KR20030083682A - 재발성 바이러스 질환의 예방 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재발성 바이러스 질환을 개선하거나 감소시키는 조성물 및 방법으로서, 우선적인 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스의 증가를 유발하는 것을 개시한다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C.제 119(e) 조에 의거하여 2000년 11월 16일 출원된 미국 가출원 제 60/249,387 호에 대해 우선권을 주장한다.
연방에 의해 지원된 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 부분적으로 미국 정부로 부터 얻은 자금을 이용하여 이루어졌다 (알레르기 및 전염병 국립연구소, Natioanl Institute of Allergy and Disease, 승인번호 제 960184 호). 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 가질 수 있다.
인간 면역 결핍성 바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV) 의 전염병에 대한 계도 노력에도 불구하고, 성적으로 전달되는 질환의 확산은 약해지지 않고 계속되고 있다. 최근의 연구에 의하면, 현재 미국에서 제 2 형 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus type-2, HSV-2) 의 연령별 확산은 20.8 % 이고, 과거 13 년간 약 30 % 증가했음을 시사하고 있다. 전체적으로, 이는 안면 장애 (facial lesions) 를 유발하는, 제 1 형 바이러스 (HSV-1) 에 대해 50 % 상동성 (homologous) 이다. 그러나, 상기 두 바이러스는 몸의 상이한 부위에 대해서 호발성 (predilection) 이고, 재발성 질환을 유발하는 경향이 다르며 (HSV-2 및 HSV-1 에 대해 각각 60% 및 30%), 상이한 신경계 질환 즉, HSV-2 는 주로 수막염, HSV-1는 뇌염에 관련되고, HSV-2 만이 종양 잠재성 (neoplastic potential) 을 갖는다. 젊은 성인 가운데 HSV-2 의 습득률이 증가함으로써 분만시 영아가 HSV-2 에 노출되게 되고, 항바이러스 진료에도 불구하고, 여전히 치명적인 감염을 초래할 가능성을 높이고 있다. HSV-2 에 대한 새로운 관심은 그것이 이전에 기술되지 않은 초과다증식성 (hyperproliferative) 장애를 유발하고 질환의 심각성을 증가시킬 뿐 아니라 HIV 의 확산도 촉진한다는 점이다.
HSV-1 나 HSV-2 감염은 네 단계로 나눌 수 있는데, (i) 급성 감염 (acute infection), (ii) 잠복기의 설정 (establishment of latency), (iii) 잠복기의 유지, 및 (iv) 잠복성 바이러스의 재활성화이다. 일차 HSV 감염 (primary HSV infection) 의 가장 흔한 부위는 HSV-1 의 경우 안면, HSV-2 의 경우 생식기 점막이다. 상기 바이러스는 감염 부위의 세포내에서 복제하여, 일차 장애 (primary lesions) 를 유발한다. 바이러스 DNA 는 일반적으로 숙주의 일생을 통하여, 잠복기 로 감각 신경세포 내에 유지된다. 어떤 자극이 바이러스 복제의 재활성화를 유발함과 동시에 바이러스의 후손을 침입구 또는 그 근처의 상피부위로 역축삭전송 (reverse axonal transport) 한다. 잠복성 바이러스 게놈의 주기적인 재활성화는 재발성 질환을 종종 유발하는 바이러스의 복제를 초래한다. 그러나, 재활성화가 항상 재발성 질환을 초래하지는 않는다. 감염된 대상의 일부 (HSV-2 및 HSV-1 에 대해 각각 60 % 및 30 %) 만이 재발성 질환으로 발전한다. HSV 감염 후 체액성 및 T 세포 매개성 면역이 나타난다. 감염된 대상은 일생 동안 지속되는 상대적으로 높은 양의 바이러스 특이적 항체 (IgG 및 IgM) 및 T 세포의 반응을 갖게 되며, 감염의결과는 면역상태에 의해 영향을 받게되고, 면역이 억제된 개인은 심각하고 쇠약하게 하는 질환을 격게 된다.
재발성 질환의 기니아 돼지 모델 (Iwasaka et al., 1983, Infect. Immun. 42:955-964) 및 감염된 환자에 있어서, 재발성 HSV-2 장애는 바이러스-특이적 T 세포 반응의 일시적 저하조절 (transient downregulation) 과 관련되어 있다. 인간 환자에 있어서, T 세포 저하조절은 신경계 바이러스 재활성화의 시기에 전구기 (prodrome) 동안 (장애 발병 전 1-2 일) 에 처음으로 나타났고 증상이 분명해지기 시작하는 장애 발병 후 3-5 일에는 더이상 나타나지 않았다. Th2 사이토카인 예를 들어, IL-6 및 IL-10 의 증가와 동시적으로 Th1 사이토카인 예를 들어, 인터페론 감마 (IFN-γ) 의 감소에서 보듯이, 저하 조절은 저하-조절 기능을 갖는 제 2 형 (Th2) 개체군을 선호하도록 HSV-특이적 T 헬퍼 세포의 균형이 이동하는 것을 반영하는 것으로 보인다.
Th1 사이토카인 유전자의 동시-투여는 DNA 예방백신의 효능을 증가시키는 것으로 나타났다 (Sin et al., 1999, J. Immunol. 162:2912-2921). 그렇지만, Th1 사이토카인이나 IL-12 의 투여가 재발성 질환의 발병을 예방하기 위한 확실한 접근법은 아닌데, 이는 이러한 인자들은 몇몇 HSV 질환, 예건대 각막염 (Niemialtowski et al., 1992, J. Immunol. 149:3035-3039) 또는 HSV-관련 다형홍반 (Jones et al., 2000, J. Gen. Virol. 81:Pt 2:407-414) 의 병인 (pathogenesis) 에 기여하고, 이러한 환경에서 그것들의 투여는 면역병리학적 HSV 질환의 심각성을 최고점으로 증가시키기 때문이다 (Kanangat et al., 1996, J. Immunol. 156:1110-1116). 더욱이, 잠복성으로 감염된 삼차신경의 (trigeminal) 신경절 내에서 바이러스의 재활성화는 CD8+ 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cells, CTL) 에 의해 가장 효과적으로 저해되는데 (Liu et al., 2000, J. Exp. Med. 191:1459-1466), 이는 Th1 사이토카인만의 투여는 재발성 질환을 방지할 수 없다는 것을 시사하는 것이다. 그렇지만, CD+8 CTL 은 바이러스 단백질 (ICP47) 에 의한 간섭때문에 HSV 감염에 의해, 설령 유도된다 하더라도, 빈약하게 유도된다 (Jugovic et al., 1998, J. Virol. 72:5076-84).
파축 등 (Pachuk et al.) 은 미국 특허 제 5,958,895 호에서 개선된 HSV 백신 프로토콜의 설계를 위하여 면역반응을 주로 Th1 으로부터 주로 Th2 로 이동하게 하는 구조체 (constructs) 를 개시하고 있다. 파축 등은 나아가 Th2 반응이 백신 접종자에게 개선된 보호를 제공한다고 언급한다. 그렇지만, 재발성 질환의 감소를 위해 기대되는 반응에 대해서는 전혀 시시하고 있지 않다.
기아시 등 (Ghiasi et al.) 은 CD8+ 를 포함한 CD4+ CTL 세포 양자가 모두 HSV-1 에 대한 보호에 관여하고 있음을 밝혀냈다 (Ghiasi et al., 2000, Br. J. Ophthalmol. 84(4):408-12). 기아시 (미국 특허 제 6,193,984 호) 는 또한 HSV 단백질의 복합 혼합물이 HSV 감염 동물에서 발견되는 것보다 낮은 수준으로 항체를 생산하는데에 이용될 수 있음을 밝혀냈다.
백시니아 (vaccinia) 재조합체에 관한 연구는 (i) 당쇄화 (glycosylation) -관련 에피토프 (epitopes) 가 바이러스 당단백질에 의한 보호 면역의 유도에 필수적이고, (ii) 비-구조적 HSV 단백질로 백신접종을 함으로써 보호가 달성되며,(iii) 보호 면역의 발현은 재조합 벡터의 제조시 예상되는 "관련되는" 항원의 제시에 의존하고, (iv) 치명적인 HSV-2 질환으로부터의 보호 및 피부로부터 다량의 HSV-2 를 제거하는 것은 주로 바이러스-특이적 T 헬퍼 제 1 형 (Th1) 면역 반응의 기능이면서도, CD8+ CTL 이 또한 개입하고 있다 (Wachsman et al., 1992, Vaccine 10:447-454) 는 것을 시사하였다. 재발성 질환을 방지함에 있어서 바이러스 특이적 면역 반응의 역할은 불명하다. 항원-코딩 플라스미드 DNA 로 면역화하는 것은 어떤 모델에서는 보호 면역을 유도하는 것으로 보였지만 다른 것에서는 면역이 불완전하였다.
치료용 백신에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 없다. 서브유닛트 조제는 재발성 질환 빈도 및 증상의 심각성의 완만한 감소를 유발하고, 바이러스 탈락 (viral shedding) 의 발생율을 감소시키지만, 이러한 효과는 강력한 아주반트 (adjuvant) 의 동시투여에 의존적이다 (Ho et al., 1989, J. Virol. 63:2951-2958). 축적성 장애 스코어 (cumulative lesion score) 에 있어서 최소 감소 (36%) 가 한가지 (다른 것은 제외) 루트에 의해 주어진 gH 결실 HSV 재조합체에서 나타났으며, 상기 면역 반응의 역할은 아직 불명하다.
ICP10ΔPK 는 ICP10 유전자의 단백질 키나제 (PK) 도메인 내에 하나의 결실을 가진 돌연변이 HSV-2 바이러스이다. 이 돌연변이체 및 그것의 백신으로서의 특성은 미국 특허 제 6,013,265 호, 제 6,054,131 호, 및 제 6,207,168 호에 기술되어 있다. 상기 ICP10ΔPK 돌연변이체는 종양의 변환 (neoplastic transformation) 을 유발하지 않고 마이토제닉/증식성 Ras/MEK/MAPK 경로를 활성화하지 않는다(Aurelian et al., 1999, Vaccine 17:1951-1963; Smith et al., 2000, J.Virol. 74:10417-10429). 최근의 연구는 HSV-2 가 감염 환자에서 광범위한 초과다증식성 장애를 유발할 수 있음을 시사하므로 (Beasley et al., 1997, J. Am. Acad. Dermatol. 37:860-863) 상기 특성은 임상적으로 중요하다.
ICP10ΔPK 는 면역계에 제시되기 위한 광범위한 항원을 보유한다. 이것은 마우스 모델 내에서 HSV-특이적 체액성 및 T 세포 면역을 유도하고 (Aurelian et al. 1999, Vaccine 17:1951-1963), 기니아 돼지 내에서 DTH 반응을 유도한다 (Wachsman et al., 2001, Vaccine 19:1879-1890). 그렇지만, HSV-2 감염 동물의 면역화가, 기존의 바이러스 특이적 면역 반응을 Th1 이나 Th2-유사 프로파일의 수준 증가 쪽으로 조절할 수 있고 상기 조절은 항원 자극의 형태에 의존한다 (Mohamedi et al., 2000, Vaccine 18, 1778-1792) 는 것이 점차 명백해 지고 있다. 본 명세서에서 ICP10ΔPK 는 재발성 질환의 전개를 예방하는 (즉, 치료백신) 것으로 나타났기 때문에, 바이러스가 주기적으로 재발하거나 장기간 존재하는 다른 바이러스 질환뿐 아니라 헤르페스에서 재발성 질환을 감소시킬 수 있는 다른 구조체의 선택시 길잡이 역할을 하는 독특한 모델을 제공한다. 이들 가운데에는 HIV, 거대세포바이러스 (cytomegalovirus), 간염 (hepatitis), 수두 대상포진 (varicella zoster), 인간 유두종 바이러스 (human papillomavirus) 및 엡프스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr virus) 가 있다.
당업계에서는 재발성 질환을 개선하는 유용한 치료용 백신이 동정되고 이용될 수 있는 메카니즘을 제공할 필요성이 오랜동안 있어왔다. 본 발명은 이러한 필요를 만족시킨다.
본 발명은 동물 내에서 Th1 반응을 유도함으로써 잠복성 감염 동물에서 재발성 질환의 증상을 예방하거나 감소시키는 것에 관한 것이다.
본 발명은 특정한 면역 반응, 즉, 제 1 형 T 헬퍼 세포 (T Helper Cell type 1, Th1) 반응을 유도해내는 것을 개시한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 Th2 반응에 비하여 Th1 반응의 증가를 유도해내는 방법을 개시한다. 더욱이, 본 발명은 Th2 반응에 비하여 Th1 반응의 증가를 유도해내는 화합물을 개시하고, 그런 화합물을 어떻게 동정하는지를 개시한다. 이러한 반응은 전형적으로, 잠복성 감염 병원체에 특이적인, 우선적으로 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스의 비 증가, IFNγ/IL-10 의 비 증가, IL-12 의 수준 증가, 및 CD8+CTL 의 수준 증가와 같은 반응 중 하나 이상을 포함하며, 그에 따라 상기 병원체의 재활성화와 관련된 질환 증상 재발로부터 잠복성 감염 동물을 보호하게된다. 마우스 내에서 우선적인 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스의 비 증가는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 IgG2a/IgG1 의 비 증가이다. 그렇지만, 인간 및 기타 동물에 있어서 상기 반응의 면역글로불린 및 그의 비는 다양할 수 있고 IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, IgG3/IgG4, (IgG1+IgG2+IgG3)/IgG4, (IgG1+IgG2+IgG3)/IgG5, IgG1/IgE, IgG2/IgE, 또는 IgG3/IgE 와 같은 비들을 포함한다. 전형적으로, 그러한 병원체는, 전형적으로는 사이클 내에서, 잠복기 및 활성기를 겪는 바이러스이다. 상기 병원체의 예는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpessimplex virus, HSV), C형 간염 바이러스 (hepatitis C Virus, HCV), 엡프스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr virus, EBV), 인간 유두종 바이러스 (human papillomavirus, HPV), 거대세포바이러스 (cytomegalovirus, CMV), 수두 대상포진 바이러스 (varicella zoster virus) 및 인간 면역 결핍성 바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV) 를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
하나의 특정한 구체예에 있어서, 본 발명은 ICP10PK 도메인이 없는 살아있는 HSV-2 및, 이에 따라 관련된 단백질 키나제 및 온코진 (oncogene) 활성이 독특한 면역 반응을 유도하고, 이러한 독특한 면역 반응이 살아있는 천연 (wild type) HSV-2 로 감염된 대상 내에서 지속하며, 이러한 독특한 면역 반응이 상기 보호적인 독특한 면역 반응을 또한 유도할 수 있는 다른 바이러스, 화합물, 조성물, 제제 또는 분자를 동정하는 시험분석에 이용될 수 있다는 것을 개시한다. 따라서, HSV 감염 및 재발성 질환에 대해 면역과 관련된 특이적 면역 반응을 유도하는 제제를 동정하는 신규한 방법뿐만 아니라 상기 반응을 유도해내기 위한 신규한 방법이 발견되었다.
본 발명의 한 구체예에 있어서, HSV, 또는 ICP6PK 나 ICP10PK 단백질이 없는 HSV 유래 단백질의 혼합물은 단독으로 또는 면역 자극제나 아주반트와 함께 투여되어 우세한 바이러스 특이적 Th1 반응을 유도한다. 이러한 단백질은 HSV DNA, 또는 ICP6PK 나 ICP10PK 단백질을 코딩하는 DNA 가 없는 HSV 단백질을 코딩하는 핵산이나 DNA 의 혼합물을 단독으로 또는 면역 자극제나 아주반트와 함께 투여함으로써 간접적으로 투여되어 우세한 바이러스 특이적 Th1 반응을 유도할 수 있다. 어느 경우든, 바이러스 특이적 Th1 반응은 마우스에서 IgG2a/IgG1 또는 인간에서 IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, IgG3/IgG4, (IgG1+IgG2+IgG3)/IgG4, (IgG1+IgG2+IgG3)/IgG5, IgG1/IgE, IgG2/IgE, 또는 IgG3/IgE 와 같이 우선적으로 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스들의 비 증가를 포함하며, 투여전 비를 적어도 15 %, 바람직하게는 적어도 25 % 상회함으로써, 재발성 질환을 감소시키는 방법을 제공한다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 비의 증가는 적어도 50 % 이다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 비의 증가는 적어도 75 % 이다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 비의 증가는 적어도 95 % 이다. 본 명세서에서 개시되는 내용에 근거하여 당업자는, 면역글로불린 서브클래스 및 비 양자에 있어서, Th1 반응이 상이한 종 가운데에서 다양할 수 있음을 알 것이며, 상기 반응을 결정하고 측정할 적절한 기술을 이용할 수 있을 것이다.
면역글로불린의 비 증가, CD8+ CTL 수준 증가, 및 IL-12 수준 증가의 하나 이상에 대신하거나 추가적으로, 바이러스 특이적 Th1 반응은, 혈액 수준이나 시험관내 (in vitro) T 세포 배양에 의해 측정되는 바와 같이, 투여전 비를 적어도 15 %, 바람직하게는 적어도 25 % 상회하는, 바이러스-특이적 IFNγ/IL-10 비의 증가를 포함할 수 있으며, 따라서 재발성 질환을 감소시키는 방법을 제공한다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 비의 증가는 적어도 50 % 이다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 비의 증가는 적어도 75 % 이다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 비의 증가는 적어도 95 % 이다.
IFNγ/IL-10 비, CD8+ CTL 수준, 및 면역글로불린의 비 증가의 하나 이상에대신하거나 추가적으로, 바이러스 특이적 Th1 반응은, 혈액 수준이나 시험관내 (in vitro) 수상돌기 세포 (dendritic cells) 배양에 의해 측정되는 바와 같이, 투여전 비를 적어도 15 %, 바람직하게는 적어도 25 % 상회하는, IL-12 수준의 증가를 포함할 수 있으며, 따라서 재발성 질환을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 증가는 적어도 50 % 이다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 상기 증가는 적어도 75 % 이다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 상기 증가는 적어도 95 % 이다.
IFNγ/IL-10 비, IL-12 수준, 및 면역글로불린의 비 증가의 하나 이상에 대신하거나 추가적으로, 바이러스 특이적 CD8+ CTL 수준은 투여전 수준을 적어도 15 %, 보다 바람직하게는 적어도 25 % 상회하도록 증가되며, 따라서 재발성 질환을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 증가는 적어도 50 % 이다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 상기 증가는 적어도 75 % 이다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 상기 증가는 적어도 95 % 이다.
마우스에서 IgG2a/IgG1 또는 인간에서 IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, IgG3/IgG4, (IgG1+IgG2+IgG3)/IgG4, (IgG1+IgG2+IgG3)/IgG5, IgG1/IgE, IgG2/IgE, 또는 IgG3/IgE 와 같이, 우선적으로 Th1 반응을 반영하는 면역글로불린 서브클래스들, IFNγ/IL-10 비, IL-12 수준, 및 CD8+ CTL 수준의 상대적 증가는, 비록 전부 같은 정도로 증가되는 것이 바람직하더라도, 전부 동일할 필요는 없다.
ICP10ΔPK 는 ICP10 유전자의 단백질 키나제 (PK) 도메인 내에 결실을 가진 돌연변이 HSV-2 바이러스이다. 이 돌연변이체 및 그것의 백신으로서의 특성은 미국특허 제 6,013,265 호, 제 6,054,131 호, 및 제 6,207,168 호에 기술되어 있다. HSV-2 돌연변이 ICP10ΔPK 는 상기 면역 특성을 유도해내는 단백질의 혼합물을 제공하는 하나의 공지된 방법이다. 미국 특허 제 6,013,265 호, 제 6,054,131 호, 및 제 6,207,168 호는 그 내용이 그 전체로서 인용되어 본 출원에 통합된다.
ICP6PK 는 HSV-2 내 ICP10PK 의 HSV-1 유사체 (analog) 이다. HSV-1 에 의한 재발성 감염을 치료하기 위하여, ICP6PK 을 제외한, HSV-1 유래 단백질이 HSV-2 에 대해 본 명세서에서 기술한 바와 마찬가지 방법으로 이용될 수 있다. 본 발명은 ICP6PK 이나 ICP10PK가 존재하지 않는 모든 HSV 균주로부터 유래한 HSV 단백질의 모든 혼합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에서는, ICP10PK가 존재하지 않는 HSV 단백질의 혼합물로 마우스를 치료하면, 상기 동물을 HSV-2 로 치료하는 것에 비해 HSV-2 항원투여에 대한 림프절 세포의 반응에 상이한 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 상기 치료된 마우스로부터 유래한 림프절 세포는, 연이어 HSV-2 로 항원투여할 경우 ICP10PK 를 함유하는 HSV-2 단백질로 예비치료된 동물로부터 유래한 림프절 세포보다 고수준의 IFNγ 및 저수준의 IL-10 을 분비한다. IL-10 에 대한 IFNγ 의 비는 또한 ICP10PK 가 없는 HSV 단백질 혼합물로 치료된 동물에서 유래한 세포에서 더 높다. 더욱이, 이러한 사실은 바이러스 특이적 Th1 반응을 가리키는 바이러스 특이적 IgG 항체 타입의 혈청 수준 (IgG2a/IgG1 비) 을 나타낸다. 또한 상기 사실은 바이러스 특이적 CD8+ CTL 의 수준 증가를 나타낸다. 상기 데이타는 ICP10PK 가 없는 HSV 단백질의 혼합물을 적절히 선택하여 생체내에서 (in vivo) 예비치료하면 Th1 기능을 지향하도록바이러스 특이적 면역 반응을 왜곡하여 재발성 질환의 감소를 유발한다는 것을 나타낸다.
본 발명은 HSV 감염에 이후 수상돌기 림프절 세포에 의한 IL-12 의 생산량이 증가하는 것에 근거하여, ICP6PK 이나 ICP10PK가 존재하지 않는 HSV 단백질을 갖는 혼합물을 적절히 선택하여 동물을 예비치료하면 바이러스 특이적 Th1 반응이 유도된다는 것을 추가적으로 예시한다.
발명의 또 다른 구체예에 있어서, HIV 감염을 치료하기 위하여, HIV-1 Env, gp41, 및 Gag 단백질의 혼합물, 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA 를 투여하는 것이 본 발명에서 확인되는 변형된 면역글로불린 비, IFNγ/IL-10 비, IL-12 나 CD8+ CTL 의 수준을 달성하기 위하여 이용될 수 있다 (Ngo-Giang-Huong et al.,2001,AIDS Res.Hum.Retrovirus 17:1435-1446).
CMV 감염을 치료하기 위한 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 인산화단백질 pp65 및 gB 단백질의 혼합물, 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA 를 투여하는 것이 덴스 바디 (dense bodies) 나 덴스 바디를 코딩하는 DNA 에 더하여, 본 발명에서 확인되는 면역글로불린 비, IFNγ/IL-10 비, IL-12 나 CD8+ CTL 의 수준을 변형시키기 위하여 이용될 수 있다 (Pepperl et al.,2000,J Virol.74:6132-46).
C형 간염의 감염을 치료하기 위한 발명의 또 다른 구체예에 있어서, Co.120, 헬리카제, NS3, NS4 및 NS5 단백질의 혼합물, 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA 를 투여하는 것이 본 발명에서 확인되는 면역글로불린 비, IFNγ/IL-10 비, IL-12 나 CD8+ CTL 의 수준을 변형시키기 위하여 이용될 수 있다 (Alvarez-Obregon etal.,2001, Vaccine 19:3940; Hempel at al.,2001,J.Med.Virol.64:340-349).
인간 파필로마바이러스 감염을 치료하기 위한 구체예에 있어서, 인간 파필로마바이러스 (HPV) 타입-16의 aa 6-36 단백질 및 HPV-16 E2 단백질의 C-말단과 N-말단 도메인의 혼합물 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA 를 투여하는 것이 본 발명에서 확인되는 면역글로불린 비, IFNγ/IL-10 비, IL-12 나 CD8+ CTL 의 수준을 변형시키기 위하여 이용될 수 있다 (Bontkes et al.,1999, J.Gen.Virol.80:2453-2459; de Gruijl at al.,1996,Int.J.Cancer.68:731-738).
에프스타인-바르 바이러스 감염을 치료하기 위한 또 다른 구체예에 있어서, EBNA1 및 EBNA3 단백질의 혼합물 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA 를 투여하는 것이 본 발명에서 확인되는 면역글로불린 비, IFNγ/IL-10 비, IL-12 나 CD8+ CTL 의 수준을 변형시키기 위하여 이용될 수 있다 (Bickham et al.,2001,J.Clin.Invest.107:121-130).
수두 대상포진 바이러스 감염을 치료하기 위한 구체예에 있어서, 당단백질 gE 의 혼합물 또는 gE 단백질을 코딩하는 DNA 를 투여하는 것이 본 발명에서 확인되는 면역글로불린 비, IFNγ/IL-10 비, IL-12 나 CD8+ CTL 의 수준을 변형시키기 위하여 이용될 수 있다 (Hasan et al.,2000,Vaccine18:1506-14).
본 발명은 "단백질이나 단백질들의 투여" 라는 용어가 단백질을 직접 투여하는 것만을 의미하는 것으로 한정하여 해석되어서는 안된다. 단백질을 코딩하는 DNA 나 분리된 핵산이 투여되는 때과 같이, 단백질의 간접 투여를 의미하는 것으로도 또한 해석되어야 한다.
대상을 면역화하는 것은 병원성 바이러스로 잠복성으로 감염된 대상 내의 재발성 질환의 증상을 감소시키기 위하여 본 명세서에서 개시된 본 발명의 조성물 및 방법의 치료적 이용뿐만 아니라 당업계에서 잘 알려진 표준적 해석을 가리킨다.
본 발명은 잠복성 감염 병원체에 대한 Th1 면역 반응을 유도하는 재제의 동정 또는 스크리닝 방법 및, 상기 반응을 유도하고 그에 따라 기타 병원체와 관련된 재발성 질환에 대해 동물을 보호하기 위하여 상기 조성물을 동물에, 바람직하게는 인간에 투여하는 방법을 또한 포함한다. 전형적으로, 상기 조성물은 본 명세서에서 개시된 내용에 근거하여, 돌연변이 바이러스 균주나 단백질 혼합물을 제조함으로써 제조될 것이다.
바이러스 특이적 Th1 면역 반응을 유도하는 인간용 재제의 제제화 (formulation) 는 안정화제와 함께 또는 없이, 그리고 면역 자극제 및 아주반트와 함께 또는 없이 용액내에서 현탁하여 얻어진다. 안정화제, 면역자극제 및 아주반트의 예는 무엇보다, 알룸, 오일/물 에멀젼, 사포닌, 불완전 프로이드 아주반트, MR-59 (Chiron Corp.사, Emeryville, CA.), MTPPE, 및 MPL (모노-포스포릴 리피드 A) 를 포함한다. 상기 안정화제, 면역자극제 및 아주반트는 당업계에서 공지되어 있고, 단독으로 또는 조합하여 이용될 수 있다. 인간에서 IgG2 또는 마우스에서 IgG2a 의 생산을 촉진하는 자극제가 특히 바람직하다.
본 발명의 조성물은 어떠한 동물에도 투여될 수 있는데, 물고기, 양서류, 조류, 및 포유류 (여기서 포유류는 원숭이, 돼지, 말, 소, 개, 고양이, 및 인간을 포함하지만 이에 한정되지 않는다) 를 포함한다. 상기 조성물은 근육 내(intramuscular), 경구 (oral), 피하 (subcutaneous), 피부 내 (intradermal), 질내 (intravaginal), 직장 내 (rectal), 또는 비강내 (intranasal) 투여와 같이 적절한 투여 형식을 통하여 투여될 수 있다. 바람직한 투여형식은 경구, 정맥 내, 피하, 근육 내 또는 피부 내 투여이다. 가장 바람직한 형식은 피하 투여를 포함한, 비경구 투여이다.
필요하다면 추가항원자극 (boosters) 을 포함하여, 투여의 빈도 및 면역화와 관련된 기타 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 이미 기술되거나 결정되지 않았을지라도 과도한 실험없이 그와 같이 시행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명 조성물의 적절한 면역보호적, 비독성 및 독특한 면역 반응-유도량은 통상의 백신 내 항원의 유효량의 범위내 일 수 있다. 그렇지만, 어느 특정 대상을 위한 투여량 수준은 나이, 일반적인 건강상태, 성 및 대상의 상식 (diet) 을 포함하는 다양한 요소들에 의존할 것이라는 것을 이해하여야 한다. 투여량 (dose level) 에 영향을 미치는 기타 요소들은 투여 시간, 투여 경로, 투여되는 다른 약물과의 상승적, 상가적, 또는 길항적인 상호작용, 및 추구하는 면역 반응의 유도 수준이나 보호의 양을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 조합백신에 있어서, 본 발명의 백신의 투여용량 (dosage) 은 다른 백신 구성성분의 방해를 상쇄하기 위해 증가될 필요가 있을 수 있다.
본 발명의 조성물, 예컨대, HSV-2 돌연변이, ICP10ΔPK 를 포함하는 치료용 백신은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 다른 백신과 조합하여 사용할 수 있다. 다른 백신은 간염, 에프스타인 바르 바이러스, 인간 파필로마바이러스 바이러스,천연두 (smallpox) 바이러스, HIV, 수두 (chickenpox), 볼거리 (mumps), 및 홍역 (measles) 과 같은 질환이나 바이러스에 대한 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 개시된 내용에 근거하여, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 HSV 에 노출시키는 다량한 투약계획 (regimens) 및 후속적인 백신이나 조합백신의 투여가 포함되며 결정될 수 있다. 예를 들어, HSV 나 돌연변이 HSV 에 대상을 노출시킨 후, HSV 백신 및, HSV-1, HSV-2, HSV-1 의 돌연변이, HSV-2 의 돌연변이, 및 기타 바이러스나 그의 돌연변이를 포함하는, 다른 바이러스 백신의 다양한 조합으로 대상에 투여할 수 있다. 본 발명에서 개시된 내용에 근거하여, 당업자는 다양한 조합을 결정할 수 있다.
바이러스 특이적 Th1 면역반응을 유도하는 돌연변이 바이러스나 기타 제제는 약제학적으로 허용가능한 담체나 희석제와 함께 투여할 수 있다. 그러한 약제학적으로 허용가능한 담체나 희석제의 예는 물, 인산 완충화 식염수 또는 소듐 바이카보네이트 완충액을 포함한다. 기타 다수의 허용가능한 담체나 희석제가 당업계에 또한 알려져 있다.
따라서, 본 발명은 HSV 및 다른 잠복성 감염 바이러스 병원체에 대해 신규하거나 독특한 면역 반응, 상기 반응을 유도하기 위한 신규한 방법, 상기 반응을 유도하는 제제를 동정하는 신규한 방법, 및 재발성 바이러스 질환을 개선하는 신규한 방법을 발견하였다.
용어의 정의
본 명세서에서 관사 "한(a)" 및 "하나(an)" 는 관사의 문법적 목적어의 하나이상 (즉, 적어도 하나) 또는 하나를 말한다. 예로서, "한 요소 (an element)" 는 하나의 요소 또는 하나 보다 많은 요소를 의미한다. "복수 (Plurality)" 는 적어도 둘을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "약(about)" 또는 "적어도(at least)" 는 기술된 수보다 약 5 퍼센트 적거나 많은 것을 의미하는데, 즉, "적어도 25 %" 는 "적어도 20 에서 30 % " 를 의미하지만, "적어도" 란 구로 정의되는 어떠한 범위를 제한하지는 않는다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "개선하다 (ameliorate)" 는 감염이나 질환의 증상을 개선하거나 완화하고 재발성 질환의 활성 단계에 관련된 증상의 발전을 방지하거나 완화하는 치료를 말한다. 개선이란 질환의 재발의 발생뿐만 아니라 재발의 심각성을 감소시키는 것을 모두 포함한다. "재발성 질환을 개선한다"는 것은 "재발성 질환을 감소시킨다"는 것과 상환하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "동시-투여" 는 전에, 동시에, 또는 연이어서를 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 "사이토카인 (Cytokine)" 은 세포내 신호전달 분자를 말하는데, 이의 가장 잘 알려진 것이 포유류 체세포 (somatic cells) 의 조절에 관여하고 있다. 그 효과상 성장 촉진 및 성장 저해를 모두 담당하는, 사이토카인의 많은 패밀리가 특성분석되었는데, 예를 들어, 인터루킨 (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9 (P40), IL-10, IL-11, IL-12 및 IL-13 과 같은 것); CSF-타입 사이토카인 (GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LIF, EPO, TNF-α 및 TNF-β와 같은 것); 인터페론 ( IFN-α, IFN-β 및 INF-γ 와 같은 것); TGF-β 패밀리의 사이토카인 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 인히빈 A, 인히빈 B, 악티빈 A, 및 악티빈 B 와 같은 것); 화학주성 인자 (chemotactic factors) (NAP-1, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, SISβ, SISδ, SISε, PF-4, PBP, γIP-10, 및 MGSA 와 같은 것); 성장인자 (EGF, TGF-α, aFGF, bFGF, KGF, PDGF-A, PDGF-B, PD-ECGF, INS, IGF-I, IGF-II, 및 NGF-β); α-타입 인터크린 사이토카인 (IL-8, GRO/MGSA, PF-4, PBP/CTAP/βTG, IP-10, MIP-2, KC, 및 9E3 와 같은 것); 및 β-타입 인터크린 사이토카인 ( MCAF, ACT-2/PAT, 744/G26, LD-78/PAT 464, RANTES, G26, I309, JE, TCA3, MIP-1α,β, 및 CRG-2 와 같은 것) 을 포함한다. 기타 다수의 사이토카인이 당업자에게 공지되어 있다. 상기 사이토카인의 원천, 특성, 작용점 및 효과자 활성은 기술되어 있다.
여기서 사용하는 "질환" 은 동물이 항상성 (homeostasis) 을 유지할 수 없는 동물의 건강 상태이다.
"헤르페스" 란 용어는 헤르페스 심플렉스 바이러스와 관련된 질환을 의미한다.
항원에 대한 "면역화" 란 용어는, 대상 내에서 면역 반응을 유도해 내는, 조성물, 단백질 복합체, 단백질 복합체를 코딩하는 DNA, 항체나 항체를 코딩하는 DNA, 단백질이나 항체를 코딩하는 DNA 를 함유한 파지, 또는 그 표면에 항체나 단백질을 발현하는 파지를 대상에 투여하는 것을 의미한다. 바람직하게는 상기 면역 반응은 항원이나 항원을 발현하는 유기체에 기인한 질환에 대한 보호를 대상에게제공한다.
본 명세서에서 사용하는 "분리된 핵산" 이란 서열로부터 분리된 핵산 단편이나 파편을 말하는데 자연 발생 상태에서 이를 그 양측에서 포함하는 서열로부터 분리된 것이다. 상기 용어는 또한 자연적으로 상기 핵산과 동반하는 기타 구성성분, 예컨대 RNA 나 DNA 또는 단백질로서 세포내에서 자연적으로 그것을 동반하는 것으로부터 실질적으로 정제된 핵산을 의미한다.
본 발명이 사용하는 핵산의 성질에 의해 제한되는 것을 의도하는 것은 아니다. 표적 (target) 핵산은 자연적인 또는 합성된 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 바이러스, 박테리아, 동물, 파지, 또는 식물 원천으로부터 유래할 수 있다. 상기 핵산은 DNA 나 RNA 일 수 있으며 이중-가닥 (double-stranded), 단일-가닥 (single-stranded) 또는 부분적으로 이중-가닥 (partially double-stranded) 형태로 존재할 수 있다. 더욱이, 핵산은 바이러스나 기타 거대분자의 부분으로 발견될 수도 있다. 예컨대, Fasbender et al., 1996, J. Biol. Chem. 272:6479-89. 를 참조.
본 발명에 유용한 핵산은 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴틀레오티드; 유전자 치료용 DNA; 바이러스 DNA 및/또는 RNA 를 포함하는 바이러스 단편; DNA 및/또는 RNA 키메라; mRNA; 플라스미드; 코스미드; cDNA; 유전자 단편; 이중-가닥 (double-stranded) DNA, 단일-가닥 (single-stranded) DNA, 수퍼코일 (supercoiled) DNA 및/또는 삼중-나선형 (triple-helical) DNA 를 포함하는 다양한 구조적 형태의 DNA; Z-DNA; 등을 포함하며, 이들 예에 한정되지 않는다. 핵산은 다량으로 핵산을 제조하기 위해 전형적으로 사용되는 통상의 재래의 수단으로 제조할 수 있다. 예를들어, DNA 및 RNA 는 상업적으로 입수가능한 시약 및 합성기를 이용하여 당업계에서 공지된 방법으로 화학적으로 합성할 수 있다. RNA 는 플라스미드를 이용한 시험관내 전사 (in vitro transcription) 를 통하여 고수율로 생산할 수 있다.
높은 뉴클레아제 안정성이 필요한 경우에서와 같이, 어떤 환경에서는, 변형된 인터뉴클레오시드 연쇄 (linkage) 를 갖는 핵산이 바람직할 수 있다. 변형된 인터뉴클레오시드 연쇄 (linkage) 를 포함하는 핵산은 당업계에서 공지된 시약 및 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들면, 포스포네이트 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트 메톡시에틸 포스포라미데이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 디이소프로필실릴, 아세트아미데이트, 카바메이트, 디메틸렌-설파이드 (-CH2-S-CH2), 디메틸렌-술폭시드 (-CH2-SO-CH2), 디메틸렌-술폰 (-CH2-SO2-CH2), 2'-O-알킬, 및 2'-데옥시-2'-플루오로 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 연쇄 (linkage) 를 포함하는 핵산의 합성 방법이 당업계에 공지되어 있다 (Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 3 1:335 및 본 명세서에 인용된 문헌 참조).
핵산은 당업계에서 공지된 바대로, 적절한 수단으로써 정제할 수 있다. 예를 들면, 핵산은 역상 (reverse phase) 또는 이온 교환 HPLC, 사이즈 엑스클루젼 크로마토그래피 (size exclusion chromatography) 또는 겔 전기영동에 의해 정제할 수 있다. 물론 숙련된 당업자는 정제 방법이 부분적으로는 정제할 DNA 의 크기에 의존한다는 것을 인식할 것이다. 핵산이란 용어는 또한 생물학적으로 발생하는 다섯 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 염기로 구성된 핵산을 특이하게 포함할 수 있다.
여기서 사용하는 "약제학적으로 허용가능한 담체" 란 용어는 활성 성분이 조합될 수 있고, 상기 조합에 따라 활성 성분을 대상에 투여하기 위해 사용할 수 있는 화학적 조성물을 의미한다.
"폴리펩티드" 란 펩티드 결합으로 연결된 아미노산 잔기, 자연발생적인 관련 구조변형체, 및 합성된 비자연발생적인 그의 유사체 (analog), 자연발생적인 관련 구조변형체, 및 합성된 비자연발생적인 그의 유사체 (analog) 로 구성된 중합체를 말한다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어, 자동화된 폴리펩티드 합성기를 이용하여 합성할 수 있다.
"단백질" 이란 용어는 전형적으로 큰 폴리펩티드 또는 전사후 변형된 폴리펩티드 (polypeptides) 를 말한다.
"펩티드" 란 용어는 전형적으로 짧은 폴리펩티드 또는 전사후 변형된 폴리펩티드를 말한다.
본 명세서에서 사용하는 "재발성 질환" 이란 용어는 잠복성 바이러스의 재활성화에 따라 발생하거나 재발하는 질환 증상을 말한다.
본 명세서에서 사용하는 "치료" 란, 질환을 갖고 있거나 질환의 징후를 나타내는 대상에게 투여하는, 유익한 효과를 제공하기에 충분한 처리를 말한다. 유익한 효과는 재발성 질환을 감소시키는 것 등을 포함한다. 예방 또는 방지적 치료 또는 백신은 감염을 막고 질환과 관련된 병변의 발생 위험을 감소시키고자하는 목적으로 질환을 가지고 있지 않거나 질환의 징후를 보이고 있지 않은 대상에게 투여하는 것이다.
본 명세서에서 사용하는 "백신" 이란 용어는 동물에 접종했을 때 동물에서, 질환이나 그 증상에 대해 동물을 완전히 또는 부분적으로 보호하는 역할을 하는 면역 반응을 자극하는 효과를 갖는 조성물을 말한다. 백신이란 용어는 치료용 백신뿐만 아니라 예방적 백신을 포함한다. 조합 백신은 둘 이상의 백신을 조합한 것이다.
하기 실시예는 당업계의 실시자에게 추가적 길잡이로서 또한 본 발명의 이해를 한층 용이하게 하기위하여 제공되는 것이며, 어떠한 경우에도 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하기 실시예들은 예시적이며 발명을 한정하는 것이 아니다.
본 명세서 실시예 1-4 에서 사용되는 물질을 하기한다.
오주령 스위스 웹스터 (Swiss Webster) 또는 BALB/c 마우스가 사용되었으며 찰스 리버 렙, 워싱턴, 메사츄세츠 (Charles River Labs, Wilmington, MA) 로부터 입수하였다. HSV-2 에 대한 표준 동물 모델이기 때문에 마우스가 선택되었다. 항-IFN-γ항체 (R4-6A2), 항-IL-10 항체 (JESS-2A5), 바이오틴화 (biotinylated) 항-IFN-γ 항체 (XMG1.2), 항-IL-12 항체 (C15.6), 바이오틴화 항-IL-12 항체 (C17.8) 및 항-IL-10 항체 (JES5-16E3) 는 파밍젠, 샌디에고, 캘리포니아 (Pharmingen, San Diego, CA) 로부터 입수하였다. 염소 항-마우스 IgG, IgG1, 및 IgG2a 와 마우스 항-인간 IgG1 및 IgG2 는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이트 사, 브링험, 알라바마 (Southern Biotechnology Associates, Inc, Birmingham, AL.) 로부터 입수하였다. 항체로 코팅된 다이나비드 (Dynabids) 는 다이날, 오슬로, 노르웨이 (Dynal, Oslo, Norway) 로부터 입수하였다. 재조합 뮤린 IL-12 는 파밍젠 (Pharmingen) 으로부터 입수하였다. 니트로셀룰로스 막 (Millititer HA) 은 밀리포어, 베드포드, 메사츄세츠 (Millipore, Bedford, Massachusetts) 로부터 입수하였다. HSV-2 항원은 서던 바이오테크놀로지 어소시에이트 사, 브링험, 알라바마 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Ala.) 로부터 입수하였다.
실시예1
ICP10ΔPK 로 유도해낸 HSV 특이적 면역 반응은 Th1 패턴을 현저하게 증명한다.
본 실시예에서 제시되는 실험에서 사용한 방법을 하기한다.
풋패드 (footpad) 내에서 피하접종에 의해 마우스 (Swiss Webster, 5주령, Charles River) 를 HSV-2 (1 x 106plaque forming units (pfu)) 또는 ICP10ΔPK (3 x 106pfu) 로 감염시켰다. 10 일 간격으로 2 또는 3 회 주사하였다.
최후의 주사 이후 3, 5 및 10 일에서 슬와부 림프절 세포 (popliteal lymph node cells, LNC) 를 수집하고 RPMI-10% FCS (완전배지) 내에서 10 ㎍/ml 의 HSV-2 항원으로 배양하였다 (4 x 106세포/ml). 인터페론-감마 (IFN-γ) (Th1) 또는 인터루킨 10 (IL-10) (Th2) 을 분비하는 세포가 배양 내에서 1-5 일에 엘리스폿분석실험 (ELISPOT assay) 으로 확인되었다. 엘리스폿 분석실험을 이용하여 IFN-γ 및IL-10 을 분비하는 세포를 찾기위해 새로 분리된 LNC 를 또한 연구하였다. 또한, 어떤 실험에서는, 항체로 코팅된 자석 비드 (Dynabeads; Dynal, Oslo, Norway) 를 이용하여 LNC 로부터 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 제거하고 HSV-2 항원 (10 ㎍/ml) 으로 배양하고 상기와 같이 엘리스폿 분석실험을 하였다.
엘리스폿 분석실험을 상기한 바대로 수행하였다. 약술하자면, 니트로셀룰로스 막 베이스 (Millititer HA, Millipore) 를 담고 있는 96-웰 플레이트를, PBS 내에서 2 ㎍/ml (100 ㎕/웰)의 농도로 항-IFN-γ mAb (R4-6A2: Pharmingen, San Diego, CA) 또는 항-IL-10 mAb (JES5-2A5: Pharmingen) 로 4℃ 에서 밤새 (overnight) 코팅하였다. 웰을 PBS 로 두번 세척한 후 완전배지로 실온에서 1 시간동안 봉쇄 (block) 하였다. 개별 웰에 자극된 또는 비자극된 LNC 를 첨가 (1 x 105세포/웰) 하고 37 ℃ 에서 20 시간동안 배양하였다. 웰을 PBS-0.5% 트윈20 (Tween20, 4 x) 로 세척하여 세포를 제거하고 실온에서 1 시간동안 PBS-트윈 내 2 ㎍/ml 의 농도에서 바이오틴화 항-IFN-γ mAb (XMG1.2: Pharmingen) 또는 항-IL-10 mAb (JES5-16E3: Pharmingen) 100 ㎕ 로 인큐베이션하였다. PBS-트윈으로 세척한 후에, 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC) 을 거친 PBS-트윈 내 1:1000 희석된 아비딘-퍼옥시다제 100 ㎕ 의 인큐베이션 (30분; 실온) 으로 상기 반응을 현상시켰다. 특이적 사이토카인을 분비하는 세포 (SFC) 의 콜로니를 나타내는 스폿을 세고 세개의 독립적 실험 결과를 평균화하였다. 결과는 SFC/105세포 +/- SEM 로서 표현하였다.
2 면역화가 주어진 마우스로부터 유래한 LNC 에서, IFN-γ를 분비하는 세포수는 HSV-2 및 ICP10ΔPK 양자에 대해 접종 후 3 일에 피크를 나타냈으며 그 이후 감소했다. 접종 후 3 일에 SFC/105세포는 HSV-2 에 대해 138 +/-20 이었고 ICP10ΔPK 에 대해 182 +/-40 이었다. 그러나, IL-10 를 분비하는 세포수는 접종후 3일 및 5일 양자모두 ICP10ΔPK 보다 HSV-2 에 대해 더 높았으므로, IFN-γ/IL-10 SFCs 의 비가 HSV-2 (접종 후 3일 및 5일에 대해 각각 2.0+/-0.13 및 2 +/-0.07) 보다 ICP10ΔPK (접종 후 3일 및 5일에 대해 각각 3.8+/-0.38 및 4.0+/-0.36) 에서 훨씬 더 높았다. IFN-γ/IL-10 SFCs 의 상대적으로 높은 비는 접종 후 10 일의 ICP10ΔPK 에서 여전히 보였다 (ICP10ΔPK 및 HSV-2 에 대해 각각 4.4 +/-1.1 및 2.1 +/-0.08). 상기 IFN-γ/IL-10 비는 HSV-2 (3.4 +/-0.16) 에 비하여 ICP10ΔPK (5.3 +/-0.39) 로 감염된 마우스로부터 유래한 새로 분리된 LNC 에서 또한 더 높았다. IFN-γ 또는 IL-10 를 분비하는 세포수는 HSV-2 및 ICP10ΔPK 로 감염된 마우스로부터 유래한 LNC 모두에 대해 배양 내 시간에 따라 증가하여 2-3 일에 최고조에 이르렀으며 이후 감소하였다. 배양내 5 일에, IL-10 생산 세포는 HSV-2 에 대해서는 여전히 보였지만 ICP10ΔPK 에 대해서는 그렇지 않았다. 상기 차이점은 이 시간에서 HSV-2 보다 ICP10ΔPK 에 대해 상대적으로 높은 IFN-γ/IL-10 SFC 의 비에 반영되어 있다. 3 면역화가 주어진 동물에서도 접종 후 10 일에서 수집된 LNC 의 IFN-γ/IL-10 SFC 비는 HSV-2 (1.9 +/-0.2) 에서보다 ICP10ΔPK (5.3 +/-0.7) 에서 더 높았다. 상기 데이타는 ICP10ΔPK 에 대한 체내 (in vivo) 노출이 Th1 기능에 유익하도록 상기 반응을 왜곡하였고 HSV-2 항원에 대한 시험관내 (in vitro) 노출은 상기 균형에 부정적으로 작용하지 않았다는 것을 시사하는 것으로 해석될 수 있다.
상기 결론의 유효성을 확인하기 위하여, 상기에서 연구한 LNC 배양 상청액을 IFN-γ 및 IL-10 수준에 대해 분석실험하였다. 항-IFN-γ (R4-6A2: Pharmingen) 및 항-IL-10 (JESS-2A5: Pharmingen) mAbs 를 포획 항체 (capture antibodies) 로 이용하고 바이오틴화 항-IFN-γ (XMG1.2: Pharmingen) mAb 및 항-IL-10 (JES5-16E3: Pharmingen) mAb 를 감지 (detection) 항체로 이용하여 엘리사 (ELISA) 를 수행하였다. 재조합 마우스 IFN-γ 및 IL-10 (Pharmingen) 를 표준 곡선을 만들기 위한 대조군 (control) 으로 사용하였다. 상기 연구의 결과는 IL-10 의 수준이 HSV-2 면역화 동물 (4184 +/-358 pg/ml) 보다 ICP10ΔPK 에서 유래한 HSV-자극된 (또는 비자극된) LNC 의 상청액 (924 +/-102 pg/ml) 에서 훨씬 더 낮다는 것을 시사한다. 엘리스폿 및 엘리사 분석실험 양자 모두에 있어서, 고갈 (depletion) 연구는 CD4+ 세포에 의해 IFN-γ 및 IL-10 양자 모두가 생산된다는 것을 나타내었다. 따라서, HSV-2 감염된 마우스 유래 LNC 의 사이토카인 분비 세포 콜로니 수 (IFN-γ 및 IL-10 에 대해 각각 77 +/-5.6 및 37.2 +/-4.2) 는 CD4+ 세포의 고갈에 의해 크게 감소 (IFN-γ 및 IL-10 에 대해 각각 7.6 +/-1.3 및 3.8 +/-1.0) 되었지만, CD8+ CTL 세포의 고갈이 사이토카인 분비 세포의 수를 감소시키지는 않았다 (IFN-γ 및 IL-10 에 대해 각각 70 +/-11 및 35.5 +/-5.6). 유사한 결과가 상청액 내 사이토카인의 수준에 대해서 얻어졌다. HSV-2 감염 마우스 유래 LNC 배양에서, IFN-γ 수준은 비프랙숀 및 CD8-고갈 배양에 대해 7834 +/-578 및 7608 +/-513 pg/ml 이었으나, CD4-고갈 배양에 대해서는 불과 677+/-51 pg/ml 이었다. ICP10ΔPK 감염 마우스 유래 LNC 의 배양 내 IFN-γ수준은 비프랙숀, CD8-고갈 배양 및 CD4-고갈 배양에 대해서 각각 4822 +/-191, 4724 +/-493 및 512 +/-36 pg/ml 이었다. IL-10 수준은 HSV-2 감염 동물 유래의 비프랙숀, CD8-고갈 및 CD4-고갈 배양에 대해서 4184 +/-358, 3847 +/-265 및 378 +/-3.5 pg/ml 이었고 ICP10ΔPK 감염 동물 유래의 비프랙숀, CD8-고갈 및 CD4-고갈 LNC 배양에 대해서 924 +/-103, 869 +/-63 및 78 +/-3 pg/ml 이었다. 동물들에게 2 회의 주사가 주어졌고 LNC 가 최후 감염후 1-10 일에 수집되었기 때문에, HSV-2 로 하는 유사한 감염이 HSV-특이적 Th2 반응을 선호하더라도 ICP10ΔPK 에 대한 두번째 노출은 지엽적인 HSV-특이적 Th1 반응을 강화하는 것으로 보인다.
ICP10ΔPK 이 Th1 기능을 양호하게 한다는 결론은 상기 두 바이러스에 의해 유도되는 IgG 항체의 타입에 의해 또한 지지된다. 마우스를 10 일 간격으로 HSV-2 (106pfu) 또는 ICP10ΔPK (3 x 106pfu) 로 3 회 풋패드 내에 감염하였다. 최후 감염후 14 일에 혈청을 수집하여 엘리사로 HSV-특이적 IgG, IgG1 (Th2 세포에 의존적) 및 IgG2a (Th2 세포에 의존적) 에 대해 분석실험하였다. 간략히 말하자면, 엘리사 플레이트를 표준 곡선을 위한 대조군으로서 사용되는 HSV-2 항원 (50 ㎍/ml) 또는 염소 항-마우스 IgG (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL) (2 ㎍/ml) 로 코팅하고, 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBS-트윈으로 세척하고 PBS-10% FCS 로 1 시간동안 37 ℃ 에서 봉쇄하였다. 표준 곡선을 위해, 상기 혈청 샘플의 순차적 희석액이 HSV 코팅된 플레이트에 첨가되는 반면, IgG, IgG1 또는 IgG2a (Southern Biotechnology Associates) 의 순차적 희석액이 대조군에 첨가되었다. 37 ℃ 에서 2 시간 후에 웰을 세척시키고, 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제 (Southern Biotechnology Associates) 에 연결된 (conjugated) 염소 항-마우스 IgG, IgG1 또는 IgG2a 중쇄 (heavy chain) 특이적 항체를 첨가하였다. 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션 및 후속적인 세척 후에, 발색을 위해 2,2-아지노-비스 3-에틸벤즈-티아솔린-6-술폰산 (ABTS) 을 웰에 첨가하였다. 웰을 엘리사 2550 EIA 리더 (바이오라드, 허큘스, 캘리포니아, BioRad, Hercules, CA) 로 405 nm 에서 읽었다. HSV-특이적 IgG 의 전체 수준이 HSV-2 (3676 +/-735 ng/ml) 에서보다 ICP10ΔPK (7581 +/-2052 ng/ml) 에서 더 높았다. IgG2a (ICP10ΔPK 및 HSV-2 에 대해 각각 3338 +/-774 및 537 +/-99 ng/ml) 에서와 마찬가지로 HSV-특이적 IgG1 의 수준이 HSV-2 (381 +/-60 ng/ml) 에서보다 ICP10ΔPK (1609 +/-408 ng/ml)에서 더 높았다. IgG2a/IgG1 비로서 표현되는 IgG 이소타입의 균형은 ICP10ΔPK (2.1 +/-0.17) 에 대해선 IgG2a 에 유익했지만, HSV-2 (1.41 +/-0.19) 에 대해선 그렇지 않았다.
실시예2
ICP10ΔPK 면역화는 수상돌기 세포 (dendritic cells) 에 의한 고수준의 IL-12 생산을 유발한다.
수상돌기 세포는 항원에 대한 반응에서 자기가 생산하는 IL-12 에 기초하여 면역 반응이 Th1 또는 Th2 인지를 결정하는 데에 관여하고 있다. 높은 IL-12 수준은 IFN-γ 생산을 포함하여, Th1 에 우호적으로 상기 반응을 왜곡한다 (Riffaubt et al., 2000, J. Gen. Virol. 8 1:2365-2373).
본 실시예에서 제시되는 실험에 사용하는 물질 및 방법을 하기한다.
ICP10ΔPK 감염 동물 유래 수상돌기 세포에 의한 IL-12 생산도 HSV-2 로 감염된 동물에서 보이는 것보다 더 높은지 조사하기 위해 하기 일련을 실험을 기획하였다. BALB/c 마우스 (5 주령, Charles River) 에 HSV-2 (106pfU) 또는 ICP10ΔPK (3 x 106pfu) 를 10 일 간격으로 풋패드에 3 회 주사하고 최후 항원자극 (boost) 후 24 시간에 슬와부 LNC 를 수집하였다. 메트리즈아미드 구배 원심분리 (metrizamide gradient centrifugation) 에 의해 수상돌기 세포를 분리하였다.
간단히 말하여, 14.5 % 메트리즈아미드 (시그마, 세인트루이스 미조리, Sigma, Saint Louis, MO) 의 완전 배지 2 ml 를 15 ml 원추형 시험관의 바닥에 적충하고 세포 현탁액 8 ml 로 부드럽게 도포하였다. 원심분리후 (600 xg, 20 분, 4 ℃), 수상돌기 세포가 풍부한 경계면을 수집하고 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 GM-CSF 25 ng/ml 및 IL-4 5 ng/ml 로 HSV-2 항원 (10 ㎕/ml) 과 함께 또는 없이 세포 배양하였다. 배양 상청액을 배양 중 3 일째 및 5 일째에 신선한 배지로 바꿔주었다. 최후의 배지 교환 후 12 시간에, 배양 상청액을 수집하고 IL-12 의 농도를 엘리사로 측정하였다. 이전과 마찬가지로 항-IL-12 (C15.6: Pharmingen) mAb 를 포획 항체로, 바이오틴화 항-IL-12 (C17.8: Pharmingen) mAb 를 감지항체로, 재조합 뮤린 IL-12 (Pharmingen) 를 표준 곡선을 위한 대조군으로 이용하여 분석실험을 수행하였다. 상기 데이타는 IL-12 의 수준이 ICP10ΔPK 가 주어진 마우스 유래 수상돌기 세포의 배양 (63.6 +/-8 ng/ml) 에서 HSV-2 가 주어진 경우 (17.2 +/-0.6ng/ml) 보다 훨씬 더 높았다는 것을 시사한다. IL-12 수준은 배양 내에서 처리된 HSV-2 항원의 유무에 무관히 유사하였는데, 이는 IL-12 의 생산 증가는 (배양 내에서) 항원에 대한 추가적 노출에 의존하지 않음을 시사한다.
실시예3
ICP10ΔPK 는 CD8+ CTL 를 유도한다.
CD8+ CTL 활성이 IL-12 및 IFN-γ 의 수준 증가에 의해 강화된다는 것을 이전의 연구가 보여준다 (McNally et al., 1999, Immunology 163:675-681). ICP10ΔPK 이 수상돌기 세포에 의한 IL-12 의 증산 및 강화된 Th1 반응 (고수준의 IFN-γ)을 독려하는 쪽으로 면역 반응을 개선하였으므로, 그것이 CD8+ CTL 에 유익한 쪽으로 상기 반응을 또한 왜곡하는지를 다음단계로 결정하였다.
본 실시예에서 제시되는 실험에 사용하는 물질 및 방법을 하기한다.
BALB/c 마우스를 10 일 간격으로 2 회 감염시켰다. 풋패드 내에서 HSV-2 (1 x 106pfu) 또는 ICP10ΔPK (3 x 106pfu) 로 감염시켰다. ICP10 의 RR 도메인 내에 결실된 HSV-2 돌연변이체 (ICP10ΔRR; 3 x 106pfu) 를 돌연변이 바이러스 감염과 관련된 비 특이적 효과의 대조군으로 사용하였다. 최후 항원자극 (boost) 후 5 일에 슬와부 LNC 를 수집하였다. 세포 (2 x 106/ml)를 완전 배지 내에서 37 ℃ 에서 3 일간 배양하였다. 비점착성 세포를 완전 배지로 한번 세척하고 효과자 (effector) 로 사용하였다. 어떤 실험에서는, 시험관내 (in vitro) 배양 전에 항체 코팅된 다이나비드 (Dynal) 를 이용하여 LNC 로부터 CD4+ 또는 CD8+ CTL 세포들을 고갈시켰다. 10 % 열-비활성화 FCS 를 갖는 둘베코 개량 배지 (Dulbecco's modified medium, DMEM) 에서 자라는 mKSA (H-2d) 세포를 HSV-2 의 10 PFU/세포로 17 시간동안 감염시키고 최후의 16 시간동안51Cr 100 μCi 로 표지화 (label) 했다. 이를 DMEM 으로 세척하고, 트립신화하고, DMEM 으로 세번 더 세척하고 생존가능한 세포를 표적으로 사용하였다. 이를 완전 배지 내에서 2 x 105세포/ml 의 최후 농도로 재현탁하고 원하는 효과자 대 표적 비 (E:T) 로 조절된 같은 부피의 효과자를 담고 있는 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 배분하였다 (2 x 104세포/웰/100ml). 상기 플레이트는 원심분리 (200 xg, 2 분) 하여, 37 ℃ 에서 6 시간동안 인큐베이션하고, 다시 원심분리 (200 xg, 5 분) 하고, 상청액으로 방출된51Cr 를 베크만 감마 카운터 (Beckman Gamma Counter) (베크만 카운터, 풀러튼, 캘리포니아, Beckman Coulter, Fullerton, CA)로 측정하였다. 자연적 방출은 표지화된 표적 세포를 효과자 세포 없이 배양함으로써 결정하였다. 최대 방출은 표적 세포를 5 % SDS 로 용해시켜서 (lysing) 결정하였다. 백분율 세포독성 활성 (percent specific cytotoxic activity) 은 하기 식으로 결정하였다: % 특이적51Cr 방출 = 실험적 방출 - 자연적 방출/최대 방출 - 자연적 방출.
ICP10ΔPK 로 감염된 동물 유래 비프랙숀화 LNC 의 CTL 활성 (20:1 에서 18 +/-1.3%) 은 HSV-2 가 주어진 동물 유래 비프랙숀화 LNC 의 경우 (20:1 에서 7 +/-0.4%) 보다 더 높았다. CD8+ CTL 세포를 고갈시키면 ICP10ΔPK 로 면역화된 마우스 유래 LNC 의 CTL 활성을 크게 감소시키게 된다 (비프랙숀화 세포를 100 % 로 할 경우에 상대적으로, 80:1, 40:1 및 20:1 에서 % 용해=46.7, 34.1 및 28.7). CD4+ 를 고갈시켜도 CTL 활성을 감소시키지는 않았다. 대조적으로, HSV-2 로 감염된 동물 유래 LNC 의 CTL 활성은 CD+4 세포의 고갈로 감소되었다 (비프랙숀화 세포를 100 % 로 할 경우에 상대적으로, 80:1, 40:1 및 20:1 에서 % 용해=43.7, 38.9 및 26.1). CD8+ 를 고갈시켜도 CTL 활성을 감소시키지는 않았다. 상기 데이타는 ICP10ΔPK 가, HSV-2 가 유도하지 않은 CD8+ CTL 를 유도한다는 것을 나타낸다.
중요하게도, ICP10ΔRR 로 감염된 마우스 유래 LNC 도 CTL 활성을 가지고 있었다 (20:1 에서 13 +/-0.6%). HSV-2 에서 보이는 경우보다 다소 낮은 수준이지만, 상기 활성은 CD4+ T 세포의 고갈로 크게 감소했다 (비프랙숀화 세포를 100 % 로 할 경우에 상대적으로, 80:1, 40:1 및 20:1 에서 % 용해=154.7, 55.6 및 50.1). CD+8 세포의 고갈에 의해 CTL 활성의 최소 감소도 또한 보이지만, 높은 E:T 비에서만인데 (비프랙숀화 세포를 100 % 로 할 경우에 상대적으로, 80:1, 40:1 및 20:1 에서 % 용해=77, 74 및 89), HSV-2 에서도 보듯이, CTL 활성이 주로 CD+4 세포에 의해 매개된다는 것을 제시한다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 상기 데이타는 ICP10 PK 단백질이 CD8+ CTL 의 유도를 방해한다는 것을 나타내는 것으로 해석할 수 있다.
실시예4
ICP10ΔPK 는 HSV-2 의 기억 반응 (memory response) 에 유사한 HSV 의 기억반응을 유도한다.
바이러스에 재노출된 직후(두번째 또는 세번째 항원자극) ICP10ΔPK 가 지엽적 (LNC) 및 조직적 (혈청) 인, CD8+ CTL 를 포함하는 Th1 반응의 유도를 용이하게 한다는 것을 보여준 후, 그것이 장기간의 면역적 기억을 유도할 수 있는지 여부를 알고자 하였다. 이 의문에 대응하기 위해 기억 CTL 분석실험을 이용하였다.
본 실시예에서 제시되는 실험에 사용하는 물질 및 방법을 하기한다.
BALB/c 마우스를 HSV-2 (1 x 106pfu) 또는 ICP10ΔPK (3 x 106pfu) 로 복강내 접종으로 감염시키고 이자 세포를 접종후 30 일에 수집하였다. 세포 (1 x 107/웰) 를 24-웰 플레이트에서 HSV-2 로 감염된 mKSA 세포 (5 x 105pfu) 와 함께 16 시간동안 배양하고 마이토마이신 C 로 처리 (50 ㎍/ml; 30 분) 했다. 배양 중 5 일에 상기 세포를 수집하고 상기한 바와 같이 되는 CTL 분석실험에서 효과자로 사용하였다. 상기 결과는 메모리 CTL 활성이 양자의 바이러스에 대해 유사하여, ICP10ΔPK 가 HSV-2 의 경우와 유사한 메모리 CTL 반응을 유도한다는 것을 나타내었다.
이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 상기 연구는 HSV-2 에 비해 상대적으로, ICP10ΔPK 가 CD8+ CTL 를 포함하는 HSV-특이적 Th1 면역의 유도를 선호한다는 것을 나타낸다. 상기 반응은 지엽적 (LNC) 및 조직적 (혈청) 이고 수상돌기 세포에 의한 IL-12 증산에 의해 매개되는 것으로 보인다. CD8+ CTL 를 포함하는 Th1 은 바이러스 항원에 대한 재노출에 대한 급속한 반응이고 따라서, 재활성화된 신경절의 바이러스 (ganglionic virus) 의 복제를 포함할 수 있으므로 이에 의해 재발성 질환의 발전을 방지한다. 반면에, HSV-2 로 감염된 동물 내의 면역 반응은 Th2 기능쪽으로 왜곡되고 (수상돌기 세포에 의한 IL-12 생산이 더 낮게 되는 것에 관계할 가능성) 감지할 수 있는 정도의 CD8+ CTL 은 없다. 그와 같이, 재활성화된 신경절 바이러스의 복제는 방해받지 않고 진행되어 재발성 질환의 발전을 낳게 된다.
실시예5
드물게 재발하는 인간 환자 내의 HSV 특이적 항체는 주로 IgG1 이다.
드물게 재발하는 HSV 를 가진 환자는 주로 바이러스 특이적 Th1 반응을 갖는다는 결론은 혈청 내에 존재하는 바이러스 특이적 면역글로불린의 서브클래스에 의해 지지된다. 드물게 재발하는 HSV 감염력을 가진 15 대상으로부터 혈청을 수집하고 엘리사로 바이러스 특이적 항체에 대해 분석실험하였다. HSV-특이적 IgG, IgG1 및 IgG2 를, 실시예1 에 기술한 바대로, 분석실험하였다. 간단히 말하자면, 엘리사 플레이트는 표준 곡선을 위한 대조군으로 사용되는 인간 IgG (Sigma, St. Louis MO), IgG1 (Sigma) 또는 IgG2 (케미콘, 테미큐바, 캘리포니아, Chemicon, Temicuba, CA) 의 순차적 희석액 (100 ㎍/ml - 2 ng/ml) 이나 HSV-2 항원 (50 ㎍/ml) 으로 코팅하고 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 상기 플레이트를 PBS-트윈으로 세척하고 PBS-10% FCS 로 1 시간동안 37 ℃ 에서 봉쇄하였다. 상기 플레이트를 세척하고 상기 HSV 플레이트에 혈청 (희석된 1:5 및 1:50)을 첨가하였다. 37 ℃ 에서 2 시간 후에 웰은 세척시키고, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (Southern Biotechnology Associates) 에 연결된 (conjugated) 마우스 항-인간 IgG, IgG1 또는 IgG2 특이적 항체를 첨가하였다. 37 ℃ 에서 1 시간 배양 및 후속적인 세척 후에, 발색을 위해 기질 2,2-아지노-비스 3-에틸벤즈-티아솔린-6-술폰산 (ABTS) 을 웰에 첨가하였다. 웰을 엘리사 2550 EIA 리더 (BioRad, Hercules, CA) 로 405 nm 에서 읽었다. HSV-특이적 IgG 의 전체 수준이 9460 +/-3204 ng/ml 이었다. HSV-특이적 IgG1 의 수준이 7587 +/- 내지 3045 ng/ml 이었으며 HSV-2 감염된 환자와 HSV-1 감염된 환자 사이에 명백한 차이는 없었다. IgG2 의 수준이 898 +/-512 ng/ml 이었으며 HSV-2 감염된 환자와 HSV-1 감염된 환자 사이에 명백한 차이는 없었다.
활성의 특정한 메카니즘에 구애되지 않기를 의도하면서, HSV-2 재발성 질환을 치료하는 방법은 사이토카인 케스케이드의 활성화를 포함하는데 이는 하기와 같다고 결론지을 수 있다: (i) 수상돌기 세포에 의해 IL-12 증산과 함께 개시, (ii) 어어서 CD4+ Th1 반응에 유익한 HSV-특이적 반응의 개선 및 , IFN-γ 의 수준 증가 (및 IL-10 의 수준 감소), 및 (iii) 차례에 따라, HSV-특이적 CD8+ CTL 수준의 증가 유발. 상기는 ICP10ΔPK 로 면역화하는 것에 의해 이루어질 수 있지만, 기타의 HSV 재조합체, 핵산, 폴리펩티드 및 바이러스 단백질의 혼합물로 유도된다면 재발성을 감소시킴에 있어서도 똑같이 효과적일 것이다. 본 발명은 HSV-2 에 대해서 효과적일 뿐만 아니라, HSV-1 에 대해서도 효과적이다. 더욱이, 장기간 지속되거나 재발성인 기타 바이러스 질환, 예컨대 거대세포바이러스, 에프스타인-바르 바이러스, 인간 파필로마바이러스, B형 간염, C형 간염, 수두 대상포진, 및 인간 면역 결핍성 바이러스 (HIV) 은 바이러스 특이적 면역글로불린 비를 증가시키도록 선택된 제제에 반응할 것인데, 여기서 면역글로불린 비는 재발성 질환 또는 지속성 질환의감소를 위해 필요한 Th1 반응의 표지로 역할하는 것이다. 본 발명은 바이러스 특이적 Th1 면역 반응을 유도하는 재제를 동정하는 방법, 및 잠재성 및 일차 바이러스 감염으로부터 보호하고 바이러스 특이적 Th1 면역 반응을 유도하는 조합백신의 이용방법을 또한 개시하고 있다.
본 명세서에서 사용되었으나 기술되지 않은 기타의 방법은 잘 공지되어 있으며 면역학, 바이러스학, 세포 생물학 및 분자 생물학 분야의 당업자의 능력범위 내에 있다.
본 명세서에서 인용된 개개 및 모든 특허, 특허출원 및 공보의 개시된 내용은 그 전체로서 인용되어 본 출원에 통합된다.
본 발명이 특이한 구체예를 참조로 개시되었지만, 본 명세서에서 개시되는 내용에 기초하여 본 발명의 다른 구체예 및 변형이 본 발명의 진정한 정신과 범위를 벗어나지 않고서 당업자에 의해 개선될 수 있음은 분명하다. 첨부한 특허청구범위는 그러한 구체예 및 균등한 변형예를 전부 포함하여 해석하도록 의도된 것이다.
Claims (53)
- 바이러스로 감염된 동물내에서 바이러스 질환의 증상을 개선하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 동물에 상기 바이러스로부터 유래한 적어도 하나의 면역원성 단백질로서, 제 1 형 T 헬퍼 세포 (Th1) 반응을 유도하는 단백질을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 Th1 반응이 하기 반응중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a. 우선적인 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스의 비 증가;b. 바이러스 특이적 인터페론γ/인터루킨-10 (IFNγ/IL-10) 비의 증가;c. CD8+ 세포독성 T 임파구 (CTL) 의 수준 증가; 및d. 인터루킨 12 (IL-12) 의 수준 증가.
- 제 2 항에 있어서, 상기 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스의 비 증가가 IgG2a/IgG1, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, IgG3/IgG4, (IgG1+IgG2+IgG3)/IgG4, (IgG1+IgG2+IgG3)/IgG5, IgG1/IgE, IgG2/IgE 및 IgG3/IgE 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질이 마우스에 투여되었을 때에 IgG2a/IgG1 의 비 증가를 포함하는 Th1 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 Th1 반응이 우선적인 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스 비의 증가, 바이러스 특이적 인터페론γ/인터루킨-10 (IFNγ/IL-10) 비의 증가, CD8+ CTL 수준 증가, 및 IL-12 수준 증가를 각각 적어도 25 % 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 방법이 우선적인 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스 비의 증가를 적어도 25 % 포함하는 반응의 증가를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 방법이 바이러스 특이적 인터페론γ/인터루킨-10 (IFNγ/IL-10) 비의 증가를 적어도 25 % 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 방법이 CD8+ CTL 수준 증가를 적어도 25 % 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 방법이 IL-12 수준 증가를 적어도 25 % 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 동물이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 바이러스가 인간 면역 결핍성 바이러스 (human immunodeficiency virus), 거대세포바이러스 (cytomegalovirus), C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus), 파필로마바이러스 (papillomavirus), 에프스타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus), 수두 대상포진 바이러스 (varicella zoster virus), 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 바이러스가 인간 면역 결핍성 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 바이러스가 거대세포바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 바이러스가 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 바이러스가 파필로마바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 바이러스가 에프스타인-바르 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 바이러스가 수두 대상포진 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 (herpes simplex virus-2) 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 (herpes simplex virus-1) 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체내에 ICP10PK 단백질은 없이, 복수의 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 단백질을 포함하는 조성물의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질 또는 투여후 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질을 발현하는 바이러스의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 의 ICP10ΔPK 돌연변이체의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산을 투여함으로써 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질을 간접적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, 상기 동물이 인간이고 상기 바이러스가 인간 면역 결핍성 바이러스, 거대세포바이러스, C형 간염 바이러스, 파필로마바이러스, 에프스타인-바르 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 상기 바이러스 질환이 헤르페스 (herpes) 이고 상기 핵산이 ICP10PK 를 코딩하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 동물이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 상기 바이러스가 인간 면역 결핍성 바이러스, 거대세포바이러스, C형 간염 바이러스, 파필로마바이러스, 에프스타인-바르 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 바이러스가 인간 면역 결핍성 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 바이러스가 거대세포바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 바이러스가 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 바이러스가 파필로마바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 바이러스가 에프스타인-바르 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 바이러스가 수두 대상포진 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36 항에 있어서, 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36 항에 있어서, 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질 또는 투여후 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질을 발현하는 바이러스의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체내에 ICP10PK 단백질은 없이, 복수의 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 단백질을 포함하는 조성물의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37 항에 있어서, 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 의 ICP10ΔPK 돌연변이체의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산을 투여함으로써 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질을 간접적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 42 항에 있어서, 상기 동물이 인간이고 상기 바이러스가 인간 면역 결핍성 바이러스, 거대세포바이러스, C형 간염 바이러스, 파필로마바이러스, 에프스타인-바르 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 바이러스 질환이 헤르페스 (herpes) 이고 상기 핵산이 ICP10PK 를 코딩하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 바이러스로 감염된 동물 내에서 바이러스 질환의 증상을 개선하는 치료용 백신으로서, 상기 바이러스로부터 유래한 적어도 하나의 면역원성 단백질을 포함하고, 상기 동물에 투여후 우선적인 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스 비의 증가, 바이러스 특이적 인터페론γ/인터루킨-10 (IFNγ/IL-10) 비의 증가, CD8+ CTL 수준 증가, 및 IL-12 수준 증가를 포함하는 반응을 유도하는 치료용 백신.
- 제 45 항에 있어서, 상기 바이러스가 인간 면역 결핍성 바이러스, 거대세포바이러스, C형 간염 바이러스, 파필로마바이러스, 에프스타인-바르 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 치료용 백신.
- 제 46 항에 있어서, 상기 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 이고 헤르페스 심플렉스 바이러스 유래의 상기 적어도 하나의 면역원성 단백질이 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 로부터 유래한 것을 특징으로 하는 치료용 백신.
- 제 47 항에 있어서, 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 돌연변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료용 백신.
- 제 48 항에 있어서, 상기 돌연변이체가 단백질 키나제 활성이 없는 돌연변이 ICP10단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 치료용 백신.
- 제 46 항에 있어서, 면역 자극제나 아주반트 (adjuvant) 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 치료용 백신.
- 바이러스 질환을 유도하는 바이러스로 감염된 동물내에서 바이러스 질환의 증상 개선제를 동정하는 방법으로서, 동물에 시험 물질을 투여하고, 그 면역반응을 분석하고, Th1 반응을 유도하는 시험 물질을 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 제 51 항에 있어서, 상기 Th1 반응이 우선적인 Th1 반응을 반영하는 바이러스 특이적 면역글로불린 서브클래스 비의 증가, 바이러스 특이적 인터페론γ/인터루킨-10 (IFNγ/IL-10) 비의 증가, CD8+ CTL 수준 증가, 및 IL-12 수준 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 51 항에 있어서, 상기 시험 물질이 바이러스, 돌연변이 바이러스, DNA, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20071026 Patent event code: PE09021S01D |
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| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20080501 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20071026 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |