KR20010106902A

KR20010106902A - 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서

Info

Publication number: KR20010106902A
Application number: KR1020000027949A
Authority: KR
Inventors: 백세환; 조정환
Original assignee: 서정구; 주식회사 바이오포커스
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2001-12-07
Anticipated expiration: 2020-05-24
Also published as: US6478938B1; JP3329449B2; KR100348351B1; JP2001337065A

Abstract

본 발명은 의료현장용 (의사진료실, 응급실 등) 혹은 가정용 진단시약에서 요구되는 분석수행의 신속성과 간편성을 제공할 수 있는 면역 크로마토그래피 방법에 기초를 둔 바이오센서의 개발에 관한 것이다. 임신과 배란과 같은 신체의 증세 혹은 세균에 대한 감염여부는 그 지표물질의 존재유무에 대한 정성분석에 의해 판별될 수 있지만 의료분야의 대부분 시료들은 임상적 판단을 위해 관심대상 분석물질의 농도를 결정하는 것이 필요하다. 따라서 본 발명자들은 의사진료실 및 응급실 등 의료현장에서 채취된 시료에 대해 즉석 정량분석이 가능하도록 면역 크로마토그래피 분석원리와 전기전도도 측정방법을 결합함으로써 새로운 개념의 바이오센서를 개발하였다.

Description

전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서 {Electrochemical membrane strip biosensor}

본 발명은 면역 크로마토그래피 원리를 이용하면서도 정성분석에 그치지 않고, 호르몬, 단백질, 효소 등과 같은 분석물질을 간편하고 정확하게 정량할 수 있는 새로운 정량방법에 관한 것이다.

인간의 질병 증세 및 진도에 대한 예측을 가능하게 하는 호르몬, 단백질, 그리고 미생물과 같은 지표물질들은 그 구조가 비교적 복잡하므로 이와 같은 분석물질들은 주로 항원-항체 반응을 이용한 면역분석법에 의해 측정된다. 이와 같은 검사는 전통적으로 특별한 기기가 갖추어진 임상 실험실 등에서 보통 수행되어왔으나, 최근 면역분석의 한 범주로써 병원이나 응급실 등 의료현장에서의 검사 그리고 가정에서 자가진단의 필요성이 급격히 요구되고 있다 (참고문헌: C. P. Price 등, Principles and Practice of Immunoassay,1997, Page 579-603, Macmillan Reference Ltd., London). 이를 위해 전문지식이나 복잡한 과정이 요구되지 않고 사용이 간편하며 수행시간이 짧은 면역분석 시스템의 고안이 시도되어 왔으며, 이러한 진단성능은 일반적으로 세공성 멤브레인을 감응단백질 (예: 항체)의 고정화모체로 사용하는 면역 크로마토그래피 방법에 의해 어느 정도 성취될 수 있었다 (참고문헌: R. Chen 등, 1987,Clin. Chem. Vol. 33, Page 1521-1525; M. P. A. Laitinen, 1996,Biosens. Bioelectron.,Vol. 11, 1207-1214; S. C. Lou 등, 1993,Clin. Chem.,Vol. 39, 619-624; S. H. Paek 등, 1999,Anal. Lett.,Vol. 32, 335-360). 분석물질이 포함된 시료를 멤브레인 스트립 하단으로부터 흡수시키면 세공을 통한 모세관현상에 의해 분석물질은 고정화된 감응단백질 층으로 운반되어 고체표면에서 분석물질과 감응단백질간의 부착반응이 야기되고 비결합된 성분들은 유체흐름에 의해 분리된다. 이와 같은 원리에 기초한 멤브레인 면역 크로마토그래피 기술은 유체의 측면흐름 (lateral flow)을 이용하여 반응성분들의 물질전달을 가속시킴으로써 분석물질의 측정 신속성과 단지 시료 첨가만으로 진단수행이 완료되는 1단계 측정의 간편성을 제공한다.

면역 크로마토그래피 분석을 수행하기 위한 면역스트립 모델시스템은 일반적으로 다음과 같은 3종류의 멤브레인 스트립을 사용하여 구성된다 (도 1의 가). 그 하단으로부터, (1) 시료첨가를 위한 유리섬유 멤브레인, (2) 분석물질에 대해 특이적으로 결합하는 감응단백질이 고정화된 니트로셀룰로우즈 (nitrocellulose, NC) 멤브레인, 그리고 (3) 흡수패드로 작용하는 셀룰로우즈 멤브레인으로 구성된다. 이와 같은 멤브레인 스트립들을 부분적으로 포개어 플라스틱 필름 상에 배열시킨 후 양면 테이프를 이용하여 고정시킨다. 분석과정을 살펴보면 첫째로, 감응단백질과 신호발생물질 (예: 금 콜로이드 입자, 효소, 유색 플라스틱 비드 등) 간 중합체를 유리섬유 멤브레인 상의 일정부위에 첨가한 후 분석물질을 포함하는 운반용액을 면역스트립 하단 끝으로부터 흡수시키면 분석물질은 모세관현상에 의해 유발된 유체의 흐름에 따라 스트립의 상부로 이동되다가 상기 중합체를 만나면 중합체 중 감응단백질과의 면역반응에 의해 결합된다 (도 1의 나). 운반용액이 계속 이동되어 니트로셀룰로오즈 멤브레인 상에 고정화된 감응단백질과 만나면 그 면역결합체는 고정화된 감응단백질 (이 감응단백질이 인지하는 항원분자상의 자리는 신호발생물질과 결합된 감응단백질이 인지하는 자리와 다름)과의 면역반응에 의해 포획되고 (도 1의 다) 포획되지 않은 성분들은 유체의 흐름에 따라 흡수패드로 작용하는 셀룰로우즈 멤브레인으로 이송되어 분리된다. 멤브레인 상의 일정지역에 포획된 샌드위치 결합체 (분석물질 분자를 중심으로 양편에 두 감응단백질 분자가 부착된 결합체)는 표지물질인 신호발생물질을 포함하므로 육안으로 확인 가능한 발색신호를 발생시킨다.

이와 같은 정성분석 형태는 단지 어떤 신체적 증상이나 병원균 감염 유무확인을 위해 수행될 수 있지만, 대부분의 임상시험 대상 지표물질의 경우 각 시료 내 포함된 성분의 농도 결정이 절대적으로 요구된다. 이러한 정량분석을 수행하기 위해 분석결과로 나타나는 발색신호를 기존의 광학적 신호변환 수단을 이용하여 광학밀도 (또는 색조밀도: optical density)로 전환할 수 있기는 하지만 전환방법의 번거로움과 측정의 민감도가 높지않은 단점때문에 실제 널리 이용되지 않고 있다.

따라서, 사용이 간편하며 수행시간이 짧은 면역 크로마토그래피 방법을 그대로 이용하면서, 광학밀도 측정법보다 간편하고 민감하게 분석물질을 정량할 수 있는 새로운 정량방법의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

이에 본 발명자는 상기 면역 크로마토그래피 방법에서 신호발생물질로서 일반적으로 사용되고 있는 금 콜로이드 입자가 전기전도성을 갖는 금속입자임에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 기존의 면역 크로마토그래피 방법의 장점을 그대로 살려서 보다 간편하고 정확한 새로운 정량방법을 제공하는데 있다. 다시 말하면 본 발명은면역 크로마토그래피 원리를 이용하면서도 정성분석에 그치지 않고, 호르몬, 단백질, 효소 등과 같은 분석물질을 간편하고 민감하게 정량할 수 있는 새로운 정량방법을 제공하는데 있다.

도 1은 면역 크로마토그래피 분석원리에 기초한 종래의 멤브레인 스트립 면역분석 시스템 및 이를 이용한 분석물질의 정성분석 원리를 보여주는 모식도이다.

도 2는 다양한 구조로 스크린 프린팅된 후막전극을 갖는 본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서를 보여주는 모식도이다.

도 3은 금속 콜로이드 표면에 흡착시킨 전도성고분자의 전자전달 촉진작용 기전에 관한 개념도이다.

도 4는 본 발명에 따르는 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서에 있어서, 전도성고분자로서 이용된 폴리아닐린의 농도 (0 ㎎/㎖, 실시예 8; 0.01 ㎎/㎖, 실시예 9; 0.1 ㎎/㎖, 실시예 10; 및 1 ㎎/㎖, 실시예 11)에 따른 전기전도도 및 그 신호/잡음비의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5은 본 발명에 따르는 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서 (실시예 10)를 이용한 분석에서 감응단백질-분석물질간 반응 후로부터 신호를 측정한 시점에 따른 전기전도도 값의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 6은 실시예 10에서 제조한 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서와 비교실시예 1에서 제조한 기존의 광학분석용 멤브레인 스트립 면역센서를 이용하여 인간 혈청 알부민의 표준용액에 대하여 각각 측정한 분석값 (도 6a)과 그 신호/잡음비 (도 6b)를 농도에 대하여 도시한 그래프이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1 : 분석물질

2 : 운반용액

3 : 결합체 중의 금속 콜로이드 입자

10 : 시료첨가용 멤브레인 패드

11 : 금속 콜로이드 입자와 감응단백질과의 결합체

12 : 전도성고분자

13 : 블로킹용 단백질

20 : 신호발생용 멤브레인 패드

21 : 고정화된 감응단백질

22 : 절연체

23 : 전극

24 : 전기 접점

30 : 흡수용 멤브레인 패드

본 발명은 (1) 시료첨가용 멤브레인 패드, (2) 분석물질에 대해 특이적으로 결합하는 감응단백질이 고정화되어 있으며 한쌍 이상의 전극이 스크린 프린팅되어 있는 신호발생용 멤브레인 패드, (3) 흡수용 멤브레인 패드, 그리고 (4) 신호발생 물질인 금속 콜로이드 입자와 감응단백질과의 중합체를 포함하는 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서에 관한 것이다.

상기의 시료첨가용 멤브레인 패드, 신호발생용 멤브레인 패드, 흡수용 멤브레인 패드 및 중합체는 기존의 면역 크로마토그래피 방법에서 사용되는 일반적인 것들이며 다만 신호발생용 멤브레인 패드에 전극이 스크린 프린팅되어 있는 것만이 상이하다.

상기 패드에 사용할 수 있는 재료는 각 패드의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 재료라도 이용될 수 있으며 그 의 대표적인 예로서는 시료첨가용 멤브레인 패드는 유리섬유 멤브레인을, 신호발생용 멤브레인 패드는 니트로셀룰로우즈 멤브레인를, 흡수용 멤브레인 패드는 셀룰로우즈 멤브레인을 사용할 수 있다.

상기 감응단백질은 분석물질과 특이적으로 반응하는 물질이며 그 예로서는 탐지항체, 효소, 수용체 등을 들 수 있다. 따라서 본 발명의 바이오센서는 항원-항체 반응에 기초한 면역반응시스템을 포함하여 효소반응과 특정 DNA를 탐지하는 핵산 접합반응을 이용한 효소센서 및 유전자 센서의 제작에 적용될 수 있다.

상기 신호발생용 멤브레인 패드에 고정화되어 있는 감응단백질과 상기 중합체 중의 감응단백질은 각각 동일 분석물질과 특이적으로 반응할 수 있는 분석물질에 대한 감응단백질이며 두 감응단백질이 반응하는 분석물질 상의 결합부위는 서로 상이하다.

상기의 금속 콜로이드 입자로서는 예를 들면 금 콜로이드 입자, 은 콜로이드 입자, 철 콜로이드 입자 등이 있으며, 바람직하게는 금 콜로이드 입자이다.

본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서에서 상기 중합체는, 시료첨가용 멤브레인 패드에 미리 건조상태로 첨가하여 바이오센서를 구성할 수도 있으며 또는 따로 용기에 포함시켰다가 분석직전에 첨가하여 사용할 수 있도록 구성할 수도 있다.

본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서에서 상기 중합체 중 감응단백질과 반응한 분석물질에 의해 이 중합체가, 바꿔말하면 금속 콜로이드 입자가 신호발생용 멤브레인 표면에 분포하게 되며 이 금속 콜로이드 입자의 밀도는 신호발생용 멤브레인 패드에 스크린 프린팅되어 있는 전극을 통하여 전기전도도 신호로 전환되는 것이다. 측정되는 전기전도도 신호는 배열된 금속 입자 농도 (즉, 분석물질 농도)에 비례하여 나타나게 된다.

본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서 신호발생용 멤브레인 패드 상에 전극을 스크린 프린팅시키는 방법은 기존의 스크린 프린팅 기술을 그대로 적용할 수 있다. 예를들어 구체적으로 설명하면, 멤브레인에 직접 또는 절연체 위에 전극재료 페이스트 (백금, 금, 은, 탄소 등)를 정해진 패턴의 스크린을 통해 프린팅하고 고온 (일반적으로, 100℃ 이상)에서 건조시킴을 반복하여 제조할 수 있다. 이때 신호발생용 멤브레인 패드에 고정화되는 감응단백질은 한쌍의 전극 사이에 위치시킨다. 그리고 전극을 절연체에 프린팅하여 사용할 경우에는 절연체를 멤브레인의 단면 또는 양면에 위치시킨 후 적절한 압력을 가하거나 부착시키거나 또는 테이프를 이용하여 멤브레인에 접착시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서에서, 전극패턴 또한 기존의 패턴을 어느 것이나 사용할 수 있으나 교차지(interdigitated) 구조가 투핑거(two-fingered) 구조에 비해 바람직하다. 이것은 마주하는 두 전극 간 표면적을 현저히 증가시켜 측정민감도를 증가시킬 수 있기 때문이다. 전극이 스크린 프린팅된 멤브레인 전극의 센서부위에 포획 감응단백질을 고정화함으로써 신호발생용 멤브레인 패드를 완성할 수 있다.

본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서에 적용할 수 있는 전극패턴을 구체적으로 예를들어 설명하면 다음과 같다.

도 2aa에 나타낸 것이 하나의 예이다. 신호발생용 멤브레인 패드 (20) 상에 전극 (23)이 스크린 프린팅되어 있으며, 전도도 측정용 장치와의 전기접촉 부위 즉 전기 접점 (24)은 멤브레인에 흡수되어 이동되는 수용액으로부터 절연된 절연체 (22) (예를들면 플라스틱 필름) 위에 형성시켜 신호발생용 멤브레인 패드 (20)와 같은 방향으로 전극의 상부에 위치시킨 것이다. 전기 접점 (24)은 전기전도도 측정시 측정장치의 센서와 전기적으로 연결시킬 수 있다.

다른 예로서는 도 2ab를 들 수 있는데, 제조된 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서와 전기전도도 측정장치와의 공간적 배열 호환성을 높이기 위하여 전기접점 (24)을 신호발생용 멤브레인 패드 (20), 바꿔말하면 바이오센서의 측면 (예를 들어 직각 방향으로)에 위치시킨 경우이다.

또 다른 예로서는 도 2b를 들 수 있다. 도 2aa 및 도 2ab와 같이 스크린 프린팅 된 전극에서는, 그 센서부위가 멤브레인 바깥표면에 형성되는 반면에 분석물질-감응단백질 반응은 멤브레인 세공 내부표면에서 일어나므로 반응된 결합체 중 단지 일부만이 전기전도도 신호발생에 기여하게 되는데 이러한 문제를 해결하기 위하여 한쌍의 전극을, 즉 음극과 양극을 따로 떼어내 멤브레인을 중심으로 각각 양편에 놓아 샌드위치 형태로 위치시킨 것이다. 이러한 샌드위치 형태의 전극 제조방법을 예를 들어 설명하면 다음과 같다:

첫번째 제조방법으로는, 플라스틱과 같은 절연체 상에 전극을 하나씩 각각 프린팅 한 후 고온에서 건조하여 전극을 제조하고 이와 같이 제조한 한쌍의 전극을 멤브레인을 중심으로 양편에 각각 샌드위치 형태로 위치시킬 수 있다. 여기에서 멤브레인과 전극 간 접촉이 불완전할 경우 저항이 증가하여 전도도를 측정할 수 없으므로 두 모체간에 적절한 압력을 가할 수 있도록 시스템을 고안하거나 혹은 테이프를 이용하여 접착부위에 전극을 스크린 프린팅 후 멤브레인에 붙이는 방법이 바람직하다.

두번째 제조방법으로는, 멤브레인의 양면에 각각 전극을 직접 프린팅하여 직접 샌드위치 형태로 위치시킬 수 있다. 이 경우 전극이 부분적으로 서로 맞닿아서 합선 (short circuit)되지 않도록 유의할 필요가 있다.

또 다른 예로서는 도 2c를 들 수 있다. 도 2b와 같은 샌드위치 형태의 전극을 동시에 여러 개를 위치시킨 것으로서, 2종류 이상의 분석물질에 대한 동시 측정시스템의 제작 시 여러 개의 센서를 함께 작은 공간에 배치시킬 수 있도록 한 것이다. 한쌍의 전극을 동일 평면위에 배열시키는 교차지 구조의 경우 합선되지 않도록 전극간 간격을 어느 정도 유지해야 하므로 각 센서 당 소요면적이 상당히 요구된다. 따라서 복수의 교차지 센서를 한 시스템 내에 설치시 신호발생용 멤브레인 패드의 길이가 매우 길어지므로 센서의 위치에 따라 분석물질과 고정화된 감응단백질 간 반응에 있어서 변화가 초래될 수 있다. 반면에, 샌드위치 형태로 배열시킨 전극의 경우 도 2c에 나타낸 바와 같이 한 쌍의 전극간 거리는 멤브레인 두께에 의해 결정되고 유지되므로 동일 평면 위에 전극을 최소한의 거리를 두고 근접되게 수직배열시킬 수 있다. 따라서 샌드위치 전극을 이용할 경우 분석물질-감응단백질간 반응에 대한 변이를 최소화시키면서 작은 공간의 신호발생용 멤브레인 패드 내에 다중센서를 설치할 수 있다. 이상에서 설명된 전극형식 이외에 멤브레인 전극의 형태와 배열은 매우 다양하게 고안될 수 있다.

신호발생용 멤브레인 패드의 감응단백질에 결합되지 않은 기타의 성분들은 액체의 흐름에 따라 계속 이동되어 흡수패드에 흡수되도록 고안되어 있다. 따라서흡수패드의 재질은 이러한 목적에 부합되는 것이라면 어느 것이라도 사용될 수 있다.

본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서에서 정량 신호를 발생시키는 금속 콜로이드 입자는 금속이므로 반응에 의해 신호발생용 멤브레인 패드 표면에 모인 금속 콜로이드 입자들을 따라 전기전도가 발생되고 그 신호는 배열된 금속입자 농도 (즉, 분석물질 농도)에 비례하여 증가하게 된다. 따라서 본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서는 기존의 광학기술을 이용한 면역크로마토그래피 방법에 비하여 상대적으로 뛰어난 장점들을 제공한다. 첫째로, 전기전도 회로 내에서의 분석물질-감응단백질간 반응은 금속 입자를 반복적으로 축적시켜 입자간 평균거리를 점진적으로 단축시키므로 전기전도도는 분석물질 농도에 정비례하여 지수적으로 증가한다 (참고문헌: A. Heller, 1990,Acc. Chem. Res.,Vol. 23, 128-134). 따라서 이와 같이 발생된 전기신호는 단지 발색에 의존하는 기존의 광학측정법에 의한 신호와 비교하여 증폭된다 (참고문헌: T. M. Swager, 1998,Chem. Res., Vol. 31, 201-207). 둘째로, 전기전도도는 거의 모든 실험실에서 보유하고 있는 일반적인 전도도 측정장치를 사용하여 측정될 수 있다. 이 장치는 비교적 안정하고 정확하게 전기전도도를 측정할 수 있으며 또한 가격이 상대적으로 저렴하고 운용이 간단할 뿐만 아니라 장치크기의 소형화도 가능하다 (R. T. da Rocha 등, 1997,J. Chem. Edu.,Vol. 74, 572-574). 마지막으로, 금속 콜로이드 입자 중 특히 금과 같은 경우 그 발색을 육안으로 확인할 수 있으므로 정량측정 후 그 결과를 추후 자료로써 영구 보존할 수도 있다.

그런데 크로마토그래피 분석 방법에서 신호발생원인 감응단백질-금속 결합체의 제조 시, 금속 입자 표면에서 비특이적 부착을 최소화하기 위해 감응단백질을 금속 입자 표면에 결합시킨 후 그 잔여표면을 단백질분자로 블로킹 처리하게 된다. 이 상태의 금속 입자 외부는 감응단백질 그리고 블로킹용 단백질 (예를 들면 우혈청 알부민, 카제인, 젤라틴 등)과 같은 이온성 고분자 층에 의해 둘러싸이게 되므로 이 단백질 층은 전도성 매개체인 금속 입자들 간의 전기전도 기작인 전자도약 (electron hopping) 과정을 방해한다 (G. Cavelier, 1995,Bioelectroch. Bioener. Vol. 40, Page 197-213; A. Heller, 1990,Acc. Chem. Res.,Vol. 23, 128-134). 단백질분자는 무정형 반도체와 유사한 전기적 성질을 지니고 이 분자 층은 그 두께가 일반적으로 효과적인 전자 도약거리 (2~2.5 nm)를 초과하므로 전기전도도에 대해 장벽으로 작용한다. 이와 같은 저항을 감소시키고자 금속 입자 표면으로부터 외부로 확장되고 상대적으로 개방된 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol) 분자를 이용하여 블로킹을 수행할 수 있으며, 이와 같은 조건하에서 특정/비특정 신호 비는 이온성 단백질을 사용한 경우와 비교시 증가한다. 그러나 전도도에 대해 저항으로 작용할 수 있는 고분자 층이 여전히 금속 입자표면에 존재하므로 이러한 문제점을 극복할 수 있는 특별한 방법의 개발이 요구된다.

따라서 본 발명의 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서도 그 금속성 콜로이드 입자 표면에 블로킹용 단백질을 흡착시켜 사용할 수 있을 뿐만아니라 또한 그 금속성 콜로이드 입자 표면에 블로킹용 단백질을 흡착시키기 전에 전도성 고분자를먼저 흡착시켜 사용할 수도 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 블로킹용 단백질로서는 상기에서 기술된 바와 같이 우혈청 알부민, 카제인, 젤라틴 등을 예로 들 수 있으며 전도성 고분자로서는 폴리아닐린 (polyaniline), 폴리피롤 (polypyrrole), 폴리티오펜 (polythiophene), 폴리파라페닐렌 (poly(p-phenylene)) 등을 들 수 있다. 상기 전도성 고분자들 중 본 발명에서 가장 바람직한 것은 폴리아닐린이다. 입자표면에 존재하는 전도성고분자는 근접한 금속 콜로이드 입자들을 전기적으로 가교시키거나 적어도 서로를 더욱 근접시켜 전하전달상태를 현저히 향상시킬 수 있다. 상기의 전도성 고분자는 전도성이 높고 산화/환원에 의한 전자전달속도가 매우 높기 때문에 에너지 저장용 신소재, 전기 변색성 소자, 전기화학 감지기, 전자기 차폐소재, 축전기 (capacitor), 이온 게이트 (ion gate) 등으로의 응용과 관련하여 활발히 연구되고 있는 유기 기능성 물질이다.

다른 전도도 조절방법으로, 고분자 사슬 내 에너지 차이 (gap) 사이에 존재하는 전자 운반체 (carrier) 혹은 수용체 (electron acceptor)를 화학 처리하여 카르보 양이온 (carbocation)이나 카르보 음이온 (carboanion)을 도입시키는 도핑법이 사용될 수 있다 (참고문헌: 김성철, 고분자공학 I, 1994, Page 333-400, 희중당, 서울).

상기 전도성고분자들은 높은 전기전도도를 나타내기는 하지만 고분자이기 때문에 수용성이 낮아서 가공시 제한점이 된다. 따라서 이러한 물성을 향상시키기 위하여 다음의 방법들 중 하나를 사용할 수 있다.

1) 이온성 염을 이용하여 도핑하는 방법. 이온성 염의 예로서는 LiCl,LiClO₄, LiBF₄등을 들 수 있다.

2) 1)의 방법을 적용시킴과 동시에 레독스 (redox) 분자를 전도성고분자에 화학결합시키는 방법. 레독스 분자의 예로서는 페로센 (ferrocene), 루테늄 (ruthenium) 등을 들 수 있다.

3) 전도성고분자에 대한 고분자 반대이온 (counterion)을 첨가해 주는 방법. 예를 들면 폴리아닐린의 반대이온으로서 폴리스티렌 설폰화물 (sulfonated polystyrene) 을 이용하는 것이다.

따라서, 신호발생용 멤브레인 패드 (20)에 고정화된 감응단백질 (21)에 분석물질 (1)과 함께 포획되어 신호를 발생시키는 금속 콜로이드 입자와 감응단백질간의 중합체는 다음과 같은 방법으로 제조하는 것이 바람직하다(도 3 참조). 먼저 금속 콜로이드 입자표면에 감응단백질을 화학반응 혹은 물리적 흡착 방법으로 중합시킨 후 선택된 전도성고분자를 순차적으로 부착시킬 수 있다. 중합체 형성시, 금속입자-감응단백질간 중합체 용액에 전도성고분자를 첨가하면 분자들은 고체표면으로 확산되고 잔여부위에 흡착되어 규칙적으로 배열된 고분자 층을 형성한다 (참고문헌: J. H. Cheung 등, 1997,Macromolecules,Vol. 30, 2712-2716). 마지막으로 최종 금속 입자 잔여표면을 일반적인 방법에 따라 블로킹용 단백질로 블로킹시킨다.

전도성고분자 농도가 너무 높을 경우 한 고분자 가닥에 의해 금속 입자간에 교차결합이 일어날 수 있고 결국 응집현상을 초래할 수 있으므로 그 신호발생 기능에 대해 고분자 농도의 최적화가 요구된다. 폴리아닐린의 경우 0.01~1 ㎎/㎖ 가 바람직하다.

본 발명에서 고안한 전기전도도 측정용 바이오센서를 이용하여 분석 시 그 측정성능은 사용된 구성성분의 질적 수준뿐만 아니라 분석물질이 함유된 시료의 물리적 (예를 들면 온도: A. de Diego 등, 1997,Electrochim. Acta, Vol. 42, 1449-1456; O. Quadrat 등, 1998,Synthetic Met., Vol. 97, 37-42) 그리고 화학적 조건 (예를 들면 이온의 종류 및 농도: A. de Diego 등, 1997,Electrochim. Acta, Vol. 42, 1449-1456; 및 T. A. Sergeyeva 등, 1998,Biosens. Bioelectron., Vol. 13, 359-369)에 의해 영향을 받게 된다. 측정 시 온도 변화는 탐지기의 전자회로 내에 설정된 보상기능에 의해 비교적 간단하게 보정될 수 있지만, 시료 혹은 운반용액 내에 포함된 다양한 이온들의 전도도에 대한 영향은 각각 다르고 또한 복합적으로 작용할 수 있으므로 이를 예측하고 보정하는 작업은 매우 어렵다. 따라서 시료운반용액의 이온농도 및 pH 등 화학적 조성은 잡음 대비 신호 비에 대해 적절히 최적화 되어야 한다.

운반용액의 pH는 중성 산성도 (pH 5~8) 를 유지하는 것이 바람직하며 따라서 완충용액을 이용하는 방법을 취할 수 있다. 운반용액으로 사용할 수 있는 완충용액으로는 예를들면 인산 완충용액 (phosphate buffer), 트리스 완충용액 (tris buffer) 등이 있다. 이때 완충용액의 농도는 잡음을 억제하기 위해 단백질 용해에 요구되는 최소 범위 내에서 선택된다. 바람직한 범위는 5~50 mM이다.

그러나 중성 산성도는 항원-항체 반응에 대해 최적 조건을 제공하는 반면에산성조건에서 도핑상태를 유지하는 폴리아닐린 (참고문헌: J.-C. Chiang 등, 1986,Synthetic Met., Vol. 13, 193-205; J. Stejskal 등, 1996,Polymer, Vol. 37, 367-369)에 대해서는 적절치 않다. 따라서 바이오반응과 전도성고분자에 대해 각각 다른 최적 산성도 조건을 제공하기 위해 항원-항체 반응을 중성에서 수행한 후 pH를 변화시켜 산성 상태 (예: pH 2)에서 전기전도도 신호를 측정하는 방법을 채택하여 정량분석의 정확도 및 정밀도를 높일 수도 있다.

한편, 분석물질이 포함된 시료는 전기전도도 측정을 방해하는 이온들을 함유할 수 있다. 이와 같은 잠재적인 문제점은 신호측정 부위가 2개 이상인 다중센서 (도 2c)를 선택하여 해결할 수 있다. 한 개 혹은 그 이상의 센서는 분석물질-감응단백질간 반응을 이용하여 단수 혹은 복수의 분석물질에 각각 비례한 신호를 측정하고 나머지 한 부위는 이온효과 등에 의해 발생되는 잡음을 감지하여 측정된 신호로부터 잡음을 제외함으로써 시료에 의한 비특정 방해효과를 제거한다.

본 발명의 기본 원리는 분석물질-감응단백질간 특정한 반응에 기초하며 이 중 특히 항원-항체반응은 선별된 항체의 특성상 분석특이성이 높고 또한 일반적으로 반응친화력이 매우 강해서 극히 낮은 농도로 존재하는 분석물질을 탐지할 수 있는 민감성을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 동일한 센서시스템 내의 반응성분 (즉, 특이항체, 효소, 수용체 등)들을 단지 교체함으로써 다른 분석물질의 측정에 적용할 수 있는 일반성을 제공하므로 질병 및 신체증세의 지표물질로 이용되는 생화학성분 (예: 호르몬, 단백질, 세포 등)의 정량분석 뿐만 아니라 식품 위해인자 (예: 농약, 항생제, 식중독균 등)와 환경호르몬 (예: 제초제, 살충제, 다이옥신류 등) 등 거의 무제한으로 분석물질의 탐지에 적용될 수 있다.

다음의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 보다 구체적으로 설명하고 그 유용성을 제시하고자 구체적인 예를 들어 기술한 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 결코 아니다. 분석물질은 인간 혈청 알부민, 감응단백질은 인간 혈청 알부민에 대한 항체, 그리고 금속 콜로이드 입자는 금 콜로이드 입자로 선택하여 제조되는 신부전증 진단시 뇨 중 인간 혈청 알부민 농도를 분석하는데 적용할 수 있는 멤브레인 스트립 바이오센서에 대하여 예시한다.

실험 재료

이하 실시예 및 실험예에서 사용된 재료 및 그 구입처는 다음과 같다. 인간혈청 알부민 (human serum albumin, HSA), 염화금 (gold chloride, HAuCl4), 글루타르알데히드 (glutaraldehyde), 카제인 (casein: sodium salt form, extracted from milk) 및 CNBr 반응기를 갖는 세파로스 (Sepharose) 4B는 Sigma 사 (St. Louis, MO, 미국)로부터 구입되었다. HSA에 대해 특이한 염소 항혈청 (IgG fraction, 8.3 ㎎/㎖), 아닐린, 과황산암모늄 (ammonium persulfate, APS), 염화리튬 (LiCl), 그리고 은 페이스트 (silver paste)는 각각 International Enzymes사 (Fallbrook, CA, 미국), Fluka 사 (스위스), Yakuri Pure Chemicals 사 (일본),Junsei Chemical 사 (일본), 그리고 서울화학연구소로부터 공급받았다. 니트로셀룰로우즈(NC) 멤브레인 (5 μm pore size, with polyester backing)은 Millipore 사 (Bedford, MA, 미국)로부터, 유리섬유 멤브레인 (G6 grade)은 Fisher Scientific 사 (Springfield, NJ, 미국), 그리고 셀룰로우즈 멤브레인 (qualitative #1 and 3MM chromatography grade)은 Whatman 사 (싱가포르)로부터 구입되었다. 20 nm의 입자크기의 금 콜로이드 입자는 구연산나크륨 방법 (R. M. Albrecht 등, Immunocytochemistry: A Practical Approach, 1993, Page 151-176, Oxford University Press, Oxford; J. Roth, Techniques in Immunocytochemistry, Vol. 2, 1983, Page 217-284, Academic Press, London)에 의해 합성되었다. 명시하지 않은 다른 시약들은 모두 분석용 등급으로 선택되었으며, 완충용액 등 모든 용액은 0.1 μS/cm 이하의 전기전도도를 나타내는 탈이온수를 이용하여 제조되었다.

실시예 1. 감응단백질 (인간 혈청 알부민에 대한 항체)의 정제

인간 혈청 알부민 (HSA) 특이 항혈청을 정제하기 위해 제조사로부터 제공된 과정에 따라 CNBr 반응기를 갖는 세파로스 4B 젤 상에 HSA를 고정화하였다. 제조된 젤을 유리칼럼 (11 x 200 mm, 젤 부피 7 ㎖) 내에 채우고, 산성과 염기성 용액으로 3번 순회 반복하여 세척하였다. 140 mM NaCl이 포함된 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.4, PBS)을 젤 칼럼에 가하여 젤 팽창에 대해 평형에 도달시킨 후, HSA 특이 항혈청 3 ㎖를 칼럼에 주입하였다. 정제공정은 액체 크로마토그래피 시스템 (Model 210, Isco, Lincoln, NE, 미국)을 이용하여 수행하였다. 젤 상에 고정화된 HSA와결합하지 않은 미반응 단백질은 15 ㎖/h의 속도로 유출되는 인산완충액으로 세척하고, 반응한 HSA 특정항체는 0.1 M 글리신 (glycine) 완충용액 (pH 3.0)을 사용하여 유출시켰다. 수집된 항체는 50 mM 초산 완충용액 (pH 4.0)과 10 mM 인산 완충용액 (pH 6.0) 그리고 인산완충액 내에서 각각 1~2시간 동안 순차적으로 투석시켰다. 이와 같이 정제된 항체용액은 한외여과 (ultrafiltration: Amicon, Beverly, MA, 미국) 과정으로 농축시킨 후 브래드포드 (Bradford) 방법을 이용하여 정량하고 (M. M. Bradford, 1976, Anal. Biochem. Vol. 72, Page 248-254), 급속 냉동 후 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다.

실시예 2. 항체의 고정화

실시예 1에서 정제된 HSA 항체를 다음과 같은 방법으로 신호발생용 멤브레인 패드에 화학적으로 고정화시켰다. 니트로셀룰로우스 멤브레인 스트립 (5 x 20 mm)을 신호발생용 멤브레인 패드로 이용하였다.

멤브레인을 10% (v/v) 메탄올로 30분 동안 처리한 후 공기 중에서 건조하였다. 그 후 멤브레인을 0.5%(v/v) 글루타르알데히드 용액에 담가 표면을 1시간 동안 처리한 후 탈이온수로 철저히 세척하였다. 건조시킨 후 멤브레인 상의 일정지역에 10 mM 인산 완충용액으로 희석한 항체 용액 (0.5 ㎎/㎖) 2.5 μL를 첨가한 후 100% 습도를 유지할 수 있는 밀폐된 상자 안에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 잔여 반응기의 불활성화 및 고체표면의 블로킹은 0.1% (v/v) 트윈-20을 포함하는 100 mM 트리스 완충용액 (pH 7.6) 내에서 45분 동안 수행하고 다시 건조하였다.

실시예 3. 금속 콜로이드 입자-감응단백질 중합체 제조

실시예 1에서 정제된 항체에 발색물질로 표지하기 위해 항체와 금 콜로이드 입자간 중합체 형성을 수행하였다 (S. H. Paek 등, 1999,Anal. Lett., Vol. 32, 335-360). 항체용액을 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.4)으로 투석시킨 후 탈이온수를 이용하여 150 μg/㎖로 희석하였다. 이 수용액 (800 μL)은 pH 9.5로 조절된 금 용액 (8 ㎖)과 혼합하고 30분 동안 반응시켰다. 금 입자의 잔여표면은 5% 카제인이 포함된 0.1 M 트리스 완충용액 (pH 7.6, 5% Casein-Tris) 1 ㎖를 가한 후 30분 동안 블로킹시켰다. 반응액은 원심분리된 후 상층액은 제거하고, 0.5 % 카제인-트리스를 다시 첨가하였다. 원심분리하여 금 입자를 다시 침전시키고 상층액을 제거하였다. 최종부피는 0.5% 카제인-트리스를 첨가하여 0.4 ㎖로 조절하였으며, 형성된 중합체는 사용시까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 4~6. 전도성고분자 도입시킨 금속 콜로이드 입자-감응단백질 중합체의 제조

먼저 바람직한 전기화학적 신호발생원을 제조하기 위해 도입할 전도성고분자인 폴리아닐린을 합성하였다. 과황산암모늄 (APS)의 존재 하에서 아닐린 단량체를 산화시키는 방법을 이용하였다 (X.-L. Wei 등, 1996, JACS, Vol. 118, 2545~2555; X. Wei 등, 1995, Synth. Met., Vol. 74, 123~125). 1 M HCl 용액으로 희석된 아닐린 (0.4 M)과 APS (0.2 mM)를 혼합한 후 실온에서 30분간 반응시켜 고분자물질을생성한 후 여과하였다. 이 여과물에 페닐히드라진 (phenylhydrazine) 용액 5 ㎖/g 을 가하여 환원시킨 후 아황산 성분이 포함된 황산 (fuming sulfonic acid) 20 ㎖/g을 첨가하여 5℃에서 1시간 동안 황화반응시킴으로써 황화 폴리아닐린 (sulfonated polyaniline)을 합성하였다. 이 산물을 0℃에서 침전시킨 후 여과하였고 순차적으로 건조하여 원하는 농도로 용해시켰다.

실시예 3에서와 동일한 조건하에서 금 콜로이드-항체 중합체를 형성시킨 후, 폴리아닐린 수용액을 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.4)으로 희석시켜 0.01, 0.1 및 1 ㎎/㎖ 농도로 제조하여 각각 첨가한 후 30분 동안 반응시켰다. 금 콜로이드-항체 중합체의 최종용액에 LiCl (0.001 to 0.1% (w/v); 0.0236 ~ 23.6 mM)을 첨가한 것을 제외하면 블로킹과 중합체의 회수과정은 실시예 3에서 제시된 중합체 제조법과 동일하였다. 이렇게 하여 전도성고분자 폴리아닐린을 0.01, 0.1 및 1 ㎎/㎖ 농도로 각각 도입시킨 금속 콜로이드 입자-감응단백질 중합체들 (실시예 4, 5 및 6)을 제조하였다.

실시예 7. 항체가 고정화된 후막전극 (thick-film electrode)의 제조

전기화학 센서형 바이오스트립을 고안하기 위해 니트로셀룰로우스 멤브레인을 지지체로 사용하는 후막전극을 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

플라스틱으로 뒷면이 코팅된 멤브레인 스트립 (5 x 20 mm)을 탈이온수로 3번 세척한 후 공기 중에서 건조하였다. 준비된 멤브레인 상에 2 전극계 구조로 패턴화된 스크린을 통해 프린팅 방법으로 은 페이스트를 입힌 후 3분 동안 100℃에서 건조시켰고, 이와 동일한 과정을 3번 반복 수행하여 멤브레인 스트립 전극 (교차지 구조의 2 x 3 디지트 패턴, 센서부위 4 x 5 mm; 도 2aa)을 제조하였다. 니트로셀룰로우스 멤브레인의 교차지 전극부위에 실시예 1에서 정제한 항체를 실시예 2와 같은 화학적 방법에 의해 고정화하였다.

전극 상의 전기 접촉부분을 마련하기 위해, 은 페이스트를 플라스틱 (일반 복사기용 PP-3300, 5 x 2.5 mm) 상에 투핑거 (two-finger) 구조로 스크린프린팅 한 후 3분 동안 100℃에서 건조하였다. 이 플라스틱 접점부위를 항체가 고정화된 멤브레인 전극 상단에 양면 테이프를 이용하여 적재시킨 후 그 두 부품의 사이에 은 페이스트를 가하여 전기적으로 연결시킴으로써 후막전극을 완성하였다.

실시예 8. 전기화학 멤브레인 바이오 센서 시스템 구성 I

본 발명에 따르는 전기화학 멤브레인 바이오 센서 시스템을 구성하였다. 그 구조는 도 2aa에 나타낸 것과 같으며 시료첨가용 멤브레인 패드 (10)로서는 0.1% (v/v) 트윈-20으로 처리된 유리섬유 멤브레인 (5 x 25 mm)을, 신호발생용 멤브레인 패드 (20)로서는 니트로셀룰로우스 멤브레인 (5 x 20 mm)을, 흡수용 멤브레인 패드 (30)로서는 셀룰로우즈 멤브레인 (5 x 35 mm)을 이용하였다. 상기 신호발생용 멤브레인 패드에는 실시예 7와 같은 방법으로 전극을 스크린 프린팅시키고 실시예 2과 같은 방법으로 항체를 두 전극 사이에 고정화시켰다.

실시예 3에서 제조한 금-항체 중합체 용액 5 μL를, 유리섬유 멤브레인의 하단으로부터 15 mm 지역에 첨가한 후 실온에서 건조하였다. 각 멤브레인 스트립들은부분적으로 포개어 구성하였으며 양면 테이프를 이용하여 플라스틱 판에 접착시켰다.

실시예 9~11. 전기화학 멤브레인 바이오 센서 시스템 구성 II

실시예 3의 중합체 대신에 실시예 4, 5 및 6에서 제조한 폴리아닐린 도입 중합체를 각각 사용한 것을 제외하고는 실시예 8과 동일한 방법으로 본 발명에 따르는 전기화학 멤브레인 바이오 센서 시스템을 구성하였다.

비교실시예 1. 광학 분석용 멤브레인 스트립 면역 센서 시스템 구성

비교예로서 육안 판별이나 색조밀도를 측정하는 기존의 멤브레인 크로마토그래피 분석시스템을 구성하였다. 그 구조는 도 1에 나타낸 것과 같으며 시료첨가용 멤브레인 패드 (10)로서는 0.1% (v/v) 트윈-20으로 처리된 유리섬유 멤브레인 (5 x 25 mm)을, 신호발생용 멤브레인 패드 (20)로서는 니트로셀룰로우스 멤브레인 (5 x 20 mm)을, 흡수용 멤브레인 패드 (30)로서는 셀룰로우즈 멤브레인 (5 x 35 mm)을 이용하였으며 실시예 2과 같은 방법으로 항체를 신호발생용 멤브레인 패드에 고정화시켰다.

실시예 3에서 제조한 금-항체 중합체 용액 5 μL를, 유리섬유 멤브레인의 하단으로부터 15 mm 지역에 첨가한 후 실온에서 건조하였다. 각 멤브레인 스트립들은 부분적으로 포개어 구성하였으며 양면 테이프를 이용하여 플라스틱 판에 접착시켰다.

실험예 1. 전기화학 측정장치를 이용한 분석 I: 폴리아닐린의 효과 실험

본 발명의 전기화학 분석시스템의 인간혈청 알부민 (HSA) 표준농도에 대한 응답을 얻기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다 (도 1 참조).

HSA 표준용액을 0.01% (v/v) 트윈-20이 포함된 10 mM 트리스 완충용액으로 희석하여 10 ㎍/㎖로 제조한 후 각 농도별로 150 μL 씩 마이크로웰 내에 분주한 후 실시예 8 (폴리아닐린 도입 농도 0 ㎎/㎖), 실시예 9 (폴리아닐린 도입 농도 0.01 ㎎/㎖), 실시예 10 (폴리아닐린 도입 농도 0.1 ㎎/㎖) 및 실시예 11 (폴리아닐린 도입농도 1 ㎎/㎖)에서 제조된 바이오스트립 센서들을 각각 수직으로 담가 세웠다. 스트립 하단으로부터 수용액을 약 6분 동안 흡수시킨 후 전기전도도 측정법을 이용하여 농도응답을 구하였다. 측정수행 전에 전도도 미터 (Model 150, Orion Corp., Beverly, MA, 미국)의 보정은 니트로셀룰로우스 멤브레인 전극과 동일한 조건하에서 스크린 프린팅 된 플라스틱 전극을 사용하여 수행되었다. 미터는 제조된 플라스틱 전극을 0.01 M KCl 표준용액 (전도도: 1413 μS/cm, 용해된 총량을 NaCl을 기준으로 환산한 농도: 692 ppm)에 담가 기기에 의해 1차 자동 보정되었고, 완전히 세척 후 전극을 다시 탈이온수에 담가 전도도 값이 0이 나오도록 2차 보정되었다. 이러한 조건하에서 전극상수 (cell constant)는 0.475~1 cm^-1범위에 분포되는 것으로 나타났고, 이와 같이 보정된 미터를 이용하여 분석물질 농도에 따른 바이오스트립 센서의 응답을 전도도 변화로 측정하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 금 입자에 중합된 폴리아닐린 농도가 증가함에 따라 전도도 신호는 그 농도에 비례하여 증가하였지만 0.1 ㎎/㎖ 이상의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 보였다. 특히 고농도 영역에서 금 입자와 중합 시 수용액의 색이 붉은색에서 보라색으로 변화하였고 이것은 폴리아닐린 분자가 금 입자들을 교차결합 시킴으로써 응집현상이 초래되었기 때문이다. 반면에 배경신호 즉 잡음은 사용된 전도성고분자 농도에 관계없이 일정한 것으로 나타났다. 결과적으로 잡음 대비 신호 비는 폴리아닐린 농도 0.1 ㎎/㎖ (실시예 10)에서 최대값에 도달하였다.

실험예 2. 전기화학 측정장치를 이용한 분석 II: 측정시간의 효과 실험

실시예 10에서 제조한 전기화학 멤브레인 바이오 센서에 대하여 실험예 1에서와 같은 방법으로 분석하였다. 여기에서 면역반응 후의 최적의 전기신호 측정시간을 확인하고자 전압을 공급한 후의 초기 일시적인 전기전도도의 변화를 시간에 따라 기록하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

두 전극사이에 전압을 가하면 전극 표면에서 전기화학 반응이 초기에 발생하였으며 포획된 중합체 (즉 금)의 양에 따라 몇 초에서 약 1분 동안 전기전도도의 불안정 상태가 지속되었다. 그러나 그 신호는 곧 정상상태에 도달하였고 전기전도도 값이 측정장치로부터 출력되었다. 그 후 전도도 수치는 점차 감소하였는데 이러한 현상은 수용액 (분리용액)에 젖었던 멤브레인 스트립이 공기 중에서 건조됨에 따라 일어나는 것으로 판단된다 (참고문헌: J.-C. Chiang 등, 1986,SyntheticMet., Vol. 13, 193-205). 따라서 실제 측정시에는 30~60초 정도 측정하여 일정한 값을 읽으면 될 것으로 판단된다.

실험예 3. 전기화학 측정장치를 이용한 분석 Ⅲ: 전기화학 분석성능 평가

실시예 10에서 제조한 전기화학 멤브레인 바이오 센서의 HSA 표준용액에 대한 분석능을 비교실시예 1에서 제조한 광학측정용 멤브레인 면역 센서의 HSA 표준용액에 대한 분석능과 비교하여 평가하였다.

HSA 표준용액은 0.01% (v/v) 트윈-20이 포함된 10 mM 트리스 완충용액으로 희석하여 0.01, 0.1, 1, 2.5, 5, 10 및 50 ㎍/㎖ 로 각각 제조한 후 각 농도별로 150 μL 씩 마이크로웰 내에 분주하여 실험하였다.

실시예 10에서 제조한 전기화학 멤브레인 바이오 센서를 이용한 측정방법은 측정시간을 60초 정도로 하여 일정한 값을 취한 것을 제외하고는 실험예 1과 동일하게 하였다.

비교실시예 1에서 제조한 광학측정용 멤브레인 면역 센서를 이용한 측정에서는, HSA 표준용액에 대한 농도응답으로 발생된 발색신호를 스캐닝 광학측정방법으로 측정하였다. 먼저 0.01% (v/v) 트윈-20를 포함하는 10 mM 트리스 용액을 이용하여 HSA 표준용액을 제조하고 각 농도별로 150 μL 씩 마이크로웰 (microwell)에 분주하였다. 비교실시예 1에서 제조된 멤브레인 스트립 면역센서의 하단을 각 마이크로웰 내에 수직으로 담가 위치시킨 후 수용액을 약 6분에 걸쳐 모세관현상에 의해 스트립 내부로 흡수시키고, 항체가 고정화된 영역에서 발색된 신호를 정량적으로결정하기 위해 스캐너 (HP ScanJet 6100C, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, 미국)를 이용하였다. 발색된 스트립을 스캐닝 한 다음 컴퓨터에 내장된 스캐닝 보오드 (board)와 소프트웨어 (Biomed Instruments, 미국)를 이용하여 멤브레인 이미지를 포착하였다. 포착된 이미지 상의 발색부분은 이미지 분석프로그램 (Multianalyst version 1.1, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, 미국)을 이용하여 발색부분이 모두 포함되도록 선택한 후 발색세기에 비례하는 적분치인 광학밀도 (optical density)로 전환시켰다.

그 결과는 도 6에 나타내었다. 먼저 도 6a는 측정된 전기전도도 및 광학밀도를 나타낸 것인데, 상기의 두 상이한 신호발생체계로부터의 각 신호는 후크효과 (분석물질 고농도 영역에서 신호가 감소하는 효과: S. A. Fernando, 1992,J. Immunol. Meth., Vol. 151, 67-86)가 나타나기 전 분석물질 농도범위에서 그 농도에 정비례하여 공히 증가하는 것으로 나타났지만 농도응답곡선의 형태에 있어서 매우 상이하였다. 후크영역을 제외한 반 로그 도식 (semi-log plot; 참고문헌: J. H. Peterman, Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, 1991, Page 47-65, CRC Press, London)에서 광학신호는 기존의 응답곡선 형태인 S자형 (sigmoidal) 곡선을 보인 반면에 전기화학신호는 특이하게 지수곡선의 패턴을 나타내었다.

또한 서로 다른 신호발생체계의 성능을 비교하기 위해, 농도응답 신호들을 잡음 대비 신호 비로 전환하여 분석물질 농도에 대해 도시하였다 (도 6b). 전기전도도 신호로부터 구한 신호/잡음비 수치는 광학밀도로부터 구한 것과 비교하여 분석물질 농도 전 범위에 걸쳐 높았을 뿐만아니라 사용된 실험조건 하에서 최대 2.3배까지 증가하였다.

이 결과로부터 전기화학신호 측정 시 지수형태의 농도응답이 더욱 뚜렷하게 나타났을 뿐만 아니라 신호증폭 효과도 확인되었다.

본 발명은 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서는 발색을 색조밀도로 전환하는 기존의 광학기술과 비교하여 잡음 대비 신호 비로써 대표될 수 있는 측정민감도를 현저히 증가시켰을 뿐만 아니라 그 전기전도도 신호를 측정하기 위해 일반적으로 보급된 저 가격대의 전도도 미터를 사용할 수 있는 장점을 제공한다. 부수적으로, 정량분석 후 발색된 멤브레인 스트립은 임상자료로써 장기간 보관될 수 있다.

Claims

(1) 시료첨가용 멤브레인 패드, (2) 분석물질에 대해 특이적으로 결합하는 감응단백질이 고정화되어 있으며 한쌍 이상의 전극이 스크린 프린팅되어 있는 신호발생용 멤브레인 패드, (3) 흡수용 멤브레인 패드, 그리고 (4) 신호발생 물질인 금속 콜로이드 입자와 감응단백질과의 중합체를 포함하는 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기의 시료첨가용 멤브레인 패드가 유리섬유 멤브레인 패드, 신호발생용 멤브레인 패드는 니트로셀룰로우즈 멤브레인 패드 그리고 흡수용 멤브레인 패드는 셀룰로우즈 멤브레인 패드인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기의 감응단백질이 분석물질과 특이적으로 반응하는 항체, 효소, 또는 수용체인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기의 금속 콜로이드 입자가 금 콜로이드 입자, 은 콜로이드 입자 또는 철 콜로이드 입자인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기의 전극이 절연체 위에 스크린 프린팅된 것인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기의 전극이 백금 페이스트, 금 페이스트, 은 페이스트, 탄소 페이스트로 스크린 프린팅된 것인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기의 전극이 교차지 전극인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기 전극의 측정장치와의 전기접점이 신호발생용 멤브레인 패드의 측면에 위치시킨 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기 전극의 음극과 양극이 각각 신호발생용 멤브레인 패드를 중심으로 각각 양편에 위치시켜 샌드위치 형태로 된 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 9항에 있어서, 상기 전극의 음극과 양극이 두 쌍 이상으로 존재하여 두 종류 이상의 분석물질을 동시에 측정할 수 있도록 된 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기의 금속 콜로이드 입자와 감응단백질과의 중합체가 금속 콜로이드 입자에 먼저 감응단백질을 중합시키고 전도성 고분자를 순차적으로 부착시킨 후 금속 콜로이드 입자의 남은 표면에 블로킹용 단백질을 흡착시켜 제조된 것인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 11항에 있어서, 상기 전도성 고분자가 폴리아닐린, 폴리피롤, 폴리티오펜, 또는 폴리파라페닐렌이고, 상기 블로킹용 단백질이 우혈청 알부민, 카제인 또는 젤라틴인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.
제 11항에 있어서, 상기 전도성 고분자가 다음 중 어느 하나의 방법으로 처리된 것인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서:

1) 이온성 염을 이용하여 도핑하는 방법.

2) 1)의 방법을 적용시킴과 동시에 레독스 분자를 전도성고분자에 화학결합시키는 방법.

3) 전도성고분자에 대한 고분자 반대이온을 첨가해 주는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 이온성 염이 LiCl, LiClO₄, 또는 LiBF₄이고, 상기 레독스 분자가 페로센, 또는 루테늄이고, 반대이온이 폴리스티렌 설폰화물인 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서.