KR20020061721A - Ｂ형 간염 바이러스의 ｄｎａ 중합효소의 샤페론으로서작용하는 ｇｒｐ94 단백질 및 활성상태의 ｂ형 간염바이러스의 ｄｎａ 중합효소의 제조를 위한 발현 벡터시스템 - Google Patents
Ｂ형 간염 바이러스의 ｄｎａ 중합효소의 샤페론으로서작용하는 ｇｒｐ94 단백질 및 활성상태의 ｂ형 간염바이러스의 ｄｎａ 중합효소의 제조를 위한 발현 벡터시스템 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론으로서 작용하는 GRP94 단백질, 활성 상태의 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 효율적으로 발현하는 동시-형질전환용 발현벡터 시스템, 그에 의해 형질전환된 미생물, 상기 미생물을 이용한 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 및 상기 DNA 중합효소를 이용한 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 활성도 분석용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 발현 벡터 시스템은 활성 상태의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 대량으로 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 DNA 중합효소는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 억제제를 효과적으로 선별하는 시스템에 이용되어, B형 간염 바이러스의 감염에 의한 질병을 치료 및 예방을 할 수 있는 후보 물질을 신속하고 정확하게 스크리닝할 수 있다.
Description
본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론으로서 작용하는 GRP94 단백질, 활성 상태의 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 효율적으로 발현하는 동시-형질전환용 발현벡터 시스템, 그에 의해 형질전환된 미생물, 상기 미생물을 이용한 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 및 상기 DNA 중합효소를 이용한 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 활성도 분석용 조성물에 관한 것이다.
섬머스와 메이슨은 인간의 B형 간염 바이러스의 지놈과 유사한 구조를 갖는 오리의 B형 간염 바이러스가 DNA 복제를 하는 경우, RNA를 중간체로 하는 역전사 과정을 거친다는 것을 최초로 규명하였다(Summers, J. 및 Mason, W. S.,Cell, 29:403-415(1982)). 또한, 토우(Toh) 등은 인간의 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 아미노산과 라우스 사코마 바이러스(Rous Sarcoma virus) 및 몰로니 뮤린 루케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus)에 존재하는 역전사효소의 아미노산을 비교한 결과, 이들 단백질 내에 동일한 아미노산 서열이 보전되고 있는 부분이 존재한다는 것을 발표하였다(Toh, H.et al.,Nature, 305:827-829(1983)). B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소가 역전사효소 활성을 갖고 있다는 것을 예측할수 있는 또 다른 증거로는, 오리의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 전사해독틀의 C-말단 부분에 있는 역전사효소와 RNase H 도메인의 아미노산 서열을 교체하는 경우에는, 오리의 B형 간염 바이러스의 DNA 합성이 현저하게 감소한다는 것이 제시되었다(Chang, L. J.et al.,J. Virol., 64:5553-5558(1990)). 또한, 바반드 등은 B형 간염 바이러스로 형질감염된 세포를 용균시켜 방출된 B형 간염 바이러스의 효소활성 겔 분석(activity gel analysis)에 의하여, 역전사효소 활성이 B형 간염 바이러스에 내재함을 밝혔다(Bavand. R. M. 및 Laub, O.,J. Virol., 62:626-628(1988)).
상술한 바와 같이, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소가 역전사 효소활성을 갖고 있다는 수많은 예측 및 증거에도 불구하고, 아직까지 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소로부터 직접 역전사 효소활성을 확인하지는 못했다. 더욱이, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 효과적인 억제제의 개발 등과 같은 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 연구에 있어서는, 활성을 갖는 다량의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 필요로 하지만, 현재까지 유전자 재조합 시스템에 의하여 활성을 갖는 다량의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 얻을 수 있는 방법이 전무한 실정이다.
따라서, 효소활성을 보유하는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 다량으로 얻을 수 있는 유전자 재조합 시스템에 대한 요구가 당업계에서 대두되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 상기한 당업계의 요구를 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 신규한 샤페론(chaperone)을 확인하고, 상기 샤페론에 대한 유전자를 포함하는 발현벡터를 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 유전자를 포함하는 발현벡터와 동시에 발현시키는 경우에는 다량의 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소가 제조됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론으로서 작용하는 GRP(Glucose Regulated Protein)94 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론으로서 작용하는 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 효율적으로 발현하는 동시-형질전환(co-transformation)용 발현벡터 시스템을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 동시-형질전환용 발현벡터 시스템에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 미생물을 이용한 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 제조방법을 제공하는 데 있다.
도 1a는 pGST-HBVP의 제한효소 지도;
도 1b는 pMBP-GRP94의 제한효소 지도;
도 2는 본 발명의 제조방법에 따라 최종적으로 정제된 시료의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 사진;
도 3은 GRP94의 샤페론 작용을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 사진;
도 4는 GRP94와 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 이형이합체 형성을 확인하는 친화성 크로마토그래피 결과를 나타내는 SDS-PAGE 겔 사진;
도 5는 GRP94와 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 이형이합체 형성을 확인하는 네이티브-PAGE 겔 사진; 및
도 6은 본 발명에 따라 수득된 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 억제제 확인 결과를 나타낸 그래프.
본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론(chaperone)으로서 작용하는 GRP(Glucose Regulated Protein)94 단백질을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론으로서 작용하는 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 다른 특징으로 한다.
한편, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터 및 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대한 샤페론 단백질인 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 포함하는 동시-형질전환(co-transformation)용 발현벡터 시스템을 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터 및 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대한 샤페론 단백질인 GRP94를 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터에 의해 동시-형질전환된 미생물을 다른 특징으로 한다.
한편, 본 발명은 상기 2종의 발현벡터에 의해 숙주 미생물을 동시-형질전환하는 단계; 동시-형질전환된 숙주 미생물을 상기 발현벡터의 두 복제 원점에서 복제가 개시되는 조건하에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액에 포함된 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 정제하는 단계를 포함하는 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다:
본 발명에서 신규한 용도가 확인된 GRP94는 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소가 세포내에서 발현되는 동안 샤페론으로서 작용한다. GRP94는 소포체내에 풍부하게 존재하는 당단백질로서 HSP90(90 kD-heat shock protein) 단백질과 아미노산 서열이 50% 동일한 것으로 보고되어 있다(Mazzarella, R.A., et al.,J. Biol. Chem., 262:8875(1987); Sorger, P.K., et al.,J. Mol. Biol., 194:341(1987)).
본 발명에 있어서, GRP94 단백질은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대하여 샤페론 역할을 할 수 있는 모든 GRP94를 포함하며, 예컨대 사람, 캐니스 패밀리아리스(Canis familiaris; GenBank accession number U01153), 마우스(GenBank accession number J03297), 토끼(GenBank accession number AF001631), 보리(GenBank accession number X67960.1), 햄스터(GenBank accession number X04850) 등 고등 진핵생물에서 분리된 GRP94를 포함한다. 또한, GRP94의 동족 단백질(homologue)로 알려진 단백질 및 GRP94의 기능성 일부 단편도 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 GRP94는 사람으로부터 분리된 것이며, 이의 아미노산 서열은 첨부한 서열 2와 같고, 이를 암호화하는 DNA의 염기 서열은 첨부한 서열 1과 같다(GenBank accession number: X15187, Maki RG, et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5658(1990)).
본 발명의 동시-형질전환용 발현벡터 시스템은 유전자 재조합 시스템을 이용하여 숙주 세포내에서 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 활성 상태로 대량 발현시키기 위하여 안출된 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를암호화하는 유전자는 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖으며, 보다 바람직하게는 서열 3에 기재된 염기 서열을 갖는다(GenBank accession number: X14193, Rho HM, et. al.,Nucleic Acids Res., 17:2124(1989)).
본 발명의 특히 바람직한 실시예에 따르면, 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터는 도 1a에 기재된 제한효소 지도를 갖는 pGST-HBVP이다. 상기 벡터는 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소가 GST(Glutathione S-transferase)와 융합된 상태로 발현되도록 제작된 것으로서, B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 제조하는 과정에서 GST의 기질(글루타티온)에 대한 친화성을 이용하여 수율 및 순도를 크게 증가시키게 된다.
한편, 바람직한 본 발명의 발현벡터 시스템에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대한 샤페론 단백질을 암호화하는 유전자는 서열 2에 기재된 GRP94의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖으며, 보다 바람직하게는 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에 따르면, 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대한 샤페론 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터는 도 1b에 기재된 제한효소 지도를 갖는 pMBP-GRP94이다.
상술한 본 발명의 동시-형질전환된 미생물의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 형질전환 미생물은 pGST-HBVP 및 pMBP-GRP94로 동시-형질전환된 것이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 숙주 세포는 당업계에서 발현 벡터의 발현에 일반적으로이용되는 것으로서, 예컨대 대장균 HB101, BL21, DH5α 등을 포함한다.
한편, 본 발명의 활성상태의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 제조방법의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 정제 단계는 DEAE, TEAE, QAE, PEI 등의 작용기가 결합된 고분자 불활성 수지가 충진된 음이온 교환 크로마토그래피 과정; B형 간염 바이러스 DNA 중합효소와 융합하여 발현되는 GST의 기질(글루타티온)에 대한 친화성을 이용한 친화성 크로마토그래피 과정; 및 헤파린이 작용기로 결합된 수지를 이용한 크로마토그래피 과정을 포함한다.
상기한 제조방법에 의해, 활성 상태의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소가 제조된다. 상기 과정에서 GRP94는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소가 숙주 세포내에서 발현될 때, 이에 결합하여 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 안정된 발현을 가능하게 한다. 따라서, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소는 활성 상태를 유지하게 된다. 즉, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 정제 단계에서 분리된 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소는 바람직하게는 GRP94 단백질과 이형이합체 형태로 정제된 것이다.
또한, 상기 방법에 의해서 제조되는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소는 GST와 융합된 상태이므로, 순수하게 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소만을 얻고자 하는 경우에는 GST-B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 적합한 프로테아제를 처리한다. 적합한 프로테아제는 예컨대, 트롬빈을 포함한다.
본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 활성상태의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 포함하는 활성도 분석용 조성물을 또 다른 특징으로 한다. 상기 조성물은 활성상태의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소, 템플레이트-프라이머로서의 호모폴리머 및 [32P]-NTP를 포함한다. 상기 호모폴리머는 예컨대, 폴리(rA)ㆍ올리고(dT), 폴리(rC)ㆍ올리고(dG), 폴리(dA)ㆍ올리고(dT) 등을 포함한다. 상기 조성물을 이용한 반응이 종료된 다음, 템플레이트에 삽입된32P의 cpm을 측정함으로써 효소의 활성을 측정할 수 있게 된다.
본 발명의 활성도 분석용 조성물를 이용하는 경우에는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 억제제를 효과적으로 선별할 수 있으므로, B형 간염 바이러스의 감염에 의한 질병을 치료 및 예방을 할 수 있는 후보 물질을 신속하고 정확하게 스크리닝하는 데 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 재료
하기의 실시예에서 사용된 시료 및 시약의 구입처는 다음과 같다:
글루타티온 S-트란스퍼라아제(Glutathione S-transferase: GST)-융합 발현벡터 pGEX-4T-1, 글루타티온-세파로스 4B, DEAE-세파로스 레진 및 헤파린-아가로스는 파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech)에서 구입하였다. 말토스-결합 단백질(Maltose binding protein: MBP)-융합 발현벡터 pMAL-c2, 아밀로스는 뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)에서 구입하였고, 제한효소 및 DNA-변형효소 프로메가(Promega)로부터 구입하였다. 방사선 동위원소 표지 뉴클레오티드는 애머샴(Amersham Inc.)으로부터 구입하였고, 템플레이트-프라이머로서의 호모폴리머는 P-L 바이오케미칼(P-L Biochemicals Inc.)로부터 구입하였다. HBV adr-k 타입은 본 발명자들에 의해 직접 동정되어진 것이고(GenBank accession number: X14193, Rho HM et. al.,Nucleic Acids Res., 17:2124(1989)), GRP94에 대한 유전자를 얻기 위한 인간 간세포인 HepG2는 ATCC로부터 구입하였다.E. coliBL21(DE3)은 한국종균협회로부터 구입하였다.
실시예 1: 발현 벡터의 제작
Ⅰ.B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 발현 벡터의 제작
B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 원핵세포에서 효과적으로 발현할 수 있는 벡터를 다음과 같이 제조하였다: 우선, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 구조 유전자는 HBV adr-k로부터 DNA를 분리한 다음, Rho HM, et al.,NucleicAcids Res., 17:2124(1989)에 개시된 방법에 따라 PCR로 증폭하였다. PCR시 사용한 기기는 Perkin Elmer 9700 Gene Amp PCR 시스템이며, 프라이머는 ATGCCCCTATCTTATCAACAC와 TCACGGTGGTCTCCATGCGAC를 사용하였고, 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 60℃에서 20초, 연장 반응은 68℃에서 2분 20초 동안 28 사이클을 수행하였다. 이어, 상기 증폭된 유전자를 pGEX4T-1 벡터의EcoRI(Promega사)과SalI(Promega사)으로 절단한 부위에 삽입하여 최종적으로 발현벡터를 제작하였고, 제작된 벡터를 "pGST-HBVP"라 명명하였으며, 이의 제한효소 지도는 첨부한 도 1a와 같다.
Ⅱ.GRP94 발현 벡터의 제작
우선, GRP94에 대한 구조 유전자는 HepG2로부터 DNA를 분리한 다음, Maki RG, et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5658(1990)에 개시된 방법에 따라 PCR 로 증폭하였다. PCR시 사용한 기기는 Perkin Elmer 9700 Gene Amp PCR 시스템이며, 프라이머는 ATGAGGGGTGACAGAGGCCGTGGT와 TTAGGCTCCAGTCTTTCCCTTGGG를 사용하였고, 5'쪽에는BglⅡ(Promega사) 링커 그리고, 3'쪽에는SalI(Promega사) 링커가 삽입되도록 제작하였고, 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 60℃에서 45초, 연장 반응은 72℃에서 2분 동안 30 사이클을 수행하였다.
이어, 상기 증폭된 유전자를 pMBP-c2 벡터를BamHI(Promega사)과SalI(Promega사)로 절단한 부위에 T4 DNA 리가아제(Promega사)로 연결하여 최종적으로 벡터를 제작하였고, 제작된 벡터를 "pMBP-GRP94"라 명명하였으며, 이의 제한효소 지도는 첨부한 도 1b와 같다. 한편, pMBP-c2벡터는 pMAL-c2벡터를MscI(Promega사)와DraI(Promega사)으로 자른 부위에 pLysE벡터(New England Biolab.사)를HincⅡ(Promega사)와EcoRV(Promega사)로 자른 부위를 T4 DNA 리가아제(Promega사)로 연결하여 제작된 것이다.
실시예 2: pGST-HBVP 및 pMBP-GRP94를 이용한 형질전환 및 동시 발현
우선, 실시예 1에서 제작한 pMBP-GRP94를E. coliBL21(DE3)에 CaCl2방법 (Cohen S.N. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 9:2110(1973))으로 형질전환시켰다. 이어, 형질전환된 균주를 선택하기 위하여 40 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 포함하는 2 × YT(Yeast Extract, Tryptophan, NaCl) 배지 플레이트에서 37℃로 하룻밤동안 배양하였다. 그런 다음, 선택된 pMBP-GRP94에 의해 형질전환된E. coliBL21(DE3) 클론을 실시예 1에서 제작한 pGST-HBVP으로 CaCl2방법으로 형질전환시켰다. 그리고 나서, 40 ㎍/㎖의 클로람페니콜 및 100 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 2 × YT 배지 플레이트에서 배양하고, 상기 배지에서 형성된 콜로니를 2 × YT 액체 배지 5 ㎖에서 37℃로 하룻밤동안 배양하였다. 동시-형질전환된E. coliBL21(DE3)를E. coliBL21(DE3)/GPM94로 명명하고, 한국종균협회에 2000년 10월 13일자로 기탁하고, 기탁번호 KFCC-11223를 부여받았다. 이어, 배양물을 40 ㎍/㎖의 클로람페니콜 및 100 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 2 x YT 배지로 1:100으로 희석하고, OD가 1.0이 될 때까지 30℃에서 배양하였다. 그런 다음,IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)을 최종 농도 0.5 mM이 되도록 첨가하여, pMBP-GRP94 및 pGST-HBVP으로 동시 형질전환된 숙주 세포에서 GRP94 및 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 발현을 유도하였다.
실시예 3: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 활성 측정
본 발명에 있어서 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 활성은 Rho HM et al.,Cancer Lett., 10:207(1980)에 개시된 방법에 따라 다음과 같이 실시하였다: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 활성을 측정하고자 하는 시료와 템플레이트-프라이머로서의 폴리(rA)ㆍ올리고(dT)(역전사 효소 활성 측정시) 또는 폴리(dA)ㆍ올리고(dT)(DNA 중합효소 활성 측정시)의 혼합물에 [32P]-TTP를 첨가하여 30℃에서 90 분동안 반응을 진행시키고, EDTA(50mM)를 첨가하는 방법으로 반응을 종결시켰다. 이어, 템플레이트에 삽입된32P의 cpm을 액상 씬틸레이션 카운터로 측정하여 효소의 활성을 측정하였다.
실시예 4: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 정제 및 활성 확인
상기 실시예 2에서 발현 유도된 배양액 100 ㎖를 2,500 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 수집하고, 수집된 세포 g당 완충용액 B(20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT 및 20% 글리세롤) 부피가 20 ㎖이 되도록 첨가하고, 5분 동안 초음파 처리를 하였다. 이어, 초음파 분쇄된 현탁액을20,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액 20 ㎖를 상기 완충용액 B로 평형화된 DEAE-세파로스 컬럼(2 × 0.5 ㎝)에 로딩한 다음, 완충용액 B로 과도하게 세척하였다. 그런 다음, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 0.1-0.5 M KCl 농도 구배를 함유하는 완충용액 B 30 ㎖로 7 ㎖/시의 유속으로 용출하였다. 이어, 역전사 효소 활성을 나타내는 부분을 실시예 3에 기재된 방법으로 실시하여 확인하고, 이를 수집하였다.
수집된 활성 부분 20 ㎖을 100 mM KCl을 함유하는 완충용액 B에 대하여 투석하고, 투석된 활성 부분 20 ㎖을 4℃에서 2시간 동안 글루타티온-세파로스 4B 비드 0.1 ㎖과 혼합하였다. 이어, 혼합물을 컬럼에 충진하고, 베드 부피의 10배에 해당하는 양의 완충용액 B로 5회 세척하였다. 그런 다음, 레진에 결합된 단백질을 20 mM 환원 글루타티온을 함유하는 완충용액 C(100 mM Tris-HCl, pH 8.5, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT 및 20% 글리세롤)로 용출하고, 활성 부분을 수집하였다.
B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 더욱 정제하기 위하여, 수집된 활성 부분 10 ㎖을 완충용액 B로 평형화된 헤파린-아가로스 컬럼(1 × 2 ㎝)에 로딩하였다. 이어, 상기 컬럼을 완충용액 B로 과도하게 세척하고, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 0.1-0.5 M KCl 농도 구배를 함유하는 완충용액 B 20 ㎖로 7 ㎖/시의 유속으로 용출하였다. 그런 다음, 활성 부분을 수집하고, 완충용액 B에 대하여 투석하였다.
최종적으로 수집된 활성 부분에서 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 정제를확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 항-GST 항혈청을 이용한 웨스턴 블롯(Sambrook J. et al.,Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(1989))을 실시하였으며, 그 결과는 도 2에 도시되어 있다. 웨스턴 블롯은 SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오리드 막에 전이시키고, 상기 막을 5% 지방-제거 건조 밀크로 블롯킹한 다음, 항-GST 항혈청(Stressgen사)을 1:2000으로 1 시간동안 25℃에서 처리하고, 인산-완충 염수액으로 세척한 후, 호스래디쉬 페록시다아제-커플링 2차 항체를 1:8000으로 1 시간동안 25℃에서 처리하고, ECL 시스템(Amersham)으로 가시화하였다.
첨부 도 2의 A 패널에서 M 레인은 분자량 마커이고, 레인 1은 크루드 세포 추출액, 레인 2는 DEAE-세파로스 컬럼 크로마토그래피를 한 활성 부분, 레인 3은 글루타티온-세파로스 4B 크로마토그래피를 한 활성 부분 및 레인 4는 헤파린-아가로스 크로마토그래피를 한 활성 부분을 각각 로딩한 것이다. 첨부 도 2의 B 패널에서 웨스턴 블롯의 각각의 웰은 상기 SDS-PAGE의 각 웰에 대응되는 것이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, 최종적으로 정제된 시료에서 pGST-HBVP에 의해 발현되는 GST-B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 접합 단백질에 해당하는 130 KD에서 단일 밴드가 관찰되었고, 이에 GST-B형 간염 바이러스 DNA 중합효소가 정제되었음을 알 수 있었다.
실시예 5: GRP94의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 샤페론 기능 확인
상기 실시예 2에서 발현 유도된 배양액을 2,500 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 수집하고, 수집된 세포 g당 완충용액 B(20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT 및 20% 글리세롤) 부피가 20 ㎖이 되도록 첨가하고, 5분 동안 초음파 처리를 하였다. 이어, 초음파 분쇄된 현탁액을 20,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상청액을 취하였다. 한편, pGST-HBVP만으로 형질전환된E. coliBL21(DE3)으로부터 상기한 방법과 동일하게 초음파 분쇄액을 수득하였다.
이어, 수득한 세포 분쇄액에 대하여 항-GST 항혈청을 이용하여 상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일하게 웨스턴 블롯팅을 실시하였고, 그 결과는 도 3과 같다.도 3에서, M 레인은 분자량 마커, 1번 레인은 pGST-HBVP만으로 형질전환된 대장균 세포 분쇄액, 그리고 2번 레인은 pMBP-GRP94와 pGST-HBVP로 동시 형질전환된 세포 분쇄액을 각각 로딩한 것이다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, pGST-HBVP만으로 형질전환된 세포에서는 GST-B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 융합 단백질의 발현이 잘 이루어지지 않았고, 대부분 분해된 형태로 나타났으나, 동시 형질전환된 세포에서는 GST-B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 해당하는 130 kD 밴드가 강하게 나타났다.
따라서, GRP94 단백질이 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 샤페론으로서 작용하여 그의 발현 및 안정화에 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
실시예 6: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소와 GRP94의 이형이합체 형성의 확인
Ⅰ.친화성 컬럼 크로마토그래피
GST와의 친화성으로 GST-B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 선별하기 위하여, 상기 실시예 4에서 최종적으로 정제된 활성 부분 10 ㎖를 상기 완충용액 B로 평형화된 글루타티온-세파로스 4B 컬럼 0.1 ㎖에 로딩한 다음, 베드 부피 10배의 완충용액 B로 세척하였다. 이어, 상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일하게 용출하고, SDS-PAGE를 실시하였고, 그 결과는 도 4와 같다.
또한, MBP와의 친화성으로 MBP-GRP94를 선별하기 위하여, 상기 실시예 4에서 최종적으로 정제된 활성 부분 1 ㎖를 완충용액 B로 평형화된 아밀로스 컬럼(1 × 2 cm)에 로딩한 다음, 베드 부피 10배의 완충용액 B로 세척하였다. 이어, 레진에 결합된 단백질을 10mM 말토스를 포함하고 있는 완충용액 B (20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT 및 20% 글리세롤)로 용출하고, SDS-PAGE를 실시하였고, 그 결과는 도 4와 같다.
첨부한 도 4에서, M 레인은 분자량 마커, 레인 1은 실시예 4의 헤파린-아가로스의 용출액, 레인 2는 글루타티온-세파로스 4B의 용출액 및 레인 3은 아밀로스 컬럼의 용출액을 각각 로딩한 것이다.
도 4에서 볼 수 있듯이, 레인 1 내지 3에서 130 KD에 해당하는 위치에서 밴드를 형성하므로, 실시예 4의 SDS-PAGE 결과 사진에서 나타나는 130 KD 밴드는 GST-B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 및 MBP-GRP94 2종의 융합 단백질에 해당하는 밴드임을 알 수 있고, GRP94와 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소가 이형이합체를 형성함을 확인할 수 있다.
Ⅱ.네이티브-PAGE
실시예 4에서 최종적으로 정제된 시료 4 ㎕를 5 × 시료 완충용액(312.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 50% 글리세롤, 0.05% 브로모페놀 블루) 1㎕와 혼합한 다음, 5% 글리세롤을 함유하는 8% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 6-8시간 동안 15-20 mA로 4℃에서 네이티브-PAGE를 실시하였고, 그 결과는 첨부한 도 5와 같다.
도 5에서, M은 분자량 마커, 레인 1은 실시예 4의 시료, 레인 2는 MBP-GRP94를 각각 로딩한 것이다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 실시예 4에서 최종적으로 정제된 활성 부분은 260 kD 부분에서 밴드를 형성하였다.
따라서, 실시예 4에서 얻은 SDS-PAGE의 결과 및 본 실시예에서 얻은 네이티브-PAGE 결과로부터, GRP94는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 이형이합체를 형성하고, 이렇게 형성된 이합체는 DNA 중합효소 활성을 나타내므로, GRP94 단백질이 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 생체내 합성과정동안 샤페론의 역할을 함을 알 수 있다.
실시예 7: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 억제제 확인
실시예 4에서 수득한 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 이용하여, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 억제제 후보 물질(아피도콜린, 액티노마이신 D, 포스포노포름산, 라미부민 및 EDTA)을 다음과 같이 확인하였다: 실시예 4에서 수득한 B형간염 바이러스 DNA 중합효소 5 ㎕, 소정의 억제 예상 물질(아피도콜린 20 μM, 액티노마이신 D 80 μM, 포스포노포름산 1 mM, 라미부딘 1 μM 또는 EDTA 20 mM), 기질로서의 폴리(rA)ㆍ올리고(dT) 또는 폴리(dA)ㆍ올리고(dT) 200 μg/㎖, [32P]dTTP 1 μCi (3000 Ci/mmol)를 5X 시료 완충용액 (100 mM Tris-HCl, pH 7.9; 500mM KCl; 50mM MgCl2; 0.05% Nonidet P-40)이 1X가 되도록 혼합하였다.
B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 억제제 확인 실험 결과는 첨부한 도 6에 도시되어 있다. 도 6에서, 오픈바는 역전사효소 활성을 나타내는 것이고, 필드바는 DNA 중합효소 활성을 나타낸 것이며, 1번은 억제제를 처리하지 않은 대조구, 2번은 아피도콜린, 3번은 액티노마이신 D, 4번은 포스포노포름산, 5번은 라미부민 및 6번은 EDTA를 각각 처리한 결과를 나타내는 것이다. 도 6을 살펴보면, 아피도콜린은 DNA 중합효소 α 및 β의 억제제로 공지되어 있는 물질로서, 본 발명의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 DNA-의존성 DNA 중합효소 활성 및 RNA-의존성 DNA 중합효소 활성에 대하여 어떠한 효과도 미치지 아니하였다. 액티노마이신 D는 역전사 효소의 DNA-의존성 DNA 합성을 억제하는 것으로 공지된 물질로서, 본 발명의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 DNA-의존성 DNA 중합효소 활성의 70% 이상을 억제하였으나, RNA-의존성 DNA 중합효소 활성에 대하여는 어떠한 효과도 미치지 아니하였다. 포스포노포름산은 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 가역적 억제제로 공지된 물질로서, 본 발명의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 DNA-의존성 DNA 중합효소 활성과 RNA-의존성 DNA 중합효소 활성모두를 50% 이상 억제하였다. 라미부딘은 역전사 효소의 억제제로 공지된 물질로서, 본 발명의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 DNA-의존성 DNA 중합효소 활성의 70% 이상 그리고 RNA-의존성 DNA 중합효소 활성 90% 이상을 억제하였다. EDTA의 경우에는, 본 발명의 중합효소의 두 활성을 완전히 억제하였다.
상기한 실험 결과는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소와 오리의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 아피도콜린, 액티노마이신 D, 포스포노포름산 및 라미부딘의 억제 효과와 관련하여 종래에 발표된 결과와 일치하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 이용하는 경우에는 중합효소의 억제제를 신속하고 정확하게 선별할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론으로서 작용하는 GRP94 단백질을 제공한다. 본 발명은 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 효율적으로 발현하는 동시-형질전환용 발현벡터 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 동시-형질전환용 발현벡터 시스템에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다. 한편, 본 발명은 상기 형질전환 미생물을 이용한 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 활성 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 포함하는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 활성도 분석용 조성물을 제공한다. 본 발명의 발현 벡터 시스템은 활성 상태의 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 대량으로 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 DNA 중합효소는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 억제제를 효과적으로 선별하는 시스템에 이용되어, B형 간염 바이러스의 감염에 의한 질병을 치료 및 예방을 할 수 있는 후보 물질을 신속하고 정확하게 스크리닝할 수 있다.
Claims (11)
- 다음과 같은 단계를 포함하는 활성 상태의 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 제조하는 방법:B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터; 및 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대한 샤페론 단백질인 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 숙주 세포에 동시-형질전환하는 단계;상기 동시-형질전환된 숙주 미생물을 상기 발현벡터의 두 복제 원점에서 복제가 개시되는 조건하에서 배양하는 단계; 및상기 배양액에 포함된 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 정제하는 단계.
- 제 1 항에 있어서, 상기 정제 단계에서 분리된 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소는 상기 GRP94 단백질과 이형이합체 형태로 정제된 것임을 특징으로 하는 활성 상태의 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 제조하는 방법.
- B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터; 및 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대한 샤페론 단백질인 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 포함하는 활성 상태의 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 제조하기 위한 동시-형질전환용 발현벡터 시스템.
- 제 3 항에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터는 도 1a에 기재된 제한효소 지도를 갖는 pGST-HBVP임을 특징으로 하는 동시-형질전환용 발현벡터 시스템.
- 제 3 항에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대한 샤페론 단백질인 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터는 도 1b에 기재된 제한효소 지도를 갖는 pMBP-GRP94임을 특징으로 하는 동시-형질전환용 발현벡터 시스템.
- B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터 및 상기 B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소에 대한 샤페론 단백질인 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터에 의해 동시-형질전환된 미생물.
- B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론으로서 작용하는 GRP94 단백질.
- 제 7 항에 있어서, 상기 GRP94 단백질은 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖음을 특징으로 하는 GRP94 단백질.
- B형 간염 바이러스의 DNA 중합효소의 샤페론으로서 작용하는 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터.
- 제 8 항에 있어서, 상기 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자는 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖음을 특징으로 하는 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터.
- 제 9 항에 있어서, 상기 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자는 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖음을 특징으로 하는 GRP94 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현벡터.
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