KR20010030656A

KR20010030656A - 전자 부품 제조를 위한 펜토피라노실뉴클레오사이드의용도, 및 이의 접합체

Info

Publication number: KR20010030656A
Application number: KR1020007003006A
Authority: KR
Inventors: 미쿨카크리스티안; 빈다브노르베르트; 브란드슈테터틸만; 부르딘스키게르하르트
Original assignee: 아벤티스 레제아르히 운트 테히놀로기스 게엠베하 운트 콤파니 카게
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 2001-04-16
Also published as: US7153955B2; AU9627198A; EP1017703B1; CA2303229A1; JP4674964B2; JP2001517675A; US6608186B1; US20060270840A1; WO1999015541A2; WO1999015540A3; AU751058B2; ATE265462T1; WO1999015541A3; US6613894B1; US20090221793A1; WO1999015540A2; US20040198966A1; US20050053945A1; WO1999015539A3; BR9812381A

Abstract

본 발명은 다음 화학식 I 또는 II의 펜토피라노실뉴클레오사이드, 이의 제조 방법, 및 치료제, 진단제 및/또는 전자 부품을 제조하기 위한 용도에 관한 것이다:

화학식 I

화학식 II

Description

전자 부품 제조를 위한 펜토피라노실뉴클레오사이드의 용도, 및 이의 접합체{Use of a pentopyranosyl nucleoside for producing an electronic component, and conjugates of said pentopyranosyl nucleoside}

본 발명은 다음 화학식 I 또는 II의 펜토피라노실뉴클레오사이드, 이의 제조 방법, 및 전자 부품, 특히 진단제 형태의 전자 부품 제조를 위한 용도에 관한 것이다:

피라노실핵산(p-NA)은 일반적으로, 펜토즈 단위가 피라노즈 형태로 존재하고 C-2'와 C-4' 위치 간의 포스포디에스테르 그룹에 의해 반복적으로 연결되는, 천연 RNA에 대해 이성체 형태인 구조적 유형을 나타낸다(도 1). "뉴클레오염기"는 본원에서 표준 뉴클레오염기 A, T, U, C, G를 의미하긴 하지만, 본 발명의 범주 내에서는, 이소구아닌/이소사이토신 쌍과 2,6-디아미노퓨린/크산틴 쌍 뿐만 아니라 기타 퓨린과 피리미딘들을 의미하는 것으로 인지된다. p-NA, 즉 리보즈로부터 유도된 p-RNAs는 에쉔모저(Eschenmoser) 등에 의해 처음으로 기재되었다[참조: Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161; Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta 1995, 78, 1621; Angew. Chem. 1996, 108, 1619-1623]. 이는 소위 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍을 이룬, 즉 퓨린-피리미딘- 및 퓨린-퓨린 쌍을 이룬 역병렬식의 가역적으로 "용융되는" 준선형의 안정한 이중나선(duplex)만을 형성한다. 키랄성의 반대 개념의 호모키랄 p-RNA 쇄 또한 조절 가능한 수준으로 쌍을 형성하며, 엄밀히 말하면 상기와 같이 형성된 이중나선에서 비-나선형이다. 초분자 단위의 제작에 매우 유용한 이러한 특이성은 리보피라노즈 포스페이트 주쇄의 비교적 낮은 가요성과 연관이 있으며 상기 쇄 축에 대한 밑면의 경사도가 크고 이로 인해 현수선간 기선이 상기 생성된 이중나선에 겹쳐 쌓여지게 되어 최종적으로는 2',4'-시스-이치환된 리보피라노즈 환이 상기 주쇄의 제작에 참여하게 되는 원인이 될 수 있다. 이와 같이 상당히 더 우수한 쌍을 이루고자 하는 성질로 인해, p-NA 쌍 형성 시스템이 초분자 단위의 제작에 사용하는데 있어서 DNA 및 RNA와 비교해서 더 바람직하다. 이들은 천연 핵산과 직교 형태의 쌍 형성 시스템을 이루고 있는데, 즉 이들은 천연 형태의 DNA와 RNA와는 쌍을 형성하지 않는데, 이것이 특히 진단 분야에서 중요하다.

에쉔모저 등(1993, 상기 참조)이 도 2에 도시된 바와 같고 다음에 예시된 바와 같은 p-RNA를 최초로 제조하였다.

이러한 맥락에서, 적절하게 보호된 뉴클레오염기를 비스(트리메틸실릴)아세트아미드와 루이스산, 예를 들면, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트의 작용에 의해 테트라벤조일리보피라노즈의 아노머(anomer) 혼합물과 반응시킨다[참조: H. Vorbruggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber. 1981, 114, 1234]. 염기(퓨린의 경우에는 THF/메탄올/물 중의 NaOH; 피리미딘의 경우에는 MeOH 중의 포화 암모니아)의 작용하에서, 아실 보호된 그룹을 상기 당으로부터 제거하고, 이러한 생성물을 p-아니스알데히드 디메틸 아세탈을 이용한 산성 촉매 작용하에서 3',4'-위치에 보호시킨다. 이러한 부분입체이성체 혼합물을 2'-위치에서 아실화시키고, 3',4'-메톡시벤질리덴-보호된 2'-벤조에이트를, 예를 들면, 메탄올 중의 트리플루오로아세트산으로 산성 처리하여 탈아세탈화시킨 다음 디메톡시트리틸 클로라이드와 반응시킨다. 상기 벤조에이트의 2'→3' 이동은 p-니트로페놀/4-(디메틸아미노)피리딘/트리에틸아민/피리딘/n-프로판올로 처리함으로써 개시한다. 거의 모든 반응을 칼럼 크로마토그래피하여 후처리시킨다. 이어서, 이러한 방식으로 합성된 주요 단위, 즉 리보피라노즈의 4'-DMT-3'-벤조일-1'-뉴클레오염기 유도체를 부분적으로 포스피틸화시킨 다음 링커를 통하여 고체 상에 결합시킨다.

다음의 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성에서는, 4'-위치에서의 캐리어-결합된 성분을 반복적으로 산성적으로 탈보호시키고, 포스포르아미다이트를 커플링 시약, 예를 들면, 테트라졸 유도체의 작용하에서 커플링시키며, 여전히 자유 상태의 4'-산소 원자를 아세틸화시킨 다음 인 원자를 산화시킴으로써 올리고머성 생성물을 수득하게 된다. 이어서, 나머지 보호 그룹을 제거하고, 생성물을 정제시킨 다음 HPLC를 통하여 탈염시킨다.

그러나, 앞서 기재된 에쉔모저 등(1993, 상기 참조)의 방법은 다음과 같은 단점을 나타낸다:

1. 뉴클레오염기와의 뉴클레오사이드화 반응에 비-아노머적으로 순수한 테트라벤조일펜토피라노즈[참조: H.G. Fletcher, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 5337]을 사용하게 되면, 후속 후처리 단계에서 엄격한 크로마토그래프 절단물의 필요성으로 인해 최종 생성물의 수율이 저하된다.

2. 1'-위치에 뉴클레오염기를 갖는 리보피라노즈로 부터 출발하여 보호된 3'-벤조에이트까지의 5번의 반응 단계로 인해, 합성 과정이 매우 길어지게 되어 산업상 대규모로 수행하는 것이 거의 불가능해진다. 비용이 많이 드는 것 이외에도, 수득된 단량체 단위의 수율이 낮은데; 퓨린 단위 아데닌의 경우에는 29%이고, 피리미딘 단위 우라실의 경우에는 24%이다.

3. 올리고뉴클레오타이드의 합성에서는, 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸이 자동화 p-RNA 합성에서 커플링 시약으로서 이용된다. 이러한 경우, 아세토니트릴 중의 테트라졸 용액 중에서의 상기 시약의 농도는 너무 높아서 상기 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸이 합성기의 얇은 튜빙에 규칙적으로 결정화됨으로써 상기 합성이 조기에 종결된다. 더우기, 상기 올리고머가 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸에 오염되는 것으로 관찰되었다.

4. 앞서 기재된 p-RNA 올리고뉴클레오타이드의 후처리, 특히 하이드라진 용액으로 염기-불안정한 보호 그룹을 제거하는 것이 상기 올리고머 중의 티미딘 분획이 높을 경우에는 항상 가능하지 않다.

생체 분자, 예를 들면, DNA 또는 RNA는 이들 생체 분자 둘 다가 뉴클레오염기의 상보 서열의 결과로서 수소 브릿지의 형성에 의해 서로 결합할 수 있는 분획을 함유하는 경우에는, 또 다른 생체 분자, 예를 들면, DNA 또는 RNA와의 비-공유적 연결에 사용될 수 있다. 이러한 유형의 생체 분자는 예를 들면, 시그날 증폭을 위한 분석용 시스템에 사용되는데, 여기서는 분석하고자 하는 서열을 지닌 DNA 분자를 한편으로는 상기 비-공유적 DNA 링커를 통하여 고체 지지체 상에 고정화시키고, 다른 한편으로는 시그날-증폭성 분지된 DNA 분자(bDNA)에 결합시킨다[참조: S. Urdea, Biol/Technol. 1994, 12, 926 또는 미국 특허 제5,624,802호]. 최종적으로 언급된 시스템의 주요 단점은 지금까지도 이들 시스템이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 핵산 진단 방법에 대한 민감도와 관련된 사항이라는 것이다[참조: K. Mullis, Methods Enzymol. 1987, 155, 335]. 이는 특히, 분석하고자 하는 DNA 분자에 대한 고체 지지체의 비-공유 결합 뿐만 아니라 분석하고자 하는 DNA 분자의 비-공유 결합이, "서열 인식" 기능과 "비-공유 결합" 기능의 혼합이 이루어짐으로 인해 항상 특이적으로 발생되지는 않는다는 사실에서 비롯된 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규의 생체 분자, 및 상기 언급된 단점들을 극복할 수 있는 이들의 제조 방법을 제공하는 것이다.

DNA 또는 RNA 쌍 형성 시스템에 개입하지 않는 직교 쌍 형성 시스템으로서 p-NA를 사용하는 것이 상기 문제점을 유리하게 해결해 주는데, 이는 언급된 분석 공정의 민감도가 현저하게 증가될 수 있기 때문이다.

본 발명의 하나의 주제는 전자 부품, 특히 진단제 형태의 전자 부품을 제조하기 위한, 펜토피라노실뉴클레오타이드 또는 펜토피라노실핵산과 생체 분자를 포함하는 바람직하게는 접합체 형태의 펜토피라노실뉴클레오타이드 또는 펜토피라노실핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 범주 내에서의 접합체는 p-NAs 및 다른 생체 분자의 공유적으로 결합된 하이브리드, 바람직하게는 펩타이드, 단백질 또는 핵산, 예를 들면, 항체 또는 이의 작용성 잔기, 또는 천연 형태의 DNA 및/또는 RNA이다. 항체의 작용성 잔기는, 예를 들면, Fv 단편[참조: Skerra ＆ Pluckthun (1988) Science 240, 1038], 일본쇄 Fv 단편(scFv; Bird et al. (1988), Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879) 또는 Fab 단편[참조: Better et al. (1988) Science 240, 1041]이다.

본 발명의 범주 내에서의 생체 분자는 천연 물질 또는 천연 물질로부터 유도된 물질을 의미하는 것으로 인지된다.

바람직한 양태에서는, 이들은 이러한 경우에 p-RNA/DNA 또는 p-RNA/RNA 접합체이다.

접합체는 "서열 인식" 기능과 "비-공유 결합" 기능이 한 분자 내에서 실현되어야만 하는 경우에 사용되는 것이 바람직한데, 이는 본 발명에 따르는 접합체가 서로 직교 형태의 2가지 쌍 형성 시스템을 함유하고 있기 때문이다.

p-NA 및 특히 p-RNA는 서로 안정한 이중나선을 형성하며 일반적으로 천연 형태의 DNA 및 RNA와는 쌍을 형성하지 않는다. 이러한 성질로 인해 p-NA가 바람직한 쌍 형성 시스템이다.

이러한 쌍 형성 시스템은 선택성, 안전성 및 가역성에 의해 구별지워지는, 비-공유적 상호작용의 초분자 시스템이며, 상기 특성들은 바람직하게는 열역학적으로, 즉 온도, pH 및 농도에 의해 영향을 받는다. 상기 쌍 형성 시스템의 선택적 특성을 고려하면, 이러한 시스템은 또한, 예를 들면, 잠재적으로 신규한 특성을 지닌 집단 연합물을 제공하기 위해 상이한 금속 집단물을 함께 브릿징하기 위한 "분자상 접착제"로서 사용할 수도 있다[참조: R.L. Letsinger, et al., Nature 1996, 382, 607-9; P.G. Schultz et al., Nature 1996, 382, 609-11]. 결과적으로, p-NA는 나노테크놀로지(nanotechnology) 분야에서 사용하기에 적합하며, 예를 들면, 신규한 재료, 진단제 및 치료제를 제조하고 또한 극소 전자공학, 광학 또는 광전자 부품을 제조하며, 예를 들면, 단백질 어셈블리의 (조합적) 합성과 같이 초분자 단위를 제공하기 위해 분자 종들을 함께 조절된 방식으로 유도하는데 적합한데[참조: A. Lombardi, J.W. Bryson, W.F. DeGrado, Biomolekuls(Pept. Sci.) 1997, 40, 495-504], 이는 p-NA가 강력하고도 열역학적으로 조절 가능한 쌍 형성 시스템을 형성하기 때문이다. 따라서, 천연 핵산을 방해하지 않는 p-NA 암호를 갖는 작용성, 바람직하게는 생물학적 단위, 예를 들면, 단백질 또는 DNA/RNA 분획을 제공할 가능성으로 인해 특히 진단제 분야와 약물 발견 분야에 추가로 적용될 수 있다[참조: WO 93/20242].

순차적 방법과 수렴적 방법 모두가 접합체의 제조에 적합하다.

순차적 방법에서는, 예를 들면, p-RNA 올리고머를 동일한 합성기 상에서 직접적으로 자동 합성시킨 후 - 시약과 커플링 프로토콜을 재조정시킨 후에, 예를 들면, DNA 올리고뉴클레오타이드를 부가적으로 합성시킨다. 이러한 방법은 또한 역순으로 수행할 수도 있다.

수렴적 방법에서는, 예를 들면, 아미노-말단 링커를 갖는 p-RNA 올리고머와, 예를 들면, 티올 링커를 갖는 DNA 올리고머를 별개의 작동으로 합성시킨다. 이어서, 문헌[참조: T. Zhu et al., Bioconjug. Chem. 1994, 5, 312]으로부터 공지된 프로토콜에 따라서 상기 두 단위의 커플링과 p-RNA 올리고머의 요오도아세틸화를 수행하는 것이 바람직하다. 수렴적 방법은 이들의 가요성을 고려해 볼때 특히 바람직한 것으로 입증되었다.

본 발명의 범주 내에서의 용어 접합체는 또한 소위 어레이(array)를 의미하는 것으로 인지된다. 어레이는 특히 분석 및 진단시 분석물의 동시 측정에 중요한 역할을 하는 고정화된 인식 종의 배열이다. 이의 예로는 펩타이드 어레이[참조: Fodor et al., Nature 1993, 364, 555] 및 핵산 어레이[참조: Southern et al., Genomics 1992, 13, 1008; Heller, 미국 특허 제5,632,957호]가 있다. 이들 어레이의 보다 높은 가요성은 암호화 올리고뉴클레오타이드에 대한 상기 인식 종과 고체 지지체 상의 특정 위치에 대한 결합된 상보 쇄를 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 상기와 같이 암호화된 인식 종을 "항-암호화된" 고체 캐리어에 결합시키고 하이브리드화 조건을 조정함으로써, 상기 인식 종을 목적하는 위치에 비-공유적으로 결합시킨다. 그 결과, 각종 유형의 인식 종, 예를 들면, DNA 분획, 항체 등이 하이브리드화 조건의 이용으로 인해 고체 지지체 상에 단지 동시에 배열될 수 있다(도 3 참조). 그러나, 이에 대한 선행 조건은 가능한 한 짧은 암호화 분획을 유지하기 위해서 극도로 강력하고 선택적이며 천연 핵산을 방해하지 않는 코돈 및 안티코돈이 필요하다. p-NA, 바람직하게는 p-RNA가 이에 특히 유리하게 적합하다.

본 발명의 범주 내에서의 용어 "캐리어"는 고체 또는 젤라틴 형태로 존재하는 물질, 특히 칩 재료를 의미하는 것으로 인지된다. 적합한 캐리어 물질은, 예를 들면, 세라믹, 금속, 특히, 귀금속, 유리, 플라스틱, 결정성 물질 또는 캐리어, 특히 언급된 물질의 박층, 또는 (생체)분자 필라멘트, 예를 들면, 셀룰로즈, 구조 단백질이다.

따라서, 본 발명은 인식 종, 바람직하게는 천연 DNA 또는 RNA 쇄 또는 단백질, 특히 항체 또는 항체의 작용성 잔기를 암호화하기 위한, 펜토피라노실핵산, 바람직하게는 리보피라노실핵산의 용도에 관한 것이다. 이어서, 이들을 도 3에 따라서 고체 캐리어 상에서 적당한 코돈과 하이브리드화시킬 수 있다. 이로써, 신규하고 진단학적으로 유용한 어레이를, 항상 신규한 인식 종의 조합을 이용하여 하이브리드화 조건을 조정함으로써 어레이 형태의 코돈이 장착된 고체 캐리어 상에서 항상 목적하는 위치로 만들 수 있다. 분석물, 예를 들면, 혈청 등의 생물학적 샘플을 적용하는 경우에는, 검출하고자 하는 종을 특정 패턴의 어레이에 결합시킨 다음, 간접적으로(예를 들면, 인식 종을 형광성 라벨링함으로써) 또는 직접적으로(예를 들면, 상기 코돈의 연결 지점에서 임피던스를 측정함으로써) 기록한다. 이어서, 적절한 조건(온도, 염, 용매, 전기천공 공정)에 의해 하이브리드화를 제거하여 코돈을 갖는 캐리어만이 잔존하도록 한다. 이어서, 이를 다른 인식 종에 재부하하고, 예를 들면, 또 다른 샘플의 측정을 위해 동일한 분석물에 사용한다. 인식 종을 어레이 포맷으로 항상 새로이 배열하고 p-NA를 쌍 형성 시스템으로서 사용하는 것이 다른 시스템[참조: WO 96/13522(하기 16, 참조)]과 비교해서 특히 유리하다.

바람직한 양태에 있어서, 펜토피라노실뉴클레오사이드는 다음 화학식 I 또는 II의 화합물이다:

화학식 I

화학식 II

상기식에서,

R¹은 H, OH, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다) 또는또는 -O-P[N(i-Pr)₂]-(OCH₂CH₂CN)(여기서, i-Pr은 이소프로필이다) 중에서 선택된 라디칼이고,

R², R³및 R⁴는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), NR⁵R⁶, OR⁷, SR⁸, =O, C_nH_2n+1(여기서, n은 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 8, 특히 1 내지 4의 정수이다), β-제거 가능한 그룹, 바람직하게는 화학식 -OCH₂CH₂R¹⁸(여기서, R¹⁸은 시아노 또는 p-니트로페닐 라디칼 또는 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 라디칼이다), 또는 (C_nH_2n)NR¹⁰R¹¹(여기서, R¹⁰R¹¹은 H, C_nH_2n+1또는 다음 화학식 III의 라디칼을 통하여 연결된 R¹⁰R¹¹이다)의 그룹이며,

R⁵, R⁶, R⁷및 R⁸은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, C_nH_2n+1또는 C_nH_2n-1(여기서, n은 앞서 정의한 바와 같다), -C(O)R⁹(여기서, R⁹는 직쇄 또는 측쇄의 치환되거나 비치환된 알킬 또는 아릴 라디칼, 바람직하게는 페닐 라디칼이다)이고,

X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 =N-, =C(R¹⁶)- 또는 -N(R¹⁷)-(여기서, R¹⁶및 R¹⁷은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, 또는 앞서 정의된 바와 같은 C_nH_2n+1또는 (C_nH_2n)NR¹⁰R¹¹이다)이며,

S_c1및 S_c2는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, 또는 아실, 트리틸 또는 알릴옥시카보닐 그룹 중에서 선택된 보호 그룹, 바람직하게는 벤조일 또는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 그룹이고,

R^1'은 H, OH, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), 또는또는 -O-P[N(i-Pr)₂]-(OCH₂CH₂CN)(여기서, i-Pr은 이소프로필이다) 중에서 선택된 라디칼이고,

R^2', R^3'및 R^4'는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), =O, C_nH_2n+1또는 C_nH_2n-1, β-제거 가능한 그룹, 바람직하게는 화학식 -OCH₂CH₂R¹⁸(여기서, R¹⁸은 시아노 또는 p-니트로페닐 라디칼 또는 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 라디칼이다) 또는 (C_nH_2n)NR^10'R^11'(여기서, R^10', R^11'은 서로 독립적으로 상기 언급된 R¹⁰또는 R¹¹의 의미를 갖는다)의 그룹이며,

X'는 각 경우에 =N-, =C(R^16')- 또는 -N(R^17')-(여기서, R^16'및 R^17'은 서로 독립적으로 앞서 정의된 R¹⁶또는 R¹⁷의 의미를 갖는다)이고,

S_c1'및 S_c2'는 앞서 정의된 바와 같은 S_c1및 S_c2의 의미를 갖는다:

[여기에서, R¹², R¹³, R¹⁴및 R¹⁵는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, OR⁷(여기서, R⁷은 앞서 정의한 바와 같다) 또는 C_nH_2n+1또는 C_nH_2n-1(여기서, n은 앞서 정의된 바와 같다)이다].

펜토피라노실뉴클레오사이드는 일반적으로 리보-, 아라비노-, 릭소- 및/또는 크실로피라노실뉴클레오사이드, 바람직하게는 리보피라노실뉴클레오사이드이며, 여기서 펜토피라노실 잔기는 D 배위 뿐만 아니라 L 배위일 수 있다.

통상적으로, 본 발명에 따르는 펜토피라노실뉴클레오사이드는 펜토피라노실퓨린, -2,6-디아미노퓨린, -6-퓨린티올, -피리딘, -피리미딘, -아데노신, -구아노신, -이소구아노신, -6-티오구아노신, -크산틴, -하이포크산틴, -티미딘, -시토신, -이소시토신, -인돌, -트립타민, -N-프탈로일트립타민, -우라실, -카페인, -테오브롬, -테오필린, -벤조트리아졸 또는 -아크리딘, 특히 펜토피라노실퓨린, -피리미딘, -아데노신, -구아노신, -티미딘, -시토신, -트립타민, -N-프탈로트립타민 또는 -우라실이다.

이들 화합물에는 또한, 링커로서, 즉 생체 분자, 예를 들면, 천연 형태의 핵산 또는 변형된 핵산, 예를 들면, DNA, RNA 뿐만 아니라 p-NA, 바람직하게는 p-RNA에 공유적으로 결합할 수 있는 작용성 그룹을 갖는 화합물로서 사용될 수 있는 펜토피라노실뉴클레오사이드가 포함된다. 이는 지금까지 p-NA에 대해서 어떠한 링커도 공지된 바 없기 때문에 놀라운 일이다.

예를 들면, 이들에는 R², R³, R⁴, R^2', R^3'및/또는 R^4'가 2-프탈이미도에틸 또는 알릴옥시 라디칼인 펜토피라노실뉴클레오사이드가 포함된다. 본 발명에 따르는 바람직한 링커는 예를 들면, 우라실의 5-위치를 바람직하게는 변형시킨 우라실계 링커, 예를 들면, N-프탈로일아미노에틸우라실 뿐만 아니라 인돌계 링커, 바람직하게는 트립타민 유도체, 예를 들면, N-프탈로일트립타민이다.

놀랍게도, 본 발명을 통해서, 뉴클레오염기를 간단한 방식으로 완전하게 탈보호시킬 수 있는, 보다 용이하게 조작 가능한 펜토피라노실-N,N-디아실뉴클레오사이드, 바람직하게는 퓨린, 특히 아데노신, 구아노신 또는 6-티오구아노신을 이용 가능한 수준으로 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 R², R³, R⁴, R^2', R^3'및/또는 R^4'가 화학식 -N[C(O)R⁹]₂의 라디칼, 특히 N⁶, N⁶-디벤조일-9-(β-D-리보피라노실)-아데노신인 펜토피라노실뉴클레오사이드를 또한 포함한다.

본 발명이 보호 그룹, 바람직하게는 염기나 금속 촉매 작용에 의해 제거될 수 있는 보호 그룹, 특히 아실 그룹, 특히 바람직하게는 벤조일 그룹을 펜토피라노시드 잔기의 3'-산소 원자 상에서만 수반하는 펜토피라노실뉴클레오사이드를 이용 가능하게 만든다는 것 또한 놀라운 일이다. 이들 화합물은, 예를 들면, 추가의 보호 그룹, 바람직하게는 산- 또는 염기-불안정한 보호 그룹, 특히 트리틸 그룹, 특히 바람직하게는 디메톡시트리틸 그룹을, 수율을 저하시키는 부가 단계, 예를 들면, 부가의 정제 단계 없이 펜토피라노시드 잔기의 4'-산소 원자 상으로 직접적으로 도입하기 위한 출발 물질로서 제공된다.

더우기, 본 발명은 보호 그룹, 바람직하게는 산- 또는 염기-불안정한 보호 그룹, 특히 트리틸 그룹, 특히 바람직하게는 디메톡시트리틸 그룹을 펜토피라노시드 잔기의 4'-산소 원자 상에서만 수반하는 펜토피라노실뉴클레오사이드를 이용 가능하게 만든다. 이들 화합물 역시, 예를 들면, 추가의 보호 그룹, 바람직하게는 염기 또는 금속 촉매 작용에 의해 제거될 수 있는 보호 그룹, 특히 아실 그룹, 특히 바람직하게는 벤조일 그룹을, 수율을 저하시키는 부가 단계, 예를 들면, 부가의 정제 단계 없이 펜토피라노시드 잔기의 2'-산소 원자 상으로 직접적으로 도입하기 위한 출발 물질로서 제공된다.

일반적으로, 본 발명에 따르는 펜토피라노실뉴클레오사이드는 소위 원-포트 반응으로 반응될 수 있는데, 이러한 반응은 수율을 증가시키므로 특히 유리하다.

다음 화합물이 본 발명에 따르는 펜토피라노실뉴클레오사이드의 바람직한 예이다:

A) [2',4'-디-O-벤조일)-β-리보피라노실]뉴클레오사이드, 특히 [2',4'-디-O-벤조일)-β-리보피라노실]-아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘, -우라실, -크산틴 또는 -하이포크산틴 및 N-벤조일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 -아데닌, -구아닌 또는 -시토신, 및 N-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 -아데닌, -구아닌 또는 -시토신, 및 O⁶-(2-시아노에틸)-N²-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 -구아닌, 및 O⁶-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-2,4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 -구아닌.

B) β-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 β-리보피라노실아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘 또는 -우라실, -크산틴 또는 하이포크산틴, 및 N-벤조일-, N-이소부티로일-, O⁶-(2-시아노에틸)- 또는 O⁶-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-β-리보피라노실뉴클레오사이드.

C) 4'-DMT-펜토피라노실뉴클레오사이드, 바람직하게는 4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘, -우라실, -크산틴 또는 -하이포크산틴, 및 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌 또는 -시토신 및 N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌 또는 -시토신, 및 O⁶-(2-시아노에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 O⁶-(2-시아노에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌, 및 O⁶-(2-(-4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 O⁶-(2-(-4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌.

D) β-리보피라노실-N,N'-디벤조일아데노신 또는 β-리보피라노실-N,N'-디벤조일구아노신.

올리고뉴클레오타이드 합성에 적합한 전구체는, 예를 들면, 4'-DMT-펜토피라노실뉴클레오사이드-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트, 바람직하게는 4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트, 특히 4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌-, -시토신-, -티미딘-, -크산틴-, -하이포크산틴- 또는 -우라실-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트 및 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌- 또는 -시토신-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트, 및 N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌- 또는 -시토신-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트, O⁶-(2-시아노에틸)-4'-DMT-리보피라노실구아닌-, -크산틴-, -하이포크산틴-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트 또는 O⁶-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌이며, 고체 캐리어에 대한 커플링에 적합한 전구체는, 예를 들면, 4'-DMT-펜토피라노실뉴클레오사이드-2'-석시네이트, 바람직하게는 4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드-2'-석시네이트, 특히 4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌-, -시토신-, -티미딘-, -크산틴, -하이포크산틴- 또는 -우라실-2'-석시네이트, 및 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌- 또는 -시토신-2'-석시네이트, 및 N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌- 또는 -시토신-2'-석시네이트, O⁶-(2-시아노에틸)-4'-DMT-리보피라노실구아닌 석시네이트 및 O⁶-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌-2'-석시네이트이다.

당해 펜타피라노실뉴클레오사이드는 보호되지 않은 펜토피라노시드로부터 출발하여,

(a) 제1 단계에서, 펜토피라노시드의 2'-, 3'- 또는 4'-위치를 먼저 보호시키고, 바람직하게는

(b) 제2 단계에서, 다른 위치를 2'-, 3'- 또는 4'-위치 상에서 보호시킨다는 점에서 본 발명에 따라서 특히 유리하게 제조될 수 있다.

이러한 방법은 인용된 문헌에 기재된 뉴클레오염기로만 제한되지 않지만, 놀랍게도 수 많은 천연 및 합성 뉴클레오염기를 사용하여 성공적으로 수행할 수 있다. 더우기, 본 발명에 따르는 방법을 선행 문헌으로부터 공지된 방법과 비교해서 평균 60% 단축된 시간으로 고 수율로 수행할 수 있다는 것이 특히 놀라운데, 이는 산업적 응용 측면에서 특히 유리하다. 또한, 본 발명에 따르는 방법을 사용하는 경우에는, 선행 문헌에 기재된 방법에 필요한 정제 단계, 예를 들면, 크로마토그래피를 이용한 중간체 정제 단계가 필요하지 않으며, 몇몇 경우에서는 반응이 소위 원-포트 반응으로서 수행될 수 있는데, 이는 공간/시간 수율을 현저하게 증가시킨다.

특정 양태에 있어서, 2'-보호된 위치의 경우에는, 2'-위치에서부터 3'-위치 까지의 보호 그룹의 전위가 발생되는데, 이는 일반적으로 염기, 특히 N-에틸디이소프로필아민 및/또는 트리에틸아민의 존재하에서 수행된다. 본 발명에 따르면, 이러한 반응은 원-포트 반응과 동일한 반응 용기에서 수행하는 것이 특히 유리할 수 있다.

추가의 바람직한 양태에 있어서, 피라노실뉴클레오사이드는 산-불안정하거나, 염기-불안정하거나 또는 금속 촉매 작용에 의해 제거될 수 있는 보호 그룹 S_c1, S_c2, S_c1'또는 S_c2'(여기서, 보호 그룹 S_c1및 S_c1'는 바람직하게는 보호 그룹 S_c2및 S_c2'와 상이하다)에 의해 보호시킨다.

일반적으로, 언급된 보호 그룹은 아실 그룹, 바람직하게는 아세틸, 벤조일, 니트로벤조일 및/또는 메톡시벤조일 그룹, 트리틸 그룹, 바람직하게는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 그룹 또는 β-제거 가능한 그룹, 바람직하게는 화학식 -OCH₂CH₂R¹⁸(여기서, R¹⁸은 시아노 또는 p-니트로페닐 라디칼 또는 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 그룹이다)의 그룹이다.

2'- 또는 3'-위치가 염기-불안정한 보호 그룹이거나 금속 촉매 작용에 의해 제거될 수 있는 보호 그룹, 바람직하게는 아실 그룹, 특히 아세틸, 벤조일, 니트로벤조일 및/또는 메톡시벤조일 그룹에 의해 보호되는 경우 및/또는 4'-위치가 산- 또는 염기-불안정한 보호 그룹, 바람직하게는 트리틸 및/또는 Fmoc 그룹, 특히 DMT 그룹에 의해 보호되는 경우가 특히 바람직하다.

선행 문헌으로부터 공지된 방법과는 달리, 당해 방법은 결과적으로 아세탈 또는 케탈 등의 아세탈 보호 그룹을 이용하지 않고서도 실시되며, 이로써 부가의 크로마토그래피를 이용한 중간체 정제 단계를 피할 수 있으며 결과적으로 상기 반응을 놀랍게도 높은 공간/시간 수율을 갖는 원-포트 반응으로 수행할 수 있게 된다.

언급된 보호 그룹은 바람직하게는 저온에서 도입되는데, 이는 이를 통하여 상기 보호 그룹이 놀랍게도 선택적으로 도입될 수 있기 때문이다.

따라서, 예를 들면, 벤조일 그룹의 도입은 저온에서 피리딘 또는 피리딘/메틸렌 클로라이드 혼합물 중의 벤조일 클로라이드와의 반응에 의해 일어난다. DMT 그룹은, 예를 들면, 염기, 예를 들면, N-에틸디이소프로필아민(휴니그 염기), 및 피리딘, 메틸렌 클로라이드 또는 피리딘/메틸렌 클로라이드 혼합물의 존재하에 실온에서 DMTCl과 반응시킴으로써 도입할 수 있다.

아실화시킨 후 및/또는 임의로 수행되는 2'-위치에서 3'-위치로의 전위 후에, 반응 생성물을 크로마토그래피하여 정제하는 것이 또한 유리하다. 본 발명에 따르는 방법에서는 트리틸화 후의 정제 단계가 필요하지 않는데, 이것이 특히 유리하다.

필요한 경우, 최종 생성물을 결정화함으로써 추가로 정제할 수 있다.

리보피라노실뉴클레오사이드의 제조를 위하여, 바람직하게는 먼저

(a) 보호된 뉴클레오염기를 보호된 리보피라노즈와 반응시킨 다음,

(b) 보호 그룹을 단계 (a)로부터의 생성물의 리보피라노실 잔기로부터 제거한 다음,

(c) 단계 (b)로부터의 생성물을 보다 상세하게 상기 언급된 방법에 따라서 반응시킨다.

이와 관련하여, 추가의 시간-소모적이고 재료-소모적인 크로마토그래피 단계를 피하기 위해서는, 아노머적으로 순수한 보호된 펜토피라노즈, 예를 들면, 테트라벤조일펜토피라노즈, 바람직하게는 β-테트라벤조일리보피라노즈를 이용하는 것만이 유리하다[참조: R. Jeanloz, J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 4052].

추가의 양태에서는, 화학식 II에 따르는 링커[여기서, R^4'는 (C_nH_2n)NR^10'R^11'이고 R^10'R^11'은 앞서 정의된 의미를 갖는 화학식 III의 라디칼을 통하여 연결된다]가 다음 단계들을 포함하는 방법에 의해 유리하게 제조된다:

(a) R⁴가 (C_nH_2n)OS_c3또는 (C_nH_2n)Hal(여기서, n은 앞서 정의된 바와 같고, S_c3는 보호 그룹, 바람직하게는 메실레이트 그룹이며, Hal은 염소 또는 브롬이다)인 화학식 II의 화합물을 아지드, 바람직하게는 DMF 중의 아지드와 반응시키는 단계,

(b) (a)로부터의 반응 생성물을, 예를 들면, 피리딘 중의 트리페닐포스핀으로 바람직하게는 환원시키는 단계,

(c) (b)로부터의 반응 생성물을 적당한 프탈이미드, 예를 들면, N-에톡시카보닐프탈이미드와 반응시키는 단계,

(d) (c)로부터의 반응 생성물을 적당히 보호된 피라노즈, 예를 들면, 리보즈 테트라벤조에이트와 반응시키는 단계,

(e) 보호 그룹을 예를 들면, 메틸레이트로 제거하는 단계 및

(f) 추가의 단계를 앞서 기재된 바와 같이 수행하는 단계.

또한, 링커로서의 인돌 유도체는 형광을 발하는 능력의 이점을 지니고 있으므로 극소량의 물질을 검출해야 하는 나노테크놀로지 응용 분야에 특히 바람직하다. 따라서, 인돌-1-리보시드가 이미 문헌[참조: N.N. Suvorov et al., Biol. Aktivn. Soedin., Akad. Nauk SSSR 1965, 60 and Tetrahedron 1967, 23, 4653]에 기재되어 있다. 그러나, 3-치환된 유도체를 제조하는 유사한 방법은 없다. 일반적으로, 이들의 제조는 보호되지 않은 당 성분의 아민 및 인돌린(이는 산화에 의해 인돌-1-리보시드로 전환된다)의 형성을 통하여 발생된다. 예를 들면, 인돌-1-글루코시드 및 -1-아라비노시드가 문헌[참조: Y.V. Dobriynin et al. Khim. -Farm Zh. 1978, 12, 33]에 기재되어 있으며, 이의 3-치환된 유도체는 통상적으로 빌스마이어 반응(Vielsmeier's reaction)을 통하여 제조된다. 그러나, 이와 같이 아미노에틸 단위를 인돌의 3-위치 내로 도입하는 경로는 산업적으로 응용하기에 너무 복잡하다.

추가의 바람직한 양태에서는, X 및 Y가 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 =C(R¹⁶)(여기서, R¹⁶은 H 또는 C_nH_2n이다) 및 Z=C(R¹⁶)-(여기서, R¹⁶은 (C_nH_2n)NR¹⁰R¹¹이다)인 화학식 I의 링커가 다음 단계들을 포함한 방법에 의해 제조되는 것이 유리하다:

(a) 적당한 인돌린, 예를 들면, N-프탈로일트립타민을 피라노즈, 예를 들면, D-리보즈와 반응시켜 뉴클레오사이드 트리올을 수득하는 단계,

(b) (a)로부터의 생성물의 피라노실 잔기의 하이드록실 그룹을, 예를 들면, 아세트산 무수물을 통하여 아실 그룹으로 바람직하게는 보호시키는 단계,

(c) (b)로부터의 생성물을 예를 들면, 2,3-디클로로-5,6-디시아노파라퀴논에 의해 산화시키는 단계,

(d) (c)로부터의 생성물의 피라노실 잔기의 하이드록실 보호 그룹을 예를 들면, 메틸레이트를 통하여 제거하는 단계, 및 최종적으로

(e) 앞서 기재된 바와 같은 추가의 단계를 수행하는 단계.

그러나, 이러한 방법은 리보피라노즈의 경우에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 리보푸라노즈 및 2'-데옥시리보푸라노즈 또는 2'-데옥시리보피라노즈의 경우에도 사용될 수 있으므로 특히 유리하다. 사용된 당의 뉴클레오사이드화 파트너는 바람직하게는 트립타민, 특히 트립타민의 N-아실 유도체, 특히 N-프탈로일트립타민이다.

추가의 양태에서는, 4'-보호된, 바람직하게는 3',4'-보호된 펜토피라노실뉴클레오사이드를 추가의 단계에서 포스피틸화시키거나 고체 상에 결합시킨다.

포스피틸화는, 예를 들면, 염기, 예를 들면, N-에틸디이소프로필아민의 존재하에서 모노알릴 N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트를 이용하거나, 또는 삼염화인 및 이미다졸 또는 테트라졸을 이용한 다음 연속적으로 염기를 첨가하면서 가수분해시킴으로써 수행한다. 첫 번째 경우에서는, 생성물이 포스포르아미다이트이고 두 번째 경우에서는 H-포스포네이트이다. 본 발명에 따르는 보호된 펜토피라노실뉴클레오사이드를 고체 상, 예를 들면, "장쇄 알킬아미노-조절된 공극 형성된 유리"[CPG, Sigma Chemie, Munich]에 결합시키는 것은, 예를 들면, 문헌[참조: Eschenmoser et al. (1993)]에 기재된 바와 같이 수행한다.

수득된 화합물은, 예를 들면, 펜토피라노실핵산의 제조를 위해 제공되는데, 여기서 바람직하게는

(a) 제1 단계에서는, 보호된 펜토피라노실뉴클레오사이드를 앞서 기재된 바와 같이 고체 상에 결합시키고,

(b) 제2 단계에서는, 단계 (a)에 따라서 고체 상에 결합된 3'-, 4'-보호된 펜토피라노실뉴클레오사이드를 포스피틸화된 3'-, 4'-보호된 펜토피라노실뉴클레오사이드에 의해 연장시킨 다음, 예를 들면, 요오드 수용액에 의해 산화시키며,

(c) 목적하는 펜토피라노실핵산이 존재할 때까지 동일하거나 상이한 포스피틸화된 3'-,4'-보호된 펜토피라노실뉴클레오사이드를 이용하여 단계 (b)를 반복한다.

산성 활성화제, 예를 들면, 피리디늄 하이드로클로라이드, 바람직하게는 벤즈이미다졸륨 트리플레이트가, 바람직하게는 아세토니트릴에서 재결정화시키고 아세토니트릴에서 용해시킨 후에 포스포르아미다이트를 이용하는 경우에 커플링 시약으로서 적합한데, 이는 커플링 시약으로서의 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸과는 대조적으로 커플링 시약주의 차단과 생성물의 오염이 전혀 발생되지 않기 때문이다.

H-포스포네이트를 이용하는 경우에는 아릴설포닐 클로라이드, 디페닐 클로로포스페이트, 피발로일 클로라이드 또는 아다만토일 클로라이드가 커플링 시약으로서 특히 적합하다.

추가로, 염화나트륨 등의 염을 올리고뉴클레오타이드, 특히 p-NA, 바람직하게는 p-RNA의 보호 그룹-제거성 하이드라진 분해 반응에 가함으로써, 피리미딘 염기, 특히 우라실 및 티민이 개환(이는 상기 올리고뉴클레오타이드를 파괴시킬 수도 있다)되지 못하게 방지하는 것이 유리하다. 알릴옥시 그룹은 바람직하게는, 예를 들어, 하이드라진 분해 반응 전에 팔라듐 [Pd(0)] 복합체에 의해 제거될 수 있다.

추가의 특정한 양태에서는, 펜토푸라노실뉴클레오사이드, 예를 들면, 천연 형태의 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘 및/또는 우라실을 단계 (a) 및/또는 단계 (b)에 혼입시켜, 예를 들면, 혼합된 p-NA-DNA 또는 p-NA-RNA를 생성시킨다.

또 다른 특정한 양태에서는, 추가의 단계에서, 다음 화학식 IV의 알릴옥시 링커를 혼입시킬 수 있다:

S_c4NH(C_nH_2n)CH(OPS_c5S_c6)C_nH_2nS_c7

상기식에서,

S_c4및 S_c7는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 보호 그룹, 특히 Fmoc 및/또는 DMT 중에서 선택된 보호 그룹이고,

S_c5및 S_c7는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 알릴옥시 및/또는 디이소프로필아미노 그룹이다. n은 앞서 언급한 의미를 갖는다.

특히 바람직한 알릴옥시 링커는 (2-(S)-N-Fmoc-O¹-DMT-O²-알릴옥시디이소프로필아미노포스피닐-6-아미노-1,2-헥산디올)이다.

몇몇 반응 단계에서는, 예를 들어, 리신으로부터 출발하여, 활성화 가능한 인 화합물과 산-불안정한 보호 그룹, 예를 들면, DMT 모두를 수반하는 아미노-말단 링커를 합성할 수 있으며, 이로써 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성에 용이하게 사용할 수 있다[참조: P.S. Nelson et al., Nucleic Acid Res. 1989, 17, 7179; L.J. Arnold et al., WO 8902439]. 이러한 레파토리를 리신계 링커를 통하여 본 발명에서 연장하는데, 여기서는 인 원자 상의 통상적인 시아노에틸 그룹 대신 알릴옥시 그룹을 도입함으로써 노요리(Noyori) 올리고뉴클레오타이드 방법에 유리하게 이용될 수 있다[참조: R. Noyori, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1691-6].

본 발명의 추가의 주제는 상기 언급된 펜토피라노실뉴클레오사이드 또는 접합체 형태의 펜토피라노실뉴클레오사이드를 포함하는, 전자 부품, 특히 진단제 형태의 전자 부품; 및 펜토피라노실뉴클레오사이드 또는 펜토피라노실핵산을 앞서 상세히 기재된 바와 같이 생체 분자와 조합하는, 접합체의 제조 방법에 관한 것이다.

다음 도면과 실시예는 본 발명을 제한하지 않고 본 발명을 보다 상세히 기재하고자 함이다.

도 1은 천연 형태의 RNA(좌측) 및 p-NA 형태의 RNA(우측)의 구조 단면을 도시한 것이다.

도 2는 에쉔모저(Eschenmoser) 등(1993)에 따르는 p-리보-(A,U)-올리고뉴클레오타이드의 합성을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 3은 고체 캐리어 상에서의 고정화된 인식 구조물(어레이)의 배열을 도식적으로 나타낸 것이다.

실시예 1

1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}티민의 합성

먼저 4'-치환시킨 다음, 2'-치환시킨 후, 이동 반응시킴:

1-(β-D-리보피라노실)티민(A) 51.6g(200mmol)을 아르곤 대기하에서 무수 피리딘 620ml에 용해시키고, N-에틸디이소프로필아민 71.4ml(2.1당량)과 분자체(4Å) 100g을 가한 다음, 이 혼합물을 KPG 교반기를 사용하여 15분 동안 교반시킨다. 디메톡시트리틸 클로라이드(DMTCl) 92g(272mmol; 1.36당량)을 클로로포름 280ml(고체 NaHCO₃로부터 신선하게 증류됨)에 용해시키고, 이 용액을 30분에 걸쳐 -6 내지 -5℃에서 트리올 용액에 적가한다. 이를 상기 온도에서 1시간 동안 교반시킨 다음, 실온(RT)에서 밤새 교반시키고, 재냉각시킨 다음, 클로로포름 70ml 중의 DMTCl 25g(74mmol; 0.37당량)을 더 가한다. 이 혼합물을 RT로 냉각시킨 다음 4시간 동안 교반시킨다.

소량의 샘플을 취하고, 수성 후처리한 다음 크로마토그래피하여 1-{4'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}티민의 분석 데이터를 수득한다.

¹H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.70 (bs, 2H, OH); 1.84 (d, 3H, Me); 2.90 (bs, 1 H, OH); 3.18, 3.30 (2m, 2H, H(5')), 3.62 (bs, 1H, H(3')); 3.70-3.82 (m, 8H, 2 OMe, H(4'), H(2')); 5.75 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H(1')), 6.85 (m, 4H, Harom); 6.96 (m, 1H, Harom), 7.20 (m, 9H, Harom, H(6)), 8.70 (bs, 1H, H(3).)

상기 반응 혼합물을 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 2.46g(20.5mmol; 0.1당량)으로 처리하고, -6℃로 냉각시키며, 피리딘 30ml 중의 벤조일 클로라이드(BzCl) 27.9ml(0.24mol; 1.2당량)을 15분에 걸쳐 -6 내지 -1℃에서 적가하고, 이 혼합물을 10분 동안 교반시킨다. 이 반응을 완료하기 위하여, 각 경우에 BzCl 2.8ml(24mmol; 0.12당량)을 냉각시키면서 25분 간격으로 가하고, 이 혼합물을 최종적으로 20분 동안 교반시킨다.

이어서, 무수 피리딘 460ml, n-프로판올 841ml(11.2mol; 56당량), p-니트로페놀 44g(0.316mol; 1.58당량), DMAP 21.7g(0.18mol; 0.9당량) 및 N-에틸디이소프로필아민 136ml(0.8mol; 4당량)을 RT에서 가하고, 이 혼합물을 61 내지 63℃에서 48시간 동안 교반시킨다. 이어서, 상기 혼합물을 RT에서 60시간 동안 정치시켜 둔다. 반응 혼합물을 24시간 동안 61 내지 63℃로 다시 가열하고, RT로 냉각시킨 다음, 로타베이퍼 상에서 농축시킨다. 잔사를 에틸 아세테이트 2L에 흡수시키고, 분자체를 여과시킨 다음, 유기 상을 매회 물 1L로 3회 추출하고 10% 농도 시트르산 1.2L로 교반시킴으로써 1회 추출하며, 유기 상을 다시 분리시키고, 물 1L로 1회 추출한 다음, 최종적으로 포화 NaHCO₃용액 1L로 추출한다. 이 유기 상을 황산나트륨을 사용하여 건조시키고, 여과시킨 다음 농축시킨다(잔사 220g).

상기 잔사를 먼저 정제를 위해 헵탄/에틸 아세테이트(1:1 내지 0.1)의 단계 구배를 이용하여 실리카 겔 60(20 x 10cm)을 통하여 여과시킨 다음, 실리카 겔 60(30 x 10cm; 디클로로메탄/에틸 아세테이트, 1:0 내지 1:1의 단계 구배) 상에서 크로마토그래피한다.

다음 물질을 수득한다:

비극성 분획 40g

1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}티민(B) 52.9g

불순물(B) 34.5g

극성 분획 3.4g.

상기 불순물 분획을 다시 크로마토그래피(SG 60, 45 x 10cm; 디클로로메탄/에틸 아세테이트, 3:1)하여 (B) 11.3g을 추가로 수득한다.

총 수득량: (B) 64.2g(97mmol), 즉 48% 수율.

¹H-NMR 상응함.

실시예 2

N⁴-벤조일-1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}시토신의 합성

먼저 2'-치환시킨 다음, 4'-치환시킨 후, 이동 반응시킴:

모든 배치를 N₂대기하에서 수행한다.

N⁴-벤조일-1-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)시토신(2):

N⁴-벤조일-1-(β-D-리보피라노실)시토신(1) 54.0g(0.155mol)을 124℃로 가온시키면서 디메틸포름아미드(DMF) 830ml 및 피리딘 1.5L(양 용매는 건조되고 분자체 3Å를 통하여 저장됨)에 용해시킨다. 피리딘 210ml에 용해된 BzCl 23.0g(0.163mol; 1.05당량)을 3.5시간에 걸쳐 -58 내지 -63℃에서 적가한다. 상기 배치를 냉각 욕 속에서 밤새 교반시킨다. n-프로판올 90.3g(1.5mol; 10당량)을 이 안에서 교반시키고 상기 배치를 고진공하에 40℃에서 농축시킨다. 톨루엔 150ml를 2회 가하고 재농축시킴으로써 피리딘 잔사를 제거한다. 잔사 124.3g을 CH₂Cl₂500ml에 용해시키고, 매회 반-농축된 NaHCO₃용액 300ml와 함께 교반시킴으로써 2회 추출하고, 침전된 고체를 여과시킨 다음 건조시켜 잔사 60.7g을 수득한다. CH₂Cl₂상을 농축시킨다(25.0g). 구배(AcOEt/이소헥산, 4:1, 이어서 순수한 AcOEt, 이어서 AcOEt/MeOH, 19:1 내지 2:1)를 이용하여 실리카 겔 60(40 x 10cm) 상에서 별도로 크로마토그래피하여 다음을 수득한다(TLC(실리카 겔, AcOET)):

2',4'-디벤조에이트 16.8g(24%) R_f0.5

(1) 12.4g(23%) R_f0.0

(2) 35.4g(51%) R_f0.14

N⁴-벤조일-1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}시토신(3):

(2) 35.4g(78mmol)을 CH₂Cl₂390ml 및 피리딘 180ml(둘 다 무수성임)에 용해시키고, DMAP 0.94g(7.8mmol; 0.1당량), N-에틸디이소프로필아민 34.6ml(203mmol; 2.6당량) 및 DMTCl 33.1g(98mmol; 1.25당량)을 가하고, 이 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반시킨다.

TLC(실리카 겔, AcOEt): R_f0.6.

CH₂Cl₂을 30℃에서 스트립핑시키고, 잔사를 피리딘 640ml, DMAP 9.37g(78mmol; 1.0당량), Et₃N 32.5ml(234mmol; 3.0당량), p-니트로페놀 21.7g(156mmol; 2.0당량) 및 p-프로판올 93.8g(1.56mol; 20당량)으로 처리하고 65℃에서 42시간 동안 교반시킨다. 상기 배치를 50℃하의 고진공하에서 농축시키고, 매회 톨루엔 250ml로 2회 처리한 다음 농축시킨다. 잔사를 CH₂Cl₂1L에 흡수시키고, 매회 묽은 NaHCO₃용액 500ml로 교반시킴으로써 3회 추출하고, 유기 상을 Na₂SO₄를 사용하여 건조시킨 다음 농축시켜 잔사 92.5g을 수득한다. 구배(메틸 3급-부틸 에테르/이소헥산, 2:1 내지 4:1, 이어서 메틸 3급-부틸 에테르/AcOEt, 1:4, 이어서 AcOEt/MeOH, 1:1 내지 1:3)를 이용하여 실리카 겔 60(50 x 10cm) 상에서 크로마토그래피하여 생성물 함유 분획 44.7g을 수득하고, 이를 CH₂Cl₂/메틸 3급-부틸 에테르(1:5) 540ml로부터 재결정화한다. 이 결정화물을 CH₂Cl₂/메틸 3급-부틸 에테르(1:1) 300ml로부터 다시 재결정화한다.

(3): TLC(실리카 겔, CHCl₃/i-PrOH 49:1): R_f0.14.

다음을 수득한다: N⁴-벤조일-1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}시토신 (3) 30.0g. 즉 (2)를 기준으로 하여 51% 수율.¹H-NMR 상응함.

실시예 3

N⁶-벤조일-9-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}아데닌의 합성

먼저 2'-치환시킨 다음, 4'-치환시킨 후, 이동 반응시킴:

9-(β-D-리보피라노실)아데닌 (2):

N⁶-벤조일-9-(2',3',4'-트리-O-벤조일-β-D-리보피라노실}아데닌 (1) 68.37g(100mmol)을 NH₃-포화된 MeOH 300ml에서 RT하에 밤새 교반시키고, 결정화물을 여과시켜 (2) 23.5g(88%)을 수득한다. TLC(실리카 겔, AcOEt/MeOH 2:1): R_f0.23/

¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 3.56-3.78 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4.04 (m, 1H, H(3')); 4.23 (ddd, J = 2.5, 8, 9.5 Hz, H(2')), 4.89 (d, J = 6 Hz, 1H, OH), 5.07 (d, J = 7 Hz, 1H, OH), 5.12 (d, J = 4 Hz, 1H, OH), 5.63 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H(1')), 7.22 (s, 2H, NH2), 8.14 (s, 1H, H(2)), 8.29 (s, 1H, H(8)).

¹³C-NMR (75 MHz, DMSO): 65.0 (t, C(5')); 66.6 (s, C(4')), 68.1 (s, C(3'), 71.1 (s, C(2')), 79.6 (s, C(1')); 118.6 (C(5)); 139.5 (s, C(8)), 149.9 (s, C(4)), 152.5 (s, C(2)), 155.8 (s, C(6)).

N⁶,N⁶-디벤조일-9-(β-D-리보피라노실)아데닌 (3):

(2) 16.8g(62.9mmol)을 N₂대기하에서 무수 피리딘 500ml에 현탁시키고 -4 내지 -10℃로 냉각시킨다. 트리메틸클로로실란 40ml(199mmol; 5당량)을 20분에 걸쳐 적가하고, 이 혼합물을 냉각시키면서 2.5시간 동안 교반시킨다. 피리딘 73ml에 용해된 벤조일 클로라이드 36.5ml(199mmol; 5당량)을 25분에 걸쳐 -10 내지 -15℃에서 가하고 냉각시키면서 10분 동안 교반시킨 다음 RT에서 2시간 동안 교반시킨다(TLC 체킹(실리카 겔, AcOEt/헵탄, 1:1): R_f0.5). 이 혼합물을 다시 -10℃로 냉각시키고, H₂O(최대 온도 +8℃) 136ml를 이 안에서 수행하고 혼합물을 RT에서 밤새 교반시킨다. 전환을 완료시킨 후, 상기 용매를 스트립핑하고, 잔사를 매회 톨루엔 200ml에 2회 흡수시킨 다음 재증발시킨다. 이 혼합물을 Et₂O 및 H₂O 각각 500ml로 처리하고, 2시간 동안 기계적으로 교반시킨 다음, 양 상에서 단지 약간의 가용성을 나타내는 생성물을 여과시키며, Et₂O 및 H₂O로 세척한 다음 고진공하에서 P₂O₅로 건조시킨다: (3) 23.8g(80%).

TLC(실리카 겔, AcOEt/MeOH 9:1): R_f0.35.

¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 3.60-3.80 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4.06 (bs, 1H, H(3')); 4.30 (ddd, J = 2.5, 8, 9.5 Hz, H(2')), 4.93 (d, J = 6 Hz, 1H, OH), 5.20 (d, J = 4 Hz, 1H, OH), 5.25 (d, J = 4 Hz, 1H, OH), 5.77 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H(1')), 7.47 (m, 4H, Harom), 7.60 (m, 2H, Harom), 7.78 (m, 4H, Harom), 8.70 (s, 1H, H-C(2), 8.79 (s, 1H, H(8)).

¹³C-NMR (75 MHz, DMSO): 66.2 (t, C(5')); 66.5 (s, C(4')), 68.0 (s, C(3')), 71.0 (s, C(2')), 80.4 (s, C(1')); 112.42 (C(5)); 126.9 (s, C(5')), 126.9, 128.9, 133.3, 133.4 (방향족 C), 146.0 (s, C(8)), 150.7 (s, C(4)), 151.8 (s, C(2)), 153.3 (s, C(6)), 172.0 (s, C=O)).

N⁶,N⁶-디벤조일-9-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)아데닌 (4):

(3) 26.4g(55.5mmol)을 N₂대기하에서 무수 CH₂Cl₂550ml 및 피리딘 55ml(각 경우에 분자체 상에서 저장됨)에 용해시키고, DMAP 0.73g(5.55mmol; 0.1당량)으로 처리한 다음 -87 내지 -90℃로 냉각시킨다. 피리딘 14ml 중의 BzCl 8.58g(61mmol; 1.1당량)을 1시간에 걸쳐 적가하고 이 혼합물을 60시간(주말) 동안 -78℃에 방치시켜 둔다. 배치를 농축시키고, 매회 톨루엔 100ml로 2회 처리하고 증발시켜 피리딘을 제거한다. 구배(AcOEt/헵탄, 1:1 내지 9:1)를 사용하여 실리카 겔 60(20 x 10cm) 상에서 크로마토그래피하여 (4) 23.2g을 수득한다.

(4): TLC(실리카 겔, AcOEt): R_f0.34.

N⁶-벤조일-9-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}아데닌 (5):

(4) 23.2g(40mmol)을 무수 CH₂Cl₂160ml에 용해시킨 다음, 연속적으로 DMTCl 14.9g(56mmol; 1.1당량) 및 N-에틸디이소프로필아민 17.7ml(104mmol; 2.6당량)으로 처리한다. RT에서 2시간 동안 교반시킨 후, DMTCl 4.0g(11.8mmol; 0.3당량)을 추가로 가하고 이 혼합물을 40분 동안 더 교반시킨다. 상기 배치를 350 내지 520mbar 및 35℃에서 로타베이퍼에서 농축시킨다. TLC(실리카 겔, AcOEt/헵탄 1:1): R_f0.18.

상기 잔사를 무수 피리딘 260ml에 용해시키고, 연속적으로 n-프로판올 51ml(679mmol; 17당량), Et₃N 16.6ml(120mmol; 3당량), p-니트로페놀 11.1g(80mmol; 2당량) 및 DMAP 5.3g(44mmol; 1.1당량)으로 처리하고 23시간 동안 60 내지 63℃에서 교반시킨다. 이어서, 상기 배치를 RT에서 21시간 동안 잔존시킨다. 이 반응 혼합물을 로타베이퍼에서 농축시킨다. 상기 잔사를 매회 톨루엔 200ml로 2회 처리한 다음 농축시키고, CH₂Cl₂에 용해시키며, 물로 3회 추출한다. 구배(AcOEt/헵탄, 1:2 내지 1:0; 이어서 AcOEt/MeOH, 1:0 내지 9:1)를 이용하여 실리카 겔 60(30 x 10cm) 상에서 크로마토그래피하여 (5) 13g을 수득한다.

(5): TLC(실리카 겔, AcOEt/헵탄 4:1): R_f0.2.

다음을 수득한다: N⁶-벤조일-9-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}아데닌 (5) 13g. 즉 (3)을 기준으로 하여 30% 수율.¹H-NMR에 상응함. 선행 문헌으로부터 공지된 방법과 비교해서 시간이 단축됨: 50%.

실시예 4

9-[3'-O-벤조일-4'-O-((4,4'-디메톡시트리페닐)메틸)-β-D-리보피라노실]-2-O-알릴-2-N-이소부티로일구아닌의 합성

먼저 3'-치환시킨 다음, 4'-치환시킴:

9-[3'-O-벤조일-β-D-리보피라노실]-2-O-알릴-2-N-이소부티로일구아닌 (B)

G 트리올 (A)(393mg, 1.0mmol)를 무수 디클로로메탄 4ml에 용해시킨다. 이 용액을 트리메틸 오르토벤조에이트(0.52ml, 3.0mmol) 및 캄포르설폰산(58mg, 0.25mmol)로 처리한 다음, 실온에서 15시간 동안 교반시킨다. 이어서, 상기 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 0℃로 예비냉각시킨 아세토니트릴, 물 및 트리플루오로아세트산의 혼합물(50:5:1) 2ml로 처리한다. 이 혼합물을 10분 동안 교반시키고 용매를 진공하에 제거한다. 상기 잔사를 디클로로메탄/메탄올 100:3을 사용하여 실리카 겔(2.3 x 21cm) 상에서 섬광 크로마토그래피하여 정제한다. 4-O-벤조일 화합물 25mg(5%), 혼합 분획 139mg(28%) 및 목적하는 3-O-벤조일 화합물 (B) 205mg(41%)을 수득한다.

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.12, 1.14 (2d, J = 7.0 Hz, 2 ×3H, NHCOCHMe₂), 2.78 (hep, J = 7 Hz, 1 H, NHCOCHMe₂), 3.85 (dd, J = 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-5'_eq), 3.94 (약 T, J = 11.0 Hz, 1 H, H=5'_ax), 4.12 (ddd, J = 2.5, 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-4'), 4.52 (dd, J = 3.5, 9.5 hz, 1 H, H-2'), 5.00 (dt, J = 1.5, 6.0 Hz, 2 H, 모두), 5.19 (dq, J = 1.5, 10.0 Hz, 1 H, 모두), 5.39 (dq, 1.5, 16.5 Hz, 1 H, 모두), 5.85 (bt, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.97 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.07 (ddd, J = 6.0, 10.0, 16.5 Hz, 1 H, 모두), 7.40-7.58 (m, 3 H, Bz), 8.10-8.16 (m, 2 H, Bz), 8.28 (s, 1 H, H-8).

9-[3'-O-벤조일-4'-O-((4,4'-디메틸옥시트리페닐)메틸)-β-D-리보피라노실]-2-O-알릴-2-N-이소부티로일구아닌 C

디올 (B)(101mg, 0.2mmol)을 무수 디클로로메탄 3.2ml에 현탁시킨다. 이 현탁액을 N-에틸디이소프로필아민 171㎕(1.0mmol), 피리딘 320㎕(3.96mmol) 및 DMTCl 102mg(0.3mmol)로 처리한 다음 실온에서 교반시킨다. 24시간 후, DMTCl 102mg(0.3mmol)을 더 가하고 이 혼합물을 24시간 동안 재교반시킨다. 이어서, 이를 디클로로메탄 30ml로 희석시킨다. 이 용액을 10% 농도의 수성 시트르산 용액 20ml 및 포화 중탄산나트륨 용액 10ml로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시킨 다음 진공하에 농축시킨다. 상기 잔사를 디클로로메탄/메탄올 100:1을 사용하여 실리카 겔(2.3 x 20cm) 상에서 섬광 크로마토그래피하여 정제한다. 공지된 목적하는 생성물 (C) 39mg(24%)을 수득한다.

실시예 5

p-RNA 링커 시스템의 합성

아미노 말단을 갖는 링커의 제공한 다음, 이를 작용성 단위의 연결에 사용할 수 있게 만드는 3가지 방식이 다음에 기재되어 있다:

5.1 우라실계 링커

우라실의 5-위치의 변형을 기준으로 함.

공지된 방법[참조: J.D. Fissekis, A. Myles, G.B. Brown, J. Org. Chem. 1964, 29, 2670]에 따라서 하이드록시에틸우라실(28)을 대규모로 제조할 수 있다. g-부티롤락톤(25)를 메틸 포르메이트로 포밀화하고, 나트륨 염(26)을 반응시켜 우레아 유도체(27)을 수득하며, 이를 폐환시켜 하이드록시에틸우라실(28)을 수득한다(반응식 4).

하이드록시에틸우라실(28)을 피리딘 중의 메탄설포닐 클로라이드로 메실화하여 (29)를 수득한다[참조: J.D. Fissekis, F. Sweet, J. Org. Chem. 1973, 38, 264].

다음 단계들을 새로이 발명하였다: DMF 중의 나트륨 아지드를 사용하여 (29)를 반응시켜 아지드(30)을 수득하고 이를 피리딘 중의 트리페닐포스핀으로 환원시켜 아미노에틸우라실(31)을 수득한다. (31)중의 아미노 작용기를 N-에톡시카보닐프탈이미드를 사용하여 최종적으로 보호시킨다(반응식 5). 리보즈 테트라벤조에이트(33)을 N-프탈로일아미노에틸우라실(32)로 뉴클레오사이드화하여 리보즈 트리벤조에이트(34)를 우수한 수율로 수득한다. H-C(1')와 H-C(2') 간의 커플링 상수 J=9.5Hz로부터 명백하게 알 수 있는 바와 같이, 피라노즈 환의 아노머성 중심은 β배위를 갖는다. 연속적으로, MeOH 중의 NaOMe를 사용하여 벤조에이트 보호 그룹을 제거하여 링커 트리올(35)를 수득한다. (35)를 DMAP의 존재하에서 피리딘/디클로로메탄 1:10 중에서 -78℃ 하에 벤조일 클로라이드와 반응시킨다. 이 공정에서는, 목적하는 2'-벤조에이트(36)(64%) 이외에도, 2',4'-디벤조일화 생성물(22%)을 수득하고, 이를 수집한 다음, (34)의 (35)로의 메탄올 분해와 유사하게 트리올(35)로 다시 전환시킨다. 2'-벤조에이트(36)을 디클로로메탄 중의 휴니그 염기의 존재하에서 디메톡시트리틸 클로라이드를 사용하여 90% 이상의 수율로 4'-위치에서 트리틸화시킨다. 4'-DMT-2'-벤조에이트(37)의 4'-DMT-3'-벤조에이트(38)로의 전위는 n-프로판올/피리딘 5:2 중의 DMAP, p-니트로페놀 및 휴니그 염기의 존재하에서 수행한다. 크로마토그래피한 후, (38)을 수득한다. 4'-DMT-3'-벤조에이트(38)을 최종적으로, 휴니그 염기의 존재하에서 ClP(OAll)N(iPr)₂과 반응시켜 포스포르아미다이트(39)를 수득한다(반응식 6). 합성 프로토콜을 변화시키지 않으면서 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성에 상기 화합물을 이용할 수 있다.

과정:

우라실 링커 단위의 합성

5-(2-아지도에틸)우라실(30)

1. 과정

(29) 26.0g(0.11mol)을 내부 온도계와 환류 응축기가 장착된 500ml 3목 플라스크에서 DMF 250ml에 용해시키고 이 혼합물을 나트륨 아지드 10.8g(0.166mol)로 처리한다. 이 현탁액을 연속적으로 60℃에서 4시간 동안 교반시킨다(TLC 체킹, CHCl₃:MeOH 9:1). DMF를 증류시키고 잔사를 물 150ml와 함께 교반시킨다. 고체를 여과시키고, 물 약 50ml로 세척한 다음, 건조기 내에서 진공하에 오산화인으로 밤새 건조시킨다. (30) 14.2g(71%)를 융점이 230 내지 235℃(분해)인 무색 고체의 형태로 수득한다.

2. 분석 데이터

5-(2-아지도에틸)우라실(30)

융점 230-235℃(분해)

TLC: CHCl₃/MeOH 9:1, R_f0.48

UV(MeOH): λ_max263.0(7910)

IR(KBr): 3209s, 3038s, 2139s, 1741s, 1671s, 1452m, 1245m, 1210m

¹H-NMR (300 MHz, d₆-DMSO): 2.46 (t, 2H, J(CH₂CH₂N, CH₂CH₂N) = 7.0, CH₂CH₂N); 3.40 (t, 2H, J(CH₂CH₂N, CH₂CH₂N) = 7.0 CH₂CH₂N); 7.36 (s, H-C(6)); 11.00 (br. s, 2H, H-N(1), H-N(3).

MS (ESI⁺): 180.0 [M+H].

5-(2-아미노에틸)우라실(31)

1. 과정

(30) 14.2g(78.0mmol)을 내부 온도계와 환류 응축기가 장착된 250ml 3목 플라스크에서 피리딘 175ml에 현탁시키고 이 혼합물을 트리페닐포스핀²⁾61.4g(234mmol)로 처리한다. 이를 60℃에서 5시간 동안 가열하고 실온에서 밤새 교반시킨다(TLC 체킹, CHCl₃:MeOH 5:1). 25% 농도의 암모니아 용액 40ml를 상기 현탁액에 가하고, 이를 정화시킨다. 상기 용매를 회전식 증발기 상에서 진공하에 제거한다. 상기 잔사를 CH₂Cl₂/MeOH 1:1 200ml 중에서 30분 동안 실온하에 교반시키고, 침전물을 여과시킨 다음 CH₂Cl₂로 세척한다. 건조기 내에서 진공하에 오산화인으로 건조시킨 후, 융점이 214 내지 220℃인 (31) 10.0g(85%)를 수득한다.

2. 분석 데이터

5-(2-아미노에틸)우라실(31)

융점: 214-220℃(가스 방출됨, 재소결)

TLC: CHCl₃/MeOH/HOAc/H₂O 85:20:10:2, R_f0.07

UV (MeOH): λ_max263.0 (6400).

IR (KBr): 3430m, 3109s, 1628s, 1474m, 1394s, 1270s, 1176w, 1103m, 1021m, 966m, 908m, 838m.

¹H-NMR (300 MHz, d₆-DMSO): 2.21 (t, 2H, J(CH₂CH₂N, CH₂CH₂N) = 6.8,CH₂CH₂N); 2.59 (t, 2H, J(CH₂CH₂N, CH₂CH₂N) = 6.8 CH₂CH₂N); 5.90 (v. br. s, 4H, H-N(1), H-N(3), NH₂); 7.19 (s, H-C(6)).

MS (ESI^-): 153.9 [M-H].

5-(2-프탈이미도에틸)우라실(32)

1. 과정

(31) 9.6g(61.8mmol)을 250ml 환저 플라스크에서 물 100ml에 현탁시키고 Na₂CO₃6.64g(62.6mmol)으로 처리한다. 실온에서 15분 동안 교반시킨 후, N-에톡시카보닐프탈이미드 14.3g(65mmol)을 여러 분획으로 나누어 가하고 이 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시킨다(TLC 체킹, CHCl₃/MeOH 5:1). 이어서, 점성의 백색 현탁액을 진한 염산을 사용하여 pH 4로 조심스럽게 조정하고, 이러한 백색 침전물을 여과시킨다. 물로 세척한 후, 고체를 건조기 내에서 진공하에 오산화인으로 건조시킨다. 이로써 융점이 324-327℃인 (32) 16.0g(91%)을 수득한다.

2. 분석 데이터

5-(2-프탈이미도에틸)우라실(32):

융점: 324-327℃(분해).

TLC: CHCl₃/MeOH 5:1, R_f0.51

UV (MeOH): λ_max263.0 (5825); λ298.0 (sh., 1380).

IR (KBr): 3446m, 3216m, 1772m, 1721s, 1707s, 1670s, 1390m.

¹H-NMR (300 MHz, d₆-DMSO): 2.49 (t, 2H, J(CH₂CH₂N, CH₂CH₂N) = 6.0, CH₂CH₂N); 3.71 (t, 2H, J(CH₂CH₂N, CH₂CH₂N) = 6.0 CH₂CH₂N); 7.24 (s, H-C(6)); 7.84 (m_c, 4H, NPht); 10.76 (br, s, H-N(1), H-N(3)).

MS (ESI^-): 284.0 [M-H].

1-(2,3,4-트리-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실(34)

1. 과정

(32) 7.00g(24mmol) 및 (33) 13.6g(24mmol)을 아르곤 유입구, 내부 온도계 및 격막이 장착된 250ml 3목 플라스크에서 아세토니트릴 120ml에 현탁시킨다. 먼저, BSA 12.2ml(50mmol)을 30분 동안 교반시킨 후, BSA 7ml(28mmol)을 주사기를 통해 더 가한다. 단시간 동안 40℃로 가열한 후, 반응 혼합물을 정화시킨다. TMSOTf 13ml(72mmol)을 실온에서 주사기를 통하여 가한다. 1시간 후, 어떠한 생성물 형성도 관찰되지 않았다(TLC 체킹, AcOEt/n-헵탄 1:1). 따라서, TMSOTf 13ml(72mmol)를 더 가한다. 연속적으로, 상기 반응 혼합물을 50℃로 가열한다. 50℃에서 2.5시간 동안 교반시킨 후(TLC 체킹), 이 혼합물을 RT로 냉각시키고 AcOEt 250ml와 포화 NaHCO₃용액 190ml의 빙냉 혼합물 상으로 도입하고 10분 동안 교반시킴으로써 집중적으로 추출시킨다. 이를 NaHCO₃용액 100ml로 다시 세척하고 수성 상을 AcOEt 100ml로 재추출한다. 묽은 유기 상을 MgSO₄를 사용하여 건조시키고 용매를 회전식 증발기 상에서 진공하에 제거시킨다. 오일 펌프 진공하에 건조시킨 후, 조 생성물 20.9g을 수득한다. 실리카 겔(h=25cm, φ=5cm, AcOEt/n-헵탄 1:1) 상에서 크로마토그래피하여 TLC-균일한 발포성 생성물을 수득하고, 이를 Et₂O를 사용하여 분해한다. 여과시키고 오일 펌프 진공하에서 건조하여 (34) 15g(86%)을 수득한다.

2. 분석 데이터

1-(2,3,4-트리-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실(34):

융점: 124℃(소결).

TLC: AcOEt/n-헵탄 1:1, R_f0.09.

UV (MeOH): λ_max263.0 (11085): λ299.0 (sh., 1530)

IR (KBr): 3238w, 3067w, 1772m, 1710s, 1452m, 1395m, 1266s, 1110s, 1070m, 1026m.

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 2.79 (m_c, 2H, CH₂CH₂N); 3.96 (m_c, 2H, CH₂CH₂N); 4.06 (dd, J(H_eq-C(5'), H_ax-C(5')) = 11.0, J(H_eq-C(5'), H-C(4')) = 6.0, H_eq-C(5')); 4.12 (t, J(H_ax-C(5'), H_eq-C(5')) = J(H_ax-C(5'), H-C(4')) = 11.0, H_ax-C(5')); 5.39 (dd, J(H-C(2'), H-C(1')) = 9.5, J(H-C(2'), H-C(3')) = 2.9 H-C(2')); 5.46 (ddd, J(H-C(4'), H_ax-C(5')) = 11.0, J(H-C(4'), H_eq-C(5')) = 6.0, J(H-C(4'), H-C(3')) = 2.9, H-C(4')); 6.26 (φt, J2.6, H-C(3')); 6.36 (d, J(H-C(1'), H-C(2')) = 9.5, H-C(1')); 7.24-7.40, 7.44-7.56, 7.61-7.66, 7.72-7.80, 7.84-7.90, 8.06-8.13 (6m, 16H, 3 Ph, H-C(6)); 7.70, 7.82 (2 m_c, 4H, NPht); 8.37 (s, H-N(3)).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃): 21.19 (CH₂CH₂N); 36.33 (CH₂CH₂N); 64.07 (C(5')); 66.81, 68.22 (C(4'), C(2')); 69.29 (C(3')); 78.59 (C(1')); 112.42 (C(5)); 123.31, 132.05, 133.89 (6C, Pht); 128.33, 128.47, 128.47, 128.83, 128,86, 129.31, 129.83, 129.83, 129.94, 133.55, 133.62, 133.69 (18C, 3 Ph); 135.87 (C(6)); 150.39, 162.78 (C(4)); 164.64, 165.01, 165.41 (3C, O₂CPh); 168.43 (2C, CO-Pht).

MS (ESI⁺): 730.2 [M+H].

C₄₀H₃₁N₃O₁₁(729.70)에 대한 원소 분석:

계산치: C 65.84, H 4.28, N 5.76

실측치: C 65.63, H 4.46, N 5.53.

5-(2-프탈이미도에틸)-1-(β-D-리보피라노실)우라실(35)

1. 과정

(34) 15g(20mmol)을 1L 환저 플라스크에서 MeOH 500ml에 용해시키고, NaOMe 324mg(6mmol)로 처리한 다음, 물을 제거하면서 실온에서 밤새 교반시킨다(TLC 체킹, AcOEt/n-헵탄 1:1). pH가 〈7이 될 때까지 앰벌라이트 IR-120을 상기와 같이 생성된 현탁액에 가한다. 고체를 가열하에 용해시키고, 이온 교환체로부터 뜨겁게 여과시키며 MeOH로 세척한다. 용매를 제거한 후, 잔사를 매회 물 150ml를 사용하여 2회 공-증발시킨다. 이로써 조 생성물을 9g 수득하고, 이를 10분 동안 MeOH 90ml에서 환류 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 Et₂O 60ml로 처리하고 4℃에서 밤새 저장한다. 여과하고, Et₂O로 세척한 다음, 오일 펌프 진공하에서 건조시켜 (35) 7.8g(93%)을 수득한다.

2. 분석 데이터

5-(2-프탈이미도에틸)-1-(β-D-리보피라노실)우라실(35):

융점 137℃(소결)

TLC: CHCl₃/MeOH 5:1, R_f0.21.

UV (MeOH): λ_max263.0 (8575): λ299.0 (sh., 1545).

IR (KBr): 3458s, 1772w, 1706s, 1400m, 1364m, 1304m, 1045m.

¹H-NMR (300 MHz, d₆-DMSO + 2 Tr. D₂O: 2.55 (m_c, 2H, CH₂CH₂N); 3.28-3.61 (m, 4H, H-C(2'), H-C(4'), H_eq-C(5'), H_ax-C(5')); 3.73 (m_c, 2H, CH₂CH₂N); 3.93 (m, H-C(3')); 5.50 (d, J(H-C(1'), H-C(2')) = 9.3, H-C(1')); 7.41 (s, H-C(6)); 7.84 (s, 4H, NPht).

¹³C-NMR (75 MHz, d₆-DMSO): 25.63 (CH₂CH₂N); 36.62 (CH₂CH₂N); 64.95 (C(5')); 66.29 (C(4')); 67.37 (C(2')); 71.12 (C(3')); 79.34 (C(1')); 110.39 (C(5)); 122.85, 131.54, 134.08 (6C, Pht); 137.92 (C(6)); 150.84 (C(2)); 163.18 (C(4)); 167.74 (2C, CO-Pht).

MS (ESI^-): 416.1 [M-H].

1-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실

5-(2-프탈이미도에틸)-1-(β-D-리보피라노실)우라실 10.6g(0.025mmol)을 가열되고 아르곤 플러쉬된 1L 4목 플라스크에서 피리딘 20ml에 용해시키고 디클로로메탄 200ml와 혼합한다. 이 혼합물을 -70℃로 냉각시키고, 피리딘 5ml 및 디클로로메탄 20ml 중의 벤조일 클로라이드 3.82ml(0.033mmol)을 냉각시키면서 서서히 적가한 다음 -70℃에서 35분 동안 교반시킨다. 이 반응 혼합물을 냉각된 염화암모늄 용액 600ml에 따라 붓고 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출한다. 합한 유기 상을 물로 세척하고, 건조시킨 다음 진공하에 건고 농축시킨다. 실리카 겔(에틸 아세테이트/헵탄 1:1) 상에서 크로마토그래피하여 1-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 7.9g(60%)을 수득한다.

TLC: R_f0.24(에틸 아세테이트/헵탄 4:1)

¹H-NMR (300 Mhz, d₆-DMSO): 2.67 (m_c, 2H, CH₂CH₂N); 3.66-3.98 (m, 5H, H-C(4'), H_eq-C(5'), H_ax-C(5'), CH₂CH₂N); 4.51 (t, 1H, H-C(3')); 4.98 (dd, 1H, H-C(2')); 6.12 (d, 1H, H-C(1')); 7.19 (s, 1H, H-C(6)); 7.29-7.92 (m, 9H, OBz, NPht).

1-(2-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실

1-(2-O-벤조일-β-D-리보피라노실-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 5.6g(10.73 mmol)을 디클로로메탄 60ml에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 4.72g(13.95mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 2.4ml(13.95mmol)로 처리한 다음 RT에서 20분 동안 교반시킨다. 이 반응 혼합물을 디클로로메탄 100ml로 희석시키고, 탄산수소나트륨 용액 및 20% 시트르산 용액으로 세척하며, 건조시킨 다음 진공하에 건고 농축시킨다. 실리카 겔(에틸 아세테이트/헵탄 1:1 + 2% 트리에틸아민) 상에서 크로마토그래피하여 1-(2-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-리보피라노실) -5-(2-프탈이미도에틸)우라실 7.7g(87%)을 수득한다.

TLC: R_f0.53 (에틸 아세테이트/헵탄 1:1 + 2% 트리에틸아민).

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 2.64 (m_c, 2H, CH₂CH₂N); 3.12 (m_c, 1H, H-C(4')); 3.59-3.63 및 3.72-3.92 (m, 5H, H-C(3'), H_eq-C(5'), H_ax-C(5'), CH₂CH₂N); 3.81 및 3.82 (s, 6H, CH₃O); 4.70 (dd, 1H, H-C(2')); 6.09 (d, 1H, H-C(1')), 7.05 (s, 1H, H-C(6)); 6.84-7.90 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).

1-(3-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실

1-(2-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 3g(3.63mmol), 4-니트로페놀 1g(7.26mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 0.44g(3.63mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 3.75ml(21.78mmol)을 이소프로판올 5.6ml 및 피리딘 25ml에 용해시키고, 65℃로 가열한 다음, 65℃에서 3일 동안 교반시킨다. 이 용액을 진공하에 건고 농축시키고 잔사를 디클로메탄 150ml에 용해시킨다. 20% 시트르산 용액 및 탄산수소나트륨 용액으로 세척한 후, 이 용액을 황산마그네슘으로 건조시킨다. 실리카 겔(에틸 아세테이트/디클로로메탄/이소헥산 2:1:1) 상에서 크로마토그래피하여 1-(3-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 2.27g(76%)을 수득한다.

TLC: R_f0.27 (에틸 아세테이트/이소헥산 2:1 + 1% 트리에틸아민).

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 2.39 (m_c, 2H, CH₂CH₂N); 2.53 (m_c, 1H, H_eq-C(5')); 3.30 (dd, 1H, H-C(2')); 3.55 (m_c, 1H, H_ax-C(5')); 3.69 (m_c, 2H, CH₂CH₂N); 3.78 및 3.79 (s, 6H, CH₃O); 3.79-3.87 (m, 1H, H-C(4')); 5.74 (d, 1H, H-C(1')); 5.77 (m_c, 1H, H-C(3')); 6.92 (s, 1H, H-C(6)); 6.74-8.20 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).

1-{2'-O-[(알릴옥시)(디이소프로필아미노)포스피노]-3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}-5-(2-프탈이미도에틸)우라실

1-(3-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 88mg(0.11mmol)을 디클로로메탄 5ml에 용해시키고, N-에틸디이소프로필아민 75㎕(0.44mmol) 및 알릴옥시클로로(디이소프로필아미노)포스핀 70㎕(0.3mmol)으로 처리하고 실온에서 3시간 동안 교반시킨다. 알릴옥시클로로(디이소프로필아미노)포스핀 35㎕(0.15mmol)을 더 가하여 상기 반응을 완료시킨 후, 이를 실온에서 1시간 동안 더 교반시키고 상기 반응 혼합물을 진공하에 농축시킨다. 실리카 겔(에틸 아세테이트/헵탄: 구배 1:2 내지 1:1 내지 2:1, 각 경우에 2% 트리에틸아민을 사용함) 상에서 크로마토그래피하여 1-{2'-O-[(알릴옥시)(디이소프로필아미노)포스피노]-3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 85mg(76%)을 수득한다.

TLC: R_f0.36(에틸 아세테이트/헵탄 2:1)

¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz,): 선택된 특징적 위치: 2.28, 2.52 (2 dd, J = 5.0, 11.0 Hz, 2 H, 2 H-5'), 3.79, 3.78 (약 2 s, 12 H, OMe), 6.14 (1 bs, 1 H, H-3').

³¹P-NMR (CDCl₃): 149.8, 150.6

5.2 인돌계 링커

N-프탈로일트립타민을 문헌[참조: Kuehne et al., J. Org. Chem. 43, 13, 1978, 2733-2735]에 기재된 바와 같이 프탈산 무수물 및 트립타민으로부터 수득한다. 이를 보란-THF로 환원시켜 인돌린을 수득한다[참조: A. Giannis et al., Angew. Chem. 1989, 101; 220].

3-치환된 인돌린을 먼저 리보즈와 반응시켜 뉴클레오사이드 트리올을 수득한 다음, 아세트산 무수물과 반응시켜 트리아세테이트를 수득한다. 이 혼합물을 2,3-디클로로-5,6-디시아노파라퀴논으로 산화시키고 아세테이트를 나트륨 메톡사이드로 절단한 다음, 2'-위치에서 선택적으로 벤조일화한다. 4'-위치에서 선택적으로 DM-트리틸화하고 이동 반응을 수행하여 3'-벤조에이트를 수득한다. 포스포르아미다이트의 형성 반응을 통상적인 방식으로 수행한다. 합성 프로토콜을 변경시키지 않고 상기 물질을 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성에 이용할 수 있다.

과정

3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)인돌린

프탈로일트립타민 (A) 51.4g(177mmol)을 질소 대기하에서 1M 보란-THF 용액 354ml(2당량)에 용해시키고 0℃로 냉각시킨다. 트리플루오로아세트산 354ml를 0℃에서 서서히 적가하고(주의: 기체 방출), 이 혼합물을 30분 동안 교반시킨다(TLC 체킹: EtOAc). 물 17.3ml을 가하고, 상기 혼합물을 10분 동안 교반시킨 다음 진공하에 농축시킨다. 이 잔사를 10% 농도의 NaOH 용액/디클로로메탄에 용해시키고, 유기 상을 분리시키며, NaSO₄로 건조시키며, 여과시킨 다음 진공하에 농축시킨다. 이 잔사(50.9g)을 뜨거운 에탄올(3L)로부터 재결정화한다. (B) 41.4g을 수득한다(융점 161-162℃). 모액을 진공하에 농축시키고 잔사를 에탄올로부터 재결정화한다. (B) 3.2g을 더 수득한다(융점 158-159℃).

총 수득량: (B) 44.6g(153mmol), 즉 86%.

¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 1.85-2.00, 2.14-2.28 (2 m, 2 ×1H, CH₂CH₂NPhth), 2.70 (bs, 1 H, NH), 3.24-3.38, 3.66-3.86 (2 m, 5 H, CH₂CH₂NPhth, H-2a, H-2b, H-3), 6.62 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 6.66-6.72 (m, 1 H, H-5), 6.99 (약 t, J = 7.5 Hz, 1 H, H-6), 7.14 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.64-7.74, 7.78-7.86 (2 m, 2 ×2 H, Phth).

¹³C-NMR (CDCl₃, 75 MHz): 32.70, 36.10 (2 t, C-2, CH₂CH₂NPhth), 39.62 (d, C-3), 53.04 (t, CH₂NPhth), 109.65 (d, C-7), 118.74 (d, C-5), 123.25 (d, Phth), 123.92, 127.72 (2 d, C-4, C-6), 131.81 (s, C-3a), 132.14 (s, Phth), 133.99 (d, Phth), 151.26 (s, C-7a), 168.38 (s, C=O).

계산치: C: 73.96, H: 5.52, N: 9.58;

실측치: C: 73.89, H: 5.57, N: 9.55.

MS (ES⁺): 293 (MH⁺, 100%)

3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)-1-(2',3',4'-트리-O-아세틸-β-D-리보피라노실)인돌

(A) 45.2g(155mmol) 및 D-리보즈 23.2g(155mmol; 1.0당량)을 무수 에탄올 750ml에 현탁시키고 질소 대기하에 4시간 동안 환류 가열한다(TLC 체킹: CH₂Cl₂/MeOH 10:1). RT로 냉각시킨 후, 혼합물을 진공하에 농축시킨다. 잔사를 피리딘 300ml에 용해시키고 빙냉시키면서 아세트산 무수물 155ml로 처리한다. 15분 후, 빙욕을 꺼내고 상기 혼합물을 RT에서 18시간 동안 교반시킨다(TLC 체킹: EtOAc/이소헥산 1:1). 이 용액을 진공하에 농축시키고 매회 톨루엔 300ml를 사용하여 3회 공증발시킨다. 수득된 오일을 디클로로메탄 900ml에 용해시키고 빙냉시키면서 2,3-디클로로-5,6-디시아노-파라퀴논 38.8g(171mmol; 1.1당량)으로 처리한다. 15분 후, 빙욕을 꺼내고 혼합물을 RT에서 1.5시간 동안 교반시킨다(TLC 체킹: EtOAc/이소헥산 1:1). 침착된 침전물을 흡인 여과시키고 디클로로메탄으로 세척한 다음 경사제거한다. 여액을 포화 NaHCO₃용액 600ml로 세척한다. 이러한 과정시 침착된 침전물을 다시 흡인 여과시키고 디클로로메탄으로 세척한 다음 경사제거한다. 합한 유기 추출물을 Na₂SO₄로 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 잔사(90.9g)를 실리카 겔 60(10 x 25cm; EtOAc/이소헥산 2:3) 상에서 섬광 크로마토그래피하여 정제한다. 다음을 수득한다: 순수한 (B) 21.5g 및 혼합 분획 46.83g, 이를 신선하게 크로마토그래피하여 순수한 (B) 20.4g을 더 수득한다.

총 수득량: (B) 41.9g(76mmol), 즉 49%.

¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 1.64, 1.98, 2.19 (3 s, 3 ×3 H, Ac), 3.06 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH₂CH₂NPhth), 3.81-4.00 (m, 4 H, H-5'_an, H-5'_eq, CH₂NPhth), 5.13 (ddd, J = 2.5, 6.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 5.36(dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 5.71(d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 5.74(app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 7.02(s, 1 H, H-2), 7.04-7.10, 7.13-7.19 (2 m, 2 ×1 H, H-5, H-6), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.58-7.66, 7.72-7.80(2 m, 5 H, Phth, H-4).

¹³C-NMR (CDCl₃, 75 MHz): 20.23, 20.65, 20.87 (3 q, Ac), 24.41, 38.28 (2 t, CH₂CH₂), 63.53 (t, C-5'), 66.24, 68.00, 68.64 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 80.33 (d, C-1'), 109.79 (d, C-7), 113.95 (s, C-3), 119.33, 120.39, 122.04, 122.47 (4 d, C-4, C-5, C-6, C-7), 123.18 (d, Phth), 128.70, 132.17 (2 s, C-3a, Phth), 133.87 (d, Phth), 136.78 (s, C-7a), 168.243, 168.77, 169.44, 169.87 (4 s, C=O).

계산치: C: 63.50, H: 5.15, N: 5.11;

실측치: C: 63.48, H: 5.16, N: 5.05.

MS (ES⁺): 566 (M+NH₄ ⁺, 82%), 549 (MH⁺, 74%), 114 (100%).

3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)-1-β-D-리보피라노실인돌

(A) 44.1g(80mmol)을 질소 대기하에서 무수 메탄올 400ml에 용해시킨다. 이 혼합물을 빙냉시키면서 30% 농도의 나트륨 메톡사이드 용액 4.0ml로 처리한 다음, RT에서 18시간 동안 교반시킨다. 침착된 침전물을 흡인 여과시키고 찬 에탄올로 세척한다. 여액을 진공하에 농축시킨다. 잔사를 디클로로메탄에 흡수시킨다. 이 용액을 포화 NaHCO₃용액으로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시킨 다음 진공하에 농축시킨다. 수득된 잔사를 반응 용액으로부터 침착된 침전물과 함께 뜨거운 에탄올로부터 재결정화한다. (B) 22.6g을 수득한다(융점 196-198℃). 모액을 진공하에 농축시키고 잔사를 에탄올로부터 재결정화한다. (B) 9.2g을 추가로 수득한다. 융점 188-194℃.

총 수득량: (B) 25.8g, 즉 76%.

¹H=NMR (MeOD, 300 MHz): 3.09 (약 t, J = 7.0 Hz, 2 H, CH₂CH₂NPhth), 3.64-3.98 (m, 5 H, H-4', H-5'_ax, H-5'_eq, CH₂NPhth), 4.05 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 4.22 (약 t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.65 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.95-7.05, 7.09-7.16 (2 m, 2 ×1 H, H-5, H-6), 7.25 (s, 1 H, H-2), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.74-7.84 (m, 4 H, Phth).

¹³C-NMR (d₆-DMSO, 75 MHz): 23.87, 37.79 (2 t, CH₂CH₂NPhth), 64.82 (t, C-5'), 66.74 (d, C-4'), 68.41 (d, C-2'), 71.42 (d, C-3'), 81.37 (d, C-1'), 110.42 (d, C-7), 111.05 (s, C-3), 118.17, 119.21, 121.36, 122.92, 123.80 (5 d, C-2, C-4, C-5, C-6, NPhth), 127.86, 131.59 (2 s, C-3a, Phth), 134.27 (d, Phth), 136.62 (s, C-7a), 167.72 (s, C=O).

MS(ES^-): 457 (M+OH^-+H₂O, 49%), 439 (M+OH^-, 100%), 421 (M-H⁺, 28%)

1-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)인돌

(A) 10.6g(25mmol)을 질소 대기하에서 무수 디클로로메탄 250ml에 흡수시킨다. 이 혼합물을 DMAP 305mg(2.5mmol) 및 피리딘 20ml로 처리한다. 모든 것이 용액 상태로 될 때까지 가열한 다음, -78℃로 냉각시킨다. 디클로로메탄 8ml에 용해된 벤조일 클로라이드 3.35ml(28.8mmol)을 15분에 걸쳐 적가한다. 30분 더 지난 후의 TLC 체킹(EtOAc/헥산 3:1)은 완전한 반응을 지시하였다. 45분 후, 찬 용액을 폴딩된 여과기를 통하여 포화 NH₄Cl 용액 200ml에 직접 가하고 여과기 잔사를 디클로로메탄으로 세척한다. 유기 상을 물로 1회 세척하고, MgSO₄로 건조시킨 다음 농축시킨다. 잔사를 톨루엔으로 2회 공증발시키고 EtOAc/헥산 3:1을 사용하여 10 x 20cm 실리카 겔 상에서 섬광 크로마토그래피하여 정제한다. (B) 8.1g(64%)을 수득한다.

¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 2.45, 2.70 (2 bs, 2 ×1 H, OH), 3.04 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH₂CH₂NPhth), 3.80-4.20 (m, 5 H, H-4', H-5'_ax, H-5'_eq, CH₂NPhth), 4.63 (bs, 1 H, H-3'), 5.46 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 6.03 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 7.08-7.31 (m, 5 H, H-2, H-5, H-6, Bz-m-H), 7.41-7.48 (m, 1 H, H-Bz-p-H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.64-7.79 (m, 7 H, Phth, H-4, Bz-o-H).

¹³C-NMR (d₆-DMSO, 75 MHz): 24.40, 38.22 (2 t, CH₂CH₂NPhth), 65.95 (t, C-5'), 66.65 (d, C-4'), 69.55 (d, C-3'), 71.87 (d, C-2'), 79.57 (d, C-1'), 109.96 (d, C-7), 113.70 (s, C-3), 119.21, 120.21, 122.11, 122.41, 123.14, (5 d, C-2, C-4, C-5, C-6, NPhth), 128.28 (d, Bz), 128.58, 128.59, (2 s, C-3a, Bz), 129.62 (d, Phth), 132.05 (s, Phth), 133.81 (Bz), 136.97 (s, C-7a), 165.12, 168.29 (2 s, C=O).

MS(ES^-): 525 (M-H⁺, 12%), 421 (M-PhCO⁺, 23%), 107 (100%).

1-{3'-O-벤조일-4'O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸-β-D-리보피라노실}-3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)인돌

(A) 8.9g(16.9mmol)을 질소 대기하에서 무수 디클로로메탄 135ml에 현탁시킨다. 이 혼합물을 DMAP 206mg(1.68mmol), N-에틸디이소프로필아민 5.8ml(33.7mmol) 및 피리딘 약 12ml로 처리한다(용해가 완료될 때까지). 이어서, 이를 분자체 4Å 34g으로 처리하고 30분 동안 교반시킨다. 0℃로 냉각시킨 후, 이를 DMTCl 11.4g(33.7mmol)로 처리하고, 빙욕을 꺼낸 후에 75분 동안 교반시킨다. 추가의 DMTCl 1.94g(0.34당량) 및 40분 후에 1.14g(0.2당량) 및 65분 후에 1.14g(0.2당량)을 가한다. 4.25시간 후, 상기 반응을 완료한다. 이어서, 이 혼합물을 n-프로판올 25.3ml(20당량)으로 처리하고 30분 더 교반시킨 다음 조심스럽게(발포체 형성) 농축시킨다. 잔사를 피리딘 100ml에 용해시킨다. 이를 DMAP 1.85g(15.1mmol; 0.9당량), N-에틸디이소프로필아민 13.05ml(101mmol; 6.0당량), n-프로판올 71ml(940mmol; 56당량) 및 p-니트로페놀 3.74g(26.9mmol; 1.6당량)으로 처리한다. 이 혼합물을 질소하에 75-80℃에서 96시간 동안 교반시킨다. 실온으로 냉각시킨 후, 이 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과시키고 농축시킨다. 잔사를 톨루엔/디에틸 에테르/트리에틸아민 90:10:1을 사용하여 9 x 17cm 실리카 겔 상에서 섬광 크로마토그래피하여 정제한다. 생성물 함유 분획(9.25g)을 먼저 EtOAc로부터 재결정화한 다음 톨루엔/메탄올로부터 재침전시킨다. (B) 5.86g(42%)을 수득한다.

¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 2.64 (bs, 1 H, OH), 2.68 (dd, J = 5.0, 11.5 Hz, 1 H, H-5'_eq), 2.94 (dd, J = 7.5, 16.0 Hz, 1 H, CH₂CH₂NPhth), 3.03 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 1 H, CH₂CH₂NPhth), 3.67-3.74 (m, 1 H, H-5'_ax), 3.69, 3.70 (2 s, 2 ×3 H, OMe), 3.85 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH₂CH₂NPhth), 3.94 (ddd, J = 3.0, 5.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 4.03 (dd, J = 3.5, 9.0 Hz, 1 H, H-2'), 5.51 (d, J = 9.0 Hz, 1 H, H-1'), 5.86 (bs, 1 H, H-3'), 6.68-7.66 (m, 25 H), 8.19-8.30 (m, 2 H).

¹³C-NMR (CDCl₃, 75 MHz): 24.16, 38.80 (2 t, CH₂CH₂NPhth), 55.25, 55.26 (2 q, Ome), 65.58 (t, C-5'), 68.29, 69.19, 73.83 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 83.03 (d, C-1'), 87.31 (CAr₃)110.03 (d, C-7), 113.37, 113.47 (2 d), 113.53 (s, C-3), 118.95, 120.20, 122.28, 122.31, 123.10, 127.07, 128.02, 128.08, 128.68 (9 d), 128.74 (s), 130.02, 130.19, 130.22 (3 d), 130.37, 131.95 (2 s), 133.40, 133.83 (2 d), 135.98, 136.14, 136.56, 145.12, 158.82, 166.76, 168.52 (7 s, C-7a, 2 COMe, 2 C=O).

1-{2'O-(알릴옥시)(디이소프로필아미노)포스피노-3'-O-벤조일-4'O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}-3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)인돌(2 부분입체이성체)

알콜(A) 1658mg(2.0mmol)을 아르곤 대기하에서 무수 디클로로메탄 10ml에 용해시킨다. 이 용액을 N-에틸디이소프로필아민 1.03ml(6.0mmol) 및 모노알릴 n-디이소프로필클로로포스포르아미다이트 0.63ml(2.8mmol)로 처리하고 실온에서 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 이소프로판올 61㎕(0.8mmol)을 가함으로써 과량의 포스포릴화 시약을 파괴시킨다. 10분 후, 이 혼합물을 진공하에 농축시키고 잔사를 헥산/EtOAc/NEt₃(75:25:1)을 사용하여 3.3 x 21cm 실리카 겔 상에서 섬광 크로마토그래피하여 정제한다. 생성물 함유 분획을 농축시키고, CCl₄에 흡수시키고 다시 농축시킨다. 거의 무색의 발포체 2.04g(정량적)을 수득하고, 이를 올리고머화에 직접적으로 사용하고 수주 동안 -20℃에서 유지시킬 수 있다.

실리카 겔(EtOAc/헥산/NEt₃33:66:1) 상에서의 TLC: 0.41.

¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 선택된 특징적 위치: 2.42, 2.53, (2 dd, J = 5.0, 11.0 Hz, 2 H, 2 H-5'_eq), 3.76, 3.77, 3.78, 3.79 (4 s, 4 ×3 H, OMe), 5.70, 5.73 (2 d, J = 9.0 Hz, 2 H, 2 H-1'), 6.16, 6.29 (2 bs, 2 H, 2 H-3').

³¹P-NMR (CDCl₃): 150.6, 151.0

5.3 리신계 링커

본 합성은 반응식 7에 도시되어 있으며 다음에 보다 상세히 기재되어 있다:

6-아미노-2(S)-하이드록시헥사노산(1)을 디아조화한 다음 가수분해시킴으로써 다음 문헌으로부터 공지된 방식으로 L-리신으로부터 제조한다[참조: K.-I. Aketa, Chem. Pharm. Bull. 1976, 24, 621].

2-(S)-N-Fmoc-6-아미노-1,2-헥산디올(2)

LiBH₄3.4g(156mmol, 4당량)을 아르곤 하에 무수 THF 100ml에 용해시킨다(발열성). 약 30℃로 냉각시킨 후, TMSCl 39.6ml(312mmol, 8당량)을 서서히 적가하면(기체 방출) 침전물이 형성된다. 6-아미노-2(S)-하이드록시헥사노산(1) 5.74g(39mmol)을 아르곤 역류하에 여러번 가하고, 혼합물을 TLC(실리카 겔; i-PrOH/진한 NH₄OH/물 7:2:1; 닌하이드린으로 염색함)가 더 이상 어떠한 출발 물질도 나타내지 않을 때까지(약 3시간) 65℃로 가열한다. 이 혼합물을 빙냉시키면서 메탄올 120ml로 조심스럽게 처리한다(강한 기체 방출). 상기 용매를 진공하에 농축시키고, 잔사를 매회 메탄올 200ml로 3회 공-증발시킨 다음, 무수 DMF 100ml에 용해시킨다. 에틸디이소프로필아민 16ml(93.6mmol, 2.4당량)을 가한 후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, FmocCl 12.1g(46.8mmol, 1.2당량)으로 여러번 처리한다. 15분 후, 빙욕을 꺼내고 혼합물을 출발 물질이 소모될 때까지(약 3시간; TLC 체킹: 실리카 겔; CHCl₃/MeOH/HOAc/물 60:30:3:5) 실온에서 교반시킨다. 이 반응 용액을 포화 NaHCO₃용액 600ml에 가한다. 침전물을 여과시키고, 물 200ml로 세척한 다음, 중량이 일정할 때까지(약 6시간) 고진공하에서 50℃에서 건조시킨다. 무색 고체 13.9g을 수득하고, 이를 에틸 아세테이트(40ml)/n-헥산(35ml)으로부터 재결정화하여 9.05g(65%)을 수득한다.

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 7.68, 7.51 (2 d, J = 8.0 Hz, 각 경우 2 H, Ar-H), 7.32 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, Ar-H), 7.23 (dt, J = 1.6, 8.0 Hz, 2 H, Ar-H), 4.92 (bs, 1 H. NH), 4.32 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH₂), 4.13 (bt, J = 7.0 Hz, OCOCH₂CH), 3.64-3.58 (m, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.54 (dd, J = 3.2, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.35 (dd, J = 7.4, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.16-3.06 (m, 2 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.0-2.0 (bs, 2 H, OH), 1.52-1.18 (m, 6 H, H-3, H-3', H-4, H-4', H-5, H-5').

2-(S)-N-Fmoc-O¹-DMT-6-아미노-1,2-헥산디올(3)을 WO 89/02439에 따라서 DM-트리틸화시킨다.

2-(S)-N-Fmoc-O¹-DMT-O²-알릴옥시디이소프로필아미노포스피닐-6-아미노-1,2-헥산디올(4)

에틸디이소프로필아민 0.51ml(3.0mmol, 3당량) 및 클로로-N,N-디이소프로필아미노알릴옥시포스핀 0.33ml(1.5mmol, 1.5당량)을 무수 디클로로메탄 10ml 중의 알콜(3) 670mg(1.02mmol)의 용액에 아르곤 하에 가한다. 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시키고, 용매를 진공하에 스트립핑하며, 수득된 잔사를 3.2 x 16cm 실리카 겔(EtOAc/이소헥산/NEt₃20:80:1) 상에서 섬광 크로마토그래피하여 정제한다. 약간 황색의 오일 839mg(97%)을 수득한다.

TLC: 실리카겔; EtOAc/이소헥산/NEt₃50:50:1; UV; R_f = 0.77.

¹H=NMR (300 MHz, CDCl₃): 7.70-6.68 (m, 21 H, Ar-H), 4.92-4.62 (m, 1 H. NH), 4.31 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH₂), 4.13 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, OCOCH₂CH), 3.98-3.40 (m, 5 H), 3.77 (2 s, 각 경우 3 H, OMe), 3.16-2.86 (m, 4 H), 2.58 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, CHCN), 2.38 (t, 1 H, CHCN), 1.80-1.20 (m, 6 H), 1.20, 1.18, 1.17, 1.16, 1.15, 1.13, 1.08, 1.06 (8 s, 12 H, NMe).

³¹P-NMR (300 MHz, CDCl₃): 149.5, 149.0 (2 s)

실시예 6

커플링 시약으로서 벤즈이미다졸륨 트리플레이트를 사용한 서열 4'-인돌 링커-A8-2'의 p-RNA 올리고의 합성

인돌 링커 포스포르아미다이트 108mg 및 포스포르아미다이트(A) 244mg을 합성기 바이알 내로 칭량하고, A 단위가 부하된 CPG 지지체 28.1mg으로 패킹된 칼럼과 함께 KOH 상에서 건조기에서 3시간 동안 고진공하에 방치시켜 둔다. 상기 포스포르아미다이트를 아세토니트릴 1ml(인돌 링커) 또는 2.5ml(포스포르아미다이트)에 용해시키고, 분자체의 수개의 비이드를 가한 다음 KOH 상에서 건조기 내에서 밀폐 방치시킨다.

요오드 200mg을 격렬하게 교반시키면서 아세토니트릴 50ml에 용해시킨다. 모든 것이 용해된 후(가시적 조절), 물 23ml 및 심콜리딘 4.6ml을 가하고 이 용액을 철저하게 1회 혼합한다. 탈트리틸화를 위해, 디클로로메탄 중의 6% 농도의 디클로로아세트산 용액을 이용한다. 캡핑 시약(아세트산 무수물 + 염기)을 구입하고 올리고뉴클레오타이드 합성에 통상적인 바대로 사용한다.

벤즈이미다졸륨 트리플레이트를 뜨거운 아세토니트릴로부터 재결정화한 다음 건조시킨다. 거의 무색인 결정을 이용하여, 무수 아세토니트릴 중의 0.1M 용액을 커플링 시약으로서 제조한다. 합성 동안 이 용액은 항상 청정한 상태로 유지되며 합성기 튜빙 내에서의 어떠한 차단도 일어나지 않는다.

에펜도르프 에코신 300+에서 변형된 DNA 커플링 주기(DMT-원):

탈트리틸화 7분

커플링 1시간

캡핑 1.5분

산화 1분

테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 20mg을 디클로로메탄 1.5ml에 용해시키고, 디에틸암모늄 하이드로겐카보네이트 20mg, 트리페닐포스핀 20mg 및 올리고뉴클레오타이드를 수반하는 유리 지지체를 가하고, 단단히 밀봉시키며(파라필름) 바이알을 RT에서 5시간 동안 진탕시킨다. 이어서, 상기 유리 지지체를 분석용 흡인 여과기를 통하여 흡인 여과시키고, 디클로로메탄, 아세톤 및 물로 세척한다.

수성 0.1mol 나트륨 디에틸디티오카바메이트 용액을 사용하여 상기 지지체를 현탁시킨 다음, RT에서 45분 동안 정치시켜 둔다. 이를 흡인 여과시키고 물, 아세톤, 에탄올 및 디클로로메탄으로 세척한다. 상기 지지체를 24% 농도의 하이드라진 수화물 용액 1.5ml에 현탁시키고, 4℃에서 24 내지 36시간 동안 진탕시킨 다음 0.1mol 트리에틸암모늄 하이드로겐카보네이트 완충액(TEAB 완충액)을 사용하여 7ml로 희석시킨다. 이를 워터스 셉-팩 카트릿지를 통하여 하이드라진이 없어질 때까지 세척한다. 이를 80% 농도의 포름산 용액 5ml로 처리하고, 30분 후에 건고 농축시킨다. 이 잔사를 물 10ml에 흡수시키고, 디클로로메탄으로 추출하며, 수성 상을 농축시킨 다음 HPL 크로마토그래피한다(tR=33분, 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액 중의 아세토니트릴의 구배). 통상적인 탈염 공정(워터스 셉-팩 카트릿지)을 수행하여 상기 올리고뉴클레오타이드를 수득한다.

수율 17.6 OD

ESI 질량 분광측정법에 의해 입증된 물질 정체:

M(계산치) = 3082 D, (M+2H)²⁺(실측치) = 1541.9 D.

실시예 7

접합체의 제조

1. 순차적 방법

서열 A₈의 p-RNA 올리고머, 즉 옥타머를 먼저, 실시예 2에 기재된 바와 같이 에펜도르프 에코신 D 300+ 상에서 제조한 다음 시약을 교환한다: 6% 농도의 디클로로아세트산을 2% 농도의 트리클로로아세트산으로 교환하고 콜리딘 중의 요오드를 피리딘 중의 요오드로 교환하며, 벤즈이미다졸륨 트리플레이트 용액을 테트라졸 용액으로 교환한다. 합성 프로그램을 변경시킨 후, 서열 GATTC의 DNA 올리고머를 공지된 방법[참조: M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, UK 1984]에 따라서 추가로 합성한다. 탈알릴화, 하이드라진 분해, HPL 크로마토그래피 및 탈염을 p-RNA 올리고머에 대해 기재된 바와 같이 수행하고(상기 참조) 목적하는 접합체를 수득한다.

2. 수렴 방법

실시예 2에 기재된 바와 같이, 서열 4'-인돌 링커-A-2'를 갖는 p-RNA 올리고머를 제조하고, 정제한 다음 요오도아세틸화시킨다. 서열 GATTC-티올 링커의 DNA 올리고머를 공지된 방법[참조: M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, UK 1984]에 따라서 합성하고 정제한다[Glen Research: No. 20-2933으로부터의 3'-티올 링커]. 두 단편을 완충 용액 중에 정치시키면[참조: T. Zhu et al., Bioconjug. Chem. 1994, 5, 312], 접합체가 생성되며, 이를 최종적으로 HPLC를 통하여 정제한다.

실시예 8

아미노-변형된 p-RNA에 대한 바이오틴 라디칼의 접합

먼저, 실시예 6에 기재된 과정과 유사하게, 유로젠텍 (2-(2-(4-모노메톡시트리틸)아미노에톡시)에틸-2-시아노에틸 (N,N-디이소프로필)포스포르아미다이트의 5'-아미노 변형제 5를 사용하여 4'-말단에서 아미노 그룹이 제공된, 서열 TAGGCAAT의 p-RNA 올리고머를 합성하고 후처리한다. 이 올리고뉴클레오타이드(17.4 OD, 0.175μmol)을 염기성 완충액 0.5ml에 흡수시킨다. 바이오틴-N-하이드록시석신이미드 에스테르 1.14mg(2.5μmol)을 DMF(무수) 114㎕에 용해시키고 이 용액을 RT에서 1시간 동안 정치시킨다. 생성된 접합체를 예비 HPLC를 통하여 정제하고, 순수한 생성물을 세팩을 이용하여 탈염시킨다.

수율: 8.6 OD(49%)

M(계산치) = 3080 D, M(유효치) = 3080.4 D.

실시예 9

시아닌 또는 바이오틴-표지된 p-RNA 온라인의 제조

먼저, 공지된 방법에 따라서 각종 A, T, G, C 및 Ind(Ind=뉴클레오염기로서의 아미노에틸인돌)을 제조한다. 글렌 리서치로부터 시아닌(Cy3-CE) 및 바이오틴 포스포르아미다이트를 수득한다.

각 경우에 있어서 15μmol을 사용하여 완전한 자동 고체 상 합성을 수행한다. 1회 합성 주기는 다음 단계로 이루어진다:

(a) 탈트리틸화: CH₂Cl₂(79ml) 중의 6% DCA(디클로로아세트산)을 사용하여 5분 동안 처리함;

(b) CH₂Cl₂(20ml), 아세토니트릴(20ml)로 세척한 다음 아르곤으로 플러싱시킴;

(c) 커플링: 수지를 활성화제(CH₂Cl₂중의 0.5M 피리딘·HCl, 0.2ml)로 세척하고; 1:1의 비율로 활성화제(0.76ml) 및 상응하는 포스포르아미다이트(0.76ml; 8당량; 아세토니트릴 중의 0.1M)로 30분 동안 처리함;

(d) 캡핑: 퍼셉티브(Perseptive)로부터의 50% 캡 A(10.5ml) 및 50% 캡 B(10.5ml)[캡 A: THF, 루티딘, 아세트산 무수물; 캡 B: 1-메틸-이미다졸, THF, 피리딘]을 이용하여 2분 동안 처리함;

(e) 산화: 요오드 용액 120ml(아세토니트릴 100ml, H₂O 46ml 및 심-콜리딘 9.2ml 중의 요오드 400mg)으로 1분 동안 처리함;

(f) 아세토니트릴(22ml)로 세척함.

상기 올리고뉴클레오타이드의 후속 HPLC 정제를 촉진시키기 위하여, 마지막 DMT(디메톡시트리틸) 또는 MMT(모노메톡시트리틸) 보호 그룹을 바이오틴 또는 시아닌 단량체로부터 제거하지 않는다. UV(503nm)에서의 트리틸 양이온 흡광도를 이용하여 수지 1%로 합성시킨 후에 변형된 포스포르아미다이트를 사용하여 마지막 커플링을 탐지한다.

올리고뉴클레오타이드의 후처리:

RT에서 5시간 후에 CH₂Cl₂(15ml) 중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(272mg), 트리페닐포스핀(272mg) 및 디에틸암모늄 하이드로겐카보네이트의 용액을 사용하여 알릴 에테르 보호 그룹을 제거한다. 이어서, 유리 지지체를 CH₂Cl₂(30ml), 아세톤(30ml) 및 물(30ml)로 세척한다. 팔라듐 착물 잔기를 제거하기 위해서, 수지를 수성 0.1M 나트륨 디에틸디티오카바메이트 수화물 용액으로 세정한다. 상기 언급된 세척 작동을 역순으로 1회 이상 수행한다. 이어서, 상기 수지를 고진공하에 10분 동안 건조시킨다. 동시에 탈벤조일화시키면서 상기 유리 지지체로부터의 제거 단계를 4℃에서 24% 하이드라진 수화물 용액(6ml)에서 수행한다. RP 18 상에서 HPLC 체킹한 후(18-25시간), 활성화된(아세토니트릴, 20ml) 워터스 셉-팩 카트릿지를 이용하여 올리고뉴클레오타이드 "트리틸 온"을 하이드라진으로부터 없앤다. 이러한 하이드라진을 TEAB 0.1M(30ml)로 세척한다. 올리고뉴클레오타이드를 아세토니트릴/TEAB, 0.1M(10ml)로 용출시킨다. 이어서, 이 혼합물을 HPLC(단편 서열을 분리시키기 위함)를 통하여 정제하고, DMT 탈보호(80% 농도의 수성 포름산 30ml)를 수행한다. 최종 탈염(TEAB 완충액 0.1M/아세토니트릴:1/1를 이용하여 셉-팩 카트릿지를 통함)시켜 순수한 시아닌- 또는 바이오틴-표지된 올리고머를 수득한다.

이러한 올리고 용액의 분취량을 ESI-MS를 수행하는데 사용한다.

4'Cy-AIndTTCCTA 2': 계산된 M = 3026, 실측치(M+H)⁺= 3027.

4'바이오틴-TAGGAAIndT 2': 계산된 M = 3014, 실측치(M+2H)²⁺m/e 1508 및 (M+H)⁺m/e 3015.

상기 올리고를 저장을 위해 동결건조시킨다.

실시예 10

N-(요오도아세틸옥시)석신이미드를 이용한 p-RNA의 요오도아세틸화

p-RNA 서열: 4' AGGCAIndT 2' M_w= 2266.56g/mol (Ind = 인돌-CH₂-CH₂-NH₂-링커)

p-RNA 1당량을 0.1mol 탄산수소나트륨 용액(pH 8.4)에 용해시키고(350nmol당 1ml), DMSO 중의 N-(요오도아세틸옥시)석신이미드 용액으로 처리한다(1mg당 40㎕). 배치를 알루미늄 필름으로 일시 정지시키고 이를 실온에서 30 내지 90분 동안 정치시켜 둔다.

반응의 진행 과정을 분석용 HPLC를 이용하여 모니터한다. 표준 조건은 다음과 같다:

완충제 A: 수중의 0.1mol 트리에틸암모늄 아세테이트 완충제

완충제 B: 물:아세토니트릴 1:4 중의 0.1mol 트리에틸암모늄 아세테이트 완충제

구배: 40분 동안 10% B로부터 출발하여 50% B

칼럼 물질: 머크 다름슈타트 게엠베하(Merck Darmstadt GmbH)로부터의 10μM 리크로스피어100 RP-18; 250 x 4mm

출발 물질의 보유 시간: 18.4분

이 경우에 생성물의 보유 시간: 23.1분

반응을 완료한 후, 상기 배치를 물을 이용하여 4배 용적으로 희석시킨다. 워터스 셉-팩 카트릿지 RP-18(팩킹 15 OD 2g으로부터)을 아세토니트릴 2 x 10ml 및 물 2 x 10ml로 활성화시키고, 올리고를 적용하며, 이 안에 담그고 반응 용기를 물 2 x 10ml로 세척하고, 물 3 x 10ml로 재세척하여 염과 시약을 제거하며, 먼저 50:1 물:아세토니트릴 5 x 1ml로 용출시킨 다음 1:1 물:아세토니트릴로 용출시킨다. 1:1 분획에서 용출된 생성물은 매우 우수한 순도를 나타낸다. 이 분획을 찬 암실에서 농축시키고, 합한 다음 다시 농축시킨다.

260nm에서 UV 흡광 분광법을 이용하여 수율을 측정한다.

질량 분광측정법:

서열: 4' AGGCAInd(CH₂CH₂NHCOCH₂-I)T 2'

계산된 질량: 2434.50g/mol

실제 질량 MH₂ ²⁺: 1217.9g/mol = 2433g/mol

실시예 11

서열 CYSKVG의 펩타이드에 대한 p-RNA의 접합

요오도아세틸화 p-RNA(M_w= 2434.50g/mol)을 완충제 시스템(114nmol당 1000㎕)에 용해시킨 다음 완충제(CYSKVG 펩타이드 2mol; M_w= 655.773g/mol; 완충액 20㎕ 중의 228mol) 중의 상기 펩타이드 용액으로 처리한다.

완충제 시스템: 보락스/HCl 완충제(Riedel-de Haen 공급), pH 8.0을 1:1의 비율로 수중 EDTA 이나트륨 염의 10mmol 용액과 혼합하고, HCl를 사용하여 pH 6.3으로 조정한다. 이러한 방법으로 5mM Na₂EDTA를 함유한 용액을 수득한다.

전환이 완료될 때까지 상기 배치를 암실에서 실온하에 방치시킨다. 이 반응을 HPLC 분석을 이용하여 모니터한다.

표준 조건은 다음과 같다:

완충제 A: 수중의 0.1mol 트리에틸암모늄 아세테이트 완충제

구배: 40분 동안 10% B로부터 출발하여 50% B

칼럼 물질: 머크 다름슈타트 게엠베하로부터의 10μM 리크로스피어100 RP-18; 250 x 4mm

출발 물질의 보유 시간: 17.6분

생성물의 보유 시간: 15.5분

반응을 완료한 후, 상기 배치를 RP-HPLC(표준 조건은 상기 참조)를 통하여 직접적으로 정제한다.

상기 분획을 찬 암실에서 농축시키고, 합한 다음 재농축시킨다. 이 잔사를 물에 흡수시키고 탈염시킨다. 워터스 셉-팩 카트릿지 RP-18(팩킹 15 OD 2g으로부터)을 아세토니트릴 2 x 10ml 및 물 2 x 10ml로 활성화시키고, 올리고를 적용하며, 이 안에 담그고 반응 용기를 물 2 x 10ml로 세척하고, 물 3 x 10ml로 재세척하여 염을 제거하며, 물:아세토니트릴 1:1로 용출시킨다. 생성물 분획을 농축시키고, 합한 다음 다시 농축시킨다.

260nm에서 UV 흡광 분광법을 이용하여 수율을 측정한다. 이는 이론치의 70 내지 95%에 달한다:

질량 분광측정법:

서열: 4' AGGCAInd(CH₂CH₂NHCOCH₂-CYSKVG)T 2'

계산된 질량: 2962.36g/mol

실제 질량 MH₂ ²⁺: 1482.0g/mol = 2962g/mol

실시예 12

펩타이드 라이브러리에 대한 p-RNA의 접합

요오도아세틸화 p-RNA(M_w= 2434.50g/mol)을 완충제 시스템(832nmol당 1300㎕)에 용해시킨 다음 완충제(8mol; 평균 분자량 M_m= 677.82g/mol; 완충액 200㎕ 중의 4.5mg=6.66μmol) 중의 상기 펩타이드 라이브러리(CKR-XX-OH; X=Arg, Asn, Glu, His, Leu, Lys, Phe, Ser, Trp, Tyr) 용액으로 처리한다.

완충제 시스템: 보락스/HCl 완충제(Riedel-de Haen 공급), pH 8.0을 1:1의 비율로 수중 EDTA 이나트륨 염의 10mmol 용액과 혼합하고, HCl를 사용하여 pH 6.6으로 조정한다. 이러한 방법으로 5mM Na₂EDTA를 함유한 용액을 수득한다.

전환이 완료될 때까지 상기 배치를 암실에서 실온하에 방치시킨다. 이 반응을 HPLC 분석을 이용하여 모니터한다. 이러한 경우, 출발 물질은 70시간 후에 사라진다.

분석용 HPLC의 표준 조건은 다음과 같다:

완충제 A: 수중의 0.1mol 트리에틸암모늄 아세테이트 완충제

구배: 40분 동안 10% B로부터 출발하여 50% B

출발 물질의 보유 시간: 18.8분

생성물의 보유 시간: 13.9-36.2분으로부터 몇몇 피크가 나타남

반응을 완료한 후, 상기 배치를 물을 이용하여 4배 용적으로 희석시킨다. 워터스 셉-팩 카트릿지 RP-18(팩킹 15 OD 2g으로부터)을 아세토니트릴 3 x 10ml 및 물 3 x 10ml로 활성화시키고, 올리고를 적용하며, 이 안에 담그고 반응 용기를 물 2 x 10ml로 재세척하고, 카트릿지를 물 3 x 10ml로 재세척하여 염과 과량의 펩타이드를 제거하며, 더 이상의 생성물이 UV 분광측정법에 의해 용출되지 않을 때까지 물:아세토니트릴 1:1로 용출시킨다. 상기 분획을 찬 암실에서 농축시키고, 합한 다음 다시 농축시킨다.

Claims

전자 부품, 특히 진단제 형태의 전자 부품을 제조하기 위한, 펜토피라노실뉴클레오타이드 또는 펜토피라노실핵산과 생체 분자를 포함하는, 바람직하게는 접합체 형태의 펜토피라노실뉴클레오사이드 또는 펜토피라노실핵산의 용도.
제1항에 있어서, 펜토피라노실뉴클레오사이드가 다음 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물임을 특징으로 하는 용도.

화학식 I

화학식 II

상기식에서,

R¹은 H, OH, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), 또는또는 -O-P[N(i-Pr)₂]-(OCH₂CH₂CN)(여기서, i-Pr은 이소프로필이다) 중에서 선택된 라디칼이고,

R², R³및 R⁴는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), NR⁵R⁶, OR⁷, SR⁸, =O, C_nH_2n+1(여기서, n은 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 8, 특히 1 내지 4의 정수이다), β-제거 가능한 그룹, 바람직하게는 화학식 -OCH₂CH₂R¹⁸(여기서, R¹⁸은 시아노 또는 p-니트로페닐 라디칼 또는 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 라디칼이다), 또는 (C_nH_2n)NR¹⁰R¹¹(여기서, R¹⁰R¹¹은 H, C_nH_2n+1또는 다음 화학식 III의 라디칼을 통하여 연결된 R¹⁰R¹¹이다)의 그룹이며,

R⁵, R⁶, R⁷및 R⁸은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, C_nH_2n+1또는 C_nH_2n-1(여기서, n은 앞서 정의한 바와 같다), -C(O)R⁹(여기서, R⁹는 직쇄 또는 측쇄의 치환되거나 비치환된 알킬 또는 아릴 라디칼, 바람직하게는 페닐 라디칼이다)이고,

X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 =N-, =C(R¹⁶)- 또는 -N(R¹⁷)-(여기서, R¹⁶및 R¹⁷은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, 또는 앞서 정의된 바와 같은 C_nH_2n+1또는 (C_nH_2n)NR¹⁰R¹¹이다)이며,

S_c1및 S_c2는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, 또는 아실, 트리틸 또는 알릴옥시카보닐 그룹 중에서 선택된 보호 그룹, 바람직하게는 벤조일 또는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 그룹이고,

R^1'은 H, OH, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), 또는또는 -O-P[N(i-Pr)₂]-(OCH₂CH₂CN)(여기서, i-Pr은 이소프로필이다) 중에서 선택된 라디칼이며,

R^2', R^3'및 R^4'는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), =O, C_nH_2n+1또는 C_nH_2n-1, β-제거 가능한 그룹, 바람직하게는 화학식 -OCH₂CH₂R¹⁸(여기서, R¹⁸은 시아노 또는 p-니트로페닐 라디칼 또는 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 라디칼이다) 또는 (C_nH_2n)NR^10'R^11'(여기서, R^10', R^11'은 서로 독립적으로 상기 언급된 R¹⁰또는 R¹¹의 의미를 갖는다)의 그룹이며,

X', Y' 및 Z'는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 =N-, =C(R^16')- 또는 -N(R^17')-(여기서, R^16'및 R^17'은 서로 독립적으로 앞서 정의된 R¹⁶또는 R¹⁷의 의미를 갖는다)이고,

S_c1'및 S_c2'는 앞서 정의된 바와 같은 S_c1및 S_c2의 의미를 갖는다:

화학식 3

[여기에서, R¹², R¹³, R¹⁴및 R¹⁵는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하게 각각 H, OR⁷(여기서, R⁷은 앞서 정의한 바와 같다) 또는 C_nH_2n+1또는 C_nH_2n-1(여기서, n은 앞서 정의된 바와 같다)이다].
제1항 또는 제2항에 있어서, 펜토피라노실뉴클레오사이드가 리보-, 아라비노-, 릭소- 및/또는 크실로피라노실뉴클레오사이드, 바람직하게는 리보피라노실뉴클레오사이드임을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 펜토피라노실 잔기가 D 또는 L 배위 형태임을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 이용된 펜토피라노실뉴클레오사이드가 펜토피라노실 퓨린, -2,6-디아미노퓨린, -6-퓨린티올, -피리딘, -피리미딘, -아데노신, -구아노신, -이소구아노신, -6-티오구아노신, -크산틴, -하이포크산틴, -티미딘, -시토신, -이소시토신, -인돌, -트립타민, -N-프탈로일트립타민, -우라실, -카페인, -테오브롬, -테오필린, -벤조트리아졸 또는 -아크리딘임을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, R², R³, R⁴, R^2', R^3'및/또는 R^4'가 2-프탈이미도에틸 또는 알릴옥시 라디칼, 또는 화학식 -N[C(O)R⁹]₂의 라디칼임을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 펜토피라노실뉴클레오사이드가 [2',4'-디-O-벤조일)-β-리보피라노실]뉴클레오사이드, 특히 [2',4'-디-O-벤조일)-β-리보피라노실]-아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘, -우라실, -크산틴 또는 -하이포크산틴, N-벤조일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 -아데닌, -구아닌 또는 -시토신, 및 N-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 -아데닌, -구아닌 또는 -시토신, O⁶-(2-시아노에틸)-N²-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 -구아닌, O⁶-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 -구아닌, β-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 β-리보피라노실아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘 또는 -우라실, -크산틴 또는 하이포크산틴, N-벤조일-, N-이소부티로일-, O⁶-(2-시아노에틸)- 또는 O⁶-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-β-리보피라노실뉴클레오사이드, 4'-DMT-펜토피라노실뉴클레오사이드, 바람직하게는 4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘, -우라실, -크산틴 또는 -하이포크산틴, N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌 또는 -시토신, N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌 또는 -시토신, O⁶-(2-시아노에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 O⁶-(2-시아노에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌, O⁶-(2-(-4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오사이드, 특히 O⁶-(2-(-4-니트로페닐)에틸)-N²-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌, 또는 β-리보피라노실-N,N'-디벤조일아데노신 또는 β-리보피라노실-N,N'-디벤조일구아노신임을 특징으로 하는 용도.
펜토피라노실뉴클레오타이드 또는 펜토피라노실핵산과 생체 분자를 포함하는 바람직하게는 접합체 형태의 펜토피라노실뉴클레오사이드 또는 펜토피라노실핵산을 포함하는 전자 부품, 특히 진단제 형태의 전자 부품.
펜토피라노실뉴클레오사이드 또는 펜토피라노실핵산과 생체 분자를 포함하는 접합체.
제9항에 있어서, 생체 분자가 펩타이드, 단백질 또는 핵산임을 특징으로 하는 접합체.
제9항 또는 제10항에 있어서, 생체 분자가 항체 또는 이의 작용성 잔기, 또는 천연 형태의 DNA 및/또는 RNA임을 특징으로 하는 접합체.
펜토피라노실뉴클레오사이드 또는 펜토피라노실핵산을 생체 분자와 조합함을 특징으로 하는, 접합체의 제조 방법.