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KR20030044695A - 피키아 파스토리스를 이용한 재조합 인간 인터루킨-2단백질 생산방법 및 생산균주 - Google Patents

피키아 파스토리스를 이용한 재조합 인간 인터루킨-2단백질 생산방법 및 생산균주 Download PDF

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KR20030044695A
KR20030044695A KR1020010075539A KR20010075539A KR20030044695A KR 20030044695 A KR20030044695 A KR 20030044695A KR 1020010075539 A KR1020010075539 A KR 1020010075539A KR 20010075539 A KR20010075539 A KR 20010075539A KR 20030044695 A KR20030044695 A KR 20030044695A
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rhil
pichia pastoris
recombinant
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KR1020010075539A
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정종문
이유진
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정종문
주식회사 유젠바이오
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Abstract

본 발명은 피키아 파스토리스를 이용한 재조합 인간 인터루킨-2 단백질 생산방법 및 생산균주에 관한 것으로, pGAPZαA/rhIL-2 재조합 벡터 및 피키아 파스토리스/rhIL-2에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 인터루킨-2 단백질은 생리학적 활성을 유지하여 암 질환 뿐만 아니라 세균과 바이러스 감염, 면역 결핍증, 자가면역 질환 등 광범위한 면역이상 질환에 대하여 치료 및 예방 용도로 사용할 수 있다.

Description

피키아 파스토리스를 이용한 재조합 인간 인터루킨-2 단백질 생산방법 및 생산균주{MANUFACTURING METHOD OF RECOMBINANT PROTEIN HUMAN INTERLEUKIN-2 IN PICHIA PASTORIS AND PICHIA PASTORIS EXPRESSING RECOMBINANT PROTEIN HUMAN INTERLEUKIN-2}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 피키아 파스토리스를 이용한 재조합 인간 인터루킨-2 단백질 생산방법 및 생산균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 pGAPZαA/rhIL-2 재조합 벡터 및 피키아 파스토리스/rhIL-2에 관한 것이다. 또한 본 발명은 재조합 인터루킨-2 단백질을 다량으로 쉽게 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
인터루킨-2(Interleukin : hIL-2)는 항원에 의하여 자극을 받은 T 세포가 분비하는 림포카인(lymphokine)의 일종으로서, B세포와 T세포를 포함한 여러 면역 세포들의 성장과 활성화를 유도하는 물질이다.(Morganet al., 1976,Science193, 1000-1008) 사람의 인터루킨-2는 당단백질이고, 당쇄화(glycosylation) 정도에 따라 다양한 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다.(Conradtet al., 1985,Eur. J. Biochem. 153, 255-261)
초기에 인터루킨-2는 특정 T 세포를 장기간에 걸쳐 배양하는 데에 반드시 필요한 림포카인인 것으로 발견되었으며, 이어서 다양한 면역 작용을 조절하는 작용을 가지는 것이 규명되었다. 인터루킨-2는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), NK(natural killer)세포, 활성 B 세포(activated B cell), 림포카인에 의한 활성 살세포(lymphokine activated killer(LAK) cell) 등의 면역 세포의 활성에 중요한 영향을 미치고, 감마-일터페론의 생성을 유도하는 것으로 확인되었다. 최근에는 암 질환의 치료에 hIL-2를 적용하고 있는데, 특히, 신장 세포에 대하여 효과적이어서 20 % 가량의 신장암의 경우 종양의 완화를 보이는 것으로 알려져 있다. 이는 종양 세포에 특히 높은 활성을 보이는 LAK 세포로 인한 것으로 추측된다. 따라서, hIL-2는 암 질환 뿐 아니라 세균과 바이러스 감염, 면역 결핍증, 자가 면역 질환등 광범위한 면역이상 질환에 대하여 적용될 수 있다.
인터루킨-2 단백질의 생산은 재조합 단백질 기법이 도입되기 이전에는 사람이나 마우스, 쥐(rat) 등의 림포사이트(lymphocyte)를 활성화시킨 다음, 이로부터 매우 소량의 hIL-2를 분리하는 방법으로 이루어졌다.(Gilliset al., 1977,Nature268, 154-156; Farraret al., 1978,J. Immunol., 121, 1353-1360; Gilliset al., 1978,J. Immunol., 120, 2027-2033)
유전자 조작기법을 이용한 것으로는 다음과 같다. 미국특허공보 제 4,518,584호에서는 인터루킨-2를 대장균에서 발현시키는 기술을 개시하였으나, 인터루킨-2가 불용성 단백질(inclusion body)형태로 존재하여 정제시 많은 시간과 비용이 든다는 단점이 있다. 미국특허공보 제 4,738,927호는 효모에서의 인터루킨-2의 발현을 개시하였으나 발현양이 적은 점이 단점이다. 대한민국 특허출원 제 1998-11309호는 인터루킨-2를 CHO 세포인 진핵세포 연속배지에서 생산하는 방법을 개시하고 있으나 제조 비용이 높다는 단점이 있다.
지금까지 인터루킨-2를 생산하는 시스템이 연구되었으나, 발현효율이 낮아 생산단가가 높을 뿐만 아니라 정제과정이 어려우며, 유도체를 사용하여야 하는 번거로움이 여전히 남아 있다.
따라서, 본 발명은 인간 인터루킨-2 유전자를 발현하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 인간 인터루킨-2 유전자를 연속적으로 발현하는 형질전환 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 피키아 파스토리스를 이용한 재조합 인간 인터루킨-2을 고수율로 대량 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 재조합 인간 인터루킨-2 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 재조합 벡터(pGAPZαA/rhIL-2)의 제조 모식도를 도시한 것이고,
도 2는 본 발명의 피키아 파스토리스/rhIL-2에서 재조합 단백질 인간 인터루킨-2의 발현 여부를 SDS-PAGE 방법으로 확인한 것이고,
도 3은 본 발명의 본 발명의 피키아 파스토리스/rhIL-2에서 재조합 단백질 인간 인터루킨-2의 발현 여부를 웨스턴 블롯(Western blot)으로 확인한 것이고,
도 4는 본 발명의 재조합 단백질 인간 인터루킨-2의 생리활성을 검증하고자 시험관내 (in vitro)에서 CTLL-2세포를 이용하여 세포증식 효과를 확인한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 프로모터(GAP), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자 리더 서열(α-factor leader sequence), 인간 인터루킨-2 유전자 및 번역종결코드를 포함하는 재조합 벡터 pGAPZαA/rhIL-2를 제공한다.
또한 본 발명은 pGAPZαA/rhIL-2로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 피키아 파스토리스/rhIL-2(KCCM10322)에서 발현된 재조합 인터루킨-2 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 pGAPZαA 벡터에 인터루킨-2 유전자를 삽입하여 pGAPZαA/rhIL-1를 제조하고, pGAPZαA/rhIL-1를 피키아 파스토리스 X33에 형질전환하고, 형질전환된 피키아 파스토리스 X33은 제오신을 포함하는 배지에 배양하여 pGAPZαA/rhIL-1가 다수카피로 삽입된 피키아 파스토리스/rhIL-1를 선별하고, 피키아 파스토리스/rhIL-1를 연속배양하여 인터루킨-2를 세포외로 발현시키고, 및 발현된 재조합 인터루킨-2를 정제하여 수득하는 것을 포함하는 재조합 인터루킨-2의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
인터루킨-2를 피키아 파스토리스에서 다량으로 발현할 수 있는 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 벡터는 통상적인 벡터와 인터루킨-2 유전자를 포함하는 것이다. 바람직한 제조합 벡터는 pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, B, C, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, B, C, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 및 pHIL-S1으로 구성된 군으로부터 선택된 벡터 및 인간 인터루킨-2 유전자를 포함하는 것이다. 가장 바람직하게는 인간 인터루킨-2 및 pGAPZαA를 포함하는 pGAPZαA/rhIL-2이다. 상기 GAPZαA 벡터는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 유전자(GAP)의 프로모터, 발현된 단백질을 효모 세포 밖으로 분비시키는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자 리더 서열(α-factor leader sequence) 및 숙주 내로 형질도입 여부를 확인할 수 있는 표지로 이용 가능한 제오신(Zeor) 유전자를 포함하고 있다.(도 1)
인간 인터루킨-2를 포함하는 재조합 벡터를 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환하여 형질전환체를 제조하였다. 상기 형질전환체 중 재조합 벡터가 다수 카피(muti copy)로 삽입된 형질전환체를 선별하였고, 피키아 파스토리스/rhIL-2(KCCM10322)를 기탁하였다.
본 발명의 피키아 파스토리스/rhIL-2(KCCM10322)는 YPD 배지에서 배양하며, 세포외로 재조합 인터루킨-2를 다량으로 분비한다. 피키아 파스토리스/rhIL-2(KCCM10322)의 재조합 인터루킨-2 발현을 증가시키기 위하여 4일 내지 5일에 한번씩 계대배양하는 것이 바람직하다. 피키아 파스토리스/rhIL-2(KCCM10322)는 호기성 플라스크 배양조에서 YPD 배지상 96시간 연속 배양하였을 때 100 ㎎/L 내지 120 mg/L의 재조합 인터루킨-2를 생산한다.(도 2, 도 3)
피키아 파스토리스/rhIL-2(KCCM10322)는 재조합 인터루킨-2의 발현을 위하여 유도체(inducer)를 사용할 필요가 없어, 재조합 인터루킨-2의 정제가 용이하다. 또한 연속적으로 재조합 인터루킨-2을 발현하고, 새로운 배지로 교환하여 재조합 재조합 인터루킨-2의 발현을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 인터루킨-2는 약 15 kDa의 분자량을 가지며, 인터루킨-2 고유의 생리활성을 가지고 있다.(도 4)
인터루킨-2의 58번과 105번 아미노산인 시스테인(cystein)의 이황화 결합이 인터루킨-2의 활성에 중요한 역할을 하며, 본 발명의 재조합 인터루킨-2는 본래의 인간 인터루킨-2와 같이 이황화 결합에 변화가 없기 때문에 재조합 인터루킨-2도 생리활성을 지닌다(U.S. Pat. No. 4,518,584)
따라서, 본 발명의 재조합 인터루킨-2는 인터루킨-2 단백질의 생리학적 활성을 유지하여 암 질환 뿐만 아니라 세균과 바이러스 감염, 면역 결핍증, 자가면역 질환 등 광범위한 면역이상 질환에 치료 또는 예방 용도로 사용할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: pGAPZαA/rhIL-2 벡터제조
(1) 균주 및 플라스미드 벡터
본 실험에서 사용한 균주 및 플라스미드는 하기의 표 1 과 같다.
계 통 유전자형 표현형
피키아 파스토리스 X-33 Zeocin 야생형
E. coliTop10 F' F'lacIq, Tn10(TetR),mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZΔM15, ΔlacX74,deoRrecA1,araD139,Δ(ara-leu)7697,galU,galK,rpsL(StrR),endA1,nupG
플라스미드 벡터pGAPZαA Zeor
테트라사이클린 내성 유전자를 선별 마커로 포함하는 박테리아E. coliTop10 F'는 인비트로젠사(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구입하여 플라스미드 벡터의 유지 및 증폭에 사용하였으며, 피키아 파스토리스 X-33 역시 인비트로젠사로부터 구입하여 인간 인터루킨-2의 발현에 이용하였다.
(2) 재조합 벡터(pGAPZαA/rhIL-2)의 제조
재조합 벡터는 pGAPZαA(인비트로젠사의 피키아 파스토리스 발현 키트에 제공되는 연속 발현 벡터)에 인간 인터루킨-2 유전자를 삽입하여 제조하였다.(도 1)
인간 인터루킨-2 유전자를 준비하기 위해 인간 peripheral blood mononuclear cells를 Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech사)을 이용한 밀도구배 원심분리로 분리하였다. 분리한 mRNA와 125번 아미노산인 시스테인(cysteine)이 세린(serine)으로 변형되도록 디자인한 서열번호 3의 올리고머로 올리고-직접 뮤타제네시스 방법(oligonucleotide-directed mutagenesis)을 실시하여 인간 인터루킨-2 유전자를 수득하였다. 상기 치환은 인터루킨-2 단백질간의 이황화결합을 방지하기 위한 것이다. 유전자(인터루킨-2의 GENE BANK No GI 512411)를 제한효소XhoI(Promega)를 처리한 다음 동일 제한효소를 처리한 pGAPZαA 및 T4 DNA라이게이즈(Promega)를 첨가하였고, 번역중지코돈인 TGA를 유전자 말단에 삽입하여 pGAPZαA/rhIL-2를 제조하였다. 칼슘클로라이드 방법으로 대장균 균주 Top10 F'에 pGAPZαA/rhIL-2를 형질전환시킨 후, 형질전환체를 제오신을 포함하는 저염(low salt) LB 평판배지(1 % 트립톤, 0.5 % 효모 추출액, 0.5 % 염화나트륨, 1.5% 아가)에서 선별하였다. 선별된 클론은 PCR과 제한효소처리를 통한 검증실험으로 확인하였고, 최종적으로 서열번호 1의 인간 인터루킨-2 DNA가 삽입된 재조합 벡터(pGAPZαA/rhIL-2)와 형질전환체(pGAPZαA/rhIL-2,E. coliTOP10 F')를 확보하였다.
실시예 2: 인터루킨-2를 발현하는 피키아 파스토리스의 제조
피키아 파스토리스 X-33 단일 콜로니를 YPD 배지 10 ㎖에 접종 후 28 - 30 ℃에서 200-250 rpm으로 12 - 15시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 YPD 배지 10 ㎖에 흡광도(OD600) 0.1 - 0.2정도로 희석한 후 28 - 30 ℃에서 미드-로그 상태(mid-log phase)까지 배양하여 500 xg로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 세포는 용액 I(DMSO, 에틸렌 글리콜) 10 ㎖에 부유시키고, 원심분리(500 xg)한 다음 용액 I 1 ㎖로 재부유시켰다. 부유액은 1.5 ㎖ 멸균 처리된 튜브에 50 ㎕씩 분주한 후 장기간 보존을 위해 -80℃에서 천천히 냉동, 보관하였다. 냉동 보관 되었던 피키아 파스토리스 X-33을 천천히 녹인 후 사용하였다.
제한효소Avr II처리로 선형화된 약 3 ㎍의 pGAPZαA/rhIL-2 DNA을 인비트로젠사의 이지컴 키트 (EasycompTM kit) 및 리튬 클로라이드(LiCl) 방법으로 피키아 파스토리스 X-33 세포에 형질전환도입하였다. 형질도입체는 YPDS Zeo+평판배지(1 % 효모 추출물, 2 % 포도당, 2 % 펩톤, 1 M 소비톨, 2 % 아가, 0.25 ㎎/㎖ 제오신)에서 배양하여 형질전환체를 선별하였다. 형질전환체는 pGAPZαA/rhIL-2벡터에 포함된 제오신을 발현함으로써 상기의 YPDS Zeo+평판배지 상에서 성장하는 것이다.
pGAPZαA/rhIL-2 재조합 유전자가 복수 삽입정도가 많을수록 형질전환제의 제오신에 대한 내성정도가 증가하고, 또한 다량의 재조합 인터루킨-2를 생산하게 된다. 이에 형질전환체의 게놈상에 pGAPZαA/rhIL-2가 복수삽입(multicopy integration)된 것을 선별하기 위하여 다양한 농도의 YPD-Zeo+(1 % 효모추출액, 2 % 펩톤, 2 % 포도당, 0.25-2.0 ㎎/㎖의 제오신) 평판배지에서 형질전환체를 배양하였다. 0.25, 1, 2 ㎎/㎖의 제오신을 포함하는 배지에서 자란 형질전환체가 선별되었으며, 2 ㎎/㎖의 제오신을 포함하는 배지에서 안정적 배양된 형질전환체를 선별하였다. 선별된 피키아 파스토리스/인터루킨-2는 2001년 10월 11일자로 기탁하여 KCCM10322를 수여받았다.
실시예 3: 재조합 인터루킨-2의 발현
(1) 재조합 인터루킨-의 발현
피키아 파스토리스/인터루킨-2를 10 ㎖ YPD 배지에 접종하여, 200 rpm, 28 ℃에서 1일간 배양하였다. 피키아 파스토리스/인터루킨-2 100 ㎕을 50 ㎖ YPD 배지로 재부유하고, 배플드 플라스크(baffled flask)에서 200 rpm으로 28℃에서 4일간 배양하였다. 배양액은 배양 시간대별(24 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr)로 각각 1㎖씩 수득하여 원심분리하고, 상층액만을 새 튜브에 모아 다음 분석 전까지 -80 ℃로 얼려 보관하였다. 상층액은 피키아 파스토리스/rhIL-2에서 분비된 인터루킨-2를 포함하고 있다. 상층액은 15 % SDS-PAGE(sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하여 인터루킨-2의 발현량을 확인하였다.
도 2 는 피키아 파스토리스/rhIL-2를 배양하고, 배양 시간대별(24 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr) 재조합 인터루킨-2를 전기영동으로 확인한 사진이다. M 은 분자량 마커이고, 레인 1 내지 4는 배양시간별 배양 상층액을 나타낸 것이다. 도 2에서 15 kDa의 단백질이 생성되었음을 확인할 수 있었고, 96 시간 배양시 발현량이 가장 높게 나타났다.
(2) 인터루킨-2의 검정(Western blot)
도 2에서 확인된 단백질이 피키아 파스토리스/인터루킨-2에서 발현된 단백질이 재조합 인터루킨-2인지를 확인하고자 웨스턴 블롯을 실시하였다.
도 2의 15 % SDS-PAGE에 항-마우스-항-인터루킨-2(Sigma) 항체를 상온에서 1시간 반응시키고, 알칼라인 포스포테이트를 포함하는 항-토끼 IgG(Alkaline phosphotate-conjugated anti-rabbit IgG, Promega)를 상온에서 30분간 반응시켜 발색을 확인하였다.
도 3은 피키아 파스토리스/인터루킨-2 배양물을 웨스턴 블롯한 사진으로, 약 15 kDa의 재조합 인터루킨-2가 발현됨을 확인하였다.
실시예 4: 재조합 인터루킨-2의 생리활성 측정
(1) 재조합 인터루킨-2의 정제
재조합 인터루킨-2 배양액에 60 % 암모니움 설페이트가 되도록 첨가하여 4 ℃에서 12시간 동안 회전 교반시켜 침전 반응시켰다. 이때 얻은 배양액을 원심분리하여 얻은 침전물을 트리스 완충액(pH 7.4)을 3 ml 첨가하여 현탁시켰다. 현탁액을 0.15 M NaCl이 첨가된 트리스 완충액(pH 7.4)에서 여러번 투석하였다. 이후 겔필터레이션 크로마토그래피(Sephacryl S-200 HR)를 실시하여 재조합 인터루킨-2의 피크부분을 선별하여 분리 정제하였다.
(2) 생리활성 검정
피키아 파스토리스/인터루킨-2에서 생산된 인터루킨-2 단백질의 생리활성을 측정하였다.
인터루킨-2 의존성 세포주인 CTLL-2(전북대학교 사이토카인 은행)는 인터루킨-2 의존성 세포주로, 인터루킨-2의 양에 따라 비례적인 성장을 가진다.
성장인자(growth factor)가 없이 1 시간 정도 배양한 CTLL-2 세포를 10 % 우태아혈청(FBS)과 2-메르캅토에탄올이 함유된 RPMI배지에 잘 섞었다. 피키아 파스토리스/인터루킨-2의 배양물을 96 웰 플레이트에 넣고, CTLL-2를 웰 당 1×104로 분주하였다. 18시간 배양후 1 μCi/웰의 [methyl-3H]티미딘을 넣고, 6시간 동안 배양하였다. CTLL-2를 수거하여 LSC(liquid scintillation counter)상에서 cpm값을 측정함으로써 세포 성장효과를 측정하였다.
도 4a는 CTLL-2에 상용중인 재조합 인터루킨-2(Promega사)를 PBS(phosphate buffered saline, PH 7.4)로 0.5배씩 희석하여 첨가하고, 배양한 다음 cpm값을 측정한 표준 그래프이고, 도 4b는 CTLL-2에 발현된 재조합 인터루킨-2를 PBS(phosphate buffered saline, PH 7.4)로 0.5배씩 희석하여 첨가하고, 배양한 다음 cpm값을 측정하여 발현된 재조합 인터루킨-2의 활성도를 그래프로 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 재조합 인터루킨-2 단백질은 본래의 활성을 지니고 있으며, 이로 인하여 CTLL-2 세포가 성장 및 증식함을 확인할 수 있었다. 재조합 인터루킨-2를 연속적으로 희석하여 활성도를 측정하여 본 결과, 활성도가 증가하다가 희석이 계속되어 재조합 인터루킨-2를 발현하는 세포배양액을 1/1,000 이상 희석할 경우에는 점차 활성도가 감소하는 양상을 나타내었다. 이런 양상은 표준그래프인 도4 (b)의 것과 매우 유사하다. 따라서, 본 발명의 인간 재조합 인터루킨-2가 실제로 세포분열을 촉진시키는 활성도를 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한 도4의 (a)와 (b) 모두가 높은 농도의 인터루킨-2에서는 오히려 활성도가 감소되는 것으로 나타나는데 이는 이렇게 높은 농도에서는 인터루킨-2가 세포의 활성을 억제하는 것으로 생각된다.
(3) 재조합 인터루킨-2의 아미노산 서열 분석
재조합 인터루킨-2 배양액을 SDS-PAGE에 전기영동하고, PVDF(polyvinylidene fluoride)로 재조합 인터루킨-2 단백질 밴드를 이동시켰다. 이의 아미노산 서열을 기초과학지원연구소에 의뢰하여 분석하였다. 그 결과 서열번호 2의 아미노산 서열을 확인할 수 있었고, 이는 천연형 인터루킨-2의 단백질과 동일한 것이었다. 따라서, 본 발명에서 생산되는 재조합 단백질은 인터루킨-2 단백질임을 확실히 증명하였다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 pGAPZαA/rhIL-2로 형질전환된 피키아 파스토리스는 재조합 인터루킨-2를 100 mg 내지 120 mg/L로 발현한다. 또한 본 발명의 재조합 인터루킨-2는 생리학적 활성을 유지하여 암 질환 뿐 아니라 세균과 바이러스 감염, 면역 결핍증, 자가 면역 질환 등 광범위한 면역이상 질환에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (5)

  1. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 프로모터(GAP), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자 리더 서열, 인간 인터루킨-2 유전자 및 번역종결코드를 포함하는 재조합 벡터 pGAPZαA/rhIL-2.
  2. pGAPZαA/rhIL-2로 형질전환된 피키아 파스토리스.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 피키아 파스토리스는 피키아 파스토리스/rhIL-2(KCCM10322)인 것인 피키아 파스토리스.
  4. 피키아 파스토리스/rhIL-2(KCCM10322)에서 발현된 재조합 인터루킨-2 단백질.
  5. (1) pGAPZαA 벡터에 인터루킨-2 유전자를 삽입하여 pGAPZαA/rhIL-1를 제조하고;
    (2) pGAPZαA/rhIL-1를 피키아 파스토리스 X33에 형질전환하고;
    (3) 형질전환된 피키아 파스토리스 X33은 제오신을 포함하는 배지에 배양하여 pGAPZαA/rhIL-1가 다수카피로 삽입된 피키아 파스토리스/rhIL-1를 선별하고;
    (4) 피키아 파스토리스/rhIL-1를 연속배양하여 인터루킨-2를 세포외로 발현시키고; 및
    (5) 발현된 재조합 인터루킨-2를 정제하여 수득하는 것을 포함하는 재조합 인터루킨-2의 제조방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892168A (zh) * 2010-07-06 2010-11-24 集美大学 一种重组鸭白细胞介素-2的毕赤酵母表达菌株及其构建方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990002810A1 (en) * 1988-09-09 1990-03-22 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of interleukin-2 polypeptides in pichia pastoris yeast cells
JPH02104292A (ja) * 1988-04-25 1990-04-17 Phillips Petroleum Co ヒト―インターロイキン―２のメチロトローフ酵母での発現
US6214547B1 (en) * 1997-01-24 2001-04-10 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
KR20010076962A (ko) * 2000-01-29 2001-08-17 김강권 엔테로박터 에스피. 4 유래의 피타제 유전자를 함유하는재조합 백터 및 이를 함유하는 형질 전환체

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02104292A (ja) * 1988-04-25 1990-04-17 Phillips Petroleum Co ヒト―インターロイキン―２のメチロトローフ酵母での発現
WO1990002810A1 (en) * 1988-09-09 1990-03-22 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of interleukin-2 polypeptides in pichia pastoris yeast cells
US6214547B1 (en) * 1997-01-24 2001-04-10 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
KR20010076962A (ko) * 2000-01-29 2001-08-17 김강권 엔테로박터 에스피. 4 유래의 피타제 유전자를 함유하는재조합 백터 및 이를 함유하는 형질 전환체

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochem Mol Biol Int. 1998 Dec;46(6):1109-16, Zhou L *
J Dairy Res. 2000 May;67(2):189-97, Wedlock DN *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892168A (zh) * 2010-07-06 2010-11-24 集美大学 一种重组鸭白细胞介素-2的毕赤酵母表达菌株及其构建方法和应用

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