유속이고, Q_car는 카라기난 겔 용액의 용량 측정 유속이다.

결과 및 토의: 50ℓ 가스-부양 바이오리액터 내에서의 발효와 혼합 역학

에탄올 생산을 위한 고정화 새포의 이용은 공개되었다. 지난 20년 동안, 연구자들은 고정화 세포 기술과 연속 공정을 결합함으로써 에탄올 생산 공정을 최적화하기 위하여 노력해왔다(Kuu, 1982; Gil, 1991; Maiorella, 1993). 많은 사람들이 성공하였고, 에탄올 생산을 위한 연속 고정화 세포 시스템의 사용이 산업화되었다. 그러나, 맥주의 1차 발효를 위한 양조 산업에서의 그와 같은 연속 공정의 실행은 간단하지 않았다. 맥주는 에탄올뿐만 아니라 무수한 향 화합물로 구성되어 있고, 이는 최종 생산물까지의 복잡성과 깊이를 더해준다. 다음 장은 파일럿 스케일 GLDT 발효조 내에서의 잘 균형잡힌 맥주의 생산을 위한 질문에 작가에 의해 얻어진 결과를 설명한다.

6.1 파일럿 스케일 GLDT 시스템에서의 1회 발효

자유롭게 분산된 효모 세포를 l용한 1회 발효는 50ℓ 파일럿 스케일 가스-부양 흡출관 바이오리액터에서 수행되었다. 이들 실험은 맥아즙을 맥주로 발효하는 이런 시스템을 사용할 수 있는 가능성을 평가할 기회를 제공하였다. 나아가 이 실험은 연속 발효 액체와의 향후 비교를 위한 기준을 설정하게 해 주었다. 2회 발효는 Labatt Culture Collection(LCC3021)으로부터 얻은 라거 효모 스트레인을 이용하여 50ℓ 바이오리액터에서 수행되었다. 영양의 소비 및 상품의 배출뿐만 아니라 효모 성장률이 발효 내내 모니터되었다.

그림 6.1과 6.2는 각각 발효 1과 2에서의 효모 농도와 생존력 프로파일을 나타낸다. 구 경우에서, 효모 생존율은 문헌에서 보고된 전통적인 비율을 따랐다. 메틸렌 블루로 측정한 바와 같이 생존율은 거의 90%에 이르러 전체에서 높게 나타났다. 발효 1과 2에서의 탄수화물 농동 프로파일은 그림 6.3과 6.4에 나타난다. 말토우즈 및 말토드리오즈의 소비 후 샘플 당류, 글루코스 및 프락토스는 효모에 의하여 우선 추출되었다. 말토우즈 및 더 큰 다당류의 수준은 발효 내내 변화가 없었다. 에탄올은 가장 중요한 효모 대사의 부산물 중 하나이다. 최적화된 혐기성 발효는 100g의 대사 글루코스 당 약 48g의 에탄올과 47g의 이산화탄소을 생산한다. 또한 소량의 글리세롤이 생산되며(100g의 글루코스 당 3.3g), 이는 이 부산물이 발효 효모 내의 산화-환원 반응의 균형 유지 및 특히 고장액에서의 세포 삼투압 균형 유지될 때 포함된다. 그림 6.5와 6.6은 발효 시간 이후의 에탄올과 글리세롤의 농도 변화를 나타낸다. 효모 세포가 호기성 성장 단계에 있는 것에 따라, 에탄올의 수준은 발효 보존액 내의 산소 존재로 인하여 발효 초기에 매우 천천히 증가한다. 일단 산소가 비워지면, 에탄올 수준은 발효가능한 당류가 비워질 때까지 지수적으로 증가하고, 이 때 농도가 평형을 유지한다. 비시널 디케톤 역시 효모 대사의 매우 중요한 부산물이다. 1회 및 2회에서의 전체 디아세틸 및 펜타네디온 농도는 그림 6.7과 6.8에 나타난다. 이들 화합물은 발효에서 약 40시간까지 효모 농도의 최고 수준에 대응하여 증가하고, 이들이 성장하는 동안 효모가 수행하는 아미노 산 합성의 결과물이다. 발효의 후반부 동안, 디아세틸, 펜타네디온 및 이들의 전조인 □-아세토락테이트와 □-케토부티레이트는 효모에 의하여 이에 대응하는 향이 덜한 액티브 디올스로 전환된다. 이 절에 나타난 결과로부터, 두 번의 발효는 통상 가스-부양 흡출관 바이오리액터 내에서 수행되었음이 나타났다. 효모의 성장과 탄수화물의도출은 부산물, 에탄올, 디아세틸 및 펜타네디온과 같이 예상 경로를 따랐다. 독립 발효 데이터와의 비교는 두 번의 경우 매우 유사한 형태로 발효되었음을 암시한다. 그림 6.9는 1회와 2회의 에탄올 농도를 비교한다. 독립 곡선들은 반복능력의 수준을 나타내는 각각을 겹치게 하는 많은 데이터 점과 함께 동일한 프로파일을 따른다. 일련의 기질 소비와 계속된 제품의 배출은 가스-부양 시스템 내에서 변화가 없음에도 불구하고, 발효율은 변하였다. 최대 에탄올 농도에 의한 대표되는 1차 발효는 약 80-85시간에 양 뱃치에서 완성되었다. 디아세틸의 30 □g/ℓ 이하로의 감소는 추가적인 20시간 후 일어났다. 이들 결과는 전통적인 뱃치 라거 발효의 경우 120-168시간이 걸리는 것에 비하여, 고중량 맥아즙의 1차 발효는 약 100시간만에 완성될 수 있음을 나타낸다. 가스-부양 흡출관 바이오리액터에 의하여 제공되는 교반은 이 시스템에 의하여 가능한 강화된 대량 운반에 의해 발효시간을 감소시겼다. 이 정보를 가지고, 이후의 발효 실험은 가스-부양 흡출관 바이오리액터는 실질적으로 효모의 발효 대사를 변화시키지 않았다는 것과 이 시스템 내에서 자유롭게 분산된 효모를 가지고 한 발효는 최소 20시간의 뱃치 발효시간을 단축시킬 수 있었다는 자신감을 가지고 수행되었다.

그림 6.1 파일럿 스케일 GLDT 바이오리액터 내의 LCC3021 효모 뱃치 발효1 동안의 전체 세포 농도와 생존력 대 발효 시간

그림 6.2 파일럿 스케일 GLDT 바이오리액터 내의 LCC3021 효모 뱃치 발효 2 동안의 전체 세포 농도와 생존력 대 발효 시간

그림 6.3 파일럿 스케일 GLDT 바이오리액터 내의 LCC3021 효모 뱃치 발효1 동안의 탄수화물 농도 프로파일 대 발효 시간

그림 6.4 파일럿 스케일 GLDT 바이오리액터 내의 LCC3021 효모 뱃치 발효2동안의 탄수화물 농도 프로파일 대 발효 시간

그림 6.5 파일럿 스케일 GLDT 바이오리액터 내의 LCC3021 효모 뱃치 발효1 동안의 에탄올과 글리세롤 농도 대 발효 시간

그림 6.6 파일럿 스케일 GLDT 바이오리액터 내의 LCC3021 효모 뱃치 발효2동안의 에탄올과 글리세롤 농도 대 발효 시간

그림 6.7 파일럿 스케일 GLDT 바이오리액터 내의 LCC3021 효모 뱃치 발효1 동안의 디아세틸과 펜타네디온 농도 대 발효 시간

그림 6.8 파일럿 스케일 GLDT 바이오리액터 내의 LCC3021 효모 뱃치 발효2동안의 디아세틸과 펜타네디온 농도 대 발효 시간

도 6.9 발효시간에 대한 뱃치 1 및 뱃치 2의 에탄올 농도 비교. LCC3021 이스트는 파이롯트 스케일 GLDT 바이오리엑터내에서 사용되었다.

6.2 고정 담체

미래 개발 작업을 위해 가장 가망성 있는 대안을 확인하는 연구 프로젝트를 통하여 수종의 담체를 조사하였다. 1 내지 2m의 사이즈를 갖는 2개의 시판 흡착 담체를 평가하였다. Schott Engineering에 의해 공급된 유리 비드 담체 Siran(상품명)(도 9) 및 World Minerals에 의해 제공된 규조토인 Celite(상품명)을 그들의 용이한 취급성 및 시장 입수성 때문에 시험하였다. 반응기를 우선 담체와 함께 담지하고, 이어서 내부 멸균하고, 마지막으로 이스트를 직접 반응기에 접종하기 때문에 흡착 담체는 무균 조작의 기회를 제공한다. 산업적 관점에서, 담체를 특별한 저장을 요하지 않고, 공장은 그의 접종 실시를 유의하게 변경해야 하는 것이 아니기 때문에 이러한 옵션은 매우 매력적이다.

50ℓ 가스 부양 흡출관 바이오리엑터내의 이들 담체의 모두로 이루어진 초기 발효는 만족할 만 하지 못했다. 발생되는 문제는 액체 배지에 비하여 Siran 및 Celite의 높은 입자 밀도 때문이었다. 담체와 액체 배지의 비가 거의 균일할 때, 3상 가스 부양 흡출관 시스템을 가장 잘 작동되었다. Siran의 경우, 1.34의 비율인 반면, Celite의 경우는 1.31이었다. 고체 및 액체 상의 이와 같은 높은 밀도 차의 결과는 50ℓ 가스 부양 흡출관 바이오리엑터를 가동시키기에 요구되는 최소 가스 유동 속도의 유의한 증가이다. 4ℓ의 Siran 담체(8%v/v 고체 담지)에 대해, (흡출관 직경에 기초로 하여) 21.5mm/초의 가스속도가 순환을 이루는데 요구된다. 이와 같이 높은 가스 속도는 시험이 수용액에서 수행될 때는 중요한 문제로 되지 않으나, 액체 배지가 맥아즙일 때, 가스 부양 흡출관(GLDT) 시스템내에서 커다란 실패를 일으킨다. 반응기내에서 요구되는 가스 속도는 과량의 거품을 일으키고, 이는 결국, 흡출관 아래까지 액체 수위를 저하시켜, 액체 및 고체의 순환을 막아버린다. Celite가 고정 물질로 대체되는 경우, Siran에서 일어난 실패와 유사한 실패가 발생한다. 이들 결과로부터, 이들 흡착 담체는 미래 가스 부양 발효 시도에 포기되었다.

□-카라기난과 같은 포촉 담체를 사용하는 것은 고체 기준으로 40%(v/v)로 담지된 시스템을 허용하고, 그의 유동 및 후발 순환용 가스의 시간당 약 0.17 스탠다드 입방미터(5.8mm/ch 표면 가스 속도)로 담지된 시스템을 가능하게 한다.카라기난-포촉 이스트 세포 비드를 담지한 시스템을 작동하여 얻어진 긍정전 결과는 담체의 낮은 밀도(약 1100 kg/㎥) 및 후속의 용이한 유동성에 기인한다. 자가 응집 이스트, LCC3021(중간 부유 응집) 및 LCC290(수퍼 부유 응집)으로 담지된 고체는 유사하게, 적당한 순환을 보증하는 데 요구되는 약 3mm/초의 가스 유동속도로 달성된다. 섹션 6.2.1은 k-카라기난 겔 담체에 대해 상세히 설명하고, 섹션 6.2.2는 50ℓGLDT 발효기내에서 연속 1차 발효용 고정 메트릭스로서 평가되는 자가-응집 이스트, LCC3021 플록 및 LCC290 플록을 설명한다.

6.2.1 □-카라기난 겔 비드

포촉 고정법은 발효 용기에 도입하기 전에 메트릭스내에 이스트 세포의 봉입을 요구한다. 이 때, 반응기 그 자체내에 접종이 가능하지 않으므로, 발효 개시 전에 이들 겔 비드를 생산하는 것이 필요하다. 장기간 보관하는 것이 접종 겔 비드에 어떠한 영향을 주는지 명백하지 않다. 부정전 보관 효과를 최소화하기 위하여, 짧은 시간(8시간) 내에 대량의 겔 비드를 생산하는 것을 결정했다. 섹션 5.2에 기술된 정선 믹서 비드 법은 이 목적에 이용되었다. 사이즈 분포의 편차계수(COV)를 최소화기위하여 0.8mm 내지 1.4mm사이의 입자 직경(D_B)를 갖는 것이 이상적 비드이다. 비드의 요구되는 양과 항상성을 갖는 비드를 제조하는 몇 개의 인자를 조정할 필요가 있다. 다음 섹션에서 비드 가공 인자 선택의 개요를 설명하고, 또한 6.2.1.2에서연속 발효에 사용되는 비드를 기술한다.

6.2.1.1. 비드 생산법: 다양한 선택

비드 제조법의 특성은 다음 제조 인자, □ 정전 믹서 직경(Ds), 정전 믹서 요소의 수(Ns), 표면 액체 유동속도(V_SL) 및 폴리머 용량 단편(□_C)에 관하여 강조된 다른 연구자들과 협력하여 수행하였다.

도 6.12는 카라기난 겔 내에서 이스트를 고정하는 정전 믹서법을 사용하여 얻어진 전형적 사이즈 분포를 나타낸다. 에 실시예에서 다음 인자가 이용되었다: 12.7mm의 정전 혼합기 직경, 60 정전 믹서 요구, 10.5 cm/초의 표면 액체 속도, 및 0.25의 폴리머 용량 단편. 평균 비드 직경은 45%의 편차 계수로 701 □m에서 측정되었다. 도 6.13에 예시된 누적 사이드 분포는 샘플 평균과 표준 편자로 계산된 정상 누진 분포에 적합한 것으로 보인다. de Kolmorogof Smirnov 법이 정상성을 시험하는데 사용되었다. 실험 데이터와 적용된 데이터(K-S 통계 D) 사이의 치대 거리는 0.0274로 산출되었다. 정상 분포를 따르는 데이터에 상응하는 수정D값은 95% 신뢰도에서 0.895이하이었다. 우리의 경우에, 수정 D값은 0.895의 한계치보다 훨씬 이하인 0.174로 산출되었고, 이는 우리의 데이터가 정상 분포에 잘 맞음을 결론지울 수 있다. 비들 제조법으로부터 얻은 모든 데이터는 단 하나의 피크를 갖는 사이즈 분포를 나타내었다. 그러나 Poncelet et al.(1992)은 교반 탱크에서 분산시켜 생산한 알긴산염 비드에 대해 200㎕ 이하의 직경을 갖는 비드에 상응하는 2차 피크 및/또는 부수 피트를 나타내었다. 우리 방법에서 얻어진 더 작은 비드는 비드 세척 단계시에 손실되어 사이즈 분포 데이터에서 나타나지 않았을 가능성이 있다.

평군비드 직경 상에서 및 사이즈 분포의 편차 계수상에서 표면 액체 속도 및 정전 믹서 직경의 효과를 도 6.14 및 6.15에 각각 나타냈다. 12.7mm 정전 믹서에 더 현저한 효과를 나타내는 모든 3종 정전 믹서 직경의 표면 액체 속도의 증가에 따라 평균 비드 직경은 감소한다. 700 □m 이상의 평균 직경을 갖는 비드는 시험되는 모든 액체 속도에서 더 작은 직역 정전 믹서(6.4mm 및 9.5mm)에서 생산되지 않은 반면, 12.7mm 직경의 정전 믹서는 11 cm/초 이하의 액체 속도에서 700 □m보다 튼 비드를 생산했다. 3종의 모든 정전 믹서 직경은 38% 및 58%의 편차 계수를 갖는 비드를 생산했다. 또한 속도가 증가함에 따라 편차 계수는 감소함이 3종 모두에서 나타났다. 가장 낮은 값을 갖는 정전 믹서 직경을 변화시킨 편차 계수는 가장 낮은 직경 정전 믹서에서 생산되었다.

3.5 cm/초의 표면 액체 속도에서, 폴리머 용량 단편은 평균 비드 직경에 영향을 주는 반면, 7 cm/ch 이상의 속도에서는 0.083 및 0.5사이를 변화하는 □c의 실험 값에서 상대적으로 차이가 없었다(도 6.16). 표면 액체 속도 증가에 따른 폴리머 용량 단편에 의해 편차 계수에 거의 영향을 주지 않음을 나타낸다.

도 6.18 및 6.19는 평균 비드 직경상에서 표면 액체 속도 및 정전 믹서 부품의 수의 영향을 나타낸다. 액체 속도가 증가할수록, 정전 믹서 부품의 수의 모든 편화에 대해 평균 비드 직경은 감소한다(도 6.18). 주어진 액체 속도에서 평균 비드 직경은 24 부품 내지 120 부품에서 비슷하였으나, 12 부품 배지는 다른 5개의 시험 배치 보다 큰 비드 직경을 생산한다. 도 6.19는 평균 비드 직경이 최소 24 정전 믹서 부품이상에 달한다.

도 6.20은 몇 개의 정전 믹서 부품 수의 변화 계수에 표면 액체 속도의 영향을 나타낸다. 액체 속도는 모든 시험 배치의 변화 계수에 영향을 주지 않는다. 편화 계수에 대한 정전 믹서 부품의 수의 영향은 매우 현저하다(도 6.21). 변화 계수는 정전 믹서 부품의 증가에 따라 감소하고, 60 이상의 부품에서는 최소 45%에 달한다. 이들 결과는3.6 cm/ch 및 17.8 cm/초 사이의 표면 액체 속도에 일치한다.

정전 믹서 직경(Ds)는 편차 계수에 의해 측정되는 바와 같이 사이즈 분포에서 증가를 유도하는 믹서내에서의 전단력의 불균일성을 생성하는 것으로 가정된다. 동시에, Ds에서의 증가는 전단력의 강도를 감소시켜 평균 비드 직경을 증가시킨다. 이들 효과의 양자는 가장 작은 평균 비드 직경(400 □m - 500 □m)과 가장 작은 편차 계수(약 40%) 또는 사이즈 분포를 갖는 가장 작은 직경 정전 믹서를 갖는 실험에서 관찰되었다.

에멀젼을 생산하는 데 요구되는 에너지는 폴리머 및 오일상에 의해 생성되는 계면 면적에 비례한다. 비드 사이즈가 작을수록, 형성하는데 요하는 에너지는 크게 된다. Berkman 및 Calabrese(1988)은 평균 표면 액체 속도(Vs)의 증가는 유체의 단위 메스당 흩어지는 에너지중의 증가를 일으키게 되어 비드 사이즈의 감소시킨다. 평균 표면 액체 속도(3.6 cm/초 및 17.8cm/초 사이에서 시험)의 증가는 평균 비드 사이즈를 감소시킨다. 이와 같은 속도 증가는 정전 믹서의 출구와 입구 사이의 압력차에 기인한다. 이 압력차는 액체의 유니트 메스당 흩어지는 에너지에 비례한다. 따라서, 속도의 증가는 시스템의 흩어지는 에너지중의 증가를 유도하고, 이는 비드사이즈의 감소시킨다. 비드 직경 D_B중의 감소는 표면 액체 속도 증가로서 관찰된다. Al Taweel 및 Walker(1983)은 유의한 교란 수준에 상응하는 높은 속도의 비드의 형성과 병합사이의 동적 평성이 이루어짐을 나타냈다. 일정한 정전 믹서 직경(Ds)와 부품의 수(Ns)를 위해 표면 속도는 변화 계수에 거의 영향을 미치지 않는다. 따라서, 속도가 인자이며, 이는 사이즈 분산을 유의하게 수정하지 않고, 평균 비드 직경의 조작 및 선택을 허용한다.

이 연구의 범위 내에서, 카라기난 겔 용량 단편(□c)는 평균비드 직경이 □c의 감소에 따라 감소하는 낮은 속도인 3.6 cm/초를 제외하고는 평균 비드 직경 또는 변화 계수에 거의 영향을 끼치지 않는다. Audet 및 Lacroix(1989)는 2상 분산 시스템(연속 정전 믹서법을 포함하지 않는 뱃치 교반 탱크)에서 카라기난 비드의 생산 인자에 대해 연구한 결과, 카라기난 농도 3%(v/v)의 폴리머 용액의 평균 비드 직경상에 εc는 영향을 미치지 않는다고 결론지었다. 비드 사이즈 분포상의 □-카라기난 겔 농도의 특정 효과는 Audet 및 Lacroix(1989)에 의해 조사되고, 그들은 이 인자가 사이즈 분포에 강력하게 영향을 줌을 나타냈다. 증가된 겔 농도는 평균 비드 직경(D_B) 및 변화 계수(COV)를 증가시킨다. 에멀젼상의 낮은 전단력 및 그로 인한 더 큰 비드에 기인하는 높은 농도에서 겔의 점도를 증가시키는 현저한 효과를 부여한다. 비드 사이즈상의 겔 농의 영향이 이 명제에서는 조사되지 않았지만, 필??에 따라 비드 사이즈를 제어하는 또 다른 수단으로 사용될 수 있다.

혼합 요소(Ns)의 수가 증가하면 정전 믹서 내에서 유체 요소를 소비하는 평균 거류시간을 증가시키고, 그 결과 더 균일한 혼합물을 형성하고, 더 작고 더 타이트한 분산 비드를 형성하게 된다. 실험에서, 분산중의 평형(변화 계수로 측정)은 60 내지 70 요소에 도달하였다. Middleman(1974)는 낮은 점도(0.6 내지 1.0 cP)를 갖는 에털젼의 경우 이와 같은 평형에 도달하는 데 10 요소면 충분함을 나타냈다. 이들 실험[3% (w/v)]에 사용된 카라기난 용액은 200 cP의 평균 점도를 가지며, 오일의 점도는 25 cP이었다. 따라서, 슈도 균일성에 도달하기 위하여는 점도가 높게 요구될수록, 오랜 거류시간이 요구된다.

도 6.12. 정전 믹서법을 사용하여 생산된 비드의 전형적 사이즈 분포. 이 실험에서 공정 인자는 Ds=12.7mm, Ns=60, V_SL=cm/초 및 □c=0.25

도 6.13. 정전 믹서법을 사용하여 생산된 비드의 전형적 누진 사이즈 분포. 이 실험에서 공정 인자는 Ds=12.7mm, Ns=60, V_SL=10.5 cm/초 및 □c=0.25

도 6.14. 평균 비드 직경(□m)에 대한 표면 액체 속도(cm/초). 3개의 상이한 정전 믹서 직경이 측정되었다(12.7mm, 9.5mm 및 6.4mm의 Ds). 정전 믹서 요소의 수(Ns)는 48시간 일정하게 유지되고, 폴리머 단편(□c)은 0.25로 설정되었다.

도 6.15. 비드 직경의 변화 계수(%)에 대한 표면 액체 속도(cm/초). 3개의 상이한 정전 믹서 직경이 측정되었다(12.7mm, 9.5mm 및 6.4mm의 Ds). 정전 믹서 요소의 수(Ns)는 48시간 일정하게 유지되고, 폴리머 단편(□c)은 0.25로 설정되었다.

도 6.16. 평균 비드 직경(□m)에 대한 표면 액체 속도(cm/초). 4개의 폴리머 단편(0.5, 0.25,0.125 및 0.083의 □c)이 측정되었다. 정전 믹서 요소의 수(Ns)는 48시간 일정하게 유지되고, 정전 믹서 직경(Ds)는 12.7mm로 설정되었다.

도 6.17. 비드 직경의 변화계수(%)에 대한 표면 액체 속도(cm/초). 4개의 폴리머 단편(0.5, 0.25, 0.125 및 0.083의 □c)이 측정되었다. 정전 믹서 요소의 수(Ns)는 48시간 일정하게 유지되고, 정전 믹서 직경(Ds)는 12.7mm로 설정되었다.

도 6.18. 평균 비드 직경(□m)에 대한 표면 액체 속도(cm/초). 정전 믹서 요소의 수(Ns)는 12, 24, 48, 60, 72 및 120으로 변화하였다. 폴리머 단편(□c)은 0.25로 일정하게 하였고, 정전 믹서 직경(Ds)는 12.7mm로 설정되었다.

도 6.19. 비드 직경의 변화계수(%)에 대한 표면 액체 속도(cm/초). 정전 믹서 요소의 수(Ns)는 12, 24, 48, 60, 72 및 120으로 변화하였다. 폴리머 단편(□c)은 0.25로 일정하게 하였고, 정전 믹서 직경(Ds)는 12.7mm로 설정되었다.

도 6.20. 정전 믹서 요소의 수(Ns)에 대한 평균 비드 직경(□m). 표면 액체 속도(cm/초)를 3.6, 7.0, 10.6, 13.2 및 17.8로 변화시켰다. 폴리머 단편(□c)은 0.25로 일정하게 하였고, 정전 믹서 직경(Ds)는 12.7mm로 설정되었다.

도 6.21. 정전 믹서 요소의 수(Ns)에 대한 평균 비드 직경의 변화 계수(%). 표면 액체 속도(cm/초)를 3.6 및 17.8 사이에서 변화시켰다. 폴리머 단편(□c)은 0.25로 일정하게 하였고, 정전 믹서 직경(Ds)는 12.7mm로 설정되었다.

6.2.1.2 비드 생산 공정: □-카라기난 비드 특성

전술한 섹션에서 기술된 데이터로부터 발효용 소망의 특성을 가지는 비드를 생산하는 비드 생산 가공 인자를 선택하는 것이 가능하다. 특별한 정전 믹서 직경의 변화 계수를 최소화하기 위하여 60 혼합 효를 오일-겔 분산을 만들기 위하여 선택하였다. 외부 메스 이송을 최소화하고, 발효 액체로부터 기계적 수단에 의해 분리을 가능하게 하기 위하여 약 1mm의 평균 지경을 갖는 비드를 선택하였다. 이를 달성하기 위하여, 대형 정전 믹서(12.7mm) 및 가장 낮은 시험 속도(3.6 cm/초)가 선택되었다. 폴미머 단편이 변화 계수에 거의 영향을 주지 않으므로, , 50/50 (□=0.5)의 겔 대 오일이 비드 생산성을 최대화하기 위하여 선택되었다.

Ds=12.7mm, Ns=60, V_SL=3.9 cm/초, 및 □c=0.5를 갖는 섹션 5.2에서 기술된 방법을 사용하여 실험실에서 LCC3021 이스트가 포촉된 겔 비드의 수종의 뱃치를 만들었다. 얻어진 비드(도 11)을 시이브를 통과시켜 2.0mm이상, 그리고 0.5mm 이하의 비드를 제거했다. 얻어진 입자 사이즈 분포를 도 6.23에 나타냈다. 도 6.24는 이들 비드의 누진 사이즈 분포를 나타낸다. 이것은 50ℓ 가스 부양 발효를 통해 적용된 전형적 분포이었다.

도 6.23. 50ℓ 가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 연속 발효중 이용된 k-카라기난 겔 비드의 사이즈 분포.

도 6.24. 50L 가스-부양 흡출관 바이오리액터 내에서의 연속 발효 실험에서 사용된 k-카라기난 겔 비드의 누적 비드 사이즈 분포

6.2.1.3 산업적 스케일로 적용하는 것에 대한 비드 프로세스의 제한

정전 믹서당, 시간당 10ℓ의 비드를 생산하는 방법이 개발되어 파이롯트 플랜트 설치되고 있다. 산업적 스케일 비드 생산이 고려될 수 있기 전에 이 방법의 몇 개의 태양이 더 개발되고 최적화 될 것이 요망되고 있다. 대용량 바이오리엑터에 공급되는 데 요구되는 고정화 세포의 용량을 공급하기 위하여 이 시스템의 용량적 생산성 증가가 필요하다. 예를 들면, 2000 hL 가스 부양 흡출관 바이오리엑터는 약 800 hL의 비드가 요구된다. 이와 같은 용량을 달성하기 위하여는, 겔과 오일의 유동 양자의 증가가 필요하다. 데이터는 6.4mm 내지 12.7mm의 정전 믹서를 사용하여 얻어지는 증가된 속도는 발효 시스템중에서 비드의 형성을 너무 작게 유도하여 사용할 수 없음을 나타낸다. 따라서, 정전 믹서의 직경을 증가시켜 평균 비드 직경을 증가시킬 필요가 있다. 그러나, 큰 직경의 정전 믹서를 사용하는 것은 비드 사이즈 분포를 증가시키고, 소망의 범위를 넘는 큰 백분율의 비드를 생산하게 된다. 또 다른 방법은 중간 사이즈(12.7mm)의 정전 믹서를 병렬로 위치시킨 시스템을 설치하는 것이다. 10개의 정전 믹서 시스템으로 100 ℓ/h에 달하는 생산성이 가능하다. 2000 hL 산업적 예를 위하여는 요구되는 용량의 비드를 얻기 위하여는 연속적으로 800 시간 또는 약 34일 운전하여야 한다. 생산시간을 감소시키기 위하여 몇 가지의 다른 시스템을 설치할 수 있으나, 이들은 또 다른 복잡한 문제가 추가된다. 이스트 생존능을 유지시키면서, 비드의 저장을 장기간 보존하는 것이 가능하다면 생산시간은 더 단축될 것이다. 진공 밀봉 콘테이너 중에 비드를 저장하거나 건조하는 방법이 개발될 수 있음이 가능하다. 폰실렛(Poncelet) 및 그의 동료들(1993)은 분산시키는 데 사용될 수 있는 정전 믹서를 고려하여야 함을 가르키는 작업을 공표하였다. 이연구에서 사용된 케닉스(Kenics) 형에 반대되는 다른 종류의 정전 믹서를 사용하는 그들의 제안 시스템으로 비드의 분포 사이즈를 손상시키지 않고(낮은 편차 계수를 유지하면서), 큰 직경의 믹서를 이용하는 것이 가능하다.

파이롯트 시스템의 추가적 고려는 40℃에서 시스템을 운전시키고, 비드 생산을 위해 식물유 및 염화칼륨 수용액을 사용하는 것이다. 이 방법에서는 높은 생산성 온도 때문에 가열 및 냉각 시스템이 요구된다. 이스트 세포가 노출되는 잠재 열적 충격은 추가의 조사가 필요하여 잠재적 부정전인 면이 내포되는 것으로 평가된다. 이 연구에서, 높은 이스트 생존율(90% 이상)을 갖는 고정화 세포 비드가 생산되나, 이 바업이 이스트 번식상 원인으로 되는 다른 영향은 조사되지 않았다. 소망의 에멀젼을 생산하기 위하여 오일이 사용되어 비드를 형성하고, 오일에 계면활성제로 작용하여 거품 형성을 억제하기 때문에, 비드 표면에 오일 잔류뮬이 나온다. 이 잔류물이 발효단계에서 도움을 줄지라도, 최종 맥주로 넘어가, 최종 제품에서 거품이 요구되므로 맥주를 손상시킨다. 오일로부터 고상(비드)을 분리하는 데 이용되는 다량의 염화칼륨 용액 및 비드를 바이오리엑터에 넣기 전에 비드 슬러리로부터 이 식염 영액을 제거하는 방법에 주의를 요한다. 그렇지 않으면, 이 용액을 반응기로부터 분출시키고 이어서 비드를 반응기에 첨가할 필요가 있다. 고정화 세포 비드가 바이오리엑터 외부에서 생산되므로, 비드가 바이오리엑터에 도입될 때까지 비드 형성 공정 및 멸균을 통해 무균 기술이 이용되어야 한다. 탱크 사이 각종 이송점은 오염될 기회가 있고, 오염의 존재가 비드내의 그의 공동 고정화로 인할 수 있다는 사실 때문에 반드시 감시되어야 한다. 실험실내에서는 부지런하기 때문에, 무균 비드를 연속적으로 생산하는 것이 가능하다. 그러나, 공장 환경에서는 실험실과 같이 후하게 생각할 수 없으므로, 엄격하게 조정하여야 한다.

6.2.2 부유 응집 이스트 세포

고정화의 가장 자연적 형태의 하나는 세포의 플록내로 미생물의 자가 응집이다. 칼레자 및 존손(Calleja and Johnson) (1977)은 세포가 서로 접촉하여 모든 현저한 결합특성을 갖는 응집물을 형성하는 3가지의 가능한 이유를 제시하였다. 첫째는 페로몬 방충에 의해 서로 끌어당기는 상이한 성의 세포를 포함한다(□ 및 a-인자). 이 결합 형태는 일시적이고, 보세포 벽에 정착한 a-응집소와 □사이에단백질-단백질 결합을 포함한다. 또한 발아공정중 모세포로부터의 분리를 실패하여 응집을 일으키기도 한다. 이 실패는 특별한 이스트 균주의 성질에 기인하거나, 또는 수많은 유전자의 변이 또는 영양 결핍에 의해 원인이 되기도 한다. 이러한 양상은 사슬 형성으로 불리며, 부유 응집으로 불리지 않는다. 이들 세포사이의 결합은 기계적 전단에 이해 비가역적으로 파괴된다(Stratford, 1996).

세 번째 시나리오는 일반적으로 부유 응집으로 알려져 있다. 스튜워트 및 러세포(1981)은 이 응집을 "이스트 세포가 덩어리로 부착하고 매질로부터 신속하게 침강여, 이들은 현탁되거나 또는 매질 표면에 발생하는 현상"으로 정의하였다. 부유 응집은 발생적으로 제어되며, 그의 메커니즘은 인접 세포벽사이 브릿지로서 작용하는 선택딘 분자에 의존한다는 광범위한 증가가 있다. 더 구체적으로, 특정 렉틴이 Ca²⁺이온 존재중에서 인접하는 세포의 □-마난에 결합된 것으로 생각된다. 이 단백질/탄화수소 결합은 킬레이트화제나 특정 당에 의해 가역적으로 저해받는 것으로 발견되었다.

제 12도는 3개의 가능한 이스트 세포 배열, 즉, 비 부유 응집 이스트, 사슬 형성 이스트 및 부유 응집 이스트를 나타낸다. 사슬 형성 이스트의 경우에, 세포가 응집하였다 하더라도, 이들 세포는 혼자서 개시할 수 없으므로 부유 응집으로 고려되지 않으며, 응집은 바람직한 환경 조건(Ca²⁺이온 및 당을 억제하는 저수준) 때문에 단일 세포가 모여 덩어리를 형성하기 때문이다. 부유 응집 세포의 경우에 특정 사이즈의 플록은 세포 발생 및 세포가 노출된(전단 환경) 수력학 조건에 의존한다.

제 13도 및 제 14도는 응집도를 변화시킨 2개의 라바트 라거 이스트 균주를 강조한다. 매질 응집 이스트 균주, LCC3021을 도 13에 나타낸다. 칼슘이온 존재하에서, 이 균주는 글루코오즈가 액상 배지에서 결핍되면 0.5mm 내지 1.0mm 응집물을 형성한다. 도 14는 수퍼 응집 이스트 균주, LCC290의 도이며, 이것은 1mm 이상의 플록을 형성하고, 낮은 전단 환경하에서는 직경 5mm에 달하는 덩어리의 응집을 형성한다. 적당히 교반되는 조건하에서, LCC290의 플록 직경은 1 및 2mm 사이이다.

이스트 부유 응집에 평가에 몇 가지의 측정법이 제안되었다(Speers & Ritcey, 1995; Akiyama-Jibiki et al., 1997; Teixera et al, 1991; Stewart & Russel, 2000). "Brewer's Yeast"(Stewart & Russell, 2000)에서, 이스트 응집법을 3가지 영역, 즉, 침강법, 정치 발효법 및 성장 배지중 플록 형성의 직접 관찰법으로 분류하였다.

1937년 Burns에 의해 처음 기술된 침강법은1953년 Helm 및 그의 동료에 의해 개량되었고, technical Committee and the Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists(1992)에 의해 표준 분석법으로 정해졌다. 이 기술은 이스트의 특성을 황산칼륨 완충액에서 평가하고, 실질적 발효 배지에서 측정하지 않으므로 인 비트로(in vitro) 법으로 불린다. Gilliland 법으로 알려진 정치 발효법은 호프 맥아즙중의 효소의 성장 및 그의 부유 응집 특성을 인 비보(in vivo)에서 측정하는 것을 포함한다. 이들 방법은 모두 UV/가시 스펙트로포토미터를 사용하는 탈응집하는 이스트 샘플 대 고정 이스트 샘플의 흡광도를 측정하는 것을 포함한다.

스튜워트 및 러세포(2000)은 20 ㎖ 스크류 캡 유리 병중 성장한 이스트 샘플중에 일어나는 부유 응집의 수준을 시각적으로 기술함으로서 이스트 부유 응집의 측정법을 제시하였다. 그들은 부유 응집을 나타내기 위하여 객관적 측정, 예컨대, 5-매우 심한 부유 응집, 4-심한 부유 응집, 3-적당한 부유 응집, 2-약한 부유 응집, 1-거친 부유 응집, 0-부유 응집 없음을 사용하였다. 수퍼 부유응집 이스트 균쥬, LCC290은 4-심한 부유응집으로 분류되었으나, LCC3021 이스트 균주는 3-적당한 부유응집으로 분류되었다.

침강하던지 또는 표면 위로 오르는 이스트의 특성은 발효액으로부터 이스트를 분리하는 방법으로 통상 사용되어 왔으므로, 부유 응집은 양조 산업에서 매우 중요한 특성이다. 그러나, 발효가 완료되기 전에 부유 응집시키는 발효 균주는 바람직하지 않다. 그 이유는 액체가 그의 이상적인 알코올로 도달하지 않고, 잔류 당 수준으로 도달하기 때문이다. 이러한 경향은 살포 가스를 분사함으로서 보정되며, 이는 현탁을 유지시킨다. 이와 같은 시스템에서 고형 입자가 연속적으로 순환되어 발효액과 접촉을 유지하기 때문에 액체 배지 미발효의 두려움은 제거될 수 있다.

6.2.2.1 섹션에서, 수퍼 부유응집 이스트, LCC290의 침전성 및 발효 수행성의 특징이 설명되어 있다. 관심은 이 특별한 이스트 균주의 부유 응집을 동정하는 것이다. 또한, 이스트 정치 용기의 디자인에서 미래 사용할 수 있는 가치 있는 정보를 제공하기 위하여 이스트의 개시 속도를 측정하였다.

6.2.2.1 수퍼 부유 응집 이스트, LCC290의 특성

가스 부양 흡출관 바이오리엑커내에서 수퍼 부유 응집 이스트, LCC290으로 연속 발효전에 실험질 스케일인 진창 플라스크 발효로 이스트의 특징을 결정하였다. 도 6.28은 시간에 따른 이스트 번식의 진행을 나타낸다. 예상한 바와 같이, 처음 48시간 동안 농도는 급격히 증가한 후, 발효 종료시에는 약간 감소로 수준이 저하하였다. 처음 48시간 동안, 이스트 성장을 허용하는 맥아즙내에 영양 및 산소가 충분하였다. 그러나, 이스트가 산소 부재중 탄화수수를 계속하여 소비하여 감에 따라, 더 이상 생산하지 못하고, 염기성 발효상태로 들어갔다. 일단, 탄화수가의 공급이 결핍되면, 이스트의 작은 번식이 사멸되기 시작한다. 이 현상은 도 6.29에 나타냈으며, 여기서, 세포 생존율은 약 97%에서 90%이상으로 감소하였다.

도 6.30은 발효중 탄화수소의 소비를 나타낸다. 처음에 발효 세포는 당 글루코오즈 및 프락토오즈를 소비하고, 그런 다음, 말토오즈 및 말토트리오즈를 취한다. 그러나, 양조 이스트는 말토테트라트로오즈 또는 더 이상 긴 사슬의 폴리사카라이드를 대사시키지 못한다(폴리 1 & 2). 총 탄화수소 농도가 감소(도 6.31에서 비중 곡성으로 표시)하므로, 이와 비례하여 에탄올 농도는 증가한다. 발효 약 37시간에서 에탄올과 탄화수소 농도는 같게 되었다.

성장과 탄화수소 대사 관점에서, 수퍼 부유 응집 이스트, LCC290은 산업 이스트 균주 LCC3021이 거동하는 바와 같이, 거동한다. 액상 비중이 약 2.7^oP에 도달할 때, 발효는 완료된 것으로 보인다. 부유응집 이스트 균주가 거대 덩어리(플록)을 형성하고, 발효 종료전에 용액으로서 나오는 것이 일반이며; 이러한 현상은 양조 산업에서 'hung' 발효로 알려졌다. 우리의 뱃치 시도에서, 플라스크를 진탕하여 이스트를 현탁시키고, 영양 성분과 폐쇄 접촉시키기 때문에 발효를 종료할 수 있었다.

조사된 또 다른 중요한 특성은 이스트의 부유 응집능이다. 특히, 우리는 이스트가 정착되고, 이 특별한 이스트 균주가 부유 응집을 개시할 때의 지표를 얻는 속도를 설정하는 데 관심이 있었다. 이러한 특징은 가스 부양 발효기내에서 건강한 이스트 번식을 유지하는 역할을 하므로 연속 발효 시도에 중요하다. 도 6.32는 발효중 이스트 정착 커브를 나타낸다. 24시간에 시험된 샘플중 발효는 거의 일어나지 않았다. 어떤 당의 존재(글루코오즈는 저해제로 알려져 있음)에 의해 부유 응집에 저해되며, 따라서, 부유 응집을 저해제가 결핍될 때에만 개시한다. 샘플중, 40시간 뱃치 발효에서 섹션 4.7에 기술된 방법에 의해 시험될 때, 세포는 부유 응집을 시작하여 용액으로부터 정착한다. 정착이 일어나지 않은 24시간을 제외하고는 모든 시험 간격에서 정착은 매우 신속하게 일어났다. 가장 늦은 정착 시도 40시간에 수행하는 동안, 이스트는 90초에서 완전히 시험기로부터 정착되었다. 71시간에서, 정착하는 데 50초 이하가 요구되었다.

연구자는 정착율은 고형분 농도의 함수로 제안하였다(Coe and Clevenger, 1916). 도 6.33은 설정 이스트 세포 sd도에서 고형분의 정착 속도를 플롯트한 것이다. 이 커브의 데이터 포인트는 각 발효 인터발에서 취합된 정착 데이터 상에 Kynch(1952)에 의해 제시된 방법을 사용하여 만들어졌다. 이 결과는 이는 Coe and Clevenger(1916)이 관찰한 바와 같은 양상을 확인하는 바와 같이, 거의 같은 커브에 존재한다.

정착 시험중 수집된 결과는 수퍼 부유응집 잇트 균주 LCC290이 6^oP이하의 액체 비중에서 부유 응집함을 나타낸다. 이 값은 세포를 부유 응집이 요구되면 슈도-안정 액체 비중이 유지되는 연속 발효의 가이드로서 사용될 수 있다. 6^oP이상에서 반응기를 작동시키는 것은 부유 응집을 불안정화시킬 위험이 있으며, 고정화 이스트 번식을 유실시킬 가능성이 있게 된다. 수퍼 부유응집의 정착 특성은 이스트 번식은 정체가 생기면 아주 신속하게 정착해 버린다. 상상 가스 부양 흡출관 바이오리엑터로 순환중이들 세포를 유지하는 것이 가능하나, 가스 공습 시스템이 실패하는 경우에는 신속히 정착되어, 고형분을 재현탁시키기 위하여 보조 분사 가스를 필요로 하게 된다. 포스트 발효 공정에서, 이러한 신속 정착 특성은 중력 침전기와 같은 고형물 분리기가 벌크 고형물 제거에 사용될 수 있으므로 유리하다. 양조산업에서, 이러한 것은 원심 장치상의 고형물 하중을 경감시키고, 원심분리 용기 배출 사이에 긴 운전시간을 허용한다. 맥주 손실의 경감이 기대되고, 또한 원심분리기에 의해 맥주에 부여되는 향미의 떨어짐을 최소화할 수 있다. 왜냐하면, 원심분리를 통해 통과한 이스트 생체 덩어리의 수준을 낮출 수 있기 때문이다.

도 6.28 발효시간에 대한 LCC290 진탕 뱃치 발효의 총 이스트 세포 농도

도 6.29 발효시간에 대한 메틸렌블루에 의해 측정된 이스트 세포 생존도

도 6.30 LCC290 이스트 뱃치 발효를 위한 발효시간에 대 탄화수소 농도 프로파일

도 6.31 LCC290 이스트 뱃치 발효를 위한 발효시간에 대 에탄올 및 그릴세롤농도 및 액제 비중

도 6.32 정착 시간대 이스트 현탁의 계면 높이. 이 도면의 값은 수개의 발효 간격으로 수집되었다.

도 6.33 세포 농도 대 이스트 현탁액의 정착 속도. 이 도면의 값은 수개의 발효 간격으로 수집되었다.

6.3. 맥주의 연속 발효용 가스 부양 기술의 평가

이 명제의 제일 그리고 가장 중요한 목표는 사카로마이세스 칼스버겐시스 세포(6.2.1에서 기술)를 포촉하는 □-카라기난을 사용하는 연속법에서 50ℓ 파이롯트 스케일 가스 부양 바이오리엑터를 운전시키는 것의 가능성을 평가하는 것이다. 또한, 향미를 갖는 북미 타입의 라거 맥주가 이와 같은 시스템으로 생산될 수 있는지 에 대해 조사하는 것이 우리의 요망이었다. 또한, 우리는 고비중의 맥아즙(17.5^oP)의 완전한 희석에 요하는 최소 거류 시간을 결정하고 또한 연속 발효 시스템내에서 산호의 작동 범위를 설정하는 것이다.

모든 맥아즙 당이 소비되는 최소 거류 시간은 24시간이었다. 이는 5∼7일 걸리은 전통적 뱃치 발효시간에 비교될 수 있다. 바이오리엑터내 설치한 인골드 산호 프로우브에 의해 측정된 용해 산소 농도는 분사 가스(0∼20%v/v)에 첨가되는 산소에 관계없이 거의 0에 가깝다. 이는 맥아즙에 공급된 산소는 이스트 세포에 의해 속히 소비되거나 또는 배출가스중에 산순히 배출되는 것을 가르킨다. 맥주의 분출중의 유리 세포의 수준은 그린 맥주 ㎖당 10⁸세포이었다. 디케톤류, 디아세틴 및 2,3-펜탄이돈이 수준 및 아세트알데히드의 수분은 분사 가스(도 6.34 및 6.35)에서 산소 비율이 감소함에 따라 감소하였다. 측정된 에스테르(에틸아세테이트 및 이소아밀 아세테이트) 및 고급 알코올(프로판올, 이소부탄올, 이소아밀아코올)은 나타나지 않아 산소 공급의 변화에 의해 영향을 주지 않았다(도 6.36).

도 6.37은 산업적으로 생산(유리 세포 뱃치 발효)되는 맥주를 제어하는 연속고정 세포 시스템으로 생산되는 2종의 최종 시험 맥주에 각종 향미 활성 화합물을 비교한다. 연속 발효 맥주 및 제어사이에 있어서, 산소 공급에 관계없이, 에스테르(에틸아세테이트, 이소아밀 아세테이트)에 약간의 차이 및 높은 차이의 알코올(프로판올)이 관찰되었다. 2% 산소로 생산된 최종 맥주의 맛은 전문 감식가에 의해 이들이 제어 맥주(산업적 제품)와 거의 밀접함을 판정하였다. 그러나, 20% 산소로 생산된 맥주는 산화 향미 및 '종이' 같고, '와인' 같은 맛을 가져 허용될 수 없었다.

파이롯트 스켄일 바이오리엑터는 6주 동안 24시간 거류 시간으로 거의 꾸준하게 작동되었다. 그린 맥주는 허용되는 향미 프로파일을 가지며, 주된 결점(유황 냄새)은 없었다. 살포 가스중의 산소양은 이 실험에서 결정전인 요소로 증명되었다. 살포 가스 중의 2∼5% 산소로 생산된 맥주는 가장 좋은 맛 프로파일을 부여한다. 이 제어는 예비 발효 및 후 발효 검체의 세트에서 수행되는 측정으로 정확한 산소측정 기술에 집중을 요한다.

통상의 뱃치 발효에서, 맥아즙을 발효기에 이송하기 전에 산소를 주입한다. 배지 접종후, 이스트 세포가 이것을 소비(이스트 성장이 일어나는 최초 발효 24시간)함에 따라 용해 산소 농도는 신속하게 감소한다. 따라서, 발효 잔류물은 대부분 혐기성 조건하에서 일어난다. 최초 발효용 연속 균일 시스템의 사용은 경시적으로 산소 농도의 변화를 허용하지 않는다. 그 이유로, 연속 및 뱃치 발효를 사용하여 생산된 맥주용 완전한 향미에 도달하게 매우 어렵기 때문이다. 이들 차이에 관계없이 초기 사정에서 시험되는 바이오리엑터 배치는 허용되는 향미와 분석적 프로필을갖는 맥주을 생산한다. 상당히 작은 사이즈(약 1mm)의 비드를 갖는 가스 부양 바이오리엑터를 사용함으로서, 조기 발효시간을 수일로 줄임으로서 용량적 바이오리엑터 생산성을 증가시키는 것이 가능하다. 배출 맥주중에 방출되는 바이오메스의 수준은 고정화 세포 바이오리엑터중의 이스트 성장 수준은 유사한 조건하에서 유리 세포 뱃치 발효의 그것에 같음을 나타낸다. 이들 관찰은 이스트 성장시 형성된 향미에 의존함을 확인한다. 이것은 한정된 성장 고정화 세포 시스템으로 허용되는 맥주를 생산하는 종전의 시도의 실패를 설명한다. 제어된 가스 혼합물의 공급은 연속 고정화 세포 발효에서 맥주의 감각수용성 특성의 미세 조정에 강력한 무기가 될 수 있다.

또한, 배출 액체중의 디아세틸의 높은 수준은 다른 연구자(Virkajarvi & Pohjala, 1999; Kronlof et al., 2000)에 의해 관찰되었다. 북미 라거 타입에서 다아세틸의 목표 수준은 연속 발효 액제중의 400∼800□g/ℓ에 비하여 30□g/ℓ이다. 통상의 숙성 공법(2℃에서 14일간 냉숙성)의 사용은 디아세틸을 소망의 범위로 낮추나, 전체 가공 생산성을 훼손한다. 2장에서 보고된 속결 2차 발효기술의 사용은 생산성을 낮추지 않고 디아세틸을 저하시키는 데 도움이 된다(2시간 공법). 그러나, 추가적 비용이 방해가 되어 모든 양조업자는 이 맥주를 높은 온도(80℃∼90℃)까지 올리는 것을 원치 않는다.

도 6.34 살포 가스중 산소 백분율 대 디케톤 농도. 발효는 40%9v/v) 카라기난 겔 비드를 실은 50ℓ 가스 부양 시스템중에서 수행되었다. 총 살포 가스율은 6.4 SCFH에서 일정하게 유지하였다. 거류시간은 24시간이었다.

도 6.35 살포가스중의 산소 백분율 대 아세트알데히드 농도. 이 발효는 40%(v/v) 카라기난 겔 비드가 담지된 50ℓ 가스 부양 시스템 중에서 수행되었다.총 살포율은 6.4SCFH로 일정하게 유지시켰다. 거류 시간은 24시간이었다.

도 6.36 살포 가스중 산소 백분율 대 에스테르 및 퓨젤 알코올 농도. 이 발효는 40%(v/v) 카라기난 겔 비드가 담지된 50ℓ 가스 부양 시스템 중에서 수행되었다. 총 살포율은 이 발효는 40%(v/v) 카라기난 겔 비드가 담지된 50ℓ 가스 부양 시스템중에서 수행되었다. 총 살포율은 6.4SCFH로 일정하게 유지시켰다. 거류 시간은 24시간이었다.

도 6.37. 산업적으로 생산된 맥주 및 맛 역치 대 살포 가스중의 2% 산소 및 20% 산소로 생산된 최종 제품의 비교. 연속 발효 제품을 위하여, 발효는 40%(v/v) 카라기난 겔 비드가 담지된 50 ℓ가스 부양 시스템에서 수행되었다. 총 살포율은 6.4SCFH로 일정하게 유지시켰다. 거류 시간은 24시간이었다.

6.4 3상 가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 발효의 혼합 및 순환율

섹션 4.8에서 개략적으로 언급된 산 주입법을 사용하여 혼합 실험을 수행하였다. 실험의 상의 목표는 2중이다. 우리는 가스 부양 시스템이 상이한 표면 유동 가스 속도에서 수많은 고정 담체용 액체 순환율 및 생성 혼합시간을 계산함으로서 잘 혼합되었는지를 평가하기를 원했다. 문헌에 보고된 것과 이 시도의 차이는 모든 실험이 모델 액체(물-고체-가스 시스템)에서 보다 활성 이스트 세포로 실제 발효 배지상에서 수행하는 것이다. 또한, 혼합 실험은 표면 액체 속도를 계산하여 연결하고, 이는 파이롯트 시스템의 미래 스케일 업에 사용될 수 있을 것이다.

6.4.1 프로우브 측정

혼합 연구에서 이용되는 pH 프로우브는 섹션 4.9에 기술된 방법을 사용하여 측정하였다. pH 프로우브로부터 방출되는 4-20 mA 시그널은 250 Ohm 저항기를 통해 통과하여 1-5 볼트 시그널로 전환되고, 이는 데이터 획득 카드(DAC)에 의해 기록된다. pH 프로우브를 일련의 완충액, 즉, pH 4.6 완충액, pH 4.0 완충액, pH 5.0 완충액, pH 6.0 완충액 및 pH 7.0 완충액에 연속적으로 침지하였다. 도 6.38은 5개의표준 pH 용액에 대한 인골드 pH 프로우브 응답용 획득 시스템에 의해 수집된 데이터를 나타낸다. 도 6.39는 측정 시그널 전압 대 실제 pH 값을 플롯팅한 pH 프로우브 측정 커브이다. 이 시스쳄에 가장 적합한 측정 커브(0.9996의 상관 관계 계수)는 다음 식에 의해 정의된다:

pH= 3.68*전압-3.53(6.1)

수집된 혼합 데이터는 가스 부양 바이오리엑터 내주에서 측정된 바와 같이 실질 pH 값을 반영하는 식 6.1을 사용하여 변환된다.

pH 변화에 대한 pH 프로우브의 응답 시간도 측정하였다. 도 6.40 내지 도 6.43은 pH 중의 4개의 상이한 단계 변화, 즉, 0.6, 1.2, 2.3, 및 3.4 유니트에 대한 pH 프로우브의 전형적 응답을 나타낸다. 원래의 데이터를 TableCurve 2D(Jandel Scientific) 데이터 프롯팅 및 분석 소프트웨어을 사용하여 펄스 함수에 적용시켰다. 얻어진 커브는 0.994 보다 큰 상관 계수를 갖는다. 이들 커브로부터 단계 변화의 98%에 응답하는 프로우브 시간(응답 시간)을 계산하고, pH 단계 변화에 대하여 프롯트하였다(도 6.44). 범위내의 pH 단계 변화에 기우는 응답 시간을 시험하였다. 0.6의 가장 작은 단계 변화에 대하여 pH 프로우브 응답 시간은 ∼6.4초이었다. 이 응답 시간은 3.4의 pH 단계 변화에 약 4.2초로 감소하였다.

특히, 이 시스템이 혼합시간 및 순환율의 계산에 사용될 때, 이러한 종류의 프로우브 특성은 중요하다. 이 프로우브는 배지중의 변화를 반영하는 낮은 응답 시간을 가져야 한다. 특히, pH 프로우브 응답시간은 이와 같은 특정에 정확히 사용된다면, 반응 중에서 순환속도보다 낮아야 한다. 그러나, 준-즉각적 응답은 필요하지않다. 왜냐하면, 응답중 약간의 지연은 연속적 순환속도 측정에 반영되어 없어지게 된다.

도 6.38. 시간에 대한 각종 완충액에 응답하는 인골드 pH 프로우브에 대한 데이터 획득 시스템에 의해 얻어진 원 데이터. 획득 주파수는 총 15000 포인트용 50 Hz이다.

도 6.39. 측정 전압(V) 대 pH 프로우브 측정 커브 플롯팅 pH. 가장 적합한 라인 또는 측정 라인은 다음 식을 갖는다: 0.9996의 상관계수(N=2500)를 갖는pH=3.68*볼트-3.53

도 6.40. ∼0.6의 pH 단계 변화에 대한 pH 프로우브 응답 시간의 전형적 데이터. TableCurve 소프트웨어를 사용형 응답에 적용했다. 최적 펄스 함수는 0.995의 상관계수를 갖는다.

도 6.41. ∼1.2의 pH 단계 변화에 대한 pH 프로우브 응답 시간의 전형적 데이터. TableCurve 소프트웨어를 사용형 응답에 적용했다. 최적 펄스 함수는 0.999의 상관계수를 갖는다.

도 6.42. ∼2.32의 pH 단계 변화에 대한 pH 프로우브 응답 시간의 전형적 데이터. TableCurve 소프트웨어를 사용형 응답에 적용했다. 최적 펄스 함수는 0.999의 상관계수를 갖는다.

도 6.43. ∼3.4의 pH 단계 변화에 대한 pH 프로우브 응답 시간의 전형적 데이터. TableCurve 소프트웨어를 사용형 응답에 적용했다. 최적 펄스 함수는 0.999의 상관계수를 갖는다.

도 6.44. 단계 변화에 대한 인골드 pH 프로우브 응답.(N=3). 높은 pH 완충액시간의 전형적 데이터. TableCurve 소프트웨어를 사용형 응답에 적용했다. 최적 펄스 함수는 0.999의 상관계수를 갖는다.

6.4.2 혼합 시간 및 순환율

혼합 시간 및 순환율 실험을 3종의 고정화 세포 발효 상에서 수행했다. 이 실험을 고형물을 함유하지 않는 수용액상에서 그리고 □-카라기난 겔 비드, 수퍼 부유 응집 LCC290 이스트 또는 배지 부유응집 LCC3021 이스트의 어느 하나를 함유하는 비중 2.7^oP의 발효 육븝에서 50ℓ 파이롯트 스테일 흡출관 바이오리엑터 내부에서 수행하였다. 도 6.45 및 6.46은 산 펄스(섹션 4.8에 기술된 방법)의 주입후에 pH 프로우브 시스템을 사용하여 수집한 1차 데이터의 샘플 묘사이다. 도 6.45는 고형물을 함유하지 않는 수용액에 산을 주입할 때의 응답을 나타내는 반면, 도 6.46은 높은 부유 응집 이스트, LCC290을 함유하는 발효육즙에 산을 주입하였을 때의 응답을 나타낸다. 시그널은 붕괴하는 사인곡선에 맞추어지고, 0.96 및 0.90의 상관계수는 각각 상응하는 식으로 계산된다. 차트 상의 적용 인자, "b", "c"는 붕괴 사인곡선 식(3.1)에 기술된 "a" 및 "□"값에 상응한다. 이들 수치는 순환율 및 주어진 시스템에서의 혼합시간을 계산하는 식 3.2 및 3.3에 사용된다.

도 6.47 및 6.48은 고형물을 함유하지 않는 수용액에 산 주입용 혼합시간 및 순환율 그래프이다. 도 6.49 및 6.50은 높은 부유 응집 이스트 LCC290을 사용하는 혼합 실험을 위한 상응하는 그래프이며, □-카라기난 혼합 시험으로의 결과는 도6.51 및 6.52에 제시되어 있다. 마지막으로 배지 부유응집 이스트 LCC3021의 혼합시간 및 순환시간은 도 6.53 및 6.54에 나타냈다. 시험되는 고체의 종류에 상관없이, 혼합 시간 및 순환율은 표면 가스속도중의 상응하는 증가에 따라 감소한다. 순환율과 표면 액체 속도 사이의 관계는 4개의 모든 시험 시스템을 위한 Kennard 및 Janekah(1991)에 의해 제안된 식 3.11에 따른다. 혼합시간은 물/무고체 시스템 및 □-카라기난 겔 비드 시스템을 위한 식 3.11의 관계를 따른다. 고정화 메트릭스와 같은 부유 응집 이스트의 시스템은 Kennard and Janekah의 이론적 모델에 강한 상관관계를 나타내지 않는다. LCC290 및 LCC3021 시스템은 모델에 의해 에견되는 것보다 낮은 초기 혼합시간(표면 가스 속도가 4mm/초를 초과할 때까지)을 갖는다. 그러나, 혼합시간에의 감소율은 모델 저하 값 동안에 4mm/초 이상의 표면 가스 속도에서 저하된다. 표 6.1은 순환시간 및 혼합시간이 표면 가스 속도에 관여하므로 이들을 위한 유도 식을 제공한다.

도 6.55는 모든 4개의 시스템을 위한 표면 가스 속도에 대한 혼합시간의 관계를 나타낸다. pH 펄스(3mm/초의 Vsg에서 ∼220초)와 LCC290 시스템의 98% 혼합에 가장 높은 시간을 나타내는 물/무 고체는 시스템(3mm/초의 Vsg에서 ∼110초)에서 산의 펄스 효과를 최소화하는 최적능을 나타낸다. LCC3021 및 □-카라기난 시스템의 값은 물/무 고체 및 LCC290 시스템 사이이다. 가스 부양 바이오리엑터 내의 고체는 소용돌이 형성을 자극하여 공축 혼합을 촉진하여 액상 DCP 원소의 분산을 도운다. 비록 배지 부유 이스트 LCC3021로서 동일한 고체 하중(16% v/v)에서라도, 수퍼 부유 응집 이소트 LCC290은 모든 시험되는 표면 가스 속도에서 빠른 혼합시간을허용한다. 2mm/초의 표면 가스 속도에서 순환시간은 가장 빠른 순환율을 갖는 물/무 고체 시스템 및 가장 느린 순환율을 나타내는 LCC290 시스템에서 28초와 35초 범위이다. 높은 가스 속도에서, 4 시스템사이의 차이는 약 3초 저하시킨다. 그러나, 모든 시험 속도에서, LCC290 시스템은 느린 순환율을 나타내는 반면, 물/무 고체 시스템은 가장 빠른 순환율을 나타낸다.

도 6.57은 표면 가스 속도와 표면 액체 속도 사이의 관계를 나타낸다. Livingston 및 Zhang (1993)에 의해 제시된 식 3.7은 주어진 순환율 및 고체 종류를 휘한 표면 액체 속도를 계산하는데 이용할 수 있다. 표면 액체 속도는 표면 가스 속도의 증가에 상응하여 증가한다. LCC3021 및 물/무 고체 시스템은 유사한 경향을 가지는 반면, LCC290 및 k-카라기난 시스템은 유사성을 갖는다. Kennard 및 Jenekah에 의해 제시된 모텔 식은 도 6.57의 표면 가스 속도 커브 대 표면 액체 속도에 맞다. 도 6.58은 식 3.10을 사용하는 이론적으로 계산된 표면 액체 속도 대 실험적으로 계산된 표면 액체 속도를 플롯트한 것이다. 4개 시스템 모두 y=0에서 기술이 1의 1차 함수로 표시되는 바와 같이 제안된 식에 맞는다. 표 6.1은 이 연구에서 시험되는 시스템에 유래하는 상관관계를 리스트한 것이다.

도 6.45 50ℓ 가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 pH 프로우브 응답 데이터. 산 펄스를 고체를 함유하지 않는 수용액에 주입하였다. 표면 가스 속도는 1.94mm/초에서 고정하였다. 원 데이터는 붕괴하는 사인 커브에 맞았다. 상관계수는 0.96이었다.

도 6.46 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 pH 프로우브 응답 데이터. 산 펄스를 높은 부유 응집 이스트, LCC290을 함유하는 발효 배지에 주입하였다. 표면 가스 속도는 1.94mm/초에서 고정하였다. 원 데이터는 붕괴하는 사인 커브에 맞았다. 상관계수는 0.90이었다.

도 6.47 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 혼합시간. 산 펄스를 고체를 함유하지 않는 수용액에 주입하였다. 혼합시간은 단계변화가 98% 무효로 되는 데(n=3) 요하는 시간에 상응하였다.

도 6.48 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 순환시간. 산 펄스를 고체를 함유하지 않는 수용액에 주입하였다.(n=3)

도 6.49 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 혼합시간. 산 펄스를 높은 부유 응집 이스트, LCC290(플록 사이즈 >1.0mm)를 함유하는 발효 배지에 주입하였다. 혼합시간은 단계 변화가 98% 무효로 되는 데 요하는 시간에 상응하였다. (n=3)

도 6.50 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 순환시간. 산 펄스를 높은 부유 응집 이스트, LCC290(플록 사이즈 >1.0mm)를 함유하는 발효 배지에 주입하였다. (n=3)

도 6.51 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 혼합시간. 산 펄스를 □-카라기난 겔 비드(비드 사이즈 1∼2mm)내에서 고정화 된 이스트 LCC3021를 함유하는 발효배지에 주입하였다. 혼합시간은 단계 변화가 98% 무효로 되는 데 요하는 시간에 상응하였다. (n=3)

도 6.52 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 순환시간. 산 펄스를 □-카라기난 겔 비드(비드 사이즈 1∼2mm)내에서 고정화 된 이스트 LCC3021를 함유하는 발효배지에 주입하였다. (n=3)

도 6.53 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 혼합시간. 산 펄스를 배지 부유 응집 이스트, LCC3021(플록 사이즈 <0.5mm)를 함유하는 발효배지에 주입하였다. 혼합시간은 단계 변화가 98% 무효로 되는 데 요하는 시간에 상응하였다. (n=3)

도 6.54 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 순환시간. 산 펄스를 배지 부유 응집 이스트, LCC3021(플록 사이즈 <0.5mm)를 함유하는 발효배지에 주입하였다. (n=3)

도 6.55 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 혼합시간. 산 펄스를 상이한 고체를 함유하는 발효배지에 주입하였다. 혼합시간은 단계 변화가 98% 무효로 되는 데 요하는 시간에 상응하였다. (n=3)

도 6.56 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 표면 가스 속도 대 순환시간. 산 펄스를 상이한 고체를 함유하는 발효배지에 주입하였다. (n=3)

도 6.57 4개의 시험 시스템- LCC3021 이스트, LCC290 이스트, 카라기난 겔비드 및 물/무 고체 시스템에서 실험적 표면 기체 속도(mm/초) 대 표면 액체 속도(mm/초). 시험은 50ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터 내에서 수행되었다.

도 6.57 4개의 시험 시스템에서 실험적 표면 액체 속도(mm/초) 대 이론적 표면 액체 속도(mm/초). 이론적 값은 Kennar 및 Janekah(1991)에 의해 제안된 다음 관계를 사용하여 산출하였다: V_SL??V_SG ^M. 1차 직선의 기울기는 1이고, Y 절편은 0이다.

표 6.1 4개의 시험 시스템에서 혼합시간, 순환율 및 표면 액체 속도를 위한 산출된 상관관계의 요약

	혼합 시간	순환율	표면 유체 속도
물/무고체LCC290 효모□-카라게닌 겔LCC3021 효모	tm=336.04 VSG -0.4tm=181.55 VSG -0.4tm=254.68 VSG -0.4tm=322.07 VSG -0.4	tc=37.94 VSG -0.4tc=44.67 VSG -0.4tc=41.73 VSG -0.4tc=37.90 VSG -0.4	VSL=189.06 VSG 0.283VSL=134.75 VSG 0.419VSL=171.92 VSG 0.283VSL=158.12 VSG 0.427

표면 액체 상관관계를 위하여, Kennard 및 Janekah(1991)은 증류수에서 0.41, 카르복시메틸 세포루로오즈 및 에탄올을 함유하는 용액에서 0.64의 지수를 제안했다. LCC290 및 LCC3021 시스템은 각각 0.419 및 0.427의 지수를 가지며, □-카라기난 시스넴 및 물/무 고체 시스템은 0.283의 지수를 갖는다.

가스 부양 흡출관 기술의 기초 가정은 이 시스템이 적당한 BHS합을 이송하여 유체 요소 배출 반응관이 완전히 혼합하는 것이다. 연속 발효기로서 50ℓ 파리롯트 스테일 시스템의 작동에 있어서, 신선한 영양 배지를 분당 36 ㎖의 유속으로 반응기 저부에 주입하여 총 반응관 용량이 50ℓ가 되도록 한다. 이것은 공븍 성분을 거의 1000배 희석을 나타낸다. LCC290 이스트 시스템용 게산된 혼합 특성으로, 유체 성분을 약 3 반응기 순환 루프로 혼합되는 반면, 물/무 고체 시나리오에서는 10 반응기 순환 루프가 필요하다. 또한, 거류 시간(24 시간)은 혼합시간(180초)보다 약 100배이다. 빠른 혼합은 시스템 내의 영양의 희석을 도와주고, 거류시간 대 혼합시간의 큰 차이는 적당한 혼합 시스템을 제시한다. 가스 부양 바이오리엑터를 사용하는 전제는 맥주 발효의 이상적 혼합 환경을 제공하는 것이다. 이 혼합 연구의 결과는 이 전제을 지지하는 3개의 모든 발효 담체에서 수행된다.

6.5 가스 부양 시스템내에서 연속 1차 발효를 위한 몇 개의 고정법의 평가

3종류의 고정 담체 □-카라기난 겔 비드, 수퍼 부유응집 LCC290 이스트 및 배지 부유 LCC3021 이스트를 이용하는 50ℓ 파이롯트 스케일 가스 부양 흡출관 바이오리엑터중에서 연속 발효를 수행하였다. 모든 발효는 같은 수준으로 이스트 접종(4g/ℓ)하고, 산업적 라거 맥아즙을 영양 배지로서 사용하였다. 발효를 뱃치로 개시하여 맥아즙 당의 빠른 환원을 허용하고, 또한 발효기내에서 이스트 성장을 촉진하였다. 부유 응집 이스트의 경우에 이 뱃치상은 이스트 플록의 형성을 허용하고, 이것은 연속 공급이 시작되면 바이로리엑터내서 보류된다. 발효 액체중의 다아세틸 수준이 일단 30 □g/ℓ이하로 떨어지면, 연속 맥아즙 공급이 시작된다. 이들 3종류의 고정화 메트릭스로부터 얻어진 발효 분석에 대해 다음 섹션에서 상세히 기술한다.

6.5.1 □-카라기난 겔 비드의 사용: 포촉

고정화 메트릭스로서 □-카라기난 겔 비드의 사용은 맥주의 연속 1차 발효를 위한 가스 부양 기술의 예비 평가에 도움이 된다. 이와 같은 시스템이 발효 불안정성 및 오염을 포함한 주된 작동 곤란성을 경험하지 않고 장기간(2개월까지) 작동될 수 있는지 평가하는 것이 여전히 필요하다. 이 발효 시도용 작동 인자는 도 6.59에 기술되어 있다. 이산화탄소 표면 가스 속도를 5.5mm/초로 맞춰놓고, 0.9mm/초의 공기를 살포 가스중의 방응기에 도입하였다. 따라서, 2∼5% 산소를 시스템에 도입할 때, 바람직한 맥주를 생산하는 것을 가르키는 섹션 6.3의 결과와 일치하는 총 살표 가스으 3%에서 산화율이 맞춰졌다. 발효온도는 15℃로 제어되었다. 데이터에서 약간의 변동이 보이며, 이들은 이용되는 제어 루프의 특성에 관한다.

도 6.60은 경시 변화에 따른 유리 이스트 세포 번식의 발전과 이스트 생존율을 나타낸다. 생존율은 약 200시간에서 일시적으로 감소하나, 2개월 발효중 상당히 높게 유지된다. 이것은 연속 맥아즙 공급의 시작전의 점에 상응한다. 뱃치 발효에서, 세포가 영양 성분을 빼앗아가 버리므로 발효 종말에서 생존율은 감소한다. 일단 연속 맥아즙 공급이 시작되면, 생존율은 약 90%로 올라간다. 유리 이스트 세포 분포는 최초 발효 400시간 동안 낮고, 다음 300시간을 넘어서는 ㎖당 ∼1억 세포 내지 1.5조 세포로 약 10배 증가한다. 이 최대 농도에서, 유리 세포 이스트 번식은 남은 발효기간동안 거의 꾸준한 상태로 유지된다.

유리 이스트 농도의 급격한 증가는 아마도 고정화 이스트 세포 번식에 연결되는 것이다. 발효 개시에, 겔에 포촉된 이스트는 허용되는 모든 공간이 채워질 때까지 겔 내부에서 성장할 것이다. 일단 겔 비드가 이스트로 채워지면, 팽창 번식은 액체 배지로 흘러 넘어간다. 우리의 결과는 최초 400시간동안 고정화 이스튼 겔 내에서 성장하고, ∼700시간에서 이스트는 비드 내에서 성장한 더 이상의 공간이 없게되어 다량의 세포를 발효 육즙속으로 방출하기 시작한다.

이스트 번식중의 불안정은 에탄올 및 비중 프로파일에 반영된다(도 6.61). 발효 최초 200시간 동안, 에탄올이 경시적으로 증가하고, 비중은 통상의 뱃치 동역학에 따라 감소한다. 200 및 600시간 사이에 에탄올은 45 g/ℓ의 수준에 달하고, 비중은 ∼6^oP에서 유지된다. 이 결과는 종료 발효 액체가 ∼2.5 내지 2.7^oP의 비중을 가지므로 예상되지 않았다. 약 600 시간에서 , 유리 이스트 번식은 그의 최대에 도달할 때, 에탄올 수준을 약 70 g/ℓ로 증가하고, 맥아즙의 비중은 약 2.2^oP로떨어진다. 경시변화의 특이적 탄화수소 프로파일에 관한 면밀한 관찰(도 6.62)은 말토오즈 농도가 약 600시간까지 떨어지지 않음을 나타낸다. 다른 당은 예상대로 저하되었다.

2개의 다른 검체, 디아세틸 및 2,3-펜탄디온을 연속 가동하면서 모니터링하였다(도 6.63). 약 180 시간에서 저점은 뱃치 개시 상의 종말에 상응한다. 일단 연속 공급이 개시되면, 디아세틸 및 2,3-펜탄디온은 급격히 증가하여 약 500 □g/ℓ 및 400 □g/ℓ로 된다. 신선한 영양공급은 이스트 성장을 자극하여 과잉의 대사산물 수준으로 증가하겨 디아세틸 및 2,3-펜단디온을 수득하게 되기 때문에 초기 증가는 예상되었다. 발효가 계속되어감에 따라, 2,3-펜탄디온 수준은 약 400 □g/ℓ으로 유지되고, 디아세틸 농도는 500 □g/ℓ에서 275 □g/ℓ로 떨어지게 된다. 이점은 섹션 6.3에서 보고한 예비 평가에서 관찰된 바와 같이 2,3-펜탄디온 수준이하로 디아세 수준을 떨어뜨리는 것과 일치한다.

도 6.59 발효 시간 대 카라기난 고정 발효용 작동 인자

도 6.60 발효시간 대 □-카라기난 고정 이스트의 생존율과 총 이스트 세포 농도

도 6.61 발효시간 대 카라기난 고정 이스트 연속 발효의 비중 및 에탄올 농도

도 6.62 발효시간 대 카라기난 고정 이스트 연속 발효의 탄화수소의 프로파일

도 6.63 발효시간 대 카라기난 고정 연속 발효의 비시날 디케톤 농도

6.5.2 수퍼 부유 응집 이스트 균규의 사용: 자기 응집

LC290 수퍼 부유응집 이스트를 담지한 50ℓ 파이롯트 스케일 바이오리엑터를 사용하는 연속 발효를 3개월간 수행하였다. 이스트 성장을 촉진(3% 산소로 도입되는 분당 1.5ℓ의 총 가스에 상응)시키기 위하여 CO₂살포가스는 ∼2.5mm/초로 공기는 ∼0.4mm/초로 도입하였다. 반응기중의 발효 온도는 전 공정을 통해 ∼15℃를 유지했다. 전력 공급 장해로 3일(약 1700시간 발효) 동안 발효온도를 4℃로 떨어졌다(도 6.64). 이 반응기 냉각은 이스트 대사를 느리게 하고, 전력 장해 동안 이스트 생존율을 유지하기 위하여 수행되었다. 이 예기치 않은 사건은 산업 현장에 일반적일 수 있는 사건에 시스템의 회복을 평가하는 기회를 제공하는 것이었다. 일단 전력이 재개하면, 반응기 온도는 15℃로 다시 맞춰지고, 발효는 다시 30일간 진행딘다.

일단 뱃치 개시 페이스가 완료되면(∼180시간), 시간단 2.16ℓ의 유속으로 맥아즙이 연속적으로 시스템에 공급되어 50ℓ의 반응기 작업 용량 상에 기초로 한 24 시간 거류시간을 제공한다. 초기 뱃치 기간후, 세포 농도는 증가하여 약 750시간에 30억 세포/㎖에 달하여 발효된다(도 6.65). 그런 다음, 이 이스트 덩어리는 1000 시간에 10억 세포/㎖로 감소하고 발효 종료까지 이 수준이 유지된다. 이스트 생존율은 발효 운전기간중 약 90%이다.

에탄올 농도 및 발효 육즙 비중은 유도 정상상태로 도달한 후, 즉시 연속 공급이 개시된다(도 6.66). 에탄올 농도는 약 70 g/ℓ로 올라가고, 액체 비중은 발효 잔류에 ∼2.3^oP이었다. 도 6.67에서 탄화수소 프로파일은 270시간 연속 발효에 슈도 정상상태임을 확인하였다. 폴리사카라이드 농도는 1400시간 발효에 ∼42 g/ℓ에서 ∼33 g/ℓ로 떨어짐을 확인하였다. 이 결과는 맥아즙 뱃치중 편차에 의한 것이다. 라거 이스트는 이들 폴리사카라이드를 소비할 수 없기 때문에, 맥아즙 영양중의 이 이형은 1차 발효 용기의 수행에 현저한 영향을 주지 않았다. 미발효 당 부분중의 상이는 제품이 "thin"체를 갖는 것을 주시하는 훈련된 미각 패널리스트에 의해 검출될 것이다.

경시 변화에 따른 디아세틸 및 2,3-펜탄디온 농도는 도 6.68에 나타냈다. □-카라기난 연속 발효로서, 디아세틸 및 2,3-펜탄디온 수준이 연속 맥아즙 공급이 시작하자마자 올라갔다. 디아세틸은 거의 375 □g/ℓ에 도달한 반면, 2,3-펜탄디온 농도는 거의 600□g/ℓ에 도달하였다. 이들 농도 수준은 ∼1700시간에서 전력이 방해받을 때까지 발효 운전중 계속 유지되었다. 액체는 더 이상의 이스트 대사(영양소 공급 부족으로 인한) 없이 3일간 뱃치에서 정지되므로, 비시널 디케톤의 수준이 감소된다. 맥아즙 공급이 다시 시작하면, 디아세틸 및 2,3-펜탄디온은 그의 슈도정상상태 값으로 돌아간다.

도 6.64 발효시간에 대한 LCC290의 운전 인자

도 6.65 발효시간에 대한 LCC290의 생존율 및 총 이스트 세포농도

도 6.66 발효시간에 대한 LCC290 이스트 연속발효의 비중 및 에탄올 농도

도 6.67 발효시간에 대한 LCC290 이스트 연속발효의 탄화수소의 프로파일

도 6.68 발효시간에 대한 LCC290 연속발효의 비시널 디케톤 농도

6.5.3 배지 부유 응집 이스트의 사용: 자기 응집

50ℓ 파이롯트 스케일 가스 부양 바이오리엑터내에서 고정 메트릭스로서 비지 부유 응집 이스트 균주 LLC3021을 사용하여 몇 개의 발효운전을 수행하였다. 고정의 2종의 종래 모드로서 최초 이스트 농도를 4 g/ℓ로 설정하였다. 이스트를 산업용 라거 맥아즙(섹션 4.2에 기술)에 넣고, 모든 발효 당이 소비되고 디아세틴 수준이 30 □g/ℓ으로 떨어질 때까지 뱃치 발효시켰다. 발효온도를 15℃로 조정하고, 살포 가스율을 LCC290 발효 주준(표면 이산화탄소 가스 속도 ∼2.5mm/초이고, 총 살포가스중 3% 산소중 생성되는 ∼0.4mm/초 공기)으로 조정된다.

초기 뱃치 단계는 이스트 세포를 부유 응집시키고, 따라서 가스 부양 시스템내에서 용이하게 유지된다. 뱃치 개시 종료에서 맥아즙 공급율은 시간당 2.16ℓ로설정되고, 이것은 50ℓ 반응 작업 용량에 의해 ∼24시간의 걸시간에 상응한다. 이스트 번식(도 6.70)은 ㎖당 약 10억개 세포로 증가하고, 1000시간(500 내지 1500시간에 연속 발효 운전)에 걸쳐 동일 수준으로 유지된다. 이스트 번식은 ∼1500시간 발효에서 급격히 2배로 되어 20억 세포/㎖ 수준으로 된다. 이스트 번식중의 이와 같은 변화는 예상하지 못했다. 발효 운전중 이스트 생존율은 약 90%로 유지되었다(도 6.70).

도 6.71은 3개월 연속 운전시의 에탄올 농도 및 발효 육즙 비중에 관한 데이터를 나타낸다. 맷치 개시 직후(180시간), 에탄올 농도는 70 g/ℓ고 되고, 비중은 최소 ∼2.2^oP에 도달하였다. 이 이스트 번식 증가에 관한 가장 논리적 설명은 총 이스트 펍식의 대부분이 성장 페이스로 들어가 이스트 농도를 2배로 생산하는 것이다. 에탄올 농도의 감소는 이스트 농도의 증가와 일치하는 것으로 예상되었으나, 연속 운전동안 에탄올이 70g/ℓ의 슈도 안정 상태 값으로 유지되기 때문에 명백히 그러지 아니하였다. 발효시간에 대한 탄화수소 농도 프로파일(도 6.72)는 에탄올과 비중 커브와 같이 동일한 결론을 나타낸다. 이 운전은 약 250시간에 그의 슈도 안정 상태에 도달하여 연속 발효로 된다.

도 6.73은 연속 발효시간에 대한 디아세틸 및 2,3-펜탄디온 농도를 나타낸다. □-카라기난 겔 및 LCC290 비시널 디케톤 결과와 같이, 다아세틸 및 2,3-펜탄디온 농독 증가하여 뱃치 개시 페이스가 ∼225□g/ℓ 및 400□g/ℓ의 슈도 안정 상태 값에 도달하게 된다.

도 6.69 발효시간에 대한 LCC3021 발효의 운전 인자

도 6.70 발효시간에 대한 LCC3021 이스트의 생존율 및 총 이스트 세포 농도

도 6.71 발효시간에 대한 LCC3021 이스트 연속 발효의 비중 및 에탄올 농도

도 6.72 발효시간에 대한 LCC3021 이스트 연속발효의 탄화수소 프로파일

도 6.73 발효시간에 대한 LCC3021 연속발효의 비시널 디케톤 농도

6.5.4. 여러가지 담체의 비교

6.5.1부터 6.5.3섹션까지에서, 고정화 매트릭스로서 카라기난 겔 비드, LCC290슈퍼 부유응집 이스트 및 LCC3021 배지 부유응집(flocculent) 이스트로 발효를 수행하였다. 상기 3종 담체는 50ℓ 파이롯트 스케일 가스-부양 흡출관 바이오리엑터내에서 연속적인 1차 발효에 적합하였다. 상기 3종 담체에서 모두 24시간 액체 거류시간에 도달했다. LCC3021 배지 부유응집 이스트 및 □-카라기난 고정화 세포 시스템보다 월등히 빠르게 슈도-안정 상태에 도달하는 LCC290 슈퍼 부유응집 이스트를 이용하여 발효가 진행된다. LCC290 발효 개시 후 약 250시간에 70g/ℓ의 최대 에탄올농도에 도달했다. LCC3021은 600시간에 70g/ℓ의 그의 안정상태 에탄올농도에 도달했다. □-카라기난 연속 발효 동안에, 에탄올은 개시 진행이후에 별개의두 지점에서 안정상태가 된다. 먼저, 에탄올은 200시간과 500시간 사이에 45g/ℓ가 되고, 그런다음 약 575시간에 70g/ℓ까지 증가하며, 시험 끝까지 그 농도를 유지했다.

3종 발효 시스템은 ∼10억세포/㎖ 의 최대 유리 이스트 세포 농도에 도달하는 것 같았다. 이스트 농도의 불일치는 □-카라기난 시스템의 에탄올 생산성(LCC290 이스트 시스템보다 낮은 초기 슈도-안정 상태 에탄올 농도)에 악영향을 주었다. 이스트 농도는 시스템마다 다른 시간간격에서 최고치를 나타냈다. LCC290의 경우, 에탄올은 연속 발효 후 500과 1000시간 사이에 최고치가 된 반면, LCC3021 발효은 연속 발효 후 1500과 2000시간 사이에 최대 세포수를 얻었다. □-카라기난 고정화 시스템은 연속 공정 700과 1000시간 사이에 최대 세포 농도에 도달했다. 3종 타입의 고정화 세포 발효-LCC290 슈도 부유응집 이스트, LCC3021 배지 부유응집 이스트 및 □-카라기난 고정화 이스트-에서 디아세틸 및 2,3-펜탄디온 슈도-안정 상태 농도가 달랐다. LCC290 발효의 경우, 디아세틸이 375 □g/ℓ에서 안정된 반면, LCC3021발효에서의 농도는 약 225 □g/ℓ에서 안정상태가 되었다. □-카라기난 발효의 경우에, 디아세틸 농도는 500 □g/ℓ에 도달하고, 연속 개시 중간쯤에 농도가 점차 감소하여 500 시간 타임 프레임에서 약 200 □g/ℓ까지 감소한다. 2,3-펜탄디온 농도는 LCC290 및 LCC3021 발효 동안의 디아세틸 보다 높은 2,3-펜탄디온농도를 가진 상기 3종 운영에서의 디아세틸 농도를 반영했다. □-카라기난 운영은 첫 번째 슈도-안정 상태에서 2,3-펜탄디온 보다 높은 디아세틸 농도로 상이한 패턴을 보였고, 그 이후에 디아세 농도가 2,3-펜탄디온 농도 아래로 떨어졌다.이스트 농도 데이터 및 에탄올 생산 데이터 또한 두 가지 독립된 독특한 슈도-안정 상태가 □-카라기난 발효 동안에 이루어짐을 시사한다.

상이한 발효 시스템을 비교하고, 어느 시스템이 더 잘 수행했는지를 평가하는 일은 시스템의 장점을 한 가지 이상의 척도에 기초할 경우 복잡해 질 수 있다. 예를 들면, 총괄적인 에탄올 생산성만을 성공 측정으로 사용했다면, 24 시간 거류 타임에 걸쳐 리액터 부피의 50L 당 70g/ℓ 에탄올 생산성은 모든 경우에 도달하므로, 상기 테스트된 3종 시스템은 상당히 동일하게 평가될 것이다.

상업적 맥주 생산은 간단한 에탄올 생산 이상을 요망한다. 제안된 발효 시스템은 담체 시스템이 제공하는 유연성 뿐 아니라, 수용가능한 맥주를 생산하는 능력(무엇보다 에탄올 생산성 및 디아세틸 농도), 담체의 잠정전 이득 비용, 담체의 유용성, 시스템 공정의 용이함, 담체 처리 등의 환경적 문제 및 담체의 안정성 측면을 평가해야 한다. 다양한 측면의 시나리오를 평가하기 위해, 상업계는 소위"균형 채점표"(Kaplan and Norton, 1996)라 불리는 크기없는 분석법을 이용한다. 첫 단계는 해당 시스템이 평가되어야 할 기준 동정을 포함하다. 그런 다음 각각의 기준에 따라 스케일 1부터 5까지로 평가된다. 1은 최하의 선호도를, 5는 최고선호도를 나타낸다. 분석결말에, 각각의 옵션에 대한 점수가 합산되고, 최고 점수를 얻은 대안은 주어진 환경에서 최선의 선택이다.

표 6.2는 발효용 50ℓ 파이롯트 스케일 가스-부양 흡출관 바이오리엑터에서 사용하기 위한 잠정전 대안으로 여겨지는 고정화 담체상에서 수행된 균형 채점표의 결과를 나타낸다. 총 6담체-치토펄(Chitopearl(상표명)) 치토산 비드,세포라이트(Celite(상표명))규조토 비드, 시런(Siran(상표명)) 글래스 비드, □-카라기난 겔 비드, 배지 부유 응집 LCC3021 이스트 및 슈퍼 부유응집 LCC290이스트-를 상업용 맥주 생산이란 1차 목표에 대하여 평가했다. 각각의 담체 시스템은 전술한 스케일을 사용하여 평가하였다. 전반적으로, LCC290 슈퍼 부유응집 이스트가 수치가 가장 높았고, 그 다음은 배지 부유응집 이스트, LCC3021이었다. 나머지 4개의 담체는 16과 20사이의 점수를 받았다. 상업용 음료는 파이롯트 단위로 생산되기 때문에, □-카라기난 시스템은 세 번째로 선택되었다. 이러한 담체 평가는 연속적인 발효 시스템 개발에 대한 향후 초점은 고정화된 양식으로서 자가-응집으로 맞춰져야 한다. 대안등에 의해 제공되는 유용성(쉽게 이용할 수 있는), 비용(공정하는데 추가 비용이 소요되지 않으므로 낮은 비용), 공정의 용이함(현존하는 공장 공정에 맞춤)은 검토된 시스템상의 이스트 플록의 잠정전 불안정성을 능가한다. 발효가 진행되는 동안에 자가 응집의 전단 민감도(shear sensitivity)를 이용하여 플록 사이즈를 조절하여, 부피 이동을 증가시켜 바이오리액터 부피 생산성을 그 이상으로 증가시키는 것이 가능할 것이다.

표 6.2 가스부양 바이오리액터 시스템내에서 맥주의 1차 발효용 고정화 담체의 비교

	Chitopearl	Celite	Siran	카라기난	LCC3021	LCC290
맥주원가유용성실시의 용이성처리/환경성안정성유연성계	321344320	135131317	115141316	432323118	555432226	455533530

6.6 가스 부양 드래프트 튜브 기법을 이용한 북미 타입의 라거 맥주 제조

상쾌한 맛의 북미(NA)타입 라거 맥주의 제조는 양조자에게 많은 문제를 제시했다. NA타입 라거 맥주는 연한 색과 덜한 쓴맛, 적은양의 잔여당(thin), 자극적이지 않은 향으로 상대적으로 뒷맛이 없는 맛 개요로 특징지어진다. 이러한 고유 특성 때문에, 양조자는 거의 맛의 결점을 감출 수가 없다. 유황이 없는 노트(탄 고무, 냄새나는 썩은 달걀, 요리된 야채)뿐 아니라, 높은 농도의 디아세틸(버터같은), 아세트알데히드(푸른 사과)가 현대 양조자를 괴롭히는 가장 흔한 향과 맛의 문제이다. 비록 발효 배지의 세균 감염 또한 이러한 맥주의 향과 맛을 떨어뜨리는 요소이긴 하지만, 발효 공정의 부적절한 제어가 더 자주 예상한 것 보다 더 많이 맛과 향을 떨어뜨린다.

해당 논제의 일부분으로서 행해진 연속 발효하는 동안 내내, 맥아즙 및 발효 용기상의 오염을 무균 기법을 꾸준히 실행하여 통제하였다. 몇 달 동안 지속된 세 가지 담체 타입의 해당 발효는 탐지할 수 없을 정도의 오염(4장에서 보고된 방법에 의해 모니터된)을 나타냈다. 소정의 디아세틸 (30 □g/ℓ 이하의 타겟) 및 아세트알데히드 농도(10mg/ℓ 이하의 타겟) 이상은 1차 연속 발효에서 산출된 생산물에이롭지 않지만 이런 정도는 세균감염 때문이 아니다. 상기 발견은 문헌(Pajunen et al., 2000; Kronlof et al., 2000)에 보고된 것과 상이하지 않다. Belgian 양조자는 연속 발효 공정에서 생산된 맥주의 높은 농도의 아세트알데히드를 판매 정도로 바꾸고 생산물을 사과향의 에일 맥주(Andries et al., 1996b)로 판매했다.

1차 발효로 생긴 높은 농도의 디아세틸은 또한 양조 산업에서 표준이다. 일부 양조자들은 1차 발효 완료후 디아세틸의 감소를 돕기 위해 소위"temperature free rise"라 불리는 방법을 사용해왔다. 다른 양조자들은 숙성하는 동안 더 오랜 시간동안 산물을 방치하여 비시널(vicinal) 디케톤(디아세틸과 2,3-펜탄디온)을 감소시켰다. 또 하나의 접근으로, 수명의 연구단은 높은 농도의 디아세틸을 처리하기 위해 2장에서 논의된 빠른 숙성기법을 개발했다. 이러한 접근은 매우 효과적이긴 하지만, 전반적인 양조 공정에 또 다른 수준의 복잡성을 추가하여 일부가 수용하기엔 어려움이 따를 것이다.

빠른 숙성 공정의 경제성은 꽤 명료하나, 양조업의 연속 공정 초기에는 전통적인 뱃치 발효에서 연속 생산으로의 전이를 촉진하기 위해서 기술의 복잡성을 최소화하는 것이 바람직하다. 이런 이유로, 마무리된 맥주의 높은 농도의 디아세틸을 조절하기 위해서 50ℓ 파이롯트 스케일 가스 부양 시스템내의 1차 연속 발효 이후에 배츠 방치를 이용하는 것을 연구하기로 결정하였다. 이러한 추가 처리 공정은 상기 Ph.D. 프로그램초기에는 예견되지 않지만, 연속적으로 생산된 맥주와 뱃치 콘트롤 맥주를 비교하기 위해서 그러한 측정을 하는 것이 필요하다.

6.6.1 1차적인 연속 발효 이후에 뱃치 저장의 사용

1차 발효 완료를 결정하는 중요한 매개변수는 마지막 발효액의 디아세틸 농도이다. 디아세틸 전구체인 □-아세토락테이트의 디아세틸로의 전환은 디아세틸 경로(도 3.5)에서 비율-제한적인 단계이다. 이러한 첫 번째 반응은 사실상 화학적이고, 온도에 상당히 의존적이다. □-아세토락테이트에서 디아세틸로의 화학적 변화가 일어나기 전에 "green" 맥주가 냉숙성 공정을 거치는 경우, 확장된 냉숙성 기간이 전구체의 느린 전환이 일어나도록 하기 위해 이용되지 않는다면, 결국 맥주는 20 □g/ℓ의 미각역이상의 디아세틸 농도를 가지게 될 것이다. 섹션 6.5에서 서술한 세 가지 연속 발효에서, 리액터를 빠져나가는 디아세틸의 농도는 희석되지 않은 맥주에서 소정의 타겟 수치인 30 □g/ℓ이상이었다. 이스트를 제거하기 위해 이 단계에서 발효액을 여과시킨다면, 디아세틸은 많이 남아있을 것이고, 따라서 수용 가능한 한계이하로 디아세틸을 줄이기 위해 웜 뱃치기간(warm batch period)을 채택했다.

연속 발효된 맥주를 모아 40ℓ 스테인레스강 맥주 용기에 넣어 21℃에서 방치하였다. 발효액에서 소량의 시료(100㎖)를 정기적으로 채취하여, 디아세틸, 에탄올, 특이적 중량(specific gravity), 에스테르 및 퓨젤 알코올을 분석하였다. 도 6.74는 고정화 매트릭스로서 LCC290 이스트로 연속 발효된 맥주 한 뱃치당 웜 저장 타임에 대한 디아세틸의 감소를 나타낸다. 월 저장 기간은 ∼600 □g/ℓ에서 30 □g/ℓ이하로 디아세틸 농도를 줄이는데 효과적이었다. 이는 양조업에서 "pre-drop"한계로 간주된다.

또 다른 테스트에서, 저장 기간동안에 디아세틸의 감소에 대한 숙성의 효과가 연구되었다. 이산화탄소 살포 가스(0.14 m³/h)를 1.27cm 스테인레스강관을 통해 맥주 수집 용기에 주입하여 액이 방치기간동안에 숙성된 채 유지되도록 하였다. 도 6.75는 상기실험의 결과를 나타낸다. 이산화탄소 살포로 주어진 숙성은 두 번째 저장 탱트에있는 디아세틸의 감소율에는 거의 영향을 주지 않는 것 같다. 이러한 결과는 이산화탄소 혼합 가스에 의한 부적절한 혼합을 지시하여, 첫 번째 화학반응(□-아세토락테이트의 디아세틸로의 전환)의 반응률을 증가시키거나 두 번째 화학반응(이스트에 의한 디아세틸의 아세토인으로 전환)이 더 빠르게 일어나도록 부피 이전을 증가시키지 않는다. 또한 일단 비율-제한적 화학변환(첫번째 단계)이 일어나면, 미숙성된 용기는 부유한 세포가 충분하여 디아세틸을 향이 있는 불활성 아세토인으로 더 많이 감소시키는 것이 가능할 것이다.

1차적인 연속발효 이후에 이러한 웜 뱃치 저장의 에스테르와 퓨젤 알코올의 농도 및 에탄올 농도, 액의 특이적 중력상의 효과를 도 6.76 및 6.77에 각각 도시하였다. 해당 결과로부터, 웜 저장 기간은 아세트알데히드, 에틸아세테이트, 프로판올, 이소부탄올, 이소아밀 알코올 및 이소아밀 아세테이트 농도에는 거의 효과가 없는 것으로 보인다. (도 6.76) 저장 용기내의 액의 특정 중력이 저장 기간의 처음 12시간후에 2.7。P에서 2.0。P로 감소하였고, 그런다음 이러한 상태가 유지되었다. 에탄올 농도는 65시간 테스트 기간내내 70 mg/ℓ를 유지하였다. 상기 결과는 저장 기간은 주로 디아세틸 및 2-3,-펜탄디온 농도에 영향을 주는 반면에 에스테르, 퓨젤 알코올 및 에탄올에 대한 영향은 극소임을 시사하였다.

도 6.74. 가스 부양 시스템내의 LCC290 이스트로 1차적인 연속 발효 후에 웜 뱃치 저장에 대한 비시널 디케톤농도

도 6.75. 가스 부양 시스템내의 LCC290 이스트로 1차적인 연속 발효 후에 웜 뱃치 저장에 대한 디아세틸농도. 하나의 시료는 이산화탄소를 살포함으로써 교반된반면, 다른 시료는 그대로 남아있다.

도 6.76. 가스 부양 시스템내의 LCC290 이스트로 1차적인 연속 발효 후에 웜 뱃치 저장에 대한 에스테르 및 퓨젤 알코올 농도

도 6.77. 가스 부양 시스템내의 LCC290 이스트로 1차적인 연속 발효 후에 온(warm) 뱃치 저장에 대한 에탄올 농도 및 특정 중력

LCC290 슈퍼 부유응집 이스트, LCC3021 배지 부유응집 이스트 또는 □-카라기난 고정화 이스트를 사용하여 50ℓ 가스부양 바이오리액터에서 연속적인 발효로 제조된 액체상에서 뱃치 저장 과정을 수행하였다. 이러한 3종 테스트 운영의 디아세틸 감소 개요는 도6.78에 도시되어있다. 3종 경우 모두에서 디아세틸은 30 □g/ℓ의 타겟 수치까지 성공적으로 줄었다. 그러나 상기 감소에 도달하기까지 필요한 시간은 세 경우가 달랐다. LCC290에서는, 600 □g/ℓ에서 30 □g/ℓ까지의 감소가 대략 48시간 후에 이루어진 반면, LCC3021 발효 및 □-카라기난 발효는 상기 타겟 수치에 도달하는데 ∼24 시간과 ∼40시간만이 소요되었다. 이러한 차이는 디아세틸의 초기 개시량과 연관되지만, 이용된 고정 매트릭스 타입과는 무관함을 시사했다.

도 6.79는 LCC3021 및 □-카라기난 발효의 결과상에서 수행된 타임 조절에 대한 도 6.78의 결과와 동일한 디아세틸을 나타낸다. 후자의 두 발효의 최초 디아세틸 감소 곡선이 이동하여 그의 초기값이 LCC290 슈퍼 부유응집 이스트에 의해 생성된 디아세틸 감소 곡선에 일치한다. 이러한 변형으로, 세 가지 시스템에 대한 디아세틸 감소 개요는 동일선에 일치하는 것으로 보였다. TableCurve2D 소프트웨어를 이용하여, 상기 결과 첫 번째 역학적 방정식(Levenspiel, 1972)에 맞도록 굽었다.(도 6.80). 도 6.79의 조절된 실험 데이터가 0.96의 상관계수를 가진 하기방정식에 맞도록 계산되었다.:

[디아세틸]=648.54 e^{(-0.0426 t)}(6.1)

상기 결과는 3종 고정 시스템이 동일한 디아세틸 감소 잠재력을 나타낸다는 이론을 강도 있게 지지한다. 해당 결과는 디아세틸 감소가 빈번하게 이스트 균주와 연결되므로 놀라운 일은 아니다(Nakatani et al., 1984). □-카라기난 시스템은 그의 겔 구조에 LCC3021 이스트를 고정했고, LCC290 이스트는 LCC3021 균주의 선택변종이다.

일단 디아세틸 농도가 30 □g/ℓ의 타겟 농도이하가 되면, 최종 산물 처리(여과, 희석, 탄화 및 포장)를 하기 전에 결과적으로 나온 맥주를 7일 동안 저온 저장(2℃)으로 숙성시켰다. 표 6.3은 고정화 매트릭스로서 LCC290 이스트, LCC3021 이스트 또는 k-카라기난 고정화 이스트로 50ℓ 파일롯트 스케일 시스템에서 제조된 맥주를 분석한 것이다. 도 6.81은 연속 제조된 세 가지 맥주와 뱃치에서 산업적으로 제조된 하나의 대조군 맥주의 에스테르와 퓨젤 알코올의 레이더 그래프이다. 산업적으로 제조된 뱃치액(대조군)과 비교할 때, 연속액은 더 적은 에스테르(에틸아세테이트, 이소아밀 아세테이트), 더 많은 프로판올 및 더 적은 이소부탄올, 1차 아밀 알코올 및 이소아밀 알코올을 가졌다. 연속 발효 산물의 아세트알데히드 농도는 대조액보다 더 높았다. 거품이 나는 단계, 초기 냉연기, 온연기, 디메틸술폭시드, 아황산 가스, 이산화탄소 및 공기는 타겟 범위안에 속해있다.

도 6.78. 가스 부양 시스템내의 LCC290 이스트, LCC3021 이스트 및 카라기난 겔 고정화 이스트로 1차적인 연속 발효 후에 온 뱃치 저장에 대한 디아세틸 농도

도 6.79. 가스 부양 시스템내의 LCC290 이스트, LCC3021 이스트 및 카라기난겔 고정화 이스트로 1차적인 연속 발효 후에 온 뱃치 저장에 대한 디아세틸 농도. LCC3021 발효 및 카라기난 발효에 대한 평가는 LCC290 발효와 동일한 개시점을 갖기 위해 시간상으로 조정되었다.

도 6.80. 가스 부양 시스템내의 LCC290 이스트, LCC3021 이스트 및 카라기난 겔 고정화 이스트로 1차적인 연속 발효 후에 온 뱃치 저장에 대한 디아세틸 농도. LCC3021 발효 및 카라기난 발효에 대한 평가는 LCC290 발효와 동일한 개시점을 갖기 위해 시간상으로 조정되었다.

초기 에탄올 농도에서 최종 5.0% v/v 로 산물을 희석함에 따라 직접적으로 영향을 받는 수개의 다른 파라미터(명백한 추출액, 추출원액, 계산된 추출원액, 색깔, 쓴맛)는 대조군과 상이하다. 이는 연속 산물은 더 높은 초기 에탄올 농도(뱃치에서 60g/ℓ에 비해 70 g/ℓ) 때문에 소정의 에탄올 농도에 도달하기 위해서 물로더 많이 희석해야한다. 도 6.82는 상술된 동일한 액의 알코올, 디아세틸, pH, 색깔 및 쓴맛에 대한 레이더 그래프이다. 알코올농도, 디아세틸 및 pH는 타겟 범위안에 속하는 반면, 색깔과 쓴맛은 범위에서 벗어난다. 더 옅은 색깔은 연속 액이 거친 더 많이 희석하였기 때문이고 이는 맥아즙내의 색깔을 증가시켜 조절할 수 있다. 쓴맛의 평가 또한 상기 희석 장애를 거치고 또한 맥아즙으로 조절할 것이다.

표 6.3 가스 부양 시스템을 이용하여 제조한 맥주에 대한 분석 요약

설명	산업상뱃치 발효된액체	LCC290으로연속 발효된액체	LCC3021으로연속 발효된액체	카라기난으로연속 발효된액체
공기(㎖)이산화탄소(%)이산화황(mg/ℓ)디메틸 황화물(□g/ℓ)쓴 맛(BU)색(SRM)pH디아세틸(□g/ℓ)알코올(%v/v)알코올(%w/w)표본 증류(oP)실제 증류(oP)원 증류 계산(oP)웜 헤이즈(FTU)초기 냉각 헤이즈(FTU)거품(s)아세트알데히드(mg/ℓ)프로파놀(mg/ℓ)에틸아세테이트(mg/ℓ)이소부탄올(mg/ℓ)초기 아밀 알코올(mg/ℓ)이소아밀 알코올(mg/ℓ)이소아밀 아세테이트(mg/ℓ)	<12.75<10<7012.003.204.10<205.003.931.553.3611.0<200<100>1704.4±1.312.8±6.832.4±4.321.6±3.420.0±2.360.9±8.62.5±0.7	0.42.9005911.302.204.15124.993.931.022.8410.5454316710.057.611.010.615.248.00.32	0.352.8103013.742.104.10125.033.961.403.2411.0505118721.951.710.68.39.440.90.25	0.352.7303013.82.304.0995.043.961.443.2711.0475417511.684.38.78.96.446.50.18

도 6.81. LCC290 이스트, LCC3021 이스트 또는 카라기난 겔 비드에 고정된 LCC3021 이스트를 이용한 가스 부양 시스템에서 연속 발효된 맥주의 레이더 그래프. 마무리된 맥주의 에스테르 및 퓨젤 알코올이 그래프상에 나타나있다. 전 산물은 1차 발효 단계를 거친 후 온 뱃치 저장 되어진다.

도 6.82 LCC290 이스트, LCC3021 이스트 또는 카라기난 겔 비드에 고정된 LCC3021 이스트를 이용한 가스 부양 시스템에서 연속 발효된 맥주의 레이더 그래프. 전 산물은 1차 발효 단계를 거친 후 온 뱃치 저장되어진다.

6.6.2 최선의 살포 가스 선택

이산화탄소는 이스트 발효의 자연적 부산물이므로 대부분의 양조자들이 쉽게 이용할 수 있다. 양조자는 방출된 이산화탄소를 모아 수집증기(일반적으로 황색 화합물)에 옮겨질 미세한 불순물을 제거하기 위해 가스 증기를 세척한다. 이렇게 정화된 증기는 그런 다음 압축되고, 향후 이용하기 위해 양조장에 액체로 저장한다. 연속 발효에서 살포가스로서 이산화탄소를 이용하는 것은 공정의 관점에서 볼 때합리적인 선택이다. 제조 공장은 수집 시스템을 이용하고, 발효조의 이산화탄소 유출을 복구할 수 있다. 다른 가스를 사용하는 것은 현존하는 공장 공정의 또 다른 복잡성만을 증가시킬 뿐이다.

그러나, 현존하는 뱃치 공정에 실용적인 대안이 되기 위한 연속 발효를 위해서 현존하는 브랜드와 밀접하게 맷치(match)하는 산물을 생산하는 것이 요망된다. 연속 발효 동안에 이스트가 받는 생물학적/생화학적 영향은 최소화시킴으로써, 상기 산물 맷치에 도달하는 것이 가능할 것이다. 이산화탄소는 1차 발효과정에서 이스트 대사에 악영향을 끼치는 것으로 공지 되어있다. 이러한 효과는 시스템에서 나온 헤드 압력이 액체 배지에서 배출된 이산화탄소의 자유로운 방출을 저지하는 높은 실린드로코니컬(cylindroconical) 용기에서 증대된다. 이러한 조건에서는 적은 에스테르와 많은 퓨젤 알코올을 가진 맥주가 제조되는 경향이 있다. 주기적으로 실린드로코니컬 용기 바닥에 보조 가스 증기를 주입하여 발효에서 약간의 이산화탄소를 제거하기 위한 시도가 성공적으로 이루어졌다. 이산화탄소 억제 효과는 더 적은 퓨젤 알코올과 더 많은 에스테르 농도를 포함하는 결과물에서는 더 줄어드는 것으로 보였다. 이러한 지식을 확립하기 위해, 가스 부양 시스템내에 살포가스로 이산화탄소 대신 질소가스를 투입하였다. 50ℓ 부양 리액터에서 발효된 수 개의 액체를 모아 하기 단계를 이용하여 라바트 실험 양조장에서 처리되었다. 상기 액체는 그런다음 48-시간 실온(21℃) 저장 기간을 두어, 디아세틸과 아세트알데히드가 라바트 조건(30 □g/ℓ 미만의 디아세틸과 10mg/ℓ 미만의 아세트알데히드)에 도달하게 하였다. 상기 액체는 그런 다음 7시간 동안 저온 숙성되었고, 그런 다음 표준적인 산업적 실행을 통해 처리하였다.

표 6.4 에서는 CO₂와 N₂가 살포된 시스템에서 LCC290 이스트로 연속 발효하여 획득한 마무리된 맥주의 결과물과 상업상 제조된 표준 액체(대조군)을 비교하였다. 액체에 1-프로판올은 2배가 더 많은 반면, 디메틸술파이드 농도는 대략 3배정도 더 낮았다. 색깔과 쓴맛에 대한 수치는 NIBEM 테스트로 측정한 바와 같이 거품 가능성이 그러한 것과 같이 상업용 액체보다 더 높은 것으로 보였다. CO₂가 살포된 맥주는 에스테르(에틸아세테이트, 이소아밀 아세테이트)가 더 적었고, 1-프로판올은 질소가 살포된 액체가 그런 것보다 더 많았다. 에스테르(에틸아세테이트, 이소아밀 아세테이트, 에틸헥사노에이트, 에틸악터노에이트, 에틸데카노에이트)와 퓨젤 알코올(1-프로판올, 이소부탄올, 이소아밀 알코올)의 비율은 대조 액체, 질소가 살포된 액체와 이산화탄소가 살포된 액체에 대해 계산되었고, 각각 0.30, 0.27, 0.15로 나왔다.

표 6.4 LCC290 슈퍼 부유응집 이스트로 개시된 가스 부양 시스템을 이용하여 연속으로 발효된 수 개의 생산물에 대한 화학적 분석의 요약

분석	산업용뱃치 발효된액체	LCC290으로연속 발효된액체	LCC3021으로연속 발효된액체
아세트알데히드(mg/ℓ)에틸아세테이트(mg/ℓ)1-프로페놀(mg/ℓ)이소부탄올(mg/ℓ)이소아밀 아세테이트(mg/ℓ)이소아밀 알코올(mg/ℓ)에틸 헥사노에이트(mg/ℓ)에틸 옥타노에이트(mg/ℓ)에틸 데카노에이트(mg/ℓ)디아세틸((□g/ℓ)2,3-펜탄디온(□g/ℓ)이산화황(mg/ℓ)다이메틸 황화물(mg/ℓ)쓴 맛(BU)색(SRM)거품(s)FAN((mg/ℓ)pHRE(oP)COE(oP)알코올(%v/v)	2.5328.0813.0317.152.5774.540.1400.1100.0079641.37911.53.11764.133.3810.974.93	3.6830.9028.4517.892.0678.450.1800.2800.06309512420.64.1210921.104.0812.775.74	4.8014.1440.037.010.6951.350.0740.0590.0081101406415.53.7195844.193.60111.505.17

도 6.83은 3종 액체에 대한 에스테르, 퓨젤 알코올 및 아세트알데히드 농도를 도시한 레이더 그래프이다. 질소가 살포된 액체의 프로파일은 더 높은 프로판올 농도를 제외하고는 대조 맥주 프로파일 다음이다. CO₂가 살포된 발효는 대조군과 일치하지 않는 훨씬 더 적은 에스테르와 퓨젤 알코올을 나타냈다. 연속 발효 두 액체에서, 디아세틸과 아세트알데히드 농도는 라바트 조건 이하였다.

상기 발견은 질소 살포가 상업용 맥주의 농도와 유사한 농도로 에스테르 생산을 증가시킨 반면, 이산화탄소 살포는 상대적으로 낮은 에스테르 농도를 가진 액체를 생산해냈음을 시사했다. 이러한 결과는 이산화탄소가 살포된 환경에서 이스트 대사에 변화가 생김을 암시한다. 살포 가스와는 상관없이, 프로판올 농도는 상업적으로 발효된 대조 맥주에서 측정된 것보다 연속 발효된 맥주에서 훨씬 더 높았다. 프로판올 농도가 100 mg/ℓ의 미각 역치보다 훨씬 낫지만, 상기 언급한 차이는 뱃치 발효와 비교할 때, 연속 발효에서 발생하는 미세하게 변화된 대사의 지표가 될 것이다. 더 높은 프로판올 농도는 아미노산 트레오닌의 연속 공급에 기인하며, 옥소산(oxo-acid) 분해 경로를 통해 아미모산 트레오닌은 프로판올을 산출하는 것 또한 가능하다.

도 6.83. 질소 및 이산화탄소가 살포된 연속 가스 부양 발효액과 상업적으로 제조된 액체의 에스테르와 퓨젤 알코올을 비교한 레이더 그래프.

7장. 결론

이러한 논제로 수행된 연구로부터 하기 결론을 얻을 수 있다. 1차 연속 발효조로 50ℓ 파이롯트 스케일 가스 부양 흡출관 바이오리액터를 이용하여 디에세틸농도를 맞추기 위해 이틀동안 뱃치 저장하여 주된 향과 맛 결함이 없는 식음 가능한 맥주를 제조할 수 있다. 24시간의 최소 거류 시간 및 하루당 1 리액터 부피 회전이 마지막 발효 배양액안으로 높은 중력 맥아즙(17.5。P)의 발효로 가능하다. 슈퍼 부유응집 이스트 LCC290, 배지 부유응집 이스트 LCC3021 및 □-카라기난 고정화 이스트의 사용은 모두 가스 부양 시스템에서 실행 가능한 담체들이다. 시런(Siran(상표명)) 글래스 비드, 세포라이트(Celite(상표명))규조토 비드 등의 더 무거운 사전 성형된 담체의 사용은 가스 부양 흡출관 시스템에서는 실용적인 대안이 되지 못한다. □-카라기난 겔 비드의 경우 최소 2개월의 연속 공정과 LCC290, LCC3021 발효에서 최소 3개월의 연속 공정은 어떠한 세균 감염이나 리액터 수행 불안정 없이 가능하다. 또한, 연속 시스템은 확장된 운영 기간동안 상업적 맥아즙 공급에서 잠정적이고 가정된 변화를 다룰 수 있다.

살포 가스로 질소를 가진 슈퍼 부유응집 이스트LCC290DFM 이용한 연속 발효 후 2일간의 뱃치 저장한 발효는 상업적 대조 맥주와 가장 가까운 향과 맛을 냈다. 1차 연속 발효조의 방출액에 높은 디아세틸 농도를 처리하기 위해 고안된 2일간의 뱃치 저장은 최적은 아니지만 효과적인 대조 메커니즘이다. 세 가지 테스트된 연속 발효 시스템의 디아세틸 감소능은 매우 유사하고, 일전에 짐작한 바와 같이 이러한 특성은 균주 타입에 기인할 수 있다. 뱃치 저장 기간은 저장 단계에서 맥주의 에스테르 및 퓨젤 알코올 농도에 영향을 미치지 않는다.

살포 가스의 3% 산소를 이용하는 것은 맥아즙의 적절한 산소 영양소 농도를 제공하여, 식음 가능한 향과 맛 개요를 가진 맥주를 생산하면서, 발효 운영동안에 실용적인 이스트 집단(90%이상)을 유지할 수 있다. 고정화 매트릭스로서 LCC290 이스트 및 LCC3021이스트를 이용한 연속 발효는 □-카라기난 겔 비드 시스템보다 월등히 빨리 슈도 안정 상태에 도달했다. 아마도 고정화 이스트 집단의 증가로 발생하는 □-카라기난 고정화 발효의 불안정성은 타겟 농도 이하의 산물 발효를 초래한다. 소정의 연속 제조를 위해서, 이러한 현상은 연장된 개시가 반응하고 하기의 엄청난 실패를 재개하기 위해 필요한 시간을 증가시키는 것처럼 매우 바람직하지 못하다. 더욱 연장된 개시 단계는 또한 흥미롭기 위해서는 더욱 연장된 연속 운영 단계를 요망한다.

연속 겔 비드 제조법은 파이롯트 스케일 유닛 내면을 테스트하기 위한 소정량의 비드를 생산했다. 그러나 더욱 엄격한 사이즈 분배로 비드를 생산하기 위해서는 비드 제조법을 더욱 최적화할 필요가 있다. 아울러, 상기 과정은 산업적 스케일에 적합하게 하기 위해서 더 많은 연구가 필요하다. 이러한 연구에서 조사된 Kenics 타입보다는 오히려 정전인 혼합기 숫자뿐 아니라 직경을 증가시켜 스케일을 늘릴 수 있는 새로운 타입의 고정 혼합기가 상기 선택이 실용적이 되기 위해 발견되고, 테스트되어야 한다. 상기 열거에서 이용된 산 펄스 추적자법으로 LCC290 슈퍼 부유응집 이스트, LCC3021 배지 부유 응집 이스트 및 □-카라기난 고정화 이스트를 포함한 발효과정에서 50ℓ 파이롯트 스케일 바이오리액터내의 혼합시간과 혼합률을 측정하였다. 혼합 자료는 혼합 시간과 혼합률을 계산하여 산출된 감소하는 사인 곡선 함수에 상응하였다.

상기 세 가지 타입의 고정화 담체에 대해 200초 이하에서 계산된 혼합시간에 따라 가스 부양 흡출관 시스템내에서 신속한 혼합이 이루어졌다. 혼합시간은 세 가지 테스트된 시나리오에서 피상적 가스 속도가 증가함에 따라 약간 감소하였다. 테스트된 모든 표면 가스 속도(2mm/s에서 6mm/s)에서, LCC290시스템이 가장 빠른 혼합시간을 나타냈다(100초 와 120초 사이). 액체 순환시간은 표면 가스 속도와는 무관하게 세 가지 담체 타입에서 매우 유사했다. 액체 순환시간은 또한 가스 속도의 상응하는 감소에 따라 선형으로 감소했다. 완성된 액체 혼합(펄스에 대한 98%반응)은 테스트된 모든 고정화 담체의 경우에 3-6 리액터 순환 주기내에서 일어났다. 상기 결과는 테스트된 50ℓ 파일롯 스케일 시스템은 연속 발효에 적절한 혼합을 제공한다는 것을 입증한다. 불충분한 혼합시간은 맥주 발효에 바람직하지 않은 가능한 데드존(dead zone)을 나타냈다.

이러한 Ph.D. 연구작업은 라바트 실험 양조장에서 디자인되고, 설립되고, 공정된 제조시스템의 향후 스케일 상승을 수행할 가능성을 명백하게 입증하였다. LCC290 슈퍼 부가응집 이스트와 살포가스로서 질소를 가지는 가스-부양 흡출관 바이오리액터를 이용하고, 이틀동안 21℃에서 배치 저장하는 것은 시스템 선택에 바람직하다.

발명의 상세한 설명-파트 2

4장. 실험재료 및 실험 방법

4.1 이스트 균주 및 특성

Saccharomyces cerevisiae보다 더 큰 양조용 균주인 라바트 배양 컬렉션(LCC)3021은 상기 연구과정동안 사용된다.Saccharomyces cerevisiae는Saccharomyces uvarumBeijerinnck var.carlsbergensisKudryavtsev, 1960(Kurtzman, 1998)와 동의어이다. 37℃에서는 LCC3021가 성장하지 않을 것이다. 이는 37℃이상의 온도에서 성장하는 대부분의 에일 이스트보다 더 큰 이스트인 LCC3021을 구별하기 용이하게 한다. LCC3021은 대부분의 더 큰 이스트가 예외는 있지만, 그러한 것처럼 바닥에서 발효하는 균주이다. 물론 해당 균주는 녹말이 아닌 글루코오즈, 갈락토오즈, 슈크로오즈, 말토오즈, 라피노오즈 및 멜리비오스를 발효시킬 것이다. 멜리비오스 발효능은 에일 이스트와 구별하기 위해 분류학자가 사용한 하나의 수단이다.

대부분의 양조 균주와 마찬가지로, LCC3021은 배수체이고 유사분열로 생식한다. 표준 양조 조건에서는 큰 균주는 감수분열로 생식하지 않는다. 이는 유전물질의 교배 가능성이 적기 때문에 양조용 균주를 유전적으로 안정하게 만드는 이점이 있다. (Kreger-van Rij, 1984).

4.2 이스트 접종 준비

-80℃의 냉동실에 극저온 저장되어있는 바이얼(vial)에서 꺼내 펩톤 이스트 추출 영양분(PYN)한천(펩톤, 3.5g/ℓ; 이스트 추출액, 3.0 g/ℓ; KH₂PO₄, 2.0 g/ℓ; MgSO₄·7H₂O, 1.0 g/ℓ; (NH₄)₂SO₄, 1.0g/ℓ; 글루코즈, 20.0 g/ℓ; 한천, 1차 증류수로 20.0 g/ℓ) 성장배지에 스트리킹하여 잘 분리된 콜로니를 얻는다. 성장하고 있는 이스트의 3-4일된 올드 플레이트에서 수 개의 콜로리를 멸균 루프로 채취한 후, 콜로니를 시험관에 있는 10 ㎖ 부피의 맥아즙에 접종하였다. 이를 21℃에서 밤새 키우고(오버나이트 배양), 그런다음 이스트 바이오매스를 증가시키기 위해 더 큰 부피의 맥아즙, 보통 200 ㎖에 첨가하였다. 소정량의 이스트 바이오매스를 증식시킬 때까지 연속적으로, 상기 혼합물을 또 다른 더 큰 부피의 맥아즙에 첨가하였다. 통상적으로 맥아즙 리터당 대략 20g의 더 큰 이스트를 생산하는 것이 요망된다. 이스트 접종을 준비하기 위해서 배양액을 4℃에서 1.0×10⁴rpm(반경=0.06 m)으로 10분간 원심분리했다. 원심분리후, 액체를 버리고 이스트의 적절한 웨트 중량을 펠렛(pellet) 으로부터 얻는다.

4.3 맥아즙 발효배지

캐나다의 라바트 브루위즈가 17.5。P의 특정 중력을 가진 양조용 맥아즙을 공급했다. 상기 발효에 사용된 양조자의 맥아즙에 들어있는 발효가능한 탄수화물, 특정 중력 및 유리 아미노 질소의 농도가 부록 A 2.1에 나타나 있다. 맥아즙 성분의 추가 세부사항은 Dale et al., 1986, Hoekstra, 1975, Hough et al., 1982, Klopper, 1974 및 Taylor, 1989에 의해 제공되어진다.

뱃치 발효:고정화 세포 비드 또는 자유롭게 부유하는 이스트에 접종하기 전에 맥아즙을 100℃에서 45분간 가압멸균하고, 식힌다.

연속 발효:연속 발효에 사용되는 맥아즙은 가스 부양 바이오리액터에 공급하기 전에 저온살균된 플래쉬(Fisher Plate Heat Exchanger, combi-flow Type Eurocal 5FH)였고, 해당 맥아즙은 섹션 4.6에서 전술된 바와 같이, 세균 오염을 막기위해 정기적으로 모니터되었다. 맥아즙에 오염이 감지되면, 즉시 버리고, 새로운 맥아즙을 제조공장에서 채취하였다.

플래시 저온살균기가 0.8 m³/hr의 체적유출율에서 작동되었다. 유닛은 맥아즙을80℃의 최저온도와 함께 평균 85℃에서 보관하는 관모양의 저장부를 가지고 있다. 저장부의 부피는 1.13×10^-2m³으로, 저장부의 거류시간을 51초 제공한다. 가열단계 이후에 맥아즙을 빠르게 2℃로 냉각 시킨다.

4.4 고정법

카파-카라기난 겔 X-0909는 Copenhagen Pectin A/S산 산물이다. 큰 이스트 세포를 포함하는 카파-카라기난 겔 비드는 Neufeld et al.(1996)에 의해 상세히 설명된 정전인 혼합법을 이용하여 겔의 107-108 세포/㎖의 초기 세포 담지로 제조된다. 도 15에 도시한 바와 같이, 정전인 혼합법은 인라인 폴리아세틸 정전 혼합기(Cole-Parmer Instrument Co., USA)를 이용하여 불용성 연속 단계, 식물성 오일(Maxola Corn Oil) 과 KCl(0.2% w/v)용액의 수용성 분산 단계, 카파-카라기난(3% w/v) 사이의 유상액 형성에 기초한다. 이스트가 빠르게 카라기난 용액과 혼합되어 유상액이 형성되는 혼합개략도의 가열부의 온도는 37℃였다. 유상액내의 카파-카라기난 방울의 겔화가 아이스 배스에서 빠른 냉각으로 야기되고, 연이어 염화칼륨 배스에서 (22g/ℓ) 경화된다. 직경 6.4m의 24-요소 정전 혼합기를 이스트와 카라기난 혼합물을 창출하기 위해 사용하였다. 직경 12.7m의 42-요소 정전 혼합기를 유상액을 창출하기 위해 사용하였다. 상기 작업의 실험에 사용된 비드는 0.5mm〈비드 직경〈2.0mm 였다.

4.5 카파-카라기난 겔 비드의 누적 입자 크기 분배

고정화 이스트 세포를 포함

카파-카파기난 겔 비드는 매스 웨트 중량 기초로 계산하기 위해 겔 비드 30ℓ 산물 운영으로부터 임의로 시료를 만들었다. 각 시료는 대략 500g 웨트 중량이었다. 비드 입자 사이즈 분배를 결정하기 위해 체질을 이용하였다. 비드는 2.0, 1.7, 1.4, 1.18, 1.0 및 0.5mm의 격자 크기를 가진 일련의 체를 통과하였다. 각 비드 시료의 체질을 용이하게 하기 위해 22 g/ℓ KCl 용액 4.5ℓ을 사용하였다. 카파-카라기난 겔 비드는 완전 구형으로 가정하여 체 직경이 입자 직경으로 간주되었다. 또한 입자 밀도는 일정하고 입자 크기와 무관하다.

4.6 이스트 세포 계산과 생존력

자유롭게 부유하는 이스트 생존력과 세포 농도: 이스트 세포 생존력을 측정하기 위해서 미국의 브루윙 케미스트 인터내셔널 메틸렌 블루 염색 기법(ASBC의 기술위원회 및 편집위원회, 1992)을 사용하였다. 상기 염색은 생존능이 있는 세포가염료를 산화하여 무색의 형태가 되는 능력에 기초하여 이스트가 생존가능한지 여부를 측정한다. 생존불능한 세포는 염료를 산화하는 능력이 부족하여 결국 블루로 남게된다. Fink-Kuhles 완충된 메틸렌 블루를 용액 B(2.5 g Na₂HPO₄·12H₂O/100 ㎖ 1차 증류수의 1.25 ㎖)로 혼합된 13.6 g KH₂PO₄/500 ㎖ 1차 증류수의 498.65 ㎖)의 500 ㎖와 용액A(0.1 g 메틸렌블루/ 500 ㎖ 1차 증류수)의 500 ㎖를 혼합하여 준비햐였다. 이는 최종 완충된 메틸렌블루 용액이 pH 4.6이 되게 한다.

희석된 이스트 용액이 시험관에서 메틸렌블루 용액과 혼합되어 현미경 시야에서 약 100개의 이스트 세포가 부유하였다. 잘 혼합된 부유물 소량을 현미경 슬라이드에 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮었다. 염료와 접촉한 지 1분에서 5분이 지나면, 블루로 염색된 세포와 무색으로 남아있는 세포가 계산된다. 생존능을 가진 세포의 비율은 세어진 총 세포 수의 비율로 기록되었다. 세포 농도는 광학 현미경과 혈구계(Hauser Scientific Company)를 이용하여 측정하였다.

고정화 세포 생존력과 세포 농도: 겔 비드는 멸균한 체(500 □m 구멍망 사이즈)를 통해 혼합물을 통과시키고 10 ㎖의 증류수로 세척하여 발효액과 분리하였다. 채취한 이스트를 포함하는 1 ㎖의 겔 비드를 19 ㎖의 증류수를 포함하는 멸균한 50 ㎖ 견본 용기에 첨가하였다. 그런 다음 폴리트론(상표명)(Brinkmann Instruuments)장치를 사용하여 비드를 희석하여 세포를 겔에서 빼냈다. 그런 다음 자유롭게 부유하는 세포를 위해 세포 생존력과 농도를 측정하였다.

4.7 미생물학적 분석

액체상 분석: 최소한 일주일에 한 번은 미생물학적 분석을 위해 연속 발효로부터 시료를 채취하였다. 연속 발효에 사용된 맥아즙 역시 바이오리액터로 옮기기 전에 오염을 테스트하였다. 호기성과 혐기성 박테리아의 존재를 테스트하기 위해, 시료를 사이클로헥시미드 10mg/ℓ을 첨가하고 유니버셜 맥주 한천(UBA, Difco Laboratories)에 깔아서 28℃에서 10일간 배양하였다. 혐기성 박테리아 오염을 테스트하기 위한 플레이트를 AnaeroGen(상표명)(Oxoid)packet을 가진 혐기성 병에 두고, 병에 남아있는 산소를 제거하여 혐기성 조건을 만든다. 산소존재하에 핑크로 변하는 혐기성 지시약(Oxoid)는 병내부의 혐기성 조건을 증명하기 위해 사용한다. 야생의 이스트 오염은 시료를 CuSO4(0.4 g/ℓ)가 첨가된 이스트 배지(YM agar, Difeo Laboratories)에 플레이팅하여 25℃에서 7일간 배양하여 테스트한다. 전술한 펩톤 이스트 추출 영양소 한천(PYN)은 37℃에서 7일간 비-라거(larger) 이스트 오염을 위한 시료를 가려내기 위해 사용했다. 37℃의 PYN에서 이스트 성장의 존재는 37℃에서 자라는 에일이 아닌 이스트 또는 오염이 존재함을 시사한다.

겔상 분석: 바이오리액터로 넣기전에 발효에 사용된 고정화 세포 비드에 박테리아가 오염되지 않았음을 입증하기 위한 분석을 우리 실험실에서 개발하였다. 주된 관심은Pediococs sp.및Latobacillus sp. 이나 와일드 이스트등의 맥주 부패 생물의 오염을 피하는 것이었다. 카라기난 겔 비드 3㎖가 하기 서술된 수 개의 상이한 선택액체 배지에 접종되었고, 250 ㎖ 플라스크에 담아 인큐베이터 교반기에서 100 rpm으로 교반하였다. NBB 배양액(Nachweis von BiershㅴdlichenBacterien)(BBL cat#98139, NBB Broth Base, 0.02 g/ℓ 사이클로헥시미드)는Pediococs sp.및Latobacillus sp. 등의 맥주 부패균을 테스트하기 위해 사용되는 반 선택 배지이다. 황산구리배양액(16 g/ℓ YM 배양액, Difco;0.4 g/ℓ CuSO₄)는 와일드 이스트 오염을 테스트하기 위한 반 선택 배지이다. 최종적으로, 표준방법(STA)+사이클로헥시미드 배양액(16 g/ℓ "표준 방법" 배양액, Difco;0.02 g/ℓ 사이클로헥시미드)은 물, 폐수, 유제품 및 식품(Power and McCuen,1998)에서 발견되는 박테리아를 테스트하기 위한 것이다. 선택배지는 잠정전 부패 미생물을 삼일내에 발견하고 동정하기위해 이용한다. 오염된 시료는 시료내의 탁도로 지시되고, 오염균의 가정에 의한 동정이 이루어진다.

호흡 결함(RD) 이스트 세포 감지법: 염화 트리페닐테트라졸륨 (TTC) 오버레이법:해당 방법은 호흡 결함 이스트와 나머지 집단을 구별하기 위해 사용하며, TTC가 환원하여 붉은 침전물을 형성하는 무색염이라는 원리에 기초한다. TTC가 이스트-펩톤-덱스트로스(YPD)한천(1차 증류수안에 이스트 추출액, 10 g/ℓ; 펩톤, 20 g/ℓ; 덱스트로스, 20 g/ℓ; 한천, 20 g/ℓ )에서 성장하는 이스트 콜로니로 오버레이 될 때, 호흡 결함 이스트는 TTC를 환원할 것이고, 이러한 콜로니는 어두운 핑크에서 레드가 될 것이다. 그러나 호흡 결함 이스트가 염료를 환원하지 않으면 원래 색깔이 유지된다.

배양액은 플레이팅하기 위해 적절한 미생물 농도, ∼100 세포/0.2 ㎖로 순차적으로 희석하였다. YPC 플레이트는 그런다음 50℃ TTC 오버레이 한천 20㎖로 오버레이된다. 50℃로 각각의 용액을 냉각시킨 후, TTC 오버레이 한천은 용액A(1차 증류수안에 12.6 g/ℓ NaH₂PO₄; 11.6 g/ℓ Na₂HPO₄; 30.0 g/ℓ 한천)와 용액B(1차 증류수 안에 2.0 g/ℓ 2,2,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드, 121℃에서 15분간 가압멸균). 플레이트는 주위온도에서 3시간 배양한 후에 해독되었다. 퍼센트 RD는 관찰된 총수의 염색되지 않은 콜로니의 비율로 기록되었다.

4.8 카파-카라기난 겔 비드에서 고정된 이스트의 전자현미경(SEM)조사

고정화 이스트를 포함한 카파-카라기난 겔 비드를 시료 포트(port)를 통해서 바이오리액터에서 꺼내어, 비드를 소량의 발효 배양액에 담기도록 10㎖ screw-cap 글라스 바이알에 넣는다. 상기 바이얼을 즉시 얼음으로 덮어 격리된 용기에 담아 SEM장치로 옮겼다. 고정화 이스트를 포함한 카파-카라기난 겔 비드를 Sorensen의 인산염 완충액, 0.07 M, pH 6.8,에서 준비된 2%(v/v)에서 고정하였다. 이는 동일한 완충액에서 준비된 1%(w/v) 오스뮴 테트록시드에서의 후기 고정과 일련의 50, 70, 80, 90, 95, 100%((v/v) 알코올 등급 용액을 통한 탈수과정이 뒤따른다. 이산화탄소르 통해 임계점 드라잉(Ladd Research Industries, Burlington, VT)하기 전에, 수 개의 비드를 액체질소로 얼린 후 분쇄하여 100% 알코올로 모은다. 결빙 분쇄로 비드 내면의 뒤틀림이 최소가 되게 한다. 임계점 드로잉 한 후, 시료를 골드/팔라디움 30nm로 스퍼터 코팅(Polaron SC500 sputter coater, Fison Industruments, England)된 후 Hitachi S-4500 필드 방출 스캐닝 전자현미경으로 조사한다(NisseiSangyo, Tokyo, Japan).

4.9 바이오리액터 샘플링 프로토콜

바이오리액터 샘플 포트(Scandi-Brew 타입 T 멤브레인 샘플 밸브) 저장기는 샘플링 사이의 입구 주위를 무균 조건으로 유지하기 위하여 70%(v/v) 에탄올 용액으로 채워졌다. 샘플을 얻기 위하여, 포트 개방 전에 플러그가 에탄올 저장기의 베이스로부터 제거되고, 배수되어, 에탄올로 완전히 세척되었다. 샘플은 클림프 바이알 또는 스크류-뚜껑이 있는 용기내에서 수집되었고, 요청되는 분석에 따라 용량은 5-60㎖까지 다양하였다. 미생물학적 오염을 테스트하기 위하여, 발효 액체 10㎖를 살균 멤브레인 필터 유니트를 통하여 진공-펌프시켰다. 0.45□m 구멍 사이즈의 멤브레인은 4.6절에 설명된 바와 같이 적당히 선택된 보존액에 위치되었다.

화학적 분석을 위하여, 샘플 60㎖가 100㎖ 밀봉-바이알로부터 회수되었고, Schleeicher and Schull, FP-050, 5□m과 0.45□m 구멍 사이즈의 이겹 주사 여과 시스템을 통하여 주사-여과되었다. 이후 샘플의 요망되는 용량이 20㎖의 헤드 스페이스 바이알 안으로 투여되었고, 테프론 격벽과 알루미늄 뚜껑으로 밀봉되었다. 요망되는 샘플 용량은 표 4.1에 리스트되어 있다.

표 4.1. 다양한 화학적 분석을 위하여 요청되는 샘플 용량

샘플	볼륨(㎖)
에탄올쇼트-체인 디올맥주 휘발성비시널 디케톤탄수화물/비중/자유 아미노 질소/단백질	5101251212

4.10 용해된 산소 측정

Dr. Thiedig Digox 5 용해된 산소 분석기는 맥아즙, 발효중인 액체 및 맥주 내의 용해된 산소를 0.001-19.99㎎/ℓ의 범위에서 측정한다(Anon, 1998). Vilacha와 Uhlig(1985)는 맥주 내에 용해된 산소를측정하기 위하여 많은 기구를 테스트하였고, Digox 분석기가 신뢰할 만한 정확한 값을 낸다는 것을 알아냈다. Digox 5로 이용된 전기 화학적 측정 방법은 전위차계로 전류의 3-전극 배열에 기초한다. 세포 측정은 전극(음극)과 반대 전극(양극) 측정으로 구성된다. 이들 전극은 산소 농도가 측정될 액체에 노출된다. 측정 전극에서의 반충작용이 제한된 측정 전위를 고정시킨 후 발생한다. 큰 은 측정 전극에서, 산소 분자가 수산기 이온으로 감소한다. 두 가지 물분자는 4개의 전자를 흡수하고 4개의 수산기 이온을 방출하는 동안 식 4.1에서 산소 1분자와 반응한다.

O₂+2H₂O+4e^-→4OH^-(4.1)

스테인리스 스틸 양극은 전류의 흐름을 보장하기 위하여 음극에서 자유롭게 된 4개의 전자를 흡수한다. 식 4.2에서, 측정 전류, I,는 직접적으로 산소 농도, C_L,O에 비례한다:

I=K×C_L,O(4.2)

Faraday 상수에 의하여 영향을 받는 상수, K,는 분자당 변환되는 전자의 개수, 음극 표면 지역, 및 측정 전극의 표면에서의 경계층의 폭.

상수인 독특한 측정 전위는 (산소의)선택력 및 측정의 정확도의 임계이다. 측정 전압은 전류에서 자유로운 관련 전극에 의하여 안정화된다. 이것은 전자적인 피드백을 제공하는 퍼텐쇼스탯과 함께 일정한 측정 전위를 제공한다. 측정 전극의 표면은 전리적으로 격벽을 통해 관련 전극과 연결되었다.

최종 용해된 산소 농도의 측정 범위에 기초한 오차는 ±3%이다(Anon, 1998). 용해된 산소 분석기는 Digox 5가 페러데이의 법칙(0.500 ㎎/ℓ)에 기초하여 제한된 산소량을 생산한 Thiedig Active Calibration을 이용하여 눈금이 매겨진 후 매트릭스에서의 측정치로 이를 교차 검사하였다. 이것은 압력, 온도 및 흐름 조건하에서 기구의 그것에 대응하여 1분내에 기구에 눈금이 매겨질 수 있도록 하였다. 센서 내에서의 분자량 변화는 확산 과정이기 때문에, 빠른 반응율을 초래하는 온도와 측정된 전류의 증가에 의하여 영양을 받는다. 따라서, Digox 5는 또한 온도를 측정하고 자동적으로 불안정을 보정하는 센서가 장착된다.

Digox 5는 멤브레인에 기초한 산소 센서에 비하여 일부 장점을 가진다. Digox는 전해질을 이용하지 않기 때문에 감도 손실이 상대적으로 낮으며 오직 측정 전극 상에 작은 침전물이 발생한다.

또한 감도는 어느 때나 실제 눈금측정을 수행함으로써 결정될 수 있다. 전극세척 및 기구에 눈금을 다시 매기는 것은 간단한 과정이다. 대부분의 멤브레인-센서에서는, 은 염화물이 음극에 침전되고, 전해질 용액이 변화하여, 전차적으로 판독이 낮아진다. 이러한 이유로 멤브레인과 전해질은 몇 주마다 교체되어야 하고, 다시 눈금이 매겨져야 하는데, 이는 길고 성가신 일이다. 멤브레인에 기초한 센서의 눈금 측정은 대개 산소 포화 상태에서 연구실에서 수행되는데, 이는 특히 매우 낮은 산소 수준의 맥아즙과 맥주에서 상당한 오차를 야기한다. 온도는 멤브레인에 기초한 센서에 3겹의 영향을 미친다: 멤브레인 투과성의 변화, 산소의 부분압의 변화 및 전해질에서의 산소 용해성의 변화이다. 이러한 멤브레인에 기초한 3가지 요인의 온도 보정은 어렵다.

저장 동안 맥아즙에 용해된 산소 측정: 유연한 Tygon(상표명) 식품 등급 관(1/4 인치 내경)이 무균으로 맥아즙 저장 탱크인 T-1과 T-2(4.2절 참조)의 원뿔형 기저의 상부 근처에 위치한 샘플 포트에 연결되었다. 다양한 속도의 연동 펌프(Masterflex(상표명), L/S^TMDigital Standard Drive, Cole-Parmer cat. #P-07523-50)는 용해된 산소 분석기 블록을 통하여 11ℓ/hr의 용량 유속을 제공하였다. 이후 맥아즙에 용해된 산소 측정은 4-5분 후에 기록되었다.

바이오리액터 내의 용해된 산소 측정: 바이오리액터의 용해된 산소 측정을 수행하기 전에 Digox 5 분석기 블록이 위생 처리되었다. 센서의 입구가 살균된 Tygon(상표명) 식품 등급 관(1/4 인치 내경)에 연결되었다. 70%(v/v) 에탄올 용액은 15분간 약 10L/hr의 용량 유속에서 분석기를 통하여 펌프되었다. 용해된 산소 분석기는 실험실 수도꼭지에 연결되었고, 뜨거운 물(70℃)이 최소 2시간 동안 센서를 통과하였다. 분석기 블록 원료는 70℃ 이상의 온도를 견딜 수 없기 때문에 증기 살균보다 오히려 이 방법이 사용되었다. 2시간의 위생처리 기간 다음으로, 유니트의 입구 및 출구의 관은 분석기 내에서 살균상태를 유지하기 위하여 밀봉되었다. 라미너 플로우 후드에서, 신선하게 살균된 관이 분석기의 입구 및 출구에 연결되었다. 이후 관의 자유단은 무균으로 바이오리액터 상판의 1/4 인치 내경의 스테인리스 스틸 포트에 밀봉되었고, 측정이 수행되었다. 바이오리액터의 포트가 사용되지 않았을 때에는 포트는 짧은 길이의 살균된 Tygon(상표명) 식품 등급 관을 사용하여 봉해졌다.

용해된 산소는 바이오리액터 상판에 위치한 포트를 통하여 발효로부터 액체를 회수함으로써 가스-부양 바이오리액터 내의 라인에서 측정되었다. 발효 액체는 바이오리액터 상판을 뚫은 1/4 인치 스테인리스 스틸 파이프에 연결된 스테인리스 스틸 필터(4.1.2절 참조)를 통하여 바이오리액터에서 나왔다. 이후 액체는 용해된 산소 분석기 블록을 통하여 11ℓ/hr의 용량 유속을 제공하는 다양한 속도의 연동 펌프(Masterflex(상표명), L/S^TMDigital Standard Drive, Cole-Parmer cat. #P-07523-50)에 연결된 유연한 Tygon(상표명) 식품 등급 관(1/4인치 내경)을 통하여 흘렀다. 이후 발효 액체는 바이오리액터 상판을 뚫은 두 번째 1/4인치 스테인리스 스틸 포트를 통하여 가시 순환되었다. Tygon(상표명) 식품 등급 관(Cole-Parmer,1999)은 센서를 바이오리액터에 연결하는데 사용되었는데, 이는 공급기의 30㎤㎜/(sㆍ㎠ㆍ㎝Hg)×10^-10의 특정된 낮은 산소 투과성 때문이다. 측정은 순환 후 4-5분 후에 수행되었다.

4.11 화학적 분석

눈금 측정은 적당한 표준 시약을 사용하여 수행되었다. 분석에 사용된 모든 시약은 99%의 순도였다. 필요한 경우, 증류를 통하여 다음의 정화가 수행되었다.

4.11.1 에탄올

에탄올 농도는 Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists(1992)의 내부 표준 가스 크로마토그래프(GC) 방법을 사용하여 결정되었다. 가스가 제거된 샘플은 이소프로패놀 내부 기준인 5%(v/v)로 직접 처리되어 불꽃 이온화 검출기(FID)와 Dynatech 오토샘플러가 구비된 Perkin Elmer 8500 가스 크로마토그래프 안으로 주입되었다. 크로모조브 102, 8--100 메쉬 컬럼은 담체 가스로서 헬륨과 함께 사용되었다. 크로마토그래피의 조건: 20㎖/min의 유속, 주입기 온도 175℃, 검출기 온도 250℃, 컬럼 온도 185℃.

4.11.2 탄수화물의 요약

발효 샘플 내의 글루코오스, 프락토우즈, 말토우즈, DP3(말토트리오즈), 폴리-1(다당류 피크 1) 및 글리세롤 농도는 양이온 교환 컬럼(Bio-Rad Aminex, HPX-87K)와 굴절 인덱스 검출기(Spectra-Physics, SP6040XR)가 구비된 Spectra-Physics(SP8100XR) 고성능 액체 크로마토그래프(HPLC)를 사용하여 측정되었다. 이동성 상태는 2염기의 인산칼륨 0.01M이었고, 시스템은 Spectra-Physics(SP8100XR) 오토샘플러가 구비되었다. 이 기구는 800psi의 후압력으로 작동되었다. 컬럼을 지나는 샘플과 용출액의 유속은 0.6㎖/min이었고, 컬럼 온도는 85℃, 검출기 온도는 40℃였다. 주입 용량은 10 □ℓ였다.

4.11.3 특정 중량

본 연구에서의 맥아즙과 발효 보존액의 특정 중량은 양조업계에서 사용되는 일반적으로 인정되는 단위인 실제 추출(Plato 등급, 。P)을 이용하여 설명되었다.

발효 샘플은 맥아즙의 특정 중량(Plato 등급)을 측정하기 위하여 디지털화된 밀도계(Anton Parr DMA-58 밀도계)를 이용하여 분석하기 전에 4.8절에서 설명된 바와 같이 여과되어 선회되었다. 발효 샘플은 u-유리관에 담겨졌고, 이는 특정 중량을 결정하기 위하여 전자적으로 진동되어 간접적으로 Plato 등급을 산출하였다.

Plato 등급은 문제의 맥아즙과 동일한 특정 중량을 갖는 20℃의 물 속의 비율 (w/v) 슈크로오즈 용액의 수치를 나타낸다. Plato 등급과 용질 농도와 관련된 용액의 특정 중량에 관한 결과표는 수성 슈크로오즈 용액에 근거하기 있기 때문에, 이것은 오직 추출물의 대략적인 양이다. 추출물은 탄수화물, 단백질, 탄닌과 같은잠재적으로 공정(Hardwick, 1995)을 통하여 양조 물질 "자체"에서 용해될 수 있는 총량을 나타내는 용어이다. 추출물은 현재에도 여전히 양조업계에서는 Plato 등급의 특정 중량으로 표현되는데, 이는 유래가 다른 맥아즙의 구성에 있어서의 변화성과 관련한 더 적절고 좋은 참고자료가 부족하기 때문이다.

4.11.4 전체 디아세틸

맥주 및 발효 샘플 내의 전체 디아세틸(2,3-부타네디온)은 Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists(1992)의 방법에 기초한 모세관 GC 분리기(Hewlett-Packard 5890)과 전자 포촉 검출기(ECD)가 수반되는 헤드스페이스 분석 샘플링 기법을 사용하여 측정되었다. 이 방법은 디아세틸 및 그 전구물인 알파-아세토락테이트를 특정하기 때문에 "전체 디아세틸"을 나타낸다. 담체 가스는 1.0㎖.min의 아르곤 내의 5%의 메탄이었고, J&W DB-Wax 컬럼이 사용되었다. 분리비율은 2:1이었고, 보조 가스는 60㎖/min의 헬륨이었다. 주입기 온도는 105℃였고, 검출기 온도는 120℃였다.

Hewlett-Packard 7694E 헤드스페이스 오토샘플러와 2,3-헥사네디온이 구비된 시스템이 내부 표준으로서 사용되었다. 샘플 사이클 시간은 40분으로, 65℃에서의 바이알 평형 시간 30분, 4.8psig에서 가압 시간 2분, 루프 충진 시간 0.2분, 루프 평형 시간 0.1분, 주입 시간 0.27분이었다. 담체 압력은 18.8psig이었고, 운반 라인 온도는 95℃, 루프 온도는 65℃였다.

4.11.5 맥주 휘발성 물질

아세트알데이드, 에틸아세테이트, 이소부탄올, 1-프로판올, 이소아밀 아세테이트, 이소아밀알코올, 에틸 헥사노에이트 및 에틸 옥타노에이트를 포함하는 맥주 휘발성 물질은 내부 표준 (n-부탄올) GC(Hewlett-Packard 5890) 헤드스페이스 방법과 불꽃 이온화 검출기(FID)를 사용하여 측정되었다. 담체 가스는 6.0㎖/min의 헬륨이었고, GC는 Hewlett-Packard 7694 헤드스페이스 오토샘플러가 구비되었다.

GC 주입기 온도는 200℃였고, 검출기 온도는 220℃였다. 오븐 온도 프로파일은 40℃(5분), 40-200℃(10℃/min), 200-220℃(50℃/min), 220℃(5분)이었다. FID 가스는 6.0㎖/min의 담체, 30㎖/min과 28psig의 헬륨 성질, 50㎖/min과 25psig의 H₂및 300㎖/min과 35psig의 공기를 포함하였다.

격벽은 0.8㎖/min의 유속로 세촉되었다. 헤드 압력은 4.0psig였다. 오토샘플러가 니들을 지나 주입 포트 안에 연결될 때, 바이알 압력은 15.9 psig, 담체 압력은 7.1 psig, 컬럼 헤드 압력은 4 psig, 분리 흐름은 18㎖/min, 컬럼 흐름은 6㎖/min이었다.

각 부의 온도: 바이알 70℃, 루프 80℃, 운반 라인 150℃.

GC 사이클 시간은 40분으로, 바이알 평형 시간 35분, 가압 시간 0.25분, 루프 충진 시간 0.1분, 루프 평형 시간 0.1분, 주입 시간 3분, 샘플 루프 용량은 1㎖였다.

4.11.6 유리 아미노질소 (FAN)

American Society Brewing Chemists의 Technical Committee 및 Editorial Committee의 유리 아미노질소 International Method는 Perkin Elmer LS50B 스펙트라포토미터를 이용하여 발효 샘플에서의 유리 아미노질소의 농도를 측정하는데 사용하였다. 당해 스펙트라포토미터 방법은 샘플 내에 존재하는 닌히드린 및 질소 사이의 색상 리액터를 나타내고 있다. 흡수량은 유리 아미노질소의 양과 직접적으로 관련되어 있다.

a) 색상 시약 :19.83g 수소 인산염 이나트륨 (Na₂HPO₄)

30.00g 이수소인산칼륨 (KH₂PO₄)

2.78g 닌히드린 1수소염

1.50g 플락토즈

b) 희석 시약 :2.00g 요드산 칼륨 (KIO₃)

596㎖ 탈이온 증류수

404㎖ 95% (v/v) 에탄올

냉장고에 보관하고 상온에서 사용하였다.

c) 글리신 비축 용액 : 0.1072 g/100㎖ 증류된 탈이온 물

d) 글리신 표준 용액 : 비축 용액은 탈이온 증류수와 1:100(v/v)으로 희석되었다. 당해 규격은 FAN 2 ㎎/ℓ를 포함한다.

이들 샘플을 증류수와 100:1의 비율로 희석하고, 2㎖ 증류된 샘플은 3개의 실험 튜브의 각각에 넣었다. 3개의 실험 튜브의 각각에 탈이온 증류수 2㎖를 넣음으로써 블랭크를 준비하였다. 또한, 글리신 표준 용액 2㎖를 포함하는 3개의 실험 튜브도 준비하였다. 모든 샘플에 색상 시약 1㎖을 첨가한 후, 정확히 16분간 100℃ 워터 배쓰(water bath)에 놓았다. 그후 실험 튜브를 20분간 20℃ 워터 배쓰에서 식혔다. 그 후 5㎖ 희석 시약을 각각의 실험 튜브에 첨가하고 잘 혼합한 후, 이들 샘플을 10 내지 15분간 방치하였다. 그 후 570㎚의 흡수물을 스펙트라포토미터를 이용하여 측정하고, 샘플에서의 FAN의 양을 방정식 4.3을 이용하여 계산하였다.

(4.3) FAN (㎎/ℓ) = (A_P- A_B- A_F) 2d/A_S

FAN이 샘플 ㎎/ℓ에서 프리 아미노질소의 양인데 반하여, A_P는 실험 용액의 흡수물의 형균이고, A_B는 블랭크 흡수물의 평균이고, A_F는 흑 맥아즙 및 맥주 중화용 흡수물의 평균이며, 2는 글리신 표준 용액에서의 FAN의 양이고, d는 샘플의 희석 요인이고, A_S는 글리신 표준 용액용 흡수물의 평균이다.

제 5장 가스 부양 바이오리엑터 시스템을 사용하는 연속 발효

공표된 우수한 메스 이송(액체-고체) 및 혼합 특성 때문에 가스 부양 흡출관 바이오리엑터 시스템을 연속 맥수 발효에 선택되었다. 액체-고체 메스 이송은 포촉된 이스트용 기질을 제공하는, 액상에서 고체 고정화 세포 바이오촉매로 영양분의 이송에 관여하므로 특히 중요하다. 이들 바이오리엑터는 양호한 통기, 낮은 전력 소모, 및 구축하기에 간단함을 제공한다. 이것은 폐수 처리(Driessen et al., 1997; Heijnen, 1993)용 시판되는 것과 같이, 대용량 스케일 가동에 매우 매력적인 가스 부양 바이오리엑터 시스템이다.

5.1 가스 흡출관 바이오리엑터 설명

이 섹션에서 이 작업에서 사용되는 가스 부양 바이오리엑터에 대해 상세히 설명한다.

5.1.1 바이오리엑터 바디

이 작업을 위해 설계된 13 ℓ가스 부양 흡출관 바이오리엑터는 도 16에 나타난 바와 같이, 내부 액체 순환(Heijnen, 1996)을 구동하는 이산화탄소에 의해 고정된 세포가 현탁으로 유지되는 3상 유동 베드(액체/고체/가스)이었다. 바이오리엑터의 사진을 도 17에 나타내고, 도 18에 상세한 영역을 갖는 상세도를 나타내었다. 길이 11mm, 외경 0.013mm의 소성 스테인레스 스틸 살포기(CO₂퍼저, Part #9222, Hagedorn & Gannon, USA)를 통해 바이오리엑터의 원추 바닥에 이산화탄소와 공기를 흘렸다. 이산화탄소는 유동가스로 사용되었고, 산소는 이스트 세포에 산소 공급으로 사용되었다. 기둥형 바이오리엑터 내주에 동심원상으로 위치된 흡출관은 유동베드 시스템중의 라이저로 기능하고, 외부 고리는 다운커머로 작동한다. 내부 흡출관은 바이오리엑터의 연장 헤드 구역에 3개의 스테인레스 스틸 탭상에 안치된 원주형 입자 분리기에 걸려있다. 바이오리엑터 내주에 끼워진 흡출관 및 입자 분리기를 유지하는 것은 외부 환경으로부터 미생물 오염의 위험을 최소화한다.

원래, 바이오리엑터는 출구에 액상으로부터 고정화 세포를 분리하는 메쉬 스크린을 갖는다. 그러나, 이 스크린은 막히기 쉬워, 스테인레스 스틸 실린더를 흡출관 정부 및 고리 하부로 이동하면서 액상으로부터 고정화 세포로부터 고정화 세포 비드를 분리하는데 사용되었다. 입자는 실린더를 쳐서, 흘러 넘쳐 바이오리엑터를 떠나기보다는 벌크 액상에 떨어진다. 그리하여, 고정 세포 입자가 없는 바이오리엑터 출구 근처의 작은 영역이 있었다. 또한 헤드 영역으로 연장된 바이오리엑터은 가스 버블 이탈용 표면이 증가한다.

5.1.2 바이오리엑터 헤드플레이트

도 19에 바이오리엑터 헤드플레이트의 개략도를 나타냈다. 헤드플레이트 포트는 오염의 위험을 저하시키기 위하여 최소한으로 유지된다. 포트는 헤드에 직접 납땜하거나 압축 조립된 것(Swagelok, 상품명)이 사용된다. 헤드플레이트는 접종 포트, 써머웰, 온도기, 가스 샘플링용 격막, 및 액체 배출기 및 용해 산소 측정용 리턴 포트에 결합되었다. 온도 센서는 써모웰내 삽입되고, 이것은 온도 제어 시스템에 피드백시킨다. 이 온도 제어기는 솔레노이드 밸브에 피드 백하고, 이는 바이오리엑터 써멀 쟈켓에 글리톨 공을 개폐한다. 온도계(Cole-Parmer WaterproofThermocouple thermometer, #90610-20) 및 바이오리엑터 헤드 플레이드에 납땜딘 타입 T 프로우브를 사용하여 온도를 모니터한다. 용해 산소를 용해 산소분석기(Dr. Theidig, Digox 5)를 사용하여 측정한다. 헤드플레이트를 통해 발효 액체로 가는 ¼ 인치 파이프를 통해 산소를 측정하기 위하여 바이오리엑터로부터 액체를 취출한다. 도 20에 나타난 바와 같이, 용해 산소 분석로부터 펌프되므로 파이프 팁은 액체로부터 큰 입자를 제거하기 위하여 필터로 연결되어 있다. 그러나 이 액체는 또 다른 헤드플레이트 중의 ¼인치 포트를 통해 바이오리엑터로 되돌아간다.

5.1.3 무균 샘플링용 위생 밸브

바이오리엑터는 바이오리엑터의 벽에 납땜된 맴브레인 샘플 밸브(Scandi-Brew, 상품명)가 갖춰져 있다. 이 밸브는 무균 조건하에서 샘플링하도록 설계되어 있다. 이 맴브레인은 발효액체에 대해 직접 빌봉하여 밸브는 2개의 출구(도 18)를 통해 스팀과 알코올로 충분히 살균되도록 되어 있다. 에탄올의 작은 외부 저장기는 샘플링 사이에 살균을 유지하는 맴브레인으로 둘러싸여 있다. 이 밸브는 모든 바이오리엑터 샘플링에 사용되며, 샘플링시의 액체 조성은 바이오리엑터 출구로 나가는 액체 조성보다 유의하게 다르지 않은 것을 가정한다. 이 작업의 물질과 방법의 장에서 언급한 바와 같이, 바이오리엑터는 바이오리엑터의 외벽에 위치한 밸브로부터 샘플링된다. 바이오리엑터 출구로부터 배출되는 액체의 조성 이바이오리엑터의 바디로부터 샘플링되는 액체와 동일하다는 가정을 확인하기 위하여 혼합시간 연구를 수행하였다.

가스 부양 바이오리엑터(Chistie, 1989)에서 혼합시간을 측정하기 위하여 펄스 트레이서법이 사용되었다. 10N HCl 1㎖를 신속하게 바이오리엑터 고리에 주입하고, pH 변화를 주입 시간 t=0으로 하여 경시적으로 기록하였다. pH를 10N NaOH를 주입하여 원래의 pH로 되돌렸다. pH 전극(Cole-Parmer, cat. #P-05990-90)은 길이 277mm, 직경 3.5mm이었다. pH 측정에 Ingld Model 2300 Process pH Transmitter가 사용되었다. 2-포인트 pH 보정은 인증된 표준 버퍼, Beckman pH 7.0 그린 버퍼, Part #566002 및 Beckman pH 4.0 red 버퍼, Part#566000으로 수행되었다. 이 데이터를 Cheryl Hudson 및 John Beltrano가 1994년에 설계하고, Norm Mensour(University of Western ONtario, London, Ontario)가 1999년에 수정한 소프프웨어를 사용하여 3750Hz에서 300초간 기록하였다.

그런 다음, pH 데이터를 Savitsky-Golay algorithm in TableCurve 2D(Jandel Scientific Software, Lavtronics, Guelph, ONtario)을 사용하여 스무스하게 하였다. Savitsky-Golay algorithm은 pH 데이터(Anon, 1996)내에서 이동 윈도우를 통해 적어도 평방 4차 다항 적용에 기초로 한 스푸싱의 시간-영역법이다. 그런 다음, 스무스하게 된 데이터를 정형화하고, 시간에 대한 ΔpH 값을 플롯팅하였다. pH가 ∼95%의 평형값에 도달할 때, 혼합 시간을 가장 가까운 분으로 하였다. 혼합 시간은 이산화탄소의 3개의 상이한 용량적 유동 속도, 283 ㎤/분, 472㎤/분(이 작업에서 사용된 용량적 유동 속도) 및 661 ㎤/분을 사용하여 측정했다. 3개의 모든 경우에, 바이오리엑터중의 pH는 부록 1에 나타난 바와 같이, 2분이내에 평형(∼95% 컷오프)이 이루어졌다. 혼합기간은 바이오리엑터가 잘 혼합됨을 원래의 가정을 확인하는 데 충분히 짧은 것이다. 이것은 바이오리엑터 벽에서 샘플링한 액체의 조성은 바이오리엑터에서 24시간 평균 액체 거류시간으로 출구에서 유출된 것과 유의하게 다르지 않다는 우리의 가정을 확인해준다. 첨부된 도면으로부터, 분산에 의해 혼합과 동일한 확실한 액체 재순환이 보이며, 이는 가스 부양 바이오리엑터의 전형이다(Chisti, 1989).

5.2 연속 맥주 발효 시스템의 흐름도

온타리오주 런던에 위치한 라바트 부루잉 컴패니 마이크로부루어리 파이롯트 플랜트에서 수용된 연속 맥주 발효 시스템의 흐름도를 도 21에 나타내고, 부분 상세도는 테이블 5.1에 기재하였다. 요약하여, 양조업자의 맥아즙을 런던 라바트 공장에서 수집하고, 플래쉬 저온 살균기(Fisher Palte Heat Exchanger, combi-flow Type Eurocal 5FH)를 사용하여 살균하고, 대량 저장 탱크(T-1 및 T-2)에 저장하였다. 연속 발효동안, 맥아즙을 제어 유동속도로 고정화된 이스트 세포를 함유하는 가스 부양 바이오리엑터(BR-1)로 이송했다. 바이오리엑터에 흘러 넘친 발효된 액체를 수납 용기(T-3)에 수집하였다. 다음 섹션에서 도 21에서 주어진 연속 맥주 발효 시스템의 작동을 상세히 설명한다.

5.2.1 맥아즙 수집 및 저장

이산화탄소로 퍼지하여 맥아즙내의 산소를 최소화하고, 1600ℓ 원추형 저장탱크에 라바트 런던 공장의 연속 발효용 산소처리되지 않은 맥아즙을 파이프를 통해 수집하였다. 맥아즙 저장 탱크를 포함한 이러한 규모의 모든 탱크, T-1 및 T-2를 사용하기 전에 라바트 베스트 프랙티스에 따라 세정하고 위생 처리했다. 그런 다음, 맥아즙을 저온 살균하고, 2℃에서 맥아즙 저장 탱크, T-1 또는 T-2(역시 이산화탄소로 예비 퍼지)로 이송했다. 연속 발효 바이오리엑터, BR-1에 액체를 공급하면서, 맥아즙을 이들 탱크에 2℃에서 2주간 저장하였다. 2주가 끝날 때에, 바이오리엑터 공급을 변경하여 맥아즙을 신선한 맥아즙을 함유하는 제2 맥아즙 탱크로 공급하였다. 신선한 맥아즙으로 변환하는 동안 비가동시간을 최소화하기 위하여 2개의 동일한 맥아즙 저장 탱크, T-1 및 T-2를 사용하였다. 모든 경우에 맥아즙을 바이오리엑터(BR-1)에 도입되기 전에 최소 2일간 오염 시험을 하였다. 맥아즙이 오염되었으면, 이를 버리고, 신선한 맥아즙을 즉시 수집하고, 저온 살균한다.

저장중 용해 산소 농도를 최소화한 맥아즙:맥아즙을 동결시키지 않고, 저온에서 일정하게 최소 산소의 맥아즙을 저장하는 것이 목표이다. 저장중 미생물의 오염 위험을 최소화하고, 바이오리엑터에 맥아즙을 일정하게 공급하기 위하여 산소로 화학반응(Narziss et al., 1993)으로부터 맥아즙 중의 원치 않는 스테일링 반응을 방지하는 것이 필요하다. 연속 발효용 맥아즙을 저장하기 이하여 사용되는 커다란 1600ℓ(넷트) 원추형 용기(T-1 및 T-2)는 원래 맥아즙 저당 탱크가 아닌 뱃치 발효용으로 설계되었다. 이 때문에, 이 용기의 냉각은 2℃로 유지하는 데 적합하지 않았다. 맥아즙의 저장 3일후에 온도는 탱크의 한 영역에서 다른 영역으로 15℃ 정도로 많이 변하였다. 탱크중의 이렇게 따뜻한 영역은 미생물 성장의 위험을 증가시킨다. 그리하여 이들 탱크중에 저온을 균일하게 유지하기 위하여는 교반이 필요하였다. 이러한 이유 때문에, 각각의 맥아즙 저장 탱크(T-1 및 T-2)의 원추 바닥에 파이프 살포기가 설치되었다. 맥아즙으로 채우고, 용해 산소의 낮은 수준을 유지하기 휘한 가장 좋은 프로토콜을 결정하기 위하여 실험을 수행하였다. 처음 실험에서, 저장 탱크를 산소처리 및 플래쉬 저온 살균하지 않고 수집한 맥아즙으로 채웠다. 일단 저장 탱크가 1600ℓ 맥아즙으로 채우면, 탱크를 0.113 ㎥/시간의 이산화탄소로 살포했다. 2번째 실험에서는 매아즙을 산소처리 및 플래쉬 저온 살균하지 않고 수집했다. 이 때, 저장 탱크를 충진 3시간 전에 이산화탄소(0.85 ㎥/시간)으로 퍼지하고, 맥아즙을 탱크로 이송하므로, 소량의 이산화탄소(0.113 ㎥/시간)로 연속적으로 저장 용기속으로 살포하였다. 이산화탄소의 낮은 유동은 연속 발효에 맥아즙을 공급하는 동안 탱크중 저당된 맥아즙을 통해 계속하여 버블을 일으킨다. 양자의 실험을 위하여 맥아즙 용해 산소 농도는 1주일 저장동안 정규적으로 모니터되어야 한다.

도 5.7에서 맥아즙 저장 시간에 대한 용해 산소 농도를 나타냈다. 저장 탱크가 이산화탄소로 예비 퍼지하지 않았을 때, 탱크의 정부의 공기는 맥아즙에 의해 산소가 탈취되는 것을 허용한다. 그리하여 탱크를 예비 퍼징하지 않으면, 맥아즙 중의 용해 산소 농도를 최소 및 일정 수준으로 도달하기 위하여는 장시간이 걸린다. 탱크가 예비 퍼지되었을 때, 맥아즙 용해 산소 농도는 저장 기간을 통해 일정하게 낮은 수준으로 유지된다. 그리하여 맥아즙 저장 탱크(T-1 및 T-2)를 예비 퍼지하고, 탱크중에 약간의 양압을 유지하기 위하여 저장중 맥아즙을 통해 이산화탄소의 작은 흐름을 계속 제공하는 것은 연속 발효용 맥아즙 저장 공정의 일부로 채용되었다. 저장 용기 중의 온도 프로파일은 0.113 ㎥/시간의 이산화탄소 살포시와 살포없이의 경우를 비교하였다. 이것은 온도계(Cole-Parmer Waterproof Thermocouple Thermometer, cat. #90610-20)에 연결된 T형 온도 프로우브를 사용하는 맥아즙에서보다 물에서 수행되었다. 수돗물(1600ℓ)을 맥아즙 저장 탱크에 수집하고, 3일간 평형화하고, 물의 온도를 저장 탱크의 상이한 영역에서 기록하였다. 탱크중의 물을 24시간에 0.113 ㎥/시간의 이산화탄소로 살포하고, 온도를 기록하였다. 각 경우에 주위 온도를 기록하고 저장탱크중의 온도 설정은 2℃이었다. 표 5.2에 나타난 바와 같이, 이산화탄소로 살포하면, 저장 탱크중의 온도는 거의 일정하게 0.1 및 4.1℃의 온도 범위로 측정되고, 탱크의 온도는 동결시키지 않았다. 이 낮은 온도는 저장중 맥아즙중의 미생물의 원치 않는 성장을 막는데 도움이 된다. 탱크의 정부에 위치한 살균 가스 필터를 통해 맥아즙 저장 탱크로부터 가스가 방출된다. 그런 다음, 변화되는 속도 연동 펌프(P-1)(Masterflex, L/s Digital Standard Drive, Cole=parmer cat. #P-07523-50)를 통해 Norprene(상품명) Good Grade L/S 플랙시블 튜브를 사용한 8ℓ 바이오리엑터 입구로 이송된다.

5.2.2. 가스 부양 흡출관 바이오리엑터 시스템을 이용한 연속 발효

바이오리엑터 BR-1의 원추 바닥 근처에서 ¼인치 포트를 통해 맥아즙을 도입하였다. 살균된 필터(Milipore, Millex-FG₅₀, 0.2 □m Filter Unit)공기 및 이산화탄소(99.99%)의 혼합물을 소성 스테인레스 스틸 살포기를 통해 바이오리엑터에 흘려보냈다. STP에서 이산화탄소 흐름을 제어하기 위하여 로타미터(R-3)를 사용하고,STP에서 공기의 유속을 제어하기 위하여 예비 보정 메스 유동 제어기(M-1)를 사용했다. 바이오리엑터를 넙친 발효 액체를 1인치 보강 PVC 튜브을 통해 외부 글리콜 코일로 냉각되어 4℃로 유지되는 30ℓ 스테인레스 스틸 수집 용기에 흘려보냈다.

5.2.3 생산품 수집

생산품 수집 용기(T-3)는 발효 액체가 수집 용기 벽에 흘러내려 거품이 최소화되도록 설계된 대형 입구 포트(1인치)를 갖는다. 또한, 이 용기는 바이오리엑터로부터 가스 방출용 살균 가스 필러(Millipore, Millex-FG₅₀, 0.2 □m Filter Unit) 및 수집 용기(R-3)을 갖는다. 수집 용기는 탱크 정상에 2인치로 위치한 ¼인치 밸브(V-12)를 사용하여 주기적으로 비운다.

5.2.4 글리콜 냉각 루프

글리콜을 런던 부루어리에서 -23℃의 온도 및 45 psig의 압력의 마이크로부루어리 파이롯트 플랜드로 이송하고, 맥아즙 저장 탱크(T-1 및 T-2), 가스 부양 바이오리엑터(BR-1) 및 생산품 수집 용기(T-3)를 위한 냉각 자켓을 통해 순환시켰다. 2개의 맥아즙 저장 탱크와 바이오리엑터를 온도 제어기를 피드백하며, 반대로 냉각 글리콜을 용기 자켓으로 흐름을 제어하는 액상 온도 프로우브로 설치한다. 맥아즙 저장 탱크는 약 2℃로 저장되는 반면, 바이오리엑터중의 온도는 구체적 실험에 따라서 12℃ 내지 22℃로 제어된다. 생산품 수집 용기는 자동 온도 제어기를 갖지 않으나, 글리콜의 흐름을 수동으로 제어하여 용기를 약 4℃로 유지한다. 용기중의 액체는 단순히 버리고 또한 분석되거나 더 이상 가공되지 않기 때문에 생산품 수집용기(T-3)의 온도를 정밀하게 제어할 필요는 없다.

글리콜은 맥아즙 탱크(T-1 및 T-2)에서 바이오리엑터(BR-1)로 의 맥아즙 이송 라인을 자켓 및 냉각하는 데 사용된다. 글리콜이 주어진 자켓을 통해 일단 순환되면 파이롯트 플랜트 마이크로부루어지내의 메인 라인으로 되돌아가, -15℃, 40 psigdm 압력에서 런던 플랜트로 되돌려진다.

5.3 바이오리엑터 살균 프로토콜

바이오리엑터(BR-1)을 Diversol CX/A(DiverseyLever, Canada) 2%(v/v) 용액으로 채우고, 세제로 세정하고, 가스 살포로 하룻밤 적셨다. 그런 다음, 반응기를 배수하고, 냉수로 린스했다. 세척액 및 물 린스의 사이클을 2회 반복했다. 스팀 살균한 바이오리엑터를 준비하기 위하여, 맥아즙과 가스 라인을 떼어놓았다. 스팀 라인을 바이오리엑터 입구에 연결하고, 다음 밸브를 열었다: 바이오리엑터 입구 및 퍼지 밸브(V-7, V-6). 가스 입구(V-17), 생산품 출구 밸브(V-9, V-11), 맴브레인 샘플링 밸브(V-8, V-10) 및 수집 용기 배수 포트(V 12). 그런 다음, 플랜트 스팀 밸브를 서서히 열고, 바이오리엑터 밸브를 조정하여 스팀이 각 외부 개구의 출구에서 조금씩 흘러나오는 것을 관찰했다. 스팀 노출 60분 후, 맥아즙 바이패스 밸브(V-6)를 제외하고, 바이오리엑터의 모든 외부 밸브(V-17, V-8, V-10 및 V-12)를 닫았다. 스팀 밸브가 닫혔을 때, 맥아즙 바이패스를 닫고, 살균 필터를 수집 용기에 연결하여 그것이 냉각됨에 따라 시스템에 들어가는 멸균되지 않은 공기에 의한 오염을 방지한다. 또한, 이 바이오리엑터 가스 라인은 시스템이 냉각되는 동안, 양압을 유지하기 위하여 닫혀있다.

5.4 발효 시스템 시작

양조자의 맥아즙은 공장으로부터 20L 스테인리스 스틸 압력 용기 내에서 수수집되어 100℃에서 45분간 압력솥에서 가열되었다. 고정화된 세포는 무균으로 내각된 맥아즙(40% w/v) 내로 이동되었다. 봉해진 용기는 바이오리액터 시스템이 수납된 Microbrewery Pilot Plant로 이동되었다. 20L 용기는 강화된 3/8" PVC 관(Cole-Parmer, USA)에 채워진 조기 연결 장치(Cornelius Anoka, MN, USA)에 연결되었다. PVC 관의 다른 쪽 단부는 바이오리액터 벽 내의 멤브레인 샘플링 밸브(V-8)에 채워졌다. 여과-살균된 이산화탄소는 10psig로 20L 용기에 적용되었고, 멤브레인 샘플 포트는 외부 공기 환경의 오염에 노출됨이 없이 고정화된 세포 혼합물을 용기로부터 바이오리액터 안으로 이동시키킬 수 있도록 개방되었다. 20L 용기의 "조기 연결" 장치의 내부 구성은 제거되었는데, 이는 고정화된 세포로 바이오리액터 내부로의 이동하는 막는 것을 방지하기 위함이다. 카파-카라기난 겔 비드에 쌓인 입자 크기 분포(소형)는 그림 5.8에 나타난다. 산술 평균 입자 직경, D_pam,은 1.252mm로 계산되었고, Sauter 평균 입자 직경, D_psm,은 1.17mm였다. 중위 입자 직경은 1.255mm였다. 실험 데이터 및 평균 소립자 직경 계산은 부록 1에 나타낸다.

고정화 셀 접종에 이어, 바이오리액터는 당 및 디아세틸 농도가 특정 비중으로 3。P이하 및 100□g/ℓ 디아세틸 이하에 도달할 때까지 뱃치 모드에서 작동되었다. 그 후 당해 시스템은 연속 동작을 위해 준비되었다. 온수로 헹구고 맥아즙 전달 라인을 스팀살균하기 위해, 밸브 V-2(또는 T-2용 V-4), V-5, 및 V-6를 개방한 반면, V-1(또는 T-2용 V-4), V-7는 폐쇄하여 맥아즙 라인과 단리시켰다. 맥아즙 전달 라인을 약 80℃에서 온수로 헹구고, 이를 V-2(또는 T-2용 V-4)룰 통해 공급했다. 온수 헹굼 주기에 이어, 공장의 스팀라인은 같은 장소에서 연결되었고, 맥아즙 전달 라인은 최소한 30분간 스팀살균되었다. 스팀라인 종료와 동시에 측관 밸브(V-6)를 폐쇄하였다. 시스템이 냉각되면 V-2(또는 T-2용 V-4) 및 측관 밸브(V-6)가 개방되고 맥아즙 전달 펌프(P-1)이 개시되었다. 맥아즙은, 라인에서 압축물이 신선한 냉각 맥아즙으로 교체될 때까지 측관 밸브(V-6)를 통해 하수관으로 보내졌다. 측관 밸브(V-6)가 폐쇄되고 리액터에서의 바이오리액터 삽입 밸브(V-6)가 개방되었을 때 연속 발효 공정을 개시하였다.

2주마다, 맥아즙이 공급된 모든 탱크는 저장 탱크(T-1 및 T-2) 사이에서 교대로 발생하였다. T-1에서 맥아즙을 공급한 후 2주후에, 연속 공급 펌프 P-1은 정지되었고, 바이오리액터의 방출 밸브(V-5)는 폐쇄되었다. 그 후 맥아즙 전달 라인은 2차 저장 탱크(T-2)에 연결되고, 플러쉬하여 상기 단락에서 설명된 바와 같이 살균하였다. 연속 발효는 1시간 이하의 쇼트 다운 시간 후에만 재개하였다.

표 5.1 그림 5.6에 나타난 순서도에 대한 상세한 부분의 설명; PTFE, 폴리데트라플루오르에틸렌; SS, 스테인리스 스틸

부호	설명	규격	재료 구성
BR-1T-1T-2T-3P-1F-1F-2F-3F-4F-5F-6M-1R-1R-2R-3PR-1PR-2PR-3V-1V-2V-3V-4	바이오리액터맥아즙 저장탱크맥아즙 저장탱크맥주 저장탱크T-1에서 BR-1까지의 맥아즙이송펌프(연동, 속도 가변)T-1 출구측 가스필터T-1 입구측 가스필터T-2 출구측 가스필터T-2 입구측 가스필터BR-1 입구측 가스필터T-3 출구측 가스필터BR-1으로의 공기유량 제어기T-1으로의 이산화탄소로타미터T-2로의 이산화탄소로타미터BR-1으로의 이산화탄소로타미터T-1&T-2로의 이산화탄소압력조절기BR-1으로의 이산화탄소악력조절기BR-1으로의 공기 압력조절기T-1의 맥아즙 밸브(나비)T-1측 CIP 루프의 맥아즙 밸브(나비)T-2의 맥아즙 밸브(나비)T-2측 CIP 루프의 맥아즙 밸브(나비)	8L 네트1600L 네트1600L 네트30L 네트<0.08L/min<4 bar<2 bar<4 bar<2 bar<2 bar<2 bar<500 sccm<10 scfh<10 scfh<2.5 scfh<100 psi<100 psi<100 psi1″1″1″1″	316 SS316 SS316 SS316 SSNorprene의 SS 롤러유연성 있는 식품용 튜브polyprop., 0.2 마이크로미터 PTFE 막polyprop., 0.2 마이크로미터 PTFE 막polyprop., 0.2 마이크로미터 PTFE 막polyprop., 0.2 마이크로미터 PTFE 막polyprop., 0.2 마이크로미터 PTFE 막polyprop., 0.2 마이크로미터 PTFE 막316 SS, 나일론, Viton "O"-링316 SS, 아크릴 블록316 SS, 아크릴 블록316 SS, 아크릴 블록316 SS316 SS316 SS316 SS, Viton 시트316 SS, Viton 시트316 SS, Viton 시트316 SS, Viton 시트

표 5.1(계속) 도 21에 나타난 순서도에 대한 상세한 부분의 설명.

부호	설명	규격	재료 구성
V-5V-6V-7V-8V-9V-10V-11V-12V-13V-14V-15V-16V-17V-18	주관의 맥아즙 밸트(볼)BR-1 맥아즙 입구의보조관 밸브(볼)BR-1 맥아즙 입구의 밸브(볼)BR-1 벽의 밸브(막 샘플)BR-1 맥주 출구의 밸브(나비)BR-1 맥아즙 출구의 밸브(막 샘플)BR-1 맥주 출구의 제2밸브(나비)T-3로의 유체 차단 밸브(볼)T-1 & T-2까지의 이산화탄소라인 밸브(볼)T-1 이산화탄소 입구 밸브(나비)T-2 이산화탄소 입구 밸브(나비)BR-1까지의 이산화탄소라인 밸브(볼)BR-1 가스 입구 밸브(급속 해제)BR-1까지의 공기 라인 밸브(볼)	1/4″1/4″1/4″12 mm1″12 mm1″1/4″1/4″1/2″1/2″1/4″1/4″1/4″	316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, Viton 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, Viton 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트316 SS, 실리콘 시트

도 21에 사용된 심볼

그림 5.7. 다른 탱크 충진 조건하에서의 맥아즙 내에 용해된 산소 농도 대 맥아즙 저장 용기(T-1 또는 T-2) 내에서의 보관 시간

표 5.2. 이산화탄소의 살포 없이 3일간의 평형 후 및 0.113㎤/시의 이산화탄소 살포된 24시간 후의 맥아즙 저장 용기(T-1 또는 T-2) 내의 맥아즙 온도 프로파일.

원뿔형 실린더 용기 내부의 측정 위치	온도(℃)CO2무살포	CO2살포
유체 표면 아래 10cm 및 용기 벽에서 10cm용기 중심에서 유체표면 아래로 10cm용기 벽에서 10cm인 원통형 몸체 부분용기 중심에서 원통형 몸체 부분실험 공장 주위	20.620.13.83.721.4	0.40.13.74.119.8

그림 5.8. 고정화된 이스트 세포를 포함하는 카파-카라기난의 입자 크기 누적 분포(n=5)

6장. 카파-카라기난 겔 고정화

라거 양조 이스트

과학자들은 칼슘 아르긴산염(Bejar 외, 1992; Curin 외 1987; Masschelein과 Ramos-Jeunehomme, 1985; Nedovic 외, 1996; Shindo 외, 1994; White와 Portno, 1978), 아가로우스(Hoojimans 외, 1990; Lundberg와 Kuchel, 1997) 및 카라기난 겔(Norton 외, 1995; Wang 외, 1982)을 포함한 모든 세포의 물리적 포촉을 위한 다양한 매트릭스를 연구해왔다. 카라기난은 식품 등급 원료이고 이는 다른 겔에 비하여 우월한 역학적 힘 때문에 세포를 캡슐에 싸는 용도로 선호되어 왔다(Bueyueguengoer, 1992).

이 장의 첫 부분에서는, 카파-카라기난 겔 비드 내의 이스트 세포의 콜로니 형성이 3순환으로 반복되는 뱃치 발효 동안 모니터되었다. 고정화된 세포와 액상으로 자유로워진 세포의 생존력이 검사되었다. 에탄올, 말토우즈, 말토트리오즈, 프락토즈 및 글루코스를 포함한 발효 파라미터는 반복되는 뱃치 발효 내내 따라왔고, 동일한 영양 조건하에서 오로지 자유롭게 분산된 이스트 세포만을 이용한 조절 발효와 비교되었다.

장기 고정화(Virkajaervi and Kronloef, 1998)와 외부 스트레스에의 연속적 노출 후 및 발효 결과의 세포에 관한 물리적 효과에 관하여 발간된 정보는 현재까지 거의 없었다. 이 장의 두 번째 부분은 가스-부양 바이오리액터 내에서의 연속 발효의 연장 기간에 걸쳐 카라기난 겔 비드 내의 고정화된 이스트 세포의 생존력, 세포 집단 분포 및 물리적 외관을 검사한다. 또한 연장 기간에 걸쳐 호흡이 불완전한 고정화된 이스트와 자유롭게 분산된 바이오리액터의 세포 집단 간의 상관 비율이 검사되었다.

카라기난은 반복적인 3-6-무수갈락토오스 유니트로 구성되고, 분류된 카라기난은 반복적인 갈락토오스 유니트 상에서 표면 에스테르 그룹의 수와 위치에 의하여 구별된다. 카라기난의 갤화 메커니즘의 구성은 도 22에서 볼 수 있다. 카라기난이 졸 상태일 때, 그것의 다당류 사슬은 불규칙한 코일 배열을 이룬다. 나선이 형성되거나 또는 나선이 응집체를 형성함에 따라, 겔은 더욱 강해지고 단단해진다(Rees, 1972).

카라기난의 세 가지 일반적인 타입은 람다, 이오타, 카파이다. 그림 6.2에 나타난 바와 같이, 이들은 표면 에스테르의 내용에 의하여 구별되고, 표면 에스테르의 양은 다당류 사슬의 용해성에 영향을 미친다.

람다-카라기난은 고도로 황산화되어 겔을 형성하는 능력이 부족하다(Marrs, 1998). 이오타-카라기난은 매우 탄성력이 있고 약한 겔을 칼슘이온이 존재할 때 형성하고 중요한 시너레시스를 보이지는 않는다. 시너레시스는 겔이 나선 또는 응집체를 형성하는 경향이 너무 강하여 네트워크가 액체 "윕핑"의 야기를 감소시킬 때 발생한다. 카파-카라기난은 적당히 황산화되고, 이에 따라 더 강하고 단단한 겔을 칼륨이온이 존재할 때 형성하고, 일부 시너레시스를 수행한다. 카파-카라기난에 의하여 가능한 이 강화된 겔 힘은 모든 이스트 세포의 고정화에 선호된다.

그림 6.2. 람다-, 이오타-, 카파-카라기난의 화학적 구조.

카라기난의 중요한 특성은 역으로 할 수 있는 열 겔화 성질이다. 카라기난 용액이 냉각됨에 따라, 점성이 증가하고 겔화가 일어난다. 용액이 데워짐에 따라, 점성은 감소하고 카라기난은 다시 졸 상태로 되돌아간다. 겔링 카티온 용액의 구성을 조절함으로써, 카라기난이 졸에서 겔로 변화하는 온도가 변할 수 있다. 카파-카라기난 겔링 온도는 용액 내의 염화칼륨 농도 증가에 따라 증가한다. 이 현상은 세포 고정화를 위한 공정 설계에 이용되었는데, 이는 극심한 온도 변화를 피할 수 있기 때문이다(Neufeld 외, 1996). 카라기난의 겔링 온도는 발효 조건하에서 겔이 될 때에는 충분히 높게, 그러나 이스트 세포가 비드 겔화 전 생존력에 대한 악영향 없이 졸 상태의 카라기난과 혼합될 수 있을 때에는 충분히 낮게 조절될 수 있다.

그럼에도 불구하고, 이스트 세포대사 및 생리학에 관한 겔 메트릭스 내에서의 고정화에 대한 영향에 관한 추가 연구가 필요하다는 것을 암시하는 많은 요인이 있다. 기질이 표면으로 이동할 수 있기 전에, 겔 메트릭스와 상승하였음이 분명한 다른 포촉된 이스트 세포로부터 추가적인 장벽이 있기 때문에 고정화된 세포는 액체 상태의 자유 세포와 동일한 마이크로-환경에 있을 수 없다(도 23). 고정화된 세포에의 영양 제한이 발효 수행에 미치는 잠재적인 부정전 영향에 관하여 더 잘 이해하기 위하여 겔 메트릭스 내의 대량 운반율에 대한 많은 연구가수행되었다(Estape 외, 1992; Hannoun과 Stephanopoulos, 1986; Korgel 외, 1992; Kurosawa 외, 1989; Merchant 외, 1987; Oyaas 외, 1995; Venancio와 Tiexiera, 1997). 카라기난 겔 내의 작은 분자들의 효과적인 확산은 오직 물 속의 동일한 분자의 확산과 비교할 만하고, 겔은 글루코오스와 에탄올 같은 작은 분자들의 분자 확산이 가능하게 한다. 그러나, 전형적인 고정화된 세포 발효에 있어서는, 분자 확산에 더하여 대류적 이동에 의하여 영양이 주로 고정화된 세포 비드로 이동된다(Hannoun과 Stephanopoulos, 1986). 일단 영양이 비드 내로 진입하면, 이동은 상대적으로 느려지는데, 이는 분자 확산이 우선하기 때문이다. 이것은 겔 비드 주위의 이스트 세포가 비드 중앙의 이스트 세포에 비하여 확실한 영양학적 잇점을 가지고 있다는 것을 의미한다.

고정화된 세포의 수명 또한 고려되어야 한다. 포촉된 세포는 연속 발효가 수개월을 넘어감에 따라 늙게 되고, 이들은 한정된 거짓-안정-상태 조건하에서 발효한다. 그러나, 뱃치 발효 동안, 이스트 세포는 시간에 따라 변하는 환경에 노출되고 그 세포는 폐기 전 제한된 발효 횟수를 위하여 재사용될 뿐이다. 발효 실행과 관련하여, 이스트 세포의 생존력에 관한 연속 발효의 장기-지속 효과에 관한 연구가 더욱 필요하다.

이 장의 파트 A에서는, 카파-카라기난 겔 비드 내의 이스트 콜로니 형성의 동력학이 3순환 반복 뱃치 발효 동안 조사되었다. 고정화된 이스트와 자유록게 분산된 이스트의 생존력와 세포 농도가 에탄올, Plato 등급, 당 농도와 함께 모니터되었다.

파트 B에서는, 겔 비드 내에서의 세포 위치와 분포에 관한 발효 시간의 효과 및 이스트 세포 형태학이 조사되었다. 겔 비드의 다른 지역 내의 카파-카라기난-고정화된 이스트 세포의 조사를 위해 각각 다른 4가지 시점에서 스캐닝 전자 검경(SEM)이 사용되었다: 1) 비드 생산 후 즉시; 2) 뱃치 발효의 2일 후; 3) 파일럿 스케일 가스-부양 바이오리액터 내에서의 연속 발효의 2개월 후; 4) 파일럿 스케일 가스-부양 바이오리액터 내에서의 연속 발효의 6개월 후. 고정화된 세포와 액체 상태의 세포 양자 내에서의 이스트 생존력과 농도 또한 측정되었다. 또한 가스-부양 바이오리액터 내에서의 연속 발효의 5개월 후에 호흡이 불완전한 이스트(조정화된 tvh 및 액체 상태의 자유 세포)의 상대적 비율이 측정되었고, 이것은 전통적인 뱃치 맥주 발효에서 발견된 비율과 비교되었다. 생산 라거 이스트 스트레인은 연구 내내 사용되었다.

6.1 실험 과정

카파-카라기난 겔 비드 생산: 카파-카라기난 겔 X-0909는 Copenhagen Pectin A/S로부터의 관대한 선물이었다. 포촉된 라거 이스트 세포를 포함한 카파-카라기난 겔 비드는 비드 직경 0.5에서 2.0㎜와 2.6×10⁷세포수/㎖의 겔(특허 출원 2133789(Neufeld 외, 1996)의 초기 세포 적재량과 함께 공전 믹서 공정을 이용하여 생산되었다.

발효 보존액: 캐나다의 Labatt Breweries는 원료 및 방법 절에 상세히 설명된 바와 같이 특정 중량 17.5。P의 양조장 맥아즙을 공급하였다.

파트 A: 카파-카라기난 겔 비드 내의 고정화된 이스트의 반복적 뱃치 동력학

발효는 21℃에서 150rpm으로 흔들어 2ℓ 삼각 플라스크 내에서 수행되었다. 담체 선적은 40% (v/v)의 고정화된 세포 비드였고, 전체 발효 용량은 1ℓ였다. 각각의 발효는 지속기간이 7일이었다. R1에서 신선한 고정화된 세포 비드는 맥아즙 내에 투입되었고, 발효의 마지막에 혼합물을 살균 스테인리스 스틸 체(500 □m 메쉬 사이즈)를 통과시킴으로써 이들 비드를 발효된 액체로부터 분리하였다. 이후 비드는 1분간 신선한 살균 맥아즙 안으로 동일한 비율로 재투입(R2)된 후, 세 번째(R3) 발효에 들어갔다. 샘플링은 각각의 발효의 처음 3일간은 하루에 두 번씩, 이후 4일째와 5일째는 하루에 한번씩 수행되었다. 발효는 이중 도는 3중으로 수행되었다. 모든 발효는 자유세포가 4g/ℓ의 비율로 발효에 투입된 것을 제외하고는 동일한 조건하에서 수행된 자유롭게 분산된 세포 조절 발효와 함께 수행되었다. 샘플은 자유세포와 고정화된 세포의 생존력, 세포 농도 및 액체 단계 탄수화물과 에탄올 농도를 위하여 분석되었다.

기질 전체 발효가능한 글루코오스로부터 에탄올 산물의 산출 요인, Y_P/S,은 3개의 고정화된 세포 발효 사이클 및 자유 세포 조절을 위한 3.20 등식을 사용하여 계산되었다. 모든 발효에 있어서, 산출 요인은 발효 시작부터 말토우즈 소비가 완료될 때까지 계산되었다.

단위 발효 시간당 전체 바이오리액터 작업 용량당 생산된 에탄올의 총량인 에탄올 생산성, V_에탄올,은 R1, R2 및 R3에서 등식 3.25 및 발효 시작부터 말토우즈의 소비가 완료될 때까지의 자유 세포 조절을 이용하여 계산되었다.산출 요인과 에탄올 생산성의 경우, 고정화된 이스트 세포와 자유롭게 분산된 이스트 세포의 공헌도는 서로 차별이 없었다.

로컬 최대 특정 성장율, □_max, 및 세포 복제 시간은 등식 3.3과 3.4를 이용하여 평균 자유 세포 조절을 위해 계산되었다.

파트 B: 연장 발효 시간에 걸친 고정화된 이스트의 생존력 및 형태학적 특성

뱃치 발효 조건: 뱃치 발효는 21℃에서 150rpm으로 흔들어 2ℓ 삼각 플라스크 내에서 수행되었다. 담체 선적은 전체 발효 용량은 1L와 함께 40% (v/v)였다.

연속 발효 조건: 파일럿 스케일 가스-부양 흡출관 바이오리액터가 연속 발효를 위하여 사용되었다. 수집된 모든 데이터는 2개월의 스캐닝 전자 검경을 제외하고는 8L 작업 용량 바이오리액터로부터 나왔는데, 스캐닝 전자 검경은 동일한 발효 보존액과 고정화 방법을 사용하여 50L 바이오리액터로부터 수집되었다. 40%(v/v)에서 고정화된 세포 비드는 공기와 이산화탄소의 혼합물을 이용하여 바이오리액터 내에서 유동화되었다. 바이오리액터는 12, 17, 22℃에서 조절된 발효 온도와 함께 다양한 조건하에서 작동되었고, 잔류 시간은 0.9에서 1.8일 사이로 유지되었다. 가스-부양 바이오리액터는 6개월의 실험 기간동안 에탄올 평균 농도 58㎏/㎥, 최대 농도 73㎏/㎥에 도달하였다.

미생물학적 분석: 샘플은 야생 이스트, 비라거 이스트와 호기성 및 혐기성 맥주 부패 박테리아를 포함한 오염을 테스트하기 위하여 최소한 일주일에 한번 가스-부양 바이오리액터의 액체 상태로부터 채취되었다. 5개월 후, 액체 상태 이스트 세포는 호흡이 불완전한 돌연변이를 위하여 중복 검사되었다.

스캐닝 전자 검경(SEM): 고정화된 라거 이스트 세포를 포함한 카파-카라기난 겔 비드(1.0-1.5mm 직경)가 4가지 다른 시점에서 SEM 검사를 위해 표본 추출되었다: 1) 고정화된 세포 비드 생산 후 및 발효 보존액 안으로의 비드의 오염 전; 2) 뱃치 발효에서 2일 후; 3) 파일럿 스캐일 가스-부양 흡출관 바이오리액터 내에서의 연속 발효 2개월 후; 4) 파일럿 스캐일 가스-부양 흡출관 바이오리액터 내에서의 연속 발효 6개월 후. SEMs 및 관련 샘플 준비를 위하여 사용된 방법론은 4.7절에 설명되었다.

4.6절에 설명된 방법을 사용하여, 이스트 세포 농도와 생존력(고정화 및 자유롭게 분산된)을 SEMs와 같은 시간에 측정하였다.

6.2 결과와 토의

파트 A: 카파-카라기난 겔 비드 내의 고정화된 이스트의 반복 뱃치 동력학

3번 반복 뱃치 발효 사이클 동안 말토우즈, 말토트리오즈, 글루코오스, 프룻토오스 및 에탄올 대 발효 시간을 나타내는 그림 6.4 (a), (b) 및 (c)에서 보는 바와 같이, 발효 시간은 고정화된 세포가 신선한 맥아즙 내오 투입될 때마나다 급격히 감소하였다. 이들 그림으로부터, 완전한 당 소비를 위한 시간은 R1에서 64시간,R2에서 44시간, R3에서 26시간임을 알 수 있다. 그림 6.5에 나타난 고정화된 세포 비드를 포함하고 있지 않은 자유롭게 분산된 세포 조절 발효는 완전한 당 소비를위하여 82시간이 걸렸다. 또한 그림 6.4의 그래프로부터 최종 에탄올 농도는 3번 반복 뱃치 고정화 세포 발효 중 세 번째에서 가장 높았다. 카파-카라기난은 수성 겔이기 때문에, 일부 에탄올은 신선한 맥아즙에 투입될 때 비드 내로 넘어간다. 따라서, R2 및 R3의 시간 0에서, 일부 에탄올이 발효 액체에서 나타났고, 글루코오스, 말토우즈, 말토트리오즈 및 프룻토즈의 초기 농도는 그림 6.5에서 알 수 있는 바와 같이 자유 세포 발효와 비교하여 고정화된 세포 발효에서 더 낮게 나타났다(그림 6.4). 그러므로, 산출 요인은 발효에서 계산되어 산출물, 즉 소비된 당의 g당 에탄올 생산량 g,은 비교가능한 기준치에 근거하여 조사될 수 있다.

그림 6.4. a) 카파-카라기난 겔 비드 내에서 고정된 라거 이스트 세포를 이용한 반복 뱃치 발효에서의 R1, 말토우즈, 말토트리오즈, 글루코오스, 프룻토즈 및 에탄올 농도 대 발효 시간

그림 6.4. b) 카파-카라기난 겔 비드 내에서 고정된 라거 이스트 세포를 이용한 반복 뱃치 발효에서의 R2, 말토우즈, 말토트리오즈, 글루코오스, 프룻토즈 및 에탄올 농도 대 발효 시간

그림 6.4. c) 카파-카라기난 겔 비드 내에서 고정된 라거 이스트 세포를 이용한 반복 뱃치 발효에서의 R3, 말토우즈, 말토트리오즈, 글루코오스, 프룻토즈 및 에탄올 농도 대 발효 시간

그림 6.5. 자유롭게 분산된 라거 이스트 조절 발효(고정화된 세포는 없음)에서의 말토우즈, 말토트리오즈, 글루코오스, 프룻토즈 및 에탄올 농도 대 발효 시간

그림 6.6 (a)와 (b)는 말토우즈와 에탄올 농도 각각 대 R1, R2, R3의 발효 시간을 비교한다. 반복된 R1 동안, 말토우즈는 신선한 맥아즙 내로 투입된 거의 직후에 추출되었다. 에탄올 농도는 반복된 R1에서 보다 조기에 최고치에 도달하고 또한 처음 두 개의 뱃치 발효보다 더 높은 농도에 도달하였다. 그림 6.6 (b)에서 오비는 바와 같이, R1에서의 에탄올 내의 초기 지체는 이들 고정화된 세포가 R2에 투입되었을 때 철저하게 감소되었고, 나아가 R3에 재투입된 후 더욱 감소하였다.

그림 6.6. a) 카파-카라기난 겔 비드 내에서 고정된 라거 이스트 세포를 이용한 반복 뱃치 발효 R1, R2, R3에서의 말토우즈 농도 대 발효 시간

그림 6.6. b) 카파-카라기난 겔 비드 내에서 고정된 라거 이스트 세포를 이용한 반복 뱃치 발효 R1, R2, R3에서의 에탄올 농도 대 발효 시간

그림 6.7 (a)는 전체 바이오리액터 용량 당 고정화된 세포 농도 대 R1, R2, R3의 발효 시간을 보여준다. 그림 6.7 (b)는 이 발효에서 고정화된 세포 매트릭스로부터 벌크 액체 상태로 자유로워진 자유 세포 대 시간을 보여준다. 그림 6.7 (c)에서, 전체 리액터 용량 당 전체 고정화된 세포와 자유 이스트 세포가 3개의 뱃치에서 나타난다. 그림 6.7 (a)는 카파-카라기난 겔 네의 고정화된 세포의 농도가 R1의 맥아즙 내의 초기 오염을 따라 계속 증가하였음을 보여준다. 비드가 반복된 R2의 신선한 맥아즙 내로 재투입될 때, 성장이 갤 비드 내에서 계속되었다. 캡슐에 싸여진 세포가 신선한 맥아즙 내로 재투입되는 세 번째에, 고정화된 세포 농도의증가율은 느려졌다. 카파-카라기난 겔 매트릭스로부터 벌크 액체 상태로 자유로워진 자유 세포와 고정화된 세포 및 R1에서의 발효 내의 전체 세포의 농도가 그림 6.8에 나타나 있다.

그림 6.7. a) 전체 바이오리액터 용량 당 고정화된 라거 이스트 세포 평균 농도 대 R1, R2, R3 발효에서의 발효 시간. 오차 막대는 실험 데이터(n=2)의 상한과 하한을 표시한다.

그림 6.7. b) 벌크 액체 상태로 자유로워진 라거 이스트 세포의 전체 바이오리액터 용량 당 농도 대 R1, R2, R3 발효에서의 발효 시간. 오차 막대는 실험 데이터(n=2)의 상한과 하한을 표시한다.

그림 6.7. c) 전체 바이오리액터 용량 당 전체(고정화 및 액체 상태의) 라거 이스트 세포 농도 대 R1, R2, R3 발효에서의 발효 시간. 오차 막대는 실험 데이터(n=2)의 상한과 하한을 표시한다.

그림 6.8. 고정화, 액체 상태 및 전체(고정화 및 액체 상태) 세포 농도 대 카파-카라기난 겔 비드 내의 고정화된 라거 이스트 세포를 이용한 3회 반복된 뱃치 발효 중 첫 번째인 R1에서의 발효 시간.

R1에서, 카파-카라기난 겔 비드 내의 고정화된 세포 농도는 오로지 액체 상태의 새포를 포함하고있는 조절 발효와 유사한 비율로 증가하고 있었다. 이것은 그림 6.9의 자유 세포 조절 발효의 평균 성장 곡선과 그림 6.10의 R1의 가라게린 내의 고정화된 세포의 유사한 성장 곡선을 비교하여 확인되었다. R1 동안, 겔 비드는 완전히 콜로니 형성되지 않았었고, 이 발효 사이클 동안 세포 수가 조금 증가하는 것으로부터 암시되듯이 겔 매트릭스는 비드 내의 이스트 세포에 억제 효과를 나타내지 않았다. 이것은 겔의 본성 또는 비드 내의 이스트 세포의 군집성, 또는 세포에의 영양 공급의 부족에 기인한 것일 수 있었다.

그림 6.9. 전체 바이오리액터 용량 대 조절 발효 자유롭게 분산된 라거 이스트 세포 평균 농도(n=3) 대 발효 시간. 고정화된 세포는 이 발효동안 나타나지 않았다.

그림 6.10. 겔 비드의 ㎖ 당 고정화된 라거 이스트 농도 대 R1, R2, R3 발효에서의 발효 시간. 오차 막대는 실험 대이터(n=2)의 상한과 하한을 표시한다.

표 6.1에서, 기질 발효 가능한 당류로부터의 에탄올 산출량, Y_P/S,이3개의 뱃치 생성과 조절에 대하여 나타난다. 표 6.2에서, 에탄올의 바이오리액터 용량 측정의 생산성이 주어지고, 표 6.1에서 주어진 데이터를 사용하여 계산되었다. 발효 동안 당류로부터 산출된 에탄올은 서로 또는 조절과 유의적으로 다르지 않았다. 산출량은 모두 Guylussac 식으로부터 예상된 0.51의 이론적인 산출량의 90% 이상이었다. 이미 언급된 바와 같이, 생물량 생산과 이스트 세포로부터 형성된 다른 부산물은 능률이 이론적(Hardwick, 1995)인 것의 95% 보다 더 높이 도달하는 것을 방지한다. 3번 반복 뱃치 발효에서의 용량 측정의 에탄올 바이오리액터 생산성은 뱃치와 반복된 뱃치에서 유의적으로 다양하였다. 에탄올 생산성은 반복된 뱃치 발효의 각사이클과 함께 증가하였고, R3에 의하여, 고정화된 세포는 조절 발효보다 더 생산성이 높았다. R2에서 생산된 에탄올의 총량은 R1 동안 생산된 그것과 유의적으로 더 많지 않았다. 그러나 발효 시간은 R1 및 조절 발효의 반보다 더 적었다. 각각의 뱃치 발효와 함께 고정화된 세포의 증가된 발효율에 공헌하는 많은 요인, 즉 이스트 세포의 발효 조건에의 적응성 및 향상되어 증가하는 세포 농도 등이 있었다. 바이오리액터 용량당 전체 세포의 수는 오직 R3에 의하여 조절의 그것보다 유의적으로 더 컸다. 그림 6.7 (b)에서, 벌크 액체 내의 자유롭게 분산된 세포(겔 매트릭스로부터 자유롭게 된) 농도 대 발효 시간의 그래프는 겔 비드로부터 자유롭게 된 세포수가 각각의 뱃치 생성과 함께 증가하였음을 나타내었다. 일단 비드가 더욱 완전히 이스트 세포와 함께 선적되면, 그들은 더 많은 세포들을 벌크 액체 상태 안으로 풀어준다. Husken 외(1996)는 조사된 박테리아 세포 콜로니 팽창과 카파-가라게린 겔 슬라브로부터의 분출/자유에 대하여 연구하였다. Vives 외(1993)은 카파-카라기난 겔 비드에서 도달한 이스트 세포의 최대 농도는 겔 그램당 10⁹개였음을 보고하였는데, 이는 R2에 의한 겔 입자 내에서 도달했던 농도이다. 유사한 최대 세포 농도가 파트 B의 연속 발효 동안 발견되었다. 그러나, 겔 매트릭스 내의 최대 세포 선적량은 초기 세포 선적량, 겔의 구성 및 다른 요인에 달려있다.

표 6.1 제품 P의 산출 Y_P/S, R1, R2, R3의 기질 글루코오즈(Glc), 과당(Frc), 맥아당(Mal), 및 말토트라오제(DP3)로부터의 에탄올, 및 유리 현탁 세포 조절 발효

뱃 치	Tf*	T0	Glcf	Frcf	Malf	DP3f	Pf	Glc0	Frc0	Mal0	DP30	P0	YP/S
농 도	(h) (㎏/㎥)
R1R2R3유리세포조절	64.044.026.082.0	0.00.00.00.0	0.00.00.00.0	0.00.00.00.0	0.00.00.00.0	2.43.13.24.2	50.149.054.066.0	13.09.78.919.5	3.02.02.83.6	60.054.52.091.2	17.415.716.027.3	0.011.014.00.0	0.50.50.50.5

* t_f는 맥아당 추출을 완성하는 시간이며, 아래첨자 f는 시간 t=t_f에서의 주어진 분석의 농도를 나타낸다.

표 6.2. 유리 현탁 세포 뱃치 발효와 비교한 고정화 세포 뱃치 발효(R1, R2, R3)의 에탄올 바이오리액터 생산성[V_ethanol=(㎏ 생산된 에탄올)/(㎥ 바이오리액터 용량·h)]

발효	Vethanol=(㎏/㎥ hr)
R1R2R3유리 세포 조절	0.4700.6681.2460.805

* 맥아당 추출 종료시에 계산된 것임

각각의 반복 뱃치 발효로 관찰된 증가된 바이오리액터 용량적 생산성에 영향을 미치는 또 다른 요인은 이스트 세포 수용과 관련이 있다. 1차 발효의 마지막까지 이스트 세포는 그 대사산물 조직을 주어진 발효 조건으로 받아들였다. 이로써, 발효율을 증가시키는 뱃치 발효의 초기에 래그(lag)상을 증가시킨다. 본 출원에서모든 조절 발효는 신선하게 준비된 라거 이스트로 수행되었다. 세포 농도 효과와 관련한 이러한 효과를 추가로 시험하기 위하여 다시 핏치된 고정화 세포 곁에 유리 현탁 조절 이스트를 다시 핏치하는 것은 중요할 것이다.

도 6.11은, 지시약으로서 메틸렌 블루 방법을 사용하는 고정화 세포 생존률이, 고정화 세포가 R1에서 맥아즙으로 최초로 핏치되었을 때에는 낮았으나, 고정화 세포의 생존률은 발효 48시간 후에 90% 이상이었다는 사실을 나타내고 있다. 이스트 세포는 신속하게 비드를 콜로니화하였고, 생존률은 R3에서 높은 상태로 있었다. 그러나, R3이 반복됨으로써, 생존률은 발효의 마지막으로 다소 줄어들었다. 그러나, 3회의 반복 뱃치 발효 내내, 벌크 액체 배지로 방출된 유리 세포는 그 고정화 대응물 보다 생존률이 높았다. 고정화 매트릭스는 이스트 세포 생존률(대량 이동 한계 및/또는 공간 한계)에 대한 부정전인 효과를 가지고 있을지도 모르고, 아니면 생존가능한 이스트 세포는 생존불가능한 세포에 벌크 액체 배지 내에 고정화 매트릭스로부터 우선적으로 방출될지도 모른다.

부록 1에 포함된, 3개의 분리 유리 현탁 이스트 조절 발효의 평균 데이터를 사용하는 것, 즉 In(X/X0) 대 발효 시간의 도표는 도 6.12에 나타낸다. 경사는, 150 rpm 진동으로 맥아즙에서 21℃로 세포의 최대 로컬 특정 성장률과 동일하다. 최대 로컬 특정 성장률은 0.096 hr^-1이었고, 세포 더블링 시간은 7.22시간이었다. 본 발명에서 발견된 □max는, 이론부분에서 언급한 바와 같이, Monod 방정식에서 사용된 순수 □max는 S가 Monod 상수인 K_S보다 현저하게 클 경우에만 달성될 수 있기 때문에, 로컬 □max로 정의된다. 앞으로의 연구에서는 Monod 방정식에서 정의된 환산 로컬 □max가 순수 최대치라는 사실을 확인하기 위하여, 이들 발효에서의 한정 기질의 Monod 상수인 K_S의 값을 구해야 한다.

도 6.11. 고정화 라거 이스트 세포 생존률(에틸렌 블루) 대 발효 시간 R1, R2 및 R3 발효

도 6.12. Ln(X/X₀) 대 평균 유리 현탁 이스트 조절 발효의 지수 성장시의 뱃치 발효 시간, 여기서 X는 시간 t,에서의 세포 농도이며, X₀는 시간 t=0일때의 세포 농도이다(n=3).

파트 B : 초과된 발효 시간에 따른 고정화 이스트의 생존률 및 형태학적 특성

겔 비드가 발효 배지 및 정전 혼합 공정을 이용하는 고정화 세포 생산에 노출되기 전, 세포 농도는 2.6×10 세포/㎖이었다(표 6.3, 여기에서 값은 두 개의 샘플의 평균이다). SEM 이미지는 세포가 겔 비드(도 24) 내내 개별적으로 고르게 퍼졌음을 나타낸다.

표 6.3 발효 시간에 따른 카파 카라기난 겔 비드에 트랩된 유리 현탁 및 고정화 라거 이스트 세포의 생존률(메틸렌 블루) 및 농도

시간	농도모드	액상에서유리 현탁된 이스트	겔상에서고정화된 이스트
		생존률(%)	세포 농도(세포/㎖액체에서)	생존률(%)	세포 농도(세포/㎖겔에서)
02일2개월6개월	n/a뱃치연속연속	n/a989392	n/a5.5E＋072.35E＋082.11E＋08	n/a9276<50*	2.6E＋072.35E＋088.60E＋081.40E＋098

* 하나의 샘플에 근거함

뱃치 발효 2일 이후에 생존률은 90% 이상이었고, 겔 비드내의 세포 농도는 10배 증가하였다. 또한, 90% 이상 성장한 세포는 겔에서 발효 벌크 액상으로 방출되기 시작하였고, 액체 농도 10⁷세포/㎖로 산출되었다. 작은 이스트 콜로니는 도 25.에 나타난 바와 같이 개별 세포에 존재하는 많은 싹 흔적(bud scars)과 함께 겔 비드 내에서 형성되었다.

고정화 이스트 세포 생존률은 가스 부양 바이오리액터에서 연속 발효 2달 후에 감소되었으나, 벌크 액상에서의 세포는 높은 생존률(90% 이상)로 남아 있고, 이러한 결과는 파일럿 스케일 가스 부양 바이오리액터에서 여러 다른 연속 발효하는 동안에 지지된다. 도 26의 SEM은 2개월에 이스트의 대형 콜로니가 비드의 외피로 형성되었음을 보여주고 있고, 이로서 다른 발명가들의 결과를 확인한다(Bancel and Hu, 1996; Godia et al., 1987; Wada et al., 1979; Wang et al., 1982). 겔 비드 중앙에 위치한 이스트와 고정화 세포 비드의 바깥 가장자리에 위치한 이스트의 형태학상의 비교는 SEM 이미지를 이용하는 여러 가지 샘플로 만들어졌다. 비드 외피에 위치한 세포은, 이스트 증식을 나타내는 많은 싹의 흔적(도 27)으로 매끄럽고 난형이었다(Smart, 1995). 비드의 중앙에 나타난 세포(도 28)은 기형이면서 동시에 싹 흔적 형성의 징후가 거의 나타나지 않았다. 싹 흔적의 결핍은 비드의 중앙에 산소 등의 영양물질의 한계를 가리키는 것일지도 모른다. 도 28의 이스트 표면에서 관찰된 표면 이상은 세포 에이징을 나타내는 것일지도 모른다(Barker and Smart, 1996; Smart, 1999).

카라기난 겔에서의 고정화 이스트의 생존률은 가스 부양 바이오리액터에서 연속 발효 6개월 후에 50% 이하로 떨어졌다. 고정화 세포 농도 및 생존률의 하나의 데이터 포인트에서만 6개월에서 모인 반면에, 5개월에서의 데이터는 고정화 세포 농도 겔 1.14×10 세포/㎖ 및 50% 이하의 생존률과 유사하였다. 고정화 세포 생존률의 점진적인 감소는 시간에 걸쳐 나타난 반면에, 벌크 액상에서의 세포 생존률은 신뢰할 수 있을 만큼 높았다. 게다가, 고정화 세포 생존률은 전체적으로 비드에서 낮았다 하더라도, 연속 발효 6개월에 바이오리액터는 완전하게 발효된 맥주를 생산했다. 이러한 발견은 발효에 대한 높은 유리 현탁 이스트 세포 덕분에 가능하였다. 마찬가지로, 비드의 중앙에 위치한 세포와 비교한 바와 같이, 대량으로 변형하는 장애가 적은 겔 비드의 외피에 위치한 고정화 세포의 잠재적인 공헌이 있다. 고정화 세포가 겔 매트릭스에서 스스로 재분산하는 능력이 있는지, 또는 이들 세포가 처음 위치한 곳에서 정지한 상태로 있는지는 불확실하다. 10 세포/㎖ 겔 비드 농도는 연속 발효 6개월 이상 이들 비드에서 최대치에 도달하였다.

도 29에서, 전체 비드는 SEM을 사용하여 나타났다. 비드는 실험된 많은 비드에서 중앙부 및 구조의 거의 중간부에 중공을 가지고 있었다. 중공은 카라게닌 겔 구조가 퇴화된 결과이며, SEM 제제에 의해 더욱 촉진되었다. 중공은 신선한 비드 제제에서는 관찰되지 않았다. 다른 연구자들의 선행 연구(Bancel et al., 1996)는 성장하는 세포가 겔 네트워크를 약하게 만들었다는 사실을 보여준다. Audet et al.(1988)은 박테리아 고정화를 위해 겔 비드의 역학적인 강화를 변형하는 카파 카라기난에 구주콩(locust bean)을 첨가한다고 보고하였다.

맥주 발효 실험 5개월 전체에 걸쳐, 가스 부양 바이오리액터는 일주일에 최소한 1회 오염 실험이 되었다. 실험중 어느 지점에서도 세균 오염은 발견되지 않았다. 실험의 마지막 2개월에, 오염된 이스트는 1과 5 cfu/㎖ 사이를 오르내리는 농도로 나타났다. 당해 이스트는 37℃에서 PYN 배지에서 성장가능하였으나, 덱스트린을 발효하지 않은 DUBA 배지(선택 박테리아)에서 호기적 또는 혐기적으로 성장하지 않았고, CuSO₄배지(선택 와일드 이스트)에서 성장하지 않았음을 보여주었다.

5개월 후, 호흡작용에 결함이 있는 이스트 세포의 평균 %는 7%이었고, 이는 산업용 뱃치 발효(평균 2%)시, 스트레인을 이용하는 보통으로 발견되는 것 보다 높았다. 다른 연구자들은 유사한 연구결과를 발표하였다(Norton and D'Amore, 1995). 호흡작용에 결함이 있는 이스트는, 이스트를 이산화탄소 및 물에 호흡작용이 불가능한 글루코오즈가 되도록 야기하는 변형에서 기인한다. 이들 이스트는 영구적인 감소하는 활성을 가진 미토콘드리아를 가지며, 대체로 미토콘드리아 DNA의 변형으로 인해 발생한다.

SEM 샘플 제제로부터의 인공물은 혼동을 야기시킬 수 있다. 핵자기공명(NMR) 분광(Fernandex, 1996) 등의 기술 및 공초점 현미경 검사(Bancel and Hu, 1996) 고정 세포 비간섭을 실험하는데 계속 사용되어 왔다. NMR 이미지 기술은 연구자들이 바이오필름에서의 세포 및 생화학의 운송, 유동, 일부 분배에 대한 연구를 가능하게 했다. 또한, 연구자들은(Bancel and Hu, 1996) 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사가 일련의 광학 절단을 통해 젤라틴 다공 미세담체에서 고정화된 세포를 관찰하는데 이용되었다는 사실을 보여주었다.

메틸렌 블루가 맥주 양조 산업에서 세포 생존률의 표준 지시약으로 이용된다고 하더라도, 이러한 방법은 많은 결점을 가지고 있다(Mochaba et al., 1998). 당해 방법은 이스트 분표가 생존 가능한지 또는 생존 불가능한지를 염료를 무색 형상으로 산화하는 생존가능한 세포의 능력에 근거하여 측정한다. 생존 불가능한 세포는 염색을 산화하는 능력이 결핍되어 있고, 따라서 블루상태로 남아있다(O'Connor-Cox et al., 1997). 플레이트 계수 및 슬라이드 배양 기술은 한천배양지의 매크로콜로니 또는 현미경 슬라이드에 커버된 배지의 마이크로콜로니를 성장, 생산하는 능력에 기초한다(Technical Committee nd Editorial Committee of the ASBC, 1992). 현재 수행중인 추가 시간에서의 고정화 매트릭스의 이스트 생존률 실험에서 Labatt사는 메틸렌 블루 뿐만 아니라, 생체 염색을 이용하는 공초점 현미경 기술의 발전 및 전술한 방법도 사용하고 있다. 세포 생존률 측정과 더불어, 앞으로의 연구에서는 고정화 세포의 생존률이 밝혀져야 할 것이다. 생존률이 성장 및 재생산하는세포의 능력을 기술하는데 사용된 경우에는, 생존률은 변형에서 회복되는 이스트 발효의 능력, 진행, 활성을 측정한다(Smart et al., 1999).

7장. 연속 가스 부양에서의 향미 제조

맥주 발효 시스템

7.1 실험과정

맥주 제조를 위해 연속 발효를 이용하는 것은, 최종생산물이 에탄올과 같은 하나의 중요한 성분으로 측정되지 않기 때문에 고정화 세포를 이용하는 다른 출원과는 매우 상이하다. 맥주 제조를 위해 연속 발효를 이용하는 것은, 오히려 양질의 완성품을 만들기 위해 균형을 유지해야 할 수많은 화학 성분의 균형이다. 1차 연속 발효시 및 2차 뱃치 저장 시간에 이스트 향미 대사산물에 대한 산소의 효과를 실험하였다. 또한, 향미 대사산물에 대한 잔류시간의 효과도 2단계로 실험하였다. 마지막으로, 연속 발효 맥아즙 써플라이에 α-아세토락테이트 데카르복실라제라는 상업용 효소제를 첨가하고, 액상 총 디아세틸 농도를 관찰하였다.

7.1.1 1차 연속 발효시의 이스트 대사산물에 대한 바이오리액터 유동 가스에서의 관련 공기양의 효과

바이오리액터 유동 가스에서의 공기 및 그에 따른 산소의 양은 변하였으나, 잔류시간, 온도, 및 기타 조절가능한 과정 변이는 변함이 없었다. 가스의 총 용량적 유동률은 동일한 온도/기압하에서 472 ㎖/분으로 변함이 없었고, 온도는 15℃이었으며, 고정화 LCC 3021 이스트를 함유하는 카파 카라게닌 겔 비드는 겔의 1×10⁸세포/㎖의 1차 세포 로딩으로 당해 실험에서 사용되었다. 공기의 4개의 서로 다른 용량적 유동률은 당해 실험(표 7.1) 내내 당해 시스템에 이용되었고, 평균 바이오리액터 잔류시간인 R_t는 1.18일이었다.

표 7.1. 살포기를 통해 바이오리액터에 공급된 연속 발효시 공기의 용량적 유동률. 바이오리액터에 공급된 총 용량적 유동률은 남아 있는 가스를 채우는 이산화탄소와 함께 동일한 온도/기압하에서 472 ㎖/분이었다.

공기 용량적 유동률 (㎖/min)	유동가스에서의 공기% (% v/v)	시작(일)	종료(일)	전체 시간(일)
94354340	19.975.07.20	10274159	26405866	1714188

아래의 분석은, 유리 아미노질소(FAN), 발효 가능한 총 탄산염(글루코오즈), 에탄올, 총 디아세틸, 휘발성 맥주(선택된 에스테르 및 알코올) 및 액상 이스트 세포 농도와 생존율 실험에서 반복적으로 행해졌다. 또한, 바이오리액터는 일주일에 최소한 1회에 걸쳐 오염 실험이 행해졌다.

바이오리액터의 벌크 액상에서의 용해 산소농도는, 연속 발효를 각각의 공기 용량적 유동률의 슈도 안정 상태로 가정했을 때 측정하였다(최소한 3회의 리액터 변화).

7.1.2. 포스트 발효 뱃치 저장 시간 : 이스트 대사산물에 대한 산소 노출의 효과 바이오리액터 유동 가스에서의 산소량이 비교적 낮더라도(동일한 온도/기압하 34 ㎖/분), 7.1.2.의 실험에서 발견된 아세트알데히드 및 총 디아세틸의 농도는 북미 대형 맥주 시장에서 중요하게 받아들여지지 않는다. 그리하여, 1차 연속 바이오리액터로부터 추출된 액체를, 이들 2개의 화합물의 농도가 줄어드는 온도인 21℃를 다소 상승시켜 48시간 동안 계속 뱃치하는 새로운 시도가 행해졌다. 또한 상기 7.1.2의 결과로부터, 유동가스에서의 산소양이 측정된 향미 화합물에서 갖는 현저한 효과가 나타났다. 따라서, 호기성 이스트 향미 대사산물 대 1차 발효에 따른 혐기성 조건에 대한 효과가 실험되었고, 여기서 2차 뱃치 저장이 발생하였다.

1차 연속 발효는, 연구를 위해 필요한 샘플의 양이 바이오리액터 8ℓ에 비하여 매우 많기 때문에, 당해 실험용 LCC3021 이스트 스트레인의 부유응집태의 이형을 사용하여 50ℓ 가스 배양 바이오리액터에서 수행되었다. 수행조건은 CO₂1180 ㎖/분, 유동가스에서 동일한 온도/기압하 공기 189 ㎖/분, 평균 바이오리액터의 잔류시간인 R_t,1일, 온도 15℃, 라거 양조업자의 맥아즙 고 비중 17.5。P이다.

4개의 샘플(100 ㎖ 크림프병)을 취하였는데, 2개는 혐기성 조건하에서 처리되었고, 나머지 2개는 호기성 환경에 노출되었다.

혐기성 샘플을 만드는 과정은 다음과 같다. 즉,

100㎖ 크림프병 2개 및 25㎖ 크림프병 6개를 가압멸균한 후, 정화 가스인 아르곤으로 혐기성 상자(미국, mbraun, Labmaster 100)에 놓았다. 2개의 100㎖ 병을45분간 균형되게 한 후, 알루미늄캡 및 Teflon 격막을 이용하여 씨일(seal)하였다. 70%(v/v) 에탄올 용액을 이용하여 살균시킨 16게이지 바늘과, 3인치로 된 하나의 50㎖ 주입기를, 샘플 밸브막의 격막에 구멍을 뚫음으로써 바이오리액터로부터 샘플을 제거시키기 위해 사용하였고, 당해 샘플을 미리 정화된 100㎖ 혐기성 병에 주입하였다. 주입하는 동안에, 병에 있던 압력이 방출되도록 무균세척 처리된 추가된 바늘을 통해 크림프병에 공기구멍을 만들어야 할 필요가 있었다. 주입기 및 바늘을 사용하지 않고, 100㎖ 씨일되지 않은 샘플병에 박막 샘플밸브를 완전히 열어 바이오리액터로부터 호기성 샘플들을 배출하기 때문에, 호기성 샘플들은 대기중에 노출되었다.

샘플 액체는 이스트를 용액에서 침전시키기 위해 2시간 동안 상온에 방치하여 벌크 액체의 세포 농도가 약 10⁶세포/㎖이 되었다. 침전이 되면 액체를 각각의 100㎖ 병에서 3개의 25㎖병으로 가만히 따랐다. 혐기성 샘플은 산소 체취량을 최소화하기 위해 혐기성 박스에서 다루는 반면, 호기성 샘플은 박편으로 되어 있는 유동 후드에서 진행되었다. 100㎖ 병에 있는 각각의 샘플들은 3개의 작은 25㎖ 병에 나누어 넣었으므로, 샘플분석은 샘플제거에 따른 발효과정을 변경하지 않고 수행할 수가 있었다. 호기성 샘플이 작은 병에 옮겨지면, 21℃에서 뚜껑을 개방한 채로 배양하였다. 혐기성 샘플들은 3개의 작은 병에 옮겨져 알루미늄캡 및 Teflon 격막을 이용하여 씨일하였다. 병 속에서 이산화탄소 형성으로 인한 압력 집중을 막기 위하여, 외부 환경에 노출된 호기성 샘플이 드러나는 것을 방지하는 동안, 격막에 바늘로 구멍을 뚫었다. 외부환경에 노출된 바늘의 선단은 에탄올(압력수두 1㎝ 이하)에 담궈 샘플 속에 공기 역류가 발생하지 않게 하였다. 분석을 위해 2, 24, 및 48시에 샘플을 모았다. 1개의 샘플은 바이오리액터로부터 직접 추출하여 프로토콜(protocol)시에 바이오리액터 사이에서 발효상태에 접근하기 위해 즉시 분석하였다. 샘플들은 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈), 에탄올, 총 디아세틸, 휘발성 맥주(선택된 에스테르 및 알코올)용으로 분석하였다.

7.1.3. 맥주 1차 연속 발효시의 이스트 대사산물에 대한 약체잔류시간의 효과

이스트 대사산물 활성에 대한 액체잔류시간의 효과를 실험하기 위하여, 카파 카라게닌 겔 비드에서 고정화된 LCC3021 이스트 세포를 사용하여 맥주 1차 연속 발효를 진행하는 동안, 바이오리액터에 대한 맥아즙 용량적 유동률에서 단계 변화된 실험이 행해졌다. 바이오리액터 온도는 실험 내내 17℃로 유지하였다. 또한, 바이오리액터에 제공된 가스 용량적 유동률은 동일한 온도/기압하에서 472 ㎖/분으로 유지하였다. 가스는 공기(동일한 온도/기압하에서 11 ㎖/분)와 이산화탄소(동일한 온도/기압하에서 461 ㎖/분)의 혼합물이었다. 카파 카라게닌 겔에서의 이스트 세포의 1차 농도는 겔 비드 2.6×10⁷세포/㎖이었고, 바이오리액터는 40%(v/v) 비드를 함유했다.

다음 분석은 탄화수소, 유리 아미노질소(FAN), 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈), 에탄올, 총 디아세틸, 휘발성 맥주(선택된 에스테르 및 알코올), 액상 이스트 세포 농도 및 생존율 실험에서 반복 수행되었다. 바이오리액터는 일주일에 최소 1회에 결쳐 오염 시험이 행해졌다.

7.1.4. 맥주 1차 연속 발효시의 총 디아세틸을 감소시키기 위한 상업용 α-아세토락테이트 데카르복실라제 제제의 사용

대부분의 북미 맥주 양조업자는 높은 디아세틸 농도가 맥주에서 바람직하지 못한 향미의 결점이 된다고 생각하고 있다. 현재까지 수행된 1차 연속 발효에서, 총 디아세틸 농도는 북미의 라거 맥주에서 전통적인 뱃치 발효(70 내지 150 □g/ℓ)의 시발단계보다 높았다. 뱃치 발효시, 산소가 더 이상 존재하지 않고 당이 첨가되지 않을 때, 디아세틸은 발효 단계의 후반에 감소한다. 연속 발효 시스템에서, 불변의 낮은 레벨의 산소는 살포기를 통해 바이오리액터에 제공하며, 새로운 맥아즙을 계속적으로 바이오리액터에 제공한다. 그리하여, 상업용 효소 제제를 사용하는 새로운 전략은 연속 바이오리액터에서 디아세틸 농도를 조절하게 하였다.

맥아즙 발효에서 디아세틸은, valine 합성의 중간생성물인 α-아세토락테이트가 이스트 세포 외부에서 산화 탈탄소화될 때 형성된다. 그 후, 이스트 세포는 디아세틸을 재흡수하고, 이를 적은 향미 활성 아세토인으로 변형시킨다. 디아세틸에 대한 당해 α-아세토락테이트의 산화 탈산소는 뱃치 맥아즙 발효에서 수치가 한정된다. 연속 발효하는 동안 총 디아세틸은 바람직하지 않은 농도(300 내지 400□g/ℓ)에서 바이오리액터를 제거한다. Novo-Nordisk AS사의 상업용 효소인 α-아세토락테이트 데카르복실라제(ALDC)는 α-아세토락테이트를 직접 아세토인으로 변형할 수 있기 때문에 소망하지 않는 디아세틸 중간생성물을 회피할 수 있다(도 7.1)(Jepsen, 1993).

도 7.1 α-아세토락테이트 데카르복실라제(ALDC)의 작용

총 디아세틸 농도에 대한 순수한 효과를 실험하기 위하여, α-아세토락테이트 데카르복실라제는 바이오리액터에 부양된 맥아즙에 첨가되었다. Alpha-Laval(Anon, 1997)의 기술인 포스트발효 48시간의 뱃치 웜 홀드 시간 및 2차 고정화 발효 시스템을 포함하여 디아세틸을 감소시키기 위한 또 다른 전략도 개발되었다. 이들 전략은 디아세틸 레벨 포스트 발효를 감소시키는데 성공하였음을 보여주고 있으나, 양자 모두 소스에서(즉, 바이오리액터 아울렛(outlet)에서) 디아세틸의 레벨을 나타내지는 못하였다. 바이오리액터로부터 배출되는 디아세틸 농도를 감소시키는 맥아즙의 ALDC를 사용함으로써 포스트발효 처리시간은 최소화되거나 없어질 수 있었다.

ALDC 활성은 10℃에서 라거 맥아즙 pH 6.0이 가장 바람직하다. 전형적인 산업용 맥아즙 pH 5.0의 경우, ALDC 활성은 35℃에서 최대화된다(Anon, 1994). 따라서, 하강한 온도 및 pH의 전형적인 맥주 발효 조건하에서 ALDC 활성은 바람직하지 못하다.

1997년 Health Canada는, 알코올음료에 ALDC를 사용하도록 허가하는 캐나다 식품의약에 관한 법률(SOR/97-81)을 개정하였고, 캐나다 맥주 양조업자에게 그의 사용을 허가하였다. 바실러스 브레비스로부터 ALDC(E.C.4.1.1.5)를 코드하는 유전자인 바실러스 섭틸러스는 효소 ALDC를 생산한다. ALDC는 유전자변형식품(GMO)으로 생산된 효소이므로, 상업용 제품에서 효소 등을 사용하기 전에 이러한 사실을 고지해야 할 필요가 있다는 논의가 일고 있다.

라거 이스트 LCC3021은 당해 실험에서 사용되었다. Labatt London brewery는 17.5。P 고비중, 라거 맥주 양조업자의 맥아즙을 공급하였다. 에탄올, 총 발효가능한 탄산염(글루코오즈), 총 디아세틸, 액상 세포 농도를 관찰하였다. 이스트 세포는 4장에서 기술한 바와 같이, 카라 카라게닌 겔 비드에 고정화되었다. 바이오리액터는 슈도 안정 상태에 이른다고 가정되기 전에 3회의 반응변화가 허용되었다. 전술한 바와 같이, 당해 발명에서 사용된 디아세틸 방법은 "총 디아세틸"이라고 한다. 당해 방법은 디아세틸 및 그에 앞선 α-아세토락테이트의 양을 측정하기 때문이다. 따라서, 당해 실험에서 관찰된 총 디아세틸의 감소는 α-아세토락테이트를 아세토인 및 이후의 낮은 농도의 유도체인 디아세틸로 직접 변형시키는 효소의 결합효과 때문일 것이다.

α-아세토락테이트 데카르복실라제(ALDC)는 상품명 Maturex L로서 덴마크 Novo Nordisk A/S가 실습용 기증품으로 제공하였다. 효소의 활성은 1500 ADU/g이었고, 여기에서 ADU는 Novo Nordisk Method AF27(Anon, 1994)에 기술된 바와 같이, 1분당 아세토인 1μ㏖을 생산하는 α-아세토락테이트의 탈탄소에 의한 표준조건하에서의 효소의 양을 가리킨다.

연속 발효 조건: 연속발효는 고정화 라거 이스트 세포를 함유하는 카파 카라기난 겔 비드의 40%(v/v)에서 피치(pitch)된 8L 가스 부양 드래프트 튜브 바이오리액터에서 수행되었다. 바이오리액터는 이산화탄소(동일한 온도/기압하 438 ㎖/분) 및 공기(동일한 온도/기압하 34 ㎖/분)의 혼합물로 살포되었다. 발효온도는 실험 내내 15℃에서 조절되었고, 바이오리액터 잔류시간 R_t는 1.5일이었다. 총 디아세틸 농도는 이들 조건하에서 관찰되었고 평균 슈도 안정 상태 조절 디아세틸 농도는 도달하였다. 그 후, ALDC는 72 □g/ℓ(108 ADU/ℓ)의 농도에서 맥아즙에 첨가되었고,바이오리액터에서의 총 디아세틸 농도는 반응으로서 관찰되었다.

실험 1 : 맥아즙을 브루하우스(brewhouse)로부터 20ℓ 스테인레스 스틸 용기에 모으고, 100℃에서 45분간 가압 멸균하였다. 바이오리액터를 부양하는 동안, 맥아즙은 조절된 water bath 온도에서 2℃로 유지하였다. 바이오리액터 내에 슈도 안정 상태의 총 디아세틸 농도가 도달하면, ALDC 72 □g/ℓ(108 ADU/ℓ)를 20ℓ 용기내 맥아즙에 첨가하였다. 카파 카라기난 겔 비드의 1차 바이오 매스 로딩은 겔 3×10⁷세포/㎖이었다.

실험 2 : 오염의 위험을 최소화하기 위해서, 4장에서 기술한 바와 같이, 당해 시스템은 아울렛(outlet)에서 루프로 완료되고 다른 업그레이드는 시스템을 만들었다. 실험 1에서와 같이, 맥아즙을 브루하우스(brewhouse)로부터 20L 스테인레스 스틸 용기에 모으고, 100℃에서 45분간 가압멸균하였다. 바이오리액터를 부양하는 동안, 맥아즙은 조절된 water bath 온도에서 2℃로 유지하였다. 카파 카라게닌 겔 비드로 로딩하는 1차 바이오 매스는 겔 3×10⁷세포/㎖이었다. 바이오리액터 내에 슈도 안정 상태 총 디아세틸 농도가 도달하면, ALDC 72 □g/ℓ(108 ADU/ℓ)를 20ℓ 용기내 맥아즙에 첨가하였다.

실험 3 : 비산화 양조 맥아즙(14hL)을 파이럿 플랜트의 커다란 맥아즙 저장용기(T-1)에 모았다. 그 후, 5장에서 기술한 바와 같이, 0.10 mg/ℓ이하의 불변의 용해 산소 농도를 유지하기 위해 순간 저온살균하고, 이산화탄소 살포로 저장하였다. 슈도 안정 상태 총 디아세틸 농도가 도달할 때까지 맥아즙은 당해 용기의 바이오리액터로 부양되었다. 그 후 ALDC(72 □g/ℓ)를 무균적으로 실험의 잔여 맥아즙에 첨가하였다. ALDC의 첨가는 저장용기에 남아있는 맥아즙의 양을 측정함과 동시에, 목표 농도 72 □g/ℓ(108 ADU/ℓ)까지 효소농도를 이르게 하는데 필요한 ALDC의 양을 산출함으로써 수행하였다. 그 후 적당한 효소의 양을 무균 맥아즙 10L에 용해하였다. 당해 용액을 20L 스테인레스 스틸 압력 용기에 옮기고, 그 병은 맥아즙 저장 병(T-1)에 샘플 포트로 무균 튜빙(tubing)하여 연결하였다. 그 후, 당해 ALDC 용액을 맥아즙 저장 병으로 무균 이산화탄소 압력을 이용하여 밀어 넣었다. 당해 ALDC 용액이 저장 용기내의 맥아즙과 함께 알맞게 혼합되게 하기 위하여, 탱크에 살포된 이산화탄소의 유동률은 동일한 온도/기압에서 1시간 동안 4720 ㎖/분으로 증가되었고, 그 후 본래의 유동률로 되돌아왔다. 그 후 당해 저장 탱크는 실험을 완성하기 위해 맥아즙을 첨가한 ALDC를 충분하게 유지하였다. 카파 카라기난 겔 비드로 로딩하는 1차의 바이오 매스는 겔 10⁸세포/㎖이었다.

7.2 결과 및 논의

7.2.1. 1차 연속 발효시의 이스트 대사산물에 대한 바이오리액터 유동 가스에서의 관련 공기 양의 효과

도 7.2 내지 7.11에서, 액상 이스트 생존율 및 세포 농도, 유리 아미노질소(FAN), 발효 가능한 총 탄산염(글루코오즈), 에탄올, 총 디아세틸, 아세트알데히드, 에딜아세테이트, 1-프로판올, 이소부탄올, 이소아밀아세테이트, 이소아밀알코올, 에틸헥사노에이트, 에틸옥타노에이트 농도는 연속 발효 시간에 대비하여 도표화된다. 바이오리액터 살포 가스에서의 공기 비율을 제외한 프로토콜 내내 모든 바이오리액터 수행 조건은 변함 없이 유지되고, 도에 직접 표시된다. 표 7.2에서 슈도 안정 상태(최소 3회 리액터 변화 후)에서의 각각의 분석 평균을 요약한다.

표 7.2. 슈도 안정 상태로 평균 1.18일의 잔류시간 Rt에서 바이오리액터에서의 키 이스트 대사산물 농도 및 액상 이스트에서 살포기를 통한 바이오리액터의 용체 측정 유동률의 효과 요약표

평균*분석 농도	공기 유체측정 유동률 (㎖/분)
	94	354	34
세포 농도 (세포/㎖)총 발효가능한 글루코오즈 (g/100㎖)FAN (㎎/ℓ)에탄올 (g/100㎖)총 디아세틸 (ug/ℓ)아세트알데히드 (㎎/ℓ)에틸아세테이트 (㎎/ℓ)1-프로판올 (㎎/ℓ)이소부탄올 (㎎/ℓ)이소아밀아세티이트 (㎎/ℓ)이소아밀알코올 (㎎/ℓ)	3.87E＋081.36196.96.1434675.6222.3844.748.730.3858.62	2.98E＋081.25171.75.461417329.4821.1350.8916.090.2161.64	4.73E＋082.07162.85.7438928.6318.0153.048.050.3059.16

평균 분석공기 용량적 유동률 (㎖/분)

에틸헥사노에이트 (㎎/ℓ)0.0600.0300.053

에틸옥타노에이트 (㎎/ℓ)0.0310.0130.025

* 각 수행 조건의 최종 4일의 평균

도 7.2. 및 7.3.은 액상 이스트 분포가 당해 실험에서는 "0"에 도달하지 않았음을 나타낸다. 당해 발명에서 연구된 향미 화합물은 유리 또는 고정화된 이스트 세포의 조합에 의해서 생산되고, 각각의 원인으로부터 상대적 기여는 결정되지 않았다. 당해 발명에서 유리로 정지된 이스트 세포는 1개 이상이었다. 즉, 겔 비드에서 벌크 액체 배지로 방출된 세포 및 바이오 매스 성장이다. 당해 연구는 세포 방출 및 성장 모델로서, 세포가 바이오필름으로부터 계속 떨어지고 있을 동안에 높은 희석 수치가 바이오리액터를 작용하더라도 생성된 액체에 세포는 여전히 분포되어 있을 것이라는 사실을 나타내고 있다.

도 7.2. 액상 이스트 세포 농도 대 관련 연속 발효 시간. 살포기를 통한 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

도 7.3. 액상 이스트 생존율 대 관련 연속 발효시간. 살포기를 통한 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

도 7.4.에서, 유리 아미노질소(FAN)의 액체 농도가 추적되었다. 최소 FAN 농도가 공기 중의 동일한 온도/기압하에서 34 ㎖/분에 발생했다는 것은 흥미로운 사실이었다. 이것은 최대 에탄올 농도 또는 최소 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈) 농도와 일치하지 않았다. 바이오리액터 액상에서 에탄올 농도가 감소한 반면에, 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈)은 도 7.5.에 나타난 바와 같이 94에서 354 ㎖/분으로 살포 가스의 공기의 용량적 유동률이 증가한 경우에 증가하였다. 발효와는 달리 세포 호흡은 산소 획득가능성이 증가함에 따라 더 많이 발생하였음을 나타낼 것이다. 용량적 유동률이 동일한 온도/기압하에서 354 ㎖/분에서 34 ㎖/분으로 다시 감소되었을 때, 에탄올 농도는 다시 증가하였으나, 유동률이 동일한 온도/기압하에서 94 ㎖/분이었을 때 나타난 농도에 도달하지 않았다. 동일한 온도/기압하에서 34 ㎖/분 에탄올 농도와 94 ㎖/분에서의 에탄올 농도를 구체적인 조건으로 비교하기는 어렵다. 왜냐하면 세포 에이징(cell aging), 동일한 온도/기압하 354 ㎖/분에서 매우 높은 산소양의 연속 노출 효과, 및 고정화 세포 분포의 변화로 인해 시스템에 영향을 주는 다른 요인이 있기 때문이다. 도 2.4에서, White and Portno(1978)는 연속 발효 시간에 따른 이스트 향미 대사산물 농도의 변화를 그들의 타워 발효기에서 알아냈다.

도 7.4. 맥아즙 내에 남아 있는 유리 아미노질소 농도 대 관련 연속 발효시간. 살포기를 통한 동일한 온도/기압에서의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

도 7.5. 액상 에탄올 및 발효 가능한 총 탄산염(글루코오즈) 농도 대 관련 연속 발효 시간. 살포기를 통해 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

도 7.6.에서, 총 디아세틸 생산에 대한 산소의 명백한 효과가 나타난다. 디아세틸은 일반적으로 맥주에서 바람직하지 못한 향미화합물로 여겨지고 있고, 바이오리액터에서의 산소양을 최적화하는 주요 이유 중의 하나는 향미화합물의 레벨을 조절하는 것이다. 기체상 354 ㎖/분 이후에, 유동률은 동일한 온도/기압하에서 34 ㎖/분로 떨어졌고, 총 디아세틸은 감소했다. 뱃치 발효시, 증가된 산소는 디아세틸의 전 형태인 α-아세토락테이트의 형성을 증가시키게 한다고 알려져 있다(Kunze, 1996).

도 7.7에서, 살포 가스에서의 공기양과 아세트알데히드 농도 사이의 관계가 명백하게 나타났다. 살포 가스의 공기 비율이 증가함에 따라 아세트알데히드의 양도 또한 증가했다. 아세트알데히드는 맥주를 green-apple적으로 만들어 주고, 20 ㎎/ℓ 이하의 레벨에서 본래 상업용 맥주로 존재된다.

도 7.6. 액상 총 디아세틸 농도 대 관련 연속 발효 시간. 살포기를 통해 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

도 7.7. 액상 아세트알데히드 농도 대 관련 연속 발효 시간. 살포기를 통해 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

표 7.2 및 도 7.8 내지 7.9에서, 에틸아세테이트, 이소아밀아세테이트, 에틸 헥사노에이트, 에틸옥타노에이트의 슈도 안정 상태 농도는 연속 발효 시간에 대비된다. 측정된 모든 에스테르에서, 탄산가스 포화처리 수치에 있어서 동일한 온도/기압하 94에서 354 ㎖/분으로의 단계변화는 농도를 감소시켰다. 탄산가스 포화처리 수치가 동일한 온도/기압에서 354 ㎖/분에서 34 ㎖/분로 감소하였을 때, 이소아밀아세테이트, 에틸헥사노에이트, 에틸옥타노에이트의 농도는 증가하였다. 그러나, 94 ㎖/분 탄산가스 포화처리 수치에서 보여진 수치로 증가하지는 않았다. 에틸헥사노에이트 및 에틸옥타노에이트와 함께 서로 밀접하게 조화된 이들 화합물의 반응패턴은 이소아밀아세테이트 보다 더 관계있는 변화를 보여주고 있다. 에틸아세테이트의 농도는 공기의 용량적 유동률이 동일한 온도/기압하에서 34 ㎖/분으로 감소하였을 때 실제로 더 감소하였다. 본 연구에서 측정된 모든 에스테르에 있어서, 농도는 공기가 유동가스에서 완전하게 제거되었을 때 증가했음을 나타냈다. 각각의 에스테르 농도는 상승한 후, 액상 세포 농도가 바이오리액터에서 급속하게 감소함에 따라 차차 줄어들었다.

도 7.8. 에틸아세테이트 농도 대 관련 연속 발효 시간. 살포기를 통해 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

도 7.9. 액상 이소아밀아세테이트, 에틸헥사노에이트 및 에틸옥타노에이트 농도 대 관련 연속 발효 시간. 살포기를 통해 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

고급 알코올 이소아밀알코올, 이소부탄올, 및 1-피로판올 대 연속 발효 시간은 도 7.10 및 7.11에 나타내었다. 측정된 알코올에 있어서, 농도는, 동일한 온도/기압하에서 94 ㎖/분에서 354 ㎖/분으로 탄산가스 포화처리에서의 단계변화 증가로 인해 증가하였다. 이소부탄올은 탄산가스 포화처리 수치가 변화하였을 때 가장 관계깊은 변화를 나타내었다. 1-프로판올 농도는 향미의 시발수치 600 내지 800 ㎎/ℓ 훨씬 이하이었다. 그러나, 연속 발효 실험에서는, 농도는 전형적인 상업용 뱃치로 생산된 맥주에서 발견된 것 이상이었고, 여기서 농도는 평소와 같이 16 ㎎/ℓ이하이었다. 이는 통상적인 범위 내에 있는 이소아밀알코올 또는 이소부탄올에 있어서만이 아니었다. 화합물 1-프로판올은 프로피오네이트(Gee and Ramirez, 1994)가 감소함에 따른 것이라고 생각된다. 나머지는(Hough et al., 1982; Yamauchi et al., 1995) 해당 옥소산 및 각각의 알데히드 □-옥소부티릭산 및 프로피리오닐알데히드와 함께 아미노산 □-아미노부티릭산 및 트레오닌의 대사산물에 대한 1-프로판올의 형성과 관련이 있었다.

도 7.10. 액상 이소아밀알코올 및 이소부탄올 농도 대 관련 연속 발효 시간. 살포기를 통해 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

도 7.11. 액상 1-프로판올 농도 대 관련 연속 발효 시간. 살포기를 통해 바이오리액터에 제공된 동일한 온도/기압하의 공기 용량적 유동률을 그래프상에 나타낸다. 가스의 잔여물은 이산화탄소이며, 총 용량적 가스 유동률은 실험 내내 동일한 온도/기압에서 472 ㎖/분으로 연속되었다.

과잉 디아세틸, 아세트알데히드 및 퓨젤알코올은 맥주에 바람직하지 않기 때문에, 제조를 한정하는 산소를 조절하는 것이 중요하다. 문헌연구에서 논의된 바와 같이, 이스트 세포에 대한 산소의 제공이 증가할 때, 아미노산 전 형태의 강화된 동화 작용의 형성이 있어 고알코올, 옥소산, 디아세틸의 유출이 있었다. 에스테르의 농도는, 에스테르 형성이 아세틸 전이효소에 의해 촉매작용을 하여 산소 ??득가능성의 증가를 감소시킨다고 알려져 있다. 불포화지방산 및 에르고스테롤은 아세틸 전이효소의 화학반응을 억제하고, 이는 교대로 산소존재를 증가시킬 것이다(Nortonand D'Amore, 1994).

당해 실험의 바이오리액터 조건에 있어서, 바이오리액터의 액상에서 측정된 슈도 안정 상태(최소 3회의 리액터 변화 후)의 용해 산소 농도는 "0"에 가까웠다(.03 ㎎/ℓ 이하).

당해 실험은, 유동가스에서 동일한 온도/기압하 공기 94 ㎖/분 및 34 ㎖/분은 가장 높은 공기 유동 수치(354 ㎖/분)에 의해 분리되기 때문에, 자료를 직접 비교하도록 허용하지 않는다. 왜냐하면 상기 바이오리액터 조건, 고정화 매트릭스, 및 연속 발효 시간이 노출됨에 따라 이스트의 생리학적 상태가 향미제조에 다른 변화를 일으킬지도 모르기 때문이다.

당해 실험을 수행하면서 어느 지점에서도 바이오리액터에서 오염이 발견되지 않았다.

이스트 생존율을 유지하는 산소에서의 이스트의 필요 및 바람직한 향미 프로파일을 갖는 맥주를 얻기 위한 산소를 최소화할 필요의 균형을 맞추기 위하여, 아연, 마그네슘과 같은 영양물을 첨가하거나, 또는 생존율을 유지하는 이스트 세포가 요구하는 기타 외생 화합물을 제공하는 등의 다른 방법이 개발될 수 있었다. 이러한 첨가방법은 이스트의 산소 필요를 더욱 감소시킬 것이다. 또 다른 가능성은 샐 생존율을 유지하는 통상적인 근거로 이스트에 제공된 산소의 주기적인 파동으로 대부분의 시간에 낮은 산소 농도로 수행되는 것이었다.

7.2.2. 포스트 발효 뱃치 저장 시간: 이스트 대사산물에의 산소노출의 효과

총 디아세틸이 1차 발효의 마지막에 상업용 맥주의 통상 범위에 속하여 있지 않았기 때문에, 바람직한 단계로 화합물의 농도를 감소시키는 여러 가지 시도가 있었다. 하나의 시도로서, 1차 연속 발효에 이어 즉시 웜 저장 시간을 이용하는 것이 있었다. 도 7.12 내지 7.21에서, 액상 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈), 에탄올, 총 디아세틸, 아세트알데히드, 에틸아세테이트, 1-프로판올, 이소부탄올, 이소아밀아세테이트, 이소아밀알코올, 에틸헥사노에이트 농도는 포스트 발효 저장 시간에 대비하여 도시화되었다. 슈도 안정 상태에서 1차 연속 발효기로부터 수집된 샘플은 각각의 도의 범례에 나타난 바와 같이 호기성 및 혐기성 조건하로 유지되었다.

도 7.12에서, 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈)의 농도는 처음 2시간 동안 급속히 감소하였고, 그 후 호기성 및 혐기성 샘플에서 남은 저장 시간동안 서서히 감소하였다. 처음 2시간 동안, 이스트는 따르기 전에 더 많이 존재하였고 당의 농도는 저장 시간이 시작 초기에 더 높았기 때문에 이렇게 관찰되었다. 처음에는 여러 가지 차이점이 나타났으나, 호기성 및 혐기성 샘플 사이에서 발효가능한 글루코오즈 흡수(uptake)에 현저한 차이는 없었다.

도 7.13에서 에탄올의 농도는 저장 시간 초기에 매우 빠르게 증가하였고, 그 후 호기성 및 혐기성 샘플은 거의 유사한 방법으로 에탄올 농도 초과 시간을 증가시켰다. 혐기성 샘플에서의 에탄올의 최초 증가는 거의 모든 당 흡수가 일어난 시간과 일치하였다. 저장 시간 마지막에 에탄올 농도는 혐기적으로 처리된 샘플에서더 높았다.

도 7.12. 발효가능한 평균 글루코오즈 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다.

도 7.13. 평균 에탄올 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.14에서, 호기성 샘플은, 바이오리액터 외부에서 호기성 조건에의 노출에 의해 아세트알데히드가 초기 증가하는 사실을 나타냈다. 당 소비 및 에탄올 제공과 함께 호기성 조건의 조합으로 결과를 설명할 수 있었다. 48시간 저장 시간의 마지막까지 아세트알데히드의 농도는 혐기성 샘플에서 17 ㎎/ℓ에서 9 ㎎/ℓ로 떨어졌고, 이는 액체 농도를 품질 좋은 북미 라거의 spec으로 만들었다(10 ㎎/ℓ 이하).

총 디아세틸의 농도 대 저장 시간은 도 7.15에 나타냈다. 본 결과로부터, 저장 시간 동안에 시스템으로부터 산소를 제거하는 것은 디아세틸 감소에 더욱 바람직한 조건을 제공한다는 사실을 알 수 있다. 총 디아세틸 곡선 그래프의 모양은 유리 아미노질소 감소 및 그 이후의 valine 세포사이의 생산과 관련이 있을지도 모르고, 당해 디아세틸은 2차산물이다(Nakatani et al., 1984a; Nakatani et al., 1984b). 1차 연속 발효 마지막에는 총 디아세틸 농도가 326 □g/ℓ이었으며, 혐기성 저장 시간의 마지막에는 농도가 33 □g/ℓ이었고, 이는 시판 맥주의 향미 시발수치 보다 훨씬 못하였다.

도 7.14. 평균 아세트알데히드 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.15. 평균 총 디아세틸 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.16 내지 7.18에서, 에스테르 에틸아세테이트, 이소아밀아세테이트, 에틸헥사노에이트 농도는 포스트 발효 저장 시간에 대비하여 도시화된다. 호기성 및 혐기성 샘플의 패턴은 모든 에스테르에서 동일하게 관찰되었다. 에스테르의 농도는 저장 시간까지 호기성 및 혐기성 샘플 사이에서 달라지지 않았고, 호기성 샘플에서의 에스테르의 농도는 감소하였으며 혐기성 샘플에서의 에스테르의 농도는 증가하였다. 연속 발효에서 에스테르의 농도는 시판 맥주에서 발견되는 에스테르 농도에 비하여 다소 낮기 때문에, 조건을 선택하는 것이 바람직하고, 에스테르 제품이 더바람직하다.

도 7.16. 평균 에틸아세테이트 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.17. 평균 이소아밀아세티이트 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.18. 평균 에틸 헥사노에이트 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.19. 내지 7.21는 이소아밀알코올, 1-프로판올, 이소부탄올 농도 대 포스트 발효 저장 시간을 나타낸다. 48시간 저장 시간의 마지막에, 혐기성 및 호기성 처리에서 이들 알코올은 현저한 차이점이 관찰되지 않았다. 그러나, 24시간 샘플은모든 호기성 처리에서 높은 농도가 나타났다.

도 7.19. 평균 이소아밀알코올 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.20. 평균 1-프로판올 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.21. 평균 이소부탄올 농도 대 가스 부양 바이오리액터에서의 1차 연속 발효 후의 호기성 및 혐기성 처리 샘플의 포스트 발효 저장 시간. 오류 막대는 실험 데이터의 상하 제한을 나타낸다(n=2).

도 7.22에서, 레이더 그래프는 48시간 호기성 및 혐기성 저장 시간후 몇몇 향미 화합물과 시판 맥주의 프로파일을 비교하게 한다. 레이더 그래프는 일반적으로 맥주 양조 산업에서 상이한 맥주의 성질의 다양성을 실험하고 비교하도록 하는 데 이용된다. 상기 도(그림)로부터, 혐기적으로 연속 발효된 맥주는 전형적인 시판 맥주에 가장 근접하다는 것을 알 수 있다. 부록 6으로부터, 1-프로판올의 경우를 제외하고 혐기성 액체는 시판 맥주의 표준의 범위 내에 있었고, 뱃치 발효된 맥주 보다 현저히 높았다는 사실을 알 수 있다. 표준의 1-프로판올 보다 고급인 이것은본 발명으로부터 연속 발효된 제품 모두에서 관찰되었다.

1-프로판올은 1차 연속 발효 단계시에 발생하였고, 호기성 조건 또는 혐기성 조건을 불문하고 저장 시간 중에 현저하게 감소하지 않았다. Kunze(1996)는 혼합, 맥아즙의 집중 탄산가스 포화처리, 이스트에의 신선한 맥아즙의 반복 추가라는 요소가 뱃치 발효시에 1-프로판올 등의 고급 알코올을 증가시킬 것이라고 한다.

궁극적으로, 1차 연속 바이오리액터 중 조건을 최적화함으로써 2차 저장 기간을 완전히 제거하는 것이 이상적인 시나리오일 것이다. 그러나, 2차 저장 시간 중의 추가 감소는, 저장 온도(이스트에 의해 제거된 디아세틸은 온도에 매우 의존적이다), 저장 기간의 초기에 액체 중에 잔존하는 발효 가능한 당의 양, 및 저장 용기의 수력학적 특성(디아세틸 제거는 이스트와 맥주사이에 접촉을 향상시킴으로써 향상된다)을 최적화하고, 이 단계에서 산소를 제거하는 측정을 취함으로써 단기간에 이루어진다.

용량적 맥주 생산성의 환산은 부록 3에 나타낸다. 당해 section에서 기술한, 48시간 뱃치 저장에 이은 24시간 잔류시간으로 연속 바이오리액터 작업된 공정은 현재의 산업 뱃치 공정보다 1.8시간 생산적이다. 여기에 기술된 연속 공정은 0.165㎥ 생산된 맥주/(㎥ 용기량×일)의 생산성을 갖지만, 7.5일의 주기 시간을 갖는 상당히 빠른 산업 뱃치 공정은 0.093㎥ 생산된 맥주/(㎥ 용기량×일)이라는 맥주 생산성을 갖는다. 추가 연구가 만약 뱃치 저장 기간을 24시간으로 짧아지게 한다면, 맥주 생산성은 산업용 뱃치 기준 보다 2.3시간 더 생산적이다. 뱃치 저장이 없는 24시간 연속 공정이라는 이상적인 시나리오가 이루어진다면, 맥주 용량적 생산성은뱃치 기준 생산성인 7.5시간이 될 것이다. 증가된 용량적 생산성과 함께, 시장 출시로의 빠른 시간, brewhouse 사이즈의 감소, 및 이스트 증식과 같은 뱃치에서 연속 공정으로 옮겨감으로써 인식된 추가 이익은 관련 작동 비용의 신중한 분석과 균형되어야 한다.

다른 연구자(Kronlof 및 Virkajarvi, 1996; Nakanishi et al., 1993; Yamauch et al., 1995)는 연속 발효(호기성)의 제 1단계가 맥아즙에 존재하는 발효 가능한 당의 일부 소비에서 일어나는 복수 단계 연속 발효를 개발하는 것에 초점을 맞췄다. 이 전략은 향미 생산의 점에서 어느 정도 성공을 나타냈으나, 이 시스템은 복잡하다. 또한, 이와 같은 시스템의 제1 호기 단계는 미생물로 오염(즉, 높은 당 노도, 온도 및 산소, 저농도의 에탄올)되기 쉬운 환경을 창출한다. 본 발명에서 제시된 가스 부양 바이오리액터에서, 바이오리액터는 낮은 정상 상태 발효 가능한 당 농도, 낮은 pH, 높은 에탄올 농도, 및 낮은 산소 농도를 가져 오염되기 쉬운 환경을 만든다.

도 7.22에서, 호기성 및 혐기성 저장 시간 48시간 후 몇몇 향미 화합물의 비용가 허용되었다.

도 7.22. 가스 부양 바이오리액터의 1차 연속 발효 이후 호기성 또는 혐기성 저장 48시간 후에 얻은 표준 농도 데이터의 레이더 그래프. 표준 데이터는 두 개의 샘플의 평균에 기초하고 있으며, 시판 맥주에 대한 데이터는 부록 6에 열거된 데이터의 중간지점을 차지하고 있었다.

7.2.3. 1차 연속 맥주 발효시의 키 이스트 대사산물에 대한 액체잔류시간의 효과

도 7.23. 내지 7.28은 분석결과를 바이오리액터의 액상으로부터 얻었음을 나타낸다. 표 7.3.에서, 슈도 안정 상태(최소 3회의 바이오리액터 변화 시간 후)에서 측정된 자료의 평균농도 및 가유동률가, 당해 실험에서 사용된 두 개의 액체 잔류시간에 열거되었다. 액상 이스트 생존율은 바이오리액터에서 맥아즙의 유동률이 증가할 때 현저하게 변화하지는 않은 반면, 이스트 세포의 농도는 도 7.23.에서와 같이 변화하였다.

표 7.3. (a) 액상 이스트 및 키 이스트 대사산물 농도에 대한 바이오리액터 잔류시간의 효과, 및 슈도 안정 상태에서의 평균값을 나타낸 요약표; (b) 액상 이스트 및 바이오리액터 outlet에서의 키 이스트 대사산물 유동률에 대한 바이오리액터 잔류시간의 효과, 및 슈도 안정 상태에서의 평균값을 나타낸 요약표

(a) 평균 분석 농도	바이오리액터 잔류시간
	1.8일	0.9일
세포 농도 (세포/㎖)총 발효가능한 글루코오즈 (g/100㎖)FAN (㎎/ℓ)에탄올 (g/100㎖)총 디아세틸 (ug/ℓ)아세트알데히드 (㎎/ℓ)에틸아세테이트 (㎎/ℓ)1-프로판올 (㎎/ℓ)이소부탄올 (㎎/ℓ)이소아밀아세티이트 (㎎/ℓ)이소아밀알코올 (㎎/ℓ)	2.38E＋080.29106.35.1629219.4741.0044.9522.780.9076.67	1.32E＋086.09246.44.8046037.0738.2913.539.131.2851.39

(b) 평균 분석 유동률	바이오리액터 잔류시간
	1.8일	0.9일
세포 농도 (세포/㎖)총 발효가능한 글루코오즈 (g/100㎖)FAN (㎎/ℓ)에탄올 (g/100㎖)총 디아세틸 (ug/ℓ)아세트알데히드 (㎎/ℓ)에틸아세테이트 (㎎/ℓ)1-프로판올 (㎎/ℓ)이소부탄올 (㎎/ℓ)이소아밀아세티이트 (㎎/ℓ)이소아밀알코올 (㎎/ℓ)	7.38E＋088.93E-033.65E-041.60E-019.06E-076.04E-051.27E-041.39E-047.06E-052.80E-062.38E-04	8.22E＋083.72E-011.50E-032.93E-012.81E-062.26E-042.34E-048.25E-055.57E-057.30E-063.13E-04

도 7.23. 액상 이스트 세포 농도 대 관련 연속 발효 시간, 바이오리액터에서의 액상 잔류 시간의 효과. Rt는 수일 후의 액체 잔류 시간이다.

도 7.24 및 7.25에서, 맥아즙 기질 유리 아미노질소(FAN)의 농도 및 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈)은 모두 액상 잔류시간이 1.8에서 0.9일로 감소하였을 때 증가하였다. 표 7.4의 부피 균형으로부터, 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈)의 소비 수치는 증가한 반면, 유리 아미노질소 소비 수치는 바이오리액터 잔류시간이 감소함과 동시에 감소하였다. 발효가능한 글루코오즈 기질로부터 발효 산물 에탄올의 산출요소인 Y_P/S는 0.3에서 0.5로, 액체 잔류시간이 감소함과 동시에 증가하였다. 시스템이 공기와 이산화탄소로 살포되었기 때문에, 기체상에서 아마도 에탄올은 손실이 적었고, 에탄올의 균형에 영향을 가함으로써 산출요소 Y_P/S에 충격이 있었을 것이다. Budac과 Margaritis (1999)의 공동연구에서 수행된 연구조사는 기체 크로마토그래프 매스 스팩트로스코피 테크니크(GC-MS)를 이용하여, 에탄올, 아세트알데히드, 에틸아세테이트, 이소아밀아세테이트를 포함하는 휘발성 맥주의 향미가 연속 발효시에 기체 부양 바이오리액터 헤드스페이스(headspace)에서 관찰되었다는 사실을 효과적으로 증명하였다.

도 7.24. 액상 에탄올 및 발효 글루코오즈 농도 대 관련 연속 발효 시간, 바이오리액터에서의 액체 잔류 시간의 효과. Rt는 수일 후의 바이오리액터 액체 잔류시간이다.

도 7.25. 액상 유리 아미노질소 및 1-프로판올 농도 대 관련 연속 발효 시간, 바이오리액터에서의 액체 잔류 시간의 효과. Rt는 수일 후의 바이오리액터 액체 잔류시간이다.

표 7.4. 유리 아미노질소에 대한 부피 균형 및 표 7.3의 평균 데이터에 기초한 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈), 잔류 시간의 효과

잔류시간	1.8일	0.9일	1.8일	0.9일
	유리 아미노질소(g/분)	발효가능한 총 글루코오즈(g/분)
Inlet *Outlet소비 (△S)산출요소(YP/S)	8.84E-043.65E-045.18E-04	1.74E-031.50E-032.35E-04	4.71E-018.93E-034.62E-010.3	9.26E-013.72E-015.54E-010.5

* 부록 1의 Inlet 농도

발효 산물 에탄올의 액체 농도는 액체 잔류시간의 단계 변화와 함께 감소하였다. 그러나 시스템 전체는 빠른 액체 잔류시간에서 대량의 유동률을 기초로 더많은 에탄올을 생산해내고 있었다. 왜냐하면 본 발명의 목적은 단리된 에탄올을 생산하는 것이 아니라, 에탄올의 생산성을 최대화하는 여러 성분이 다른 요소와 균형을 이루는 맥주를 제공하는 것이기 때문이다. 시판용 1차 맥주 발효의 마지막에 발효 글루코오즈 부양물의 대부분이 소비되어야 한다.

도 7.26.에서, 맥아즙 유동률에서의 단계 변화에 대한 아세트알데히드 및 총 디아세틸 농도의 반응이 나타난다. 양자 모두 액체 잔류시간이 감소하였을 때 농도 및 생산 수치가 증가하였다. 뱃치 맥주 발효시, 아세트알데히드는 처음 발효하는 수일 동안 이스트에 의해 분비되었다(Kunze, 1996).

도 7.26. 액상 총 디아세틸 및 아세트알데히드 농도 대 관련 연속 발효 시간, 바이오리액터에서의 액체 잔류 시간의 효과. Rt는 수일 후의 바이오리액터 액체 잔류시간이다.

도 7.25 및 7.27은 고급 알코올 1-프로판올, 이소부탄올 및 이소아밀알코올의 액체 농도에 대한 바이오리액터 잔류시간의 감소에 따른 효과를 나타낸다. 3개의 모든 고급 알코올은 바이오리액터 잔류시간이 감소했을 때 농도가 감소하였다.

도 7.27. 액상 이소부탄올 및 이소아밀알코올 농도 대 관련 연속 발효 시간, 바이오리액터에서의 액체 잔류 시간의 효과. Rt는 수일 후의 바이오리액터 액체 잔류시간이다.

표 7.3(b)에 나타난 에틸아세테이트 및 이소아밀아세티이트의 대량 유동률은 모두 액체 잔류시간이 감소함에 따라 증가하였다. 도 7.28에서, 에틸아세테이트의 액체 농도는 감소한 반면, 이소아밀 아세티이트는 증가하였다. 본 실험은 시스템에 산소 써플라이를 증가시키지 않고 액상 세포 성장이 증가하게 하므로, 바이오리액터에서의 조건이 에스테르 생산을 촉진시켰다. Hough et al.(1982)는 증가된 성장및 감소된 산소 조건이 에스테르 형성을 촉진한다고 한다.

도 7.28. 액상 에틸아세테이트 및 이소아밀아세테이트 농도 대 관련 연속 발효 시간, 바이오리액터에서의 액체 잔류 시간의 효과. Rt는 수일 후의 바이오리액터 액체 잔류시간이다.

7.2.4. 1차 연속 맥주 발효시 총 디아세틸을 감소시키는 상업용 α-아세토락테이트 데카르복실라제 제제의 사용

실험 1 : 본 실험이 완료되기 전에 Gram 양성 구균의 호기성 성장으로 바이오리액터가 오염되었다. 맥아즙 써플라이의 미생물학적 테스트에서는 오염이 전혀 없었기 때문에 바이오리액터 그 차체가 오염된 것으로 판명되었다. 이것은 오염에 대한 향상된 세이프가드로 바이오리액터의 업그레이드가 필요하다는 사실을 지적하였다. 그러나, 시스템이 종료되기 전, ALDC가 맥아즙 써플라이에 첨가되었을 때 총디아세틸 농도가 감소된다는 것이 관찰되었다. 그러나, 불행하게도 바이오리액터 오염에 대한 혼동되는 효과 때문에 상기 데이터로부터 어떠한 결론도 유도해 낼 수 없었다.

실험 2 : 수많은 바이오리액터의 업그레이드의 결과, 시스템은 실험 2 내내 오염 없이 진행되었다. 당해 실험 데이터는 도 7.29 내지 7.31.에 나타낸다. 표 7.5에서, 맥아즙에 첨가된 ALDC 전후의 총 디아세틸의 평균 슈도 안정 상태 농도를 요약하였다. 총 디아세틸 농도는 맥아즙에의 ALDC 첨가로 인해 47%까지 떨어졌고, 이는 장래에 효소를 사용하도록 만들었다(3회의 바이오리액터 반응 후의 평균). 도 7.30 및 7.31에 나타난 바와 같이, 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈) 및 세포 농도는 본 실험 동안에 다소 동떨어졌고, 이는 ALDC 첨가 전후에 바이오리액터에 제공된 맥아즙의 약간의 차이에 의한 것일지도 모른다.

도 7.29. 액상 총 디아세틸 농도 대 연속 발효 시간, 맥아즙 발효 배지의 ALDC 추가에 따른 효과, 실험 2

도 7.30. 발효가능한 액상 탄산염(글루코오즈) 및 에탄올 농도 대 연속 발효시간, 맥아즙 발효 배지의 ALDC 추가에 따른 효과, 실험 2

도 7.31. 액상 세포 농도 대 연속 발효 시간, 맥아즙 발효 배지의 ALDC 추가에 따른 효과, 실험 2

맥아즙 생존율에 혼동을 일으킬 수 있는 효과를 제거하기 위하여, 실험 3에서, 슈도 안정 상태 베이스라인이 도달되면, brewhouse(14 hL)에서 대량의 맥아즙을 취하고, ALDC를 저장 용기에 남아 있는 맥아즙에 직접 첨가하였다. 또한 이는 실험 2의 발효 수행에 영향을 미칠 수 있는 맥아즙에 대한 모든 잠재 모순을 제거하였다. 당해 맥아즙 저장용기는 또한 카본디옥사이드 살포되었기 때문에 맥아즙 써플라이의 용해 산소 레벨은 낮은 레벨로 계속 유지되었다.

실험 3 : 도 7.32 내지 7.34는 맥주 연속 발효시 총 디아세틸, 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈), 에탄올, 및 유리현탁된 세포 농도에 대하여, 맥아즙 써플라이의 추가 ALDC의 효과를 나타낸다. 표 7.6은 또한 맥아즙 써플라이에 대한 ALDC의 추가 전후로 평균 슈도 안정 상태 총 디아세틸 농도를 나타낸다(3회의 바이오리액터 변화 후의 평균). 당해 실험시 어떠한 지점에서도 오염이 발견되지 않았다. 총 디아세틸의 농도는 ALDC의 추가에 따라 45%까지 감소하였다. 에탄올, 발효가능한 총 탄산염(글루코오즈) 또는 유리현탁된 세포 농도에서는 유의할 만한 어떠한 차이도 관찰되지 않았고, 이는 Aschengreen과 Jepsen(1992)의 뱃치 연구 결과와 일치한다.

도 7.32. 액상 총 디아세틸 농도 대 연속 발효 시간, 맥아즙 발효 배지에 ALDC 추가에 따른 효과, 실험 3

도 7.33. 액상 에탄올 및 발효가능한 총 당(글루코오즈) 농도 대 연속 발효 시간, 맥아즙 발효 배지에 ALDC 추가에 따른 효과, 실험 3

도 7.34. 액상 세포 농도 대 연속 발효 시간, 맥아즙 발효 배지에 ALDC 추가에 따른 효과, 실험 3

실험 2 및 3의 결과는, 가스 부양 바이오리액터에서 연속 발효하는 동안, ALDC가 총 디아세틸 농도에서 유의한 효과를 가지며, 총 디아세틸 농도 46%로 평균 감소한다는 사실을 나타낸다. 이는 연속 가스 부양 시스템에서 디아세틸 감소를 위한 2차 공정을 제거하거나 감소시킬 가능성이 있다. 이들 초기 실험에서는 ALDC의 높은 투여가 이용되었고, 효소를 공정에 사용한다면 맥아즙에서의 ALDC 투여의 양, 방법, 시간을 효과적으로 할 필요가 있을 것이다. 또한, 양조발효 조건하에서 효소가 높은 활성 레벨을 갖게 되거나, 또는 효소 자체가 고정화되어 다시 사용될 경우에는(Dulieu et al., 1996) 절약 또한 가능할 것이다. 유전자변형식품을 이용하여 제조되어 온 효소 첨가제를 수요자들이 수용할지를 또한 고려해야 할 것이다.

바람직한 투여양인 2 ㎏/1000hL, 및 상업용 효소 제제의 비용인 $131.05/㎏, $0.26/hL은 발효 재료 비용에 추가되어야 할 것이다. 수행된 실험에서 사용된 바와 같이, 효소 투여는 72 □g/ℓ (108 ADU/ℓ) 또는 7.2 ㎏/1000hL ALDC이었고, 추가 재료 비용은 $0.94/hL이 되었다. 가스 부양 연속 발효시 디알킬 감소를 위해 ALDC를 효율적으로 사용하는 것은 바이오리액터 조건하 및 그 사용에 의해 절약된 시간의 양에서 효소의 투여에 따라 달라질 것이다.

표 7.5. 가스 부양 바이오리액터에서의 맥주 연속 발효시, 총 디아세틸 농도에 대한 맥아즙 발효 중간체에 ALDC 추가에 따른 평균 슈도 안정 상태 효과의 요약

실험	평균 총 디아세틸 농도 (□g/ℓ)	디아세틸 감소 %
	(ALDC 비존재)		(ALDC, 6 □ℓ/ℓ)
실험 II실험 III	495445	260245	4745

* 3회의 리엑터 변화 후의 슈도 안정 상태 가치에 근거한 평균

다음의 내용은, 가스 부양 흡출관 바이오리액터 시스템에서의 고정화 이스트 및 결합된 유리 세포를 이용하는 연속 발효가 아래의 기준에 근거한 맥주 제조용 뱃치 발효의 실용적 대안이라는 제안을 지지한다.

- 완성된 향미의 조화

- 높은 바이오리액터 용량 생산성

- 최소 복잡성

- 증명된 장기 연속 작용

- 향미 조절을 위한 유동 가스에서의 공기(산소)의 조절

- 디아세틸 조절 옵션용 α-아세토락테이트 데카르복실라제 효소의 추가

- 무균 상태

- 경제적 이득

아직까지도 연구해야 할 많은 분야가 있으나, 그 기술은 광범위하게 실험되는 경향이 있다. 가스 부양 바이오리액터는 폐수 처리공정에서 이미 산업용으로 사용되고 있고, 이를 통해서 실현 가능한 기술적인 맥주 연속 발효 시스템에 이를 수있다고 전망된다. 네덜란드의 Grolsch brewery사는 폐수처리용 가스 부양 바이오리액터 230㎥를 사용한다고 보고되어 있다(Driessen et al., 1997).

양조 산업에서 시장 규모의 연속 발효에 진입하는 데 가장 큰 장벽은 전통에 깊이 묶인 산업에 양조업자의 새로운 방법의 수용일 것이다. 이 작업에서 수행된 연속 맥주 발효중 생산된 2차 이스트 대사산물에서 얻어진 데이터는 맥주 향미 형성용 유동 가스중 산소를 제어하는 것이 가장 중요한 초점이다. 주어진 작동 조건하에서, 바이오리엑터 유동 가스중의 증가된 공기는 아세트알데히드, 다아세틸, 및 고급알코올(이소아밀 알코올 및 이소부탄올)을 증가시키는 반면, 에스테르(이소아민 아세테이트, 에틸 헥사노에이트, 에틸 옥타노에이트) 및 에탄올의 농도는 저하됨을 발견하였다. 이들 데이터는 바이오리엑터 유동 가스의 조성을 통하여 맥주 향미를 제어하는 것이 가능하여 일정한 제품을 생산할 수 있음을 제시한다.

공기가 유동가스로부터 제거되는 경우를 제외하고, 10⁸세포/㎖이상의 유리 현탁 세포 농도는 바이오리엑터 액체상에서 유지된다. 그리하여, 이 시스템은 바이오리엑터, 고정화 이스트 및 액상 현탁 이스트중 공존하는 하나 이상의 이스트 세포의 번식을 가진다. 바이오리엑터 액상중 성장하는 대량의 생 이스트 때문에 이스트 번식자로서 연속 바이오리엑터를 사용하는 가능성이 존재한다.

2차 48시간 뱃치 저장 시간이 다음 연속 1차 발효 후에 첨가될 때, 시판 맥주 범위내의 향미 프로파일이 얻어진다. 이 기간의 온도는 21℃이고, 향미 형성 기간동안 액체의 산소에의 노출을 최소화하는 중요성은 실험실적으로 입증되었다.저장 기간의 부가는 공정 및 추가 복잡성 때문에 2일을 추가하나, 시판 뱃치 발효보다 여전히 유의하게 빠르며, 이것은 7일 및 14일 사이이다.

궁극적으로, 1차 연속 바이오리엑터중 조건을 최적화함으로서 2차 저장 기간을 완전히 제거하는 것이 이상적인 시나리오이다. 그러나, 2차 저장 시간중의 추가 감소는 저장 온도(이스트에 의해 제거된 디아세틸은 매우 온도 의존적이다), 저장 기간의 새기에 액체중 잔존하는 발효 가능한 당의 양, 저장 용기의 수력학적 특성(디아세틸 제거는 이스트와 맥주사이에 접촉을 향상시킴으로서 향상된다)을 최적화하고, 이 단계에서 산소를 제거하는 측정을 취함으로서 단기간에 이루어진다.

다른 연구자(Kronlof 및 Virkajarvi, 1996; Nakanishi et al., 1993; Yamauch et al., 1995)는 연속 발효(호기성)의 제 1단계가 맥아즙에 존재하는 발효 가능한 당의 일부 소비에서 일어나는 복수 단계 연속 발효를 개발하는 것에 초점을 맞췄다. 이 전략은 향산 생산의 점에서 어느 정도 성공을 나타냈으나, 이 시스템은 복잡하다. 또한, 이와 같은 시스템의 제 1 호기 단계는 미생물로 오염(즉, 높은 당 노도, 온도 및 산소, 저농도의 에탄올)되기 쉬운 환경을 창출한다. 본 작업에서 제시된 가스 부양 바이오리엑터에서, 바이오리엑터는 낮은 정상 상태 발효 가능한 당 농도, 낮은 pH, 높은 에탄올 농도, 및 낮은 산소 농도를 가져 오염되기 쉬운 환경을 만든다. 저개발 양조에서 복잡함을 최소화하고, 감칠 맛 나게 하고, 내오염 방법이 중요한 성공 인자이다.

연속 발효를 공급하는 맥아즙에 알파-아세토아세테이트 데카르복실라제(ALDC)의 시판 제제를 첨가하면 디아세틸을 평균 46% 저하시킴을 나타낸다. 그러나, ALDC가 유전자 변형 유기체(GMO)로 생산되는 효소이므로, 시판제품중 이와 같은 효소를 사용하기 전에 고지하여야 하는 공중 인식 문제가 있다. 또한, 디아세틸 제어용 시판 효소는 발효 조건하에서는 최적 활성도를 갖지 않는다.

카파-카라기난 겔 고정을 사용하는 6개월 이상의 연속 발효에서, 액상에서 유리 현탁 세포는 90% 이상의 생존율을 가지는 반면, 고정화 세포 생존도는 60% 이하로 감소된다. 스캐인 일렉트론 마이크로그래프은 겔 비드의 주위 근처에 위치한 세포는 다수의 발아 흔적과 정상적 몰포로지를 가지는 반면, 비드 코어 주위는 성장을 훼손하는 불규칙한 형상 및 소수의 발아 흔적을 갖는다. 또한, 마이크로그래프는 비드 코어 주위에 위치한 이스트가 숙성의 신호를 나타내는 것을 제시한다. 섹션 5에서 논의한 바와 같이, 카파-카라기난 겔은 소망의 이스트 고정 메트릭스를 만드는 많은 특성을 가진다. 그러나, 비드 제조용으로 입수할 수 있는 산업적 방법은 현재 없으며, 이스트가 비드 제조 고정의 일부로서 메트릭스내에 포촉되기 때문에 상업적 플랜트에서 비드 취급은 복잡하고, 비용이 올라간다. 자기 응집 또는 부유 응집과 같은 고정화 법은 미래 개발될 것이다. 이는 공장 환경에서 비드 취급의 복잡성이 제거될 것이고, 또한, 이스트 플록이 정규적 기초에서 부셔진다면, 숙성 세포는 바이오리엑터로터 규칙적으로 제거되는 것을 확보할 수 있다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명은 연속 발효법과 뱃치 발효법을 결합한 방법이며, 연속 단계는 수퍼부유 응집 이스트와 엄격한 산소 제어를 적용하는 가스 부양 바이오리엑터의 사용하고, 연속 단계는 연속 방법으로부터 배출된 "적어도 부분적으로 발효된"것을 마무리용 뱃치 공정으로 이송하여 고정된 및/또는 일부 발효된 맥아즙의 포스트-연속 단계 분배를 제공하여 맥아즙을 높은 순도로 유지하고, 향미를 개선하며, 맥주 생산성을 높이는 유용한 발명이다.

Claims (16)

1. 음용 알코올의 생산 방법에 있어서, 발효 가능한 당을 함유하는 맥아즙을 초기에 발효시키는 연속 발효단계를 채용하고, 이어서 연속 방법으로부터 배출된 "적어도 부분적으로 발효된"것을 마무리용 뱃치 공정으로 이송함을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 음용 알코올이 맥주인 방법.
3. 제 2항에 있어서, 맥주가 저알코올 맥주(pale style beer)임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 전술한 맥주가 라거임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 전술한 맥주가 북미 맥주임을 특징으로 하는 방법.
6. 맥아즙이 제한된 산소 공급으로 부유 응집 이스트 균주를 채용하는 가스 부양 바이오리엑터중 적어도 부분적으로 발효되는 맥주으 연속 발효방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 발효가 1차 발효임을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 연속 단계가 가스 부양 바이오리엑터중에 수행함을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 상기 연속 발효단계가 이스트 또는 부유 응집 이스트가 고정된 담체로 이루어진 군에서 선택된 "고정화된" 세포를 채용함을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 부유 응집 이스트가 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 1차 발효의 완료가 상기 뱃치 저장 단계에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항에 있어서, 디아세틸 농도 저하가 수행됨을 특징으로 하는 방법.
13. 제 11항에 있어서, 아세트알데히드 농도 저하가 수행됨을 특징으로 하는 방법.
14. 제 11항에 있어서, 고급 퓨젤 알코올의 농도가 실질적으로 뱃치 저장 가공 단계에 의해 영향을 받지 않음을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항에 있어서, 연속 발효단계로부터 배출이 상기 뱃치 저장 공정이 일어나는 복수의 뱃치 저장 용기의 하나에 대해 다기관을 통해 분배됨을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1항에 있어서, 연속 방법이 뱃치 저장 단계서 뱃치 발효 후에 핏칭 방법인 것을 특징으로 하는 방법.