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KR20030012321A - 동물세포용 발현벡터 및 ｈｂｖ의 표면 항원을 대량으로생산하기 위한 동물세포용 발현벡터 - Google Patents

동물세포용 발현벡터 및 ｈｂｖ의 표면 항원을 대량으로생산하기 위한 동물세포용 발현벡터 Download PDF

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KR20030012321A
KR20030012321A KR1020010046304A KR20010046304A KR20030012321A KR 20030012321 A KR20030012321 A KR 20030012321A KR 1020010046304 A KR1020010046304 A KR 1020010046304A KR 20010046304 A KR20010046304 A KR 20010046304A KR 20030012321 A KR20030012321 A KR 20030012321A
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KR
South Korea
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dhfr
hbv
expression vector
surface antigen
promoter
Prior art date
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Abandoned
Application number
KR1020010046304A
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English (en)
Inventor
김현희
유광현
최완규
오영애
권장성
신성호
Original Assignee
(주)코아바이오텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by (주)코아바이오텍 filed Critical (주)코아바이오텍
Priority to KR1020010046304A priority Critical patent/KR20030012321A/ko
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Abstract

본 발명은 HBV의 표면 항원과 같은 단백질을 동물세포에서 다량으로 생산하기 위한 발현벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사이토메갈로바이러스의 인핸서 부위가 제거된 프로모터, 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 dhfr 및 진핵세포에서 작동하는 복제원점을 포함하는 dhfr-동물세포용 발현벡터, 이를 포함하는 HBV의 표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 dhfr-동물세포용 발현벡터에 관한 것으로서, 본 발명의 발현벡터를 이용하는 경우에는 종래의 방법보다 낮은 농도의 DHFR 저해제에 의해서도 다량의 HBV 표면 항원을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 조기 항체 생성능 및 항체 지속능이 우수한 HBV 표면 항원을 다량으로 얻을 수 있다.

Description

동물세포용 발현벡터 및 ＨＢＶ의 표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 동물세포용 발현벡터{Expression Vectors Useful in Animal Cells and Expression Vectors for Preparing HBV Surface Antigen}
본 발명은 동물세포용 발현벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 HBV의 표면 항원과 같은 단백질을 동물세포에서 다량으로 생산하기 위한 발현벡터에 관한 것이다.
HBV (Hepatitis B Virus)는 간염의 주된 병원체로서, 현재 지구상의 약 3 억 인구가 감염되어 있어서 심각한 세계 보건문제를 나타내고 있다. 동남아 지역 및 열대 아프리카 지역에서 만성 보균자가 약 10% 정도에 달하며 우리 나라도 1980년중반에는 10% 정도가 만성보균자였으며 현재는 공중위생의 선진화, 간염백신 접종으로 인해 4-5%수준으로 줄어들었으나, 선진국의 1%에 비해 많은 보균율을 보이고 있다 (Choi, B. Y. et al.,J. Hanyang Med. Coll.10:245-263(1990)).
HBV는 42 nm의 Dane 입자, 22 nm 구형 입자 및 100 nm의 튜브 입자로 구성되어 있는데, 이중 예방 백신의 제조에는 22 nm의 HBsAg가 이용된다. HBsAg 입자는 단일의 긴 오픈 리딩 프레임에 의해 생성된 거대(L), 중간(M) 및 소(S)로 표시되는 세 가지 표면 항원 단백질로 구성되어 있다. 상기 S 단백질은 HBV 지놈의 S 부위에 의해 코딩되는 주 단백질로서, 비글리코실화 p22 및 모노글리코실화된 gp26의 두 가지 형태로 존재한다 (Tiollais, P. et al.,Science213:406-411(1981)). 상기 M 단백질은 S 단백질에 프리-S2 도메인인 108개의 아미노산이 추가되어 모노글리코실화된 gp33 및 디글리코실화된 gp36이 있다. L 단백질은 M 단백질에 프리-S1 도메인인 55개의 아미노산이 추가되어 비글리코실화 p39 및 글리코실화 gp42가 있다. 일반적으로 만성 보균자나 포유동물 세포에서 유래된 HBsAg에서 상기 세가지 펩타이드 농도는 S>>>M>L 순서이다.
한편, HBV의 간세포 침입 기작은 다음과 같다: 인체 내에 침입한 HBV는 프리-S1 및 프리-S2 항원에 존재하는 특정 부위를 이용하여 간세포와 결합한 다음, 융합 방법을 통해 자신의 DNA를 간세포 내로 보낸다. 프리-S 항원은 단백질 분해에 매우 민감한 아미노산 서열을 가지고 있는데 상기 융합 시에 이 부위가 분해되어 HBV DNA가 간세포 내로 이동될 수 있는 통로를 제공해 준다. 이와 같이 HBV의 간세포 침입 기작을 고려할 때, 프리-S에 대한 항체가 생성되어야 HBV 감염에 노출되었을 경우 바이러스의 간세포 내로의 침투를 원천적으로 봉쇄해 완전한 방어력을 유도해 줄 수 있음을 알 수 있다.
또한, Thoma 등 (Progress in Hepatitis B Immunization.194:35(1990))은 프리-S 항원에서 얻어지는 간염 바이러스에 대한 방어력이 S-항원에 의하여 얻어지는 방어력보다 오래 유지된다고 보고 하였으며, Neurath 등 (Vaccine4:35-37(1986)) 및 Beasly 등 (Grune & Stratton,New York.pp 209-224(1984))은 프리-S 항체가 S 항체 보다 조기에 생성되어 프리-S를 함유한 백신의 수직 감염에 대한 효율성을 보고하였다. 따라서, HBV에 대한 백신 개발 시 프리-S를 함유하는 백신을 개발하는 것이 바람직하고, 당업계에서도 그에 대한 요구가 있다.
HBV의 감염을 조절하기 위하여 개발된 여러 가지 백신을 살펴보면, 초기 단계에는 HBV에 감염된 보균자의 혈청을 펩신으로 처리하여 HBsAg를 정제하고 이를 포르말린으로 불활화한 B 형 간염백신이 이용되었다 (Hillman, M. et al.,Am. J. Med. Sci. 270:401-404(1975)). 그러나, 상기 방법은 재료를 구하기가 용이하지 않고 세균에 의해 오염되어 있을 가능성도 있기 때문에 문제가 있었고, 이러한 문제점을 피하기 위하여, 재조합 표면 항원 단백질의 개발이 시도되었다.
Valenzuela 등 (Nature 298:347-350(1982))이 이스트를 이용하여 유전자 재조합 표면 항원 백신을 개발하였으나, 이는 S 펩타이드인 p24로 구성되어 있으며 글리코실화가 되어 있지 않아서 생체 내에서 비교적 불안정하고, 프리-S도 함유되어 있지 않아서 면역 유도력 다소 떨어지는 문제점이 있다. 또한, 이스트를 숙주로 하여 r-HBsAg (recombinant-HBsAg) 입자를 제조할 경우에 분자량이 약 200만 달톤되는 r-HBsAg를 세포 밖으로 분비시키는 것은 불가능하기 때문에 간염 항원 정제시 숙주 세포 내에 축적된 간염 항원을 용출시키기 위하여 세포를 파쇄하여야 한다. 이 때 단단한 세포막을 파쇄하기 위해 물리적 및 화학적 처리가 필수적으로 실시되는 데, 이러한 처리는 간염 항원의 면역원성과 항원성에 영향을 준다. 더불어, 숙주 세포 파쇄는 수 많은 숙주 유래 단백질을 용출시켜 간염 항원의 정제에 많은 어려움을 주는 문제점이 있다.
한편, 대한민국 특허출원 제 1989-700312 호는 항원성이 우수한 HBV의 신규한 프리-S1을 개시하고 있고, 특허출원 제 1995-43662 호는 HBV의 표면항원 프리-S의 N-말단 2번째 및 3번째 아미노산을 암호하는 염기 서열에 돌연변이가 유발된 전사체로부터 발현된 프리-S 항원 변이 단백질을 개시하고 있으며, 특허출원 제 1995-9865 호는 글루타티온-S-전이효소를 코드하는 유전자의 3'-말단에 HBV의 프리-S1 단백질의 N-말단으로부터 50내지 58개의 아미노산으로 이루어진 프리-S1 펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 연결시켜 제조한 융합유전자를 개시하고 있다.
또한, 대한민국 특허출원 제 1991-25893 호는 소아마비 바이러스의 외피 단백질을 암호화 하는 유전자의 일부를 절단 또는 제거하고 여기에 B형 간염 바이러스의 표면항원 및 프리 에스 항원을 암호화 하는 유전자틀 삽입시켜 재조합 Dl 바이러스 벡터를 제조한 후, 벡터 자체 또는 시험관내 전사(In vitro transcription)에 의하여 만들어진 재조항 DI 바이러스의 RNA-트랜스크립트를 영장류 동물 세포에트랜스펙션시킨 다음 조력자 바이러스로 수퍼 인펙션시키고 인리리먼트 될 수 있도록 바이러스를 계대 배양한 다음, 정제하여 제조한 DI 바이러스를 분리하고, 이를 장용성 복용형으로 제형함을 특징으로 하는 경구용 B형 간염 백신의 제조방법을 개시하고 있다.
상기 특허 문헌 이외에도 대한민국 특허출원 제 1985-1458 호 및 제 1993-29980 호도 HBV의 표면 항원에 대하여 개시하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
따라서, 본 발명의 목적은 dhfr-동물세포용 발현벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 HBV의 표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 dhfr-동물세포용 발현벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 dhfr-동물세포주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 HBV 표면 항원의 제조방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 본 발명의 벡터 중 일 구현예인 pCMVdE-dhfr의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 개략도;
도 2는 본 발명에 의하여 사이토메갈로바이러스의 인핸서 부위가 제거된 프로모터의 생성을 확인하는 아가로스 겔 사진;
도 3은 본 발명의 벡터를 제조하기 위한 방법의 중간 단계에서 제조되는 pZeo-dhfr 벡터의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 개략도;
도 4는 본 발명의 벡터 중 일 구현예인 pCB2FD 벡터의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 개략도;
도 5는 본 발명의 벡터 중 일 구현예인 pCMVdE-dhfr의 유전자 지도를 나타낸 도면;
도 6은 본 발명의 벡터 중 일 구현예인 pCB2FD의 유전자 지도를 나타낸 도면;
도 7은 본 발명의 세포주의 세포 모양을 보여 주는 페이즈 콘트라스트 현미경 사진;
도 8은 본 발명의 방법에 따라 생산 및 정제된 HBsAg의 정제도 및 분자량을 나타내는 SDS-PAGE 겔 사진;
도 9는 본 발명의 방법에 따라 생산 및 정제된 HBsAg의 면역학적 특성을 보여 주는 면역 블롯팅 겔 사진;
도 10은 본 발명의 방법에 따라 생산 및 정제된 HBsAg의 면역학적 특성을 보여 주는 ELISA 분석 그래프; 및
도 11은 본 발명의 세포주에서 HBsAg 유전자가 세포주의 gDNA에 삽입되어 있는지를 확인하기 위한 서던 블롯 분석을 보여 주는 겔 사진.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 사이토메갈로바이러스의 인핸서 부위가 제거된 프로모터, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 dhfr 및 진핵세포에서 작동하는 복제원점을 포함하는 dhfr-동물세포용 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 사이토메갈로바이러스의 인핸서 부위가 제거된 프로모터, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 dhfr, 진핵세포에서 작동하는 복제원점, HBV의 표면 항원을 코딩하는 유전자 및 상기 HBV의 표면 항원을 코딩하는 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터을 포함하는 HBV의 표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 dhfr-동물세포용 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 dhfr-로 형질전환된 동물세포에서 목적의 단백질을 대량으로 생산하기 위한 발현벡터에 관한 것이다. 본 명세서에서, 용어 "dhfr-동물세포"는 디히드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase: DHFR)가 정상적으로 발현되지 않아, 세포 내 상기 효소의 활성이 없거나 또는 거의 없도록 형질전환된 동물세포를 의미한다. 본 발명은 상기 숙주 세포의 특성 및 선택 (selection) 되기 위한 DHFR 유전자 (이하, "dhfr"라 한다)를 포함하는 유전자의 증폭 (gene amplification) 원리를 이용한 것이다. 즉, dhfr-동물세포를 dhfr-포함 DNA (예:벡터)로 형질전환시키고, 형질전환된 세포에 DHFR 저해제를 처리한 경우에는 dhfr를 포함하는 벡터가 세포 내에서 많이 증폭된 세포가 선택되게 된다. 결국, 벡터의 증폭이 달성된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 낮은 농도의 DHFR 저해제에 의해서도 효과적인 벡터의 증폭을 달성할 수 있도록 벡터를 제작하였다. 이러한 전략을 위하여, dhfr에 작동적으로 (operatively) 연결된 프로모터의 전사 활성 (transcriptional activity)을 인위적으로 감소시킨다. 상기 프로모터는, 바람직하게는 동물 세포에서 통상적으로 이용되는 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: 이하, "CMV"라 한다)의 프로모터이고, 보다 바람직하게는 CMV의 즉시 초기 프로모터 (immediately early)이다. 이 프로모터의 활성을 감소시키기 위하여, CMV의 인핸서 부위가 제거된 프로모터가 바람직하고, 통상적인 CMV의 프로모터 서열 중에서 전사 인자 (transcription factor) 및 RNA 중합효소와의 상호작용에 의하여 전사 과정을 촉발하는 데 필요한 최소 서열이 보다 바람직하며, 가장 바람직하게는 서열 1에 기재된 프로모터 서열 중 1-428이 제거된 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 진핵세포는 CHO (Chinese Hamster Ovary)이고, 이는 DHFR이 결핍된 CHO 세포는 안전성과 효용성이 검증되어 FDA로부터 승인 받아 널리 사용되고 있기 때문이다.
본 발명의 벡터에 포함된 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV 40 복제원점, pMB1 복제원점, Adeno 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 벡터에서, dhfr 이외에 다른 유전자에 연결된 프로모터는 강력한 프로모터를 이용하는 것이 바람직하고, 예컨대, CMV 프로모터, tk 프로모터, SV 40 후기 (late) 프로모터, SV 40 초기 (early) 프로모터, MT 프로모터, MMTV LTR 프로모터, 아데노바이러스 주 후기 프로모터 (Ad MLP), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) 프로모터, 뮤라인 메탈로티오닌 (murine metallothionein) 유전자의 프로모터 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, dhfr-동물세포용 발현벡터는 도 5에 도시된 유전자 지도를 갖는 pCMVdE-dhfr이다.
HBV의 표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 본 발명의 dhfr-동물세포용 발현벡터에서, HBV의 표면 항원 (이하, "HBsAg"이라 한다)을 코딩하는 유전자는 프리-S1 유전자, 프리-S2 유전자 또는 S 항원 유전자, 또는 이들의 조합으로 구성된 것이 바람직하다. 공지된 문헌에서 확인할 수 있듯이, HBsAg을 코딩하는 유전자는 프리-S 유전자 (즉, 프리-S1 유전자 및 프리-S2 유전자)를 포함하는 것이 보다 바람직하며, 이와 같은 프리-S를 포함하는 항원은 조기 항체 생성능 및 항체 지속능이 우수하다.
본 발명의 발현벡터에는 전사 종결 서열로서, 폴리 아데닐화 서열이 포함되며, 예를 들어 SV40 polA 서열 및 BGH polA 서열 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, HBV의 표면 항원을 대량으로 얻기 위한 진핵세포용 발현벡터는 도 6에 도시된 유전자 지도를 갖는 pCB2FD이다 (KCTC 1025BP).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 본 발명의 dhfr-동물세포용 발현벡터에 의해 형질전환된 dhfr-동물 세포주를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 HBV의 표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 dhfr-동물세포용 발현벡터로 형질전환된 dhfr-동물 세포주를 제공한다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 상기 동물 세포주는 CHO/dhfr-세포주이다 (KCTC 1025BP). 이와 같은 동물 세포주에 의해 발현되는 HBsAg은 미생물 유래 항원에 비하여 천연형 항원 단백질의 3차 구조와 더욱 유사한 항원이고, 또한 현재 사용되고 있는 효모 유래 HBsAg 보다 조기 항체 생성능 및 항체 지속능 측면에서 우수하다.
본 발명에 있어서, dhfr-동물세포를 벡터로 형질전환하는 방법은 미세 주입법 (Capecchi, M.R.,Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al.,Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al.,EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질전환법 (Wong, T.K. et al.,Gene, 10:87(1980)),DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal,Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기한 HBV의 표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 dhfr-동물세포용 발현벡터로 형질전환된 dhfr-동물 세포주를 디히드로폴레이트 환원효소의 저해제의 첨가 하에서 배양하는 단계; 및 (b) 배양물에서 HBV 표면 항원을 정제하는 단계를 포함하는 HBV 표면 항원의 제조방법를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 디히드로폴레이트 환원효소의 저해제는 예를 들어, 아미노프테린 (aminopterin) 및 메토트렉세이트 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 메토트렉세이트이다.
유전자 증폭에 이용되는 MTX는 고가이기 때문에, 시험관 수준으로 실시되는 실험실에서의 실험에서는 중요한 고려 요소가 되지 않지만, 대용량 수준으로 실시되는 경우에는 중요한 고려 요소가 된다. 이에, 당업계에서는 유전자 증폭을 위해 첨가되는 MTX의 농도를 감소시킬 수 있는 방안을 계속적으로 연구하고 있다. 한편, 통상적으로, 당업계에서는 유전자 증폭을 위하여 MTX 0.5-1 μM 정도가 이용되고 있다. 본 발명의 제조방법에 이용되는 세포주는 저농도의 MTX에서도 유전자 증폭이 잘 이루어지도록 형질전환 된 것이다. 따라서, 본 발명에 첨가되는 메토트렉세이트의 농도는 5-100 nM이 바람직하고, 보다 바람직하게는 30-60 nM이며, 가장 바람직하게는 40-50 nM이다. 하기의 실시예에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에서 MTX가 50 nM 이상이 되는 경우에는 유전자 증폭이 증가되는 비율이 크게 감소되어, MTX의 가격 및 증폭정도를 모두 고려하면, 첨가되는 MTX의 증가가 그 의미를 상실하게 된다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 배양하는 단계는 본 발명에서 통상적으로 이용되는 배지에서 실시될 수 있고, 상업적으로 구입 가능한 배지는 예컨대 함스 F10 (Sigma), MEM (minimal essential medium, Gibco BRL), RPMI-1640 (Sigma), DMEM (Gibco BRL) 등이 있다. Ham 및 Wallace,Meth. Enz., 58:44(1979) 및 Barnes 및 Sato,Anal. Biochem., 102:255(1980)에 개시되어 있는 배지를 이용할 수 있다.
상기 배양 단계에서, 숙주 세포 내에 발현된 HBsAg가 배지로 분비 되고, 이렇게 분비 된 HBsAg를 정제하면, 목적의 HBsAg를 다량으로 얻게 된다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: HBV의 프리-S 및 S 항원을 코딩하는 유전자의 분리
HBV에 감염된 환자의 혈청에서 HBV gDNA를 지놈 DNA 분리 키트 (Promega)를 이용하여 추출하고, 이를 주형으로 해서 HBV의 프리-S 및 S 항원을 코딩하고 있는 유전자를 PCR 방법으로 증폭하여 얻었다. PCR에 사용된 Pfu 중합 효소는 Solgent 사로부터 구입한 것이고, 온도 조건은 어닐링 58℃에서 30초, 연장 반응은 72℃에서 2분 30초, 변성은 94℃ 에서 30초간으로 하여 총 30 사이클을 수행하였다. 사용된 전방향 프라이머는 5'-GTGGAAGGCTAGCATTCTATATAA-3'이고, 역방향 프라이머는 5'-CGTCCCGCGCAGGATCCAGTT-3'이고, 상기 프라이머는NheI 및BamHI 제한 효소 자리가 발생하도록 제작된 것이다.
실시예 2: CHO 세포에서 r-HBsAg 항원을 발현하기 위한 벡터 제작
Ⅰ.pCMVdE-dhfr의 제작
낮은 농도의 MTX 함유 배지에서 r-HBsAg를 높게 발현하는 세포주를 얻기 위하여 우선 pCMVdE-dhfr를 다음과 같이 제작하였다 (참조 도 1): 우선, hCMV 프로모터를 가지고 있는 pZeo-SV2(+) 벡터(Invitogen)를 주형으로 하여 인핸서 부분이제외된 hCMV IE 프로모터 부분을 PCR 방법으로 얻었다. PCR은 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였으며, 사용된 전방향 프라이머는 5'-ATCGATTTCCAAAATGTCGTA-3'이고, 역방향 프라이머는 5'-TGCTAGCCGGTGTCTTCT-3'이다. 이어, PCR 증폭물을 pMOS Blue (Amersham Pharmacia Biotech)에 삽입하여 pCMVdE를 제조하였으며, 아가로스 겔 상에서 크기를 관찰하여 인핸서 부분이 제거로 프로모터의 크기가 감소된 것을 확인하였으며(참조: 도 2), 염기서열 분석으로 인핸서 부부의 제거를 재확인하였다. 도 2에서 M 레인은 크기 마커를 로딩한 것이고, CMV 레인은 인핸서를 포함하는 pCMV(E+P)를 제한 효소ClaI과NheI으로 자른 절편이며, CMVdE 레인은 상기 pCMVdE를 제한 효소ClaI과NheI으로 자른 절편을 각각 로딩한 것이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, pCMVdE에서는 인핸서 부분이 제거된 CMV IE 프로모터가 포함되어 있음을 알 수 있다.
한편, pZeo-SV2(+) 벡터(Invitogen) 및 pSV2-dhfr 벡터 (ATCC)를 각각HindⅢ 및BamHI으로 처리하여 pSV2-dhfr에 포함된 dhfr 유전자를 pZeo-SV2(+)에 삽입시켜 pZeo-dhfr를 제작하였다 (참조: 도 3).
이어, 상기 벡터 pCMVdE를 제한 효소ClaI과NheI으로 절단하고 같은 효소로 처리된 벡터 pZeo-dhfr에 삽입하여 최종적으로 pCMVdE-dhfr를 제조하였다.
Ⅱ. pCB2FD의 제작
우선 상기 실시예 1에서 증폭된 산물을NheI 및BamHI으로 절단한 다음, pGEM-T Easy 벡터 (Promega)에 삽입하였다. 이어, pGEM-T Easy 벡터 및 동물세포발현 벡터인 pcDNA3.1/Zeo (Invitrogen)를NheI 및BamHI으로 각각 절단한 다음, pGEM-T Easy 벡터 내에 있는 HBsAg 유전자를 pcDNA3.1/Zeo에 삽입하여 pCMV-HBsAg를 제조하였다. 그런 다음, 벡터 pCMV-HBsAg를 포유동물 세포주인 COS-7 (ATCC)에 형질전환한 후 3일 동안 배양하고, HBsAg 항원의 분비 여부를 ELISA (녹십자, GENEDIA HBsAg ELISA 3.0) 방법으로 조사하여, 상기 실시예 1에서 PCR 증폭된 산물의 기능적 활성을 확인하였으며, ELISA 측정 결과 정상적으로 HBV 표면 항원이 발현됨을 확인하였다.
그리고 나서, 지속적으로 HBsAg 항원을 발현하는 CHO 세포주를 얻기 위하여, 상기 pCMVdE-dhfr 벡터 및 pCMV-HBsAg를 각각EcoRI으로 절단하고, pCMV-HBsAg의 pCMV-HBsAg 부분을 pCMVdE-dhfr에 삽입하여 최종적으로 pCB2FD 벡터를 제작하였다.
첨부한 도 4는 pCB2FD 벡터의 제작 과정을 대략적으로 도식화한 것이고, 도 5는 상기 pCMVdE-dhfr의 유전자 지도이며, 도 6는 최종적인 본 발명의 pCB2FD 벡터의 유전자 지도를 나타내는 것이다.
실시예 3: 본 발명의 벡터를 이용한 형질전환
3 ㎕의 FuGENETM6 (Roche)를 혈청이 포함되지 않은 IMDM 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Media, GiBco BRL) 100 ㎕에 희석하고, 상기 실시예 2에서 제작된 pCB2FD 벡터 2 ㎍을 첨가하여 혼합한 다음, 40분 동안 실온에서 방치한 후 준비한 CHO/dhfr-(ATCC CRL 9096) 세포 위에 골고루 넣어 주었다. 이어, 정상배지(10% FBS와 HT(0.1mM 소듐 하이포잔틴, 0.016 mM 티미딘)가 포함된 IMDM 배지)에서 72시간 더 배양한 후 0.25% 트립신 (GiBCO BRL)을 처리하고 원심분리하여 얻어진 세포를 웰 당 1 ×104개 세포가 되도록 96-웰 플레이트에 분주하였다. 그런 다음, 투석된 혈청 (GiBCO BRL, 26300) 10% 및 제오신 (Invitrogen, R-250) 500 ㎍/㎖을 함유하는 α-MEM 배지 (GiBCO BRL)를 첨가하여 배양 (37℃, 5% CO2농도) 하고 4-5일 간격으로 배지를 갈아주면서 2주 동안 배양하였다. 2주 후 생존한 클론들을 100 여개 얻었고, 각 클론의 r-HBsAg 표면 항원 생산 능력을 측정하기 위하여 HBsAg ELISA (녹십자, GENEDIA HBsAg ELISA 3.0)를 수행하였다. 이 중에서 rHBsAg 표면 항원을 가장 많이 생산하는 세포주를 "CHO D14"라 명명하고, 1 ×106개 세포를 취하여 100 ㎜ 접시에 옮기고, MTX (Sigma) 5 nM을 함유하는 α-MEM 배지에서 4-5일 간격으로 배지를 교환하면서 2주 동안 배양하였다. 상기 농도의 MTX에서 생성된 콜로니들을 트립신으로 처리한 후에 팁을 이용하여 96-웰 플레이트에 옮겨주고, 다시 동일한 ELISA 방법으로 HBsAg의 발현 정도를 측정하였다. 가장 발현량이 높은 세포주를 "CHO D-14-3"라 명명하고, 다시 50 nM MTX가 함유된 α-MEM 배지에서 배양하여 최종적으로 얻어진 r-HBsAg 표면 항원 고발현 세포주를 "CHO D14-3-4"라 명명하고, 상기 세포주를 "CHOdhfr-"로 표시하여 한국세포주 은행 (Korean Collection for Type Cultures)에 2001년 6월 1일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 1025BP를 부여 받았다.
실시예 4: 형질전환된 본 발명의 세포주 및 rHBsAg의 분석
Ⅰ.세포의 형태학적 특징 분석
상기 실시예에서 얻은 rHBsAg를 생산하는 세포주를 현미경 (Phase contrast microscope, Nikon)으로 관찰한 결과, 전형적인 상피 세포 모양으로 관찰되었고, 이는 원래의 세포와 동일한 형태의 정상적인 모양이다 (참조: 도 7). 따라서, 본 발명의 세포주에서 생산된 rHBsAg를 백신으로 사용하는 것에 문제가 없을 것으로 판단된다.
Ⅱ.rHBsAg의 분리 및 정제
가.농축 및 투석
천연형 HBsAg 입자의 크기가 약 22 nm이며 분자량이 100만 - 200만 달톤 정도 (Zaslavsky, V. et al.J. Gen. Virol., 2:341-9(1980))라는 특성을 이용하여 다음과 같은 정제 과정을 실시하였다: rHBsAg를 생산하는 본 발명의 세포주를 배양한 배양액 5 ℓ를 MW가 30만 컷-오프인 한외여과 시스템 (Millipore Pellicon System)을 이용하여 500 ㎖까지 농축한 후 PBS (Phosphate buffered saline)로 분자량 30만 이하의 물질을 제거하였다. 이어, PBS 염 조건하에서 4% PEG를 처리한 다음, 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 수득한 상층액에 10% 농도가 되게 PEG을 다시 처리한 다음 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 침전물을 수거하였다.
나.KBr 농도구배 초원심분리
일반적으로 pHBsAg 및 rHBsAg의 밀도는 약 1.2 g/㎖로 알려져 있고, 지질 또는 지질단백질의 밀도는 이 보다 매우 낮으며 대다수 단백질들은 보다 높은 밀도를 갖는다는 특성을 이용하여 다음과 같이 정제 과정을 실시하였다: 상기 PEG 침전물을 PBS로 용해한 다음, KBr을 첨가하여 밀도가 1.2 g/㎖가 되게 한 후 Beckman Ti 70 로터를 이용하여 60,000 rpm에서 원심분리를 실시하였다. 원심분리가 종결된 후 주사기를 이용하여 rHBsAg 밴드를 분리하였다. 이렇게 분리된 rHBsAg를 MW 10,000 컷-오프로 투석여과 하여 염을 제거하여 최종적으로 정제를 실시하였다.
다.SDS-PAGE 분석
상기 과정에서 정제된 rHBsAg을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 다음, 은 염색 플러스 시스템 (BIO-RAD, 161-0499)을 이용하여 염색하였다 (참조: 도 8). SDS-PAGE를 이용한 서브유니트 단백질 패턴 분석결과, 22 kD 및 26 kD에서 S 단백질 및 글리코실화된 S 단백질의 밴드를 확인 할 수 있었고, 33 kD 및 36 kD에서 모노글리코실화된 프리-S2 및 디글리코실화된 프리-S2를 확인하였으며, 39 kD 및 42 kD에서 프리-S1 및 글리코실화된 프리-S1의 밴드를 확인하였다. 따라서, 상술한 정제 과정에 의해 rHBsAg이 정제되었음을 알 수 있다.
Ⅲ.면역적 분석
가.면역 블롯팅 분석
상기 실시예에서 정제된 rHBsAg 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동 한 후 전기 이동 방법으로 NC 막 (Schleicher & Shuell)에 흡착시켰다. 이어, 폴리클로날 토끼 항-HBsAg (Fitzgerald, 20-HR20)를 상기 NC 막에 반응시킨 후, 2차 항체로서 알칼린 포스파타제-접합 항-토끼 IgG (KPL, 075-1506)을 처리하고, 발색기질인 BCIP/NBT (Sigma)를 넣어 발색시켰다 (참조: 도 9). 분석 결과, 본 발명의 세포주에서 발현되는 재조합 단백질은 HBV의 pre-S1 및 pr-S2를 포함하는 S 표면 항원임을 확인 할 수 있었다.
나.ELISA 분석
본 발명의 세포주들에서 발현된 rHBsAg를 녹십자사의 GENEDIA HBsAg ELISA 3.0 키트를 이용하여 정량하였다. 50 nM MTX 농도에서 적응하여 최종 얻어진 형질전환 세포주 CHO D14-3-4는 2.5 ㎍/106세포/24시간의 발현량을 나타내었다 (참조: 도 10). 또한, MTX에 의한 유전자 증폭을 유도하지 않은 세포주, CHO D14가 가장 낮은 발현량을 나타내었고, 5 nM MTX로 증폭을 유도한 세포주도 CHO D14-3-4가 비교하여서는 발현량이 현저히 작았다.
다.서던 블롯 분석
본 발명에 의해 구축된 rHBsAg 유전자가 CHO 세포의 gDNA에 삽입되어 있는지를 확인하기 위하여, 서던 블롯 분석을 다음과 같이 실시하였고, 분석에는 DIG DNA labling & Detection 키트 (Roche, 1 093 657)를 이용하였다: 우선, CHO/dhfr-와 형질전환된 본 발명의 세포주 CHO D14-3-4의 gDNA를 분리 (Steffen, et al.,Proc. Nat. Acad. Sci., 76:4554-4558(1979)) 한 후 정량하였다. 이어, 분리된 gDNA 각각 5 ㎍을 제한 효소EcoRI으로 절단하고 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동 하였다. 그런 다음, DNA를 모세관 방법으로 나일론 막 (Amersham Phamacia Biotech)으로 전이시키고, 형성된 블롯을 DIG-표지 프로브 (HBsAg 유전자를 확인하기 위한 프로브)와 혼성화시킨 다음, 알칼린 포스파타제가 접합되어 있는 항-DIG 항체와 반응시키고, 발색기질인 NBT/BCIP를 넣어 발색시켰다 (참조: 도 11).
분석 결과 CHO/dhfr- 세포에서는 시그날이 전혀 검출되지 않았지만, CHO D14-3-4 세포주에서는 HBV 프리-S 및 S 표면 항원 유전자의 시그날이 강하게 나타났다. 이러한 결과로 CHO D14-3-4 세포주의 gDNA에는 dhfr 유전자 및 HBV 유전자가 삽입되어 있으며 유전자 증폭으로 HBV 표면 항원이 고발현되고 있음을 확인 할 수 있었다. 한편, CHO D14 세포주에서도 HBV 표면 항원에 대응하는 밴드가 관찰되었지만, 매우 약하게 나타났고, 가장 아래 쪽에 있는 비특이적 밴드이다.
본 발명은 dhfr-동물세포용 발현벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 HBV의표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 dhfr-동물세포용 발현벡터를 제공한다. 한편, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 dhfr-동물세포주를 제공한다. 또한, 본 발명은 HBV 표면 항원의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 종래의 방법보다 낮은 농도의 DHFR 저해제에 의해서도 다량의 HBV 표면 항원을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 조기 항체 생성능 및 항체 지속능이 우수한 HBV 표면 항원을 다량으로 얻을 수 있다.

Claims (16)

  1. 사이토메갈로바이러스의 인핸서 부위가 제거된 프로모터, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 dhfr 및 진핵세포에서 작동하는 복제원점을 포함하는 dhfr-동물세포용 발현벡터.
  2. 사이토메갈로바이러스의 인핸서 부위가 제거된 프로모터, 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 dhfr, 진핵세포에서 작동하는 복제원점, HBV의 표면 항원을 코딩하는 유전자 및 상기 HBV의 표면 항원을 코딩하는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터을 포함하는 HBV의 표면 항원을 대량으로 생산하기 위한 dhfr-동물세포용 발현벡터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 인핸서 부위가 제거된 프로모터는 서열 1에 기재된 프로모터 서열 중 1-428이 제거된 것을 특징으로 하는 dhfr-동물세포용 발현벡터.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 진핵세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 dhfr-동물세포용 발현벡터.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV 40 복제원점, pMB1 복제원점, Adeno 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 dhfr-동물세포용 발현벡터.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 진핵세포용 발현벡터는 도 5에 도시된 유전자 지도를 갖는 pCMVdE-dhfr인 것을 특징으로 하는 dhfr-동물세포용 발현벡터.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 HBV의 표면 항원을 코딩하는 유전자는 프리-S1 유전자, 프리-S2 유전자 및 S 항원 유전자로 구성된 것을 특징으로 하는 dhfr-동물세포용 발현벡터.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 HBV의 표면 항원을 대량으로 얻기 위한 진핵세포용 발현벡터는 도 6에 도시된 유전자 지도를 갖는 pCB2FD인 것을 특징으로 하는 dhfr-동물세포용 발현벡터 (KCTC 1025BP).
  9. 상기 제 6 항의 발현벡터에 의해 형질전환된 dhfr-동물 세포주.
  10. 상기 제 8 항의 발현벡터에 의해 형질전환된 dhfr-동물 세포주.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 동물 세포주는 CHO/dhfr-세포주인 것을 특징으로 하는 형질전환된 dhfr-동물 세포주 (KCTC 1025BP).
  12. 다음과 같은 단계를 포함하는 HBV 표면 항원의 제조방법:
    (a) 상기 제 11 항의 세포주를 디히드로폴레이트 환원효소의 저해제의 첨가하에서 배양하는 단계; 및
    (b) 배양물에서 HBV 표면 항원을 정제하는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 디히드로폴레이트 환원효소의 저해제는 아미노프테린 또는 메토트렉세이트인 것을 특징으로 하는 HBV 표면 항원의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 디히드로폴레이트 환원효소의 저해제는 메토트렉세이트인 것을 특징으로 하는 HBV 표면 항원의 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 메토트렉세이트의 농도는 5 - 100 nM인 것을 특징으로 하는 HBV 표면 항원의 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 메토트렉세이트의 농도는 30-60 nM인 것을 특징으로 하는 HBV 표면 항원의 제조방법.
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