KR20030020561A

KR20030020561A - 헬리코박터 파일로리 유래의 신규한 항바이러스 펩타이드및 그의 용도

Info

Publication number: KR20030020561A
Application number: KR1020010053706A
Authority: KR
Inventors: 우은란; 함경수; 이동건; 장영수
Original assignee: 학교법인조선대학교
Priority date: 2001-09-01
Filing date: 2001-09-01
Publication date: 2003-03-10
Anticipated expiration: 2021-09-01
Also published as: KR100438415B1

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 균이 생산하는 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1, RPL1)의 아미노말단(amino-terminal) 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항바이러스 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성(amphipathic)을 갖고 있는 펩타이드인 HP (2-20)의 친수성 부위를 소수성 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시키는 양친화성 구조로 합성한서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체는 세포독성이 없고 탁월한 바이러스-세포 융합저해 활성을 나타내므로 인체에 안전한 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

헬리코박터 파일로리 유래의 신규한 항바이러스 펩타이드 및 그의 용도{Novel antiviral peptide derived from Helicobacter pylori and use thereof}

본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 균이 생산하는 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1, RPL1)의 아미노말단(amino-terminal) 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항바이러스 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성(amphipathic)을 갖고 있는 펩타이드인 HP (2-20)의 친수성 부위를 소수성 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시키는 양친화성 구조로 합성한서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

후천성 면역결핍 바이러스(HIV) 감염은 주로 재활성화 형태로 바이러스 자체질환을 유발할 뿐만 아니라 HIV 증식을 증강시키는 보조역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 바이러스 군에는 거대세포 바이러스, 단순포진 바이러스, 대상포진 바이러스, EBV(Epstein-Barr virus) 등이 포함된다. 이들은 식도염뿐만 아니라 폐렴, 척수염, 다발성 신경병증, 부신염, 부고환염, 자궁 경부염 및 췌장염 등을 일으킨다.

HIV에 처음 감염되면 약 3-6주 후에 급성 HIV증후군이라는 심한 몸살 같은 증상이 1-2주 계속되다가 사라지고, 그 후 증상이 없는 "임상적 잠복기"가 약 10년간 지속된다. 그러나 이런 오랜 잠복기 동안에도 바이러스의 증식과 면역체계의 파괴는 계속되며, 마지막 수년에 가서야 면역 부전으로 인한 합병증 즉 기회 감염과 악성종양이 나타나게 된다.

에이즈의 치료에는 위에 기술한 여러 가지 합병증(기회 감염, 종양, 신경 질환)에 대한 치료와 HIV 자체에 대한 항바이러스 치료(anti-retroviral therapy), 그리고 파괴된 면역체계의 회복을 목표로 하는 치료 등이 있다. 이 중 항바이러스치료는 바이러스 수가 적고, 면역계 파괴가 적은 감염 초기에 강력한 항바이러스제에 의하여 최대한 바이러스 증식을 억제하고 궁극적으로는 몸에서 HIV를 완전히 근절하고, 면역을 회복/유지하는 것이 목표이다. 이러한 목적을 위하여 여러가지 항바이러스제를 동시 투여하여 내성 발현을 막아야 한다. 임상적 효과와 함께 혈장 HIV RNA치와 숙주세포의 막 단백질인 CD4수를 치료의 지표로 삼는다.

현재 임상에서 사용되고 있는 대부분의 에이즈 치료제들은 역전사 효소 저해제와 프로테아제 저해제로서 이들 치료제들은 심각한 골수장애 등의 부작용뿐만 아니라 내성 바이러스의 출현 등으로 인해 사용에 많은 한계를 드러내고 있어 새로운 작용양식에 기초한 에이즈 치료제 개발이 시급하다고 하겠다(Langtry, et al.,Drugs, 37, 408-450,1989; Whittington, et al.,Drugs, 44, 656-683,1992; De Clercq,Biochem. Pharmacol., 47, 155-169,1994). 최근 유전자 운반의 방법이 개발되면서 그 대상이 확대되어져 가고 있다. 유전자 치료는 모든 다른 실험처리 절차에서처럼 체세포 유전자 치료법에 의해 치료된 환자에게 일어날 수 있는 부차적인 효과 또는 잠재적으로 가능한 유해점들을 배제하기 위해 가능한 모든 사전주의를 필요로 하고 있다.

특히, AIDS의 경우에는 이 병의 원인이 되는 HIV 바이러스의 그 엄청난 양적인 복제의 특성과 치료중에 보여주는 돌연변이에 의한 내성으로 인하여 유전자 치료가 가장 필요한 질병이라 할 수 있으며, 이것의 감염경로는 우선 후천성 면역결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120과 gp 41이 숙주세포의 막 단백질인 CD4와의 결합으로 일어나는 막융합에 의해 바이러스의 중심부분이 숙주세포에 침입함으로써 일어나는 것으로 알려지고 있다(Lin, et al.,Antimicrob. Agents Chemother., 40, 133-138,1996; Hart, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2189-2193,1991). 실험적인 AIDS의 유전자 치료로서는 감염세포 내에서의 HIV 복제저해와 건강한 세포에로의 감염을 방지하는 것이며 이를 위한 유전자 치료방법은 항바이러스를 형질전환(transfection)이나 ex vivo 상태에서 CD4+ T 세포 또는 CD34+ 세포에 설치류의 레트로바이러스(murine retrovirus)를 매개로 하여 전달한 후, 유전자가 변이된 세포들을 자가(autologous) 혹은 동계/이계(syngeneic/allogeneic)의 수용체에 주입하는 것이다. 따라서 후천성 면역결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120 및 gp 41과 숙주세포의 막 단백질인 CD4와의 결합에 이은 막 융합을 저해하는 물질은 새로운 작용양식을 가진 에이즈 치료제 개발의 좋은 단서를 제공할 것으로 판단된다. 폴리설페이트, 폴리카르복실레이트 등의 폴리아니오닉 화합물들이 면역 결핍바이러스의 외피 당단백질인 gp 120 및 gp 41과 숙주세포의 막 단백질인 CD4 간의 결합을 저해하는 것으로 알려져 있으나 이러한 화합물들은 생체내 이용률이 낮을 뿐 아니라 I형 면역 결핍바이러스에 선택성을 나타내지 않아 이 화합물에 대한 더 이상의 개발은 이루어지지 못하고 있다(De Clercq,Antiviral Res., 7, 1-10,1987). 최근 I형 면역 결핍바이러스의 외피 당단백질인 gp 41로부터 유래하는 합성 펩타이드와 gp 41로부터의 유사체 합성 펩타이드를 트리테르페노이드에 결합시킨 천연물에 강력한 바이러스-세포 융합저해 활성이 있는 것으로 알려지면서 합성 펩타이드에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Mayaux, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3564-3568,1994; Pereira, et al.,FEBS Letters, 362, 243-246,1995; Ryu, et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 265, 625-629,1999).

지난 세기 동안 소화성 궤양은 스트레스와 위산 과다생성에 의한다는 생각이 우세하였으나, 최근에 이러한 소화성 궤양이 헬리코박터 파일로리균에 의한 것이라고 밝혀지면서(Blaser, M. J.,Trends Microbiol., 1, 255-260,1991) 이에 대한 관심이 집중되고 있다. 헬리코박터 파일로리균은 그람 음성균에 속하고 성장속도가 매우 느린 나선모양과 편모를 가지는 혐기성 미생물이다. 헬리코박터 파일로리균이 생산하는 많은 단백질 중 RPL1이라는 단백질은 230개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 상기 단백질의 아미노말단 부위는 세크로핀과 그 구조가 유사하다는 것이 밝혀져 있는데, 특히 아미노말단의 8개 아미노산이 동일한 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 파일로리의 RPL1 아미노말단부위는 완벽한 양친화성 나선모양 구조를 가지는데(Putsep, K. et al.,Nature, 398, 671-672,1999), 이러한 양친화성 펩타이드는 세포막의 지질 성분과 유사한 구조를 지니므로 미생물의 세포막 지질성분과 결합함으로써 미생물의 세포막을 파괴하거나, 세포막의 전위에 영향을 주어 이를 변화시킴으로써 미생물을 파괴한다는 작용 기작이 보고되어 있다. 이외에도 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 역시 항균활성을 가진다는 보고가 있다(Putsep, K., et al.,Nature, 398, 671-672,1999).

이에 본 발명자들은 양친화성을 갖는 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 특정 부위 서열과 상기 서열 중 일부를 소수성 아미노산으로 치환시킴으로써 소수성 부위를 증가시키는 양친화성 구조로 펩타이드 유도체를 설계하고 합성하였으며, 이와 같이 합성된 펩타이드 유도체의 항바이러스 활성 및 세포 독성(용혈활성)을 확인하여 상기 펩타이드 유도체가 항바이러스제로 이용될 수 있는 펩타이드임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항바이러스제로 이용할 수 있는 세포독성이 없고 우수한 바이러스-세포 융합 저해 활성을 나타내는 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균의 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1)의 아미노말단 HP (2-20) 펩타이드 유래의 유사체 펩타이드를 설계한 도해(diagram)를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 항바이러스 펩타이드를 CD4 양성 헬라(HeLa) 세포에 처리하고 바이러스 표면에 I형 면역결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120, gp 41을 발현하는 벡시니아 바이러스로 감염시켰을 경우 바이러스와 세포간의 융합이 저해됨을 확인한 현미경 사진이다.

A : 양성 대조군,

B : HP (2-20),

C :서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드,

D : 바이러스 대조군

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 균이 생산하는 RPL1 단백질의 아미노말단(amino-terminal) 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체를 항바이러스용으로 사용하는 용도를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기의 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 항바이러스용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 헬리코박터 파일로리균이 생산하는 RPL1 단백질의 아미노말단 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.

본 발명자들은 헬리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노 말단 부위 중 양친화성을 갖고 있는 펩타이드인 HP (2-20)의 친수성 부위를 소수성 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시킴으로써 양친화성 구조를 갖는 항바이러스 펩타이드를 합성하였다.

상기 항바이러스 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였으며(Merrifield, RB.,J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)서열번호 1로 기재되는 HP(2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 트립토판으로 치환한서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드를 제조하였다(도 1참조). 이와 같이 제조된 항바이러스 펩타이드를 분리ㆍ정제하고 그 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항바이러스 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

서열번호 2로 기재되는 아미노산으로 구성된 본 발명의 항바이러스 펩타이드는서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 트립토판 이외의 다른 소수성 아미노산으로 치환할 수 있으며, 바람직하게는 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 치환할 수 있다.

또한, 본 발명의 항바이러스 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드의 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 부위가 증가되는 양친화성 구조로 합성할 수 있으며, 바람직하게는 8번째 아미노산인 아르기닌과 10번째 아미노산인 글루탐산 및 20번째 아미노산인 리신을 상기에 기술한 소수성의 다른 아미노산으로 치환시켜 합성할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 펩타이드 및 그의 유도체를 항바이러스용으로 사용하는 용도를 제공한다.

우선, 본 발명의 펩타이드가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 펩타이드의 항바이러스 활성을 측정하였다. 항바이러스 활성을 측정하기 위하여 CD4 양성 헬라(HeLa) 세포와 I형 면역결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120과 gp 41을 발현하고 있는 벡시니아 바이러스(vPE 16)와의 융합 분석법(Fusion assay)을 수행하였다. 면역결핍 바이러스에 대한 항바이러스제에 대한 검색방법으로 여러 가지가 있지만 본 발명에서는 면역결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120, gp 41과 숙주세포 막 단백질인 CD4 사이의 결합에 이은 막융합을 저해하는 정도를 측정하는 방법으로 항바이러스 활성을 확인하였다. 그러나 면역결핍 바이러스를 일반 실험실에서 사용하는 것은 상당한 위험에 노출되기 때문에 I형 면역 결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120과 gp 41을 발현하는 유전자를 벡시니아 바이러스에 감염시켜 조제한 유전자 재조합 바이러스 vPE 16과 CD4 양성 헬라 세포간의 막 융합을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 5배 가량의 높은 세포-바이러스 융합저해활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 덱스트란보다도 탁월한 항바이러스 활성을 나타내었다(표 1,도 2참조).

아울러, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사한 결과, HP (2-20)과 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다(표 2참조).

상기의 결과로부터, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드는 탁월한 세포-바이러스 융합저해 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 항바이러스용 약학적 조성물을 제공한다.

상기서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체의 유효용량은 0.1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그의 유도체의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 펩타이드의 합성 및 분리정제

본 발명자들은 소수성 영역이 증가되어 양친화성 구조를 갖는 항바이러스 펩타이드를 합성하기 위하여, 헬리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 친수성 부위를 소수성 아미노산으로 치환시켰다. 구체적으로,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 트립토판으로 치환한서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드를 제조하였다. 펩타이드 합성 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였다(Merrifield, RB.,J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)(도 1).

구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실말단이 -NH₂형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬(chain)의 연장은 DCC(N-hydroxybenzo triazole (HOBt)-dicyclo-hexycarbodiimide)법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% NMP(piperidine /N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H₂O-triisopropylsilane(85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.)용액을 가하고 2 내지 3시간 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸 에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrle gradient)에서 정제형 역상(reverse phase, RP)-HPLC 칼럼(Delta Pak, C₁₈300 Å, 15, 19.0 ㎜×30 ㎝, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N HCl을 이용하여 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압농축하고 0.02 N HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.

상기의 방법으로 조성된 펩타이드의 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI 질량 분석법(Hill, et al.,Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395,1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항바이러스 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

<실험예 1> 펩타이드의 항바이러스 활성 측정

본 발명자들은 상기실시예 1에서 제조된 펩타이드의 항바이러스 활성을 측정하기 위하여, CD4 양성 헬라(HeLa) 세포와 I형 면역결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120과 gp 41을 발현하고 있는 벡시니아 바이러스(vPE 16)와의 융합 분석법(Fusion assay)을 수행하였다.

면역결핍 바이러스에 대한 항바이러스제에 대한 검색방법으로 여러 가지가있지만 본 발명에서는 면역결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120, gp 41과 숙주세포 막 단백질인 CD4 사이의 결합에 이은 막융합을 저해하는 정도를 측정하는 방법으로 항바이러스 활성을 확인하였다. 그러나 면역결핍 바이러스를 일반 실험실에서 사용하는 것은 상당한 위험에 노출되기 때문에 I형 면역 결핍 바이러스의 외피 당단백질인 gp 120과 gp 41을 발현하는 유전자를 벡시니아 바이러스에 감염시켜 조제한 유전자 재조합 바이러스 vPE 16과 CD4 양성 헬라 세포간의 막 융합을 측정하였다.

융합 분석법(Fusion assay)에 사용된 시료는 10 μM의 농도로 조제하여 0.22 μm의 필터를 통과시켰다. 표면에 CD4 단백질을 갖고 있는 CD4 양성 헬라(HeLa)세포를 햄스(Ham's)배지에서 배양하였다. 배지의 성분으로는 10%의 열처리한 갓 태어난 송아지 혈청, 100 units/㎖의 페니실린(Penicillin G), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate) 및 NaHCO₃(1.176 g/ℓ)를 첨가하였다. 유전자 재조합 바이러스 vPE 16은 표면에 외피 당단백질 gp 120과 gp 41을 발현하는 벡시니아 바이러스로서 vPE 16의 스톡(stock)은 vPE 16이 감염된 베로(vero)세포의 상등액을 모아 사용하였다. 상등액의 바이러스 역가(titer)는 플라크 분석법(plaque assay)을 이용하여 결정하였으며 바이러스 원액은 -80℃에 보관해서 사용하였다. 분석방법을 요약하면 대수기에 있는 CD4 양성 헬라 세포(2x10⁵세포/㎖)를 12-웰 플레이트(12-well plate)에 깔고 3일 후에 신선한 배지로 플레이트 위에 붙지 않은 세포를 씻어내었다. 상기의 검체가 들어있는 0.2 ㎖의 배지를 넣고30분간 배양한 후 희석시킨 vPE 16(7.3x10²PFU) 10 ㎕를 넣고 30분간 더 배양시켰다. 그 후 0.8 ㎖의 배지를 넣고 16∼20시간 후에 현미경하에서 융합형성(syncytia formation)을 관찰하였다. 융합계수(Fusion index)와 융합저해의 비율(% fusion inhibition percent)은 하기수학식 1및수학식 2에 의해서 구했다.

FI = 전체 핵수/전체 세포의 수 - 1

% 융합계수 = (1-FI₁/FI₂) x 100

이때 FI₁은 검체의 융합계수이고 FI₂는 대조군의 융합계수이다. 융합분석의 결과를 하기표 1에 나타내었다.

시료	농도	융합계수	% 융합저해
음성대조군	0	0.70±0.05	0
HP (2-20)	10 μM	0.59±0.16	16.1±10.4
서열번호 2	10 μM	0.16±0.07	76.7±6.55
양성대조군	100 ㎍/㎖	0.40±0.08	57.1±5.65

그 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에서는 거의 나타나지 않던 바이러스-세포 융합저해 활성이 양성 대조물질로 사용된 덱스트란 설페이트보다도 탁월한 활성을 나타내었다.

<실험예 2> 항바이러스 펩타이드의 세포 독성 측정

본 발명의 항바이러스 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항바이러스 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사하였다. 구체적으로, 사람의 적혈구를 8 %의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 12.5 μM/웰 부터 1/2의 농도로 펩타이드를 연속적으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 조사하기 위하여 1% 트리톤-X100을 첨가하여 흡광도를 측정하였고, 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하여 이를 각 항바이러스 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기수학식 3에 따라 계산하였다.

상기 식에서, 흡광도 A는 414 nm 파장에서 펩타이드 용액의 흡광도, 흡광도B는 414 nm 파장에서 PBS의 흡광도 및 흡광도 C는 414 nm 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.

상기 식에 의한 적혈구 파괴능의 결과를 하기표 2에 나타내었다.

항바이러스 펩타이드의 세포 독성 측정

펩타이드	% 적혈구 파괴능 (μM)
펩타이드	12.5	6.25	3.125	1.56	0.78	0.39	0.195	0.097
HP(2-20)	0	0	0	0	0	0	0	0
서열번호 2의 항바이러스 펩타이드	0	0	0	0	0	0	0	0
멜리틴	100	100	95	93	31	0	0	0

그 결과, 본 발명의 HP(2-20)과서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다.

<실험예 3> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드를 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 비경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의 항바이러스 펩타이드는 랫트에서 5 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 10 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기의 결과로부터, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드는 강력한 바이러스-세포 융합저해 활성을 나타내었으며 세포독성을 나타내지 않으므로, 인체에 안전한 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

바이러스-세포 융합저해 활성을 가지는서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그 유도체.
제 1항에 있어서, 항바이러스 펩타이드 및 그 유도체는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1, RPL1)의 아미노말단 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 것을 특징으로 하는 항바이러스 펩타이드 및 그 유도체.
제 2항에 있어서, RPL1 단백질의 아미노말단 부위는 양친화성을 갖고 항바이러스 활성을 나타내는서열번호 1로 기재되는 펩타이드 HP (2-20)인 것을 특징으로 하는 항바이러스 펩타이드 및 그 유도체.
제 3항에 있어서,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 트립토판 이외의 다른 소수성 아미노산으로 치환시켜 합성하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 펩타이드 및그 유도체.
제 4항에 있어서, 소수성 아미노산은 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 펩타이드 및 그 유도체.
제 3항에 있어서,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 부위가 증가되는 양친화성 구조를 가지도록 합성하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 펩타이드 및 그 유도체.
제 6항에 있어서,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 8번째 아미노산인 아르기닌과 10번째 아미노산인 글루탐산 또는 20번째 아미노산인 리신 중 하나 혹은 그 이상을 트립토판, 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 구성된 아미노산으로 치환시켜 합성한 것을 특징으로 하는 항바이러스 펩타이드 및 그 유도체.
제 1항의서열번호 2로 기재되는 항바이러스 펩타이드 및 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 약학적 조성물.