KR20010051915A

KR20010051915A - 유전자 ｓｕｃＣ 및 ｓｕｃＤ를 암호화하는 신규한뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR20010051915A
Application number: KR1020000070226A
Authority: KR
Inventors: 뫼켈베티나; 페페를레발터; 막스아힘
Original assignee: 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2001-06-25
Also published as: CN1298019A; HUP0004715A2; MX223007B; SK17352000A3; HU0004715D0; ID28476A; EP1103611A1; PL344145A1; MXPA00011289A; BR0005608A; JP2001190290A; CA2324496A1; DE19956686A1; AU7183700A; ZA200006884B; US6623946B1

Abstract

본 발명은

a) 서열 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

b) 서열 3의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

c) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

d) 서열 3의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

e) a), b), c) 또는 d)의 폴리뉴클레오타이드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오타이드, 및

f) a), b), c), d) 또는 e)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 연속적인 뉴클레오타이드 15개 이상을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 그룹으로부터 선택된, 유전자 sucC 및 sucD를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 유전자가 감쇠된 형태로 존재하는 코리네형 세균을 사용하여 L-아미노산을 발효적으로 생산하는 방법, 및 하이브리드화 프로브로서 상기 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도에 관한 것이다.

Description

유전자 ｓｕｃＣ 및 ｓｕｃＤ를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 {New nucleotide sequences coding for the genes sucC and sucD}

〈110〉 Degussa-Huls AG

〈120〉 New nucleotide sequences coding for the genes sucC and sucD

〈130〉 990171 BT

〈140〉

〈141〉

〈150〉 DE 199 56 686.0

〈151〉 1999-11-25

〈160〉 3

〈170〉 KoPatentIn Ver. 1.71

〈210〉 1

〈211〉 2410

〈212〉 DNA

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (142)..(1347)

〈223〉 sucC

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (1372)..(2253)

〈223〉 sucD

〈400〉 1

gcaccacgga tccaattttg ttgcaatttg caaagtttac agtgttagac ttcacaatac 60

gatcatattg gtgagttgaa acacttactt ttacgggaag actttgttaa agacgcagaa 120

ggctctaagc atgggccgga a atg gaa ttg gca gtg gat ctt ttt gaa tac 171

Met Glu Leu Ala Val Asp Leu Phe Glu Tyr

1 5 10

caa gca cgg gac ctc ttt gaa acc cat ggt gtg cca gtg ttg aag gga 219

Gln Ala Arg Asp Leu Phe Glu Thr His Gly Val Pro Val Leu Lys Gly

15 20 25

att gtg gca tca aca cca gag gcg gcg agg aaa gcg gct gag gaa atc 267

Ile Val Ala Ser Thr Pro Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ala Glu Glu Ile

30 35 40

ggc gga ctg acc gtc gtc aag gct cag gtc aag gtg ggc gga cgt ggc 315

Gly Gly Leu Thr Val Val Lys Ala Gln Val Lys Val Gly Gly Arg Gly

45 50 55

aag gcg ggt ggc gtc cgt gtg gca ccg acg tcg gct cag gct ttt gat 363

Lys Ala Gly Gly Val Arg Val Ala Pro Thr Ser Ala Gln Ala Phe Asp

60 65 70

gct gcg gat gcg att ctc ggc atg gat atc aaa gga cac act gtt aat 411

Ala Ala Asp Ala Ile Leu Gly Met Asp Ile Lys Gly His Thr Val Asn

75 80 85 90

cag gtg atg gtg gcg cag ggc gct gac att gct gag gaa tac tat ttc 459

Gln Val Met Val Ala Gln Gly Ala Asp Ile Ala Glu Glu Tyr Tyr Phe

95 100 105

tcc att ttg ttg gat cgc gcg aat cgt tcg tat ctg gct atg tgc tct 507

Ser Ile Leu Leu Asp Arg Ala Asn Arg Ser Tyr Leu Ala Met Cys Ser

110 115 120

gtt gaa ggt ggc atg gag atc gag atc ctg gcg aag gaa aag cct gaa 555

Val Glu Gly Gly Met Glu Ile Glu Ile Leu Ala Lys Glu Lys Pro Glu

125 130 135

gct ttg gca aag gtg gaa gtg gat ccc ctc act ggt att gat gag gac 603

Ala Leu Ala Lys Val Glu Val Asp Pro Leu Thr Gly Ile Asp Glu Asp

140 145 150

aaa gcg cgg gag att gtc act gct gct ggc ttt gaa act gag gtg gca 651

Lys Ala Arg Glu Ile Val Thr Ala Ala Gly Phe Glu Thr Glu Val Ala

155 160 165 170

gag aaa gtc att ccg gtg ctg atc aag atc tgg cag gtg tat tac gaa 699

Glu Lys Val Ile Pro Val Leu Ile Lys Ile Trp Gln Val Tyr Tyr Glu

175 180 185

gag gaa gca aca ctc gtt gag gtg aac ccg ttg gtg ctc acg gat gac 747

Glu Glu Ala Thr Leu Val Glu Val Asn Pro Leu Val Leu Thr Asp Asp

190 195 200

ggc gat gtg att gcg ctt gat ggc aag atc acg ctg gat gat aac gct 795

Gly Asp Val Ile Ala Leu Asp Gly Lys Ile Thr Leu Asp Asp Asn Ala

205 210 215

gat ttc cgc cat gat aac cgt ggt gcg ttg gct gaa tct gcc ggt ggc 843

Asp Phe Arg His Asp Asn Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ser Ala Gly Gly

220 225 230

ttg gac att ttg gaa ctg aag gcc aag aag aat gat ctg aac tac gtg 891

Leu Asp Ile Leu Glu Leu Lys Ala Lys Lys Asn Asp Leu Asn Tyr Val

235 240 245 250

aaa ctt gat ggc tct gtg ggc atc att ggc aat ggt gca ggt ttg gtg 939

Lys Leu Asp Gly Ser Val Gly Ile Ile Gly Asn Gly Ala Gly Leu Val

255 260 265

atg tcc acg ttg gat atc gtg gct gca gct ggt gaa cgc cat ggt ggg 987

Met Ser Thr Leu Asp Ile Val Ala Ala Ala Gly Glu Arg His Gly Gly

270 275 280

cag cgc ccc gcg aac ttc cta gac att ggt ggc gga gca tca gct gaa 1035

Gln Arg Pro Ala Asn Phe Leu Asp Ile Gly Gly Gly Ala Ser Ala Glu

285 290 295

tcg atg gct gct ggt ctc gat gtg atc ctt ggg gat agc cag gta cgc 1083

Ser Met Ala Ala Gly Leu Asp Val Ile Leu Gly Asp Ser Gln Val Arg

300 305 310

agt gtg ttt gtg aat gtg ttt ggt ggc atc acc gcg tgt gat gtg gtg 1131

Ser Val Phe Val Asn Val Phe Gly Gly Ile Thr Ala Cys Asp Val Val

315 320 325 330

gca aag gga atc gtt gga gct ttg gat gtg ctc ggc gat caa gca acg 1179

Ala Lys Gly Ile Val Gly Ala Leu Asp Val Leu Gly Asp Gln Ala Thr

335 340 345

aag cct ctt gtg gtg cgc ctt gat ggc aac aac gtg gtg gaa ggc aga 1227

Lys Pro Leu Val Val Arg Leu Asp Gly Asn Asn Val Val Glu Gly Arg

350 355 360

cga atc ctc gcg gaa tat aac cac cct ttg gtc acc gtt gtg gag ggt 1275

Arg Ile Leu Ala Glu Tyr Asn His Pro Leu Val Thr Val Val Glu Gly

365 370 375

atg gat gca gcg gct gat cac gct gcc cat ttg gcc aat ctt gcc cag 1323

Met Asp Ala Ala Ala Asp His Ala Ala His Leu Ala Asn Leu Ala Gln

380 385 390

cac ggc cag ttc gca acc gct aat tagttaagga gcacctgttt aatc atg 1374

His Gly Gln Phe Ala Thr Ala Asn Met

395 400

tct att ttt ctc aat tca gat tcc cgc atc atc att cag ggc att acc 1422

Ser Ile Phe Leu Asn Ser Asp Ser Arg Ile Ile Ile Gln Gly Ile Thr

405 410 415

ggt tcg gaa ggt tca gag cat gcg cgt cga att tta gcc tct ggt gcg 1470

Gly Ser Glu Gly Ser Glu His Ala Arg Arg Ile Leu Ala Ser Gly Ala

420 425 430 435

aag ctc gtg ggt ggc acc aac ccc cgc aaa gct ggg caa acc att ttg 1518

Lys Leu Val Gly Gly Thr Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gln Thr Ile Leu

440 445 450

atc aat gac act gag ttg cct gta ttt ggc act gtt aag gaa gca atg 1566

Ile Asn Asp Thr Glu Leu Pro Val Phe Gly Thr Val Lys Glu Ala Met

455 460 465

gag gaa acg ggt gcg gat gtc acc gta att ttc gtt cct cca gcc ttt 1614

Glu Glu Thr Gly Ala Asp Val Thr Val Ile Phe Val Pro Pro Ala Phe

470 475 480

gcc aaa gct gcg atc att gaa gct atc gac gct cac atc cca ctg tgc 1662

Ala Lys Ala Ala Ile Ile Glu Ala Ile Asp Ala His Ile Pro Leu Cys

485 490 495

gtg att att act gag ggc atc cca gtg cgt gac gct tct gag gcg tgg 1710

Val Ile Ile Thr Glu Gly Ile Pro Val Arg Asp Ala Ser Glu Ala Trp

500 505 510 515

gct tat gcc aag aag gtg gga cac acc cgc atc att ggc cct aac tgc 1758

Ala Tyr Ala Lys Lys Val Gly His Thr Arg Ile Ile Gly Pro Asn Cys

520 525 530

cca ggc att att act ccc ggc gaa tct ctt gcg gga att acg ccg gca 1806

Pro Gly Ile Ile Thr Pro Gly Glu Ser Leu Ala Gly Ile Thr Pro Ala

535 540 545

aac att gca ggt tcc ggc ccg atc ggg ttg atc tca aag tcg gga aca 1854

Asn Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Gly Leu Ile Ser Lys Ser Gly Thr

550 555 560

ctg act tat cag atg atg tac gaa ctt tca gat att ggc att tct acg 1902

Leu Thr Tyr Gln Met Met Tyr Glu Leu Ser Asp Ile Gly Ile Ser Thr

565 570 575

gcg att ggt att ggc ggt gac cca atc atc ggt aca acc cat atc gac 1950

Ala Ile Gly Ile Gly Gly Asp Pro Ile Ile Gly Thr Thr His Ile Asp

580 585 590 595

gct ctg gag gcc ttt gaa gct gat cct gag acc aag gca atc gtc atg 1998

Ala Leu Glu Ala Phe Glu Ala Asp Pro Glu Thr Lys Ala Ile Val Met

600 605 610

atc ggt gag atc ggt gga gat gca gag gaa cgc gct gct gac ttc att 2046

Ile Gly Glu Ile Gly Gly Asp Ala Glu Glu Arg Ala Ala Asp Phe Ile

615 620 625

tct aag cac gtg aca aaa cca gtt gtg ggt tac gtg gca ggc ttt acc 2094

Ser Lys His Val Thr Lys Pro Val Val Gly Tyr Val Ala Gly Phe Thr

630 635 640

gcc cct gaa gga aag acc atg ggg cat gct ggc gcc atc gtg aca ggt 2142

Ala Pro Glu Gly Lys Thr Met Gly His Ala Gly Ala Ile Val Thr Gly

645 650 655

tca gaa ggc act gcg cga gca aag aag cat gca ttg gag gcc gtg ggt 2190

Ser Glu Gly Thr Ala Arg Ala Lys Lys His Ala Leu Glu Ala Val Gly

660 665 670 675

gtt cgc gtg gga aca act ccg agt gaa acc gcg aag ctt atg cgt gag 2238

Val Arg Val Gly Thr Thr Pro Ser Glu Thr Ala Lys Leu Met Arg Glu

680 685 690

gta gtt gca gct ttg taactaacag gccacagatc ttagctttga ccagcggatt 2293

Val Val Ala Ala Leu

695

tgtggctaat cgcccggtct gtgtagagta ttcatctgtg cgcaggacag tgtgacaaac 2353

actgaatagt gcatggcttt aaggccctgt ggcgcagttg gttagcgcgc cgccctg 2410

〈210〉 2

〈211〉 402

〈212〉 PRT

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈400〉 2

Met Glu Leu Ala Val Asp Leu Phe Glu Tyr Gln Ala Arg Asp Leu Phe

1 5 10 15

Glu Thr His Gly Val Pro Val Leu Lys Gly Ile Val Ala Ser Thr Pro

20 25 30

Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ala Glu Glu Ile Gly Gly Leu Thr Val Val

35 40 45

Lys Ala Gln Val Lys Val Gly Gly Arg Gly Lys Ala Gly Gly Val Arg

50 55 60

Val Ala Pro Thr Ser Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala Asp Ala Ile Leu

65 70 75 80

Gly Met Asp Ile Lys Gly His Thr Val Asn Gln Val Met Val Ala Gln

85 90 95

Gly Ala Asp Ile Ala Glu Glu Tyr Tyr Phe Ser Ile Leu Leu Asp Arg

100 105 110

Ala Asn Arg Ser Tyr Leu Ala Met Cys Ser Val Glu Gly Gly Met Glu

115 120 125

Ile Glu Ile Leu Ala Lys Glu Lys Pro Glu Ala Leu Ala Lys Val Glu

130 135 140

Val Asp Pro Leu Thr Gly Ile Asp Glu Asp Lys Ala Arg Glu Ile Val

145 150 155 160

Thr Ala Ala Gly Phe Glu Thr Glu Val Ala Glu Lys Val Ile Pro Val

165 170 175

Leu Ile Lys Ile Trp Gln Val Tyr Tyr Glu Glu Glu Ala Thr Leu Val

180 185 190

Glu Val Asn Pro Leu Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Val Ile Ala Leu

195 200 205

Asp Gly Lys Ile Thr Leu Asp Asp Asn Ala Asp Phe Arg His Asp Asn

210 215 220

Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ser Ala Gly Gly Leu Asp Ile Leu Glu Leu

225 230 235 240

Lys Ala Lys Lys Asn Asp Leu Asn Tyr Val Lys Leu Asp Gly Ser Val

245 250 255

Gly Ile Ile Gly Asn Gly Ala Gly Leu Val Met Ser Thr Leu Asp Ile

260 265 270

Val Ala Ala Ala Gly Glu Arg His Gly Gly Gln Arg Pro Ala Asn Phe

275 280 285

Leu Asp Ile Gly Gly Gly Ala Ser Ala Glu Ser Met Ala Ala Gly Leu

290 295 300

Asp Val Ile Leu Gly Asp Ser Gln Val Arg Ser Val Phe Val Asn Val

305 310 315 320

Phe Gly Gly Ile Thr Ala Cys Asp Val Val Ala Lys Gly Ile Val Gly

325 330 335

Ala Leu Asp Val Leu Gly Asp Gln Ala Thr Lys Pro Leu Val Val Arg

340 345 350

Leu Asp Gly Asn Asn Val Val Glu Gly Arg Arg Ile Leu Ala Glu Tyr

355 360 365

Asn His Pro Leu Val Thr Val Val Glu Gly Met Asp Ala Ala Ala Asp

370 375 380

His Ala Ala His Leu Ala Asn Leu Ala Gln His Gly Gln Phe Ala Thr

385 390 395 400

Ala Asn

〈210〉 3

〈211〉 294

〈212〉 PRT

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈400〉 3

Met Ser Ile Phe Leu Asn Ser Asp Ser Arg Ile Ile Ile Gln Gly Ile

1 5 10 15

Thr Gly Ser Glu Gly Ser Glu His Ala Arg Arg Ile Leu Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Lys Leu Val Gly Gly Thr Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gln Thr Ile

35 40 45

Leu Ile Asn Asp Thr Glu Leu Pro Val Phe Gly Thr Val Lys Glu Ala

50 55 60

Met Glu Glu Thr Gly Ala Asp Val Thr Val Ile Phe Val Pro Pro Ala

65 70 75 80

Phe Ala Lys Ala Ala Ile Ile Glu Ala Ile Asp Ala His Ile Pro Leu

85 90 95

Cys Val Ile Ile Thr Glu Gly Ile Pro Val Arg Asp Ala Ser Glu Ala

100 105 110

Trp Ala Tyr Ala Lys Lys Val Gly His Thr Arg Ile Ile Gly Pro Asn

115 120 125

Cys Pro Gly Ile Ile Thr Pro Gly Glu Ser Leu Ala Gly Ile Thr Pro

130 135 140

Ala Asn Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Gly Leu Ile Ser Lys Ser Gly

145 150 155 160

Thr Leu Thr Tyr Gln Met Met Tyr Glu Leu Ser Asp Ile Gly Ile Ser

165 170 175

Thr Ala Ile Gly Ile Gly Gly Asp Pro Ile Ile Gly Thr Thr His Ile

180 185 190

Asp Ala Leu Glu Ala Phe Glu Ala Asp Pro Glu Thr Lys Ala Ile Val

195 200 205

Met Ile Gly Glu Ile Gly Gly Asp Ala Glu Glu Arg Ala Ala Asp Phe

210 215 220

Ile Ser Lys His Val Thr Lys Pro Val Val Gly Tyr Val Ala Gly Phe

225 230 235 240

Thr Ala Pro Glu Gly Lys Thr Met Gly His Ala Gly Ala Ile Val Thr

245 250 255

Gly Ser Glu Gly Thr Ala Arg Ala Lys Lys His Ala Leu Glu Ala Val

260 265 270

Gly Val Arg Val Gly Thr Thr Pro Ser Glu Thr Ala Lys Leu Met Arg

275 280 285

Glu Val Val Ala Ala Leu

290

본 발명은 유전자 sucC 및 sucD를 암호화하는 코리네형 세균의 뉴클레오타이드 서열 및 sucC- 및/또는 sucD 유전자가 감쇠된 세균을 사용하여, 아미노산, 특히, L-라이신 및 L-글루타메이트를 발효적으로 생산하는 방법을 제공하다.

L-아미노산, 특히, L-라이신 및 L-글루타메이트는 사람 의약 및 제약 산업, 식품 산업, 특히 동물 영양 산업에 사용된다.

아미노산을 코리네형 세균 균주, 특히, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)의 발효에 의해 생산할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 아미노산의 중요성 때문에 생산 공정을 개량하기 위한 노력이 계속되고 있다. 생산의 개량은 예를 들어, 교반 및 산소 공급, 또는 예를 들어, 발효중 당의 농도 같은 영양 배지의 조성, 또는 예로써, 이온 교환 크로마토그라피에 의한 생산물 형태의 후처리와 같은 발효 기술 수단, 또는 미생물 자체의 본질적인 생산 특성과 관련될 수 있다.

돌연변이유발, 돌연변이체의 선별 및 선택과 관련있는 방법을 사용하여 생산 특성을 개량한다. 이 방법으로 항대사물질에 대해 내성이거나 조절성 중요 대사물질에 대해 영양요구성이며, 아미노산을 생산하는 균주가 생산된다.

몇 년간 재조합 DNA 기술을 또한 사용하여 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량해 왔다.

본 발명은 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트의 발효적 생산 방법을 개량하기 위한 신규한 수단을 제공함을 목표로 한다.

도 1은 플라스미드 pCRBluntsucCint의 지도이다.

사용되는 두문자어 및 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다.

KmR: 카나마이신 내성-유전자

제오신: 제오신 내성-유전자

HindIII: 제한 효소 HindIII의 절단 부위

SphI: 제한 효소 SphI의 절단 부위

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

sucCint: sucC-유전자의 내부 단편

ColE1 ori: 플라스미드 ColE1의 복제 오리진

도 2는 플라스미드 pK18mobsacBsucDdel의 지도이다.

사용되는 두문자어 및 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다.

oriV: pMB1의 ColE1-유사 오리진

sacB: 단백질 레반슈크로오스를 암호화하는 sacB-유전자

RP4mob: RP4-이동 부위

Kan: 카나마이신에 대한 내성 유전자

sucDdel: 씨. 글루타미쿰의 sucD-유전자의 결실 대립유전자

SphI: 제한 효소 SphI의 절단 부위

PstI: 제한 효소 PstI의 절단 부위

XmaI: 제한 효소 XmaI의 절단 부위

XbaI: 제한 효소 XbaI의 절단 부위

이후, L-아미노산 또는 아미노산이 언급되는 경우, 이들 용어는 L-아스파라긴, L-트레오닌, L-세린, L-글루타메이트, L-글라이신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소루이신, L-루이신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-라이신, L-트립토판 및 L-아르기닌을 포함하는 그룹으로부터 선택된, 이들의 염을 포함하는 아미노산 1종 이상을 언급하는 것으로 이해된다. L-라이신과 L-글루타메이트가 특히 바람직하다.

본 발명은

f) a), b), c), d) 또는 e)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 연속적인 뉴클레오타이드 15개 이상을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 상기 폴리펩타이드는 바람직하게는 석시닐-CoA 합성효소의 활성을 나타내는, 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한

(i) 서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는

(ii) 유전자 암호의 축퇴성 영역내에서 상기 서열 (i)에 상응하는 서열 하나 이상, 또는

(iii) 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 대해 상보적인 서열과 하이브리드화되는 서열 하나 이상, 및 임의로

(iv) (i)중 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 함유하는, 바람직하게는 복제성 DNA인, 특허청구범위 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한

서열 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 함유하는, 특허청구범위 제4항에 따르는 폴리뉴클레오타이드,

폴리뉴클레오타이드가 코리네형 세균중에서 복제성인, 바람직하게는 재조합 DNA인, 특허청구범위 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드,

본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드의 일부를 함유하나, 청구된 서열의 연속적인 뉴클레오타이드 15개 이상을 함유하는 벡터, 및

sucC- 및/또는 sucD-유전자가 특히 삽입 또는 결실에 의해 감쇠되어 있는 코리네형 세균을 제공한다.

본 발명은 또한 서열 1에 따르는 상기 언급한 폴리뉴클레오타이드의 서열 또는 이의 단편을 함유하는 프로브를 사용하여 서열 1에 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 완전한 sucC- 및/또는 sucD-유전자를 함유하는 유전자 라이브러리를 하이브리드화로 스크리닝하고, 상기 언급한 DNA 서열을 분리함으로써 수득할 수 있는, 폴리뉴클레오타이드 서열을 실질적으로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명에 따르는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 석시닐-CoA 합성효소를 암호화하는 전장의 cDNA, 핵산 및/또는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자를 분리하고, 서열이 석시닐-CoA 합성효소 유전자의 것과 유사성이 높은 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한, RNA, cDNA 및 DNA에 대한 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

본 발명에 따르는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 석시닐-CoA 합성효소를 암호화하는 유전자로부터 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산될 수 있는 DNA를 위한 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 역할을 하는 상기와 같은 올리고뉴클레오타이드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 가장 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유한다. 뉴클레오타이드 길이가 40 또는 50개 이상인 뉴클레오타이드가 또한 적합하다.

"분리된"이란 이의 천연 환경으로부터 분리된 것을 의미한다.

"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 언급하며, 여기서 이들 용어와 관련하여 비개질된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA를 언급할 수 있다.

용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통하여 결합된 아미노산 2개 이상을 함유하는 펩타이드 또는 단백질로 이해된다.

본 발명에 따르는 폴리펩타이드로는 서열 2 및 서열 3에 따르는 폴리펩타이드, 특히 석시닐-CoA 합성효소의 생물학적 활성을 가질 뿐만 아니라 서열 2 또는 서열 3에 따르는 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 서열 2 또는 서열 3에 따르는 폴리펩타이드와 80% 이상, 및 특히 바람직하게는 90 내지 95% 이상 동일하며 상기 언급한 활성을 갖는 것들이 있다.

본 발명은 또한 이미 아미노산, 특히 L-라이신 및/또는 L-글루타메이트를 생산하며, sucC- 및/또는 sucD-유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 감쇠되어 있고, 특히 낮은 수준으로 발현시키는 코리네형 세균을 사용하여, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-세린, L-글루타메이트, L-글라이신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소루이신, L-루이신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-라이신, L-트립토판 및 L-아르기닌을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.

이와 관련하여 용어 "감쇠"는 미생물내에서 상응하는 DNA에 의해 암호화될 수 있는 효소(단백질) 1종 이상의 세포내 활성을 예를 들어, 약한 프로모터 또는 활성이 낮은 상응하는 효소를 암호화하고/하거나 상응하는 유전자 또는 효소(단백질)을 불활성화시키며 임의로 이들 특징이 혼합되어 있는 유전자 및/또는 대립유전자를 사용하여 감소 또는 스위치-오프(switching-off)시키는 것을 설명한다.

본 발명의 주제인 미생물은 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분, 셀룰로오스로부터 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 아미노산, 특히, L-라이신을 생산할 수 있다. 상기 미생물은 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속의 유형일 수 있다. 코리네박테리움 속에서 특히, 당해 분야의 숙련가들에게 L-아미노산을 생산할 수 있는 능력이 공지되어 있는, 코리네박테리움 글루타미쿰 유형이 언급되어야 한다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 유형의 적합한 균주로 특히 다음과 같은 공지된 야생형 균주

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806

코리네박테리움 아세토악시도필룸 ATCC13870

코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965

코리네박테리움 써모아미노제네스 FERM BP-1539

브레비박테리움 플라붐 ATCC14067

브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020, 및 L-아미노산을 생산하는 이들로부터 수득한 돌연변이체 및/또는 균주, 예를 들어, L-라이신-생산 균주

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5714가 있다.

효소 석시닐-CoA 합성효소(EC 6.2.1.5)를 암호화하는 신규한 유전자 sucC 및 sucD는 씨. 글루타미쿰으로부터 분리되었다.

sucC- 및/또는 sucD-유전자 또한 기타 유전자를 씨. 글루타미쿰으로부터 분리하기 위하여, 먼저 상기 미생물의 유전자 라이브러리를 이. 콜라이중에 배양시킨다. 상기 유전자 라이브러리의 배양은 일반적으로 공지된 교재 및 참고서에 설명되어 있다. 예를 들어, 다음 문헌을 언급할 수 있다[the textbook by Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Genes and Clones, An Introduction to Gene Technology) (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990) 또는 the handbook by Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. 숙지되어 있는 유전자 라이브러리는 코하라(Kohara) 등에 의해 λ-벡터내에서 배양된, 이. 콜라이 K-12 균주 W3110[Cell 50, 495-508 (1987)]이다. 다른 문헌[Bathe et al, Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996]에는 코스미드 벡터 SuperCos I[Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164]의 조력하에 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]중에서 배양시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 유전자 라이브러리가 설명되어 있다.

문헌[Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)]에는 또한 코스미드 pHC97[Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 수득한 유전자 라이브러리가 설명되어 있다. 또한, 문헌[O'Donohue, The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997]에는 문헌[Short et al., Nucleic Acids Research, 16: 7583]에 기재된 λ Zap 발현 시스템을 사용한 씨. 글루타미쿰 유전자의 클로닝이 설명되어 있다.

이. 콜라이중에서 씨. 글루타미쿰으로부터의 유전자 라이브러리를 생산하기 위하여, pBR322[Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC9[Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268]과 같은 플라스미드를 또한 사용할 수 있다. 숙주로서, 예를 들어, 균주 DH5α[Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1992]와 같은, 제한-결함 및 재조합-결함성인 이. 콜라이 균주가 특히 적합하다.

이후, 코스미드 또는 기타 λ-벡터를 사용하여 클로닝한 긴 DNA 단편을 DNA 서열 분석용으로 적합한 입수용이한 벡터중으로 서브-클로닝할 수 있다.

DNA 서열 분석 방법은 특히, 다음 문헌에 설명되어 있다[Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977].

이어서, 상기 수득한 DNA 서열을 예를 들어, Staden[(Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)]의 것, Butler의 GCG-프로그램[Methods of Biochemical Analysis, 39, 74-97 (1998)], Pearson과 Lipman의 FASTA 알고리즘[Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, 2444-2448 (1988)] 또는 Altscul 등의 BLAST의 알고리즘[Nature Genetics 6, 119-129 (1994)]와 같은 공지된 알고리즘 및/또는 서열 분석 프로그램으로 조사하고 공개적으로 접근할 수 있는 데이터 뱅크에 기재된 서열 입력 내용과 비교할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열에 대해 공개적으로 접근할 수 있는 데이터 뱅크의 예로는 European Molecular Biologies Laboratories(EMBL, Heidelberg, Germay)의 것들 또는 National Center for Bioltechnology Information(NCBI, Bethesda, MD, USA)의 것들이 있다.

sucC- 및 sucD-유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 신규한 DNA 서열이 발견되었으며, 서열 1로서 본 발명의 일부이다. 상응하는 단백질의 아미노산 서열이 또한 현존하는 DNA 서열로부터 상기 설명된 방법을 사용하여 유도되었다. 생성된 sucC- 및 sucD-유전자 생성물의 아미노산 서열은 서열 2 및 서열 3으로 나타낸다.

유전자 암호의 축퇴성으로 인하여 서열 1로부터 발생하는 암호화 DNA 서열이 또한 본 발명의 대상이 된다. 동일한 방법으로 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화되는 DNA 서열이 또한 본 발명의 대상이 된다. 최종적으로, 서열 1로부터 수득한 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산된 DNA 서열이 또한 본 발명의 대상이 된다.

당해 분야의 숙련가들은 특히, 하기 문헌에 기재된 하이브리드화에 의해 DNA 서열 확인에 대한 정보를 발견할 수 있다[the handbook "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" published by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) 및 Liebl et al. International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-260]. 하이브리드화는 엄격한 조건하에서, 다시 말해서, 프로브와 표적 서열, 즉, 프로브로 처리된 폴리뉴클레오타이드가 70% 이상 동일한 하이브리드만이 형성되는 조건하에서 일어난다. 세척 단계를 포함한 철저한 하이브리드화는 완충액 조성, 온도 및 염 농도를 변화시킴으로써 영향을 받거나 심지어 이에 의해 결정된다. 하이브리드화 반응은 세척 단계와 비교하여 상대적으로 낮은 정도의 철저함으로 수행하는 것이 바람직하다[Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996].

예를 들면, 하이브리드화 반응의 경우 5x SSC-완충액을 약 50 내지 68℃의 온도에서 사용할 수 있다. 이와 관련하여 프로브를 또한 상기 프로브의 서열과의 동일성이 70% 미만인 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화시킬 수 있다. 상기와 같은 하이브리드는 안정성이 낮으며 엄격한 조건하에서 세척에 의해 제거된다. 이는 예를 들어, 염 농도를 2x SSC로 감소시키고 임의로 연속해서 0.5x SSC로 감소시키고 [The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995], 온도는 약 50 내지 68℃로 유지하면서 수행할 수 있다. 또한, 임의로 염 농도를 0.1x SSC로 감소시킬 수 있다. 50℃에서 68℃ 까지 약 1 내지 2℃의 단계로 하이브리드화 온도를 단계적으로 상승시킴으로써, 예를 들어, 사용된 프로브의 서열과의 동일성이 70% 이상 또는 80% 이상, 또는 90 내지 95% 이상인 폴리뉴클레오타이드 단편을 분리시킬 수 있다. 하이브리드화에 대한 추가적인 지침은 소위 키트의 형태로 시중에서 입수할 수 있다(예를 들어, DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1603558).

당해 분야의 숙련가들은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 DNA 서열을 증강시키는 것에 대한 상세한 내용을 특히, 하기 문헌으로부터 알 수 있다[the handbook by Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) 및 Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994].

본 발명에 이르러 코리네형 세균이 sucC- 및/또는 sucD-유전자를 감쇠시킨 후 향상된 방식으로 L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산한다는 것이 밝혀졌다.

상기와 같이 감쇠시키기 위하여, sucC- 및/또는 sucD-유전자의 발현 또는 상기 효소 단백질의 촉매적 특성을 감소 또는 스위치-오프시킬 수 있다. 두 가지 방법을 임의로 혼용할 수 있다.

유전자 발현의 감소는 적합한 배양 조건 또는 상기 유전자 발현의 시그날 그조의 유전적 변형(돌연변이)에 의해 성취될 수 있다. 유전자 발현의 시그날 구조는 예를 들어, 억제 유전자, 활성화 유전자, 오퍼레이터, 프로모터, 감쇠 인자(attenuator), 리보솜 결합 부위, 개시 코돈 및 종결 인자이다. 당해 분야의 숙련가들은 상기에 관한 정보를 예를 들어 문헌[특허원 WO96/15246, Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1988)), Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)] 및 유전학 및 분자생물학에 관한 공지된 교재, 예를 들면, 문헌[the textbook by Knippers ("Molekulare Genetik", 6th Edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) 또는 textbook by Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990)]에서 발견할 수 있다.

효소 단백질의 촉매적 특성을 변형 및/또는 감소시키는 돌연변이는 선행 기술에 공지되어 있으며; 예를 들어, 하기 문헌들을 언급할 수 있다[Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61:1760-1762 (1997)) 및 Mockel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzymes", ("The Threonine Dehydratase from Corynebacterium glutamicum: Cancellation of the Allosteric Regulation and Structure of the Enzyme"), reports of the Julichs Research Centre, Jul-2906, ISSN09442952, Julich, Germany, 1994]. 개요 및 요약은 예를 들어, 하기와 같은 유전학 및 분자생물학에 대한 공지된 교재로부터 수득할 수 있다[Hagemann "Allgemeine Genetik" (General Genetics"), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986].

돌연변이는 전좌, 역위, 삽입 및 결실과 같은 현상을 포괄한다. 효소 활성에 대한 아미노산 교환의 효과에 따라서, 미스센스 돌연변이 또는 넌센스 돌연변이로 언급한다. 유전자 중 염기쌍 1개 이상이 삽입 또는 결실됨으로써 프레임 이동 돌연변이가 발생하고, 그 결과, 오류 아미노산이 도입되거나 해독이 조숙하게 정지된다. 수 개의 코돈이 결실되면 전형적으로 효소 활성이 완전 억제된다. 상기와 같은 돌연변이 발생에 관한 세부 사항은 선행 기술의 일부이며 예를 들어, 하기와 같은 유전학 및 분자생물학에 관한 공지된 교재로부터 입수할 수 있다[the textbook by Knippers ("Molekulare Genetik", 6th Edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), the textbook by Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) 또는 the textbook by Hagemann "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986].

씨. 글루타미쿰의 유전자를 돌연변이시키는 통상의 방법은 하기 문헌에 기재된 유전자 파괴 및 유전자 대체법이다[Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)].

유전자 파괴의 방법에서는 당해 유전자의 암호화 영역의 중앙 부분을 숙주(전형적으로 이. 콜라이, 씨. 글루타미쿰에서는 안됨)에서 복제할 수 있는 플라스미드 벡터내로 클로닝시킨다 . 사용할 수 있는 벡터의 예로는 pSUP301[Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pK18mobsacB 또는 pK19mobsacB[Jager et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)], pGEM-T(제조원: Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO[Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; 미국 특허 제5,487,993호], pCRBlunt[Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molicular Biology, 234: 534-541 (1993)] 또는 pEM1[Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516]이 있다. 이후, 상기 유전자의 암호화 영역의 중앙부를 함유하는 플라스미드 벡터를 목적하는 씨. 글루타미툼 균주내로 접합 또는 형질전환에 의해 전환시킨다.

접합법은 예를 들어, 하기 문헌에 설명되어 있다[Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]. 형질전환법은 예를 들어, 하기 문헌에 설명되어 있다[Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988), Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989) 및 Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]. 교차(crossover)에 의해 상동성 재조합시킨 후, 영향받은 유전자의 암호화 영역을 벡터 서열로 파괴하여 각각 3'- 및 5'-말단이 결여된, 2개의 불완전한 대립유전자를 수득한다. 이 방법은 예를 들어 Fitzpatrick에 의해 씨. 글루타미쿰의 recA-유전자를 스위치-오프시키기 위하여 사용되었다[Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)]. sucC- 및/또는 sucD-유전자는 이 방법으로 스위치-오프시킬 수 있다.

유전자 대체 돌연변이 방법에서는, 예를 들어, 결실, 삽입 또는 염기 교환 같은 돌연변이를 당해 유전자내에 시험관내에서 수행한다. 이어서, 생산되는 대립유전자를 씨. 글루타미쿰에 대해 비복제성인 벡터내로 클로닝하고 상기 벡터를 씨. 글루타미쿰에 대해 바람직한 숙주내로 형질전환 또는 접합에 의해 전환시킨다. 표적 유전자 및/또는 표적 서열내로 돌연변이 및/또는 대립유전자를 도입시키는 것은 상동성 재조합 후 통합시키는 1차 교차 및 절단시키는 2차 교차에 의해 수행한다. 이 방법은 예를 들어, 문헌[Peters-Wendsch (Microbiology 144, 915-927 (1988)]에 의해 결실에 의해 씨. 글루타미쿰의 pyc-유전자를 스위치-오프시키기 위하여 사용되었다. 이 방법으로 결실, 삽입 또는 염기 교환을 sucC- 및/또는 sucD-유전자내로 도입시킬 수 있다.

이 방법으로 결실, 삽입 또는 염기 교환을 sucC- 및/또는 sucD-유전자내로 도입시킬 수 있다.

또한, L-아미노산, 특히 L-라이신의 생산의 경우, 관련 생합성 경로, 해당 작용, 보충 반응(anaplerotic), 시트르산 회로 또는 아미노산 수송에 관련된 효소 하나 이상을 증진, 특히 과-발현시키기위함 외에도, sucC- 및/또는 sucD-유전자를 감쇠시키는데 유리할 수 있다.

따라서, L-라이신 및/또는 L-글루타메이트를 생산하는데 있어서, sucC- 및/또는 sucD-유전자의 감쇠 외에도, 다음 그룹으로부터 선택된 유전자 하나 이상을 증강, 특히 과-발현시킬 수 있다:

· 디히드로디피콜리네이트-합성효소를 암호화하는 dapA-유전자[EP-B 제0 197 335호],

· 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap-유전자[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

· 트리오스포스페이트 이소머라제에 대해 암호화하는 유전자 tpi[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

· 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 유전자 pgk[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc-유전자[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo-유전자[Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

· 피드-백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 유전자 lysC(승인번호 P26512),

· L-라이신-수송에 관여하는 효소를 암호화하는 lysE-유전자[DE-A 제195 48 222호],

· Zwa1-단백질을 암호화하는 유전자 zwa1[DE 제199 59 328.0호, DSM 13115].

또한, L-라이신 및/또는 L-글루타메이트의 생산에 있어서, sucC- 및/또는 sucD-유전자의 감쇠 외에도, 동시에 다음 그룹으로부터 선택된 유전자 중 하나 이상의 발현을 감쇠, 특히 감소시키는 것이 유리할 수 있다:

· 포스포에놀피루베이트-카복시키나제를 암호화하는 유전자 pck[DE 제199 50 409.1호, DSM 13047),

· 글루코오스-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 유전자 pgi[US 제09/396,478호, DSM 12969],

· 피루베이트-옥시다제를 암호화하는 유전자 poxB[DE 제199 51 975.7호, DSM 13114],

· zwa2-단백질을 암호화하는 유전자 zwa2[DE 제199 59 327.2호, DSM 13113].

또한, L-아미노산, 특히 L-라이신 및/또는 L-글루타메이트의 생산에 있어서, sucC- 및/또는 sucD-유전자의 감쇠 외에도, 바람직하지 않은 2차 반응을 스위치-오프시키는 것이 유리할 수 있다[Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

특허청구범위 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 미생물은 또한 본 발명의 대상이며 L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산하기 위하여 연속적으로 또는 배치식으로 배치 공정(배치식 배양) 또는 공급식 배치 또는 반복 공급식 배치식 공정으로 배양시킬 수 있다. 공지된 배양법의 개요는 다음 문헌에서 발견할 수 있다[the textbook by Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Biological Process Technology, Introduction to Biological Engineering) (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 the textbook by Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreactors and Peripheral Equipment) (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)].

사용할 배양 배지는 관련 균주의 요구조건을 적합하게 만족시켜야 한다. 여러 가지 미생물에 대한 배양 배지에 대한 설명은 다음 문헌으로부터 알 수 있다[the handbook "Munual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981].

탄소원으로서 당 및 탄수화물(예를 들면, 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 오일 및 지방(예를 들면, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예를 들면, 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(예를 들면, 아세트산)이 사용될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.

질소원으로서 유리 질소-함유 화합물(예를 들면, 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 말트 추출액, 옥수수 침지액, 대두박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예를 들면, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 사용될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.

인 공급원으로서 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 사용될 수 있다. 배양 배지는 또한 성장에 필수적인 금속염, 예를 들면 황산마그네슘 또는 황산철을 함유할 수 있다. 최종적으로, 상기 언급한 물질 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 이와는 별도로, 적합한 전구체를 배양 배지에 가할 수 있다. 상기 언급한 피드백 물질을 원-오프(one-off) 부가의 형태로 가할 수 있거나, 적절한 방법으로 실제적인 배양시 계량할 수 있다.

배지의 pH를 조절하기 위하여 알칼리성 화합물(예, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수) 또는 산성 화합물(예, 인산 또는 황산)을 적합한 방식으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 발포체 형성을 방지할 수 있다. 예를 들어, 항생제와 같은 적합한 선택적 활성 물질을 배지에 가하여 플라스미드의 안정성을 유지할 수 있다. 산소 또는 예를 들어, 공기와 같은 산소-함유 가스 혼합물을 배지에 도입하여 호기성 조건을 유지한다. 배양 온도는 통상 20 내지 45℃이며 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 최대 수율로 목적하는 생성물이 형성될 때까지 배양을 계속한다. 이 목표는 통상 10 시간 내지 160 시간내에 성취된다.

L-아미노산 측정법은 선행 기술로부터 공지되어 있다. 분석은 예를 들어, 하기 문헌[Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기재된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그라피에 이어서 닌히드린 유도법으로 수행할 수 있거나 문헌[Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 기재된 바와 같이, 역상 HPLC로 수행할 수 있다.

본 발명은 이후, 실시 양태에 의해 더욱 상세하게 설명된다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 염색체 DNA를 문헌[Tauch et al., 1995, Plasmid 33: 168-179]에 기재된 바와 같이 분리하여 제한 효소 Sau3AI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Code no. 27-0913-02)로 부분적으로 절단한다. 상기 DNA 단편을 새우 알칼린 포스파타제(제조원: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Code no. 1758250)으로 탈인산화시킨다. 제조원(Stratagene, La Jolla, USA, Product Description SuperCos Cosmid Vector Kit, Code no. 251301)로부터 입수한, 코스미드 벡터 SuperCos1[Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160-2164]의 DNA를 제한 효소 XbaI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02)로 절단하고 새우 알칼린 포스파타제로 마찬가지로 탈인산화시킨다. 이어서, 코스미드-DNA를 제한 효소 BamHI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04)로 절단한다. 이 방법으로 처리한 코스미드-DNA를 상기 처리한 ATCC13032-DNA와 혼합하고 상기 배치를 T4-DNA-ligase(제조원: Amersham pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4-DNA-ligase, Code no. 27-0870-04)로 처리한다. 이후, 상기 결합 혼합물을 Gigapack II XL 패킹 추출액(제조원: Stratagene, La Jolla, USA, Product Description Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217)을 사용하여 파아지중에 패킹시킨다. 이. 콜라이 균주 NM554[Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575]를 감염시키기 위하여 상기 세포를 10 mM MgSO₄중에 흡수시키고 상기 파아지 현탁액 분취량과 혼합한다. 코스미드 뱅크의 감염 및 적정은 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기재된 바와 같이 수행하고, 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB-아가[Lennox, 1955, Virology, 1:190]상에 플레이팅시킨다. 37℃에서 밤새 배양시킨 후 각각의 재조합 클론을 선택한다.

실시예 2

유전자 sucC 및 sucD의 분리 및 서열 분석

각각의 콜로니의 코스미드-DNA를 Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라서 분리하고 제한 효소 Sau3AI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sua3AI, Product No. 27-0913-02)로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 새우 알칼린 포스파타제(제조원: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Code no. 1758250)으로 탈인산화시킨다. 겔 전기영동 분리시킨 후 코스미드 단편을 QiaExII Gel Extraction Kit(Product No. 20021, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 1500 내지 2000 bp의 거대 영역으로 분리한다. 제조원(Invitrogen, Groningen, Niederlande, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01)로부터 입수한 서열 분석 벡터 pZero-1의 DNA를 제한 효소 BamHI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product No. 27-0868-04)로 절단한다. 서열 분석 벡터 pZero-1내에 상기 코스미드 단편을 결합시키는 것은 문헌[Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기재된 바와 같이 수행하고, DNA 혼합물은 T4-리가제(제조원: Pharmacia Biotech, Freibrug, Germany)와 함께 밤새 항온처리한다. 상기 결합 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649]내로 전기천공법으로 도입시키고[Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7] 제오신 50㎍/㎖를 함유하는 LB-아가[Lennox, 1955, Virology, 1:190]상에 플레이팅시킨다. 재조합 클론의 플라스미드 제조는 Biorobot 9600(Product No. 900200, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)으로 수행한다. 서열 분석은 문헌[Zimmermann et al. 1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067]에 의해 개질된 바와 같이 디데옥시 연쇄 종결법[Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467]에 따라서 수행한다. 제조원(PE Applied Biosystems, Product No. 403044, Weiterstadt, Germany)로부터의 RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit를 사용한다. 겔 전기영동 분리와 서열 분석 반응의 분석은 로티포레시스 NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드 겔(29:1)(Product No. A124.1, 제조원: Roth, Karlsruhe, Germany)중에서 제조원(PE Applied Biosystems , Weiterstadt, Germany)로부터의 "ABI Prism 377" 서열 분석 장비를 사용하여 수행한다.

이어서 수득한 초기 서열 데이타를 Staden 프로그램 패키지[1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231] Version 97-0를 사용하여 프로세싱시킨다. pZero1 유도체의 각각의 서열을 접착성 콘티그(Contig)내로 조립한다. 암호화 영역의 컴퓨터-보조 분석은 프로그램 XNIP[Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231]로 수행한다. 추가 분석은 BLAST 서치 프로그램[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402]으로, National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD, USA)의 비-중복 데이터 뱅크에 대해 수행한다.

수득한 뉴클레오타이드 서열은 서열 1에 설명되어 있다. 뉴클레오타이드 서열의 분석으로 sucC-유전자로 확인된 1206개 염기쌍의 개방 판독 프레임, 뿐만 아니라, sucD로 확인된 882개 염기쌍의 개방 판독 프레임이 밝혀졌다. sucC-유전자는 서열 2에 나타낸 402개의 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화한다. sucD-유전자는 서열 3에 나타낸 294개의 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화한다.

실시예 3

3.1 sucC-유전자의 통합 돌연변이 유발용 통합 벡터의 작제

염색체 DNA를 균주 ATCC 13032로부터 Eikmanns 등의 방법[Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 따라서 분리한다. 실시예 1로부터 공지된 씨. 글루타미쿰에 대한 sucC-유전자의 서열을 기준으로, 다음 올리고뉴클레오타이드를 폴리머라제 연쇄 반응용으로 선택한다:

sucC-in1:

5'CGC GCG AAT CGT TCG TAT 3'

sucC-in2:

5'CGC CAC CAA TGT CTA GGA 3'

표시된 프라이머는 제조원(MWG Biotech, Ebersberg, Germany)에 의해 합성하고 PCR 반응은 제조원(Boehringer Mannheim, Germany, Product Description Pwo DNA Polymerase, Product No. 1 644 947)으로부터의 Pwo 폴리머라제를 사용하여 Innis 등의 표준 PCR 방법[PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, 1990, Academic Press]에 따라서 수행한다. 폴리머라제 연쇄 반응의 조력하에 프라이머는 sucC-유전자의 대략 0.55 kb 크기의 내부 단편을 증폭시킨다. 이 방법으로 증폭된 생성물은 0.8% 아가로스 겔중에서 전기영동법으로 체크한다.

상기 증폭된 DNA 단편을 벡터 pCRBlunt II[Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)]내로 제조원(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA; Catalogue Number K2700-20)으로부터의 Zero Blunt™ Kit를 사용하여 결합시킨다.

이후, 이. 콜라이 균주 TOP10을 결합 배치[Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985]내로 전기천공법으로 도입시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선택은 카나마이신 25㎎/ℓ이 보충된 LB 아가[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]상에 상기 형질전환 배치를 플레이팅시켜 수행한다. 플라스미드 DNA를 제조원(Qiagen)으로부터의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 제한 효소 EcoRI로 절단한 다음 아가로스 겔 전기영동법(0.8%)으로 체크한다. 상기 플라스미드를 pCRBluntSucCint로 명명하고 도 1에 나타낸다.

3.2 sucD-유전자의 결실

상기 목적을 위해, 염색체 DNA를 균주 ATCC13032로부터 Tauch 등의 방법[1995, Plasmid 33: 168-179]으로 분리한다. 실시예 2로부터 공지된 씨. 글루타미쿰에 대한 sucD-유전자의 서열을 기준으로, 이후 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 sucD 결실 대립유전자를 생산하기 위하여 선택한다.

sucD-d1:

5'-CGA TGT GAT TGC GCT TGA TG-3'

sucD-d2:

5'-ACC TCA CGC ATA AGC TTC GCA TGC TCT GAA CCT TCC GAA C-3'

sucD-d3:

5'-GTT CGG AAG GTT CAG AGC ATG CGA AGC TTA TGC GTG AGG T-3'

sucD-d4:

5'-ATG AAG CCA GCG ACT GCA GA -3'

관련 프라이머를 제조원(MWG Biotech, Ebersberg, Germany)에 의해 합성하고 PCR 반응을 Pfu 폴리머라제(제조원: Staratagene, Product. No. 600135, La Jolla, USA) 및 PTC 100-Thermocyclers(제조원: MJ Research Inc., Waltham, USA)를 사용하여 수행한다. 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 상기 프라이머는 내부 결실을 갖는 sucD 대립유전자를 증폭시킨다. 이 방법으로 증폭된 생성물을 0.8% 아가로스 겔중에서 전기영동법으로 시험하고 또한 Sanger 등에 의해 설명된 바와 같이 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977 서열 분석한다.

실시예 4

4.1 균주 DSM 5715중 sucC-유전자의 통합 돌연변이 유발

실시예 3.1에 언급된 벡터 pCRBluntsucCint를 씨. 글루타미쿰 DSM 5715중으로 Tauch 등의 전기천공법[FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)]에 따라서 전기천공법으로 도입시킨다. 균주 DSM 5715는 AEC 내성 L-라이신 생산 균주이다. 벡터 pCRBlunt-sucCint는 독립적으로 DMS5715내서 복제할 수 없으며, 따라서 DSM 5715의 염색체내로 통합될 경우 셀룰로오스중에 남아 있게 된다. 염색체내로 통합된 pCRBluntsucCint를 갖는 클론의 선택은 카나마이신 15㎎/ℓ이 보충된 LB 아가[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]상에 상기 전기천공법 배치를 플레이팅하여 수행한다.

통합을 검출하기 위하여, sucCint 단편을 문헌["The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" of Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)]에 기재된 방법에 따라서, 제조원(Boehringer)으로부터의 Dig-하이브리드화 키트를 사용하여 표지시킨다. 강력한 통합체의 염색체 DNA를 Eikmanns 등의 방법 [Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 따라서 분리하고, 각 경우 제한 효소 SphI 및 HindIII로 절단한다. 생성된 단편을 아가로스 겔 전기영동법으로 분리하고 68℃에서 제조원(Boehringer)으로부터의 Dig-하이브리드화 키트를 사용하여 하이브리드화시킨다. 실시예 3.1에서 명명된 상기 플라스미드 pCRBluntsucCint를 그 자체로 염색체 sucC-유전자내의 DSM 5715의 염색체내로 삽입한다. 상기 균주는 DSM5715::pCRBluntsucCint인 것으로 확인되었다.

4.2 교환 벡터 pK18mobsacBsucDdel의 작제

실시예 3.2에서 수득한 sucD-결실 유도체를 아가로스 겔 (0.8%)중에서 분리후 Qiagenquick Gel Extraction Kit(제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로스 겔로부터 분리한 다음 결합용으로 이동성 클로닝 벡터 pK18mobsacB[Schafer et al. (1994), Gene 14: 69-73]와 함께 사용한다. 이는 미리 제한 효소 XmaI 및 XbaI로 분해하여, sucD-결실 대립유전자와 혼합하고, T4-DNA-리가제(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리한다.

이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649]에 결합 배치[Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach, Vol.1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]를 전기천공법으로 도입시킨다. 플라스미드-함유 세포는 카나마이신 25㎎/ℓ이 보충된 LB 아가[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]상에 상기 형질전환 배치를 플레이팅하여 수행한다.

플라스미드 DNA를 제조원(Qiagen)으로부터의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고, 클로닝된 sucD-결실 대립유전자는 제조원(컴파니 MWG Biotech, Ebersberg, Germany)에 의해 서열 분석으로 증명한다. 상기 플라스미드를 pK18mobsacBsucDdel로 명명한다. 상기 균주는 이. 콜라이 DH5αmcr/pK18mobsacBsucDdel로 확인되었다.

4.3 씨. 글루타미쿰 균주 DSM 5715중 sucD-유전자의 결실 돌연변이 유발

실시예 4.2에서 언급된 벡터 pK18mobsacBsucDdel을 Tauch 등의 전기천공법[1989 FEMS Microbiology Letters 123: 343-347]에 따라서 전기천공법으로 도입시킨다. 상기 벡터는 독립적으로 DMS5715내서 복제할 수 없으며, 따라서 염색체중으로 통합될 경우 셀룰로오스중에 남아 있게 된다. 통합된 pK18mobsacBsucDdel을 갖는 클론의 선택은 카나마이신 15㎎/ℓ이 보충된 LB 아가[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]상에 상기 전기천공법 배치를 플레이팅하여 수행한다. 배양한 클론을 카나마이신 25㎎/ℓ을 함유하는 LB-아가 플레이트상에 스트리킹하여 33℃에서 16 시간 동안 배양시킨다.

sucD-유전자의 완전한 염색체 복사체와 함께 상기 플라스미드를 절개하기 위하여, 클론을 10% 슈크로오스를 함유하는 LB-아가상에서 성장시킨다. 상기 플라스미드 pK18mobsacB는 슈크로오스를 씨. 글루타미쿰에 대해 독성이 아닌 레반슈크로오스로 전환시키는 sacB-유전자의 복사체를 함유한다. 따라서, 통합된 pK18mobsacBsucDdel이 절개된 클론만이 슈크로오스를 함유하는 LB-아가상에서 성장할 수 있다. 절개에 있어서, sucD-유전자의 완전한 염색체 복사체 또는 내부 결실을 함께 갖는 불완전한 복사체를 상기 플라스미드와 함께 절개할 수 있다.

sucD의 불완전한 복사체가 염색체중에 여전히 남아있는지 검출하기 위하여, 플라스미드 pK18mobsacBsucDdel 단편을 문헌["The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" published by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)]에 설명된 방법에 따라서 제조원(Boehringer)으로부터의 DIG-하이브리드화 키트를 사용하여 표지시킨다. 강력한 결실 돌연변이체의 염색체 DNA를 Eikmanns 등의 방법[Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 따라서 분리하여 각 경우 제한 효소 SphI 및 PstI를 사용하여 별개의 절편으로 절단한다. 생성된 단편을 아가로스 겔 전기영동법으로 분리하고 68℃에서 제조원(Boehringer)으로부터의 DIG 하이브리드화 키트를 사용하여 하이브리드화시킨다. 생성된 단편을 기준으로하여, 균주 DSM5715가 sucD-유전자의 완전한 복사체를 소실하고 대신 결실된 복사체만이 여전히 입수가능한 것으로 밝혀졌다. 상기 균주는 씨. 글루타미쿰 DSM5715△sucD인 것으로 확인되었다.

실시예 5

5.1 균주 DSM5715::pCRBluntsucCint를 사용한 L-글루타메이트의 생산

실시예 4.1에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715::pCRBluntsucCint를 L-글루타메이트 생산을 위하여 적합한 영양 배지중에서 배양하여 배양 상등액중의 글루타메이트 함량을 측정한다.

이를 위하여, 상기 균주를 먼저 24시간 동안 33℃에서 상응하는 항생제를 갖는 아가 플레이트 (카나마이신(25㎎/ℓ)을 함유하는 뇌-심장 아가)상에서 배양시킨다. 예비-배양물을 상기 아가 플레이트 배양물을 사용하여 접종한다(Erlenmeyer 플라스크 100 ㎖중 배지 10 ㎖). 완전 배지 Cg III를 예비-배양용 배지로 사용한다.

배지 Cg III

NaCl 2.5 g/ℓ

박토-펩톤 10 g/ℓ

박토-효모 추출액 10 g/ℓ

글루코오스(별도로 오토클레이빙시킴) 2% (w/v)

pH는 pH 7.4로 조정한다.

카나마이신(25㎎/ℓ)을 상기 배지에 가한다. 예비-배양물을 진탕기상에서 16시간 동안 33℃에서 240 rpm으로 배양시킨다. 주 배양물의 초기 광학 밀도(660 ㎚)가 0.1 OD가 되도록 주 배양물을 상기 예비-배양물로부터 접종한다. 상기 배지 MM을 주 배양용으로 사용한다.

배지 MM

CSL(옥수수 침지액) 5 g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20 g/ℓ

글루코오스(별도로 오토클레이빙시킴) 50 g/ℓ

염류:

(NH₄)₂SO₄) 25 g/ℓ

KH₂PO₄0.1 g/ℓ

MgSO₄·7H₂O 1.0 g/ℓ

CaCl₂·2H₂O 10 ㎎/ℓ

FeSO₄·7H₂O 10 ㎎/ℓ

MnSO₄·H₂O 5.0 ㎎/ℓ

바이오틴(멸균 여과한 것) 0.3 ㎎/ℓ

티아민·HCl(멸균 여과한 것) 0.2 ㎎/ℓ

푸마레이트(멸균 여과한 것) 5.81 g/ℓ

루이신(멸균 여과한 것) 0.1 g/ℓ

CaCO₃25 g/ℓ

CSL, MOPS 및 염 용액은 암모니아수로 pH 7로 조정하여 오토클레이빙시킨다. 멸균 물질 및 비타민 용액 뿐만 아니라 건식 오토클레이빙시킨 CaCO₃를 가한다.

배양은 10㎖ 용적으로 100㎖ 에를렌마이어 플라스크중에서 배플을 사용하여 수행한다. 카나마이신(25㎎/ℓ)을 가한다. 배양을 33℃에서 80% 대기 습도에서 수행한다.

24시간 후 OD를 660㎚의 측정 파장에서 Biomek 1000 장비(제조원: Beckmann Instruments GmbH, Munich)를 사용하여 측정한다. 형성된 글루타메이트의 양은 제조원(Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)로부터의 아미노산 분석기중에서 이온 교환 크로마토그라피 및 닌히드린 검출에 의한 후-컬럼 유도로 측정한다.

시험 결과를 표 1에 나타낸다.

균주	OD (660 ㎚)	L-글루타메이트 ㎎/ℓ
DSM5715	10.4	20
DSM5715::pCRBluntsucCint	3.9	154

5.2 균주 DSM5715△sucD를 사용한 L-글루타메이트의 생산

실시예 4.3에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715/pK18mobsacBsucDdel을 L-글루타메이트 생산을 위하여 적합한 영양 배지중에서 배양하여 배양 상등액중의 글루타메이트 함량을 측정한다.

이를 위하여, 상기 균주를 먼저 24시간 동안 33℃에서 아가 플레이트상에서 배양시킨다. 예비-배양물을 상기 아가 플레이트 배양물(Erlenmeyer 플라스크 100 ㎖중 배지 10 ㎖)을 사용하여 접종한다 . 완전 배지 Cg III를 예비-배양용으로 사용한다. 카나마이신(25㎎/ℓ)을 상기 배지에 가한다. 예비-배양물을 진탕기상에서 16시간 동안 33℃에서 240 rpm으로 배양시킨다. 주 배양물의 초기 광학 밀도(660 ㎚)가 0.1 OD가 되도록 주 배양물을 상기 예비-배양물로부터 접종한다. 상기 배지 MM을 주 배양용으로 사용한다.

배양은 10㎖ 용적으로 100㎖ 에를렌마이어 플라스크중에서 배플을 사용하여 수행한다. 배양을 33℃에서 80% 대기 습도에서 수행한다.

72시간 후 OD를 660㎚의 측정 파장에서 Biomek 1000 장비(제조원: Beckmann Instruments GmbH, Munich)를 사용하여 측정한다. 형성된 글루타메이트의 양은 제조원(Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)로부터의 아미노산 분석기중에서 이온 교환 크로마토그라피 및 닌히드린 검출에 의한 후-컬럼 유도로 측정한다.

시험 결과를 표 2에 나타낸다.

균주	OD (660 ㎚)	L-글루타메이트 ㎎/ℓ
DSM5715	8.1	7
DSM5715△sucD	13.3	33

Claims

a) 서열 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

b) 서열 3의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

c) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

d) 서열 3의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

e) a), b), c) 또는 d)의 폴리뉴클레오타이드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오타이드, 및

f) a), b), c), d) 또는 e)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 연속적인 뉴클레오타이드 15개 이상을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 폴리펩타이드가 석시닐-CoA 합성효소의 활성을 갖는, sucC- 및/또는 sucD-유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 바람직하게는 코리네형 세균중에서 복제가능한 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, 서열 1에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서,

(i) 서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는

(ii) 유전자 암호의 축퇴성 영역내에서 서열 (i)에 상응하는 서열 하나 이상, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 대해 상보적인 서열과 하이브리드화되는 서열 하나 이상, 및 임의로

(iv) (i)내에 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 함유하는 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제5항에 있어서, 하이브리드화를 최대로 2x SSC에 상응하는 엄격한 조건하에서 수행하는, 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
sucC- 및/또는 sucD-유전자가 감쇠되어 있는 코리네형 세균.
a) 무엇보다도 sucC- 및/또는 sucD-유전자 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 감쇠되어 있는, 특히 스위치-오프되어 있는, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 세균의 발효 단계;

b) 배지 또는 세균 세포내에 L-아미노산을 농축시키는 단계, 및

c) L-아미노산의 분리 단계를 수행함을 특징으로 하는, L-아미노산, 특히 L-라이신 및/또는 L-글루타메이트의 생산 방법.
제9항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 다른 유전자가 추가로 증강되어있는 세균을 사용하는 방법.
제9항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 스위치-오프되어 있는 세균을 사용하는 방법.
제9항에 있어서, sucC- 및/또는 sucD-유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)의 발현이 감쇠되어 있는, 특히 스위치-오프되어 있는 방법.
제9항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 sucC 및 sucD가 암호화하는 폴리펩타이드(효소 단백질)의 촉매적 특성이 감소되어 있는 방법.
제9항에 있어서, L-아미노산의 생산을 위하여,

14.1 디하이드로디피콜리네이트-합성효소를 암호화하는 dapA-유전자,

14.2 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc-유전자,

14.3 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap-유전자,

14.4 트리오스포스페이트 이소머라제를 암호화하는 유전자 tpi,

14.5 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 유전자 pgk,

14.6 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo-유전자,

14.7 L-라이신 수송에 관여하는 효소를 암호화하는 lysE-유전자,

14.8 피드-백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 유전자 lysC,

14.9 Zwa1-단백질을 암호화하는 유전자 zwa1을 포함하는 그룹으로부터 선택된 유전자 하나 이상이 동시에 증강되고/되거나 과발현되는 미생물을 발효시키는 방법.
제9항에 있어서, L-아미노산의 생산을 위하여,

15.1 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 유전자 pck,

15.2 글루코오스-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 유전자 pgi,

15.3 피루베이트-옥시다제를 암호화하는 유전자 poxB,

15.4 Zwa2-단백질을 암호화하는 유전자 zwa2를 포함하는 그룹으로부터 선택된 유전자 하나 이상이 동시에 감쇠된 코리네형 미생물을 발효시키는 방법.
제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드의 일부로서 청구된 서열중 연속적인 뉴클레오타이드 15개 이상을 포함하는 벡터를 함유하는 코리네형 세균.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 유형의 미생물을 사용하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 하이브리드화 프로브로 사용하여, 석시닐-CoA 합성효소를 암호화하거나 sucC 및/또는 sucD-유전자의 서열과 유사성이 높은 핵산 및/또는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자를 분리시키기위한 RNA, cDNA 및 DNA를 검출하는 방법.