KR20030033782A - 캔디다 알비칸스에서 유전자 조작의 효율적 연구를 위한일련의 재조합 벡터 - Google Patents
캔디다 알비칸스에서 유전자 조작의 효율적 연구를 위한일련의 재조합 벡터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 캔디다 알비칸스에서 유전자 조작의 효율적 연구를 위한 일련의 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 벡터들은 박테리아의 선택 표지 유전자를 제거하고 박테리아의 자동복제서열과 항생제 내성 유전자를 남겨 놓은 박테리아용 벡터 안에, 캔디다의 자동복제서열 발현에 필요한 최소 서열, 선택 표지 유전자의 발현에 필요한 최소 서열 및 박테리아용 벡터로부터 유래한 다중 클로닝 부위만이 삽입되어 크기를 최소화한 재조합 벡터를 기본 구조로 하여, 필요에 따라 형광 단백질 유전자, 유도성 프로모터 및 전사종결인자 등의 인자를 첨가한 재조합 벡터이다.
본 발명의 재조합 벡터들은 기존의 벡터에 비해 크기가 작기 때문에 유전자 조작이 용이하고, 캔디다 내에서 발현율이 높아 이후의 실험 단계가 수월하게 진행될 수 있으며, 여러 가지 유용한 인자들을 갖추고 있어 유전자 라이브러리 제작, 연구 대상 유전자의 생리적 역할 및 연구 대상 단백질의 세포 내 위치·기능에 대한 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에서 유전자 조작의 효율적 연구를 위한 일련의 재조합 벡터에 관한 것이다.
병원에서 발생하는 주요 2차 감염증에 대한 조사 결과, 주된 감염원이 박테리아나 바이러스가 아닌 곰팡이에 의한 것으로 밝혀졌다. 2차 감염으로 인한 사망의 40 %가 병원성 곰팡이에 의한 것으로, 이 중 80%는 캔디다 알비칸스 한 종에 의한 것이다. 캔디다 알비칸스는 온혈 동물에 상주균으로 기생하는 병원성 곰팡이의 일종으로, 이들 병원성 곰팡이에 의한 질환은 장기간의 항암 치료, 항생제의 남용 및 후천성면역결핍증(AIDS) 등으로 인해 면역 기능이 저하된 환자가 급증함에 따라 더욱 심각한 문제로 대두되고 있다.
캔디다를 비롯한 병원성 곰팡이에 의한 질환을 치료하기 위해 여러가지 항진균제들이 개발되어 왔다. 그러나 곰팡이는 숙주인 온혈 동물과 마찬가지로 진핵 생물이기 때문에 숙주와 많은 생화학적 성질을 공유하고 있어, 기존의 항진균제들은 숙주에 많은 부작용을 나타냈다. 따라서 곰팡이에 대해서만 선택적으로 치료 효과를 나타내는 항진균제 및 치료 방법의 개발을 위해, 곰팡이에 대한 분자생물학적 ·유전학적 연구가 절대적으로 필요하다.
다양한 방면에서 효율적인 분자생물학적 연구가 이루어지기 위해서, 연구 대상 유전자를 용이하게 조작할 수 있게 하는 수단인 벡터(vector)가 필수적으로 요구된다. 캔디다 등 병원성 곰팡이의 연구에 사용될 벡터가 갖추어야 할 요건으로, 곰팡이 내에서 벡터 스스로 복제가 가능하게 하는 자동복제서열(autonomous replicative sequence; ARS), 벡터의 발현 여부를 파악할 수 있게 하는 선택 표지유전자(selective marker gene), 다양한 클로닝(cloning) 부위 등의 기본적 구성 요소 뿐 아니라, 배지 조성 등의 환경에 따라 유전자 발현을 조절할 수 있는 유도성 프로모터(promoter)나 세포생물학적 연구에 유용하게 사용될 수 있는 발현 에피토프(epitope) 등이 필요하다.
캔디다에 비해 연구가 많이 진척된 곰팡이인 사카로마이세스 세레비재 (Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 상기 요건을 갖춘 여러 종류의 벡터가 제공되고 있어서, 다양한 강도와 선택성을 지닌 프로모터를 이용하여 연구 대상 유전자의 발현을 조절할 수 있으며, 여러 종류의 표식 에피토프를 이용하여 연구 대상 유전자의 세포 내 위치 및 기능에 대한 연구가 가능하다.
그러나, 캔디다 연구에 사용되는 벡터는 그 종류가 다양하지 못하며 사용될 수 있는 분야도 한정되어 있다.
현재 자동복제서열, 선택 표지 유전자, 클로닝 부위 등을 갖춘 캔디다 벡터는 몇몇 종류가 개발되었으나, 캔디다 내에서 그 발현율이 매우 낮아 이후의 실험 단계에 많은 제약을 주어왔으며, 클로닝할 수 있는 부위도 두세 개 정도에 그쳐 클로닝에 많은 어려움이 있다.
또한 기존의 캔디다 벡터들에 삽입된 선택 표지 유전자 및 에피토프 등은 한 두 종류로 제한되어 있어 다양한 목적의 실험에 사용되기 어렵고, 대부분 크기가 10 Kb에 달하기 때문에 2 Kb 이상의 유전자를 클로닝하는 것이 기술적으로 매우 어려워 실제 유전자 조작에 있어 많은 한계를 안고 있다.
그러므로 캔디다 알비칸스 등의 병원성 곰팡이에 대한 효율적인 연구를 위해, 높은 발현율과 함께 다양한 방면의 연구에 사용될 수 있는 요건들을 갖추고 있으며, 유전자 조작에 적절한 크기를 가진 재조합 벡터에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 높은 발현율을 나타내며 다양한 목적의 연구에 사용될 수 있는 인자들을 갖춘 적절한 크기의 캔디다 벡터를 제공하는데 있다.
상기 과제를 달성하기 위해 본 발명에서는 박테리아 벡터에 캔디다 알비칸스의 자동복제서열, 캔디다 알비칸스에서 발현되는 선택 표지 유전자 및 박테리아용 벡터로부터 유래한 다중 클로닝 부위(multicloning site; MCS)를 삽입하고, 필요에 따라 발현 에피토프, 유도성 프로모터 및 전사종결인자 등을 삽입한 일련의 재조합 벡터들을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명의 재조합 벡터 pNH2a, pNH2b, pNH4, pNH5, pNH6a 및 pNH6b의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 벡터 pNH2b, pNH4, pNH5와 각 벡터의 돌연변이 유도 전단계 벡터들이 각각 도입된 형질전환체에 대해URA3유전자의 발현율을 측정한 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 벡터 pNH2a가 도입된 형질전환체에 대해, 선택 압력이 가해지거나 가해지지 않은 조건에서URA3유전자의 발현율을 측정한 도이다.
도 4는 본 발명의 재조합 벡터 pNH5와 이 벡터의 돌연변이 유도 전단계 벡터들이 각각 도입된 형질전환체에 대해,MET3프로모터의 유도 조건과 비유도 조건에서yEGFP3유전자의 발현을 확인함으로써MET3프로모터의 기능을 확인하기 위해 한 도이다.
본 발명은 캔디다 알비칸스의 효율적 연구를 위한 일련의 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 벡터들은 박테리아의 선택 표지 유전자를 제거하고 박테리아의 자동복제서열과 항생제 내성 유전자를 남겨 놓은 박테리아용 벡터 안에, 캔디다의 자동복제서열 발현에 필요한 최소 서열, 선택 표지 유전자의 발현에 필요한 최소 서열 및 박테리아용 벡터로부터 유래한 다중 클로닝 부위만이 삽입되어 크기를 최소화한, 박테리아와 캔디다 양쪽에서 발현될 수 있는 셔틀 벡터(shuttle vector)를 기본 구조로 한다.
본 발명의 기본 벡터 제조시, 각 구성 요소들이 삽입되는 박테리아용 벡터는 재조합 벡터의 골격 역할을 하게 되며, 벡터의 크기를 최소화할 수 있도록 복제개시서열인OriC와 항생제 내성 유전자인Amp r 등 박테리아 내에서의 발현에 필수적인 요소만을 남기고, 선택 표지 유전자인LacZ ·LacI및 기존의 클로닝 부위 등 캔디다 연구에 불필요한 부분을 삭제한다. 본 발명에서 사용가능한 박테리아용 벡터는, 클로닝에 널리 이용되어 온 pUC18 등 공지의 여러 가지 박테리아용 벡터를 사용할 수 있다.
자동복제서열은 원래 곰팡이의 게놈 DNA에 있는 서열의 일부로 곰팡이의 DNA 복제가 일어날 수 있도록 하는 부위로, 복제에 관여하는 단백질들이 이 부위에 결합함으로써 복제가 시작된다. 이 자동복제서열을 벡터에 삽입시킴으로써, 벡터는 곰팡이 세포 내에서 게놈 복제와 상관없이 스스로 복제할 수 있는 능력을 지니게 된다.
선택 표지 유전자는 벡터 내의 유전자들이 곰팡이 내에서 제대로 발현되었는지를 판별할 수 있게 하는 표식(marker) 역할을 한다. 예를 들어, 실험에 널리 사용되는 캔디다 균주는 게놈 DNA 중 유라실(uracil) ·유리딘(uridine)계 염기의 합성에 관여하는URA3유전자에 인위적으로 돌연변이를 일으킨 것을 사용하는데, 이 균주에 정상URA3유전자를 함유한 벡터를 도입하여 형질전환시킬 경우, 성공적으로 형질전환된 균은 유라실이 없는 배지에서 생장할 수 있으나 형질전환되지 않은 균은 죽게 되므로, 이 경우URA3유전자는 외부에서 도입된 유전자들이 잘 발현되었는지를 선별하게 하는 표지로서 작용하게 된다. 본 발명에서 선택 표지 유전자는URA3등 공지의 여러 가지 선택 표지 유전자 중 어느 것을 사용해도 무방하나, 바람직하게는 다른 표지 유전자에 비해 보다 정확하게 벡터의 발현 여부를 판별할 수 있게 하는URA3유전자를 사용한다.
다중 클로닝 부위는 제한 효소(restriction enzyme)들이 인식할 수 있는 부위를 여러 개 가지고 있는 부분으로, 다중 클로닝 부위에 많은 제한 효소 부위가 존재해야 유전자 조작이 용이해진다. 본 발명에서는 다양한 제한 효소 부위를 가진 pBluescriptⅡKS(+) 등 공지의 여러 가지 박테리아용 벡터의 다중 클로닝 부위 중 어느 것을 사용해도 무방하다.
상기 요소들을 갖춘 기본 벡터에, 여러 가지 유용한 인자들을 삽입하여 본 발명의 재조합 벡터들을 제조한다. 본 발명의 기본 벡터에 추가로 삽입될 수 있는 유용한 인자들은 목적에 따라 형광 단백질, 유도성 프로모터, 전사종결인자 등을 사용할 수 있다.
형광 단백질은 곰팡이의 살아있는 세포에서 유전자의 발현 여부, 단백질의 기능, 위치 및 이동 경로를 연구하는데 매우 유용한 발현 에피토프이다. 본 발명에서 사용 가능한 형광 단백질 유전자는yEGFP(enhanced green fluoroscence protein),yGFP(green fluoroscence protein),yCFP(cyan fluoroscence protein) 등이 있으며, 바람직하게는 형광 현미경 기법을 이용한 연구에 가장 널리 사용되고 있는yEGFP3유전자를 사용한다.
유도성 프로모터는 배지에 함유된 영양소의 유무에 따라 대상 유전자의 발현을 조절하므로, 그 대상 유전자의 산물이 어떤 기능을 하는지 알 수 있게 한다. 예를 들어MET3프로모터의 경우, 메티오닌(methionine)이 배지에 존재하면 유전자의 발현을 억제하고, 배지에 존재하지 않으면 유전자가 발현되도록 한다. 본 발명에서 사용 가능한 프로모터는MET3프로모터를 비롯하여 갈락토오스(galactose), 말토오스(maltose) 등의 탄소원에 따라 유전자 발현을 조절하는GAL1프로모터,MAL1프로모터 등이 있으며, 바람직하게는 탄소원을 바꿀 필요가 없어 캔디다의 대사에 영향을 미치지 않으며 다른 프로모터에 비해 보다 강력하게 유전자 발현을 통제하는MET3프로모터를 사용한다.
전사종결인자는 전사체 말단 또는 프로모터 영역에 인접하여 위치하는 DNA 서열로서, RNA 중합효소가 전사를 종료하도록 하는 서열이다. 별도로 전사종결인자의 서열이 없는 유전자를 발현시키고자 할 경우에, 이 전사종결인자를 그 유전자의 3'에 삽입함으로써 제대로 발현이 되도록 할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 전사종결인자는 캔디다의 키틴 합성 효소(chitin synthase)를 비롯하여 공지된 캔디다 유전자의 전사종결인자들 중 어느 것을 사용해도 무방하나, 바람직하게는 캔디다의 키틴 합성 효소 2의 전사종결인자를 사용한다.
본 발명의 재조합 벡터에는 기본 벡터인 pNH2a, pNH2b와, 이들 기본 벡터에 추가로 여러 가지 인자를 삽입한 pNH4, pNH5, pNH6a 및 pNH6b의 6 종류가 있다.
본 발명의 재조합 벡터들의 구조는 도 1에 나타나 있으며, 그 각각의 특성은 다음과 같다.
1) pNH2a와 pNH2b
본 발명의 기본 벡터인 pNH2a(도 1a)와 pNH2b(도 1b)는 캔디다의 자동복제서열 발현에 필요한 최소 서열인 GenBank 등록번호 X16634의 1번부터 1203번까지의 서열(서열번호 1)과, 선택 표지 유전자URA3유전자의 발현에 필요한 최소 서열인 GenBank 등록번호 X14198의 11번부터 1365번까지의 서열(서열번호 2)을 박테리아용 벡터인 pUC18에 삽입한 후, pUC18의LacZ유전자에서부터 클로닝 부위,LacI유전자까지의 서열을 제거하고 대신yEGFP3유전자와 박테리아용 벡터 pBluescriptⅡKS(+)로부터 얻은 다중 클로닝 부위가 융합된 서열을 삽입한 후, 다시yEGFP3유전자를 제거하여 얻는다.
본 발명의 pNH2a와 pNH2b를 제조할 때, 캔디다의 자동복제서열과 선택 표지 유전자URA3유전자의 발현에 필요한 최소 서열은 각각의 서열을 증폭할 수 있도록 고안된 프라이머를 이용하여 PCR(polymerized chain reaction)로 얻는다.
본 발명의 pNH2a와 pNH2b를 제조할 때, 다양한 방법으로 클로닝을 할 수 있도록 다중 클로닝 부위를 각각 다른 방향으로 삽입한다. pNH2a의 경우 다중 클로닝 부위가 pBluescriptⅡKS(+)의 다중 클로닝 부위와 같은 방향으로 삽입되었으며, pNH2b는 다중 클로닝 부위가 그 반대 방향으로 삽입된다.
본 발명의 pNH2a와 pNH2b를 제조할 때, pBluescriptⅡKS(+)의 다중 클로닝 부위만을 삽입하기에는 그 크기가 너무 작기 때문에, 실험상의 편의를 도모하기 위해yEGFP3를 함께 융합하여 삽입한 후, 나중에yEGFP3유전자는 제거한다.
이와 같이, 본 발명의 기본 벡터 pNH2a와 pNH2b는 각 구성 요소들이 캔디다와 박테리아 둘 다에서 발현되는데 꼭 필요한 유전자만을 포함하고 필요없는 부분은 제거함으로써, 필수 구성 요소를 다 갖추면서도 최소 크기를 가질 수 있게 한 것이다.
따라서, 본 발명의 pNH2a와 pNH2b는, 이들과 마찬가지로 자동복제서열과URA3를 가진 기존의 캔디다 벡터에 비해 훨씬 크기가 작아(∼ 5Kb), 연구 대상 유전자의 크기에 상관없이 클로닝을 용이하게 할 수 있으며, 필요에 따라 프로모터나 에피토프 등의 인자를 추가로 삽입할 수 있다.
또한 본 발명의 pNH2a와 pNH2b는 다중 클로닝 부위가 각각 다른 방향으로 삽입되어 있어, 연구 대상 유전자에 따라 클로닝하기에 적절한 벡터를 둘 중에서 선택하여 사용할 수 있다.
2) pNH4
본 발명의 pNH4(도 1c)는 pNH2a의 다중 클로닝 부위의 3' 방향에 형광 단백질 유전자인yEGFP3와 캔디다의 키틴 합성 효소 2의 전사종결인자를 순차적으로 삽입한 벡터이다.
본 발명의 pNH4 제조시,yEGFP3유전자는 Dr. Cormack 실험실에서 얻은 pUC19/yEGFP3로부터 제한효소로 절단하여 얻는다. 본 발명의yEGFP3유전자에는 별도의 전사종결인자가 없으므로,yEGFP3유전자의 전사가 제대로 이루어지도록 캔디다의 키틴 합성 효소 2를 주형으로 하여 PCR 반응을 통해 얻은 전사종결인자의 최소 크기 서열을yEGFP3유전자의 3'에 삽입한다.
본 발명의 pNH4에는 별도의 프로모터가 없어, 연구 대상 유전자와 그 유전자의 프로모터를 함께 클로닝하게 되어 있으므로, 유전자 자신의 프로모터에 의한 조절 하에 그 유전자에 대해 연구할 수 있다.
또한 본 발명의 pNH4에는 곰팡이 내에서 녹색 형광 단백질을 발현시키는yEGFP3유전자가 있어, 이 녹색 형광 단백질이 연구 대상 단백질의 C-말단(C-terminal)에 융합되므로, 형광 신호를 이용한 세포 내에서의 대상 단백질 위치 및 기능에 대한 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
3) pNH5
본 발명의 pNH5(도 1d)는 pNH4의 다중 클로닝 부위의 5' 방향에MET3프로모터를 삽입한 벡터이다.
본 발명의 pNH5 제조시,MET3프로모터의 최소 크기 서열은 PCR을 통해 얻는다.
본 발명의 pNH5를 사용하면 형광 단백질에 의한 연구가 가능하다는 것은 pNH4와 마찬가지이나, 본 발명의 pNH5에는yEGFP3유전자의 5' 쪽에MET3프로모터가 있어, 배지에 메티오닌을 첨가 또는 배제함으로써 연구자의 의도대로 대상 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
4) pNH6a와 pNH6b
본 발명의 pNH6a(도 1e)와 pNH6b(도 1f)는 각각 기본 벡터 pNH2a와 pNH2b의다중 클로닝 부위의 5'에MET3프로모터를, 다중 클로닝 부위의 3'에 전사종결인자를 삽입한 벡터이다.
본 발명의 pNH6a와 pNH6b를 이용하면MET3프로모터의 조절 하에 연구 대상 유전자의 기능을 관찰할 수 있다.
또한 본 발명의 pNH6a와 pNH6b에서는 다중 클로닝 부위의 3'에 전사종결인자가 위치하므로, 별도의 전사종결인자 서열이 없는 유전자도 클로닝할 수 있어 클로닝의 유용성을 도모할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서 다중 클로닝 부위 내의 제한 효소 절단 부위 중 몇몇 부위가 다중 클로닝 부위 이외의 다른 부분에도 존재하기 때문에, 연구 대상 유전자를 이들 부위에 클로닝하는 것이 곤란하다. 따라서 본 발명의 재조합 벡터 각각에 대해 다중 클로닝 이외의 다른 부분에 존재하는 제한 효소 절단 부위를 불활성화시킨 돌연변이 벡터를 제조하였다.
모든 재조합 벡터에 대해 자동복제서열에 존재하는 두 개의 PstⅠ부위와 한 개의 BamHⅠ부위, 그리고URA3유전자에 존재하는 EcoRⅠ부위와 XbaⅠ부위가 각각 불활성화되었다. pNH5, pNH6a, pNH6b에서는MET3프로모터에 존재하는 XbaⅠ부위와 SalⅠ부위도 각각 불활성화되었다.
본 발명의 재조합 벡터들은 기본 벡터의 경우 기존의 캔디다 벡터에 비해 훨씬 크기가 작다. 또한 기본 벡터에 여러 가지 유용한 인자가 추가로 삽입된 재조합벡터의 경우에도 필수 구성 요소만을 갖춘 기존의 캔디다 벡터와 크기가 비슷하므로, 유전자 조작에 용이하게 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터들은 캔디다에서 발현시켰을 때, 다중카피(multicopy) 벡터와 비슷한 수의 카피로 존재한다. 따라서 본 발명의 재조합 벡터들을 사용하면 기존의 벡터보다 많은 양의 플라스미드를 얻을 수 있어 이후의 실험 단계를 수월하게 진행할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터들은 유라실·유리딘이 포함된 배지에서 오랫동안 배양해도URA3유전자를 소실하지 않고 오랫동안 보존하는 등 캔디다 내에서 안정적으로 존재하므로, 연구 과정 중 벡터가 불안정해짐에 따라 도중에 발생할 수 있는 문제점들이 해결될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터들은 상기한 공통의 장점 외에, 각기 다른 실험 목적에 따라 유용하게 사용될 수 있다.
pNH2a와 pNH2b는 발현율이 높으면서도 크기가 작으므로, 캔디다를 비롯하여 곰팡이나 박테리아의 유전자 라이브러리(library)를 제작하는데 사용될 수 있다.
MET3 프로모터를 가진 pNH5, pNH6a, pNH6b는 프로모터의 조절에 따라 연구 대상 유전자의 발현이 활성화 또는 불활성화될 때 각각 나타나는 생리적 활성의 차이를 관찰할 수 있으므로, 기능을 알지 못하는 유전자의 역할을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있다.
yEGFP3유전자를 가진 pNH4와 pNH5는 형광 현미경 기법을 이용하여 연구 대상 단백질의 세포 내 위치 및 기능을 파악하는데 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하되, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] pNH2a와 pNH2b의 제조
본 발명에서 제공하는 일련의 재조합 벡터들을 제조하기 위해, 우선 이들 벡터들의 기본 구조가 되는 pNH2a와 pNH2b를 제조하였다.
우선, 캔디다의 게놈(genome) DNA로부터 PCR을 수행하여 캔디다의 자동복제서열과 선택 표지 유전자URA3의 최소 필요 서열을 분리하였다. 사용된 프라이머는 각각 CaARS2-5', CaARS2-3' 프라이머와 CaURA3-3', CaURA3-5' 프라이머로 그 서열은 다음과 같다.
CaARS2 (정방향): 5' - CATATGGATCATACCAAAAAAAAATCCGGGG - 3' (서열번호 3)
CaARS2 (역방향): 5' - CATATGGATCCCAGCTTCTCCTTATT - 3' (서열번호 4)
CaURA3 (정방향): 5' - GACGTCGGAATTGATTTGGATGGTAT - 3' (서열번호 5)
CaURA3 (역방향): 5' - GACGTCTAGAAGGACCACCTTTGA - 3' (서열번호 6)
PCR 결과 각각 1.2 Kb와 1.3 Kb의 유전자를 얻고, 염기 서열 분석을 통해 이들 유전자가 각각 캔디다의 자동복제서열 및URA3유전자임을 확인하였다. PCR로 얻은 두 유전자를 각각 pUC18의 NdeI 부위와 AatⅡ 부위에 삽입하여 자동복제서열 및URA3를 포함하는 재조합 벡터를 얻었다.
상기 재조합 벡터에 다중 클로닝 부위를 삽입하기 위해, pBluescriptⅡ KS(+)(이하 pBS)의 다중 클로닝 부위를 택하였으나 이 부분만을 클로닝하기에는 그크기가 너무 작으므로, 클로닝의 유용성을 도모하기 위해yEGFP3를 삽입하기로 하였다.yEGFP3는 Dr. Cormack 실험실에서 얻은 pUC19/yEGFP3을 주형으로 하여 PCR 후 얻은 산물을 사용하였으며, 이때 사용된 프라이머와 그 염기 서열은 다음과 같다.
yEGFP (정방향): 5' - GAGCTCATGTCTAAAGGTGAAG - 3' (서열번호 7)
yEGFP (역방향): 5' - GAGCTCCTGCAGTTATTTGTAC - 3' (서열번호 8)
PCR 결과 0.7 Kb 크기의 DNA를 얻어 pBS의 SacI 부위에 클로닝하였다. 이 벡터를 주형으로 하고 T3/T7 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과 pBS의 다중 클로닝 부위와yEGFP3유전자가 융합된 약 800 bp의 DNA를 얻었다.
한편, 앞서 얻은 재조합 벡터, 즉 캔디다의 자동복제서열과URA3유전자를 포함하는 pUC18를 PvuⅡ로 절단하였으며, 이 과정에서 pUC18의LacZ유전자에서부터LacI유전자까지의 서열이 제거되었다. 절단된 4.9 Kb 크기의 벡터와 800 bp의 PCR 산물의 말단을 각각 클레노우(Klenow) 효소로 처리하여 평활 말단(blunt end)을 만든 후 이들을 연결(ligation)하였다. 그 결과 다중 클로닝 부위와yEGFP3유전자가 융합되어 있으며, 다중 클로닝 부위의 방향이 서로 다른 두 종류의 벡터를 얻고 이를 각각 pNH1a와 pNH1b로 명명하였다.
상기 벡터들로부터, 자동복제서열과URA3유전자와 다중 클로닝 부위만을 포함하는 기본 벡터들을 얻기 위해, pNH1a와 pNH1b를 SacI으로 절단하여yEGFP3를 제거하였다. 그 결과 남은 5 Kb의 DNA만을 자가 연결(self ligation)시킴으로써 본 발명의 기본 벡터가 되는 재조합 벡터들을 얻었다.
본 발명의 재조합 벡터에서 다중 클로닝 부위 내의 제한 효소 절단 부위 중 몇몇 부위가 다중 클로닝 부위 이외의 다른 부분에도 존재하므로, 이들 부위를 이용하여 클로닝할 수가 없다는 문제점이 있었다. 따라서 다중 클로닝 이외의 다른 부분에 존재하는 제한 효소 절단 부위를 불활성화시켜, 다중 클로닝 부위의 모든 부위를 확보하기로 하였다.
자동복제서열의 경우 두 개의 PstⅠ부위와 한 개의 BamHⅠ부위를 불활성화시켜야 했으므로, 특정 부분의 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)를 수행하였다. 각 재조합 벡터에 대해, 두 개의 PstⅠ부위를 불활성화시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그러나 BamHⅠ부위는 알 수 없는 원인에 의해 돌연변이 유도가 제대로 이루어지지 않았으므로, 각 재조합 벡터에 대해 BamHⅠ효소를 단시간만 처리하여 부분적인 절단이 일어나게 하였다. 절단된 양 끝을 평활 말단으로 만들어 연결시킨 후, 박테리아에 도입하여 얻은 형질전환체 중 다중 클로닝 부위에만 BamHⅠ부위를 가지는 것을 선별하였다.
URA3유전자의 경우 각 재조합 벡터에 대해 EcoRⅠ부위와 XbaⅠ부위를 각각 불활성화하였다.
각각의 돌연변이 유도에 사용된 프라이머의 염기 서열과 돌연변이 유도로 인한 결과를 표 1에 나타내었다.
| 돌연변이를유도할 부분 | 돌연변이 유도에 사용된프라이머의 염기 서열 | 결과 |
| ARS | 5'-CGTAGCTGCCGCACTGCTACAACCCATC-3'(서열번호 9) | PstⅠ의 불활성화(CTGC A G →CTGC C G) |
| 5'-GGGTTGTAGCAGTGCGGCAGCTACGAATG-3'(서열번호 10) | ||
| ARS | 5'-GTATGTGCTGTCGCGGCAGGGGAGGG-3'(서열번호 11) | |
| 5'-GATTACCCCTCCCCTGCCGCGACAGC-3'(서열번호 12) | ||
| URA3 | 5'-CAAGGAACTCCT TAGTGGTATCAAC -3'(서열번호 13) | EcoRⅠ부위의 불활성화(GA A TTC →GA G TTC) |
| 5'-CCACTAAGGAGTTCCTTGAATTAATTG -3'(서열번호 14) | ||
| URA3 | 5'-CGTCTAGGAGGACCACCTTTGATTG-3'(서열번호 15) | XbaⅠ부위의 불활성화( T CTAGA → C CTAGA) |
| 5'-CAAAGGTGGTCCTCCTAGACGTC-3'(서열번호 16) |
이렇게 하여 얻은 재조합 벡터들은 캔디다의 자동복제서열과 캔디다의URA3유전자와 pBS의 다중 클로닝 부위의 발현에 필요한 최소 서열만을 포함하는 기본 벡터이며, 이들을 각각 pNH2a와 pNH2b로 명명하였다.
[실시예 2] pNH4의 제조
본 발명의 기본 벡터를 이용하여,yEGFP3유전자와 전사종결인자를 추가로 삽입한 벡터를 얻기 위해 다음의 과정을 수행하였다.
pNH2a의 제조 과정 중 얻은 벡터인 pNH1a에서,yEGFP3유전자의 염기 서열을 분석한 결과, 이 벡터 내의yEGFP3유전자에 중 네 개의 염기에 돌연변이가 일어났음을 확인하였다. 이러한 현상은yEGFP3유전자의 PCR 과정 중에 일어난 것으로, 다시 돌연변이가 일어날 가능성을 배제하기 위해 이 유전자를 pUC19에 클로닝되어 있는 원래의yEGFP3유전자로 대체하기로 하였다.
이를 위해 pNH2a를 SacI으로 잘라 돌연변이를 일으킨yEGFP3유전자 부분을 제거하였다. 돌연변이가 일어나지 않은 원래의yEGFP3유전자를 얻기 위해, pUC19/yEGFP3플라스미드를 HindⅢ와 PstI으로 잘라 720 bp의yEGFP3유전자를 얻었다. 절단된 pNH2a와yEGFP3유전자를 각각 평활 말단으로 만들어 연결시켰다.
그런데yEGFP3유전자 내에는 별도로 전사의 종결을 지시하는 인자가 없으므로,yEGFP3유전자의 3'에 전사종결인자를 삽입하기로 하였다. 전사종결인자 서열은 캔디다의 키틴 합성 효소 2로부터 PCR을 통해 얻었으며, 이때 사용된 프라이머와 그 염기 서열은 다음과 같다.
CaCHS2T (정방향): 5'- GGCGCCCCAGCACCTCCAGAAGAG -3' (서열번호 17)
CaCHS2T (역방향): 5'- GGCGCCCAAAAGAATAGTATGGGC -3' (서열번호 18)
PCR 결과 얻은 469 bp의 PCR 산물을 T 벡터에 클로닝한 후 NarI과 PstI으로 잘라 전사종결인자의 최소 서열인 200 bp의 DNA를 얻고,yEGFP3가 삽입되어 있는 재조합 벡터는 NarI으로 절단한 뒤 각각의 양끝을 평활 말단으로 만들었다. 두 DNA를 연결하여 클로닝 후 얻어진 플라스미드에 대해, 염기 서열 분석을 통해 전사종결인자의 방향을 확인하여yEGFP3와 같은 방향으로 연결된 클론을 선택하였다.
이렇게 하여 얻은 재조합 벡터는 다중 클로닝 부위의 3'에yEGFP3유전자와 전사종결인자가 차례로 존재하며, 이 벡터를 pNH4로 명명하였다.
[실시예 3] pNH5의 제조
yEGFP3유전자와 전사종결인자를 가질 뿐 아니라, MET3 프로모터의 조절을 받는 재조합 벡터를 얻기 위해 다음의 과정을 수행하였다.
우선 캔디다의 MET3 프로모터를 얻기 위해, 캔디다의 게놈 DNA을 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머와 그 염기 서열은 다음과 같다.
CaMet3p (정방향): 5' - CTGCAGGCGCTGAAAAACTACGAA - 3' (서열번호 19)
CaMet3p (역방향): 5' - CTGCAGGTTTTCTGGGGAGGGTAT - 3' (서열번호 20)
그 결과 얻은 1.3 Kb의 DNA의 양끝을 평활 말단으로 만들고, pNH4을 KpnI으로 절단한 후 양끝을 평활 말단으로 만들어 이들을 연결하였다. 클로닝으로 얻어진 플라스미드의 염기 서열을 분석하여MET3프로모터의 방향을 확인하고,yEGFP3및 전사종결인자와 같은 방향으로 삽입된 클론을 선택하였다.
상기 벡터에 대해 다중 클로닝 부위의 모든 부위를 확보하기로 하기 위해, 실시예 1에서와 같이 자동복제서열과URA3유전자에서 돌연변이 유도를 수행하였다.MET3프로모터의 경우 pNH5, pNH6a, pNH6b에 대해 XbaⅠ부위와 SalⅠ부위를 각각 불활성화하였으며 이때 사용된 프라이머는 다음 표 2과 같다.
| 돌연변이를유도할 부분 | 돌연변이 유도에 사용된프라이머의 염기 서열 | 결과 |
| MET3 | 5'-CGATGTTTAAATCTAGCTACCCAATATG-3'(서열번호 21) | XbaⅠ부위의 불활성화( T CTAGA → G CTAGA) |
| 5'-GGGGATTTCATATTGGGTAGCTAGATTTAAAC -3'(서열번호 22) | ||
| 5'-GTTCATTGTCGTGGCGACATTCTAAC-3'(서열번호 23) | SalⅠ부위의 불활성화(GTCG A C →GTCG C C) | |
| 5'-CTTTAGTTAGAATGTCGCCACGACAATG-3'(서열번호 24) |
이렇게 하여 얻은 재조합 벡터는 다중 클로닝 부위의 5'에MET3프로모터가 존재하고, 다중 클로닝 부위의 3'에yEGFP3유전자와 전사종결인자가 차례로 존재하며, 이 벡터를 pNH5로 명명하였다. 본 발명의 pNH5는 2001년 10월 12일 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10090BP로 기탁되었다.
[실시예 4] pNH6a와 pNH6a의 제조
MET3프로모터와 전사종결인자를 가진 재조합 벡터를 얻기 위해, 다음의 과정을 수행하였다.
기본 벡터 pNH2a는 KpnI으로, pNH2b는 SacI으로 각각 절단하고, 전사종결인자는 pNH4를 제조할 때와 같은 방법으로 준비한 후, 각 DNA의 양끝을 평활 말단으로 만들어 각 벡터에 전사종결인자를 연결하였다.
연결 후, pNH2a를 벡터로 하는 경우는 SacI으로, pNH2b를 벡터로 하는 경우는 KpnI으로 각각 절단하고,MET3프로모터는 PstI으로 절단한 후, 각 DNA의 양끝을 평활 말단으로 만들어 연결시켰다. 클로닝으로 얻어진 플라스미드는 염기 서열분석을 통해 삽입된 방향을 확인하였다.
상기 벡터에 대해 다중 클로닝 부위의 모든 부위를 확보하기로 하기 위해, 실시예 3에서와 같이 자동복제서열,URA3유전자,MET3프로모터에서 돌연변이 유도를 수행하였다.
이렇게 하여 얻어진 재조합 벡터들은 다중 클로닝 부위의 5'에MET3프로모터가 존재하고, 다중 클로닝 부위의 3'에 전사종결인자가 존재하며, 이를 각각 pNH6a와 pNH6b로 명명하였다.
[실험예 1] 본 발명의 재조합 벡터의 자동복제서열의 기능성 및 안정도 확인
1) 본 발명의 재조합 벡터의 자동복제서열의 기능성 확인
본 발명의 재조합 벡터의 자동복제서열의 기능성을 확인하기 위해, 본 발명의 재조합 벡터를 실제로 캔디다에 도입한 후 선택 표지 유전자의 발현율을 측정하였다. 본 발명의 재조합 벡터 제조시, 다중 클로닝 부위의 확보를 위해 모든 벡터에서 자동복제서열과URA3유전자의 일부분을 돌연변이시켰기 때문에, 최종 산물인 재조합 벡터와 돌연변이 유도를 수행하기 전단계의 벡터에 대해 함께 실험을 수행하였다.
본 발명의 재조합 벡터 중 pNH2b, pNH4, pNH5와 각 벡터에 대해 돌연변이 유도 전단계의 벡터들, 그리고 액틴(actin)이 삽입된 플라스미드를 각각 전기충격법 (electroporation)을 이용하여 캔디다에 도입시켰다. 형질전환시킬 균주로 캔디다의 야생형(wild type)인 CAI4 균주(ura3Δ::imm34/ura3Δ::imm34)를 사용하였으며, 전기충격에 민감해지도록 저온 상태를 유지하면서 캔디다 세포를 100 mM 리튬 아세테이트(lithium acetate)와 10 mM DTT (dithiothreitol)를 함유하는 TE 완충액으로 처리하였다. 2 ㎜의 홈을 가진 전기충격용 큐벳(cuvette)에 캔디다 세포 40 ㎕와 DNA 1 ㎍을 넣고 얼음에 5분간 두었다. 큐벳을 전기충격기(Easyject Plus, Eurogentec)에 고정시킨 후, 1.8 ㎸, 25 ㎌, 99 Ω의 조건으로 전기충격을 가했다. 이렇게 하여 각각의 플라스미드로 형질전환된 캔디다를 얻었다.
이때 각 재조합 벡터의 발현율을 측정하기 위해, 단일카피 벡터인 YCp50과 다중카피 벡터인 YEp24를 마찬가지의 방법으로 도입하여 형질전환시킨 사카로마이세스 세레비재를 함께 준비하였다.
각 형질전환체로부터 전체 RNA를 추출한 후(Domdey H. et al., Cell, 39:611-621, 1984), 슬롯 블롯 분석법(slot blot analysis)을 수행하였다. 각각의 전체 RNA 40 ㎍을 RNA 분해 효소가 없는 물 10 ㎕에 녹인 후, RNA 변성화 용액(RNA denaturation solution; 포름아미드(formamide) 660 ㎕, 37% 포름알데히드 (formaldehyde) 210 ㎕, 10 ×MOPS 전기영동 완충액 130 ㎕) 30 ㎕와 섞어 65 ℃에서 5분간 항온처리(incubation)하였다. 상기 반응액을 얼음 상에서 식힌 후, 동일 부피의 20 ×SSC 완충액을 처리하였다.
한편, RNA를 전이(transfer)시킬 멤브레인(membrane)은 적절한 크기로 잘라 20 ×SSC 완충액에 1시간 동안 담가두었다가, 블롯팅할 기기(blotting manifold)의 반응구멍(well)에 멤브레인을 위치시킨 후, 10 ×SSC 완충액으로 멤브레인을 세척하였다. RNA를 변성시킨 반응액을 멤브레인 위에 올린 후 10 ×SSC 완충액으로 세척하고, 5분간 진공을 이용하여 멤브레인을 건조시켰다.
RNA가 전이된 멤브레인을 자외선으로 고정(cross-linking)시킨 후, 전혼성화 용액(prehybridization solution; 포름아미드 5 ㎖, 물 2 ㎖, 50% 덱스트란 설페이트(dextran sulfate) 2 ㎖, 10% SDS 1 ㎖, 0.58 g 염화나트륨, 연어의 정자(salmon sperm) DNA 100 ㎕)에 넣어 42 ℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 전혼성화 용액에 동위원소로 표지한 프로브(probe)를 20 ㎕ 넣어 42 ℃에서 16시간 이상 혼성화하였다. 이때 프로브는 선택 표지 유전자인URA3유전자를 PCR 반응으로 얻어 사용하였으며, 재조합 벡터 제조시 사용된 서열번호 3, 4의 염기 서열을 가진 프라이머를 이용하였다.
혼성화가 끝난 후, 0.1 % SDS가 각각 함유된 2 ×SSC, 1 ×SSC 및 0.1 ×SSC의 용액을 사용하여 순서대로 세척한 후, 자기방사표지법(autoradiography)에 의해 결과를 분석하였다. 슬롯 블롯 분석시, 각 경우의URA3mRNA 밀도를 비교하기 위해 곰팡이에서 항상 일정하게 발현되는 actin mRNA의 양을 함께 분석하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서, 항상 일정하게 발현되는 유전자인 액틴의 mRNA의 양에 비추어볼 때 pNH2b, pNH4, pNH4의 돌연변이 유도 전단계 벡터는 YEp24와 비슷한 정도의 높은URA3발현율을 나타냈으며, pNH5, pNH2b의 돌연변이 유도 전단계 벡터, pNH5의 돌연변이 유도 전단계 벡터는 그보다 낮은 발현율, 즉 YCp50과 비슷한 정도의 발현율을 나타냈다.
따라서 본 발명의 재조합 벡터들은 대부분 다중카피 벡터만큼의 높은 발현율을 나타내므로, 발현율이 단일카피 벡터의 수준에 그쳤던 기존의 캔디다 벡터보다 훨씬 높은 활성을 가진 자동복제서열을 지니고 있음을 알 수 있다.
또한 돌연변이 유도를 하기 전단계의 벡터와 돌연변이 유도를 수행하여 얻은 최종 산물인 재조합 벡터의 발현율에 별다른 차이가 없는 것으로 보아, 본 발명의 재조합 벡터에 포함된 자동복제서열과URA3유전자는 제조 과정 중 발생한 몇 개의 염기 돌연변이에 상관없이 캔디다 내에서 제대로 작용함을 알 수 있다.
2) 본 발명의 재조합 벡터의 자동복제서열의 안정도 확인
본 발명의 재조합 벡터의 자동복제서열의 안정도를 확인하기 위해, 본 발명의 재조합 벡터를 실제로 캔디다에 도입한 후 선택 압력(selection pressure)이 가해지는 상황에서 선택 표지 유전자의 발현 안정성을 측정하였다.
본 발명의 재조합 벡터 중 pNH2a를 택하여, 발현율을 확인할 때와 마찬가지의 방법으로 전기 충격법을 이용하여 CAI4 균주에 도입하였다. 정상적인 발현율을 확인하기 위해서, 형질전환된 CAI4를 대수성장기(log phase)까지 배양하여 전체 RNA를 얻었다.
선택 압력을 가한 조건에서의 발현율을 확인하기 위해서, 형질전환된 CAI4를 대수성장기 이후까지 계속 배양하여 성장정지기(stationery phase)까지 키운 후, 각각 유라실 또는 유리딘이 함유된 배지로 옮겼다. 이때 선택 압력이 가해지지 않은 조건에서의 발현율을 함께 비교하기 위해 아무런 염기도 함유되지 않은 배지로옮긴 조건도 준비하였다. 각 조건마다 하루에 한번씩 새 배지로 갈아주면서 3일간 배양한 후, 전체 RNA를 추출하였다.
각각의 조건으로부터 발현율을 확인할 때와 마찬가지의 방법으로 슬롯 블롯 분석법을 수행하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서, pNH2a로 형질전환된 캔디다는 유라실(b)이나 유리딘(c) 등 염기가 함유된 배지에 여러 세대 동안 배양했을 때에도URA3유전자를 소실하지 않았으며, 대수성장기까지 배양한 캔디다(a)나 염기를 공급해주지 않은 배지에서 배양한 캔디다(d)에서와 마찬가지로 높은URA3발현율을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 압력이 가해진 상황 하에서도 높은 안정도를 가지고 발현됨을 알 수 있다.
[실험예 2] 본 발명의 재조합 벡터의
MET3
프로모터와
yEGFP3
유전자의 기능성 확인
본 발명의 재조합 벡터에 대해MET3프로모터와yEGFP3유전자의 기능성을 확인하기 위해, 다중 클로닝 부위의 5'에MET3프로모터를, 3'에yEGFP3유전자를 지니고 있는 pNH5를 대표로 택하였다.
pNH5의MET3프로모터 부분에서 다중 클로닝 부분의 확보를 위해 XabⅠ과 SalⅠ 부위를 돌연변이시켰으므로, 돌연변이가 일어난 벡터에서MET3프로모터가 제대로 기능할 수 있는지를 확인할 필요가 있었다. 돌연변이시키기 전의 원래 벡터, XabⅠ부위에 돌연변이를 일으킨 벡터, SalⅠ부위에 돌연변이를 일으킨 벡터 및XabⅠ과 SalⅠ부위에 모두 돌연변이를 일으킨 벡터를 실험예 1과 마찬가지의 방법으로 CAI4에 각각 도입하였다.
각 형질전환체를 메티오닌이 첨가되지 않았거나 첨가된 배지에서 배양한 후, 형광 현미경 하에서yEGFP3유전자의 발현을 관찰하였다(도 4).
도 4에서, 메티오닌이 첨가되지 않은 배지에서 배양된 형질전환체에서는 모두 형광을 나타내는 세포들을 관찰할 수 있었으므로,MET3프로모터에 의해yEGFP3유전자가 제대로 발현되었음을 알 수 있다. 반면 메티오닌이 첨가된 배지에서 배양된 형질전환체들에서는 모두 형광을 나타내는 세포가 관찰되지 않았다.
따라서 본 발명의 재조합 벡터의MET3프로모터는 메티오닌의 존재 유무에 따라 정확하게 유전자의 발현을 조절할 수 있으며,yEGFP3유전자 또한 정상적으로 발현됨을 알 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터들은 기존의 벡터에 비해 크기가 작기 때문에 유전자 조작이 용이하다.
본 발명의 재조합 벡터들은 캔디다 내에서 발현율이 높으며 안정성을 갖추고 있으므로, 이후의 실험 단계가 수월하게 진행될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터들은 여러 가지 유용한 인자들을 갖추고 있으므로, 유전자 라이브러리 제작, 연구 대상 유전자의 생리적 역할 및 연구 대상 단백질의 세포 내 위치·기능에 대한 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (25)
- 박테리아의 선택 표지 유전자를 제거하고 박테리아의 자동복제서열과 항생제 내성 유전자를 남겨 놓은 박테리아용 벡터 안에, 캔디다의 자동복제서열 발현에 필요한 최소 서열, 선택 표지 유전자의 발현에 필요한 최소 서열 및 박테리아용 벡터로부터 유래한 다중 클로닝 부위만이 삽입되어 크기를 최소화한 재조합 벡터
- 제 1항에 있어서, 박테리아용 벡터는 pUC18이며, 자동복제서열 발현에 필요한 최소 서열은 서열번호 1이며, 선택 표지 유전자는URA3이고 상기 유전자의 발현에 필요한 최소 서열은 서열번호 2이며, 다중 클로닝 부위는 박테리아용 벡터 pBluescriptⅡKS(+)로부터 얻음을 특징으로 하는 재조합 벡터
- 제 2항에 있어서, 자동복제서열의 BamHⅠ부위와 두 개의 PstⅠ부위,URA3유전자의 EcoRⅠ부위와 XbaⅠ부위가 모두 불활성화됨을 특징으로 하는 재조합 벡터
- 제 3항에 있어서, 도 1a의 구조를 가짐을 특징으로 하는 재조합 벡터 pNH2a
- 제 3항에 있어서, 도 1b의 구조를 가짐을 특징으로 하는 재조합 벡터 pNH2b
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 벡터의 다중 클로닝 부위의 3'에 형광단백질 유전자와 전사종결인자가 순차적으로 추가 삽입된 재조합 벡터
- 제 6항에 있어서, 형광 단백질 유전자는yEGFP3유전자이며, 전사종결인자는 캔디다 키틴 합성 효소 2의 전사종결인자임을 특징으로 하는 재조합 벡터
- 제 7항에 있어서, 도 1c의 구조를 가짐을 특징으로 하는 재조합 벡터 pNH4
- 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 벡터에 있어서, 다중 클로닝 부위의 5'에 유도성 프로모터가 추가로 삽입된 재조합 벡터
- 제 9항에 있어서, 유도성 프로모터는MET3프로모터임을 특징으로 하는 재조합 벡터
- 제 10항에 있어서,MET3프로모터의 XbaⅠ부위와 SalⅠ부위가 모두 불활성화됨을 특징으로 하는 재조합 벡터
- 제 11항에 있어서, 도 1d의 구조를 가짐을 특징으로 하는 재조합 벡터 pNH5
- 제 12항에 있어서, 기탁번호 KCTC 10090BP로 기탁되어 있는 재조합 벡터 pNH5
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 벡터의 다중 클로닝 부위의 5'에 유도성 프로모터, 다중 클로닝 부위의 3'에 전사종결인자가 추가로 삽입된 재조합 벡터
- 제 14항에 있어서, 유도성 프로모터는MET3프로모터이며, 전사종결인자는 캔디다 키틴 합성 효소 2의 전사종결인자임을 특징으로 하는 재조합 벡터
- 제 15항에 있어서,MET3프로모터의 XbaⅠ부위와 SalⅠ부위가 모두 불활성화됨을 특징으로 하는 재조합 벡터
- 제 16항에 있어서, 도 1e의 구조를 가짐을 특징으로 하는 재조합 벡터 pNH6a
- 제 16항에 있어서, 도 1f의 구조를 가짐을 특징으로 하는 재조합 벡터 pNH6b
- 제 4항의 재조합 벡터를 도입시킨 미생물
- 제 5항의 재조합 벡터를 도입시킨 미생물
- 제 8항의 재조합 벡터를 도입시킨 미생물
- 제 12항의 재조합 벡터를 도입시킨 미생물
- 제 17항의 재조합 벡터를 도입시킨 미생물
- 제 18항의 재조합 벡터를 도입시킨 미생물
- 제 19항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 또는 곰팡이임을 특징으로 하는 미생물
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