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KR20020073582A - 변형된 면역원성 반응을 생성하는 단백질, 및 그의제조방법 및 사용방법 - Google Patents

변형된 면역원성 반응을 생성하는 단백질, 및 그의제조방법 및 사용방법 Download PDF

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KR20020073582A
KR20020073582A KR1020027010234A KR20027010234A KR20020073582A KR 20020073582 A KR20020073582 A KR 20020073582A KR 1020027010234 A KR1020027010234 A KR 1020027010234A KR 20027010234 A KR20027010234 A KR 20027010234A KR 20020073582 A KR20020073582 A KR 20020073582A
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KR
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protein
variant
polypeptide
cell
interest
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Withdrawn
Application number
KR1020027010234A
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English (en)
Inventor
에스텔데이비드에이
하딩피오나에이
Original Assignee
제넨코 인터내셔날 인코포레이티드
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Publication date
Application filed by 제넨코 인터내셔날 인코포레이티드 filed Critical 제넨코 인터내셔날 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 과다 및 과소 알레르기원성 조성물을 생성하기 위한 신규 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은, 에피토프를 인식하기 위해서, T-세포의 능력을 중화 또는 감소시켜, 단백질에 대한 개체의 감작을 예방하는 것을 포함한다. 또한, T-세포 에피토프는 변이형성되어, 증가된 면역원성 반응을 생성한다. 또한, 천연 단백질이 공급된다.

Description

변형된 면역원성 반응을 생성하는 단백질, 및 그의 제조방법 및 사용방법 {PROTEINS PRODUCING AN ALTERED IMMUNOGENIC RESPONSE AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME}
산업적, 약학적 및 상업적 용도로 사용되는 단백질의 유병력(有病力)이 증가되고 있다. 결과로서, 이러한 유병력으로 인한 증가된 노출은, 일부 사람들이 이러한 펩티드에 감작(感作)될 경우, 그 다음의 노출이 유해하고 심지어는 치명적일 수 있는 과도한 알레르기성 반응을 일으켜 유발되는 일부 안정성 위험을 발생시킨다. 예를 들어, 프로테아제는 일부 개체에서 위험성 과민증을 일으키는 것으로 알려져 있다. 결과로서, 예를 들어 세탁 세제, 화장료, 직물 처리제 등의 산업적 유용성, 및 예를 들어 세척 조건하에서 보다 효과적인 얼룩 제거력을 갖는 개선된 프로테아제를 제공하기 위해 당업계에서 수행된 과도한 연구에도 불구하고, 산업적인 프로테아제의 사용은 일부 사람들에게서 과민성 알레르기원성 반응을 일으키는 활성으로 인해 문제시 되어 왔다.
이러한 문제를 완화시키기 위해, 많은 연구가 수행되어 왔다. 프로테아제 사용의 잠재적인 면역원성을 줄이기 위해 연구된 전략으로서, 공기운반 프로테아제에 수반되는 먼지 입자 또는 에어로졸(aerosol)의 현장 농도를 조절하고 최소화하는 것에 의한 가능성 있는 접촉을 줄이는 개선된 생산방법, 프로테아제 산물로부터실질적으로 생산되는 먼지 또는 에어로졸의 양을 줄이는 개선된 과립화 방법, 및 최종 생산물에 가능성있는 알레르기원성 오염물의 양을 줄이기 위한 개선된 회수방법이 개발되었다. 그러나, 프로테아제 그 자체의 면역원성을 줄이기 위한 노력은 비교적 성공적이지 못했다. 또한, 과민성 개체에서 면역글로블린 E (IgE)에 의해 인식되는 프로테아제내 에피토프(epitope)를 마스크하기 위한 노력(PCR 공개번호 WO92/10755), 또는 문제시 되는 프로테아제에 중합체 또는 펩티드/단백질을 부착하는 것에 의해 항원 결정기의 특성을 확대시키거나 변화시키는 노력이 수행되었다.
적응성 면역반응이 과장된 또는 부적절한 형태로 발생하는 경우, 상기 반응을 일으키는 개체는 과민성(hypesensitive)이라고 불려진다. 과민증 반응은, 일반적으로 이로운 면역반응이 부적절하게 작용하여 때때로 면역반응 및 조직파괴가 유발된 결과이다. 과민증은 수많은 항원에 의해 자극될 수 있고; 과민증 반응의 유발은 개체마다 다양하다. 과민증은 일반적으로 항원에 대한 1차 접촉시에 그 자체로는 나타나지는 않지만, 통상적으로 그 다음의 접촉에서는 나타난다. 과민증의 한 형태는, 화분(花粉), 먼지성 진드기 또는 동물 비듬과 같은 무독성 외부 항원에 대한 IgE 반응의 유도에 의해 발생한다. IgE-감작성 마스트 세포(mast cell)에 의한 약리학적 매개자의 결과된 방출은, 천식 또는 비염과 같은 증상과 함께 급성 염증 반응을 생산한다.
그럼에도 불구하고, IgE 부위의 변형을 포함하는 전략은 일반적으로 초기 감작 반응의 유발을 방지하는데 성공하지 못할 것이다. 따라서, 상기 전략은 이후 발생하는 과민성 반응의 혹독성을 중화하거나 감소시킬 수는 있지만, 실질적으로감작되는 수 또는 사람을 감소시키지 못할 것이다. 예를 들어, 어떤 사람이 일부 항원에 과민성인 것으로 알려졌을 때, 이러한 상태를 다루는 일반적이고 단지 안전하기만한 방식은, 가능한한 완벽하게 과민성 사람을 항원으로부터 분리시키는 것이다. 실제로, 기타 다른 처치 방법들은 감작성 개체의 건강에 위험할 수 있다. 따라서, 감작성 개체에 대한 특정 단백질의 위험을 줄이는 것도 중요하지만, 1차 대면 장소에서 과민성 반응을 개시할 수 없는 단백질을 생산하는 것이 산업적인 목적에 훨씬 더 가치가 있다.
T-림프구 (T-세포)는 면역반응의 유도 및 조절, 및 면역학적 주효인자의 기능수행에 중요한 역할을 한다. 감염 제제 및 종양에 대한 특이 면역은 이들 세포에 의존한다고 알려져 있으며, 이들은 상처의 치료에도 기여한다고 생각되어진다. 반대로, 이러한 반응의 조절 실패는 자기 공격(auto-aggression)을 유발할 수 있다. 일반적으로, 항원은, 다양한 세포 표면 기작을 통해 T-세포에 의한 항원 인식에 적합한 방식으로 항원 또는 부분적 항원을 포획하고 표출하는 항원 제시 세포 (antigen presenting cell)의 형태로 T-세포에 제시된다. T-세포 표면 상의 수용체 (T-세포 수용체)에 의해 특이 에피토프가 인식되면, 상기 T-세포는 B-세포에 의한 항체의 생산을 유도하는 증식을 포함한 일련의 복합적 상호작용을 시작한다. T-세포 및 B-세포 모두가 상기 단백질 또는 펩티드 상에 존재하는 항원성 에피토프에 의해 활성화되지만, 상기 단핵세포에 의해 인식되는 실질적인 에피토프들은 일반적으로 동일하지 않다. 실제로, 면역학적 다양성의 생성을 개시하기 위해서 T-세포를 활성화시키는 에피토프는, 자주 종종, 이후의 면역학적 반응 과정에서의 B-세포에 의해 인식되는 에피토프와 동일하지 않다. 따라서, 과민증에 관하여, T-세포와 항원 사이의 특이 항원성 상호작용이 항원 노출에 대한 면역 반응의 개시에 주요 요소이지만, 이러한 상호작용의 특이체, 즉 인식되는 에피토프는 종종 이후 형성되는 전체 유발성 알레르기성 반응에 관련이 없다.
PCT 공개 제 WO 96/40791호는 출발물질로서 폴리알킬렌 옥시드를 사용하는, 감소된 알레르기원성을 갖는 폴리알킬렌 옥시드-폴리펩티드 콘쥬게이트의 제조방법을 개시한다.
PCT 공개 제 WO 97/30148호는 공유결합으로 커플링된 둘 이상의 폴리펩티드를 갖는 하나의 중합체성 담체 분자를 포함하는, 감소된 알레르기원성을 갖는 폴리펩티드 콘쥬게이트를 개시한다.
PCT 공개 제 WO 96/17929호는 폴리펩티드 모체에 1 내지 30개의 다분자 (polymolecule)를 콘쥬게이트하는 단계를 포함하는, 감소된 알레르기원성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법을 개시한다.
PCT 공개 제 WO 92/10755호는 동물에서 감소된 면역원성 반응을 유발하는 단백질 변이체의 생산 방법을 개시한다. 상기 적용에서, 목적 단백질인 일련의 프로테아제 및 그의 변이체는 래트(rat)를 면역시키기 위해 사용되었다. 그런 다음, 래트 유래의 혈청은, 목적 단백질 및 그의 변이체에 대한 면역된 혈청 내에서의 이미 생산되어 존재하는 폴리클로날 항체의 반응성을 측정하기 위해 사용되었다. 이러한 결과로부터, 시료 내 항체가 상기 단백질 및 그의 변이체에 상대적으로 다소의 반응성을 갖고 있어, 단백질내 변형 면역글로블린의 결합능을 중화시키거나 감소시킬 수 있는지에 대한 여부를 결정할 수 있었다. 상기 래트에서의 검사로부터, 127, 128, 129, 130, 131, 151, 136, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251 및 261에 대응하는 서브틸리신 309 잔기들의 임의 변형이 면역학적 잠재성의 변형을 유발할 수 있다는 결론에 도달하였다.
PCT 공개 제 WO 94/10191호는 모노머성 단백질 모체의 올리고머 형태를 포함하며, 상기 올리고머가 실질적으로 그의 활성을 유지하는, 낮은 알레르기원성 단백질을 개시한다.
일부 연구는 몇몇 단백질의 알레르기원성의 감소방법 및 일부 개체에서 알레르기성 반응을 유발하는 에피토프의 동정법을 제공하며, 상기 에피토프의 동정에 사용되는 검사법은 일반적으로 항원에 사전 노출된 혈청에서의 IgE 및 IgG 항체의 측정을 포함한다. 그러나, 일단 면역글로블린 반응이 개시되면, 감작은 이미 발생한다. 따라서, 1차 대면장소에서 감작을 유발하는 에피토프의 결정방법이 요구되는데, 이는 이러한 에피토프의 중화가 유의적으로 낮은 감작 발생 가능성을 유도하여, 초기 감작 가능성을 감소시킬 수 있기 때문이다. 또한, 강화된 면역원성 반응을 생성하는 단백질을 생산할 필요가 있고, 낮은 면역원성 반응을 생성하는 천연 단백질을 동정할 필요가 있다. 본 발명은 상기 요구 및 기타 다른 요구들을 충족한다.
도 1A, B1, B2 및 B3는바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신(BPN')의 DNA (서열번호 1) 및 아미노산 (서열번호 2) 서열, 및 상기 유전자의 부분적 제한효소 지도를 나타낸다.
도 2는바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스(서열번호 3) 및바실러스 렌투스(야생형) (서열번호 4) 유래의 서브틸리신 중 보존 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 3A 및 3B는바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스(BPN'),바실러스 서브틸리스,바실러스 리체니포르미스(서열번호 5) 및바실러스 렌투스유래의 서브틸리신형 프로테아제의 아미노산 서열 얼라인먼트(alignment)를 나타낸다. 기호 *는 서블틸리신 BPN'와 비교할 때의 특정 아미노산 잔기의 부재를 나타낸다).
도 4는바실러스 렌투스프로테아제 (GG36)에 대응하는 펩티드에 대한 16개의 말단 단핵 혈액 샘플의 첨가 T-세포 반응을 나타낸다. 펩티드 E05는바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스유래의 프로테아제내 170-173에 대응하는 잔기들을 함유하는 영역을 포함한다.
도 5는 인간 서브틸리신 분자에 대응하는 펩티드에 대한 10개의 말단 단핵 혈액 샘플의 첨가 T-세포 반응을 나타낸다. 펩티드 F10, F9, F8 및 F7 모두는, 도 3의 서열 얼라인먼트에서바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스유래의 프로테아제내 170-173에 대응하는 잔기들을 함유하는 영역에 대응하는 아미노산 서열 DQMD를 함유한다.
도 6A 및 6B/6C는바실러스 렌투스프로테아제 및 인간 서브틸리신의 서열로부터 각각 유도된 펩티드에 대응하는 아미노산 가닥을 나타낸다.
도 7은 인간 서브틸리신의 아미노산 서열 (서열번호 6)을 나타낸다.
도 8은 BPN'(바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스) 프로테아제, SAVINASE (바실러스 렌투스) 프로테아제 및 인간 서브틸리신(S2HSBT)의 아미노산 서열 얼라인먼트를 나타낸다.
도 9는바실러스 렌투스프로테아제에 대해 과민성인 것으로 알려진 개체로부터 채취한 샘플내의바실러스 렌투스프로테아제 유래의 펩티드에 대한 T-세포 반응을 나타낸다. 펩티드 E05는바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스로부터 유래한 프로테아제내 170-173에 대응하는 영역을 나타낸다.
도 10은바실러스 렌투스프로테아제에 대해 과민성인 것으로 알려진 개체로부터 채취한 샘플내의 E05바실러스 렌투스프로테아제 펩티드 세트에서의 다양한 알라닌 치환에 대한 T-세포 반응을 나타낸다.
도 11은 상기 프로테아제에 대해 과민성인 것으로 알려진 개체로부터 채취한 샘플내의 E05 프로테아제 펩티드(변형되지 않은 서열을 칭하는 T-세포 에피토프의 구현예)에서의 다양한 알라닌 치환에 대한 T-세포 반응을 나타낸다.
도 12는 인간 서브틸리신 분자에 대한 백분율 반응을 나타낸다.
도 13A는후미콜라 인솔렌스엔도글루코나아제(접근 번호: A23635)로부터 유래한 펩티드의 T-세포 반응을 나타낸다. 펩티드 A02 및 F06은후미콜라 인솔렌스엔도글루코나아제의 T-세포 에피토프의 구현예로서, 각각 70-84 및 37-51 잔기들에 대응하는 영역을 나타내며, 여기에서 전장 서열은 도 13B에 나타내었고, A02 및 F06은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타내었다.
도 14A는써모마이세스 라누기노사리파아제(접근번호: AAC08588, PID 번호: g2997733)로부터 유래한 펩티드에 대한 T-세포 반응을 나타낸다. 펩티드 B02 및 C06은 써모마이세스 라누기노사 리파아제의 T-세포 에피토프의 구현예로서, 각각 83-100 및 108-121 잔기들에 대응하는 영역을 나타내며, 여기에서 전장서열은 도 14B에 나타내었고, B02 및 C06은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타내었다.
도 15A는스트렙토마이세스 플리카투스에도-베타-N-아세틸글루코사미니다아제 (접근번호: P04067)로부터 유래한 펩티드에 대한 T-세포 반응을 나타낸다. 펩티드 C06은스트렙토마이세스 플리카투스엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다아제의T-세포 에피피토프의 구현예로서, 126-140 잔기에 대응하는 영역을 나타내며, 여기에서 전사서열은 도 15B에 나타내었고, C06은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타내었다.
도 16은 22 개체에 대해 축적된 BPN' 유래의 펩티드에 대한 T-세포 반응을 나타내며, 여기에서 바람직한 T-세포 에피토프의 서열이 나타내어졌다.
도 17은 22 개체에 대해 축적된 GG36 유래의 펩티드에 대한 T-세포 반응을 나타내며, 여기에서 T-세포 에피토프의 구현예의 서열이 나타내어졌고, GSISYPARYANAMAVGA 및 GAGLDIVAPGVNVQS가 바람직하다.
도 18은 본원에서 제공된 하이브리드 단백질의 구현예이며, 여기에서 N-말단은 N-말단 GG36 서열을 포함하고, C-말단은 C-말단 BPN' 서열을 포함하며, 이때 도 8에 나타내어진 서열과의 비교를 통해, 형성되는 하이브리드는 각 단백질의 바람직한 T-세포 에피토프가 제거되어 있음을 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명에 따르면, T-세포 에피토프의 동정방법이 제공된다. 또한, 비교적 중요하거나 잠재적인 T-세포 에피토프를 갖는, 또는 어떠한 T-세포 에피토프도 갖지 않은, 천연 단백질을 포함하는 단백질이 본 발명의 방법에 따라 동정될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 원하는 면역원성 반응을 생성하고, 천연 단백질 및 적당한 반응을 생성하도록 변이시킨 단백질을 포함한 단백질의 동정 및 생산을 가능하게 한다. 용어 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 때때로 상호 의미교환할 수 있는 것으로 본원에서 사용된다는 것을 이해할 수 있다. 여기에서, 펩티드는 단백질의 부분이며, 숙련된 당업자는 용어가 사용된 문맥에 따라 이를 이해할 수 있다.
하나의 구현예에 의하면, 본 발명은 하기와 같은 에피토프 및 비(非)에피토프를 동정하는 검사법을 제공한다: 분화된 수상 세포를 순수한 인간 CD4+및/또는 CD8+T-세포와 결합하고, 여기에서 목적 펩티드를 결합하는 방법. 더욱 구체적으로는, T-세포 에피토프가 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해서 인식되어진다: (a) 단일 혈액원으로부터 수상 세포 (dendrite cell)의 용액 및 순수한 CD4+및/또는 CD8+T-세포의 용액을 얻는 단계; (b) 상기 수상 세포의 용액 내에서 분화를 촉진시키는 단계; (c) 상기 분화된 수상 세포의 용액 및 상기 순수한 CD4+및/또는 CD8+T-세포의 용액을 상기 목적 폴리펩티드와 함께 결합하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서의 T-세포의 증식을 측정하는 단계.
하나의 구현예에 의하면, 분석될 목적 펩티드는 목적 폴리펩티드로부터 유래한다. 본 발명의 실시에 의하면, 본 발명은 개체 또는 개체 채취시료 내에서 감작을 유발할 수 있는 에피토프의 위치를 정확히 동정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 목적 폴리펩티드의 전부 또는 일부에 대응하는 일련의 펩티드 올리고머가 제조된다. 예를 들어, 단백질의 관련부위 또는 전부를 포함하도록 펩티드 라이브러리가 생성된다. 하나의 구현예에 의하면, 펩티드를 생산하는 방식은, 예를 들어 피검체 단백질의 아미노산 서열 1-10에 대응하는 1차 펩티드, 피검체 단백질의 아미노산 서열 4-14에 대응하는 2차 펩티드, 피검체 단백질의 아미노산 서열 7-17에 대응하는 3차 펩티드, 피검체 단백질의 아미노산 서열 10-20에 대응하는 4차 펩티드 등을, 전체 분자에 대응하는 대표 펩티드가 생성될 때까지 생성하는 펩티드 라이브러리로 중복부분을 도입하는 것이다. 본원에서 제공된 검사법으로 펩티드 각각을 개별적으로 분석하는 것에 의해, T-세포에 의해 인식되는 에피토프의 위치를 정확하게 동정하는 것이 가능하다. 상기 실시예에 의하면, 이웃되는 것들보다 더 큰 반응을 나타내는 하나의 특정 펩티드가 3개 내의 아미노산으로 에피토프 접극자(anchor)의 동정을 용이하게 할 것이다. 이러한 에피토프의 위치를 결정한 후에, 펩티드가 본래 단백질과는 다른 T-세포 반응을 생성할 때까지, 각각의 에피토프 내에서 아미노산을 변형할 수 있다. 또한, 상기 에피토프는, 표적 (예컨대, 감염 작용물 또는 종양 세포)에 대한 면역 반응을 자극하기 위해서, 본래 형태로 사용될 수 있다. 또한, 요구되는 정도로 높거나 낮은 T-세포 에피토프 잠재성을 갖고, 천연형태로 사용될 수 있는 단백질이 본원에 의해 동정될 수 있다.
본원에서 사용된 "항원 제시 세포"는 T-세포 표면의 수용체가 인식할 수 있도록 이들의 표면에 항원을 제시하는 면역계 세포를 의미한다. 항원 제시 세포의예로는, 수상 세포, 지상돌기세포(interdigitating cell), 활성화된 B-세포 및 대식세포가 있다.
본원에서 사용된 "T-세포 증식"은, 항원이 존재하거나 존재하지 않는 상황하에서, 항원 제시 세포와 함께 T-세포를 배양하는 동안에 생성되는 T-세포수를 의미한다.
본원에서 사용된 "기준 T-세포 증식"은, 펩티드 또는 단백질 항원의 부재하에, 항원 제시 세포의 노출에 대응하여 개체에서 일반적으로 보여지는 T-세포 증식을 의미한다. 본원의 목적을 위하여, 기준 T-세포 증식 수준은, 항원의 부재하에, 항원 제시 세포에 대응한 T-세포의 증식으로써, 각각의 개체에 대한 샘플마다 기준을 결정한다.
"T-세포 에피토프"는, 항원을 포함한 펩티드에 대한 면역원성 반응의 초기에, T-세포 수용체에 의해서 인식되는 펩티드 또는 단백질의 특징을 의미한다. T-세포에 의한 T-세포 에피토프의 인식은, 일반적으로 항원 제시 세포상에 제시되는 클래스 I 또는 클래스 II 대조직적합성 복합체(major histocompatability) 분자에 결합된 펩티드 항원 단편을, T-세포가 인식하는 메커니즘을 통해 이루어지는 것으로 여겨진다 [예를 들어, Moeller, G. ed., "Antigenic Requirements for Activation of MHC-Restricted Responses,"Immunological Review, Vol. 98, p.187 (Copenhagen; Munksgaard)(1987) 참조].
본원에서 사용된 "샘플"은 순수한, 즉 연구용 항원에 감작되지 않은 단핵세포를 포함한다.
본원에서 사용된 "상동체"는, 유사한 촉매 작용을 갖는 단백질 또는 효소, 구조 및/또는 목적 단백질로서의 용도를 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 목적 단백질 및 상동체는 진화적으로 (예컨대, 다른 종 유래의 동일 가능성 단백질) 반드시 연관되어 있지는 않다. 목적 단백질내 에피토프를 상동체 유래의 유사 분획 (segment)으로 대체하는 것이 변형의 파괴성을 줄일 수 있기 때문에, 목적 단백질과 유사한 3차 및/또는 1차 구조를 갖는 상동체를 찾는 것이 요구된다. 따라서, 밀접한 상동성을 갖는 효소는 가장 바람직한 에피토프 치환 재료를 제공할 것이다.또한, 가능하다면, 상기 단백질에 대한 인간 유사체를 찾는 것도 이롭다. 예를 들어, 박테리아 서브틸리신 중의 특정 에피토프를, 서브틸리신에 대한 인간 유사체 (즉, 인간 서브틸리신) 유래의 서열로 대체하는 것은, 박테리아 단백질의 매우 낮은 알레르기원성을 유도해야만 한다.
"유사" 서열은, 대체 아미노산 서열이 에피토프 또는 그 근방에서 목적 단백질내 아미노산 아미노산 서열과 유사한 기능, 3차 구조 및/또는 보존 잔기들을 나타낸다는 것을 확인하는 것에 의해서, 결정될 수 있다. 따라서, 에피토프 영역이 예를 들어 알파-나선구조 또는 베타-시트 구조를 함유한 경우, 대체 아미노산은 그러한 특이 구조를 유지하여야만 한다. 이어서, 본원에서 제공된 검사법에 따라 결정된 에피토프는, 목적 단백질의 면역학적 잠재성을 줄이거나 증대하기 위하여 변형된다. 바람직한 구현예에 의하면, 변형된 에피토프는, 샘플내 기준 T-세포 증식보다 3배 초과의 T-세포 증식 수준을 생성한다. 변형된 경우, 에피토프는 3배 미만의 기준 증식, 바람직하게는 2배 미만의 기준 증식, 가장 바람직하게는 샘플의 기준 증식 미만이거나 실질적으로 그와 동일한 기준 증식을 생성한다.
바람직하게는, 에피토프는 하기 방법 중의 하나에 의해 변형된다: (a) 에피토프의 아미노산 서열을, 목적 단백질에 대한 인간 상동체 유래의 유사 서열로 치환하는 방법; (b) 에피토프의 아미노산 서열을, T-세포의 인식으로 인한 면역원성 반응 (예컨대, 알레르기원성 반응)이 목적 단백질보다 더 낮게 생성되는 목적 단백질에 대한 비인간 유래의 유사 서열로 치환하는 방법; (c) 에피토프 아미노산 서열을, 상기 에피토프에 기인한 주요 3차 구조를 실질적으로 모방하지만 T-세포의 인식으로 인한 면역원성 반응(예컨대, 알레르기원성 반응)이 목적 단백질 보다 더 낮게 생성되는 서열로 치환하는 방법; 또는, (d) T-세포의 인식으로 인한 면역원성 반응(예컨대, 알레르기원성 반응)이 목적 단백질 보다 더 낮게 생성되는 서열로 치환하는 방법.
그러나, 숙련된 당업자는, 목적하는 결과에 따라 상기 에피토프가 다른 방식으로 변형될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 수 있다. 예를 들어, T-세포 백신을 목적으로 한다면, 에피토프의 아미노산 서열을, 증가된 MHC 결합 및/또는 T-세포 인식을 통해 펩티드에 대한 면역학적 반응을 증가시키는 아미노산으로 치환하는 것을 고려할 수 있다. 또 다른 예에 의하면, 자기 항원에 대한 자가면역 반응의 변형을 목적으로 한다면, 에피토프의 아미노산 서열을, 염증성 또는 기타 면역반응으로의 이동을 감소시키거나 유발시키는 아미노산 서열로 치환하는 것을 고려할 수 있다.
본 발명의 범위는, 예를 들어 T-세포 백신으로서 사용되는 펩티드, 또는 예를 들어 암, 감염성 질환 및 자가면역질환에 대한 치료제로서 사용되는 펩티드 또는 단백질과 같이, 면역원성 반응을 변형시키는 것을 목적으로 하는 모든 단백질로 확장된다. 당업계의 숙련된 기술자는 본 발명의 단백질 및 펩티드가 반드시 순수한 단백질 및 펩티드만이 아니라는 것을 이해할 것이다. 실제로, 본 발명의 하나의 구현예에 의하면, 본원에 기술된 검사법은 셔플 유전자(shuffled gene) 유래 단백질의 면역학적 반응을 결정하기 위해 사용된다. 유전자 셔플링 및 이러한 유전자의 발현에 대한 설명에 대해서는 문헌 [Stemmer,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA91: 10747 (1994); Patten,et al.,Current Opinion in Biotechnol. 8: 724(1997); Kuchner & Arnold,Trends Biotechnol.15: 523 (1997); Moore,et al.,J. Mol, Biol.272: 336 (1997); Zhao,et al.,Nature Biotechnol.16: 258 (1998); Giver,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95: 12809 (1998), Harayama,Trends Biotechnol.16: 76 (1998); Lin,et al.,Biotechnol., Prog.15: 467 (1999); 및 Sun,J. Comput.Biol. 6: 77 (1999)]을 참조할 수 있다. 상기 검사법은 셔플 유전자에 의해 코딩된 단백질의 면역학적 반응을 예상하기 위해 사용될 수 있다. 일단 검사되면, 상기 단백질은 변형되어, 상기 단백질에 대한 면역학적 반응을 변형시킬 수 있다.
상기한 단백질 및 펩티드 이외에도, 본 발명은 단백질의 알레르기원성을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 이러한 단백질은, 글루카나아제, 셀룰라아제, 엔도-글루코시다아제 Hs (엔도-H), 프로테아제, 카보히드라아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 키나아제, 포스파타아제, 아밀라아제 등을 포함하지만, 여기에 국한되지는 않는다. 인간과 같은 동물에서 천연 아미노산 서열의 알레르기원성을 줄이는 것 이외에도, 본 발명은 변이된 인간 단백질, 예를 들어 단백질의 기능 활성을 변화시키도록 변형된 단백질의 알레르기원성을 줄이는 것을 포함한다. 수많은 예에 의하면, 예를 들어, 활성을 증가시키기 위한 인간 단백질의 변이는 변이된 단백질에 대한 새로운 T-세포 에피토프의 혼입이 유발한다. 본 발명의 검사법은 새로운 T-세포 에피토프의 존재를 결정하고, 변이된 단백질의 알레르기원성을 감소시키는 치환 아미노산을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명이상기한 단백질들과 그외의 많은 것들을 포함할지라도, 단순화시키자면, 하기가 본 발명의 특히 바람직한 구현예, 및 프로테아제의 변형을 설명한다. 프로테아제는 단백질 또는 펩티드의 펩티드 결합을 절단하는 작용을 일반적으로 갖는 카르보닐 히드롤라아제이다. 본원에서 사용된 "프로테아제"는 천연 프로테아제 또는 재조합 프로테아제를 의미한다. 천연 프로테아제는 a-아미노아실펩티드 히드롤라아제, 펩티딜아미노산 히드롤라아제, 아실아미노 히드롤라아제, 세린 카르복시펩티다아제, 메탈로카르복시펩티다아제, 티올 프로테인나아제, 카르복시프로테인나아제 및 메탈로프로테인나아제를 포함한다. 세린, 메탈로, 티올 및 산 프로테아제, 및 엔도 및 엑소-프로테아제도 포함된다.
본원의 하나의 구현예에 의하면, 하이브리드 폴리펩티드가 제공된다. "하이브리드 폴리펩티드"는 바람직하게는 서로 상동체인 둘 이상의 다른 단백질로부터 가공된 단백질이다. 예를 들어, 바람직한 하이브리드 폴리펩티드는 한 단백질의 N-말단 및 그의 상동체 단백질의 C-말단을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에 의하면, 두 말단의 끝은 전장 활성 단백질에 대응하도록 조합될 수 있다. 바람직한 구현예에 의하면, 상동체들은 실직적으로 유사성을 공유하지만, 동일하지는 않은 T-세포 에피토프를 갖는다. 따라서, 하나의 구현예에 의하면, 예를 들어 C-말단내에 하나 이상의 T-세포 에피토프를 갖는 목적 폴리펩티드는, C-말단내 낮은 활성의 T-세포 에피토프 및 작은 T-세포 에피토프를 갖는, 또는 C-말단내에 T-세포 에피토프가 전혀 없는 상동체의 C-말단으로 대체된 C-말단을 가질 수 있다. 따라서, 당업자는, 상동체 중의 T-세포 에피토프를 동정할 수 있는 것에 의해서, 다른 여러 면역원성 반응을 생성할 수 있는 다양한 변이체를 형성할 수 있다. 또한, 내부 부위 및 하나 이상의 상동체가 본 발명의 변이체를 생성할 수 있음이 이해될 수 있다.
더욱 일반적으로는, 본원에서 제공된 변이체는, 전구체 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해서 전구체 아미노산 서열로부터 유도될 수 있다. 이러한 변형은, 전구체 효소의 아미노산 서열을 코딩하는 "전구체 DNA 서열" 중에서 이루어지는 것이 바람직하지만, 전구체 단백질의 조작에 의해서도 수행될 수 있다. 상기 전구체 DNA 서열의 상기 조작을 위한 적당한 방법은, 본원에 개시된 방법 및 당업계에 공지된 방법[참조: 예를 들어, EP 0328299, WO89/06279 및 본원에서 이미 언급한 미국특허 및 출원들]을 포함한다.
서브틸리신은, 일반적으로 단백질 또는 펩티드 중의 펩티드 결합을 절단하는 작용을 하는 박테리아 또는 균류의 프로테아제이다. 본원에서 사용된 "서브틸리신"은 천연 서브틸리신 또는 재조합 서브틸리신을 의미한다. 일련의 천연 서브틸리신은, 다양한 미생물 종들에 의해 생산되고 종종 분비되는 것으로 공지되어 있다. 이러한 일련의 구성원으로서의 아미노산 서열은 완전히 상동인 것은 아니다. 그러나, 이러한 일련의 서브틸리신은 동일하거나 유사한 형태의 단백질분해 활성을 나타낸다. 이러한 계열의 세린 프로테아제는, 키모트립신 관련 계열의 세린 프로테아제와는 다른 촉매 3련구조(catalytic triad)로 정의된 공통적인 아미노산 서열을 공유한다. 서브틸리신 및 키모트립신 관련 세린프로테아제는 모두 아스파테이트, 히스티딘 및 세린을 포함하는 촉매 3련구조를 갖는다. 서브틸리신 관련 프로테아제에서, 상기 아미노산 서열의 상대적 순서는, 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 판독하였을 때, 아스파테이트-히스티딘-세린이다. 그러나, 키모트립신 관련 프로테아제에서의 상대적 순서는, 히스티딘-아스파테이트-세린이다. 따라서, 본원의 서브틸리신은, 서브틸리신 관련 프로테아제의 촉매 3련구조를 갖는 세린 프로타아제에 관한 것이다. 예로는, 본원의 도 3에서 확인된 서브틸리신이 있지만, 여기에만 국한된 것은 아니다. 일반적으로 그리고 본 발명의 목적을 위해서, 프로테아제내 아미노산의 넘버링은 도 1에 나타내어진 성숙바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신 서열에 부여된 숫자에 대응한다.
"재조합", "재조합 서브틸리신" 또는 "재조합 프로테아제"는, 서브틸리신 또는 프로테아제를 코딩하는 DNA 서열이 천연 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 코딩하는 변이체 (또는 돌연변이체) DNA 서열을 생산하도록 변형된, 서브틸리신 또는 프로테아제에 관한 것이다. 이러한 변형체의 적당한 생산 방법, 및 본원에 개시된 것과 조합될 수 있는 방법은, USP 4.760,025 (RE 34,606), USP 5,204,015 및 USP 5,185,258에 개시된 것을 포함한다.
"비인간 서브틸리신" 및 이들을 코딩하는 DNA는, 수많은 원핵 및 진핵 유기체로부터 얻어질 수 있다. 원핵 유기체의 적당한 예로는,E.coli또는슈도모나스와 같은 그람 음성 유기체, 및마이크로코쿠스또는바실러스와 같은 그람 양성 유기체를 포함한다. 서브틸리신 및 이들의 유전자를 얻을 수 있는 진핵 유기체의 예로는사카로마이세스 세레비시애에와 같은 효모,아스페르질루스 sp.과 같은 균체를 포함한다.
"인간 서브틸리신"은 서브틸리신 형태의 촉매활성, 예를 들어 켁신(kexin)계열의 인간 유래 프로테아제를 포함하는 인간 기원의 단백질을 의미한다. 상기 단백질의 예는 도 7의 서열에 의해 나타내어진다. 또한, 펩티드 결합의 가수분해활성과 같은 펩티드의 필수활성을 유지하며, 마우스 또는 토끼와 같은 비인간 유래의 것들을 포함하는 본원에서 제공된 단백질의 유도체 또는 상동체는, 50% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 때때로는 95% 또는 98%의 목적 폴리펩티드와의 상동성을 갖는다. 하나의 구현예에 의하면, 목적 폴리펩티드는 도면에서 보는 바와 같다.
본원에서 사용된 아미노산 위치 숫자는 도 1에서 나타낸 성숙바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신에 부여된 것에 관한 것이다. 그러나, 본 발명은 상기 특정 서브틸리신의 돌연변이에 한정되지 않고,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신내 특정 동일 잔기와 "동등"한 위치에서의 아미노산 서열을 함유하는 전구체 프로테아제로 확장된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 전구체 프로테아제는바실러스 렌투스서브틸리신이며, 상기 나열한 것에 대응하는B. 렌투스내 동일 아미노산 잔기에서 치환, 결실 또는 삽입이 수행된다.
전구체 프로테아제의 잔기가 상동성 (즉, 1차 또는 3차 구조의 위치에 대응하는) 또는바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신내 특정 잔기 또는 그 부분과 유사한 (즉, 화학적으로 결합, 반응 또는 상화작용하는 기능성에서 동일성 또는 유사성을 갖는) 경우, 전구체 프로테아제의 잔기 (아미노산)는 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스 서브틸리신의 잔기와 동등하다. 본원에서 사용된 "대응하는"은 일반적으로 상기 펩티드 중의 유사성 위치에 관한 것이다.
1차구조에 대한 상동성을 확립하기 위해서, 전구체 프로테아제의 아미노산 서열은,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신 1차 서열, 특히 공지된 서열로서 서브틸리신 내에서 불변영역인 것으로 알려진 잔기들의 세트와 직접적으로 비교된다. 예를 들어, 본원의 도 2는B. 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신 및B. 렌투스서브틸리신 사이의 보존서열을 나타낸다. 보존서열을 얼라인(align)하고, 얼라인먼트를 유지하기 위해 (즉, 임의 결실 및 삽입을 통해 보존 서열이 제거되는 것을 피하기 위해) 요구되는 삽입 및 결실을 수행한 후,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신내 특정 아미노산과 동등한 잔기를 정의한다. 보존 잔기의 얼라인먼트는, 바람직하게는 상기 잔기를 100% 보존해야만 한다. 그러나, 보존잔기가 75% 이상 또는 50% 정도인 얼라인먼트도 또한 동등한 잔기로 정의하기에 적합하다. 촉매 3련구조인 Asp32/His64/Ser221의 보존은 유지되어야만 한다.
예를 들어,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스,바실러스 서브틸리스,바실러스 리체니포르미스(칼스버젠시스(carlsbergensis)) 및바실러스 렌투스로부터의 서브틸리신의 아미노산 서열을 얼라인함으로써, 아미노산 서열 간의 최대량의 상동성을 제공할 수 있다. 이러한 서열의 비교는, 수많은 보존서열이 각각의 서열 내에 함유되어 있다는 것을 보여준다. BPN' 및B. 렌투스사이의 보존 잔기가 도 2에서 확인되었다.
따라서, 이러한 보존서열은,바실러스 렌투스(PCT 공개 제 WO89/06279호, 1989. 7. 13. 공개) 및 본원의 바람직한 프로테아제 전구체 효소로부터의 서브틸리신과 같은 기타 서브틸리신, 또는 바람직한바실러스 렌투스서브틸리신과 매우 높은 상동성을 갖는 PB92로 언급되는 서브틸리신 (EP 0 328 299)에서바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스의 대응하는 동등 아미노산 잔기를 정의하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 서브틸리신의 일정한 아미노산 서열은, 최대 상동성의 보존 서열을 생성하기 위해,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스의 서열과 함께, 도 3A 및 도 3B에 얼라인되었다. 보여지는 바와 같이,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신과 비교하여,바실러스 렌투스의 서열내에 수많은 결실이 존재한다. 따라서, 예를 들어, 기타 서브틸리신에서바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신내 Val165에 대한 동등 아미노산은B. 렌투스및B. 리체니포르미스에 대한 이소루신이다.
따라서, 예를 들어, +170 위치에서의 아미노산은,B. 아밀롤리쿠에파시엔스및B. 리체니포르미스서브틸리신 둘 다에서 리신 (K)이며, 사비나세(Savinase)에서는 아르기닌 (R)이다. 그러나, 본 발명의 프로테아제 변이체의 하나의 구현예에 의하면,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신내 +170과 동등한 아미노산은 아스파트산 (D)로 치환된다. 본 발명에서, 모든 아미노산에 대한 약자 및 한 문자 코드는 문헌 [PatentIn User Manual (GenBank, Mountain View, Ca) 1990, p. 01]에서 확인된다.
또한, 상동 서열은 "서열 비교 알고리즘 (sequence comparison algorithm)"을 사용하는 것에 의해 결정될 수 있다. 비교용 서열의 최적의 얼라인먼트는, 예를 들어 스미스 및 워터맨의 국부적 상동성 알고리즘 [Smith & Waterman,Adv. Appl. Math.2: 482 (1981)]에 의해, 니들맨 및 운취의 상동성 얼라인머트 알고리즘 [Neddleman & Wunsch,J. Mol. Biol.48: 443 (1970)]에 의해, 피어슨 및 립맨의 유사성 검사법 [Pearson & Lipman,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA85: 2444 (1988)]에 의해, 상기 알고리즘의 컴퓨터 해석법[GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)에 의해, 또는 기시화 검사법에 의해 수행될 수 있다. 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예는, 문헌 [Altschul, et al.,J. Mol. Biol.215: 403-410 (1990)]에 기재된 BLAST 알고리즘이 있다. BLAST 수행용 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터[National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)]를 통해 공공적으로 이용될 수 있다. 상기 알고리즘은, 우선, 데이터 베이스 서열에서 동일한 길이를 갖는 단어와 얼라인하였을 때, 양성값의 임계(threshhold) 스코어(score) T와 대등하거나 이를 만족시키는 의뢰 서열내 길이 W의 짧은 단어를 동정하는 것에 의해서, 높은 스코어링 서열 쌍(HSPs)을 동정하는 것을 포함한다. 이러한 초기 이웃 단어 맞춤(hit)은 이를 함유하는 더 긴 HSPs를 찾는 시작점으로서 작용한다. 상기 단어 맞춤은, 누적 얼라인먼트 스코어가 증가될 수 있을 때까지 비교되는 각각의 두 서열에 따라 두 방향으로 확장된다. 상기 단어 맞춤의 확장은 다음에서 멈춘다: 누적 얼라인먼트 스코어가 최대 달성 값으로부터 수량 X 만큼 떨어졌을 때; 누적 스코어가 0 이하가 되었을 때; 또는, 각 서열의 종결점에 도달하였을 때. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 상기 얼라인먼트의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 단어 길이 (W) 11, BLOSUM 62 스코어링 매트릭스 [Henikoff & Henikoff, Proc. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989) 참조] 얼라인먼트 (B) 50, 예상값 (E) 10, M'5, N'-4및 상기 두 가닥의 비교를 디폴트(default)로서 사용한다.
이어서, BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석[Karlin & Altschul,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA90: 5873-5878 (1993) 참조]을 수행한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 측정은, 두 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 매치(match)가 우연하게 발생할 확률을 나타내는 최소 합 확률(smallest sum probability) (P(N))이다. 예를 들어, 검사 아미노산 서열을, 프로테아제 아미노산 서열과 같은 단백질과 비교하였을 때, 최소 합 확률이 0.1 미만, 바람직하게는 0.01 미만, 가장 바람직하게는 0.001 미만이라면, 상기 아미노산 서열은 프로테아제와 같은 단백질과 유사하다고 간주한다.
또한, "동등 잔기"는 X-선 결정학적으로 측정된 전구체 단백질의 3차구조 수준에서 상동성을 측정하는 것에 의해 정의될 수 있다. 동등 잔기는, 프로테아제 및바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신과 같은 전구체 단백질의 특정 아미노산 잔기 중 주요 사슬원자 둘 이상의 원자 배위(N 위의 N, CA 위의 CA, C 위의 C, 및 O 위의 O)가 얼라인먼트 후에 0.13㎚ 내, 바람직하게는 0.1㎚ 내에 있는 것으로 정의된다. 얼라인먼트는,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신에 해당하는 프로테아제와 같은 단백질내 비수소 단백질 원자의 원자배향이 최대 오버랩을 형성하도록 최적의 모델을 배향시키고 위치시킨 후에, 성취된다. 최적의 모델은, 이용할 수 있는 가장 높은 해상도에서 실험 회절 데이터에 대한 가장 낮은 R 인자를 제공하는 결정학적 모델이다.
바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신의 특정 잔기와 기능적으로 유사한 동등 잔기는,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신의 특정 잔기에 대해 정의된 또는 그에 기인하는 방식으로, 단백질 구조, 결합 기질 또는 촉매작용을 변화 및 변형시키거나 그에 도움을 주는 형태를 채택하게 할 수 있는, 프로테아제와 같은 전구체 단백질의 아미노산으로 정의된다. 또한, 이들은, 예를 들어 상기 잔기의 주사슬 원자가 상동성 위치의 점유를 기초로하는 동등성 임계치를 만족하지는 않지만 잔기 중 부사슬 원자 둘 이상의 원자 배치가바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신의 대응 부사슬 원자와 0.13㎚ 내에 놓여있는 확장에까지 유사성 위치를 점유하는 프로테아제(이의 3차구조는 X-선 결정학적으로 얻어짐) 등의 전구체 단백질의 전기들이다.바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신의 3차원적 구조의 배치는 EPO 공개 제 0 251 446호 (USP 5,182,204에 대응, 이의 개시내용은 참조문헌으로 본원에 통합됨)에 기재되어 있으며, 3차구조 수준에서의 동등잔기를 결정하기 위해서, 상기 개요한 바와 같이 사용될 수 있다.
치환, 삽입 또는 결실을 위해 동정된 일부 잔기들은, 보존된 잔기이며, 그외의 것들은 아니다. 보존되지 않은 잔기의 경우, 하나 이상의 아미노산의 대체는 천연에서 찾아질 수 있는 것에 대응하지 않는 아미노산을 갖는 변이체를 생산하는 치환에만 한정된다. 보존되는 잔기의 경우, 상기 대체는 천연 서열을 초래하지 말야만 한다. 본 발명의 변이체는 성숙한 형태의 단백질 변이체 뿐만이 아니라, 상기 단백질 변이체의 프로- 및 프리프로- 형태도 포함한다. 프리프로- 형태는 단백질 변이체의 발현, 분비 및 성숙화를 용이하게할 수 있기 때문에, 바림직게 제작된다.
"프로서열(prosequence)"은, 제거되었을 때 "성숙한" 형태의 단백질 모양을 형성하는 단백질의 성숙한 형태의 N-말단 부위에 결합된 아미노산의 서열에 관한 것이다. 수많은 단백질분해 효소가 번역 프로효소로서 천연에서 찾아지며, 후번역 단계의 부재하에 프로서열 형태로 발현된다. 프로테아제 변이체와 같은 단백질 변이체를 생성하는 바람직한 프로서열은, 기타 프로서열이 사용될 수 있을지라도, 바실러스아밀롤리쿠에파시엔스 서브틸리신의 추정된 프로서열이다.
"시그널 서열" 또는 "프리서열"은, 성숙 또는 프로 형태의 단백질의 분비에 관련된 단백질의 N-말단 부위 또는 프로단백질의 N-말단 부위에 결합된 아미노산의 임의 서열에 관한 것이다. 시그널 서열의 상기 정의는 기능성에 관한 것으로, 순수한 조건하에서 단백질의 분비를 일으키는데에 관련된 단백질 유전자의 N-말단 부부위에 의해 코딩되는 모든 아미노산 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명은 본원에서 정의된 단백질 변이체의 분비에 효과를 갖는 서열들을 이용한다. 하나의 가능한 시그널 서열은,바실러스 렌투스(ATCC 21536) 유래 서브틸리신의 시그널 서열의 잔여 잔기에 융합된바실러스 서브틸리스서브틸리신 유래 시그널 서열 중 처음 7개의 아미노산 서열을 포함한다.
"프리프로" 형태의 단백질 변이체는, 단백질의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 프로서열을 갖는 성숙한 형태의 단백질 및 상기 프로서열의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 "프리" 또는 "시그널" 서열로 이루어진다.
"발현 벡터"는 적당한 숙주 내에서 제작 DNA의 발현 효력을 나타낼 수 있고 적당한 대조 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 제작 DNA에 관한 것이다. 상기 대조서열은, 전사 효력을 나타내기 위한 프로모터, 상기 전사를 조절하기 위한 선택적 작동 유전자(operator) 서열, 적당한 mRNA 라이보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전자 및 번역 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지(phage) 입자 또는 간단하게는 가능성있는 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 복제될 수 있고, 숙주 게놈과는 독립적으로 기능하거나, 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합(integrate)된다. 현재 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이기 때문에, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호의미교환할 수 있는 것으로 사용되었다. 그러나, 본 발명은, 동등한 기능을 제공하는, 또는 당업계에 공지된 발현벡터의 다른 형태의 것도 포함하는 것으로 의도한다.
본 발명에서 사용된 "숙주세포"는, 바람직하게는 USP 4,760,025 (RE 34,606)에 개시된 방법에 의해 조작되고, 활성화된 엔도뉴클레아제를 효소적으로 분비할 수 없는 원핵 또는 진핵 숙주이다. 단백질 발현을 위한 바람직한 숙주세포는, 효소적으로 활성화된 중성 단백질 및 알칼리성 프로테아제(서브틸리신)가 결핍된바실러스균주 BG 2036이다. 균주 BG2036의 제작은 USP 5,264,366에 상세히 기재되어 있다. 단백질 발현을 위한 다른 숙주세포는바실러스 서브틸리스I168 [UPS 4,760,025(RE 34,606) 및 USP 5,264,366에 또한 개시되어 있으며, 이는 참조문헌으로 본원 명세서에 통합되어 있음] 뿐만 아니라,B. 리체니포르미스,B. 렌투스와 같은 임의의 적합한바실러스균주를 포함한다.
숙주 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제작된 벡터로 형질전환되거나 형질감염된다. 이러한 기술은 임의의 분자생물학 실제 지침서, 예를 들어 문헌 [Sambrooket al., Molecular Cloning - A laboratory Manual (2판) vol. 1-3, Cold Spring Harbor Publishing (1989)("Sambrook"); 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., (eds.), Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc., (1997 Supplement)("Ausubel")]에서 찾아질 수 있다. 상기 형질전환된 숙주세포는 단백질 변이체를 코딩하는 벡터를 복제할 수 있거나 목적 단백질 변이체를 발현할 수 있다. 프리- 또는 프리프로-형태의 단백질 변이체를 코딩하는 벡터의 경우, 발현될 때, 상기 변이체는 전형적으로 숙주세포로부터 숙주 세포 배지로 분비된다.
두 DNA 영역 사이의 관계를 설명할 때, "작동가능하게 연결된"은, 간단하게는, 이들이 서로 기능적으로 관련되어 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프리서열이 시그널로서 기능한다면, 즉 대부분 시그널 서열의 절단이 아마도 포함되어 성숙된 형태의 단백질 분비에 관여하게 된다면, 이는 펩티드에 작동가능하게 연결된 것이다. 프로모터이 서열의 전사를 조절한다면, 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이며; 라이보좀 결합 부위가 위치되어, 번역이 가능해진다면, 이는 코딩서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
천연 전구체 단백질을 코딩하는 유전자는 당업자에게 통상적으로 알려진 방법에 따라 얻어질 수 있다. 상기 방법은, 일반적으로 목적 단백질 영역을 코딩하는 추정 서열을 갖는 표지화된 프로브를 합성하는 단계; 상기 단백질을 발현하는 유기체로부터 게놈 라이브러리를 제작하는 단계; 및 상기 프로브를 하이브리드형성시키는 것에 의해서, 목적 유전자를 위한 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 그런 다음, 양성적으로 하이브리드형성된 클론은 매핑(mapping)되고, 서열결정된다.
"하이브리드형성"은 상기 DNA 단편 또는 유전자가 본원에 기재된 서열에 대응하여, 본 발명의 범위 내에 존재하지의 여부를 분석하기 위해 사용된다. 하이브리드 형성된 샘플은, 아가로스 겔(예를 들어, 0.8% 아가로스)을 통해 전기영동하여, DNA 단편의 분리를 크기별로 가시화시킬 수 있다. 전형적으로, DNA 단편은 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화될 수 있다. 겔을 증류수로 간단하게 헹군 후, 부드럽게 교반하면서 적당한 용액(예컨대, 0.25M NaOH)으로 탈퓨린화시킨 다음, 부드럽게 교반하면서 (예를 들어 0.4M NaOH를 이용하여) 30분동안 변성시킨다. 재형성(renaturation) 단계는, 부드럽게 교반하면서 1.5M NaCl, 1M Tris (pH 7.0)에 겔을 위치시키는 단계가 포함되어질 수 있다.
이어서, DNA는, 트랜스퍼 용액 (예컨대, 6 ×SSC (900mM NaCl, 90mM 트리소듐 시트레이트) 등)을 사용하여 적당한 양전하 막 (예컨대, 최대 강도 니트란 플러스 막(Maximum Strenghth Nytran Plus membrane; Schleicher & Schuell, Keene, N.H.))으로 트랜스퍼되어야만 한다. 일단 트랜스퍼가 완료된다면, 일반적으로 약 2시간 후에, 막을, 예를 들어 2 ×SSC (2 ×SSC = 300mM NaCl, 30mM 트리소듐 시트레이트)로 헹구고, 상온에서 공기건조한다. 그런 다음, 막은 적당한 예비 하이브리드형성 용액(예컨대, 100㎖마다 다음을 함유하는 수용액: 20-50㎖의 포름아미드,25㎖의 20 ×SSPE(1 ×SSPE = 0.18M NaCl, 1mM EDTA, 10mM NaH2PO4, pH 7.7), 0.25㎖의 20% SDS, 및 1㎖의 10㎎/㎖의 쉬어링된 청어(sheared herring) 또는 연어 정자(salmon sperm) DNA)를 이용하여, (약 2시간 이상 동안) 예비 하이브리드형성을 해야만 한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 예비 하이브리드형성 용액내 포름아미드의 양은 통상적인 방법에 따라 행해지는 반응의 특성에 의존하여 다양하다. 낮은 양의 포름아미드는, 더 많은 양의 포름아미드를 사용하는 동일방법보다, 하이브리드형성 분자를 동정하는 측면에서, 더욱 완벽한 하이브리드형성을 유도할 수 있다. 반면, 강력한 하이브리드형성 밴드는, 더욱 많은 포름아미드를 사용하는 것에 의해, 더욱 쉽게 가시적으로 동정될 수 있다.
목적 DNA 서열에 상보적이거나 거의 상보적이며, 100 내지 1000bp 길이를 갖는 DNA 프로브는 (예를 들어, 제조자의 지시에 따른 메가프라임 표지화 시스템(Megaprime labeling system)을 사용하여) 표지화시켜, DNA 내에32P를 통합시킨다. 표지화된 프로브는 95℃에서 5분동안 변성시킨 다음, 즉시 막 및 예비 하이브리드형성 용액에 첨가한다. 하이브리드형성 반응이 적당한 조건하에 적당한 시간동안 (예컨대, 부드럽게 교반 또는 회전하면서 37℃에서 18시간 동안) 수행해야만 한다. 막을 헹구고 (예컨대, 2 ×SSC/0.3% SDS), 그런 다음 부드럽게 교반하면서 적당한 세척 용액으로 세척한다. 목적하는 부착성(stringency)이 막 (필터)이 세척되는 조건에 반영될 것이다.
구체적으로는, 상기 반응의 부착성 (즉, 성공적인 하이브리드형성을 위해 요구되는 상동성 정도)은, 하이브리드형성 후에 수행되는 여과에 대한 세척 조건에 따라 다양할 것이다. 본원에서 정의된 "낮은-부착성" 조건은 0.2 ×SSC/0.1% SDS의 용액을 이용하여 20℃에서 15분동안 필터를 세척하는 것을 포함한다. "높은 부착성" 조건은 0.2 ×SSC/0.1% SDS의 용액을 이용하여 37℃에서 30분동안 2번 필터를 세척하는 것을 포함한다.
세척후, 막은 건조되고, 결합된 프로브가 검출된다.32P 또는 다른 방사성 동위원소가 표식제로서 사용된다면, 결합된 프로브는 방사선 사진에 의해서 검출될 수 있다. 기타 프로브의 가시화 기술은 당업자에게 통상적으로 알려져 있다. 결합된 프로브의 검출은 핵산서열이 목적하는 상동성을 갖으며, 본 발명의 범위내에 포함된다는 것을 나타낸다.
이어서, 클로닝된 단백질은 단백질 발현을 위해 형질전환하는데 사용된다. 이어서, 단백질 유전자는 높은 복제수(copy number)를 갖는 플라스미드에 결찰된다. 상기 플라스미드는, 플라스미드 복제에 요구되는 것으로 통상적으로 알려진 하기 요소를 함유하고 있다는 감지(感知)하에, 숙주세포에서 복제된다: 해당유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터(숙주세포에 의해 인식(예를 들어, 전사)된다면, 유전자 자신의 상동성 프로모터가 공급될 수 있음); 전사말단; 단백질 유전자의 내인성 종결 영역에 의해 공급되거나 외생적인 폴리아데닐화 영역(일부 진핵 세포에서 단백질 유전자로부터 숙주세포에 의해 전사된 mRNA의 안정성을 위해 요구됨); 및 요구된다면, 항생제 함유 배지에서의 성장에 의해 플라스미드 감염된 숙주세포의 지속적 배양 유지를 가능하게 하는 항생제 내성 유전자와 같은 선별(selection) 유전자. 높은 복제수를 갖는 플라스미드는, 또한 숙주세포에 대한 복제 시작점(origin of replication)을 함유함으로써, 크로모좀의 제한 없이, 세포질 내에서 많은 수의 플라스미드를 발생케할 수 있다. 그러나, 단백질 유전자의 다수의 복제수를 숙주 게놈으로 통합시키는 것도 본원 범위내이다. 이는, 특히 상동성 재조합(homologous recombination) 되기 쉬운 원핵 및 진핵 유기체에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
하나의 구현예에 의하면, 유전자는B. 렌투스또는B. 아밀롤리쿠에파시엔스의 것과 같은 천연 유전자일 수 있다. 또한, 천연 또는 돌연변이 전구체 단백질을 코딩하는 합성 유전자가 생산될 수 있다. 상기 접근법에서, 전구체 단백질의 DNA 및/또는 아미노산 서열이 결정된다. 그런 다음, 다수의 오버랩(overlapping) 합성 단일가닥 DNA 단편이 합성되고, 이때 하이브리드형성 및 결찰(ligation)은 전구체 단백질을 코딩하는 합성 DNA를 생성한다. 합성 유전자 제작의 예는 USP 5,204,015의 실시예 3에 기재되어 있으며, 상기 개시물은 참고문헌으로서 본원에 통합된다.
일단 천연 또는 합성 전구체 단백질 유전자가 클로닝되었다면, 수많은 변형이 수행되어, 천연 전구체 단백질의 합성 이상으로 유전자의 용도를 강화시킨다. USP 4,760,025 (RE 34,606) 및 EPO 공개 제 0 251 446호, 및 본원에 기재된 '단백질 변이체의 생산'에 개시된 바와 같이, 상기 변형은 재조합 단백질의 생산을 포함한다.
다른 방법이 사용될 수 있을지라도, 하기의 카세트 돌연변이형성법(cassettemutagenesis method)이 본 발명의 단백질 변이체의 제작을 용이하게 수행하기 위해 사용될 수 있다. 우선, 단백질을 코딩하는 천연유전자를 얻고, 전체적으로 또는 부분적으로 서열결정한다. 이어서, 코딩된 효소내 하나 이상의 아미노산 중에 돌연변이 (결실, 삽입 또는 치환)를 만들고자하는 포인트를 스캔한다. 상기 포인트에 인접한 서열에서는, 발현될 때 다양한 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 풀(pool)로 짧은 유전자 분획을 대체하기 위한 제한효소 부위의 존재를 확인한다. 상기 제한효소 부위는, 상기 유전자 분획의 대체를 용이하게 수행하기 위해서, 바람직하게는 상기 단백질 유전자 내의 단일 부위이다. 그러나, 단백질 유전자내에 너무 과다하지 않은 임의의 적절한 제한효소 부위가 사용될 수 있고, 제한효소 절단에 의해 형성된 유전자 단편이 적당한 서열 내에서 재조립(reassemble)되도록 제공될 수 있다. 선택된 포인트로부터 적절한 거리 (10 내지 15 뉴클레오타이드) 내의 위치에 제한효소 부위가 존재하지 않는다면, 판독 프레임(reading frame) 및 코딩된 아미노산 서열이 최종 제작물 내에서 변화되지 않는 방식으로, 유전자 내에서 뉴클레오타이드 치환시킴으로써 제한효소 부위를 생성시킬 수 있다. 목적하는 서열과 일치하도록 서열을 변화시키기 위해서, 유전자의 돌연변이는 통상적으로 공지된 방법에 따라, M13 프라이머 확장을 수반할 수 있다. 적당한 인접영역을 위치시키고 두 개의 적절한 제한효소 부위 서열을 나타내도록 요구되는 변화를 수행하는 작업은, 유전자 코드의 중복성(redundancy), 유전자의 제한효소 지도 및 수많은 다른 제한효소에 의해서 통상적으로 수행된다. 적절한 인접 제한효소 부위가 이용될 수 있다면, 상기 방법은 상기 부위를 함유하지 않은 인접 영역과 관련해서만 필요적으로 이용될 수 있다는 것을 인식해야만 한다.
천연 DNA 또는 합성 DNA가 클로닝된다면, 변이될 위치에 인접한 제한효소 부위는 동질의 제한효소를 이용하여 절단하고, 복수개의 말단 종결-상보성(end termini-complementary) 올리고뉴클레오타이드 카세트가 상기 유전자에 결찰된다. 동일한 제한효소 부위를 갖기 위해서, 모든 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있고, 제한효소 부위를 창출하기 위해 합성 연결자(linker)를 전혀 필요로하지 않기 때문에, 돌연변이형성은 상기 방법에 의해 단순화된다.
본 발명의 하나의 특성에 의하면, 알레르기원성 잠재성을 감소시키는 것은 효소의 더욱 안전한 사용을 가능하게 하기 때문에, 본 목적은 전구체 단백질과 비교하여 변형된 알레르기원성 잠재성을 갖는 변이체 단백질을 확보하는 것이다. 본 발명은 더욱 낮은 알레르기원성 잠재성에 유용하며, 본원에서 특정시킨 돌연변이는 당업계에 공지된 돌연변이와 조합하여 이용함으로써, 전구체와 비교하여 개질된 열안정성 및/또는 개질된 기질특이성, 변형된 활성 또는 개질된 알칼리 안정성을 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명은, T-세포 증식을 유도하기 위해서,바실러스 렌투스내 잔기 위치 170-173을 포함하는 T-세포 에피토프의 능력을 변형시키는 것에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 특히 바람직한 구현예는 R170D, Y171Q 및/또는 N173D 중 하나 또는 모두에 대해 변형시키는 것을 포함한다. 유사하게, 상기에서 상세히 기술한 바와 같이, 임의의 단백질내 대응 잔기의 변형은, 단백질내 주요 T-세포 에피토프의 중화를 초래한다고 여겨진다. 따라서, 본원에서 개시한 아미노산 잔기 170-173에 대응하는 영역내 돌연변이와 조합하여, 효소의 전체적 안정성 및/또는 단백질 분해 활성을 변경시키기 위하여 본 발명의 변이체 단백질의 알레르기원성 잠재성을 감소시키는 것에 더하여,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리스의 V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R 및 T260A에 대응하는 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 선택적으로 조합한 N76D/S103A/V104I/G159D에 대응하는 위치에서의 치환이 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에서 제공된 치환은, 생성된 돌연변이 효소의 강화된 안정성 및/또는 강화된 활성을 생성하기 위해서,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리스의 V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R 및 T260A에 대응하는 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 선택적으로 조합한 S103A/V104I/G159D의 돌연변이와 조합하여, 동등 위치 +76에서의바실러스 렌투스서브틸리신내 아스파라긴 (N)의 아스파테이트 (D)로의 돌연변이가 조합될 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예는, 하기 위치에 대응하는 치환 잔기의 특정 조합을 포함한다:바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신의
N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R; 및
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A.
상기 치환이 임의의바실러스단백질에서 만들어질 수 있을지라도, 바람직하게는 상기 치환은바실러스 렌투스(재조합 또는 순수한 형태)에서 만들어진다.
변이체 단백질을 이용하여 얻어지는 스크리닝 결과에 기초하여,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신에 대해 상기에서 언급한 상기 돌여변이는, 단백질분해 활성, 상기 효소의 성능 및/또는 안정성, 및 상기 변이체 효소의 세정 또는 세척 성능에서 중요하다.
본 발명의 수많은 단백질 변이체는 다양한 세제 조성물을 제형화하는데 유용하다. 본 발명의 단백질 돌연변이를 포함하는 조성물에 유용한 적당한 계면활성제로 수많은 공지된 화합물이 있다. 이들은, Barry J. Anderspon의 USP 4,404,128, Jiri Flora 등의 USP 4,261,868에 기재된 바와 같이, 비이온성, 음이온성, 양이온성, 음이온성 또는 양성이온성(zwitterionic) 세제를 포함한다. 적합한 세제 제형으로는, USP 5,204,015의 실시예 7에 기재된 것이 있다 (상기를 참고문헌으로서 본원에 통합함). 당업계에서는, 세정 조성물로서 사용될 수 있는 다른 제형들에 대해서 잘 알려져 있다. 전형적인 세정 조성물 이외에도, 본 발명의 단백질 변이체는 순수한 또는 야생형 단백질이 사용되는 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다는 것이 용이하게 이해될 수 있다. 따라서, 상기 변이체들은, 예를 들어 바 (bar) 또는 액체 비누 제품, 접시 케어 제형, 콘택트 렌즈 세정 용액 또는 제품, 펩티드 가수분해제, 쓰레기 처리제, 직물 제품에 사용될 수 있고, 및 단백질 제품내 융합-절단 효소 등으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 변이체는, 감소된 알레르기원성 이외에도, (전구체 단백질과 비교하여) 세제 조성물내에서 강화된 성능을 포함할 수있다. 본원에서 사용된 '세제 내에서 강화된 성능'은, 표준 세척 사이클 후의 통상적인 평가에 의해 측정되었을 때, 목초 및 혈액과 같은 일정 효소 민감성 얼룩의 증가된 세정으로 정의된다.
단백질, 특히 본 발명의 프로테아제는 약 0.01 내지 약 5중량%(바람직하게는 1중량% 내지 5중량%)의 수준에서 6.5 내지 12.0의 pH를 갖는 공지된 분말 및 액체 세제로 제형화될 수 있다. 이러한 세제 세정 조성물은, 또한 공지된 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 또는 엔도글리코시다아제 뿐만 아니라, 비누 혼화제 및 안정화제도 포함할 수 있다.
단백질, 특히 종래의 세정 조성물을 위한 본 발명의 프로테아제의 첨가는 임의의 특정 용도의 제한을 형성하지 않는다. 다시 말하면, 상기한 범위내에 pH가 존재하고, 온도가 기술된 단백질의 변성온도보다 낮다면, 세제에 적합한 임의의 온도 및 pH가 본 조성물에 적합하다. 또한, 본 발명의 단백질은 세제 없는 세정 조성물에 사용될 수 있고, 다시말하면 그 자체로 또는 비누 혼화제 및 안정화제와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 변이체 단백질은, 예를 들어 US 5,612,055; US 5,314,692; 및 US 5,147,642에 기재된 바와 같이, 동물 사료 첨가제의 일부분과 같이 동물 사료에 혼합될 수 있다.
본 발명의 하나의 특성은, 본 발명의 변이체 단백질을 포함하는 직물 처리용 조성물이다. 본 조성물은, 예를 들어 RD 216,034; EP 134,267; US 4,533,359; 및 EP 344,259에 기재된 바와 같이, 실크 또는 울(wool)을 처리하기 위해 사용될 수있다.
본 변이체는, 당업계에 통상적으로 공지된 방법에 따라, 단백질 분해 활성을 위해 스크린될 수 있다. 바람직한 프로테아제 변이체는, 하기에 대응하는 위치에서의 다수 치환체를 포함한다:
바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스서브틸리신에서,
N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R; 및
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A.
본 발명의 단백질은, 이들의 전구체 단백질과 비교하여, 변형된 면역원성을 나타낸다. 바람직한 구현예에 의하면, 본 단백질은 감소된 면역원성을 나타낸다. 다른 구현예에 의하면, 본 단백질은 증가된 면역원성을 나타낸다. 면역원성의 증가는, B-세포 또는 채액(humoral) 면역학적 반응의 증가에 의해, T-세포 또는 세포 면역학적 반응의 증가에 의해, 또는 B 세포 및 T-세포 모두의 면역학적 반응의 증가에 의해 명백해진다. 당업자는, 본 발명의 단백질의 사용이 크게는 단백질의 면역학적 특성에 따라 결정된다는 것을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 감소된 면역원성을 나타내는 효소는 세정 조성물에 사용될 수 있다. "세정 조성물"은, 직물, 접시, 콘택트 렌즈, 기타 고체 물질, 헤어 (샴푸), 피부 (비누 및크림) 등과 같은 기질로부터 원치않는 화합물을 제거하기 위해 사용될 수 있는 조성물이다.
감소된 알레르기원성을 갖는 단백질, 특히 셀룰라아제, 프로테아제 및 아밀라아제는, 또한 직물 처리에 사용될 수 있다. "직물 처리"는 직물 또는 의류로 역어지고(woven), 펠트되고(felted), 짜질(knitted) 수 있는 직물, 개별적인 실 및 섬유를 효과적으로 목적하는 특성을 갖도록 처리되는 방법을 포함한다. 상기 목적하는 특성의 예로는, "스톤워싱(stone-washing)", 디필링(depilling), 탈모 (dehairing), 소형화(desizing), 연질화(softening) 및 당업계에 통상적으로 알려진 기타 직물처리가 있다.
개체에서 면역반응을 일으키는 치료제 단백질은 또한 본 발명에 포함된다. 특히, 단백질의 내인성 생산이 부족한 개체는 중화항체를 형성하기 쉽고, 치료가 실패하기 쉽다. 또한, 단백질의 변형을 통해, 잠재적으로 면역원성이 되는 신규 에피토프를 도입할 수 있다. 본 발명의 방법은, 중화 반응을 방지하기 위해서, 예를 들어 인간 인자 Ⅷ 내의 에피토프를 동정하고 변형하는데 사용될 수 있다.
약학 조성물이, 과립, 정제, 환약, 좌약, 캡슐, 현탁액, 연고, 로션 등과 같은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 약학 등급의 유기 또는 무기 담체 및/또는 경구 및 국부적 사용을 위해 적합한 희석제가 치료 활성 화합물을 함유하는 조성물을 만들기 위해 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 희석제는 수용성 배지, 식물 및 동물 오일 및 지방을 포함한다. 안정화제, 습윤 및 에멀젼화제, 삼투압의 다양화를 위한 염 또는 적당한 pH 값을 유지하기 위한 완충액, 및 피부 침투 강화제가 보조제로서 사용될 수 있다. 약학 조성물은 또한 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 혈청 알부민과 같은 담체 단백질; 완충액; 미세 결정질 셀룰로오스, 락토오스, 옥수수 및 기타 전분과 같은 충전제; 접합제; 감미료 및 기타 향료; 착색제; 및 폴리에틸렌 글리콜. 첨가제는 당업계에 공지되어 있으며, 다양한 제형으로 사용된다.
본원과 관련된 모든 공개물 및 특허는 참고문헌으로서 전체적으로 본원에 통합된다. 하기는 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 이에 의해 특허청구범위의 범위가 한정되지는 않는다.
발명의 개요
본 발명은 목적 면역원성 반응을 생성하는 단백질, 그러한 단백질의 동정 및 제조 방법, 및 상기 단백질의 이용방법을 제공한다. 예를 들어, 하기 상세한 설명으로부터 명백해지는 바와 같이, 본원에서 제공되는 방법 및 조성물은 과다- 및 과소- 알레르기원성 조성물을 형성하는데 유용하다. 본원에서 사용된 '과다' 및 '과소'는, 조성물이 본 발명의 단백질을 함유하지 않은 동일 조성물 보다 각각 더 높거나 더 낮은 면역원성 반응을 생성하는 것을 의미한다. 상기 조성물은 세정 조성물, 직물 처리제, 콘택트 렌즈 세정 용액 또는 제품, 펩티드 가수분해 제품, 쓰레기 처리 제품, 및 피부, 헤어 및 경구 케어용을 포함한 화장료 제형, 혈액 응고 제거 제품과 같은 약학물, 및 백신을 포함한 치료제 및 효소와 같은 연구 제품을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 특징에 의하면, 목적 폴리펩티드가 선택되고 본원에서 제공된다. 목적 폴리펩티드는 바람직하게는 T-세포 에피토프를 갖는 것이며, 하기한 바와 같이 다양하다. 그러나, 목적 폴리펩티드는 또한 천연 특성에 기초하여 선택될 수 있고, 변형되지 않을 수도 있다. 또한, 목적 폴리펩티드는 T-세포 에피토프를 가지지 않지만, T-세포 에피토프를 가지기 위해서 변형된 것을 선택할 수 있다.
본 발명의 하나의 특징에 의하면, T-세포 에피토프를 포함하는 목적 폴리펩티드의 변이체가 본원에서 제공된다. 변이체는, 변이체 및 폴리펩티드가 개체 내에서 다른 면역원성 반응을 생성하도록 변형된 T-세포 에피토프를 갖는 것에 의해 목적 폴리펩티드와는 상이하다. 상기 목적 폴리펩티드 보다 더 많은 또는 더 적은 면역원성 반응을 생성하기 위해, 변이체가 제조될 수 있으며, 선택될 수 있다.
목적 폴리펩티드는 임의의 목적 폴리 펩티드일 수 있다. 하나의 특징에 의하면, 상기 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 인자, 백신 및 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에 의하면, 목적 폴리펩티드는 상기 개체에 대해서 내인성으로서 상기 개체에 의해 인식되지 않고, 또는 "그 자체"로서 인식되지도 않는다. 본원에서 나타낸 목적 폴리펩티드는 효소이다. 하나의 구현예에 의하면, 효소는 리파아제, 셀룰라아제, 엔도-글루코시다아제 H, 프로테아제, 카보히드라아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 키나아제 및 포스파타아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에 의하면, 목적 폴리펩티드 및 상기 목적 폴리펩티드의 변이체는 각각 일부분 이상의 동일 활성을 포함한다. 예를 들어, 프로테아제의 변이체가 제공된다면, 상기 변이체는 변형된 면역원성 반응을 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 검출가능한, 바람직하게는 비교가능한 프로테아제 활성을 유지할 수 있다.
목적 폴리펩티드의 변이체가 제공되는 경우, T-세포 에피토프는, 아미노산 치환, 결실, 첨가 및 이의 조합에 의한 것을 포함한 수많은 방식으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, T-세포 에피트프는 아미노산 치환을 갖는 것에 의해서 변형된다. 본원의 하나의 구현예에 의하면, 아미노산 치환은 목적 폴리펩티드 상동체의 대응 아미노산으로 만들어질 수 있으며, 이때 상기 상동체는 목적 폴리펩티드와 대응되는 위치에서 동일한 T-세포 에피토프를 포함하지 않는다. 하나의 특징에 의하면, 하나 이상의 T-세포 에피토프를 포함하는 목적 폴리펩티드의 말단 부위는 목적 폴리펩티드 상동체의 대응 말단 부위로 대체되며, 이때 상기 대체는 상기 다른 면역원성 반응을 생성한다. 본원에서 제공되는 또 다른 구현예에 의하면, 요구되는 면여성 반응을 생성하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 본원에서 제공된다. 또한, 본 발명은 본원에서 제공되는 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 숙주세포를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 및 그의 변이체가 동정된다면, 실질적으로 상기 폴리펩티드 및 변이체의 상동체 서열 또는 상기 폴리펩티드 및 변이체와 하이브리드형성하는 서열들이 동정될 수 있으며, 이에 대해서도 본원에서 제공된다. 또한, 상동성은 하기 정의되었고, 유사성 또는 동일성으로 언급될 수 있으며, 바람직하게는 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 상동성 서열은 본원에서 제공된 폴리펩티드 및 변이체의 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 아미노산 서열 또는 헥산이다.
본 발명의 또 다른 특징은, 단백질에 의해 생산되는 면역원성 반응의 결정방법이다. 하나의 구현예에 의하면, 상기 방법은, (a) 단일 혈액원으로부터 수상 세포 (dendritic cell)의 용액 및 순수한(naive) CD4+및/또는 CD8+T-세포의 용액을 얻는 단계; (b) 상기 수상 세포의 용액 내에서 분화를 촉진시키는 단계; (c) 상기 분화된 수상 세포 용액 및 상기 순수한 CD4+및/또는 CD8+T-세포의 용액을 상기 단백질과 함께 결합하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서의 T-세포 증식을 측정하는 단계를 포함한다.
또한, 단백질에 의해 생성되는 면역원성 반응을 측정하는 방법은, 단백질의 비교 면역원성 반응을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 특징에 의하면, 단백질의 면역원성 반응을 결정하는 방법은 또한 하나 이상의 단백질의 면역원성 반응을 비교하는 것을 포함한다. 단백질은 서로간의 상동체, 동일 단백질의 변이체, 동일 단백질의 다른 형태(예컨대, 다른 프로테아제), 또는 동일 단백질의 다른 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은, 다음 단계를 포함하는 목적 폴리펩티드의 면역원성을 변형하는 방법을 제공한다: 상기 폴리펩티드의 면역원성을 결정하는 단계; 상기 폴리펩티드내 T-세포 에피토프를 동정하는 단계; 및 상기 폴리펩티드의 면역원성을 변화시키기 위하여, 상기 T-세포 에피토프를 변형시키는 단계. 본원에 기재된 바와 같이, 상기 변형은 단일 아미노산을 변형시키거나 목적 폴리펩티드의 부위를 상동체의 대응 부위로 대체하는 것에 의해 수행될 수 있고, 이때 상기 대체는 변형된 면역원성 반응을 생성한다.
본 발명의 다른 특징은 하기 설명에 의해 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1:순수한 인간 T-세포를 이용한 펩티드 T-세포 에피토프의 동정 검사
바실러스 렌투스및 인간 서브틸리신 유래의 프로테아제내 항원성 에피토프의 결정을 위해서, 신선한 인간 말초 혈액 세포를 "순수한" 인간, 즉바실러스 렌투스프로테아제에 노출되거나 감작되지 않은 것으로 알려진 사람으로부터 수집하였다. 순수한 인간은, 개체가 과거에 프로테아제에 대한 반응에 노출되거나 상기 반응이 발현되지 않은 것으로 알려진 것을 의도적으로 의미한다. 말초 단핵 혈액 세포 (상온에서 저장, 24시간이 지나지 않도록 함)는 사용을 위해 하기와 같이 제조되었다: 전체 혈액 1유닛으로부터 약 30㎖의 완충 코트(buffy coat) 제제 용액을 둘베코(Dulbecco's) 인산 완충 용액(DPBS)과 함께 50㎖이 되도록 하고, 두개의 튜브로 나누어 담았다. 샘플을, 상온 림포프렙 밀도 분리 배지(lymphoprep density separation media; 니콤드 밀도(Nycomed density): 1.077 g/㎖)에 깔았다. 상기튜브를 600G에서 30분동안 원심분리하였다. 두 상의 경계면을 수집하여 모으고 DPBS로 세척하였다. 생성 용액의 세포 밀도는 혈구계수기(hemocytometer)에 의해 측정되었다. 생존성은 트리판 블루 노출에 의해 측정되었다.
생성 용액으로부터, 즉 용액 중에 75㎖ 배양 플라스크당 108 세포 밀도를 갖는 말초 혈액 단핵 세포 샘플로부터, 분화된 수상 세포 배양액을 하기와 같이 제조하였다:
(1) 혈청 없는 AIM V 배지(Gibco) 50㎖에, 1:100 희석된 베타-메르캅토에탄올(Gibco)을 보충한다. 플라스크를 37℃, 5% CO2하의 평평한 곳에서 2시간동안 방치하여, 모노사이트가 플라스크 벽에 흡착하도록 하였다.
(2) 모노사이트에서 수상 세포로의 분화는 다음과 같이 유도한다: 비흡착 세포를 제거하고, 생성된 흡착 세포 (모노사이트)를 AIM V 30㎖, GM-CSF (Endogen) 800 유닛/㎖ 및 IL-4 (Endogen) 500 유닛/㎖과 조합시키고; 수득된 혼합물을 37℃, 5% CO2조건하에서 5일동안 배양하였다. 5일 후에, 사이토카인 TNFa (Endogen)을 0.2 유닛/㎖ 첨가하고, 사이토카인 IL-1a (Endogen)을 최종농도가 50 유닛/㎖이 되도록 첨가한 다음, 혼합물을 37℃, 5% CO2하에서 2일 이상 배양하였다.
(3) 7일째, 마이토마이신 C를 50㎍/㎖의 농도로 첨가하여, 현재 분화된 수상 세포 배양물의 성장을 멈추게 하였다. 상기 용액을 37℃, 5% CO2하에서 60분동안 배양하였다. 세포 스크래퍼(scrapper)를 이용하여 세포 바닥으로부터 부착세포를 부드럽게 긁어서, 수상 세포를 수집하였다. 부착 및 비부착 세포를 600G에서 5분동안 원심분리하고, DPBS로 세척한 다음, 계수하였다.
(4) 제조된 수상 세포를, 총부피 100㎕의 AIM V 배지내에 2 ×104/웰이 되도록 96웰 환저 바닥 어레이(array)에 옮겼다.
CD4+T-세포는, 인간 CD4+Cellect kit (Biotex)를 사용하여, 하기 변형을 수행한 제조자의 지침서에 따라, 수상세포를 제조하기 위해 사용된 말초 혈액 세포 샘플의 냉동 분액으로부터, 제조되었다: 분액을 녹이고, 약 108 세포수가 Cellect 컬럼에 적용되도록 세척하고; 세포를 4㎖의 DPBS 및 1㎖의 Cellect Kit 중의 세포 시약으로 재현탁하고, 용액을 상온에서 20분동안 유지한다. 생성 용액을 600G에서 5분동안 원심분리하고, 펠렛을 2㎖의 DPBS로 재현탁한 다음, Cellect 컬럼에 적용한다. 컬럼으로부터의 유출물을 DPBS 중의 2% 인간 혈청에 수집한다. 생성 CD4+세포 용액을 원심분리하고, AIM V 배지로 재현탁한 후, 밀도를 측정한다.
CD4+T-세포 현탁액을, AIM V 중에서 2 ×106/㎖의 세포수가 되도록 재현탁하여, 96웰 플레이트의 효율적인 조작이 용이하게 하였다.
1:10 비율로 AMI V를 이용하여 희석하는 것에 의해, DMSO 중의 1M 저장 용액으로부터, 펩티드 항원을 제조하였다. 저장용액 10㎕를, 분화된 수상 세포를 함유하는 96 웰 플레이트의 각 웰에 위치시켰다. 상기 제조된 것으로서, 희석된 CD4+T-세포 용액 100㎕를 각 웰에 또한 첨가하였다. 유용한 대조구는 희석된 DMSO 공백 및 테타누스(tetanus) 독소 양성 대조구를 포함한다.
최종부피 210㎕의 각 웰에서의 최종 농도는 하기와 같다:
2 ×104CD4+
2 ×105수상 세포 (10 : 1 의 R : S)
5 mM 펩티드.
실시예 2: 바실러스 렌투스 및 인간 서브틸리신으로부터 프로테아제내 T-세포 에피토프의 동정
실시예 1에 기재된 검사법에 사용하기 위한 펩티드는바실러스 렌투스및 인간 서브틸리신 아미노산 서열을 기초로하여 제조되었다. 펩티드 항원은 하기에 지칭한 바와 같다. 도 1에서 제공된 인간 서브틸리신 또는바실러스 렌투스프로테아제의 전장 아미노산 서열로부터, 15mer가 합성적으로 제조되었으며, 이때 각 15mer는 상기의 것 및 3개의 잔기를 제외한 그 다음의 15mer와 겹친다.
사용되는 펩티드는 도 8에서 제공되는바실러스 렌투스내 아미노산 잔기 가닥에 대응하며, 펩티드는 도 7에서 제공된 인간 서브틸리신내 아미노산 잔기에 대응한다. 프로테아제에 대응하여 사용되는 상기 펩티드는 도 6에서 제공된다. 모든 검사는 적어도 두 번의 반복수행을 실시하였다. 기록된 모든 검사는 항원인 테타투스 독소에 대한 강한 양성 대조구 반응을 나타내었다. 반응은 각 실험 내에서 평균내어졌으며, 이어서 기준 반응에 대해서 일반화시켰다. 반응이 기준 반응보다 적어도 3배이상이라면, 양성 결과로 기록된다.
인간 서브틸리신 및바실러스 렌투스로부터 제조된 펩티드에 대한 면역원성반응 (즉, T-세포 증식)이 이어졌고, 이는 각각 도 4 및 도 5에 제공되었다. T-세포 증식이, 통합 트리튬(tritium) 방법에 의해 측정되었다. 그 결과가, 다양한 펩티드에 대한 10개체 (도 4) 및 16개체 (도 5)에서의 면역 첨가 반응의 비교로서 도 4 및 5에 나타내어졌다. 1.0을 각 샘플에 대한 기준반응과 동일시한 첨가 반응으로서 나타내었다. 따라서, 도 4에서, 10.0 이하의 판독은 기준반응이며, 도 5에서 16.0 이하의 판독은 기준반응이다. 그 이상의 반응은, 더욱 유효한 T-세포 에피토프로서 간주된다.
도 4 및 도 5에서 나타내어진 바와 같이, 감작되지 않은 개체로부터 순수한 혈액 샘플의 면역원성 반응은,바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스프로테아제의 잔기 170-173에 대응하는바실러스 렌투스유래의 펩티드 단편에서 현저한 알레르기원성 반응을 나타내었다.
도 9는바실러스 렌투스프로테아제에 대해 과민성인 것으로 알려진 개체로부터 채취한바실러스 렌투스프로테아제 유래의 펩티드에 대한 T-세포 반응을 나타낸다. 펩티드 E05는바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스로부터의 프로테아제내 170-173 잔기에 대응하는 영역을 나타낸다. 도 9에서 나타낸 바와 같이, 과민성 개체는 펩티드 E05에 의해 나타내어진 T-세포 에피토프에 대해 매우 높은 반응을 나타냈다. 이러한 결과는, 본 발명의 검사법을 실제화하는 것에 의해, 과민성 개체의 T-세포에 의해 동정된 주요 에피토프를 예상할 수 있다는 것을, 확인시켜준다.
도 10은바실러스 렌투스프로테아제에 대해 과민성인 것으로 알려진 개체로부터 채취한 샘플내바실러스 렌투스프로테아제로부터 유래한 E05 펩티드 내에서의 다양한 알라닌 치환에 대한 T-세포 반응을 나타낸다. 알라닌 치환은, 에피토프내의 임의 특정 잔기의 역할을 결정하는 목적을 위한 치환체로서 사용되었다. 도 10의 기호는 알라닌 치환된 펩티드, 즉 펩티드 E06 (서열 GSISYPARYANAMAV) 중의 위치에 관한 것이다: G 에서 A = 2, S 에서 A = 3, I 에서 A = 4, S 에서 A = 5, Y 에서 A = 6, P 에서 A = 7, R 에서 A = 8, Y 에서 A = 9, N 에서 A = 10, M 에서 A = 11, V 에서 A = 12. 도 10에서 나타낸 바와 같이,바실러스 렌투스유래의 프로테아제내 잔기 R170A, Y171A 및/또는 N173A 중의 하나의 치환은, 과민성 개체의 혈액 샘플에서 현저하게 감소된 반응을 초래한다.
이러한 결과로부터, 잔기 170, 171 및 173은,바실러스 렌투스유래의 프로테아제 내에서, 알레르기성 반응의 개시에 매우 큰 원인임이 명백해진다.
실시예 3: 후미콜라 인솔렌스 유래의 셀룰라아제 (Carezyme )내 T-세포 에피토프의 동정
후미콜라 인솔렌스유래 셀룰라아제 (노보 노르디스크사(Novo Nordisk)의 Carezyme)로부터 유래한 펩티드에 대해서, 상기 기재한 방법을 수행하였다. 도 13에서 보는 바와 같이, 2개의 T-세포 에피토프 (A01 및 F06)가 찾아졌다.
실시예 4: 써모마이세스 라누기노사 유래의 리파아제(Lipolase )내 T-세포 에피토프의 동정
써모마이세스 라누기노사유래 리파아제 (노보 노르디스크사의 Lipolase)로부터 유래한 펩티드에 대해서, 실시예 2에 기재된 방법이 수행되었다. 도 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 두 개의 T-세포 에피토프 (A12 및 C06)가 찾아졌다. 펩티드 E03은 순수 공여자(donor)의 T-세포 증식을 약간 증가시키는데 효과적이었지만, 그러나 상기 펩티드는 A12에 연관성이 있고, 이들은 하나의 에피토프를 나타낸다. 이와 관련하여, 당업자는, 에피토프의 길이가 다양할 수 있이며, 천연 또는 변이된 에피토프의 정확한 효과성은 본원 방법에 의해 측정될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해된다.
실시예 5: 스트렙토마이세스 플리카투스 유래의 엔도글루카나아제내 T-세포 에피토프의 동정
스트렙토마이세스 플리카투스유래 엔도글루카나아제 H로부터 유래한 펩티드에 대해서, 실시예 2에 기재된 방법을 수행하였다. 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 단일 T-세포 에피토프 (C06)가 찾아졌다.
실시예 6: 프로테아제 하이브리드 (GG36-BPN')의 동정
T-세포 에피토프의 위치를 결정한 후, 확립된 단백질 공학 기술을 이용하여 프로테아제 하이브리드를 제작하였다. 상기 하이브리드는, 단백질의 높은 알레르기원성 아미노산 서열이 낮은 알레르기원성 상동체 유래의 대응 서열로 대체되도록, 제작되었다. 이러한 예로, 프로테아제의 처음 122개의 아미노산이 GG36으로부터 유도되었으며, 잔여 아미노산 서열은 BPN'로부터 유도되었다.
상기 하이브리드는 우선 100ppm의 시료로부터 0.5ppm씩 24웰 검사기에 분주하여 북아메리카 조건하에서 검사되었고, 스와치(swatch)를 과하게 고정한 다음, 3K의 스와치와 함께 24웰 검사기에 액체(Tide KT)를 0.5 씩 넣은 다음, N'N'-디메틸 카세인 검사, NA 세척제 중의 5 g/ℓDMC, TNBS 검출방법을 수행한다.
그 결과를 도 16, 17 및 18에 나타내었다.
실시예 7: 천연 저면역원성 단백질의 동정
본원 발명을 사용하여, 여러 다른 상업적으로 이용될 수 있는 프로테아제보다 낮은 면역원성 반응을 생성하는 것으로서 프로테인나아제 K를 동정하였다. 본원에서 동정된 프로테인나아제 K는 티리티라츔 알붐 림버 (Tritirachium Album limber) 유래이다. 프로테아제 및 방법론의 일반적인 기재에 대해서는, 문헌 [Mathew, C.G.P., Isolation of high molecular weight eukaryotic DNA, in Methods in Molecular Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J.M., ed.), Humana, Clifton, NJ, (1984) pp. 31-34]를 참조.

Claims (28)

  1. T-세포 에피토프를 포함하는 목적 폴리펩티드의 변이체로서, 개체내에서 상기 변이체 및 상기 폴리펩티드가 다른 면역원성 반응을 생성하도록 변형된 T-세포 에피토프를 갖는 것에 의해, 상기 변이체가 상기 목적 폴리펩티드와는 다른 것을 특징으로 하는 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체에 의해 생성된 상기 면역원성 반응이 상기 목적 폴리펩티드에 의해 생성된 상기 면역원성 반응보다 더 작은 것을 특징으로 하는 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체에 의해 생성된 상기 면역원성 반응이 상기 목적 폴리펩티드에 의해 생성된 상기 면역원성 반응보다 더 큰 것을 특징으로 하는 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 목적 폴리펩티드가 효소, 호르몬, 인자(factor), 백신 및 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 변이체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 목적 폴리펩티드가 상기 개체에 대해서 내인성으로서 상기 개체에 의해 인식되지 않음을 특징으로 하는 변이체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 목적 폴리펩티드가 리파아제, 셀룰라아제, 엔도-글루코시다아제 H, 프로테아제, 카보히드라아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 키나아제 및 포스파타아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소임을 특징으로 하는 변이체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 T-세포 에피토프가 아미노산 치환에 의해 변형됨을 특징으로 하는 변이체.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 목적 폴리펩티드의 상동체의 대응 말단 부위로 교체된 상기 T-세포 에피토프를 포함하며, 상기 상동체는 상기 교체된 T-세포 에피토프와 동일한 T-세포 에피토프를 포함하지 않은 상기 목적 폴리펩티드의 말단 부위를 갖는 것에 의해, 상기 T-세포 에피토프가 변형됨을 특징으로 하는 변이체.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 변이체가 상기 목적 폴리펩티드 및 상기와 조합된 상동체보다 낮은 T-세포 에피토프를 하나 이상 포함함을 특징으로 하는 변이체.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 변이체가 상기 목적 폴리펩티드 및 상기와 조합된 상동체보다 낮은 T-세포 에피토프를 둘 이상 포함함을 특징으로 하는 변이체.
  11. 제 1 항에 따른 변이체를 코딩하는 핵산.
  12. 제 11 항에 따른 핵산을 포함하는 발현벡터.
  13. 제 12 항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
  14. 제 6 항에 따른 변이체를 포함함을 특징으로 하는 세정 조성물, 동물 사료 조성물 또는 직물 처리용 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서, 약학적으로 수용가능한 담체를 더 포함함을 특징으로 하는 변이체.
  16. 조성물내에, 동일한 형태의 다른 효소에 대하여 감소된 면역원성 반응을 생성하는 천연 효소를 포함함을 특징으로 하는 세정 조성물, 동물 사료 조성물 또는 직물 처리용 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 형태가 프로테아제임을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 효소가 프로테인나아제 K임을 특징으로 하는 조성물.
  19. 단백질에 의해 생성되는 면역원성 반응의 결정 방법에 있어서, 하기 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법:
    (a) 단일 혈액원으로부터 수상 세포 (dendrite cell)의 용액 및 순수한(naive) CD4+및/또는 CD8+T-세포의 용액을 얻는 단계;
    (b) 상기 수상 세포의 용액 내에서 분화를 촉진시키는 단계;
    (c) 상기 분화된 수상 세포 용액 및 상기 순수한 CD4+및/또는 CD8+T-세포의 용액을 상기 단백질과 함께 결합하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)에서의 T-세포 증식을 측정하는 단계.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 면역원성 반응을 또 다른 단백질과 비교하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 단백질 및 상기 또 다른 단백질은 서로 상동체임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 상기 단백질 및 상기 또 다른 단백질은 각각 프로테아제임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 단백질 및 상기 또 다른 단백질은 각각 동일한 단백질의 다른 펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  24. 목적 폴리펩티드의 면역원성의 변형방법으로서, 하기의 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법:
    a) 상기 폴리펩티드의 면역원성을 결정하는 단계;
    b) 상기 폴레펩티드내의 T-세포 에피토프를 동정하는 단계; 및
    c) 상기 폴리펩티드의 면역원성을 변형하기 위해서, 상기 T-세포 에피토프를 변형하는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 T-세포 에피토프가 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 것에 의해서 변형됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 상기 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 변형하는 것에 의해서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 T-세포 에피토프를 포함하는 상기 목적 단백질의 부위를 상기 목적 폴리펩티드의 상동체의 대응 부위로 대체하는 것에 의해, 상기 T-세포 에피토프가 변형되며, 여기에서 상기 대응 부위는 상기 T-세포 에피토프를 함유하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 부위가 상기 목적 폴리펩티드의 종결 부위임을 특징으로 하는 방법.
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