KR20030096227A

KR20030096227A - 신경 및 신경정신 질환의 치료방법

Info

Publication number: KR20030096227A
Application number: KR10-2003-7005769A
Authority: KR
Inventors: 본회르슈텐슈테판; 카스크안츠; 데무트한스-울리히; 호프만마티아스; 크루버수잔네; 엔구옌후푸크
Original assignee: 프로비오드룩 아게
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-29
Publication date: 2003-12-24
Also published as: AU2177302A; ZA200302394B; IL155116A0; HK1062643A1; CA2424475A1; NO20031849D0; ES2309108T3; PT1328271E; CN1471392A; BR0114921A; CN101143217A; EP1328271A2; RU2286149C2; IL155116A; NO20031867D0; BR0114924A; KR20040025875A; NO20031867L; JP2004512300A; CN1278683C

Abstract

본 발명은 불안증, 우울증, 불면증, 정신분열증, 간질, 경련 및 만성 통증과 같은 정신신체 질환, 우울성 질환 및 신경정신 질환에 대해 사람을 포함하는 동물을 치료학적으로 치료하기 위한 방법을 기재한다. 적합한 DP IV 억제제의 투여는 인과적인 결론으로서 포유동물의 뇌에서 신경펩티드 Y(NPY)의 감소된 분해를 유도한다. 이러한 치료는 기능적으로 활성인 신경세포 NPY(1-36)의 농도의 저하시에 감소 또는 지연을 유발한다. 내인성 NPY(1-36)의 생성된 안정성의 향상으로 인해, NPY 활성이 연장되어 다른 효과 중에서도 기능적으로 활성인 NPY Y1 수용체가 활성이 되도록 하므로, 항우울 효과, 항불안 효과, 진통 효과, 항고혈압 효과 및 기타 신경학적 효과를 촉진시킨다.

Description

신경 및 신경정신 질환의 치료방법{Method for the treatment of neurological and neuropsychological disorders}

발명의 배경

발명의 분야

본 발명은 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV) 및 DP IV형 효소의 억제제를 투여함으로써 뇌 신경펩티드 Y(NPY) 시스템의 내인성 신경 및 신경정신 효과의 지속 또는 강화에 관한 것이다. 본 발명은 또한 중추 신경계(CNS)내에서의 NPY Y1 수용체 매개된 효과의 강화를 통하여 고혈압, 열병, 수면 장애, 식욕 부진, 우울증을 포함하는 불안 관련 질환, 간질을 포함하는 발작, 약물 금단 현상 및 알콜 중독, 인식 기능 장애 및 치매를 포함하는 신경 변성 질환, 및 정신 분열증을 포함하는 신경정신 질환의 치료에 관한 것이다.

DP IV 및 NPY

DP IV(CD26;EC 3.4.14.5)는 삼관능성 역할을 갖는 엑소펩티다제(exopeptidase)이다. DP IV는 T 세포 의존성 면역 반응[참조: Kahne et al., 1999; Korom et al., 1997] 및 전이[참조: Cheng et al., 1998; 2000]에서호르몬 및 화학 역동 현상[참조: Mentlein et al., 1999; Pauly et al., 1999]을 순환시키는, 폴리펩티드의 N-말단으로부터 Xaa-프로 디펩티드의 이완과 관계된다. DP IV는 N-말단 프롤린 및 알라닌 잔기를 제2 음절화한 후 펩티드를 선택적으로 분할한다. 이러한 효소에 대한 내인성 기질은 글루코즈 의존성 인슐린 친화성 폴리펩티드(예: GIP 및 GLP-1)와 같은 인크레틴(incretin)을 포함한다. DP IV의 존재시, 이러한 호르몬은 불활성 형태로 효소적으로 분해된다.

NPY의 회복

췌장 폴리펩티드 부류에 속하는 36개의 아미노산 펩티드인 신경펩티드 Y(NPY)는 먼저 1982년에 돼지 뇌로부터 분리되었다[참조: Tatemoto and Mutt, 1982]. NPY는 심혈관계를 자극하는 모든 교감 신경 속에 존재하며 뇌 및 심장 속에서 가장 풍부한 펩티드이다. 추가로, 쥐에서 NPY는 또한 혈소판 및 내피 조직에서 신경세포외로 발견되지만, 사람에게서는 발견되지 않는다[참조: Zukovska-Grojec et al., 1993]. 최초에, NPY는 강력한 혈관 수축제 및 신경 조절제로서 공지되어 있다. 스트레스, 운동 및 심근 허혈에 의해 방출된 NPY는 관상 동맥 심질환, 울혈성 심부전증 및 고혈압과 관련되어 있다[참조: Zukovska-Grojec et al, 1998]. 보다 최근에, 음식 섭취의 자극에 대한 NPY의 강력한 능력 덕분에, 비만 및 당뇨병에서 역할을 다할 것으로 생각된다[참조: Kalra et al., 1999]. 최근의 발견은 NPY가 또한 쥐 대동맥 혈관 연근 세포용 미토겐임을 나타낸다[참조: Zukovska-Grojec et al., 1999].

NPY 관련 연구는 적어도 3가지의 주요 방향, 즉 (1) 노르아드레날린을 사용한 동시 발현으로 인한 동시 전달 및 교감 혈관 수축; (2) 강력한 성취 효과로 인한, CNS내에서의 신결 전달 및 기능; 및 NPY가 가장 잘 보존된 공지된 생체 활성 펩티드 중의 하나이기 때문에 NPY의 진화에 초점을 맞춰 왔다[참조: Colmers and Wahlestedt, 1993; Lundberg, 1996; Wahlestedt and Reis, 1993; Wettstein et al., 1996]. NPY는 CNS에서 펩티드 약리학 및 독특한 분포에 변화를 주면서 적어도 6개의 수용체(Y1 내지 Y6)에 작용한다[참조: Gehlert, 1998](표 1).

NPY, NPY 수용체 아형 및 mRNA의 분포

사람 및 쥐 뇌의 CNS내에서의 NPY 자체, NPY 수용체 단백질 및 이의 mRNA의 분포는 최근에 검토되어 왔다[참조: Dumont Y, Jacques D, St-Pierre, J.-A., Tong, Y., Parker, R., Herzog H. and Qurion, R., 2000; in Handbook of Chemical Neuroanatomy, Vol. 16: Peptide Receptors, Part I; Quirion, R., Bjorklund, A. 및 Hokfeld, T., editors]. 간단한 조사는 표 1에 기재한다.

NPY 함유 뉴런은 사람을 포함하는 각종 종의 비점막에서 명백하며, 흔히 선포 및 혈관과 관련된다[참조: Baraniuk et. Al., 1990; Grunditz et. al., 1994]. 개에서 비점막(익돌관 신경)에 대한 부교감 신경 공급의 자극은 당해 구역에서 혈액 유동을 증가시키고 주로 아트로핀 자극을 유발한다. NPY의 정맥내 투여는 NPY Y1-선택적 작용제[Leu31, Pro34]NPY에 의해 모조되는 것이 아니라 NPY Y2 수용체 작용제 N-아세틸[Leu28, Leu31]NPY(24-36)의 투여에 의해 모조되는 효과인 교감 신경 자극으로 인한 혈관 확장을 감소시킨다[참조: Lacroix et al., 1994]. 이는 부교감 신경 말단으로부터 신경 전달 물질 방출의 NPY Y2형 접합전 수용체 매개된 억제와 일치한다.

NPY 수용체 기능

NPY는 CNS 및 말초 신경계(PNS)에서 넓은 분포를 갖는, 현재까지 발견된 가장 풍부한 신경펩티드임에는 이론의 여지가 없다. NPY는 펩티드 YY(PYY)(약 70% 상동성) 및 췌장 폴리펩티드(PP)(약 50% 상동성)와 함께 펩티드 부류를 형성하며; NPY와 PYY는 매우 생체 활성이 있는 반면, PP는 일반적으로 생체 활성이 훨씬 작다[참조: Gehlert, 1998; Wahlestedt and Reis, 1993](표 2).

NPY의 2개의 수용체 아형은 시험관내 검정 시스템에서 신경펩티드 Y와 비교하는 경우, 관련 펩티드 YY-(13-26)의 각추 동족체에 대해 상이한 반응의 기초하에 신경펩티드 Y Y1(접합전) 및 신경펩티드 Y Y2(접합전)이라고 불린다[참조: Wahlestedt et al., 1986]. NPY 신경 세포 접합전 수용체의 활성화는 일반적으로 신경 전달 물질을 방출시키는 데 작용하는 국소 인자에 반응하며 신경 충격에 반응하는 신경 전달 물질의 방출을 감소시키는 신경 활성을 억제한다. 접합전 또는 신경펩티드 Y Y2 수용체 분류는 펩티드 YY(13-36)의 작용을 기초로 하지만, 다수의 시스템에서 이러한 분자 뿐만 아니라 신경펩티드 Y-(13-36)는 혈압 상승 활동을 나타낸다[참조: Rioux et al., 1986; Lundberg, et al., 1988; Potter et al., 1989]. 이는 몇몇에 의해 몇몇 혈관층에서 접합전 막에 두 가지 형태의 신경펩티드 Y 수용체(둘 다 신경펩티드 Y Yj 및 신경펩티드 Y2)가 존재함을 나타내는 것으로 해석되어 왔다[참조: Schwartz et al., 1989]. 그러나, 이러한 분자들의 선택도 결여는 Yj 수용체에 대한 부분 길항 활동의 보존 때문일 수 있으며, 이는 감소된 기능적 반응을 유발할 수 있다. 이전에, 신경펩티드 Y의 13 내지 36개의 동족체, 즉 생체내 연구시 전체 신경펩티드 Y 분자와 등가의 접합전 활성을 나타내는 (Leu 17, Glu", Ala 21, Ala 22, Glu 23, LeU28, LeU31) 신경펩티드 Y-(13-26)(ANA 신경펩티드 Y-(13-36))이 기재되어 있다[참조: Potter et al., 1989].

이러한 이력학적으로 익히 정의되어 있는 신경펩티드 Y 수용체와는 달리, 다수의 기타 아형(Y3, Y4, Y5 및 Y6)의 존재는 약리학적 기준에 제시되어 있으며[참조: Michel et al., 1998], Y1, Y2, Y4 및 Y5에 상응하는 수용체의 클로닝에 대한 상세한 내용은 문헌[참조: Herzog et al., 1992; Gerald et al., 1995; Bard et al., 1995; Gerald et al., 1996](표 1)에 공지되어 있다. 이러한 각종 수용체 아형의 분포 및 생리적 유의성은 아직 정의되어 있지 않다. 몇몇 논쟁은 하나 또는 기타 수용체 아형에 대한 신경펩티드 Y의 각추 형태의 선택도에 대해 존재하지만[참조: Potter et al., 1989], 유출되는 영상은 접합전 및 접합후 수용체 아형으로 최초 분류를 지지한다. 하나의 신경펩티드 Y 수용체 아형을 구체적으로 발현하는 세포계가 개발되어 왔으며 신결 펩티드 Y의 수용체 선택적 동족체의 발달은 이러한 세포계에서 결합 특성에 주로 집중해 왔다[참조: Sheikh et al., 1989; Aakerlund et al., 1990 ; Fuhlendorff et al., 1990]. 보다 최근에, cDNA 부호화 신경펩티드 Y Y1 수용체는 클로닝되어 왔으며 클로닝된 수용체를 발현하는 세포계는 신경펩티드 Y 동족체의 특정 결합[참조: Herzog et al., 1992] 및 특정 동족체에 의해 유발된 기능적 반응) 둘 다에 대해 분석되어 왔다. 생체내 후속 연구와 결합된 이러한 결합 연구로부터, 2개의 동족체가 신경펩티드 Y Y1 접합후 수용체에 대해 구체적으로 작용하는 것으로 분류되어 왔다. 이러한 신경펩티드 Y Y 수용체 선택적 동족체, (Pro 34) 신경펩티드 Y 및 (Leu", Pro 34) 신경펩티드 Y는 혈압 상승시 신경펩티드 Y의 작용을 모조하며, 또한 신경펩티드 Y Y 수용체만을 발현하는 세포계, 예를 들면, 사람 신경모세포종 세포계 SK-N-MC 및 클로닝된 신경펩티드 Y Y 수용체를 발현하는 섬유모세포계에 대한 유사한 결합을 공유한다[참조: Herzog et al., 1992]. 신경펩티드 Y Y2 수용체 작용 뿐만 아니라, 생체내 심장 미주 신경 작용의 억제, 아세틸콜린 방출의 억제의 징후를 나타내지 않는다[참조: Potter et al., 1991; Potter 및 McCloskey, 1992].

CNS내에서의 NPY 수용체 아형의 분포 및 기능

수용체 아형	CNS 발현	기능	선택적 작용제	선택적 길항제또는 선택도
Y1	피질 등	불안증, LHRH 방출	무손상 N-말단:[Leu31, Pro34]NPY	BIBP3226:BIBO 3304
Y2	해마,시상하부	건망증 방지	C 말단 단부: PYY3-36;PYY13-36	T4[NPY(33-36)]4;BIIE0246
Y3	Ncl. 소뇌 단생(NTS)	서맥,고혈압	NPY>>PYY,[Leu31,Pro34]NPY	PYY-불감성
Y4	(DVC)	구토유발제	PP>>NPY,PYY	PP-우선
Y5(a)	시상하부	영양	NPY,PYY.[Leu31,Pro]NPY	[Leu31,Pro34]NPY-민감성, BIB3226-비가역성
Y5(b) 또는 Y6	시상하부	?; 종 특이성	?	?
표 1: CNS내에서의 NPY 수용체 아형; ? = 공지되지 않거나 조사되지 않음

고친화력, 비펩티드 NPY 길항제, BIBP3226 및 BIBO 3304의 개발은 당해 화합물이 적어도 Y2R, Y3R 및 Y4R에 대한 활성이 없는 Y1R에 대한 선택도를 나타내기 때문에 NPY 수용체의 기능적 특성화를 촉진시킨다[참조: Doods et al., 1996]. 최근, 2개의 Y2 수용체 길항제가 기재되어 있다. 그중 하나는 TASP-분자[참조: Grouzmann et al., 1997]이고, 다른 하나는 비펩티드 길항제[참조: Wieland et al., 1999]이며, 다른 비펩티드 길항제 특히 화합물은 시판된다[참조: Daniels et al., 1995]. 따라서, 뇌 속의 특이 수용체 차단은 중추 NPY 수용체에 의해 매개된 행동적 및 생리적 효과의 기능적 특성화를 허용한다. 또한, YIR이 결여된 쥐가 발생되고 시판된다[참조: Pedrazzini et al., 1998]. NPY형 면역 반응성 및 NPY 수용체 발현을 나타내는 뉴런은 CNS에서 풍부하며(표 1), 이는 아마도 시상하부 및 소위 대뇌 변연 구조에서 가장 투렷하게 발견되지만, 또한 뇌 줄기 모노아민성 뉴런 및 피질 GABA성 뉴런으로 동시 국한된다[참조: Chronwall, 1985; Dumont et al., 1996].

수용체 아형 및 펩티드 선택도

수용체 아형	펩티드 효능
Y1형
Y1	NPY = PYY = Pro³⁴-NPY > PP > NPY_13-36
Y4	PP ≫ NPY = PYY = LP-NPY > NPY_13-36
Y6	NPY = PYY = Pro³⁴-NPY > NPY_13-36> PP
Y2형
Y2	NPY = PYY = NPY_13-36> Pro³⁴-NPY > PP
Y5형
Y5	NPY = PYY = Pro³⁴-NPY > NPY_13-36> PP
클로닝되지 않음
PP 수용체	PP ≫ PYY = NPY
Y3	NPY = Pro³⁴-NPY = NPY_13-36≫ PYY
PYY-우선	PYY > NPY ≫ NPY_13-36≫ Pro³⁴-NPY
표 2: 1998년 겔러트(Gehlert)에 따르는 수용체 아형 및 펩티드 선택도

NPY, 불안증 및 우울증

NPY의 항불안제 등 효과는 상승된 추가 미로 시험(Montgomery), 고통받은 음용 시험(Vogel), 고통받은 반응 시험(Geller-Seifter) 및 벤조디아제핀의 효력 및 효능 시험[참조: Griebel, 1999; Heilig et al., 1989; Wettstein et al., 1995]을 사용하여 입증되었다. NPY는 신규성에 대한 반응에서 항불안에 대해 작용하며[참조: Heilig and Murison, 1987; von Horsten et al., 1998b], 상승된 추가의 미로 시험 및 기타 불안증 관련 시험에 대한 항불안제 등 효과를 생성시킨다[참조: Wahlstedt and Reis, 1993; Wahlestedt et al., 1993]. 흥미롭게도, Y1 수용체 항감각 치료된 쥐는 운동 활동 및 음식 섭취의 변경 없이 눈에 띄는 불안증 관련 행동을 나타낸다[참조: Wahlestedt et al., 1993]. 또한, 플린더(Flinder) 래트 균주에서, 우울증의 유전적 모델인 Y1 수용체 mRNA 발현은 상이한 피질 영역 및 해마의 치아 이랑에서 감소하는 반면, Y2 수용체 mRNA 발현은 대조군과 상이하지 않다[참조: Caberlotto et al., 1998]. 래트에서의 후각 망울 절제는 우울증의 모델로서 개발되어 왔다[참조: Leonard and Tuite, 1981]. 당해 모델에서, 대부분의 변화는 우울증 환자에게서 발견된 것과 유사하다[참조: Song et al., 1996]. 후각 망울 절제된 래트에서 NPY의 7일째 i.c.v. 투여는 당해 모델에서 행동 및 신결 전달 물질 결핍을 감소시킨다[참조: Song et al., 1996]. NPY Y1, Y2 및 가능하게는 Y5 수용체는 쥐류에서 불안증 수준의 조절에 포함되며 Y1 매개된 효과가 가장 특징적인 것으로 생각된다[참조: Heilig et al., 1993 ; Kask et al., 1998b]. 따라서, 내인성 NPY는 스트레스와 불안증에 대해 길항한다[참조: Heilig et al., 1994]. 또한, 이러한 데이타는 Y1 수용체 아형이 불안증 및 우울증 관련 행동과 관련될 수 있음을 제안한다. 추가로, 카스크(Kask)(1996) 등은 Y1 길항제인 BIBP3226의 i.c.v. 주사가 어떠한 운동 결핍도 없이 상승된 추가의 미로 시험에서 항불안제 등 효과를 발생시키는 것으로 보고하였다. 이러한 효과는 등쪽 수도관 주위 회색질(dorsal periaqueductal gray matter)에서 BIBP3226을 투여함으로써 재생될 수 있으나, 시상하부의 청반(locus coeruleus) 또는 뇌실결핵(paraventricular nucleus)에서는 재생될 수 없다. 또한, 등쪽 수도관 주위 회색질로 투여된 BIBP3226 및 GR231118은 래트에서 활성 사회적 상호 작용에서 시간 소모를 감소시킨다[참조: Kask et al., 1998d]. NPY의 스트레스 방지 작용에 중요한 뇌 영역은 편도[참조: Sajdyk et al., 1999, Thorsell et al., 1999],청반[참조: Kask et al., 1998c] 및 등쪽 수도관 주위 회색질[참조: Kask et al., 1998a, b]을 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 편도 NPY는 BIBP3226 또는 BIB03304를 사용한 NPYY₁R의 차단이 상승된 추가의 미로 시험 및 사회적 상호 작용 시험에서 측정된 불안증을 증가시키지 않는다[참조: Kask et al., 1998b; Sajdyk, 1999]. 그러나, 일정한 NPY성 색조는 등쪽 수도관 주위 회색질에 존재하지 않는 것으로 생각되며, 여기서, NPY Y₁R 길항제는 실험적 불안증 모델 둘 다에서 항불안제 등 효과를 갖는다[참조: Kask et al., 1998a,b]. 따라서, 특정 뇌 영역에는, NPY계를 통한 불안증의 긴장성이 조절될 수 있다.

CNS NPY계의 신경 및 정신생리학적 효과: 다면 발현

따라서, 다수의 연구는 CNS에서의 NYP 및 이의 동류물의 생리적 기능을 기재하고 있으며[참조: Kalra and Crowley, 1992; Dumont et al., 1992; Stanley, 1993; Wahlestedt and Reis, 1993; Grundemar et al, 1993; Gehlert, 1994,1998 ; Colmers and Bleakman, 1994; Wettstein et al, 1995; Heilig and Widerlow, 1995; Munglani et al., 1996; Inui, 1999; Bischoff and Michel, 1999; Vezzani et al., 1999], 넓은 범위의 효과를 입증하고 있다. 현재는 이러한 각종 생리적 기능의 이점을 얻기 위한 약리학적 접근이 존재하지 않는다.

벤조디아제핀 또는 NPY를 사용한 불안증 관련 질환의 치료시의 통상의 문제점

불안증 치료를 위한 통상의 방법은 여러 문제점이 수반된다:

항불안제로서 통상 사용되는 벤조디아제핀은 선택도가 낮거나 전혀 없는 비정상적 화합물이다. 항불안 활성 이외에, 벤조디아제핀은 진정 효과 및 항간질 효과를 나타내며 근육 이완에 영향을 줄 것으로 예상된다. 유감스럽게도, 이는 다수의 부작용, 즉 피로, 수면증, 집중력 부족, 주의력 및 반응성 감소와 관련된다. 벤조디아제핀의 만성 적용은 조화 운동 불능, 현기증, 반사력 소실, 근육 및 언어 장애와 같은 신경 질환을 유발한다. 벤조디아제핀을 사용한 장기 치료는 의존성 및 중독성을 수반할 것으로 예견된다.

환자의 불안증의 장기 치료를 위한 신경펩티드 Y의 직접 i.c.v. 투여는 적합하지 않다.

포유동물의 뇌에서의 DP IV 및 DP IV형 활성의 존재

하르텔-쉔크(Hartel-Schenk)(1990) 등은 면역 조직 화학 및 활성 조직 화학을 비교하여 출생한 후 임신 10, 16 및 21일째와 1, 4, 8, 13, 21, 26 및 60일째에 위스타(Wistar) 래트 기관에서 개발 동안에 DP IV의 발생을 연구했다. 모든 조사된 조직에서, 다클론 항체와의 면역 반응성은 DP IV보다 빨리 나타났으며 배아 및 배아밖(탈락막) 세포의 혈장막에서 임신 10일째에 이미 존재한다. 이러한 부위 및 기타 부위, 예를 들면, 뇌 모세관 내피 및 기관 또는 기관지 내피에서, 출생 및 효소 활성 후 감소되거나 소실된 다클론 항체를 갖는 면역 반응성은 개발되지 않는다. 단클론 항체를 갖는 면역 반응성은 다클론 항체를 갖는 면역 반응성보다 늦게나타나며 DP IV 활성이 후속적으로 발견되는 모든 구조에서 대부분 나타난다. 에피토프 D에 대한 단클론 항체는 부고환관, 신장 집합관 및 간세포 혈장막의 모든 영역에서 고반응성을 나타내는데, 이는 기타 항체와의 DP IV 활성 뿐만 아니라 면역 반응성이 관찰되지 않는다. 이 결과는 또한 DP IV가 촉매적으로 활성으로 되기 전에 분자로서 존재할 수 있으며 면역 반응성이 DP IV 활성보다 많은 부위에서 발생하는 것으로 나타난다. 면역 조직 화학 기술에 있어서는, 베른슈타인(Bernstein)(1987) 등이 사람 태아, 신생아 및 노인으로부터 유래된 뇌 물질에서 디펩티딜 아미노펩티다제 IV 면역 반응성의 존재를 조사하였다. 이는 효소 단백질이 미숙아 CNS에서 풍부하게 존재하는 것으로 밝혀졌다. 반면, 성인 사람 뇌는 디펩티딜 아미노펩티다제 IV 면역 반응성을 훨씬 덜 포함한다. 이는 효소가 구체적으로 특정 신경 영양 펩티드(IGF II, 성장 호르몬)에서 이의 가능한 작용에 관하여 신경 증식 및/또는 분화에서 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다. 아미노펩티다제 M(APM), 아미노펩티다제 A(APA), 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV) 및 γ-글루타밀 전이 효소(GGT)는 뇌실막, 맥락막총 및 연수막의 반응 패턴을 나타내기 위해 래트 뇌의 냉각기 단면에서 조직 화학적으로 입증되었으나, APA, APM 및 DP IV는 맥락총의 모세관 내피 뿐만 아니라 연수막에서 각종 활성을 나타냈다[참조: Mitro & Lojda, 1988]. 카토(Kato)(1979) 등은 래트 뇌에서 X-프롤릴 디펩티딜-아미노펩티다제 활성을 밝혀냈고 각종 연령에서 발육상의 변화를 검토하였다. 뇌 1개당 전체 효소 활성은 4주령이 될 때까지 증가하고, 이어서 성숙하는 동안에 감소한다. 어린 래트 뇌의 특정 활성은 성인 래트 뇌의 특정 활성보다 높다.뇌 효소의 특성은 뇌하수체 및 기타 조직의 특성과는 상이하다. 네쎌(Nassel)(2000) 등은 바퀴벌레 조직에서 프롤린 특이 DP IV 활성의 발생을 조사하였다. 부분적으로 정제된 DP IV 활성은 기질로서의 Gly-Pro-4-니트로아닐리드를 사용하여 L. 마데라(L. maderae)의 뇌 및 중간 창자로부터 특징지워진다. 높은 활성은 창자의 막 분획으로부터 수득되며; (단백질 1mg당) 약 10배 낮은 활성은 뇌 막으로부터 수득된다. 이는 기니 피그 뇌에서 전체 프롤린 후 디펩티딜-아미노펩티다제 활성의 55%가 세포의 가용성 분획과 관련되며, 나머지 활성은 미립 분획 전체에 걸쳐 널리 분포되어 있는 것으로 보고되어 있다. 그러나, 이러한 미립 활성의 중요한 부분은 시냅스 소체 막 분획과 관련된다[참조: O'Connor & O'Cuinn, 1986]. 빛 및 전자 현미경검사에 의한 조직 화학적 조사는 마카크(macaque) 털없는 피부의 마이스너 소체(Meissner corpuscle)에서 디펩티딜 펩티다제 IV가 존재함을 나타낸다. 효소 활성은 마이스너 소체 주위에 불완전한 캡슐을 형성하는 섬유아세포형 세포에서 발견된다. 디펩티딜 펩티다제 IV 활성으로 인한 분명한 전자 고밀도 반응 생성물은 감각 축색돌기의 민말이집 신경 세포 부분을 둘러싸는 특수한 슈완 세포(Schwann cell)의 혈장막에 일관되게 국소화된다. 이의 축삭집에는 디펩티딜 펩티다제 IV 반응 생성물이 없다[참조: Dubovy, 1988].

드 볼트와 미트로(De Bault & Mitro)(1994)는 래트 뇌활밑 기관(SFO), SFO의 표면을 덮는 뇌실막 및 인접한 뇌 구조의 혈관에서 막 프로테아제 글루타밀 아미노펩티다제(EAP), 미세 소체 알라닐 아미노펩티다제(mAAP), 디펩티딜 펩티다제 IV(DP 1V) 및 γ-글루타밀 트랜스펩티다제(γ-GTP)의 국소화를 검토하였다. 효소 조직화학 반응의 결과는 EAP, mAAP 및 γ-GTP에 대한 강한 활성을 나타내지만, 위의 발견과는 반대로 SFO의 미세 혈관에는 DP IV가 부재한다. SFO를 덮는 뇌실막은 γ-GTP에 대해 양성이지만, 다른 연구된 프로테아제에 대해서는 음성이다. 그 결과는 SFO의 대부분의 혈관에서 효소의 스펙트럼이 EAP, mAAP 및 γ-GTP에 대해 양성이지만 DP IV에 대해서는 음성인 인접한 뇌 조직의 미세 혈관의 효소의 스펙트럼과 유사함을 나타낸다. 홍(Hong)(1989) 등은 분자에 의한 DP IV의 조직 분포가 래트와 비슷한 것으로 평가했다. 면역블로트 분석에 의하면 DP IV가 신장, 폐 및, 고농도의 소장, 중간 농도의 간 및 비장, 및 저농도의 심장에 존재하는 것으로 입증되었다. DP IV에 대한 mRNA는 신장과 소장에서 고농도가 검출된 것에 비해, 폐, 간 및 비장에서는 중간 농도가 검출되었다. DP IV의 mRNA는 위, 고환, 심장, 근육 및 뇌에서 저농도로 발견된다.

발명의 요약

본 발명은 목적은 신경 및 정신생리학적 효과에 유리한 약물을 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 불안증을 포함하는 스트레스에 대한 행동 및/또는 신경학적 적응 반응에 유리한 약물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 포유동물의 뇌에서 NPY의 지속 또는 연장된 활성 및/또는 효과를 발생시키는 약리학적 접근을 제공함으로써 선행 기술의 위에서 언급한 문제점을 극복하거나 감소시키는 것이다.

당해 목적은 불안증을 포함하는 스트레스에 대해 행동 및/또는 신경학적 반응을 조절하기 위한 약물 제조용 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV 또는 CD26) 또는 DP IV형 효소의 억제제를 사용함으로써 해결된다.

이는 환자에게 진단된 불안증의 감소, 고혈압, 열병, 수면 조절 곤란증, 식욕 부진증, 우울증을 포함하는 불안증 관련 질환, 간질을 포함하는 발작, 약물 금단증 및 알콜 중독증, 울혈성 기능 장애 및 치매를 포함하는 신경 변성 질환, 정신 분열증을 포함하는 신경 정신과 질환의 치료를 포함하지만, 이로써 한정되지는 않는, NPY Y1 수용체에 의해 매개된 내인성 신경학 또는 신경정신학적 효과의 확대를 가져온다.

도 1은 하노버(HAN), 미국(USA), 독일(GER) 및 일본(JAP) 사육사들로부터 구입한 피셔(Fischer) 344(F344) 래트 아균주의 혈청에서의 DP IV 효소 활성을 도시한 것이다. 그 결과는 유전자형 1개당 4 내지 5세에 일치하는 동물의 평균(±SEM)이다. 분산 분석 결과, F(3,15): 50.4, p<0.0001인 "아균주"의 유의적인 효과를 나타낸다. 별표는 유의적인 PLSD hoc 후 효과 대 "야생형(wild-type)" F344USA 및 F344HAN 아균주("***"= p<0.0001)를 나타낸다.

도 2는 일본(JAP), 미국(USA) 및 독일(GER) 사육사들로부터 구입한 피셔 344(F344) 래트 아균주에서의 활성 사회적 상호 작용(SI)에서의 시간 소모를 도시한 것이다. 래트의 불안증에 대한 사회적 상호 작용 시험에서 SI 시간의 증가는 항불안 분앙으로서 해석된다. 그 결과는 유전자형 1개당 12세에 일치하는 동물의평균(±SEM)이다. 분산 분석 결과, F(2,32): 8.8, p=0.0009인 "아균주"의 유의적인 효과를 나타낸다. 별표는 유의적인 PLSD hoc 후 효과 대 "야생형" F344USA 래트("**"= P<0.01; "***"= P<0.001)를 나타낸다.

도 3은 연속 3일째에 스트레스 후의 체중 변화를 도시한 것이다. 연속 3일째에, 일본(JAP), 미국(USA) 및 독일(GER) 사육사들로부터 구입한 동일 연력의 동물을 새로운 방에 개별적으로 옮기고, 1시간 동안 체류시킨다. 1일째에, 톱밥을 포함하는 새로운 우리를 사용하고 동물을 표준 동물 래크에 놓는다. 2일째에, 우리 안에 톱밥이 없는 것을 제외하고는 과정이 동일하다. 3일째에 스트레스 과정은 우리를 새로운 방의 바닥에 놓은 것을 제외하고는 2일째와 동일하다. 반복 측정에 대한 분산 분석 결과, F(2,30): 13.5, P=0.0004인 "아균주"의 유의적인 효과를 나타낸다. 별표는 유의적인 PLSD hoc 후 효과를 1일당 하나의 인자 ANOVA 분할 대 "야생형" F344USA 래트("*"= P<0.05; "**"= P<0.01)를 나타낸다.

도 4는 개방 영역 시험의 연속 4분내에 이동된 거리에 대한 i.c.v. 이소로이실 티아졸리딘 치료 효과를 도시한 것이다. 반복 측정에 대한 분신 분석 결과, 이러한 활성 변수(F (3,78): 0.7, p=0.5; n. s.)에 대한 유의적인 치료 효과를 나타내지 않는다.

도 5는 개방 영역 시험의 연속 4분의 합계로서 벽에 근접하는 데 소모된 시간에 대한 i.c.v. 이소로이실 티아졸리딘 치료 효과를 도시한 것이다. 분산 분석 결과, F(3,26): 4.1, p=0.015인 유의적인 "치료" 효과를 나타낸다. 별표는 유의적인 PLSD hoc 후 효과 대 "aCFS" 대조군("*"= P<0.05)을 나타낸다.

도 6은 상승된 추가의 미로(EPM)의 개방 아암에서의 시간 소모율에 대한 i.c.v. 이소로이실 티아졸리딘 치료 효과를 도시한 것이다. 분산 분석 결과, F(3,26): 3.0, p=0.048인 "치료"의 유의적인 효과를 나타낸다. 별표는 유의적인 PLSD hoc 후 효과 대 "aCFS" 대조군("*"= P<0.05)을 나타낸다.

도 7은 상이한 용량(이소로이실 티아졸리딘: 5pmol 내지 500nmol; NPY: 50pmol 내지 1.6nmol)으로 배합시 CSF, 이소로이실 티아졸리딘 및 NPY를 사용한 배합된 i.c.v. 치료 효과를 도시한 것이다. 불안증의 사회적 상호 작용 시험에서 활성 사회적 상호 작용에서 소모된 시간(SI 시간)을 측정한다. SI 시간의 증가는 항불안제 등 효과를 나타내는 것이다. 시험 과정에 익숙해진 후, 동물은 임의로 선택된 치료제와 항상 새로운 상호 작용 파트너를 사용하여 반복 시험한다. 시험은 서로 적어도 4일만에 분리시킨다. 각각의 시험 동안, 각각의 질환에 대해 5 내지 6마리의 동물로 된 그룹 4개의 거리를 재고, 분산 분석 결과, 좌측으로부터 우측으로 다음의 유의적인 "치료" 효과(aCSF+aCSF; aCSF+NPY; 이소로이실 티아졸리딘 + aCSF; 이소로이실 티아졸리딘+NPY): 이소로이실 티아졸리딘 5pmol+NPY 50pmol: F(3,18): 0.25, p=0.8, n. s.; 이소로이실 티아졸리딘 50pmol+NPY 100pmol: F (3,18): 22.4, p<0.0001; 이소로이실 티아졸리딘 500pmol+NPY 200pmol: F(3,20): 8.6, p=0.007; 이소로이실 티아졸리딘 50nmol+NPY 0.8nmol: F(3,20): 23.3, P<0. 0001 ; 및 이소로이실 티아졸리딘 500nmol+NPY 1.6nmol: F(3,20): 11.2, p=0.0008를 나타낸다. 별표는 aCSF+NPY 대 이소로이실 티아졸리딘+NPY("*" = p<0.05) 사이에 막대로 나타낸 바와 같은, 유의적인 PLSD hoc 후 효과 대 "aCFS+aCSF" 대조군을나타낸다.

도 8은 상이한 투여량(이소로이실 티아졸리딘: 5pmol 내지 500nmol; NPY: 50pmol 내지 1.6nmol)으로 배합된 상태의 aCSF, 이소로이실 티아졸리딘 및 NPY를 사용한 배합된 i.c.v. 치료 효과를 도시한 것이다. 1시간내에 공급된 식품의 양을 측정한다. 동물은 임의로 선택된 치료제를 사용하여 반복해서 시험한다. 각각의 시험 동안, 각각의 질환에 대해 5 내지 6마리의 동물로 된 그룹 4개의 거리를 재고, 분산 분석 결과, 좌측으로부터 우측으로 다음의 유의적인 "치료" 효과(aCSF+aCSF; aCSF+NPY; 이소로이실 티아졸리딘 + aCSF; 이소로이실 티아졸리딘+NPY): 이소로이실 티아졸리딘 5pmol+NPY 50pmol: F(3,18): 7.0, p=0.0025, n. s.; 이소로이실 티아졸리딘 50pmol+NPY 100pmol: F (3,20): 4.5, p<0.016; 이소로이실 티아졸리딘 500pmol+NPY 200pmol: F(3,20): 4.4, p=0.015; 이소로이실 티아졸리딘 50nmol+NPY 0.8nmol: F(3,20): 6.6, P=0.0027 ; 및 이소로이실 티아졸리딘 500nmol+NPY 1.6nmol: F(3,20): 13.7, p<0.0001을 나타낸다. 별표는 aCSF+NPY 대 이소로이실 티아졸리딘+NPY("*" = p<0.05) 사이에 막대로 나타낸 바와 같은, 유의적인 PLSD hoc 후 효과 대 "aCFS+aCSF" 대조군을 나타낸다.

도 9는 상이한 투여량(이소로이실 티아졸리딘: 5pmol 내지 500nmol; NPY: 50pmol 내지 1.6nmol)으로 배합된 상태의 aCSF, 이소로이실 티아졸리딘 및 NPY를 사용한 배합된 i.c.v. 치료 효과를 도시한 것이다. 12시간내에 공급된 식품의 양을 측정한다. 각각의 시험 동안, 각각의 질환에 대해 5 내지 6마리의 동물로 된 그룹 4개의 거리를 재고, 분산 분석 결과, 좌측으로부터 우측으로 다음의 유의적인"치료" 효과(aCSF+aCSF; aCSF+NPY; 이소로이실 티아졸리딘 + aCSF; 이소로이실 티아졸리딘+NPY): 이소로이실 티아졸리딘 5pmol+NPY 50pmol: F(3,18): 0.5, p=0.7, n.s.; 이소로이실 티아졸리딘 50pmol+NPY 100pmol: F (3,20): 0.17, p<0.9, n.s.; 이소로이실 티아졸리딘 500pmol+NPY 200pmol: F(3,20): 1.1, p=0.34, n.s.; 이소로이실 티아졸리딘 50nmol+NPY 0.8nmol: F(3,20): 1.2, P=0.3 ; 및 이소로이실 티아졸리딘 500nmol+NPY 1.6nmol: F(3,20): 3.4, p<0.039를 나타낸다. 별표는 aCSF+NPY 대 이소로이실 티아졸리딘+NPY("*" = p<0.05) 사이에 막대로 나타낸 바와 같은, 유의적인 PLSD hoc 후 효과 대 "aCFS+aCSF" 대조군을 나타낸다.

도 10은 배합된 상태의 Y1R 길항제 BIBP3226, 이소로이실 티아졸리딘 및 NPY(BIBP3226: 100nmol; 이소로이실 티아졸리딘: 50nmol; NPY: 0.8nmol)를 사용한 배합된 i.c.v. 치료 효과를 도시한 것이다. 불안증의 사회적 상호 작용 시험에서 활성 사회적 사회적 작용에서 소모된 시간(SI 시간)을 측정한다. SI 시간의 증가는 항불안제 등 효과를 나타낸다. 시험 과정에 익숙해진 후, 동물은 i.c.v. 치료 계획과 동일한 치료 상호 작용 파트너에 임의로 선택된다. 시험은 치료 질환당 총 6 내지 8마리의 동물을 사용하여 연속된 2개의 그룹의 거리를 잰다. 분산 분석 결과, 다음 그룹: (1) aCSF+aCSF+aCSF; (2) BIBP+aCSF+aCSF; (3) aCSF+이소로이실 티아졸리딘+aCSF ; (4) BIBP + 이소로이실 티아졸리딘+aCSF; (5) aCSF+aCSF+NPY; (6) BIBP+aCSF+NPY; (7) aCSF+P32/89+NPY ; (8) BIBP +이소로이실 티아졸리딘+NPY의 거리를 재어, F(7, 44): 33.6, p<0.001인 유의적인 "치료" 효과를 나타낸다. hoc 후 비교군 대 대조군(aCSF+aCSF+aCSF)에서 유의성의 수준은 별표를 "*"=p<0.05;"**"=p<0.01; "***"=p<0.001로 표시하고, 상응하는 길항성 치료제(BIBP +n.n.)는 "#" 기호를 ("#" = p<0.05; "##"= P<0.01; "###"= P<0.001)로 표시한다.

도 11은 배합된 상태의 Y1R 길항제 BIBP3226, 이소로이실 티아졸리딘 및 NPY(BIBP3226: 100nmol; 이소로이실 티아졸리딘: 50nmol; NPY: 0.8nmol)를 사용하여 1시간 동안의 식품 섭취량에 대한 배합된 i.c.v. 치료 효과를 도시한 것이다. 시험 과정에 익숙해진 후, 동물은 i.c.v. 치료 계획과 동일한 치료 상호 작용 파트너에 임의로 선택된다. 시험은 치료 질환당 총 6 내지 8마리의 동물을 사용하여 연속된 2개의 그룹의 거리를 잰다. 분산 분석 결과, 다음 그룹: (1) aCSF+aCSF+aCSF; (2) BIBP+aCSF+aCSF; (3) aCSF+이소로이실 티아졸리딘+aCSF ; (4) BIBP + 이소로이실 티아졸리딘+aCSF; (5) aCSF+aCSF+NPY; (6) BIBP+aCSF+NPY; (7) aCSF+P32/89+NPY ; (8) BIBP +이소로이실 티아졸리딘+NPY의 거리를 재어, F(7, 44): 5.4, p<0.0002인 유의적인 "치료" 효과를 나타낸다. hoc 후 비교군 대 대조군(aCSF+aCSF+aCSF)에서 유의성의 수준은 별표를 "*"=p<0.05; "**"=p<0.01; "***"=p<0.001로 표시하고, 상응하는 길항성 치료제(BIBP +n.n.)는 "#" 기호를 ("#" = p<0.05; "##"= P<0.01; "###"= P<0.001)로 표시한다. 모든 데이타는 ±S.E.M.을 의미하는 것으로 나타난다.

당해 분야의 기타 제안된 방법과는 달리, 본 발명은 디펩티딜 펩티다제 IV 또는 DP IV형 효소의 저분자량 억제제를 사용하여 경구 투여 치료제를 제공하는 것이다. 당해 발명은 포유동물의 불안증 및 기타 신경학적 또는 정신적 장애의 치료를 위한 신규한 방법을 나타낸다. 이는 특히 사람 질병에 관한 치료 요법에 사용하기에 유리하고, 유용하게 시판되며, 적합하다.

경구 투여되는 저분자량 디펩티딜 펩티다제 IV 억제제의 예는 [N- N'-치환된 글리실)-2-시아노피롤리딘, L-threo-이소로이실 티아졸리딘, L-allo-이소로이실 티아졸리딘, L-threo-이소로이실 피롤리딘, L-allo-이소로이실 티아졸리딘 및 L-allo-이소로이실 피롤리딘과 같은 제제이다. 이는 전문이 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제6,001,155호, 국제 공개특허공보 제WO 99/61431호, 제WO 99/67278호, 제WO 99/67279, 독일 특허 제198 34 591호, 국제 공개특허공보 제WO 97/40832, 독일 특허 명세서 제196 16 486 C2호, 국제 공개특허공보 제WO 98/19998호, 제WO 00/07617호, 제WO 99/38501호 및 제WO 99/46272호에 기재되어 있다. 이러한 제제의 목적은 DP IV를 억제하는 것이며, 이로써 저혈당 수준으로 되도록 하여 혈액 속에 상승된 농도의 포도당과 관계된 다당증 및 관련 질병을 효과적으로 치료하는 것이다.

DP IV는 N 말단 프롤린 및 알라닌 잔기를 제2 음절화한 후 펩티드를 선택적으로 분할한 엑소펩티다제라는 효소이다. 이러한 효소에 대한 내인성 기질은 글루코즈 의존성 인슐린 친화성 폴리펩티드(예: GIP 및 절두형 GLP-1)와 같은 인크레틴을 포함한다. DP IV의 존재시, 이러한 호르몬은 불활성 형태로 효소적으로 감소된다. GIP 및 GLP-1의 불활성 형태는 인슐린 분비를 유도하여 특히 다당 상태에서 혈액 포도당 수준을 상승시킨다. 상승된 혈액 포도당 수준은 진성 당뇨병(표 1 및표 2)을 포함하며, 후에 진성 당뇨병을 수반하는 다수의 상이한 병리학과 관련된다. DP IV형 효소는, 예를 들면, N-말단 프롤린 및 알라닌 잔기를 제2 음절화한 후 펩티드를 선택적으로 분할하기 위한 시험에 펩티다제를 위치시키고, 이러한 분할에 영향을 미치는 펩티다제를 선택하며, 펩티다제를 분리시킴으로써 선택될 수 있다.

이는 또한 DP IV가, 예를 들면, 기관 이식시 T-세포 매개된 면역 반응에서 역할을 다하는 것으로 밝혀졌다. DP IV의 억제는 심장 동종 이식을 연장하는 것으로 입증되었다. 추가로, DP IV의 억제는 류마티스형 관절염의 억제에 기여한다. DP IV는 또한 T-세포(T-조세포)로의 HIV의 투과에 역할을 다하는 것으로 생각된다.

디펩티딜 펩티다제 IV 억제제의 이러한 각종 효과는 병리학적으로 상이한 조직의 치료에 사용되는 경우, 정상적인 건강한 조직 및 기관에 대한 충격을 수반한다. 본 발명의 목적은 NPY의 효과 및 활성을 지속시키고, 증가시키거나 연장하며 표적 조직에서 높은 생체이용성 및 정확하게 예측 가능한 활성 시간을 나타내는 뇌 표적화 제제(brain targeted agent)를 개발하는 것이다.

표적 특이성의 경구 투여되는 저분자량 제제의 예는 화학식 A-B-C를 포함하는 안정한 및 불안정한 디펩티딜 펩티다제 IV 억제제의 프로드러그이며, 여기서, A는 아미노산을 나타내고, B는 A와 C 또는 아미노산 사이의 화학 결합을 나타내며, C는 디펩티딜 펩티다제의 불안정한 또는 안정한 억제제를 나타낸다. 이는 전문이 본원에 참고로 인용되어 있는 국제 공개특허공보 제WO 99/67278호 및 제WO 99/67279호에 기재되어 있다.

본 발명은 포유동물의 뇌에서 효소 디펩티딜 펩티다제(DP IV 또는 CD26) 또는 DP IV형 효소 활성의 억제제의 투여가 신경펩티드 Y(NPY)의 감소된 분해에 대한 인과적인 결과로서 유도되는 신규한 방법에 관한 것이다. 이러한 치료는 기능적으로 활성인 NPY(1-36)의 농도의 저하시에 감소 또는 지연을 유발한다.

본 발명에 따르면, 포유동물, 특히 사람의 뇌에서 NPY의 효과 및/활성이 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV) 또는 DP IV형 효소의 억제제의 투여에 의해 지속되거나 연장될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 뇌에서의 NPY의 분해는 감소될 수 있다. 이는 정신 신체 질환, 우울증 및/또는 신경 정신과 질환의 완화 또는 개선을 유발한다. 당해 발명은 특히 불안증 및 기타 신경학적 또는 정신적 장애의 치료를 위한 신규한 방법을 나타낸다. 이는 특히 사람 질병에 관한 치료 요법에 사용하기에 유리하고, 유용하게 시판되며, 적합하다.

DP IV 또는 DP IV형 효소의 억제제의 투여가 뇌에서 NPY의 분해를 억제하거나 저하시킬 수 있다는 발견은 다음 이유 때문에 특히 놀랄만하다: 홍(1989) 등은 DP IV에 대한 cDNA 및 이에 대한 항체를 사용하여 래트 조직에서 조직 분포를 평가하였다. 면역블로트 분석에 의하면 DP IV가 신장, 폐 및, 고농도의 소장, 중간 농도의 간 및 비장, 및 저농도의 심장에 존재하는 것으로 입증되었다. DP IV에 대한 mRNA는 신장과 소장에서 고농도가 검출된 것에 비해, 폐, 간 및 비장에서는 중간 농도가 검출되었다. DP IV의 mRNA는 위, 고환, 심장, 근육 및 뇌에서 저농도가 발견된다.

하르텔-쉔크(1990) 등은 면역 조직 화학 및 활성 조직 화학을 비교하여 출생한 후 임신 10, 16 및 21일째와 1, 4, 8, 13, 21, 26 및 60일째에 위스타 래트 기관에서 개발 동안에 DP IV의 발생을 연구했다. 모든 조사된 조직에서, 다클론 항체와의 면역 반응성은 DP IV보다 빨리 나타났으며 배아 및 배아밖(탈락막) 세포의 혈장막에서 임신 10일째에 이미 존재한다. 이러한 부위 및 기타 부위, 예를 들면, 뇌 모세관 내피 및 기관 또는 기관지 내피에서, 출생 및 효소 활성 후 감소되거나 소실된 다클론 항체를 갖는 면역 반응성은 개발되지 않는다. 단클론 항체를 갖는 면역 반응성은 다클론 항체를 갖는 면역 반응성보다 늦게 나타나며 DP IV 활성이 후속적으로 발견되는 모든 구조에서 대부분 나타난다. 에피토프 D에 대한 단클론 항체는 부고환관, 신장 집합관 및 간세포 혈장막의 모든 영역에서 고반응성을 나타내는데, 이는 기타 항체와의 DP IV 활성 뿐만 아니라 면역 반응성이 관찰되지 않는다. 이 결과는 또한 DP IV가 촉매적으로 활성으로 되기 전에 분자로서 존재할 수 있으며 면역 반응성이 DP IV 활성보다 많은 부위에서 발생하는 것으로 나타난다. 면역 조직 화학 기술에 있어서는, 베른슈타인(1987) 등이 사람 태아, 신생아 및 노인으로부터 유래된 뇌 물질에서 디펩티딜 아미노펩티다제 IV 면역 반응성의 존재를 조사하였다. 이는 효소 단백질이 미숙아 CNS에서 풍부하게 존재하는 것으로 밝혀졌다. 반면, 성인 사람 뇌는 디펩티딜 아미노펩티다제 IV 면역 반응성을 훨씬 덜 포함한다. 이는 효소가 구체적으로 특정 신경 영양 펩티드(IGF II, 성장 호르몬)에서 이의 가능한 작용에 관하여 신경 증식 및/또는 분화에서 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다. 드 볼트 운트 미트로(1994)는 래트 뇌활밑 기관(SFO), SFO의 표면을 덮는 뇌실막 및 인접한 뇌 구조의 혈관에서 막 프로테아제 글루타밀 아미노펩티다제(EAP), 미세 소체 알라닐 아미노펩티다제(mAAP), 디펩티딜 펩티다제 IV (DP (1V) 및 γ-글루타밀 트랜스펩티다제(γ-GTP)의 국소화를 검토하였다. 효소 조직 화학 반응의 결과는 EAP, mAAP 및 γ-GTP에 대한 강한 활성을 나타내지만, 위의 발견과는 반대로 SFO의 미세 혈관에는 DP IV가 부재한다. SFO를 덮는 뇌실막은 γ-GTP에 대해 양성이지만, 다른 연구된 프로테아제에 대해서는 음성이다. 그 결과는 SFO의 대부분의 혈관에서 효소의 스펙트럼이 EAP, mAAP 및 γ-GTP에 대해 양성이지만 DP IV에 대해서는 음성인 인접한 뇌 조직의 미세 혈관의 효소의 스펙트럼과 유사함을 나타냈다.

이러한 발견과는 반대로, 본 발명은 DP IV 억제제형 이소로이실 티아졸리딘의 투여에 의해 래트에서 항불안 효과를 생성시킴을 나타낸다. 놀랍게도, 본 발명은 DP IV 억제제 이소로이실 티아졸리딘의 투여에 의해 래트에서 항불안 효과를 나타냄을 보여준다. 뇌에서 이소로이실 티아졸리딘에 대한 특이 분자량 표적은 멘틀라인(Mentlein)(1993)이 태반으로부터 분리되고 시험과내 연구에서 사용되는 DP IV 효소가 아니다. DP IV 억제제 이소로이신 티아졸리딘이 래트에서 i.c.v. 투여 후 불안증을 완화시킨다는 사실은 본 발명의 표적은 DP IV형 효소의 단독 또는 일련의 세트라는 증거가 된다.

DP IV 억제제의 투여에 의해 야기된 내인성 NPY(1-36)의 생성된 안정성의 향상으로 인해, NPY 활성이 지속, 증가 또는 연장되어 -다른 효과 중에서도- 기능적으로 활성인 NPY Y1 수용체가 활성으로 되므로, 항우울 효과, 항불안 효과 및 항고혈압 효과(상기 참조)를 촉진시킨다.

불안증의 치료를 필요로 하는 사람을 포함한 동물에서 불안증을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 DP IV 또는 관련된 효소 활성에 대한 억제제를 투여함으로써 NPY의 존재를 강화시킴을 포함한다. DP IV 억제제의 경구 투여는 대부분의 상황에서 바람직할 수 있다. DP IV 또는 DP IV형 효소 활성의 억제제를 투여함으로써, NPY의 활성 형태의 반수명은 생리학적 조건하에 상당히 연장, 증가 또는 지속된다. 활성 NPY의 연장된 존재에 의해 NPY Y1 수용체 활성이 향상된다.

본 발명은 또한 약제학적 조성물을 제공한다. 당해 조성물은 치료학적으로(또는 예방학적으로) 유효량의 억제제(및/또는 DP IV 억제제의 투여에 수반되는 당 환제), 및 특히 뇌를 표적화하는데 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 적합한 담체는 식염수, 완충된 식염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 배합물을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 당해 담체 및 조성물은 바람직하게는 우수한 실험실 실습 조건하에 제조되며, 가장 바람직하게는 멸균된다. 제형은 통상의 관례에 따라, 투여 형태를 적합하게 되도록 관념적으로 선택된다.

약제학적으로 허용되는 적합한 담체는 물, 염 용액(예: NaCl), 알콜, 아라비아 검, 식물성 오일, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 잴라틴, 탄수화물(예: 락토즈), 아밀로즈 또는 전분, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 비스코스 파라핀, 방향 오일, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈 등을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 약제학적 제제는 멸균될 수 있으며, 경우에 따라, 보조제, 예를 들면, 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 방향제 및/또는 활성 화합물과 유해하게 반응하지 않으나 안정성, 제조능 및/또는 심미적 호감을 향상시키는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 경우에 따라, 또한 소량의 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 또한, 당해 조성물은 액제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방출제 또는 산제일 수 있다. 또한, 당해 조성물은 통상의 결합제 및 담체(예: 트리글리세라이드)를 사용하여 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 제형은 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등의 약제학적 등급과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 사람에게 정맥내 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 관례적인 절차에 따라 제형화될 수 있다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 경우에 따라, 당해 조성물은 또한 주사 부위에 통증을 완화시키기 위해 가용화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 당해 성분은, 예를 들면, 활성 화합물의 양이 표시되는 앰플 또는 향낭과 같은 용접 밀폐된 용기 속에서 건조 동결된 분말 또는 물 비함유 농축액으로서 단일 투여 형태로 개별적으로 공급되거나 함께 혼합된다. 당해 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균성 약제학적 등급의 물, 식염수 또는 덱스트로즈/물을 함유하는 주입 용기에 분배될 수 있다. 당해 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 주입용 멸균수 또는 식염수의 앰플은 당해 성분이 혼합된 후 투여될 수 있도록공급될 수 있다.

마지막으로, 본 발명의 조성물은 천연 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 그룹, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 그룹과 같은 유리 아미노 그룹으로 형성된 염을 포함한다.

특히 장애 또는 질환의 치료에 유효한 본 발명의 조성물의 양은 장애 또는 질환의 특성에 의존하며, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 및/또는 생체내 검정은 최적 용량 범위를 확인하는 데 임의로 사용될 수 있다. 당해 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존하며, 전문의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.

이는 본원에 기재된 실시예 및 지시에 대해 상이한 DP IV 억제제의 발생을 포함하는 다수의 변경이 이루어질 수 있으며 본 발명의 정신 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 치료적 조성물을 변경할 수 있음이 당해 숙련가에 의해 용이하게 이해된다.

본 발명은 DP IV 결핍의 유전적 모델에서의 항불안 및 스트레스 방지 작용(실시예 1), CNS내에서의 DP IV 억제제의 약리학적 투여량의 항불안 작용(실시예 2), NPY 매개된 항불안 효과의 상호 작용 및 상승 작용(실시예 3) 및 NPY Y1 수용체 매개된 효과의 상승 작용을 기본으로 한 항불안 기전의 특성화(실시예 4)에 초점을 맞춘 다음 실시예를 참고하여 설명하고자 한다.

실시예 1

피셔(Fischer)(F344) 래트의 아균주에서 관찰된 DP IV 유전자의 자발적인 돌연변이는 스트레스에 대한 행동 조절 및 적응에서 DP IV의 역할을 연구하기 위한 모델을 제공한다. F344 래트의 돌연변이는 DP IV형 표소적 활성의 결핍을 야기하며, 독일(GER) 및 일본(JAP)[참조: Thompson et al., 1991; Tsuji et al., 1992]으로부터의 아균주에서 발견되지만, 미국(USA) 및 하노버(HAN) 사육사들로부터의 래트는 유의적인 효소 활성을 나타낸다. F344JAP 래트에서, CD26 단백질에서의 G633R의 치환은 돌연변이주 불활성 효소[참조: Tsuji et al., 1992; Cheng et al., 1999]의 크게 감소된 발현을 야기하지만, 다른 DP IV 음성 F344GER 아균주는 불활성 돌연변이주 효소[참조: Thompson et al., 1991]를 나타낸다. 따라서, F344JAP 래트는 "단백질 파괴" 모델[참조: Cheng et a., 1999]을 나타낼 수 있으나, G344GER 아균주는 "단백질 과발현" 모델[참조: Shingu, Helfritz, Meyer, Schmidt, Mentlein, von Horsten]을 나타낼 수 있다. 이러한 발견을 기본으로 하여, 돌연변이주 F344JAP 및 F344GER 아균주와 "야생형" F344USA 래트와의 직접 비교에 의해 행동 조절에 대한 DP IV 발현 및 활성의 역할과 기타 생체내 신경학적 및 정신생리학적 기능 사이에 분화가 허용된다. 당해 실시예에서, 본 발명자들은 DP IV 결핍된 F344 아균주가 스트레스 유도된 생리학적 변화에 대해 덜 불안하며 덜 반응함을 보고하였다.

동물. F344USA, F344JAP 및 F344GER 아균주는 독일 샤를스 리버(Charles River)를 통해 상이한 지역으로부터 구입한다. 최초에 F344USA 아균주로부터 유도된 F344Han 래트는 하노버 의과대학의 중앙 동물 실험실[참조: Central Animal Laboratory at Hannover Medical School; 참조: http://www.mh-hannover. de./institut/tierlabor/f344.htm]의 사육지로부터 구입한다. 모든 아균주는 하노버에 있는 중앙 동물 실험실에서 한 세대 동안 사육되며 음식과 물에 대한 자유로운 접근하에 12시간의 낮과 12시간의 밤의 주기로(07.00시간이 낮이다) 25℃에서 특이 병원균 비함유 시설에서 유지된다. 실험 연령과 일치하는 주령의 F1에 대해서는 모든 아균주의 새끼를 사용한다. 독일 하노버에 소재하는 주 정부(District Government, Hannover, Germany)는 모든 연구 및 동물 보호 규정을 승인했다.

F344 아균주의 조직에서의 DP IV 활성의 정량화. 혈장, 폐 및 각종 기타 조직 샘플을 사용할 때까지 -80℃에서 냉동시켜 둔다. 조직을 균질화하고, DP IV 효소 활성을 기질인 글리실프롤린 p-니트로아닐리드(gly-Pro-pNA, PBS 중 lmg/ml)[독일 바헴(Bachem, Germany)]를 배양하여 검출하고, 색 발생은 405nm에서 측정한다.

사회적 상호 작용(SI) 시험. SI 시험은 파일(File)(1980)이 먼저 기재한 바와 같이 수행하고, 실험실에서 최초에 인가된다[참조: Kask, Nguyen, Pabst, von Horsten]. 유전자형 및 체중이 일치하는 2마리의 래트를 가정 우리에서 꺼내어 시험 환경에 노출시킨다. 투기장은 음향 격리 상자 속에 놓인, 알루미늄으로 된 정방형의 개방 영역(50x50x50cm)이다[참조: Coulbourn Instruments, Lehigh Valley, PA]. 이 장치에 대한 세부 사항은 선행 연구[참조: von Horsten et al., 1998c]를참조한다. 개방 영역은 적색 사진광 전구(Philips PF712E; 1.3Lux)로 비춘다. 래트는 당해 장치에 생소하다. 시험용/격리 상자 내부 영역 위에 놓인 비디오 카메라를 사용하여 행동을 모니터링한다. 2마리의 래트의 SI 행동을 상자 상부의 외측에 놓인 모니터로부터 온라인으로 기록한다. 래트의 아균주가 의식하지 못한 관찰자(HPN)가 다음 변수, 즉 다른 래트의 아래와 위에서 냄새 맡기, 추적하기, 네발기기에 소모되는 시간[단, 피동적 신체 접촉(휴식, 수면)은 없음]을 채점한다. SI 시간의 증가는 항불안 반응이라고 생각된다.

스트레스 유도된 체중 손실. 연속 3일째에, 일본(JAP), 미국(USA) 및 독일(GER) 사육자들이 새로운 방으로 개별적으로 옮기고, 1시간 동안 체류시킨다. 1일째에, 톱밥을 포함하는 새로운 우리를 사용하고, 동물을 표준 동물 래크에 놓는다. 2일째에, 우리 안에 톱밥이 없는 것을 제외하고는 과정이 동일하다. 3일째에 스트레스 과정은 우리를 새로운 방의 바닥에 놓은 것을 제외하고는 2일째와 동일하다.

통계학적 분석. 반복 관찰한 데이타를 반복 측정에 대한 투-웨이(two-way) 분산 분석(ANOVA)에 의해 분석한다(인자: "아균주" 및 반복 측정으로 인한 "스트레스 후 체중 변화"). DP IV 활성 또는 SI 시간과 같은 단순 측정으로부터 수득한 데이타를 원-웨이(one-way)(인자: "아균주")의 ANOVA로 분석한다. 별표는 피셔의 PLSD에 의해 구입한, 유의적인 hoc 후 효과 대 F344USA 아균주(대조군)를 나타낸다. 모든 데이타는 평균 ±S.E.M.으로서 나타낸다.

F344 아균주의 DP IV 활성. 문헌과 상응하는, F344GER 및 F344JAP 아균주는내인성 DP IV 활성이 부족하다(도 1). 따라서, 이러한 래트는 행동 조절에 있어서 DP IV 활성의 생리적 역할에 대한 조사를 위한 유전 모델을 제공한다.

사회적 상호 작용 시험에서의 불안증. DP IV 활성이 결핍된 이러한 F344 아균주(F344JAP 및 F344GER)는 새로운 투기장에서 활성 사회적 상호 작용시에 유의적인 추가의 시간을 소모한다. 따라서, 내인성 DP IV형 활성의 결핍은 항불안제 등 효과를 매개한다.

스트레스 유도된 체중 손실. F344JAP 및 F344GER는 반복된 1시간의 운반 스트레스 후 체중이 유의적으로 덜 손실된다. 이러한 아균주에서의 내인성 DP IV형 활성이 결핍되면 적당한 스트레스에 의해 유도된 생리적 변화가 감소한다(도 3).

또한, 이러한 데이타는 DP IV 결핍 F344 래트의 유전 모델에서 내인성 DP IV 활성의 결핍은 항불안성 및 스트레스 방지 효과를 일으킨다.

실시예 2

실시예 1에서, 본 발명자들은 불안증 및 스트레스 반응이 DP IV 결핍의 유전 모델에서 감소된다. 당해 실시예에서, 본 발명자들은 DP IV 억제제 이소로이실 티아졸리딘의 중추 신경계 투여(i.c.v.)가 상승된 추가의 미로 시험인 설치류의 불안증에 대한 잘 설정된 시험에서 항불안제 등 효과를 유도하는 것으로 보고하였다. 본 발명자들은 추가로 개방 영역 파라다임에 의해 측정된 신규성에 대한 반응에서 래트의 정서가 활성에 영향을 미치지 않으면서 이소로이실 티아졸리딘 처리된 래트에서 덜 주장되는 것으로 보고하였다.

동물. 체중 350 내지 390g의 수컷 위스타 F/Han(WF) 래트[참조: Central Animal Laboratory, Hannover Medical School, Hannover, Germany; http://www.mh-hannover. de./institut/tierlabor/f344.htm]를 12시간의 낮과 12시간의 밤의 주기로(80Lux의 광도하에서는 07.00시간이 낮이다) 특이 병원균 비함유 방음 조건하에 조절된 온도(24.0±0.5℃)의 방에서 하우징된다. 음식[알트로민 실험실 음식 펠렛(Altromin laboratory chow pellet)]과 수도물에는 자유롭게 접근할 수 있다. 케타민/크실라신(100/5mg/kg, i.p.) 마취하에, 래트를 코프 향착성 프레임(Kopf stereotaxic frame) 속에 고정시키고, 측실 위쪽의 캐뉼러[미국 버지니아주 로노크 소재의 플라스틱 원 인코포레이티드(Plastic One, Inc.)]로 이식한다. 모든 연구 및 동물 보호 규정은 로어 색슨 주 정부(Lower Saxony district government; 독일 하노버)에 의해 승인되었고, 1986년 11월 24일의 유럽 지역 의회 훈령(European Community's Council Directive; 86/609/EEC)에 기재되어 있는 원칙에 따른다.

수술 및 i.c.v. 적용. 수술을 위해, 래트를 마취시키고, 앞에서 상세하게 기재한 바와 같은 표준 향착 과정[참조: von Horsten et al., 1998a, b, c]을 사용하여 i.c.v. 캐뉼러[배위: A:-0.7mm의 꼬리, L: 브레그마(bregma)로부터 옆으로 1.4mm; 및 V: 복부로부터 두개골 표면까지 3.2mm; 치대: 귀대 위쪽 +3.0]를 준비한다. 7일의 회복 기간이 지난 후, 성공적인 심실 캐뉼러화가 안지오텐신 음용 반응에 의해 확인된다[참조: von Horsten et al., 1998a]. 이어서, 양성 음용 반응(n=40)을 나타내는 래트는 7일 동안 1일 겉보기 주사에 의해 실험 처리에 익숙해진다.

동물은 실험적 불안증에 대한 상이한 행동적 시험을 완결한, 4개의 실험 그룹(n=8 내지 10/그룹)으로 임의로 분할한다. 각각의 그룹의 동물을 각각의 위상으로 동일한 방식으로 처리하고, -60분에 i.c.v. 주사를 맞은 후 행동 시험을 수행한다: 인조 뇌척수액(aCSF)(대조군), 이소로이실 티아졸리딘(0.05nmol), 이소로이실 티아졸리딘(5nmol) 및 이소로이실 티아졸리딘(500nmol). 이소로이실 티아졸리딘을 완충된 aCSF를 사용하여 최종 농도로 되도록 조절하고, 우심실에 5㎕/분의 용적을 적용한다. 캐뉼러를 폴리에틸렌 관 약 30cm를 사용하여 해밀턴 미세 주사기(Hamilton microsyringe)에 결합시키고, 모든 화합물은 TSE 다중 채널 주입 펌프[독일 바트 홈부르크(Bad Homburg, Germany)]를 사용하여 5.0㎕/분의 속도로 주입한다.

신규성에 대한 반응(개방 영역 시험). 중추 신경계 DP IV 길항 작용에 의해 유도된 신규성에 대한 반응의 차이는 개방 영역(OF) 시험을 사용하여 연구한다. 일반적인 과정은 위에 상세하게 기재되어 있다[참조: von Horsten et al., 1993,1998d]. 그러나, 다음의 변경이 적용된다: 암반응 단계 중에, 래트를 적색 사진광으로 비춰진 음향 격리된 상자내에 정방형 50x50x50 OF내에 위치시킨다. 15분의 단순 연속 시험 기간 중에 자발적인 활성을 비디오 경로 분석기 시스템[참조: E61-21 비디오 경로 분석기 시스템, 미국 펜실베니아주 소재의 콜번 인스트루먼츠(Coulbourn instruments)]을 사용하여 기록한다. 당해 분석기 시스템은 14개의 데이타 성분을 분석하는 15개의 1분 간격으로 행동을 결정한다: 벽-, 모서리-, 사분역 1-4-, 이동-, 휴식-, 양육 시간(모두 초 단위임), 스테레오 양육 시간, 시계 방향 회전 및 시계 반대 방향 회전 사건(모두 정수) 및 이동 거리(cm). 또한, 대변 거환(fecal boli)의 전체 발병률은 각각의 기간 후 계수하며, 신랑병 행동의 발병률 및 기간(초)은 동물 치료에 사람 맹인이 비디오 모니터하여 동시에 기록한다[참조: von Horsten et al., 1998c].

상승된 추가의 미로(EPM) 시험. 상승된 추가의 미로 장치 및 시험 과정은 래트를 사용하여 사용하기 위한 일반적인 고려 및 확인을 기준으로 하여, 1996년에 페르난드 및 파일(Fernandes and File)에 따라 적응된다. E+ 장치(TSE 시스템, 독일 홈부르크)는 회색 플라스틱으로 제조되며 2개의 개방 아암(50x10cm) 및 지면에서 50cm 높이의 벽 높이가 40cm인 동일한 크기의 2개의 동봉된 아암을 갖는다. 미로에는 E+ 성능의 컴퓨터화된 측정을 가능하게 하는 광선 센서가 구비되어 있다. 미로는 그림자에 남아 있는 밀폐된 아암 방향으로 미로의 30cm 위에 놓여진 위의 적색 광 전구[필립스(Philips) PF712E; 1.5Lux]로 비춘다. 실험 개시시, 래트는 밀폐된 아암에 면한 헤드를 사용하여 중심 플랫폼에 놓고, 5분 동안 미로를 자유롭게 탐색한다. 다음 변수를 계산한다: 아암 입구의 총 수(TA); 밀폐된 아암에 대한 입구(CA); 개방 아암에 대한 입구(OA); 개방 아암의 입구의 주파수(%)(%OA: OA x 100/TA); 전체 시험 기간(TT): 300g; 밀페 아암에서의 체류 시간(밀폐 시간: CLT); 총 아암-체류 시간에서의 CLT의 점유율(CLT x IOO/AT); 개방 아암에서의 체류 시간(개방 시간: OT) 및 총 아암 -체류 시간에서의 OT의 점유율(%OT : OT x 100/AT). 표준 시공 측정 이외에, "중심 정방형에 대한 시간 소모율 및 시간의 비율이 기록된다(중심 시간, CT: 1초당 플랫폼에서의 체류 시간; 시험 기간에서 CT의점유율, %CT: CT x 100/TT). 개방 아암에서 소모된 시간의 증가는 항불안 반응으로서 해석되고, 소모된 시간의 감소는 항불안 유전자 반응으로서 해석되는 반면, 밀폐된 아암으로의 입구의 수는 일반적인 활성의 표시이다[참조: Pellow et al., 1985].

통계학적 분석. 통계학적 분석에 있어서, 모든 시험 시간(분)으로부터의 행동 미처리 데이타를 반복 측정용 투-웨이 분산 분석(ANOVA)으로 분석한다(인자: 반복 측정으로 인한 처리 및 시간). 일정 기간으로부터의 총합으로서 수득한 데이타는 1가지 방식(인자: 처리) ANOVA으로 분석한다. 피셔의 PLSD에 의해 구입한, 유의적인 hoc 후 효과 대 aCSF(대조군)은 별표로 나타낸다. 모든 데이타는 평균 ±S.E.M.으로서 나타낸다.

개방 영역에서의 이소로이실 티아졸리딘에 대한 반응: 이소로이실 티아졸리딘은 넒은 범위의 투여량으로 개방 영역에서 활성에 대해 영향을 미치지 않는다(도 4). 개방 영역에서 정서적으로 감소된 특성에는, 이소로이실 티아졸리딘에 의해 유도된 벽에 근접하는 데 소모된 시간의 용량 의존성 감소가 존재한다(도 5). 50pmol의 매우 낮은 용량은 이미 유효하다.

EPM에서의 이소로이실 티아졸리딘에 대한 반응: 저용량의 이소로이실 티아졸리딘(50pmol)은 항불안제 등 효과가 나타나는 미로의 개방 아암에 대해 소모된 시간의 비율을 증가시킨다(도 6). 또한, 이러한 데이타는 먼저, DP IV 억제제 이소로이실 티아졸리딘의 약리학적 용량의 투여가 불안증에 대한 2마리의 동물 모델에서 용량 의존성 항불안제 등 효과를 생성시키는 것으로 나타난다.

실시예 3

당해 실시예에서, 본 발명자들은 DP IV 억제제 이소로이실 티아졸리딘 자체의 중추 신경계 투여(i.c.v.)가 또한 불안증의 사회적 상호 작용 시험에서 용량 의존성 항불안제 등 효과를 갖는 것으로 보고하였다. 본 발명자들은 또한 이소로이실 티아졸리딘에 의한 항불안 작용의 크기가 NPY에 의해 생성된 항불안 작용의 크기와 유사한 것으로 보고하였다. 또한, 본 발명자들은 이소로이실 티아졸리딘 및 NPY가 SI 시험에서 추가의 항불안제 등 효과를 가짐을 설명한다. 마지막으로, 본 발명자들은 1시간 및 12시간의 음식 섭취가 이소로이실 티아졸리딘 처리 단독 및 이의 조합에 의해 덜 영향을 받음을 설명한다.

동물. 체중 330 내지 370g의 수컷 위스타 F/Han(WF) 래트[참조: Central Animal Laboratory, Hannover Medical School, Hannover, Germany; http://www.mh-hannover. de./institut/tierlabor/wf.htm]를 12시간의 낮과 12시간의 밤의 주기로(80Lux의 광도하에서는 07.00시간이 낮이다) 특이 병원균 비함유 방음 조건하에 조절된 온도(24.0±0.5℃)의 방에서 하우징된다. 음식(알트로민 실험실 음식 펠렛)과 수도물에는 자유롭게 접근할 수 있다. 케타민/크실라신(100/5mg/kg, i.p.) 마취하에, 래트를 코프 향착성 프레임에 고정시키고, 측실 위쪽의 캐뉼러[참조: Plastic One, Inc., Roanoke, VA, USA]로 이식한다. 모든 연구 및 동물 보호 규정은 로어 색슨 주 정부(독일 하노버)에 의해 승인되었고, 1986년 11월 24일의 유럽 지역 의회 훈령(86/609/EEC)에 기재되어 있는 원칙에 따른다.

수술 및 i.c.v. 적용. 수술을 위해, 래트를 마취시키고, 앞에서 상세하게 기재한 바와 같은 표준 향착 과정[참조: von Horsten et al., 1998a, b, c]을 사용하여 i.c.v. 캐뉼러(배위: A:-0.7mm의 꼬리, L: 브레그마로부터 옆으로 1.4mm; 및 V: 복부로부터 두개골 표면까지 3.2mm; 치대: 귀대 위쪽 +3.0)를 준비한다. 7일의 회복 기간이 지난 후, 성공적인 심실 캐뉼러화가 안지오텐신 음용 반응에 의해 확인된다[참조: von Horsten et al., 1998a]. 이어서, 양성 음용 반응(n=59)을 나타내는 래트는 7일 동안 1일 겉보기 주사에 의해 실험 처리에 익숙해진다.

동물은 불안증에 대한 상이한 연속 SI 시험을 완결한, 4개의 실험 그룹 2세트(n=5 내지 6/그룹)로 임의로 분할한다. 각각의 그룹의 동물을 각각의 위상으로 동일한 방식으로 처리하고, -60분 및 -45분에 i.c.v. 주사를 맞은 후 상이한 용량(이소로이실 티아졸리딘: 5pmol 내지 500nmol; NPY: 50pmol 내지 1.6nmol)으로 행동 시험을 수행한다. 이소로이실 티아졸리딘을 완충된 aCSF를 사용하여 최종 농도로 되도록 조절하고, 우심실에 5㎕/분의 용적을 적용한다. 캐뉼러를 폴리에틸렌 관 약 30cm를 사용하여 해밀턴 미세 주사기에 결합시키고, 모든 화합물은 TSE 다중 채널 주입 펌프(독일 바트 홈부르크)를 사용하여 5.0㎕/분의 속도로 주입한다. 활성 사회적 상호 작용에서 소모된 시간(SI 시간), 1시간 및 12시간의 음식 섭취량을 측정한다. 동물은 임의로 선택된 치료제와 항상 새로운 상호 작용 파트너를 사용하여 반복 시험한다. 시험은 서로 적어도 4일만에 분리시키고, 항상 암주기로 수행된다. 5회의 일련의 시험이 수행된다. 각각의 시험에서, 질환당 5 내지 6마리로 된 4개의 그룹(aCSF+aCSF; aCSF+NPY; 이소로이실 티아졸리딘 + aCSF; 이소로이실티아졸리딘+NPY)의 거리를 잰다.

사회적 상호 작용(SI) 시험. SI 시험은 파일(1980)이 먼저 기재한 바와 같이 수행하고, 실험실에서 최초에 인가된다[참조: Kask, Nguyen, Pabst, von Horsten]. 유전자형 및 체중이 일치하는 2마리의 래트를 가정 우리에서 꺼내어 시험 환경에 노출시킨다. 투기장은 음향 격리 상자 속에 놓인, 알루미늄으로 된 정방형의 개방 영역(50x50x50cm)이다[참조: Coulbourn Instruments, Lehigh Valley, PA]. 이 장치에 대한 세부 사항은 선행 연구[참조: von Horsten et al., 1998c]를 참조한다. 개방 영역은 적색 사진광 전구(Philips PF712E; 1.3Lux)로 비춘다. 래트는 당해 장치에 생소하다. 시험용/격리 상자 내부 영역 위에 놓인 비디오 카메라를 사용하여 행동을 모니터링한다. 2마리의 래트의 SI 행동을 상자 상부의 외측에 놓인 모니터로부터 온라인으로 기록한다. 래트의 아균주가 의식하지 못한 관찰자(HPN)가 다음 변수, 즉 다른 래트의 아래와 위에서 냄새 맡기, 추적하기, 네발기기에 소모되는 시간[단, 피동적 신체 접촉(휴식, 수면)은 없음]을 채점한다. SI 시간의 증가는 항불안 반응이라고 생각된다.

통계학적 분석. 반복 관찰(음식 섭취량)한 데이타를 반복 측정에 대한 투-웨이 분산 분석(ANOVA)으로 분석한다(인자: "아균주" 및 반복 측정으로 인한 "음식 섭취량"). DP IV 활성 또는 SI 시간과 같은 단순 측정으로부터 수득한 데이타를 원-웨이(인자: "아균주") ANOVA로 분석한다. 별표는 피셔의 PLSD에 의해 구입한, 유의적인 hoc 후 효과 대 aCSF+aCAF(대조군)를 나타낸다. 모든 데이타는 평균 ±S.E.M.으로서 나타낸다.

이소로이실 티아졸리딘에 의한 SI 시험에서의 용량 의존성 분석. DP IV 억제제 이소로이실 티아졸리딘의 중추 신경계 투여(그룹: aCSF+이소로이실 티아졸리딘: 5pmol 내지 500nmol)은 불안증에 대한 사회적 상호 작용에서 "벨-형(bell-shaped)"의 용량 의존성 항불안제 등 효과를 생성시킨다(도 7). 이는 이소로이실 티아졸리딘이 또한 EPM과 유사한 강력한 항불안성 화합물로서 SI 시험 및 개방 영역 시험에서 작용함을 입증한다(실시예 2 참조). NPY의 i.c.v. 적용(0.05 내지 1.6nmol)은 유사한 항불안제 등 효과를 갖는다(도 7). 이러한 발견은 배경 기술에서 기재한 바와 같이, NPY의 공지된 항불안 작용을 반복한다. 이소로이실 티아졸리딘 매개된 효과와 NPY의 효과를 비교하면 억제제가 유사한 잠재력이 있음을 나타낸다. 흥미롭게도, 이소로이실 티아졸리딘의 전처리 후 NPY로의 전처리에 의해 넓은 범위의 용량으로 추가의 효과를 생성시키며, 당해 화합물이 동일 기전을 통해 작용함을 암시한다(도 7). 선행 기술에서 언급한 바와 같이, 당해 기전은 대개는 CNS Y1 수용체의 활성화이다.

공급시 이소로이신 티아졸리딘의 최소 효과. 도 8 및 도 9는 1시간 NPY가 "u-형" 용량 의존성 공급 효과를 생성시킴을 입증하는 것이다. 이소로이실 티아졸리딘은 0.05nmol의 용량에서만 유의성에 이르는 온화한 공급 효과를 생성시킨다(도 8). 이소로이실 티아졸리딘 후 NPY의 배합된 처리는 NPY 단독(가장 높은 비생리학적 용량은 제외함)과는 상이하며, 이는 NPY의 공급 효과가 하나의 기전을 통해 매개되지 않으며 이소로이실 티아졸리딘에 의해 영향을 미침을 나타낸다. 선행 기술에서의 대부분의 데이타는 NPY의 암주기 공급 효과가 우선 매개된 Y5 수용체임을나타낸다. 매우 고용량으로 섭취하는 것을 제외하고는, 밤새 음식 섭취하는 것은 임의의 처리에 의해 영향을 받지 않는다(도 9). 따라서, DP IV 억제제 이소로이실 티아졸리딘의 중추 신경계 적용은 주요 공급 조절 시스템에 영향을 미치지 않는다(즉, NPY Y5 수용체).

실시예 4

당해 실시예에서, 본 발명자들은 실시예 3의 도 7에서 도시한 바와 같이, 중량 투여량(이소로이실 티아졸리딘, 50nmol; NPY, 0.8nmol)으로 NPY 매개된 항불안제 등 효과의 잠재성에 대한 기전에 대해 보고하였다. 본 발명자들은 NPY Y1 수용체 길항제 BIBP3226을 사용한 전처리가 SI 행동에 대한 NPY 매개된 항불안제 등 효과의 이소로이실 티아졸리딘 유도된 잠재성을 차단할 수 있으며 추가로 1시간 공급 효과가 Y1R의 폐색에 의해 단지 부분적으로 영향을 받음을 나타내는 것으로 입증하였다.

동물. 체중 330±31g±SD의 수컷 위스타 F/Han(WF) 래트[참조: Central Animal Laboratory, Hannover Medical School, Hannover, Germany; http://www.mh-hannover. de./institut/tierlabor/wf.htm]를 12시간의 낮과 12시간의 밤의 주기로(80Lux의 광도하에서는 07.00시간이 낮이다) 특이 병원균 비함유 방음 조건하에 조절된 온도(24.0±0.5℃)의 방에서 하우징된다. 음식(알트로민 실험실 음식 펠렛)과 수도물에는 자유롭게 접근할 수 있다. 케타민/크실라신(100/5mg/kg, i.p.) 마취하에, 래트를 코프 향착성 프레임에 고정시키고, 측실 위쪽의 캐뉼러(미국 버지니아주 로노크 소재의 플라스틱 원 인코포레이티드)로 이식한다. 모든 연구 및 동물 보호 규정은 로어 색슨 주 정부(독일 하노버)에 의해 승인되었고, 1986년 11월 24일의 유럽 지역 의회 훈령(86/609/EEC)에 기재되어 있는 원칙에 따른다.

수술 및 i.c.v. 적용. 수술을 위해, 래트를 마취시키고, 앞에서 상세하게 기재한 바와 같은 표준 향착 과정[참조: von Horsten et al., 1998a, b, c]을 사용하여 i.c.v. 캐뉼러(배위: A:-0.7mm의 꼬리, L: 브레그마로부터 옆으로 1.4mm; 및 V: 복부로부터 두개골 표면까지 3.2mm; 치대: 귀대 위쪽 +3.0)를 준비한다. 7일의 회복 기간이 지난 후, 성공적인 심실 캐뉼러화가 안지오텐신 음용 반응에 의해 확인된다[참조: von Horsten et al., 1998a]. 이어서, 양성 음용 반응(n=56)을 나타내는 래트는 7일 동안 1일 겉보기 주사에 의해 실험 처리에 익숙해진다.

동물은 불안증에 대한 하나의 SI 시험을 완결한, 8개의 실험 그룹(n=6 내지 8/그룹)으로 임의로 분할한다: (1) aCSF+aCSF+aCSF; (2) BIBP+aCSF+aCSF; (3) aCSF+이소로이실 티아졸리딘+aCSF ; (4) BIBP + 이소로이실 티아졸리딘+aCSF; (5) aCSF+aCSF+NPY; (6) BIBP+aCSF+NPY; (7) aCSF+P32/89+NPY ; (8) BIBP +이소로이실 티아졸리딘+NPY. 각각의 그룹의 동물을 각각의 위상으로 동일한 방식으로 처리하고, -60분 및 -55분에 i.c.v. 주사를 맞은 후 행동 시험을 수행한다. 그룹을 사용하여 두번의 밤의 길이를 잰 실험은 2개의 암주기에 대해 역평형을 이룬다. 주사 캐뉼러는 폴리에틸렌 관 약 30cm를 사용하여 해밀턴 미세 주사기에 결합시키고, 모든 화합물은 캐뉼러를 폴리에틸렌 관 약 30cm를 사용하여 해밀턴 미세 주사기에 결합시키고, 모든 화합물은 TSE 다중 채널 주입 펌프(독일 바트 홈부르크)를 사용하여 5.0㎕/분의 속도로 총 5.0㎕의 용적으로 주입한다. 활성 사회적 상호 작용에서 소모된 시간(SI 시간), 1시간 및 12시간의 음식 섭취량을 측정한다.

펩티드 및 길항제. 래트 신경펩티드 Y_1-36을 폴리펩티드 라보라토리즈(Polypeptide Laboratories)로부터 구입한다(독일 볼펜뷔텔). NPY Y1 수용체 길항제 BIBP3226은 미국 캘리포니아주 선베일에 소재하는 아메리칸 펩티드 캄파니(American Peptide Company)(Cat#:60-1-22B)로부터 구입한다. 모든 약제는 멸균수에 용해시키고, 최종 희석액을 aCSF로 제조한다.

사회적 상호 작용(SI) 시험. SI 시험은 파일(1980)이 먼저 기재한 바와 같이 수행하고, 실험실에서 최초에 인가된다[참조: Kask, Nguyen, Pabst, von Horsten]. 유전자형 및 체중이 일치하는 2마리의 래트를 가정 우리에서 꺼내어 시험 환경에 노출시킨다. 투기장은 음향 격리 상자 속에 놓인, 알루미늄으로 된 정방형의 개방 영역(50x50x50cm)이다[참조: Coulbourn Instruments, Lehigh Valley, PA]. 이 장치에 대한 세부 사항은 선행 연구[참조: von Horsten et al., 1998c]를 참조한다. 개방 영역은 적색 사진광 전구(Philips PF712E; 1.3Lux)로 비춘다. 래트는 당해 장치에 생소하다. 시험용/격리 상자 내부 영역 위에 놓인 비디오 카메라를 사용하여 행동을 모니터링한다. 2마리의 래트의 SI 행동을 상자 상부의 외측에 놓인 모니터로부터 온라인으로 기록한다. 래트의 아균주가 의식하지 못한 관찰자(HPN)가 다음 변수, 즉 다른 래트의 아래와 위에서 냄새 맡기, 추적하기, 네발기기에 소모되는 시간[단, 피동적 신체 접촉(휴식, 수면)은 없음]을 채점한다. SI시간의 증가는 항불안 반응이라고 생각된다.

통계학적 분석. SI 시간 및 1시간 음식 섭취량의 측정으로부터 수득한 데이타를 원-웨이(인자: "처리") ANOVA로 분석한다. 또한, 3인자(인자: "길항제", "억제제", NPY") ANOVA는 일반적인 결론을 확인하는 데 수행된다(데이타는 도시되지 않음). 별표는 hoc 후 유의적인 효과 대 aCSF+aCSF+aCSF(대조군)을 나타내는 반면, "#" 기호는 Y1R 길항제 처리의 유의적인 차이 대 피셔의 PLSD에 의해 구입한 길항제 부재의 상응하는 처리제를 나타낸다. hoc 후 비교시 유의성의 수준은 별표를 "*"=p<0.05; "**"=p<0.01; "***"=p<0.001로 표시하고, "#" 기호를 "#" = p<0.05; "##"= P<0.01; "###"= P<0.001로 표시한다. 모든 데이타는 평균 ±S.E.M.으로서 나타낸다.

이소로이실 티아졸리딘 전처리에 의해 SI 시험에서 NPY 유도된 불안 작용의 잠재성이 매개된 NPY Y1 수용체. 50nmol 용량의 이소로이실 티아졸리딘 및 0.8nmol의 용량의 NPY의 배합된 중추 신경계 투여는 SI 시험에서 항불안제 등 효과를 효과적으로 강화시킨다(도 10). 이러한 발견은 도 7에서 도시된 관찰을 상응하는 용량으로 반복한다. 이러한 용량으로, 이소로이실 티아졸리딘 헤미푸마레이트(p32/98) 처리는 단독으로 항불안제 등에 작용하지 않는다. 그러나, 내인성 사회적 조사 행동, NPY의 항불안제 등 효과 및 배합된 이소로이실 티아졸리딘+NPY 처리에 의해 유도된 잠재적 항불안 작용은 Y1 수용체 폐색에 의해 모두 길항된다. 이는 CNS에서 NPY Y1 수용체를 통해 불안증 수준의 긴장 조절을 나타내며, 또한 배합 처리에 의해 유도된 잠재적인 항불안 작용 뿐만 아니라 NPY의 항불안제 등 효과는 모두 주로 Y1 수용체에 의해 매개되었음을 입증한다. 자발적인 공급 및 NPY 유도된 공급은 Y1R에 의해 단지 부분적으로 매개되며 이소로이실 티아졸리딘 처리에 의해 유도된 공급의 비유의적인 약간의 증가는 y1R 길항 작용에 의해 유도된다(도 11).

참고 문헌

Claims

불안증을 포함하는 스트레스에 대한 행동 및/또는 신경학적 적응 반응의 조절용 약제를 제조하기 위한, 디펩티딜 펩티다제 IV(DP IV 또는 CD 26) 또는 DP IV형 효소의 억제제의 용도.
제1항에 있어서, 내인성, CNS 국소화된 신경펩티드 Y(NPY) 및 유사한 특성을 공유하는 기타 기질의 분해 감소용 약제를 제조하기 위한 용도.
제1항 또는 제2항에 있어서, 정신신체 질환, 우울성 질환 및 신경정신 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 용도.
제3항에 있어서, 정신신체 질환, 우울성 질환 및 신경정신 질환이 불안 장애, 우울증, 불면증, 만성 피로, 정신분열증, 간질, 식이 장애, 경련 및 만성 통증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 억제제가 신경펩티드 Y와 배합된 상태로 사용되는 용도.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 억제제가 약리학적으로 적합한약제 운반 부형제 속에 존재하는 용도.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 억제제가 이의 프로드러그로서 제형화되는 용도.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 억제제가 비경구, 장내, 경구 또는 흡입에 의해 사용되거나 좌제로서 사용되는 용도.