KR20010033640A - 신규 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호하는 ｃＤＮＡ 및그 용도 - Google Patents

Abstract

성인의 뇌조직 및 뇌조직 유래의 세포주, 사람의 골수에서 유래된 세포주 및 사람의 제대정맥 내피 세포주가 생산하고 있는 신규 폴리펩티드 및 그 제조법, 그 폴리펩티드를 암호하는 cDNA, 그 cDNA 서열에 선택적으로 하이브리드하는 단편, 그 cDNA를 조립한 복제 또는 발현 플라스미드, 그 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포, 그 폴리펩티드의 항체, 그 펩티드 또는 항체를 함유하는 약학적 조성물.

Description

신규 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호하는 ｃＤＮＡ 및 그 용도{NOVEL POLYPEPTIDES, cDNAS ENCODING THE SAME AND UTILIZATION THEREOF}

종래, 어떤 특정한 폴리펩티드 또는 그것을 암호하는 cDNA를 얻고자 하는 경우, 조직이나 세포 배양액중에 목적으로 하는 생물 활성을 확인하고, 계속해서 폴리펩티드의 단리 정제를 거쳐 유전자를 클로닝하는 방법, 혹은 그 생물 활성을 지표로 하여 유전자를 발현 클로닝하는 방법이 일반적으로 이용되어 왔다. 그러나, 생체내 생리 활성 폴리펩티드는 다양한 생물 활성을 갖고 있는 경우가 많기 때문에, 어떤 하나의 활성을 지표로 하여 유전자를 클로닝한 결과, 그것이 이미 알려진 폴리펩티드와 동일하다는 것이 나중에 판명되는 사례가 증가하고 있다. 또한, 미량 밖에 생산되지 않거나, 특별한 생리적 조건에서만 발현되는 인자도 많고, 그것이 단리, 정제 및 생물 활성의 확인을 곤란하게 하고 있다.

최근, cDNA의 제작 기술이나 서열 분석 기술은 급속히 발전하여 대량의 cDNA의 서열 분석을 신속히 행할 수 있게 되었다. 그래서 이들 기술을 이용하여 여러가지 세포나 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고, 랜덤으로 cDNA를 클로닝하여 염기 서열을 결정하여, 신규 폴리펩티드를 암호하는 유전자를 단리하는 방법이 발전하고 있다. 이 방법은 생화학적, 유전학적인 해석을 일체 필요로 하지 않고 유전자를 클로닝하여 그 염기 서열의 정보를 얻을 수 있다라고 하는 특징을 갖고 있지만 목적으로 하는 유전자의 발견은 우발적 요소가 크다.

본 발명의 발명자들는 지금까지 조혈계나 면역계에서 작용하는 증식 분화 인자의 유전자 클로닝을 연구해 왔다. 그리고, 증식 분화 인자(예컨대, 각종 시토킨 등)같은 분비 단백질이나 그 수용체와 같은 막 단백질(이하, 이들을 통합하여 분비 단백질 등이라고 함)의 대부분이 그 N 말단에 시그널 펩티드라고 불리는 서열을 갖고 있는 것에 착안하여, 시그널 펩티드를 암호하는 유전자를 효율적이고 또한 선택적으로 클로닝하는 방법을 예의 검토했다. 그 결과, 동물 세포를 이용하여 시그널 펩티드를 암호하는 cDNA를 간단히 선발할 수 있는 방법(시그널 서열 분석 트랩(SST)법)을 발견하였다(일본 특허 공개 공보 평성6-315380호 참조). 또한, 동일한 개념하에 효모를 이용하여 더욱 효율적이고 간편하게 시그널 펩티드를 암호하는 유전자를 단리하는 방법(효모 SST법)도 개발되었다(미국 특허 No. 5,536,637참조).

본 발명은 신규 폴리펩티드, 그 제조 방법, 그 폴리펩티드를 암호하는 cDNA, 그 cDNA로 이루어지는 벡터, 그 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 그 폴리펩티드의 항체 및 그 펩티드 또는 항체를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은 치료, 진단, 혹은 연구상 유익한 신규 인자(폴리펩티드), 특히 분비 시그널을 갖는 분비 단백질 및 막 단백질에 착안하여 그것을 발견하기 위해 예의 검토를 행하였다.

그 결과, 상기 방법을 이용하여 다종 다양한 분비 단백 및 막 단백을 생산하고 있다고 예상되는 세포주 및 조직, 예컨대 성인의 뇌조직 및 뇌조직에서 유래된 세포주, 인간 골수에서 유래된 세포주 및 인간 태아 간장이 생산하고 있는 신규 분비 단백질 혹은 막 단백질 및 그것을 암호하는 cDNA를 발견하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 제공하는 cDNA 서열은 클론 OM007 및 OMB096으로서 확인되고, 상기 효모 SST법에 의해 성인 뇌조직으로부터 제작한 cDNA 라이브러리에서 단리되었다. 클론 OM007 및 OMB096은 분비 단백질(여기서는 각각 OM007 및 OMB096 단백질로 표시함)을 암호하는 완전한 cDNA 서열을 포함하는 전장쇄 cDNA이다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대해서 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OM007, OMB096 및 각각을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 분비 단백질인 것이 판명되었다.

본 발명이 제공하는 cDNA 서열은, 클론 OAF0038-Leu 및 OAF038-Pro로서 확인되고, 상기 효모 SST법에 의해 성인의 골수에서 유래된 세포주(HAS303)로부터 제작한 cDNA 라이브러리에서 단리되었다. 클론 OAF0038-Leu 및 OAF038-Pro는 막 단백질(여기서는 OAF0038-Leu 및 OAF038-Pro 단백질로 표시함)을 암호하는 완전한 cDNA 서열을 포함하는 전장쇄 cDNA이다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대해서는 BLASTN 및 FASTA에 의해, 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서는 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OAF0038-Leu, OAF038-Pro 및 각각을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 막 단백질인 것이 판명되었다.

본 발명이 제공하는 cDNA 서열은 클론 OR087H로서 확인되고, 상기 효모 SST법에 의해 태아의 간장으로부터 제작한 cDNA 라이브러리에서 단리하였다. 클론 OR087H는 분비 단백질(여기서는 OR087H 단백질로 표시함)을 암호하는 완전한 cDNA 서열을 포함하는 전장쇄 cDNA이다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대해서는 BLASTN 및 FASTA에 의해, 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서는 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OR087H 및 그것을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 분비 단백질인 것이 판명되었다.

본 발명이 제공하는 cDNA 서열은, 클론 OA004-FG 및 OA004-LD로서 확인되고, 상기 효모 SST법에 의해 사람의 신경교 아종 세포주 T98G에서 제작한 cDNA 라이브러리에서 단리하였다. 클론 OA004-FG 및 OA004-LD는 막 단백질(여기서는 OA004-FG 및 OA004-LD 단백으로 표시됨)을 암호하는 완전한 cDNA 서열을 포함하는 전장쇄 cDNA이다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대해서는 BLASTN 및 FASTA에 의해, 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서는 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OA004-FG 및 OA004-LD 및 각각을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 막 단백질인 것이 판명되었다.

즉, 본 발명은

(1) 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,

(2) 상기 (1)에 기재한 폴리펩티드를 암호하는 cDNA,

(3) 서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17 또는 20으로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA,

(4) 서열 번호 3, 6, 9, 12, 15, 18 또는 21로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA에 관한 것이다.

본 발명은 실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 그 동족체, 그 서열의 단편 및 그 동족체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 이들 폴리펩티드를 암호하는 cDNA에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17 또는 20으로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA 및 서열 번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20 또는 21로 표시되는 염기 서열에 선택적으로 하이브리드하는 단편을 갖는 cDNA에 관한 것이다. 하이브리드하는 cDNA에는 상기 서열의 상보 서열도 포함된다. 하이브리드의 조건은 엄밀한 것이 바람직하다.

실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란 일반적으로 생산시의 폴리펩티드의 90% 이상, 예컨대 95, 98 또는 99%가 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 의미한다.

서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 동족체란 일반적으로 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 예컨대 40, 60 또는 100개의 연속한 아미노산 영역에서, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 또는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동성인 것이고, 그러한 동족체는 이후 본 발명의 폴리펩티드로서 기재된다.

또한, 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 단편, 또는 이들 동족체의 단편란, 적어도 10 아미노산, 바람직하게는 적어도 15 아미노산, 예컨대 20, 25, 30, 40, 50 또는 60 아미노산 부분을 의미한다.

서열 번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20 또는 21로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA에 선택적으로 하이브리드하는 cDNA란 일반적으로 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 예컨대 40, 60 또는 100개의 연속 염기 서열 영역에서, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 또는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동성인 것이고, 그러한 cDNA는 이후 본 발명의 cDNA로서 기재된다.

서열 번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20 또는 21로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA의 단편란 적어도 10 염기, 바람직하게는 적어도 15 염기, 예컨대 20, 25, 30 또는 40 염기 부분을 의미하며, 그러한 단편도 본 발명의 cDNA에 포함된다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 cDNA를 함유하는 복제 또는 발현 벡터가 포함된다. 벡터로서는, 예컨대 ori 영역과, 필요에 따라 상기 cDNA의 발현을 위한 프로모터, 프로모터의 제어 인자 등으로 이루어지는 플라스미드, 바이러스 또는 파지(phage) 벡터를 들 수 있다. 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택적 마커 유전자, 예컨대 암피실린 내성 유전자를 포함하고 있어도 좋다. 벡터는 시험관내에 있어서, 예컨대 cDNA에 대응하는 RNA의 제조, 숙주 세포의 형질 전환에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에는 서열 번호 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20 또는 21로 표시되는 염기 서열 또는 이들 오픈 리딩 프레임을 갖는 cDNA를 비롯한 본 발명의 cDNA를 복제 또는 발현시키기 위한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포도 포함된다. 세포로서는 예컨대 세균, 효모, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포를 들 수 있다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서, 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조 방법도 포함된다. 배양은 본 발명의 폴리펩티드가 발현되어 숙주 세포로부터 제조되는 조건하에서 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 cDNA는 상기와 같은 벡터의 안티센스 영역에 삽입하여 안티센스 RNA를 제조할 수도 있다. 이러한 안티센스 RNA는 세포중 본 발명의 폴리펩티드의 레벨을 제어하는데 이용할 수도 있다.

본 발명은 본 발명에 기재된 폴리펩티드의 모노클로널 또는 폴리클로널 항체도 포함한다. 또한, 본 발명에 기재된 폴리펩티드의 모노클로널 또는 폴리클로널 항체의 제조 방법도 포함한다. 모노클로널 항체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 단편을 항원으로서 이용하여, 통상의 하이브리도마(hybridoma) 기술에 의해 제조할 수 있다. 폴리클로널 항체는 숙주 동물(예컨대, 래트나 토끼 등)에 본 발명의 폴리펩티드를 접종하여 면역 혈청을 회수하는 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드, 그 항체와 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 함유하는 약학적 조성물도 포함된다.

전술한 (1)의 본 발명의 폴리펩티드로서는, 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19로 표시된 아미노산 서열을 갖는 것 이외에, 그 일부가 결손된 것(예컨대, 서열 번호 1 중, 생물 활성의 발현에 필수적인 부분만으로 이루어지는 폴리펩티드 등), 그 일부가 다른 아미노산과 치환된 것(예컨대, 물성이 유사한 아미노산으로 치환된 것) 및 그 일부에 다른 아미노산이 부가 또는 삽입된 것도 포함된다.

잘 알려진 바와 같이 하나의 아미노산을 암호하는 코돈은 1∼6종류(예컨대, Met는 1종류, Leu는 6종류)가 알려져 있다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 바꾸지 않고 cDNA의 염기 서열을 바꿀 수 있다.

상기 (2)에 특정한 본 발명의 cDNA에는, (1)의 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19로 표시되는 폴리펩티드를 암호하는 모든 염기 서열군이 포함된다. 염기 서열을 바꿈으로써 폴리펩티드의 생산성이 향상되는 경우가 있다.

상기 (3)의 서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17 및 20으로 특정되는 cDNA는 (2)로 표시되는 cDNA의 일형태이며 천연형 서열을 나타낸다.

상기 (4)의 서열 번호 3, 6, 9, 12, 15, 18 및 21로 표시되는 cDNA는 (3)에 특정한 cDNA에 천연의 비번역 부분을 첨가한 서열을 나타낸다.

서열 번호 3, 6, 9, 12, 15, 18 또는 21로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA의 제작은 이하의 방법에 따라서 행해진다.

먼저, 효모 SST법(미국 특허 No. 5,536,637에 기재)의 개요에 관해서 설명한다.

사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)등의 효모가 자당 또는 라피노오스(raffinose)를 에너지원이나 탄소원으로서 이용하기 위해서는 전화효소를 배지중에 분비해야 한다(전화효소는 라피노오스를 자당과 멜리비오스로, 자당을 프럭토스와 글루코스로 분해하는 효소임). 또한 수많은 이미 알려진 포유류의 시그널 펩티드는 효모의 전화효소를 분비시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 이러한 지견으로부터 효모의 전화효소 분비를 가능하게 하는 신규 시그널 펩티드를 라피노오스 배지상에서의 효모의 생육을 지표로 하여 포유류의 cDNA 라이브러리에서 스크리닝하는 방법으로서 본 방법은 개발되었다.

우선, 번역 개시점(ATG)을 삭제한 비분비형 전화효소 유전자 SUC2 (GENBANK accession No.V0131l)를 효모의 발현 벡터에 조립하여 효모 SST용 벡터 pSUC2를 제작했다. 발현 벡터에는 AAH5 플라스미드(Gammerer, Methods in Enzymol. 101, 192-201, 1983)에서 유래된 발현용 프로모터(ADH 프로모터) 및 터미네이터(ADH 터미네이터)가 조립되어 있고, 효모 복제 기점으로서는 2μori, 효모 선택 마커에는 TRP1, 대장균 복제 기점으로서는 ColEl ori, 대장균 약제 내성 마커로서 암피실린 내성 유전자가 각각 조립되어 있다.

그 SUC2 유전자의 상류에 포유류의 cDNA를 조립하여 효모 SST cDNA 라이브러리를 조제하였다. 이 라이브러리를 가지고 분비형 전화효소가 결손되어 있는 효모를 형질 전환시켰다. 조립된 포유류 cDNA가 시그널 펩티드를 암호하고 있는 경우 효모에서 발현된 전화효소에 대해서도 분비 작용을 가진다고 생각되고, 그 결과 라피노오스의 배지상에서의 생육이 가능해진다. 따라서 출현한 콜로니로부터 효모를 배양하고 플라스미드를 조제하여, 삽입 cDNA의 염기 서열을 결정함으로써 신규 시그널 펩티드의 검색을 신속하고 용이하게 하였다.

효모 SST cDNA 라이브러리의 제작은

(1) 대상이 되는 세포에서 mRNA를 단리하고, 특정의 제한 효소(효소Ⅰ) 부위를 연결한 랜덤 프라이머를 이용하여 이본쇄 cDNA를 합성하고,

(2) 효소Ⅰ과는 다른 특정의 제한 효소(효소 Ⅱ) 부위를 포함하는 어댑터를 연결하여 효소Ⅰ로 분해한 뒤 적당한 크기로 분획하고,

(3) 얻어진 cDNA 단편을, 효모 발현 벡터 내의 시그널 펩티드를 삭제한 전화효소 유전자의 상류에 연결하여, 형질 전환하는 공정으로 이루어진다.

각 공정을 자세히 설명하면, 공정(1)에서는 대상이 되는 포유류의 장기나 세포주 등으로부터, 필요에 따라 적당한 자극제로 자극한 후 공지의 방법(이하, 공지의 방법은 특별한 기재가 없으면 Molecular Cloning[Sambrook. J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 1989년에 발간) 또는 Current Protocol in Molecular Biology(F.M.Ausubel 등 편, John Willey ＆ Sons,Inc.에서 발간)에 기재된 방법에 따라서 행해짐]에 따라서 mRNA의 단리를 실시한다.

대상이 되는 세포로는 HAS303(사람의 골수 스트로마 세포주: 동경 의과 대학 제1내과 소토야마 케이스케 교수, 아이자와 신 조수 공여. J.Cell.Physiol.148,245-251, 1991 및 Experimental Hematol. 22,482-487, 1994에 기재), 사람의 신경교 아종 세포주 T98G(ATCC No.CRL-1690), 또는 태아의 간장(CLONTECH, # CL6527-1)을 들 수 있다. 또한, 조직으로는 성인의 뇌를 들 수 있다. 랜덤 프라이머를 이용하는 이본쇄 cDNA의 합성은 공지의 방법에 의해 행해진다.

어댑터에 연결되는 제한 효소(효소 I) 부위와 다음 공정 (2)에서 이용되는 제한 효소(효소 II) 부위는 서로 다른 것이라면 어떤 것을 이용하더라도 좋다. 바람직하게는 효소 I로서 XhoI, 효소 II로서는 EcoRI을 이용하는 것이 좋다.

공정 (2)에서는 T4DNA 중합 효소로 말단을 평활화하고, 효소 II 어댑터를 연결한 뒤, 효소 I로 분해하여, 아가로스 전기 영동(AGE)에 의해 300∼800 bp의 cDNA를 분획화한다. 효소 II는 전술한 것처럼 효소 I과 다른 것이라면 어떤 것이라도 좋다.

공정 (3)은 효모 발현용 플라스미드 벡터에 연결된 시그널 펩티드를 삭제한 전화효소 유전자의 상류에, (2)에서 얻어진 cDNA 단편을 조립하여 대장균으로 형질 전환하는 공정이다. 여기서 효모 발현용 플라스미드 벡터로서는 여러 가지의 것이 알려져 있는데, 예컨대 대장균내에서도 기능하는 YEp24등이 이용되지만, 적합하게는 전술한 플라스미드 pSUC2가 이용되는 것이 좋다.

형질 전환을 위한 숙주 대장균주는 이미 많은 것이 알려져 있고, 바람직하게는 DH10B의 컴피턴트 세포이다. 또한, 형질 전환 방법은 공지의 어느 방법을 이용해도 좋지만, 바람직하게는 일렉트로포레이션법으로 실시하는 것이 좋다. 형질 전환체는 통상 방법으로 배양하여 효모 SST용의 cDNA 라이브러리를 얻는다.

이 cDNA 라이브러리에는 모든 클론에 cDNA 단편이 도입되어 있는 것은 아니고, 또한 전부가 미지의(신규의) 시그널 펩티드를 암호하는 유전자 단편이라고 한정할 수는 없다. 따라서, 그 다음 상기 라이브러리로부터 미지의 시그널 펩티드를 암호하는 유전자 단편을 스크리닝할 필요가 있다. 이 목적을 위해서는 cDNA 라이브러리를 전화효소 유전자를 갖지 않는 효모 사카로마이세스 세레비시에(예컨대 YT455주 등) 또는 전화효소 유전자를 인위적으로 결손시킨 세포주(공지의 방법에 따라서 제작 가능)에, 상기 cDNA 라이브러리를 도입하여 시그널 펩티드를 암호하는 서열을 갖는 단편의 스크리닝을 행한다.

효모의 형질 전환은 공지의 방법, 예컨대 아세트산 리튬법으로 실시한다. 형질 전환체를 선택 배지에서 생육한 후, 라피노오스를 탄소원으로 하는 배지로 옮겨, 생육 가능한 콜로니를 선택하여 플라스미드를 회수한다. 라피노오스를 탄소원으로 하여 효모가 생육되었다는 것은, 라이브러리중의 어느 정도에 분비 단백질의 시그널 펩티드가 조립되어 있다는 것을 나타낸다.

다음으로, 단리한 양성 클론에 대해서 염기 서열을 결정하고, 미지의 단백질을 암호하는 것이 분명해진 cDNA에 대해서는, 그것을 프로브로 하여 전체 길이 클론을 단리하고 전체 길이의 염기 서열을 결정할 수 있다. 이들 조작은 당업자에게 모두 공지된 방법으로 행해진다.

서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17 또는 20으로 표시되는 염기 서열이, 일부(바람직하게는 모두)가 확정되면, 포유류에 존재하는 본 발명의 단백질을 암호하는 cDNA 혹은 본 발명 단백질의 동족체 및 서브 세트를 암호하는 cDNA를 얻을 수 있다. 적당한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 그것을 이용하여 포유류에서 유래된 cDNA 라이브러리 혹은 mRNA로부터 PCR법에 의해, 혹은 적당한 염기 서열의 단편을 프로브로서 하이브리드시킴으로써 다른 포유류 cDNA 라이브러리 혹은 그 게놈 라이브러리로부터 다른 포유류형의 상기 단백질을 암호하는 cDNA를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 cDNA가 SST에서 얻어진 cDNA 단편의 염기 서열(또는 그 상동 서열)을 포함하고 있으면 시그널 펩티드를 암호하고 있는 것이 되므로, 상기 cDNA가 전장(全長), 또는 거의 전장인 것은 분명하다(시그널 펩티드는 예외없이 단백질의 N 말단에 존재하기 때문에, cDNA의 오픈 리딩 프레임의 5'말단에서 암호된다).

또한, 공지의 방법에 따라서 상기 cDNA를 프로브로 하여 노던(Northern) 해석에 의해 전장을 확인해도 좋다. 하이브리드한 밴드로부터 얻어지는 mRNA의 크기와 상기 cDNA의 크기를 비교하여 거의 동일하면 그 cDNA는 거의 전장이라고 생각할 수 있다.

본 발명의 단백질에는 전장형 및 성숙형 양쪽이 모두 포함된다. 이들 단백질의 전장형 및 성숙형은 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 및 19로 표시되어 있다. 이들 성숙 단백질은 서열 번호 3, 6, 9, 12, 15, 18 및 21로 표시되는 전장 cDNA를 적당한 포유류의 세포 혹은 그 밖의 숙주 세포에서 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 성숙형 단백의 서열은 전장형의 아미노산 서열에서 예측 가능하다.

서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17 또는 20으로 표시되는 염기 서열이 일단 확정되면, 그 후는 화학 합성에 의해서 혹은 상기 염기 서열의 단편을 화학 합성하여 이것을 프로브로서 하이브리드시켜 본 발명의 cDNA를 얻을 수 있다. 또한, 본 cDNA를 함유하는 벡터 cDNA를 적당한 숙주에 도입하여 이것을 증식시킴으로써, 목적으로 하는 cDNA를 필요량 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 얻는 방법으로는,

(1) 생체 또는 배양 세포로부터 정제 단리하는 방법,

(2) 펩티드 합성하는 방법, 또는

(3) 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산하는 방법

등을 들 수 있지만, 공업적으로는 (3)에 기재한 방법이 바람직하다.

유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현계(숙주- 벡터계)로서는, 예컨대 세균, 효모, 곤충 세포 및 포유 동물 세포의 발현계를 들 수 있다.

예컨대, 대장균에서 발현시키는 경우에는 성숙 단백질 부분을 암호하는 cDNA의 5' 말단에 개시 코돈(ATG)을 부가하고, 얻어진 cDNA를 적당한 프로모터(예컨대, trp 프로모터, lac 프로모터, λPL 프로모터, T7 프로모터 등)의 하류에 접속시켜, 대장균내에서 기능하는 벡터(예컨대, pBR322, pUC18, pUC19 등)에 삽입하여 발현 벡터를 제작한다.

다음에, 이 발현 벡터로 형질 전환한 대장균(예컨대, E.Coli DH1, E.Coli JM109, EColi HB101주 등)을 적당한 배지에서 배양하여, 그 균체에서 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 박테리아의 시그널 펩티드(예컨대, pelB의 시그널 펩티드)를 이용하면 페리플라즘 중에 목적으로 하는 폴리펩티드를 분비할 수도 있다. 또한, 다른 폴리펩티드와의 퓨전·프로틴(fusion protein)을 생산할 수도 있다.

또한, 포유 동물 세포로 발현시키는 경우에는 예컨대, 서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17 또는 20으로 표시되는 염기 서열을 적당한 벡터(예컨대, 레트로 바이러스 벡터, 파피로마 바이러스 벡터, 종두 바이러스 벡터, SV40계 벡터 등) 중의 적당한 프로모터(예컨대, SV40 프로모터, LTR 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터 등)의 하류에 삽입시켜 발현 벡터를 제작한다. 다음에, 얻어진 발현 벡터로 적당한 포유 동물 세포(예컨대, 원숭이 COS-7 세포, 차이니스 햄스터 CHO세포, 마우스 L세포 등)를 형질 전환하고 형질 전환체를 적당한 배지에서 배양함으로써, 본 발명의 단백질(폴리펩티드)이 분비 단백질인 경우와 막 단백질인 경우에 다음과 같이 발현된다.

본 발명의 단백질이 분비 단백질인 경우, 그 세포 상청중에 목적으로 하는 폴리펩티드가 발현된다. 또한, 그 외의 폴리펩티드, 예컨대 항체의 정상 영역(Fc 부)을 암호하는 cDNA 단편과 연결함으로써 융합 단백질을 생산할 수도 있다.

한편, 본 발명의 단백질이 막 단백질인 경우, 그 세포막 상에 목적으로 하는 폴리펩티드가 발현된다. 또한, 서열 번호 9, 12, 18 또는 21로 표시되는 아미노산 서열을 암호하는 cDNA의 막관통 영역을 결실시킨 결실체를 상기 벡터에 삽입하고, 이를 이용하여 적당한 포유류 동물 세포를 형질 전환시키면, 그 배양액중에 목적으로 하는 가용성 폴리펩티드가 분비된다. 또한, 그 막관통 영역을 결실시킨 결실체를 암호하는 cDNA 단편과 그 외의 폴리펩티드, 예컨대 항체의 정상 영역(Fc 부)을 암호하는 cDNA 단편을 연결하여 융합 단백질을 생산할 수도 있다.

이상과 같이 하여 얻어진 폴리펩티드는 일반적인 생화학적 방법에 의해서 단리 정제할 수 있다.

이하에 본 발명의 클론에 관한 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.

실시예 1: 클론 OM007

poly(A)⁺RNA의 조제

성인의 뇌조직에서 TRIzo1시약(TRlzol reagent, 등록 상표, GIBCO BRL에서 판매)을 이용하여 모든 RNA를 추출하고, mRNA 정제 키트(mRNA Purification Kit, 상품명, Pharmacia에서 판매)를 이용하여 poly(A)⁺RNA를 정제했다.

효모 SST cDNA 라이브러리의 조제

전술한 poly(A)⁺RNA를 주형에 XhoI 부위를 연결한 랜덤 9량체[5'-CGATTGAATTCTAGACCTGCCTCGAGNNNNNNNNN-3'(서열 번호 22)]를 프라이머로 하고, 수퍼스크립트·플라스미드·시스템(SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning, 상품명, GIBCOBRL에서 판매)을 이용하여 2본쇄 cDNA의 합성을 행했다. EcoRI 어댑터(GIBCOBRL에서 판매)를 DNA 결찰 키트 Ver.2(DNA ligation kit ver.2, 상품명, 다까라슈조(가부시키가이샤)에서 판매. 이후 cDNA의 연결은 전부 본 키트를 사용)를 이용하여 연결한 뒤, XhoI로 분해하고, 아가로스 전기 영동으로 300∼800 bp의 cDNA를 추출하여 분획한 뒤, pSUC2(미국 특허5536637호 참조)의 EcoRI/NotI 부위에 연결하고, 대장균 DH10B주에 일렉트로포레이션법으로 형질 전환하여 효모 SST용 cDNA 라이브러리를 얻었다.

SST에 의한 스크리닝 및 SST 양성 클론의 염기 서열의 결정

이 cDNA 라이브러리의 플라스미드를 조제하고, 아세트산 리튬법(Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1 를 참조)에 의해 효모 YTK12주를 형질 전환하고, 트립토판(Trp)이 함유되지 않은 효모 형질 전환체의 선택 배지(CMD-Trp 배지)의 평판 상에 도말하여, 30℃에서 48시간 배양 한 뒤, 액큐트런 레플리카 플레이터(Accutran Replica Plater, 상품명, Schleicher ＆Schuell에서 판매)를 이용하여 얻은 콜로니(형질 전환체)의 레플리카를, 라피노오스를 탄소원으로 하는 YPR 평판에 이식하여, 30℃에서 14일간 배양하였다. 3일 후 출현된 각각의 콜로니를 하나씩 다시 YPR 평판에 스트리킹하여 30℃에서 48시간 배양한 뒤, 단일 콜로니를 YPD 배양기에 이식하여 30℃에서 48시간 배양한 후, 플라스미드를 조제했다. 계속해서 pSUC2의 클로닝 부위의 양끝 서열에 두종류의 프라이머(센스쇄는 비오틴화 프라이머)를 이용하여 공지의 방법에 따라서 PCR를 행하고, 삽입된 cDNA를 증폭한 뒤 다이나비드(Dynabeads, 상품명, DYNAL에서 판매)를 이용하여 비오틴화 1본쇄 cDNA를 정제하여 염기 서열의 결정을 행했다. 염기 서열의 결정은 DNA 시퀀싱·키트[DNA Sequencing kit(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction), 상품명, Applied Biosystems Inc.에서 판매]를 이용한 형광 다이터미네이터 사이클 서열 분석법으로 반응을 행하고, 자동 DNA 시퀀서 373(Applied Biosystems Inc.)으로 판독을 행하였다(이후 염기 서열 결정은 모두 본 방법으로 행함).

얻어진 염기 서열 및 추정되는 아미노산 서열에 관해서 데이터 베이스와의 상동성 검색을 행하여, 데이터 베이스에 등록되어 있지 않은 신규의 cDNA인 것이 분명해진 클론에 대해서 전장 cDNA의 클로닝을 시도했다. 또한 추정되는 아미노산 서열을 이미 알려진 시그널 펩티드와 비교함으로써 각 cDNA가 기능적으로 또한 구조적으로도 시그널 펩티드를 갖는 것을 확인했다.

전장 cDNA의 클로닝 및 염기 서열의 결정

전장 cDNA의 클로닝은 마라톤·cDNA 증폭 키트(Marathon cDNA Amplification Kit, 상품명, Clontech사에서 판매)에 의한 3' RACE (Rapid Amplification of cDNA End)법을 이용하여 행했다. 2본쇄 cDNA 조제는 각 클론 유래, 즉 성인 뇌조직의 poly(A)⁺RNA로 제작했다. SST에서 얻어진 염기 서열의 정보에 기초하여 추정 번역 개시점 ATG 영역을 포함하는 27량체의 프라이머 OM007-F3:5'- AACTGCAGATCTTGGGACTCATCAGCC-3'(서열 번호 23)를 제작하여 그 키트에 첨부된 어댑터 프라이머로 PCR을 행했다. 또한, 한 번의 PCR로 cDNA가 충분히 증폭되지 않았기 때문에, OM007-F1 프라이머의 3'측에 다시 28량체의 프라이머 OM007-F2[5' -AAGAGGACATTGTTTTCATCATGGATGC-3'(서열 번호 24)]를 제작하여 네스티드(nested) PCR을 행하였다. 클론 OM007로 특이적으로 증폭된 cDNA를 아가로스 전기 영동으로 분획후, pT7Blue-2 T-Vector(상품명, Novagen에서 판매)에 연결하여, 대장균 DH5a로 형질 전환하여 플라스미드를 조제했다. 처음에 5'측의 염기 서열을 결정 하여 OM007SST cDNA의 염기 서열이 존재하는 것을 확인한 후, 전염기 서열을 결정하여 서열 번호 3으로 표시되는 cDNA 서열을 얻었다. 또한, 오픈 리딩 프레 임을 결정하고 아미노산으로 번역하여 서열 번호 1 및 2로 표시되는 서열을 얻었다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대하여 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OM007 및 그것을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 분비 단백질인 것이 판명되었다. 그러나 상동성 검색의 결과 BLASTX, BLASTP 및 FASTA는 클론 OM007(서열 번호 1의 아미노산 서열 21-765 사이의 영역)과 닭의 콜랩신2(collapsin-2[Gallus gallus], Genbank Accession U28240의 아미노산 서열 9∼753 사이의 영역) 사이에 유의적 상동성이 있는 것을 나타냈다. 이들의 상동성에 기초하여 클론 OM007은 적어도 콜랩신이 속하는 세마포린(Semaphori)계와 같은 활성을 보유할 것으로 예상된다.

실시예 2: 클론 OMB096

본 발명의 클론 OMB096에 관한 실시예는 OM007과 같은 수법을 이용했지만 이하의 점만 다르다.

전장 cDNA의 클로닝 및 염기 서열의 결정

전장 cDNA의 클로닝은 Marathon cDNA 증폭 Kit(상품명, C1ontech사에서 판매)에 의한 3'RACE 법을 이용하여, OM007과 같은 방법으로 행했다. 2본쇄 cDNA 조제는 각 클론에서 유래된, 즉 성인 뇌조직의 poly(A)⁺RNA로 제작했다. SST에서 얻어진 염기 서열의 정보에 기초하여 추정 번역 개시점 ATG 영역을 포함하는 27량체의 프라이머 OMB096-F1[5'-ACAACATGCACCACCAGTGGCTTCTGC-3'(서열 번호 25)]를 제작하여, 그 키트에 첨부된 어댑터 프라이머로 PCR을 행했다. 클론 OMB096으로 특이적으로 증폭된 cDNA를 OM007과 같은 수법으로 재클로닝하고 전염기 서열을 결정하여 서열 번호 6으로 표시되는 cDNA 서열을 얻었다. 또한, 오픈 리딩 프레임을 결정하고 아미노산으로 번역하여 서열 번호 4 및 5로 표시되는 서열을 얻었다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대해서 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OMB096 및 그것을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 분비 단백질인 것이 판명되었다.

실시예 3: 클론 OAF038-Leu 및 OAF038-Pro

본 발명의 클론 OAF038-Leu 및 OAF038-Pro 에 관한 실시예는 OM007과 같은 수법을 이용했지만 이하의 점만 다르다.

poly(A)⁺RNA의 조제

사람의 골수 스트로머 세포주 HAS303(동경 의과 대학 제1내과 소토야마케이스케교수, 아이자와 신 조수 공여)에서 TRIzol 시약(등록 상표, GIBCOBRL에서 판매)을 이용하여 모든 RNA를 추출하고, mRNA Purification Kit(상품명, Pharmacia에서 판매)를 이용하여 poly(A)⁺RNA를 정제했다.

전장 cDNA의 클로닝 및 염기 서열의 결정

전장 cDNA의 클로닝은 Marathon cDNA Amplification Kit(상품명, Clontech 사에서 판매)에 의한 3'RACE 법을 이용하여 OM007과 같은 방법으로 행했다. 2본쇄 cDNA 조제는 각 클론 유래, 즉 HAS303의 poly(A)⁺RNA로 제작했다. SST에서 얻어진 염기 서열의 정보에 기초하여 추정 번역 개시점 ATG 영역을 포함하는 28량체의 프라이머 OAF038-F1[5'-AGAATGTGGAGCCATTTGAACAGGCTCC-3'(서열 번호 26)]를 제작하고, 그 키트에 첨부된 어댑터 프라이머로 PCR을 행했다. 클론 OAF038에 특이적으로 증폭된 cDNA를 OM007과 같은 수법으로 재클로닝하고 전염기 서열을 결정하여, 서열 번호 9 및 12로 표시되는 cDNA서열을 얻었기 때문에 각각의 클론을 OAF038-Leu 및 OAF038-Pro라고 명명했다. 또한, 오픈 리딩 프레임을 결정하여 아미노산으로 번역한 결과, 각각 서열 번호 7, 8 및 10, 11로 표시되는 서열을 얻었다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대해서 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OAF038-Leu, OAF038-Pro 및 각각을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 막 단백질인 것이 판명되었다. 그러나, 상동성 검색의 결과 BLASTX, BLASTP 및 FASTA는 클론 OAF038-Leu 및 OAF038-Pro(서열 번호 7 및 10의 아미노산 서열 5∼343 사이의 영역)과 래트 MCA-32 단백질(Rat MCA-32 protein, Genbank Accession U39546의 아미노산 서열 42-268 사이의 영역)의 사이에 유의적 상동성이 있는 것을 나타내었다. 폴리펩티드 OAF038-Leu 및 OAFO38-Pro는 Rat MCA-32 단백질과 마찬가지로 세포외 영역에 Ig 도메인을, 세포질 영역에 SH2 도메인을 갖는 단백질이며, 이들의 상동성에 기초하여 클론 OAF038-Leu 및 OAF038-Pro는 적어도 상기한 Rat MCA-32 단백질과 같은 활성을 유지할 것으로 기대된다.

실시예 4: 클론 OR087H

본 발명의 클론 OR087H에 관한 실시예는 OM007과 같은 수법을 이용했지만 이하의 점만 다르다.

poly(A)⁺RNA의 조제

CLONTECH에서 태아의 간장 poly(A)⁺RNA(CL6527-1)를 구입했다.

전장 cDNA의 클로닝 및 염기 서열의 결정

전장 cDNA의 클로닝은 Marathon cDNA Amplification Kit(상품명, Clontech사에서 판매)에 의한 3'RACE 법을 이용하여 OM007과 같은 방법으로 행했다. 상기 키트의 방법에 따라서 각 클론 유래, 즉 태아 간장의 poly(A)⁺RNA로 어댑터를 연결한 2본쇄 cDNA를 조제했다. SST에서 얻어진 염기 서열의 정보에 기초하여 추정 번역 개시점 ATG 영역을 포함하는 27 mer의 프라이머 OR087H-F1:5'-TGAAGCCCTTGTCCGTAAGCCTTGAAC-3'(서열 번호 27)를 제작하고 그 키트에 첨부된 어댑터 프라이머로 PCR을 행했다. 클론 OR087H로 특이적으로 증폭된 cDNA를 OM007과 같은 수법으로 재클로닝하고 전염기 서열을 결정하여 서열 번호 15에 나타낸 cDNA 서열을 얻었다. 또한, 오픈 리딩 프레임을 결정하고 아미노산으로 번역하여 서열 번호 13 및 14로 표시되는 서열을 얻었다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대해서 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과 본 발명의 폴리펩티드 OR087H 및 그것을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 분비 단백질인 것이 판명되었다. 그러나, 상동성 검색 결과 BLASTX, BLASTP 및 FASTA는 클론 OR087H(서열 번호 13의 아미노산 서열 1-115 사이의 영역)과 사람의 라파마이신-FK506 결합 단백질(라파마이신 및 FK506 결합 단백질[호모사피엔스], Genbank Accession M75099의 아미노산 서열 1∼116 사이의 영역) 사이에 유의적 상동성이 있는 것을 나타냈다. 이들의 상동성에 기초하여 클론 OR087H는 적어도 FK 결합 단백질(FK-binding protein)계와 같은 활성을 보유할 것으로 기대된다.

실시예 5: 클론 OA004-FG 및 OA004-LD

본 발명의 클론 OA004-FG 및 OA004-LD에 관한 실시예는 OM007과 같은 수법을 이용했지만 이하의 점만 다르다.

poly(A)⁺RNA의 조제

사람의 신경교 아종세포주 T98G(ATCC No. CRL-1690)에서 TRIzol 시약(등록 상표, GIBCO BRL에서 판매)을 이용하여 모든 RNA를 추출하고, mRNA Purification Kit(상품명, Pharmacia에서 판매)를 이용하여 Poly(A)⁺RNA를 정제했다.

전장 cDNA의 클로닝 및 염기 서열의 결정

전장 cDNA의 클로닝은 진트랩퍼 cDNA 포지티브 셀렉션 시스템(GENETRAPPER cDNA Positive Selection System. 상품명, GIBCOBRL에서 판매)을 이용하여 행했다. 우선, SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(상품명, GIBCOBRL)을 이용하여 사람의 신경교 아종 세포주 T98G의 poly(A)⁺RNA에서 플라스미드 pSPORT1(GIBCO BRL)을 벡터로 하여 dT-프라이밍된 cDNA 라이브러리를 제작했다. 이어서 SST에서 얻어진 염기 서열의 정보에 기초하여 27량체의 비오틴화 프라이머 OA004-Fl[5'비오틴-ATGCACATCTTCAAGCATGCTCAG-3'(서열 번호 28)]를 제작한 뒤, Gene Trapper 키트의 방법에 따라서 비오틴화 프라이머와 특이적으로 하이브리드하는 플라스미드를 전술한 cDNA 라이브러리로부터 회수하여, 대장균 DH10B를 형질전환시켰다. 또한, 랜덤 프라이머·DNA 라벨링 키트(Random Primer DNA Labeling kit, 상품명, 다까라슈조에서 판매)를 이용하여³²P-dCTP로 라벨링한 OA004 SST cDNA를 시료로 하여 공지의 방법에 의해 콜로니 하이브리드화를 행하고, 양성 클론을 단리하여 플라스미드를 조제했다. 처음에 5'측의 염기 서열을 결정하여 OA004 SST cDNA의 염기 서열이 존재하는 것을 확인한 후 전염기 서열을 결정하고, 서열 번호 18 및 21로 표시되는 cDNA 서열을 얻었기 때문에, 각각 OA004-FG 및 OA004-LD라고 명명했다. 또한, 오픈 리딩 프레임을 결정하고 아미노산으로 번역하여 각각 서열 번호 16, 17 및 19, 20으로 표시되는 서열을 얻었다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대해서 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OA004-FG, OA004-LD 및 각각을 암호하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규 막 단백질인 것이 판명되었다. 그러나, 상동성 검색의 결과 BLASTX, BLASTP 및 FASTA는 클론 OA004-FG 및 OA004-LD(서열 번호 16 및 19의 아미노산 서열 151-353 사이의 영역)와 C.엘레강스 52.8kD 단백질(이론상 52.8kD 단백질[Caenorhabdtis elegans], SwissProt Accession YJ95_CAEEL의 아미노산 서열 238~453 상이의 영역)의 사이에 유의적 상동성이 있는 것을 나타냈다. 또, 클론 OA004-FG 및 OA004-LD(서열 번호 16 및 19의 아미노산 서열 236~319 사이의 영역)와 사람의 프레제닐린 2(presenillin-2[Homo sapiens], Genbank Accession A56993의 아미노산 서열 340~416 사이의 영역) 사이에서도 유의적이라고 생각되는 상동성이 있는 것을 나타내었다. 이들의 상동성에 기초하여 클론 OA004-FG 및 OA004-LD는 적어도 프레제닐린계와 같은 활성을 유지할 것으로 기대된다.

본 발명의 폴리펩티드 및 이것을 암호하는 cDNA는 1 혹은 그 이상의 효과나 생물 활성(이하에 열거하는 분석에 관련되는 것을 포함)을 나타내는 것이 생각된다. 본 발명의 단백질에 관해서 기술되는 효과 혹은 생물 활성은, 그 단백질의 투여 혹은 사용에 의해, 혹은 그 단백질을 암호하는 cDNA의 투여 혹은 사용(예컨대, 유전자 요법이나 cDNA 도입에 적당한 벡터)에 의해 제공된다.

시토킨 활성 및 세포 증식/분화 활성

본 발명의 단백질은 시토킨 활성 및 세포 증식(유도 혹은 저해)/분화 활성(유도 혹은 저해)을 나타낼 가능성, 혹은 어떤 세포 집단에 다른 시토킨의 생산을 유도 혹은 억제한다고 생각된다. 모든 공지의 시토킨을 비롯하여 현재 발견되어 있는 많은 단백성 인자는, 인자에 의존적인 1 혹은 그 이상의 세포 증식 분석법으로 활성을 나타내왔기 때문에, 이들 분석법은 시토킨 활성이 편리한 확인법으로서 기능한다. 본 발명의 단백질의 활성은 많은 종래의 인자 의존성 세포주의 세포 증식 분석중 어느것에 의해서도 증명될 수 있다.

면역 자극/억제 활성

본 발명의 단백질은 면역 자극 활성 및 면역 억제 활성도 나타낸다고 생각된다. 또한, 어떤 단백질은 예컨대 T림프구 및 B림프구 혹은 어느 한 쪽의 성장 및 증식을 제어(자극 혹은 억제)하는 것이나, 마찬가지로 NK 세포나 다른 집단의 세포 상해성 활성에 영향을 부여하는 것에 따라, 여러가지 면역 부전 및 질환[중증 복합 면역 결핍증(SCID)을 포함]의 치료에 효과를 나타낸다고 생각된다. 이들 면역 부전은 유전성인 경우도 있고, 예컨대 HIV 같은 바이러스나 마찬가지로 세균이나 곰팡이의 감염이 원인으로 발생하는 경우도 있다. 혹은, 자기 면역 질환으로부터 유래될 가능성도 있다. 구체적으로는, HIV, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 마이코박테리아, 레이슈마니아, 말라리아 및 칸디다 같은 여러가지 곰팡이 감염을 비롯한, 바이러스, 세균, 곰팡이 혹은 다른 감염에 의한 감염증의 원인을, 본 발명의 단백질을 이용함으로써 치료할 수 있다고 생각된다. 물론, 이와 관련하여 본 발명의 단백질은 면역 시스템이 증대하고 있는 것이 일반적으로 시사되는 경우, 즉 암치료의 개소에서 효과를 나타낸다고 생각된다.

본 발명의 상기 단백질은, 알레르기 반응 및 천식이나 기타 호흡기계 질환과 같은 증상의 치료에도 효과를 나타낸다고 생각된다. 면역 억제가 요구되는 것 같은 다른 상태(예컨대, 천식이나 관련 호흡기 질환을 포함)에도 본 발명의 단백질을 이용하여 치료할 수 있다고 생각된다.

본 발명의 단백질은, 예컨대 패혈병성 쇼크 혹은 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)과 같은 염증성 대장염, 클론병, 혹은 IL-11에 의해 효과가 증명된 TNF나 IL-1 같은 시토킨의 과잉 생산에 유래하는 감염에 관련된 만성 혹은 급성의 염증을 억제할 가능성도 있다.

조혈 세포 제어 활성

본 발명의 단백질은, 조혈 세포의 제어에, 또 그에 따라서 골수구양 세포 혹은 림프구양 세포의 결핍에 대한 치료에도 효과를 나타낸다고 생각된다. 콜로니 형성 세포 혹은 인자 의존성 세포주의 원조 하에서의 극히 약한 생물 활성에서 조차도, 조혈 세포의 제어에 관계되는 것을 시사한다. 그 생물 활성이란 다음에 기재하는 예의 전부 혹은 그 어느 하나로 예시된 것에 관한 것이다. 적혈구 전구 세포만의 성장 및 증식 지지, 혹은 다른 시토킨과의 조합, 또한 그것이 시사하는 유효성, 예컨대 여러가지 빈혈의 치료, 혹은 적혈구 전구 세포 및 적혈구 혹은 이 중 어느 하나의 생산을 자극하는 방사선 요법/화학 요법과 조합하여 사용; 과립구 및 단구/대식세포와 같은 골수구의 성장 및 증식 지지(즉, 고전적인 CSF 활성), 화학 요법에 따르는 골수 억제를 막기 위한 화학 요법과의 병용; 거핵구의 성장 및 증식과 후속되는 혈소판의 성장 및 증식의 지지, 이에 의해 혈소판 감소증 같은 여러가지 혈소판 장해를 방어 및 치료를 가능하게 하는 혈소판 수혈시 혹은 상보적인 일반적 사용; 상기 조혈 세포 중 몇가지 세포 혹은 모든 세포로 성숙 가능한 조혈 간세포의 성장 및 증식의 지지, 따라서 여러가지 간세포 장해(한정은 되지 않지만, 재생 불량성 빈혈 및 발작성 야간 혈색소뇨증을 포함한, 이식으로 일반적으로 치료되는 것 등)에 치료적 효과를 발견할 수 있고, 또한 정상 세포 혹은 유전자 요법을 위해 유전적으로 조작된 세포를 시험관내 혹은 생체외(즉, 골수 이식에 따름) 중 어느 한 쪽에서, 방사선 요법/화학 요법 후에 간세포 분획의 재구축을 수행하는 것도 마찬가지이다.

본 발명의 단백질은 다양한 방법 중에서 이하의 방법으로 측정하는 것이 가능하다.

조직 생성/수복 활성

본 발명의 단백질은 손상 치유 및 조직 수복과, 또 화상, 절개 및 궤상의 치료와 같이, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 및 신경 조직 성장 혹은 재생 중 어느 하나에 사용된다고 생각된다.

뼈를 정상적으로 형성하지 않는 환경에서의 연골 및 뼈 혹은 이 중 어느 하나의 성장을 유도하는 본 발명의 단백질은 사람 및 다른 동물의 골절 및 연골 손상 혹은 결손의 치유에 적용된다. 본 발명의 단백질을 사용하고 있는 제제는 개방 골절과 마찬가지로 폐쇄 골절의 접골, 또 인공 관절 고정의 개량에 이용된다. 골형성제에 의해 유도된 신생 골 형성은 선천성, 외상성, 암절제술에 의해 유발된 두개안면의 결손의 회복에 공헌한다. 또한, 미용 성형 외과 분야에도 유효하다.

본 발명의 단백질은 치근막증의 치료 및 기타 치아의 수복에도 사용된다고 생각된다. 그러한 약품은 골형성 세포를 유인하여, 그 세포의 증식을 자극하고 그 전구 세포의 분화를 유도하는 환경을 제공한다고 생각된다. 본 발명의 단백질은 뼈 및 연골 혹은 어느 하나의 회복을 자극하는 것을 통해서, 혹은 염증 혹은 염증 과정에서 개재되는 조직 파괴(콜라게나아제 활성이나 파골 세포의 활성)의 과정을 저지함으로써, 골다공증 및 골관절염의 치료에 유효하다고 생각된다.

본 발명의 단백질에 기인한다고 생각되는 조직 재생 활성의 다른 카테고리는 힘줄/인대 형성이다. 본 발명의 단백질은 힘줄/인대 형태 조직 혹은 다른 조직이 정상적으로 형성되지 않은 환경에서 그러한 조직 형성을 유도하는 것이지만, 사람 및 다른 동물에서 힘줄/인대의 열상, 기형 및 기타 힘줄/인대의 장해의 치유에 적용할 수 있다. 힘줄/인대 형태 조직을 유도하는 단백질을 사용하고 있는 제제는, 골 혹은 다른 조직으로의 힘줄/인대 고정의 개량 및 힘줄/인대 조직 결손의 회복에서의 사용은 물론, 힘줄 혹은 인대 손상의 방어에 대하여 예방적 사용도 생각된다. 본 발명의 구성물에 의해 유도된 신생 힘줄/인대 형태 조직 형성은 선천성, 외상 혹은 다른 기원의 힘줄 혹은 인대 결손의 수복에 공헌한다. 또한, 힘줄 혹은 인대의 접합 혹은 수복이라는 미용 성형 외과에도 유효하다. 본 발명의 구성물은 힘줄/인대 형성 세포를 유인하여 그 세포의 증식을 자극하고, 그 전구 세포의 분화를 유도하는 환경을 제공한다고 생각된다. 혹은 조직 수복을 달성하기 위해서 생체내로의 반환에 대비하여 시험관내에서 힘줄/인대 세포 혹은 그 전구 세포를 유도한다. 상기 발명의 구성물은 건염, 수근 터널 증후군(Carpal tunne1 syndrome) 및 그 외의 힘줄 혹은 인대 결손의 치료에도 유효하다. 그 구성물에는 적당한 기질 및 담체와 마찬가지로 당업자에게 잘 알려져 있는 격리제도 포함된다.

본 발명의 단백질은 신경 세포의 증식 및 신경과 뇌조직의 재생, 즉 신경 세포 혹은 신경 조직의 변성, 사망 혹은 외상을 포함하는 기계적 및 외상적 장해와 마찬가지로 중추 및 말초 신경계 질환 및 신경병의 치료에 대해서도 효과를 나타낸다고 생각된다. 구체적으로는, 어떤 단백질은 말초 신경 장해, 말초 신경증 및 국소적 신경증같은 말초 신경계의 질환 및 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측책(側策)증(amyotropic lateral) 및 샤이·드레거(Shy-Drager) 증후군 같은 중추 신경계의 질환의 치료에 유효하다고 생각된다. 또한, 본 발명에 따라서 치료될 수 있는 조건에는 척수장해, 두부 외상 및 뇌졸중 등의 뇌혈관 질환 같은 기계적 및 외상적 장해를 포함한다. 화학 요법 혹은 다른 치료에 기인하는 말초 신경증도 본 발명의 단백질을 이용하여 치료 가능하다.

본 발명의 단백질은 예컨대 췌장, 간장, 장, 신장, 피부, 내피를 포함하는 장기, 평활, 골격 혹은 심장 근육 및 혈관 내피를 포함하는 혈관 조직같은 다른 조직을 생성하는 활성, 혹은 그러한 조직을 구성하는 세포의 증식을 촉진하는 활성을 나타낼 가능성도 기대된다. 요구되는 효과의 일부는 정상 조직을 재생시키는 섬유성 반흔(scarring)의 저해에 의해서도 담당된다고 생각된다.

본 발명의 단백질은 소화관 보호 혹은 재생 및 폐 혹은 간장의 섬유화, 여러가지 조직의 재환류손상 및 전신성 시토킨 장해에 기인하는 상태에 대한 치료에도 유효하다고 생각된다.

액티빈/인히빈 활성

본 발명의 단백질은 액티빈/인히빈에 관련된 활성을 나타낸다고 생각된다. 액티빈은 여포 자극 호르몬(FSH)의 방출을 자극하는 활성에 의해서 특징지어지지만, 인히빈은 여포 자극 호르몬(FSH)의 방출을 저해하는 활성에 의해서 특징지어진다. 따라서, 본 발명의 단백질은 단독 혹은 인히빈 α계의 구성원과의 이종이량체로서, 포유류 동물의 암컷의 수정율을 감소시켜 수컷의 정자 형성을 감소시키는 인히빈의 활성에 기초하는 피임 조절제로서 유효하다고 생각된다. 충분량의 다른 인히빈의 투여에 의해서도 포유 동물의 불임이 유도 가능하다. 한편, 본 발명의 단백질은 인히빈 β그룹의 다른 단백질 서브유니트와의 동종이량체 혹은 이종이량체로서, 전뇌하수체의 세포로부터 FSH 방출을 자극하는 액티빈 분자의 활성에 기초한 치료적인 불임 유도에 유효하다고 생각된다(미국 특허 4,798,885를 참조). 본 발명의 단백질은 소, 양 및 돼지와 같은 가축의 생애 출산 능력 가능한 기간을 연장시키기 때문에, 성적으로 미숙한 포유류 동물에 있어서의 임신 개시를 빠르게 하는데 유효하다고 생각된다.

주화성/화학 운동성 활성

본 발명의 단백질은 예컨대, 단구, 호중구, T세포, 마스트세포, 호산구 및 내피 세포 혹은 이 중 어느 것을 포함하는 포유 동물의 세포에 대해서, 예컨대 케모카인으로서 작용하는 주화성/화학 운동성 활성을 갖는다고 생각된다. 주화성/화학 운동성 단백질은 반응이 요구되는 부위로 요구되는 세포 집단을 고정화 혹은 유인하기 위해 사용되는 것이 가능하다. 주화성/화학 운동성 단백질은 국소적인 감염과 같이 창상 및 다른 외상의 치료에 특별한 우위성을 제공한다. 예컨대, 림프구, 단구 혹은 호중구를 종양 혹은 감염부위로 유인하는 것은 종양 혹은 감염 부위에 대한 면역 응답을 개선하는 결과가 된다고 생각된다.

단백질이나 펩티드는 만약 그것이 직접 혹은 간접적으로 특수한 세포 집단에 대하여 지시된 방향 혹은 운동을 자극 가능하다면, 그와 같은 세포 집단에 대한 주화성 활성을 보유하고 있다. 바람직하게는 그 단백질이나 펩티드는 세포의 지시된 운동을 직접적으로 자극하는 활성을 보유하는 것이 좋다. 특별한 단백질이 어느 집단의 세포에 대하여 주화성 활성을 유지하는가 아닌가는, 어떠한 이미 알려진 세포 주화성의 분석법에 그러한 단백질 혹은 펩티드를 사용하더라도 용이하게 결정할 수 있다.

응혈 및 혈전 활성

본 발명의 단백질은 응혈 혹은 혈전 활성도 나타낸다고 생각된다. 결과적으로, 그와 같은 단백질은 여러가지 응고 장해(혈우병같은 유전성 장해를 포함)의 치료에 유효할 것으로 예상된다. 혹은 외상, 수술 혹은 다른 원인에 의해 생긴 창상의 치료에 있어서 응고 및 다른 응혈 사상을 촉진시키는 것이 예상된다. 본 발명의 단백질은 혈전 형성의 용해 혹은 저해 및 혈전 혹은 졸중 등에 의해 생기는 상태의 치료 및 예방에도 효과가 있다고 생각된다.

수용체/리간드 활성

본 발명의 단백질은 수용체, 수용체/리간드 혹은 수용체/리간드의 억제제 혹은 작동물질로서의 활성을 나타낼 가능성도 있다. 그러한 수용체 및 리간드의 예로서 시토킨 수용체 및 그 리간드, 수용체 키나제 및 그 리간드, 수용체 포스파타아제 및 그 리간드, 세포간 상호 작용에 관련된 수용체[셀렉틴(Selectin), 인테그린(Integurin) 및 그 리간드, 수용체 키나제 등의 세포 접착 분자를 포함] 및 그 리간드 및 항원 제시, 항원 인식 및 세포성 및 액성 면역 반응의 발달에 관계되는 수용체/리간드의 조합을 들 수 있지만 본 발명을 제한할만한 것은 아니다. 수용체 및 리간드는 그 상호 작용에 대한 가능한 펩티드 혹은 소분자의 억제제의 스크리닝에도 유효하다. 본 발명의 단백질(수용체 및 리간드의 단편을 포함하지만, 제한되는 것은 아님)은 그 자신의 수용체/리간드와의 상호 작용 억제제로서 유효하다고 생각된다.

기타 활성

본 발명의 단백질(폴리펩티드)은 이하에 나타내는 부가적인 활성 혹은 효과의 하나 혹은 그 이상을 나타낸다고 생각된다. 즉, 세균, 바이러스, 곰팡이 및 다른 기생충을 포함하는 감염성의 물질을 살상하고, 신장, 체중, 털의 빛깔, 눈의 빛깔, 피부 혹은 다른 조직의 색소 침착 혹은 예컨대 흉부 증량 혹은 감량 등 기관의 크기 등의 신체적 특징을 억제 혹은 촉진하는 효과를 미친다. 또, 식이 지방, 단백질 혹은 탄수화물의 분해에 효과를 미치고, 식욕, 성욕, 스트레스, 인식(인식 장해), 울병, 폭력 행동을 포함하는 행동 특징에 효과를 미친다. 진통 효과 혹은 다른 통증을 감소시키는 효과를 미치고, 배성간세포의 조혈계 이외의 다른 계통으로의 분화 및 증식을 촉진하며, 효소의 경우 그 효소의 결실을 보충하고 관련 질환을 치료한다.

상기 활성을 갖는 단백질은 예컨대, B세포, T세포, 비만 세포의 증식 또는 세포사, 면역글로불린의 클래스 스위치 촉진에 의한 클래스 특이적 유도, B세포의 항체 생산 세포로의 분화, 과립구 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사, 단구·대식세포 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사, 호중구, 단구·대식세포, 호산구, 호염기구의 증식 또는 기능 항진, 세포사, 거핵구 전구 세포의 증식 또는 세포사, 호중구 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사, B 또는 T 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사, 적혈구의 생산 촉진, 적혈구, 호중구, 호산구, 호염기구, 단구·대식세포, 비만 세포, 거핵구 전구 세포의 증식 지지, 호중구, 단구·대식세포, B세포 또는 T세포의 유주 촉진, 흉선 세포의 증식 또는 세포사, 지방 세포의 분화 억제, 천연 킬러 세포의 증식 또는 세포사, 조혈 간세포의 증식 또는 세포사, 간세포 및 각종 조혈 전구 세포의 증식 억제, 간엽계 간세포로부터의 골 아세포, 연골 세포로의 분화 촉진 또는 증식, 세포사 혹은 파골 세포의 활성화나 단구로부터 파골 세포로의 분화 촉진에 의한 골흡수의 촉진 작용을 본 발명의 폴리펩티드만으로, 또한 리간드 수용체 사이의 결합을 통해 혹은 다른 분자와 상승적으로 작용하는 것에 의해 보유한다고 생각된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 신경계에도 작용하는 것이 예측되기 때문에, 각종 신경 전달 물질 작동성 신경 세포로의 분화 및 이들의 생존 유지 또는 세포사, 신경교 세포의 증식 촉진 또는 세포사, 신경 돌기의 신장, 신경절 세포의 생존 유지 또는 세포사, 아스트로부위의 증식 또는 분화 촉진 또는 세포사, 말초 신경의 증식 또는 생존 유지, 세포사, 슈반 세포의 증식 또는 세포사, 운동 신경의 증식 또는 생존 유지, 세포사의 작용도 있다고 생각된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 초기배의 발생 과정에서, 외배엽 유도 작용 에 의한 표피, 뇌, 등뼈, 신경의 기관 형성, 중배엽 유도 작용에 의한 배색(背索) 결합 조직(뼈, 근육, 힘줄), 혈구 세포, 심장, 신장, 생식소의 기관 형성, 혹은 내배엽 유도 작용에 의한 분해기계 장기(위, 장, 간장, 췌장), 호흡기계(폐, 기관)의 형성에 촉진적 또는 억제적으로 작용한다고 생각됨과 동시에, 생체에 있어서도 상기 기관의 증식 혹은 증식 억제 작용을 갖는다고 생각된다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 그 자신이 면역계 또는 신경계 혹은 골대사 기능의 저하 또는 항진에 관한 질환, 또는 조혈계 세포의 발육 부전 또는 이상 증식, 예컨대 염증성 질환(류머티즘, 궤양성 대장염 등), 골수 이식 후의 조혈 간세포의 감소증, 암, 백혈병에 대한 방사선 조사 또는 화학 요법제 투여 후의 백혈구, 혈소판, B세포 또는 T세포의 감소증, 빈혈, 감염증, 암, 백혈병, AIDS, 골대사 이상(골다공증 등), 각종 변성 질환(알츠하이머병, 다발성 경화증 등), 혹은 신경 손상의 예방 또는 치료약으로서 이용될 것이 기대된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽에서 유래된 기관의 분화 또는 증식 작용을 갖는다고 생각되기 때문에 각 기관(표피, 뼈, 근육, 힘줄, 심장, 신장, 위, 장, 간장, 췌장, 폐, 기관 등)의 조직 회복제로서 이용하는 것도 기대된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드의 폴리클로널 항체 또는 모노클로널 항체를 이용하여 생체에서의 그 폴리펩티드의 정량을 행할 수 있고, 이로써 그 폴리펩티드와 질환과의 관계의 연구 혹은 질환의 진단 등에 이용할 수 있다. 폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체는 그 폴리펩티드 혹은 그 단편을 항원으로서 이용하여 통상적인 방법에 의해 제작할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드(바람직하게는 그 세포외 도메인의 폴리펩티드)를 이용함으로써, 예컨대 친화성 컬럼을 제작하여 본 폴리펩티드와 결합하는 이미 알려진 또는 미지의 단백질(리간드)의 동정, 정제 혹은 그 유전자 클로닝을 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드(바람직하게는 그 막관통 영역 또는 세포내 도메인의 폴리펩티드)를 이용하여, 예컨대 웨스트-웨스턴법에 의해, 또는 그 cDNA(바람직하게는 상기 폴리펩티드의 막관통 영역 또는 세포내 도메인을 암호하는 cDNA)를 이용하여, 예컨대 효모 2-하이브리드법에 의해 상기 폴리펩티드와 세포질내에서 상호작용하는 하류의 시그널 전달 분자의 확인, 유전자 클로닝을 행할 수도 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하는 것에 의해, 본 폴리펩티드 수용체 작동물질, 길항물질 및 수용체-시그널 전달 분자 사이의 저해제 등의 스크리닝을 행할 수도 있다.

본 발명의 cDNA는 많은 유용성이 기대되는 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 때의 중요하면서 필수적인 주형이 될 뿐만 아니라, 유전병의 진단이나 치료(유전자 결손증의 치료 또는 안티센스 DNA(RNA)에 의해서, 폴리펩티드의 발현을 정지시키는 것에 의한 치료 등)에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 cDNA를 프로브로 하여 게놈 DNA를 분리할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 cDNA와 상동성이 높은 사람의 관련 폴리펩티드의 유전자, 또한, 마우스 이외의 생물에서 본 발명의 폴리펩티드와 상동성이 높은 폴리펩티드의 유전자를 분리하는 것도 가능하다.

의약품에의 적용

상기한 질환에 적응하기 위해서, 본 발명의 폴리펩티드 혹은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 통상 전신적 또는 국소적으로, 일반적으로는 경구 또는 비경구의 형태로 투여된다. 바람직하게는 경구 투여, 정맥내 투여 및 뇌실내 투여가 좋다.

투여량은 연령, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1인당 1회에 100 μg에서 100 mg의 범위로 1일 1회 내지 수회 경구 투여되거나 또는 성인 1인당 1회에 10 ㎍에서 100 ㎎의 범위로 1일 1회 내지 수회 비경구 투여된다.

물론 상기와 같이 투여량은 여러가지 조건에 의해 변동하기 때문에 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또한 범위 이상으로 필요한 경우도 있다.

본 발명의 화합물을 투여할 때에는, 경구 투여를 위한 고체 조성물, 액체 조성물 및 그 밖의 조성물, 비경구 투여를 위한 주사제, 외용제, 좌제 등으로서 이용된다.

경구 투여를 위한 고체 조성물에는 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제 등이 포함된다. 캡슐에는 연질 캡슐 및 경질 캡슐이 포함된다.

이러한 고체 조성물에 있어서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질이 적어도 하나의 불활성 희석제(예컨대 락토오스, 만니톨, 글루코오스, 히드록시 프로필셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루미늄산마그네슘 등)와 혼합된다. 조성물은 통상적인 방법에 따라서 불활성 희석제 이외의 첨가물 예컨대, 윤활제(스테아르산 마그네슘 등), 붕괴제(섬유소 글리콜산 칼슘 등), 안정화제(사람의 혈청 알부민, 락토오스 등), 용해 보조제(아르기닌, 아스파라긴산 등)을 함유하고 있어도 좋다.

정제 또는 환제는 필요에 따라 백당, 젤라틴, 히드록시 프로필셀룰로오스, 히드록시 프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트 등의 위용성 혹은 장용성의 필름으로 피막해도 좋고, 또한 2이상의 층으로 피막해도 좋다. 또한 젤라틴처럼 흡수될 수 있는 물질의 캡슐도 포함된다.

경구 투여를 위한 액체 조성물은 약학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭시르제 등을 포함하고, 일반적으로 이용되는 불활성 희석제(예컨대 정제수, 에탄올 등)를 포함하고 있어도 좋다. 이러한 조성물은 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제를 함유하고 있어도 좋다.

경구 투여를 위한 그 밖의 조성물로서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 포함하여 공지의 방법 자체로 처방되는 분무제가 포함된다. 이 조성물은 불활성 희석제 이외에 아황산수소나트륨같은 안정제와 등장성을 부여하는 것 같은 안정화제, 염화나트륨, 구연산나트륨 혹은 구연산같은 등장제를 함유하고 있어도 좋다. 분무제의 제조 방법은 예컨대 미국 특허 제2,868,691호 및 동 제3,095,355호 명세서에 자세히 기재되어 있다.

본 발명에 의한 비경구 투여를 위한 주사제로서는 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 유탁제를 포함한다. 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제로서는, 하나 또는 그 이상의 활성 물질이 적어도 하나의 불활성 희석제와 혼합한다. 수성의 희석제로서는 예컨대 주사용 증류수 및 생리 식염수를 들 수 있다. 비수성 희석제로서는, 예컨대 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유같은 식물유, 에탄올같은 알콜류, 폴리솔베이트 80(등록 상표) 등을 들 수 있다.

이러한 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예컨대, 인간혈청 알부민, 락토스 등), 용해 보조제(예컨대, 아르기닌, 아스파라긴산 등)같은 보조제를 포함하고 있더라도 좋다.

Claims (10)

1. 실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 그 동족체, 그 단편 또는 그 단편의 동족체로 이루어진 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16 또는 19에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제1항에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 cDNA.
4. 서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17 또는 20에 제시된 염기 서열을 가지는 제3항에 기재된 cDNA, 또는 그 서열에 선택적으로 하이브리드하는 단편으로 이루어지는 cDNA.
5. 서열 번호 3, 6, 9, 12, 15, 18 또는 21에 제시된 염기 서열을 가지는 제3항에 기재된 cDNA, 또는 그 서열에 선택적으로 하이브리드하는 단편으로 이루어지는 cDNA.
6. 제3항 내지 제5항중 어느 한 항에 기재된 cDNA로 이루어지는 복제 또는 발현 벡터.
7. 제6항에 기재된 복제 또는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
8. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서 제7항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것으로 이루어지는, 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 제조 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 모노클로널 또는 폴리클로널 항체.
10. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 또는 제9항에 기재된 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.