KR20010005623A - 신경재생 자극방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경재생 자극에 사용되는 방법에 관한 것으로, 말초신경 및 중추신경계, 특히 척수의 신경에 적용될 수 있다. 본 발명은 특히, 뉴로트로픽 인자 발현 시스템이 삽입되는 생물적합성 슬리브를 포함하는 시스템을 사용한다.

Description

신경재생 자극방법{PROCESS FOR STIMULATING NEURAL REGENERATION}

신경계, 즉 중추신경계(CNS) 및 말초신경계(PNS) 모두의 병변은 외상적으로 빈번하며 심각하다. 따라서, 수질병변(외상성이든 퇴행성이든), 말초신경 병변, 또는 상완 신경총 또는 요 신경총 병변은 지금까지는 손상되거나 병을 앓고있는 개체를 일생동안 심각하게 신체장애로 남게 한다. 비록 PNS는 높은 자발적 재생능을 지니지만, 통상적인 신경수선술을 이용해서는 실망스러운 결과만 부여될 뿐이다. 이러한 기술은 두 신경말단의 봉합(물질손실, 또는 신경절의 절제를 요하는 신경의 과도한 열상의 경우)을 허용하기에 텐션이 지나치게 높을 때 자가 또는 타가 신경 이식의 맞춤 또는 직접적인 문합(吻合)으로 주로 이루어진다. 이러한 기술로는, 팔의 중앙 신경 수선 환자의 5% 미만이 5년 후 정상적인 감각 또는 운동기능을 재발견하게 된다(1).

좀더 최근에는, 손상 신경 말단을 연결하는 튜브 보철(커핑기술)의 사용이 이러한 기존의 신경 수선술에 대한 대안을 제공하였다(2, 3). 이러한 기술은 신경다발의 재정렬 조건을 단순화하는 이점을 제공하며, 실험적으로나 임상적으로나 모두 물질의 소량 손실을 성공적으로 브리징하게 하였다(5 내지 7 mm 이하 (1-6)). 그러나, 좀더 큰 크기의 물질의 손실을 브리징하기 위해서는, 뉴로트로픽 물질 또는 세포를 튜브 안쪽에 첨가하는 것이 필수적이다. 실험적으로는, 스텐트에서 생체내 적용으로서 FGF-1 및 -2, 또는 NGF(7-10), 또는 전신성 적용에 CNTF 또는 IGF II와 같은 몇몇 인자가 시험되었으나, 결과적으로 신경재생에서의 이들의 역할이 명백히 증명되지는 않았다(7-12). 더욱이, 척수 병변의 경우 현재로서는 어떠한 임상적 치료법도 존재하지 않고 있다.

본 발명은 신경계의 생물학 분야, 특히 의학 생물학 분야에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 말초신경과 중추신경계, 특히 척수 모두에 적용될 수 있는 신경재생 자극법에 관한 것이다. 이들의 국소적이고 특이적인 특성으로 해서, 본 발명의 방법은 각종 병리학적 상황, 및 특히 척수 병변의 경우에 있어서 말초신경, 또는 상완 신경총 또는 요 신경총의 신경재생의 자극에 사용될 수 있다.

도 1: 본 발명에 따른 장치의 말초신경상 설치도.

도 2: 척수의 천요추부의 수준에서 찍은 β-갈락토시다제 (X-Gal 기질과 함께 방출됨)의 척수 운동뉴런 내부에서의 높은 생성을 나타내는 현미경 사진.

도 3: D12에서의 조직 재생의 육안적 외관. (A) 대조군 동물에서 관찰된 예. 어떠한 조직 연속성도 신경 수선의 근위말단 및 원위말단 사이에서 관찰되지 않는다. (B) 10⁷pfu Ad-NT3를 주사한 동물 중의 스텐트 내용물의 외관. 신경 수선의 근위말단 및 원위말단을 결합시키는 조직 연결의 존재를 알아냄이 가능하다.

도 4: D12에서 관찰된 HRP로의 역행 염색의 외관. (A) 대조군 그룹에서, 약간의 드물고 약하게 표지된 운동뉴런이 관찰된다. (B) 10⁷pfu Ad-NT3로 처리된 그룹에서, 대다수의 강하게 표지된 척수 뉴런이 존재한다.

도 5: 병변 위의 건강한 골수의 수준에서 병변 아래의 말초 구심성 신경의 브리징을 본 발명에 따라 적소에 배치하는 도.

도 6: 본 발명에 따른 장치를 척수에서 적소에 배치하는 도.

도 7: 신경에서 작동시키고 본 발명에 따른 장치를 설치한 후 시간의 함수로서 관찰된 운동 반응의 도.

1. 방법

1-1. 아데노바이러스 벡터:

상기에 표시된 바와 같이, 바이러스 벡터, 특히 아데노바이러스는 본 발명의 특히 바람직한 양태를 구성한다.

사용된 재조합 아데노바이러스는 선행 기술에 기재된 기술에 따라 상동성 재조합에 의해 수득된다. 간단히 말해서, 이들은 선형 바이러스 게놈 단편 (d1324) 및 좌측 ITR, 캡시드화 서열, 트랜스진 및 이의 프로모터와 재조합을 허용하는 바이러스 서열을 함유하는 플라스미드 사이의 재조합에 의해서 세포 293에서 작제된다. 이들은 실험실의 P3에서 규칙적으로 재정제된다. 바이러스 게놈은 또한 출원 WO 96/25506에서 기재된 기술에 따라 원핵 세포에서 제조될 수 있다. 더욱 상세하게는 하기의 바이러스가 사용된다:

- AD-βGal: (i) 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터 (RSV-LTR 또는 RSV로 표시)의 조절 하에 이.콜라이 β-갈락토시다제를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 카세트로 도입되는 수준에서 E1 영역의 결실 및 (ii) E3 영역의 결실을 포함하는 Ad5 혈청형으로부터 도입된 결손 재조합 아데노바이러스. 이러한 아데노바이러스의 작제가 문헌 [참조: J. Clin. Invest. 90 (1992) 626]에 기재되어 있다.

- Ad-NT3: 게놈 중으로 결실된 E1 영역 대신에 삽입되어 전사 프로모터 (특히 RSV LTR)의 조절 하에 NT3를 암호화하는 cDNA로 이루어진 NT3 발현 카세트를 포함하는 Ad5 혈청형의 재조합 아데노바이러스. 다른 작제는 출원 WO 96/22378에 기재된 바와 같이 E4 영역에 추가의 결실을 포함한다.

- Ad-CNTF: 게놈 중으로 결실된 E1 영역 대신에 삽입되어 전사 프로모터 (특히 RSV LTR)의 조절 하에 CNTF를 암호화하는 cDNA로 이루어진 CNTF 발현 카세트를 포함하는 Ad5 혈청형의 재조합 아데노바이러스. 작제에 대한 상세한 설명이 출원 WO 94/08026에 기재되어 있다. 다른 작제는 출원 WO 96/22378에 기재된 바와 같이 E4 영역에 추가의 결실을 포함한다.

- Ad-GDNF: 게놈 중으로 결실된 E1 영역 대신에 삽입되어 전사 프로모터 (특히 RSV LTR)의 조절 하에 GDNF를 암호화하는 cDNA로 이루어진 GDNF 발현 카세트를 포함하는 Ad5 혈청형의 재조합 아데노바이러스. 작제에 대한 상세한 설명이 출원 WO 95/26408에 기재되어 있다. 다른 작제는 출원 WO 96/22378에 기재된 바와 같이 E4 영역에 추가의 결실을 포함한다.

- Ad-BDNF: 게놈 중으로 결실된 E1 영역 대신에 삽입되어 전사 프로모터 (특히 RSV LTR)의 조절 하에 BDNF를 암호화하는 cDNA로 이루어진 BDNF 발현 카세트를 포함하는 Ad5 혈청형의 재조합 아데노바이러스. 작제에 대한 상세한 설명이 출원 WO 95/25804에 기재되어 있다. 다른 작제는 출원 WO 96/22378에 기재된 바와 같이 E4 영역에 추가의 결실을 포함한다.

- Ad-FGFα: 게놈 중으로 결실된 E1 영역 대신에 삽입되어 전사 프로모터 (특히 RSV LTR)의 조절 하에 FGFα를 암호화하는 cDNA로 이루어진 FGFα 발현 카세트를 포함하는 Ad5 혈청형의 재조합 아데노바이러스. 작제에 대한 상세한 설명이 출원 WO 95/25803에 기재되어 있다. 다른 작제는 출원 WO 96/22378에 기재된 바와 같이 E4 영역에 추가의 결실을 포함한다.

작제된 바이러스의 기능성을 배양물 중의 섬유아세포를 감염시킴으로써 조사한다. 상응하는 뉴로트로픽 인자의 존재를 ELISA에 의해서 및/또는 이러한 신경 1차 배양물의 트로픽성을 시험함으로써 배양물에서 분석한다.

아데노바이러스로부터 유도된 기타 작제물, 특히 추가의 결실 및/또는 상이한 프로모터를 운반하고/하거나 기타 뉴로트로픽 인자를 암호화하는 벡터도 본 발명의 구조내에서 제조되고 사용될 수 있음이 이해된다.

1-2. 외과적 프로토콜

동물은 체중이 320 내지 340 g인 Sprague-Dawley 래트 수컷으로 이루어진다 (Iffa Credo - Les Oncins - France). 전신마취 (펜토바비톨 1 ml/kg의 복강내 주사 - Sanofi Sante Animale) 하에서, 우측 뒷다리를 허벅지 수준에서 절개하고, 근육 면을 우측 좌골 신경을 방출하기 위해서 분리한다. 신경을 슬와 공간과 좌골 신경 분리사이 중간을 절개하고 5 mm 단편을 제거한다 (도 1B). 튜브형 실리콘 보철(길이 14 mm, 직경 1.47 mm, 벽 두께: 0.23 mm - Silastic, Dow Corning Corporation, USA)이 제시된다. 신경의 근위말단을 튜브로 도입하고 척수와 신경을 연결하는 나일론 9/0 봉합의 보조로 적소에 유지한다. 원위부 수준에서 튜브와 신경 사이 제 2 봉합을 10 mm (자발적 말초신경 재생이 사용된 실험 조건 하에서 래트에서 관찰될 수 있음)의 물질의 손실을 달성하기 위해서 적소에 배치한다 (도 1C). 이어서 근위부 수준에서 조립의 누출방지성을 스텐트로 도입하기 전에, 신경 근위말단과 접촉하여 피브린 아교(Tissucol, Immuno AG, Vienna, Austria), 바이러스 용액 10 μl, 또는 대조군 동물에 대한 등장성 식염수 용액의 보조로 마이크로시린지의 보조로 수득한다 (도 1D). 스텐트의 사(死) 용적을 신경 원위 말단이 도입되기 전 등장성 식염수 용액 (0.9 % 나트륨 클로라이드 용액)으로 차례대로 튜브 보철에 채우고 이러한 말단의 누출밀봉을 피브린 아교에 의해서 확실히 한다 (도 1E). 근육 및 피부 면을 각각 표준 6/0 및 4/0 나일론 봉합으로 폐쇄한다. 동물을 개별 우리에 넣고, 12 시간/12 시간 밤/낮 사이클로 유지한다.

1-3. 축색 재증식의 조절 및 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)에 의한 척수 운동뉴런의 역행 염색

12 일 후, 및 동물을 전신마취 하에 둔 후, 조립물을 재노출하여 주변 부착성 물질로부터 절개한다. 조립물을 최초 신경 섹션의 근위말단의 3 mm 아래에서 절개하기 전 조직 연속성의 존재가 관찰된다. 이렇게 하여 수득된 "스텀프 (stump)"를 30 % (w/v) HRP 용액 (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)으로 충진시키기 전 등장성 식염수 용액으로 세정한다. 1 시간 동안 배양 후, 이 용액을 제거하고 신경 근육 및 피부 면을 봉합하고 동물을 우리에 다시 넣기 전에 신경 말단을 등장성 식염수 용액으로 세정한다. 48 시간 후, 동물을 재마취시키고, PBS로 세정한 후 3.6 % 글루타르알데히드의 심장내 주입에 의해서 고정시킨다. 이어서 척수를 절개하고, 3.6 % 글루타르알데히드에서 3 시간 동안 후-고정시키며, 48 시간 내지 72 시간 동안 30 % (w/v) 수크로스에 넣는다. 골수의 요천부를 35 μm 두께의 종절편 시리즈로 절단하여 냉동하며 Mesulam (15)에 의해 기재된 통상의 기술에 따라 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 사용하여 HRP의 존재가 드러난다.

1-4. β-갈락토시다제의 검출

β-갈락토시다제 활성을 X-Gal 기질을 사용하여 가시화한다 (14). 간단히 말해서, 100 μm 두께의 천요추부 골수 종절편을 칼륨 헥사시아노페레이트 (4 mM), 칼륨 페리시아나이드 (4 mM), X-Gal 기질 (0.4 mg/ml) 및 마그네슘 클로라이드 (4 mM)를 함유하는 PBS에서 37 ℃에서 18 시간 동안 배양한다. 배양 후, 조직 절편을 PBS에서 세정한 다음 수성 매질 (젤라틴-글리세롤)에 고정한다.

2. 축색절개한 척수 운동뉴런에 의한 비반복성 아데노바이러스의 역수송의 증명 및 트랜스진 발현의 입증

이러한 최초의 연구는 축색절개한 뉴런이 아데노바이러스 벡터의 역수송을 수행하고 4 주의 시간에 걸쳐 트랜스진을 발현시킬 수 있음을 설명함을 가능하게 한다. 벡터 (1-1에 기재된 아데노바이러스 β-갈락토시다제)를 튜브당 10⁹의 양으로 주입하고 트랜스진의 발현을 D4, D14 및 4 주에 시험한다.

4 일째에, β-갈락토시다제의 높은 발현이 좌골 신경을 자극하는 근부에 상응하는 척수의 천요추부의 복각에서 관찰된다 (도 2). 척수 운동뉴런에 의한 트랜스진의 이러한 높은 발현은 14 일에 전부 β-갈락토시다제 양성 세포의 평균수 63.2 ± 33.6 세포로 발견되고, 즉 좌골 신경을 자극하는 척수 신경 총 수의 12.25 %에 속하는 감염 효율이다. 척수의 요추 영역에서 β-갈락토시다제 활성의 존재는 표지 강도를 감소시키면서 4 주까지 검출된다 (표 1).

3. 10 mm의 물질 손실을 통한 래트 좌골 신경의 축색 재증식에 대한 뉴트로핀 (NT3) 암호화 벡터의 효과 시험

축색절개 후 신경 재증식을 자극하는 데에 유전자 치료 유형 시스템을 생체내에서 사용할 가능성을 나타내는 결과에 이어서, 말초신경 재생에 대한 뉴트로핀-3 (1-1에 기재된 Ad-NT3) 암호화 트랜스진을 운반하는 아데노바이러스의 효과를 시험한다. 축색절개 및 10⁷pfu의 벡터를 받은 Silastic으로 제조된 가이드 스텐트로의 신경 수선을 수행한 12 일 후 수득된 결과는 조직 연속성이 Ad-NT3로 처리된 동물 그룹에서만 관찰됨을 나타낸다 (도 3, 표 2). 축색을 가이드 스텐트를 통하여 재생한 다수의 척수 운동뉴런의 HRP로의 역행 염색에 의한 분석은 이러한 조직 연속성이 신경 재증식으로 이루어지고 대조군 그룹의 24.25 ± 42.7 HRP-양성 뉴런에 대해 평균 182.3 ± 76.5 HRP-양성 뉴런임을 나타낸다 (도 4, 표 2).

이러한 결과는 뉴로트로픽 인자를 암호화하는 유전자를 운반하는 복제-결손 아데노바이러스 벡터를 사용하는 본 발명에 따른 장치가 중추 및 말초성 모두인 축색 재증식을 촉진하기 위해서 사용될 수 있는 것으로 결론지음을 가능하게 한다.

4. 래트에서 말초신경의 절개 후 기능적 회생의 비교

병변은 적어도 10 mm의 물질 손실을 일으키기 위해서 성체 래트에서 좌골 신경의 수준에서 수행된다. 병변의 근위부 및 원위부를 생리식염수 용액, 또는 AV-RSVβgal (10 μl 중의 10⁷pfu), 또는 AV-RSVNT₃(10 μl 중의 10⁷pfu), 또는 NT3 단백질이 도입되는 본 발명에 따른 장치 (실리콘 튜브, 길이 14 mm, 내경 1.47 mm - Silastic)에 의해서 결합시킨다. 기능적 회생을 근전도법에 의해서 측정한다: 비복근에서의 운동 반응을 2주 마다 기록한다 (도 7).

기능적 회생을 AV-RSVNT₃로 처리한 그룹을 기타 그룹과 비교 관찰한다. 이러한 증가는 112일 후 AV-RSVβgal 그룹 및 70 내지 112 일 후 그룹 rNT3와 시간 경과에 따라 비교하였을 때 통계학적으로 유의하다. 개별 프로필의 근전도 분석은 AV-RSVNT₃로의 처리가 해당 동물에 있어서 신경 재증식을 개시할 가능성을 증가시킴을 나타낸다. 그러나, 재증식이 시작되었을 때 재증식 수준은 변형되지 않는다.

그러므로, 이러한 결과는 본 발명에 기재된 기술에 의해서 뉴로트로픽 인자를 암호화하는 유전자의 전달이 말초신경 절개 후 기능적 회생을 증가시키는 데에 효과적임을 제시한다.

참조문헌

β-갈락토시다제를 암호화하는 아데노바이러스 벡터에 의한 축색절개한 운동뉴런의 감염 효율의 측정

기간	동물	고도로 표지된뉴런의 수	표지된 세포체의 수	표지된 뉴런의 총수
D4	123	103617	125531	229148
D14	123	165924	24486	4010730
4주				발산 표지

D12에 축색 재증식에 대한 Ad-NT3 주사의 효과

그룹	동물	기간	조직 연속성	HRP-양성 뉴런의 수
대조군	T01T02T03T05	D12D12D12D13	+---	9880
Ad-NT3 107pfu	N71N72N73N75	D12D12D12D14	++++++++++++	182106N.D.*259
N.D. 측정되지 않음* 주입 도중 죽은 동물

본 발명은 신경, 외상성 또는 퇴행성 병변의 치료상 이러한 문제점에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명은 사실상, 생물적합성 커프 및 뉴로트로픽 인자를 암호화하는 핵산의 조성물에 의한 신경재생 자극법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 신경증식 자극인자(뉴로트로픽 인자) 발현 시스템이 도입되는 생물적합성 커프를 포함하는 신경재생 자극장치에 관한 것이다. 본 발명의 다른 일면은 한편으로는 생물적합성 커프를 포함하고 다른 한편으로는 신경증식 자극인자 발현 시스템을 포함하는 조성물을 포함하는 신경재생 자극 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 신경재생 자극을 위한 조성물의 제조를 위한, 뉴로트로픽 인자의 발현 시스템이 도입되는 생물적합성 커프의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 말초신경의 재생 및 척수내 축색 재생 자극 모두에 적용될 수 있다.

본 발명은 몇몇 특징으로부터 온다. 특히, 적당한 장치에 의한 신경의 두 섹션 간의 물리적 교량을 외과적으로 설정하고, 뉴로트로픽 인자 발현 시스템을 이러한 장치 중으로 도입시키는 것이 가능하다는 증거로부터 온다. 또한 본 발명은 트로픽 인자의 국소농도를 신경증식을 자극하기에 충분한 지속기간 동안 유도할 수 있다는 증거로부터 온다. 따라서, 본 발명은 치료관점에서 특히 유리한 몇몇 특징을 겸비한다. 본 발명은 무엇보다도, 트로픽 인자의 연장된 방출 효과에 의해 지속적인 작용을 허용한다. 뉴로트로픽 인자의 생물학적 효과는 신경증식을 촉진하고 안내할 수 있도록 하는 커프의 스텐트 효과에 의해 더욱 강화된다. 또한 본 발명의 방법은 매우 국소적이고, 따라서 매우 특이적인 작용을 허용하며, 트로픽 인자는 외상부위 또는 퇴행부위상에서 밀봉장치에 싸이게 된다. 따라서, 실시예에 제시된 결과는 본 발명의 방법이 신경의 신속하고 효과적이며 국소적인 수선을 허용함을 보여준다.

본 발명의 방법은 좀더 구체적으로는, 신경 섹션의 수준에서 국소적으로 작용함에 있다. 절개된 신경 또는 다발의 근위 또는 원위 섹션은 생물적합성 커프의 일단에 도입되며, 여기에서 적소에 물리적으로 유지된다. 이어서, 뉴로트로픽 인자 발현 시스템을 포함하는 조성물이 커프에 도입된다. 절개된 신경 또는 다발의 제 2 섹션이 이어서 커프의 타단에 도입되며, 여기에서 또한 적소에 물리적으로 유지된다. 발현 시스템이 커프 바깥으로 확산되는 것을 피하기 위하여, 말단에서 생물학적 아교로 결찰시키고/시키거나 유지시키는 것이 유리하다. 이러한 장치는 또한 발현 시스템의 새로운 주입을 허용할 수 있다. 지지체 및 뉴로트로픽 인자 양자가 고농도로 장기간 존재함으로써 실시예에 설명된 바와 같이, 신경 연속성을 재구성하고, 따라서 상응하는 활성을 회복할 수 있게 된다.

말초신경계에 좀더 특이적인 방식으로, 본 발명의 방법은 병변 밑에 있는 말초신경 또는 근부를 취하고 신경 또는 근부의 절개후 생물적합성 커프를 설치하는 것으로 이루어진다. 섹션의 근위부(운동기능을 갖든 감각성이든)는 예를 들면, 봉합 또는 생물학적 아교의 도입에 의해, 커프에 도입되어 적소에 유지된다. 활성인자를 암호화하는 발현 시스템이 이러한 커프 중으로 주입되어 적소에 놓이게 된다. 이어서, 섹션의 원위부는 커프의 타단에 재연결되어, 축색 연속성의 회복이 허용된다(도 1).

중추, 특히 수질 신경계 수준에서, 본 발명의 방법은 또한 척수내 병변을 브리징하는 데 특히 적합하다. 더욱이 이러한 형태의 외상은 본 발명 시스템의 주된 적용 중 하나를 구성하며, 이에 대해 현재까지는 어떠한 임상적 치료법도 존재하지 않는다. 두 가지 유형의 적용이 구상될 수 있다: 병변 밑에 있는 말초 구심성 신경을 이러한 병변 밑에 있는 건강한 골수와 연결하거나(도 5), 병변 밑에 있는 건강한 골수를 이러한 병변 밑에 있는 골수와 연결하는 것(도 6).

첫 번째의 경우, 수질병변(도 5a) 밑에 있는 하나 이상의 근부를 절개하여 튜브 보철(커프) 중으로 도입시킨 다음 봉합 또는 생물학적 아교의 도움으로 적소에 유지시킨다. 이어서, 스텐트는 운동뉴런의 축색 신장을 자극할 수 있는 유전자를 운반하는 발현 시스템; 및/또는 임의로는 말초신경 이식과 같은 축색 재증식을 자극하는 것으로 알려진 각종 인자, 또는 세포를 수용할 수 있다. 이어서, 스텐트를 병변 밑에 있는 건강한 골수에서 행한 세로 절개부에 도입시킴으로써 튜브의 근위 말단이 회백질(척추 운동뉴런이 위치하는 부위)의 전각을 건드리게 된다. 스텐트는 하나 이상의 봉합으로 아라크노이드 및 생물학적 아교에 부착된다(도 5b). 이러한 조립은 따라서 기능성을 특정의 주 근육으로 되돌린다.

두 번째의 경우, 골수의 손상부를 절개하여 스텐트를 상류와 하류에 이식하여 손상부 상하 부위간의 주 다발(추체, 피질척수 등)을 연결시킨다(도 6). 이어서, 스텐트를 상기와 같이 동일 물질로 충진한다.

본 발명의 구조내에서, 섹션의 근위부 또는 신경의 근위부는 중추신경계와 접촉상태에 있는 신경부분을 의미한다. 말초신경의 경우, 이의 근위부는 척수에 연결되는 것이다. 척수 병변의 경우, 근위부는 중추신경계와 접촉상태에 있는 것이다.

섹션의 원위부 또는 신경의 원위부는 또한, 신경의 말초부를 의미한다. 말초신경의 경우, 이의 원위부는 따라서 운동종판(신경근 연접부)에 연결되는 것이다. 척수 병변의 경우, 원위부는 중추신경계와 분리되는 것이다.

본 발명을 수행하기 위해, 커프는 치료 용도에 적합한 임의 장치로 구성될 수 있다. 커프의 구조와 조성은 (i) 축색 연속성을 회복시키고, (ii) 활성인자 발현 시스템을 포함하는 조성물을 함유할 수 있으며, (iii) 척수에서 말초쪽으로, 말초에서 척수쪽으로, 및 척수에서 척수쪽으로 축색 재증식용 스텐트로서 작용할 수 있도록 유리하게 정의된다. 커프의 스텐트 특성은 그 자체로 신경의 부착능 및 그 위에서의 성장능, 특히 내면에서의 성장능을 통해 발휘한다. 부착성은 부착을 유발하는 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리적 상호작용의 임의 형태 및/또는 세포의 커프상 부착으로부터 생길 수 있다. 더욱이, 사람의 치료에 적용하는 경우, 커프는 불투과성 또는 반투과성 형태이되, 발현 시스템의 통과를 허용하지 않는 것이 또한 바람직하다.

유리하게는, 커프는 고체상의 무독성 및 생물적합성 지지체이다. 특히, 실리콘, PAN/PVC, PVFD, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 섬유 또는 아크릴 공중합체와 같은 합성재료로 이루어진 커프일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 특히 가교결합된 콜라겐, 뼈 분말, 탄수화물 기초 중합체, 폴리글리콜산/폴리락트산 유도체, 히알루론산 에스테르, 또는 초크 기초 지지체와 같은 생물학적 물질로 이루어지거나 이를 기본으로 한 커프의 사용이 바람직하다. 바람직하게는, 콜라겐 또는 실리콘이 본 발명의 구조내에서 사용된다. 인간, 소 또는 쥐 기원의 콜라겐일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 유형 I 또는 III 또는 IV, 유리하게는 IV/IVox, 콜라겐으로, 또는 실리콘 이중층으로 이루어진 커프가 사용된다. 특정 예를 들면, 실리콘으로 이루어진 실라스틱 커프(Dow-Corning)를 들 수 있다. 더욱이, 커프는 유리하게는 원통형 또는 각진 섹션의 튜브 형상을 취한다. 커프의 직경은 원하는 적용에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 특히, 말초신경의 재생을 자극하기 위해서는, 0.05 내지 15 mm의 비교적 소직경이 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 커프의 내경은 0.5 내지 10 mm이다. 척수 재생 적용의 경우, 대직경 커프가 선택될 수 있다. 특히, 이러한 적용의 경우, 사용된 커프는 해당 신경 섹션에 따라, 높이가 15 내지 20 mm일 수 있는 내경을 갖는다. 상완 신경총의 수준에서 벗겨낸 근부를 브리징하는 경우, 커프의 직경은 유리하게는 근부 직경에 상응한다. 커프의 길이는 일반적으로 보상하고자 하는 물질의 손실 부위에 의해 결정된다. 길이가 0.5 내지 5cm인 커프가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 커프의 길이는 5cm 미만인 채로 잔류하며, 5cm 이상의 물질 손실이 덜 빈번하게 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 첫 번째의 경우, 신경의 제 1 부분을 커프에 도입시킴에 있다. 이는 유리하게는 신경의 근위부이다. 이어서 이를 적소에 유지시켜 (i) 양호한 신경 증식 및 (ii) 장치의 누출방지성을 보장한다. 이를 수행하기 위해서는, 신경과 커프간의 봉합을 수행하고/하거나 생물학적 아교를 도입시킬 수 있다. 봉합은 적당한 실을 사용하여 통상적인 수술법에 따라 수행될 수 있다. 생물학적 아교는 신경계에 적용될 수 있는 임의의 생물적합성 아교일 수 있다. 이는 특히, 사람의 수술에 사용되는 임의의 생물적합성 아교, 특히 피브린으로 이루어진 아교: Biocolle(Biotransfusion, CRTS, Lille), Tissucol(Immuno AG, Vienna, Austria) 등일 수 있다.

본 발명의 방법은 전술한 바와 같이, 뉴로트로픽 인자 발현 시스템을 포함하는 조성물의 커프 중으로의 도입을 포함한다.

본 발명의 목적상, "발현 시스템"이란 용어는 뉴로트로픽 인자를 암호화하는 핵산의 생체내 발현을 허용하는 작제물을 의미한다. 유리하게는, 발현 시스템은 전사 프로모터의 조절하에 뉴로트로픽 인자를 암호화하는 핵산(발현 카세트)을 포함한다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA의 경우, cDNA, gDNA 또는 하이브리드 DNA, 즉 gDNA의 하나 이상의 인트론을 함유하는 DNA가 사용될 수 있으며 이에 한정되지는 않는다. DNA는 또한 합성 또는 반합성, 특히 코돈의 최적화 또는 감소된 형태 생성을 위해 인공합성된 DNA일 수 있다.

전사 프로모터는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포, 특히 신경세포에서 기능을 띠는 여타 프로모터일 수 있다. 프로모터는 해당세포나 유기체에서 기능을 발휘할 수 있을 때 고려되는 뉴로트로픽 인자의 발현에 본연히 관여하는 프로모터 영역일 수 있다. 이는 상이한 기원 영역(기타 단백질의 발현 담당, 또는 심지어 합성)을 나타낼 수도 있다. 특히, 이는 진핵생물 또는 바이러스 유전자의 프로모터 영역을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 이는 표적 세포의 게놈에서 유도된 프로모터 영역일 수 있다. 진핵생물 프로모터 중, 유전자의 전사를 특이적으로 또는 비특이적으로, 유도적으로 또는 비유도적으로, 강하게 또는 약하게 자극하거나 억제하는 프로모터 또는 유도 서열이 사용될 수 있다. 이들은 특히 편재성 프로모터(HPRT, PGK, α-액틴 또는 튜불린 유전자 등의 프로모터), 중간체 필라멘트의 프로모터(GFAP, 데스민, 비멘틴, 신경필라멘트 또는 케라틴 유전자 등의 프로모터), 치료 유전자의 프로모터(예를 들면, MDR, CFTR, 인자 VIII 또는 ApoAI 유전자 등의 프로모터) 또는 자극에 반응하는 프로모터(스테로이드 호르몬 수용체, 레티논산 수용체 등)일 수 있다. 또한, 이들은 바이러스 게놈에서 유도된 프로모터 서열, 예를 들면 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터, 또는 RSV LTR 프로모터 등일 수 있다. 추가로, 이들 프로모터 영역은 활성화 또는 조절 서열 또는 조직 특이적 또는 주된 발현을 허용하는 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다.

구성적 진핵 생물 또는 바이러스 프로모터가 본 발명의 구조내에서 유리하게 사용된다. 이는 좀더 상세하게는 HPRT, PGK, α-액틴 또는 튜불린 유전자의 프로모터 또는 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터, 또는 RSV LTR 프로모터 중에서 선택된 프로모터이다.

추가로, 발현 카세트는 유리하게는 표적 세포의 분비 경로에서 합성된 산물을 지령하는 시그널 서열을 포함한다. 이 시그널 서열은 합성된 산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 기타 기능성 시그널 서열, 또는 인공 시그널 서열일 수도 있다.

결국, 발현 카세트는 일반적으로 전사 종결 시그널 및 폴리아데닐화 부위를 규정하는 3'에 위치된 영역을 포함한다.

본 발명의 구조내에서 사용될 수 있는 트로픽 인자는 본질적으로 뉴로트로핀 부류, 뉴로카인 부류, 베타-TGF 부류, 섬유아세포 생장 인자(FGF) 및 인슐린형 생장 인자(IGF) 부류로 분류된다[16참조].

좀더 바람직하게는, 뉴로트로핀 부류에서, BDNF, NT-3 또는 NT-4/5의 사용이 본 발명의 구조내에서 바람직하다.

Thoenen[17]이 기술한 뇌-유도된 뉴로트로픽 인자(BDNF)는 118 아미노산의 단백질이고 13.5 kD의 분자량을 가진다. 시험관내에서, BDNF는 신경돌기 형성 및 배양에서, 망막의 갱글리오닉 뉴런, 중격의 콜린작동성 뉴런 및 중뇌의 도파민작동성 뉴런의 생존을 자극한다[18참조]. 인간 BDNF 및 래트 BDNF를 암호화하는 DNA 서열[19], 특히 돼지 BDNF를 암호화하는 서열[20]이 클로닝 및 서열분석되었다. 이의 성질이 잠재적으로 유리하지만, BDNF의 치료적 용도는 각종 장애물을 맞고있다. 특히 BDNF의 생물학적 이용 효능의 결여는 치료적 사용을 제한한다. 본 발명의 구조내에서 생성된 뇌-유도된 뉴로트로픽 인자(BDNF)는 인간 BDNF 또는 동물 BDNF일 수 있다.

뉴로트로핀-3(NT3)은 시험관내에서 심지어 매우 낮은 농도에서 뉴런을 생존시키는 119 aa의 분비 단백질이다[21]. 인간 NT3를 암호화하는 cDNA 서열에 관해 기술되어있다[22].

TGF-B 부류는 특히 교질 세포에서 유도된 뉴로트로픽 인자를 포함한다. 교질 세포에서 유도된 뉴로트로픽 인자, 즉 GDNF[23]는 134 아미노산의 단백질이고 16 kD의 분자량을 가진다. 이는 시험관내에서, 도파민작동성 뉴런과 운동뉴런의 생존을 촉진하는 본질적인 능력을 가진다[16]. 본 발명의 구조내에서 생성된 교질 세포-유도된 뉴로트로픽 인자(GDNF)는 인간 GDNF 또는 동물 GDNF일 수 있다. 인간 GDNF 및 래트 GDNF를 암호화하는 cDNA 서열이 클로닝 및 서열분석되었다[23].

본 발명의 구조내에서 사용될 수 있는 또다른 뉴로트로픽 인자는 특히 DNTF("섬모 뉴로트로픽 인자")이다. CNTF는 뉴런의 사멸을 예방할 수 있는 뉴로카인이다. 앞서 지적했듯이, 임상 시험은 결과 부족으로 인해 아직 시행되고 있지않다. 본 발명은 현재 CNTF 단독, 또는 기타 트로픽 인자와의 배합물 형태로의 생체내 생성을 장기간 및 연속적으로 허용한다. 인간 및 쥐 CNTF의 cDNA 및 유전자가 클로닝 및 서열분석되었다(EP 385 060; WO 91/04316).

본 발명의 구조내에 사용될 수 있는 기타 뉴로트로픽 인자는 예를 들면 IGF-1(Lewis et al., 1993) 및 섬유아세포 생장 인자(FGFα, FGFβ)이다. 특히, IGF-I 및 FGFα가 매우 유용한 후보자이다. FGFα 유전자의 서열, 및 생체내에서 이를 발현시키는 벡터에 관해 문헌에 기재되어있다(WO 95/25803).

바람직하게는, 본 발명의 발현 시스템은 뉴로트로핀, 뉴로카인 및 TGF 중에서 선택된 뉴로트로픽 인자의 생체내 생성을 허용한다. 이는 좀더 바람직하게는 BDNF, GDNF, CNTF, NT3, FGFα 및 IGF-I 중에서 선택된 인자이다. NT3의 생성이 가장 특별한 관심을 끈다.

또한, 본 발명의 일 변형에 따르면, 2 뉴로트로픽 인자의 생성을 허용하는 발현 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 양태에서, 발현 시스템은 두 발현 카세트, 또는 두 핵산(비시스트론 단위)의 동시 발현을 허용하는 단일 카세트를 포함한다. 시스템이 두개의 발현 카세트를 포함하면, 이들은 동일하거나 상이한 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 발현 시스템에서, 발현 카세트(들)는 유리하게는 벡터의 일부분이다. 이는 특히 바이러스 또는 플라스미드 벡터일 수 있다. 다수의 발현 카세트를 포함하는 발현 시스템의 경우, 카세트는 개별 벡터, 또는 동일 벡터에 의해 운반될 수 있다.

사용된 벡터는 본 발명에 따른 발현 카세트(들) 이외에, 복제 기원 및 마커 유전자를 함유하는 표준 플라스미드 벡터일 수 있다. 마커 유전자 및 복제 기원이 없거나(WO 96/26270) 예를 들어, 조건부 복제 기원을 보유하는(PCT/FR96/01414) 각종 유형의 개선된 벡터에 관해서도 기재되어있다. 이들 벡터는 본 발명의 구조내에서 유리하게 사용될 수 있다.

사용된 벡터는 바이러스 벡터일 수도 있다. 각종 벡터는 주목할만한 유전자 전달성을 지닌 바이러스로부터 작제되고 있다. 좀더 구체적으로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, AAV 및 허프스바이러스가 언급될 수 있다. 유전자 전달 벡터로서 사용되기 위해서는, 이들 바이러스 게놈은 세포에서 자가 복제가 불가능하도록 변형된다. 이들 바이러스는 복제 결손형으로 불린다. 일반적으로, 게놈은 바이러스 복제에 트랜스로 있는 필수 영역을 발현 카세트(들)로 치환하여 변형된다.

본 발명의 구조내에서, 아데노바이러스에서 유도된 바이러스 벡터의 사용이 바람직하다. 아데노바이러스는 크기가 약 36 (킬로베이스) kb인 선형 이본쇄 DNA를 지닌 바이러스이다. 이들 게놈은 특히 각 말단에 역 반복 말단(ITR), 캡시드화 서열(Psi), 초기 유전자 및 후기 유전자를 포함한다. 주요 초기 유전자는 E1, E2, E3 및 E4 영역에 함유된다. 이들 중, E1 영역에 함유된 유전자는 특히 바이러스 증식에 필요하다. 주요 후기 유전자는 L1에서 L5 영역에 함유된다. 아데노바이러스 Ad5의 게놈이 완전히 서열분석되었고 데이타베이스로 입수가능하다(특히 Genebank M73260 참조). 또한, 기타 아데노바이러스 게놈(Ad2, Ad7, Ad12 등)의 일부, 또는 심지어 전부도 서열분석되었다.

유전자 전달 벡터로서 이들을 사용하기 위해, 각종 치료 유전자를 내포하는 각종 아데노바이러스-유도된 작제물이 제조되고 있다. 좀더 상세하게 말하면, 선행기술에 기재된 작제물은 바이러스 복제에 필수적인 E1 영역이 결여된 아데노바이러스로서, 이 속으로 이종 DNA 서열이 삽입된다[참조문헌: Levrero et al., Gene 101(1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161]. 또한, 벡터의 성질을 개선시키기 위해, 아데노바이러스 게놈에서 기타 결실 또는 변형이 이루어질 것을 제안하고 있다. 따라서, 열-감수성 점 돌연변이는 돌연변이체 ts125 중에 도입되며, 이는 72 kDa DNA-결합 단백질(DBP)를 불활성화시킬 수 있다[13]. 기타 벡터는 바이러스 복제 및/또는 증식에 필수적인 또다른 영역, 즉 E4 영역의 결실을 포함한다. E4 영역은 실제로 후기 유전자의 발현 조절, 후기 핵 RNA의 안정성, 숙주 세포 단백질의 발현 억제 및 바이러스 DNA의 복제 효율과 관련된다. E1 및 E4 영역이 결여된 아데노바이러스 벡터는 전사 백그라운드 노이즈 및 매우 감소된 바이러스 유전자 발현을 보유한다. 이러한 벡터는 예를 들면, 출원 WO 94/28152, WO 95/02697 및 WO 96/22378에 기재되어있다. 추가로, IVa2 유전자에서 변형을 운반하는 벡터도 기재되어있다(WO 96/10088).

문헌에 기재된 재조합 아데노바이러스는 각종 아데노바이러스 혈청형에서 생성된다. 실제로, 구조 및 성질이 다소 상이하지만, 필적할 만한 유전자 구성을 지닌 각종 아데노바이러스 혈청형이 존재한다. 좀더 구체적으로 말하면, 재조합 아데노바이러스는 인간 또는 동물 기원일 수 있다. 인간 기원의 아데노바이러스의 경우, 바람직하게는 C 그룹으로 분류되는 것들, 특히 유형 2(Ad2), 5(Ad5), 7(Ad7) 또는 12(Ad12) 아데노바이러스가 언급될 수 있다. 동물 기원의 각종 아데노바이러스 중, 바람직하게는 개 기원의 아데노바이러스, 특히 모든 CAV2 아데노바이러스 균주가 언급될 수 있다[예를 들어 manhattan 또는 A26/61 균주(ATCC VR-800)]. 동물 기원의 기타 아데노바이러스는 특히 본원에서 참조문헌으로 인용된 출원 WO 94/26914에 인용되고 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 재조합 아데노바이러스는 C 그룹 인간 아데노바이러스이다. 좀더 구체적으로 말하면, 이는 Ad2 또는 Ad5 아데노바이러스이다.

재조합 아데노바이러스는 캡시드화 세포주, 즉 재조합 아데노바이러스 게놈에서 결핍된 하나 이상의 기능을 트랜스로 상보할 수 있는 세포주에서 생성된다. 이들 세포주 중 하나는 예를 들면, 아데노바이러스 게놈의 일부가 통합되는 세포주 293이다. 좀더 정확히 말하면, 세포주 293은 혈청형 5 아데노바이러스(Ad5) 게놈의 좌측 말단(약 11-12%)을 함유하는 배 인간 신장 세포주로서, 좌측 ITR, 캡시드화 영역, E1 영역(E1a 및 E1b 포함), pIX 단백질을 암호화하는 영역 및 pIVa2 단백질을 암호화하는 영역의 일부를 포함한다. 이 세포주는 E1 영역이 결여된, 즉 E1 영역의 전부 또는 일부가 결여된 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보할 수 있고, 높은 역가를 지닌 바이러스 스톡을 생성할 수 있다. 이 세포주는 또한 허용 온도(32℃)에서, 추가로, 열-감수성 E2 돌연변이를 포함하는 바이러스 스톡을 생성할 수 있다. 특히 인간 폐 종양 세포 A549(WO 94/28152) 또는 인간 망막아세포(Hum.Gen.Ther.(1996)215)에 기초한 E1 영역과 상보적일 수 있는 기타 세포주에 관해 기재되어있다. 또한, 다수의 아데노바이러스 기능을 트랜스상보할 수 있는 세포주에 관해서도 기재되어있다. 특히, E1과 E4 영역에 상보적인 세포주[참조문헌: Yeh et al., J. Virol.70 (1996) 559; Cancer Gen.Ther. 2(1995) 322; Krougliak et al., Hum.Gen.Ther.6 (1995) 1575] 및 E1과 E2 영역에 상보적인 세포주(WO 94/28152, WO 95/02697 및 WO 95/27071)가 언급될 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 일반적으로 바이러스 DNA를 캡시드화 세포주로 도입한 다음, 약 2 내지 3일 후에 세포를 용해(아데노바이러스 사이클의 역학은 24 내지 36시간)시켜 생성된다. 세포 용해 후, 재조합 바이러스 입자는 세슘 클로라이드 구배 원심분리에 의해 분리된다. 다른 방법은 본원에서 참조문헌으로 인용된 출원 FR 96 08164에 기재되어있다.

치료 유전자(들)를 발현시키는 카세트는 선행기술에 기술된 기술에 따라, 재조합 아데노바이러스 게놈의 상이한 부위로 삽입될 수 있다. 이는 우선 E1 결실 수준에서 삽입될 수 있다. 이는 또한 E3 영역의 수준에서, 서열 첨가 또는 치환 형태로 삽입될 수 있다. 이는 또한 결실된 E4 영역의 수준에 위치될 수 있다. 두개의 발현 카세트를 운반하는 벡터의 작제를 위해, 하나는 E1 영역의 수준에서 삽입될 수 있고, 나머지는 E3 또는 E4 영역의 수준에서 삽입될 수 있다. 두 카세트 모두 동일한 영역의 수준에 도입될 수 있다.

본 발명을 수행하기 위해, 발현 시스템을 포함하는 조성물은 다양한 방법으로 제형될 수 있다. 이는 특히 등장성 멸균 식염수 용액(모노나트륨 또는 디나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라, 멸균수 또는 생리식염수의 첨가로 주사액의 제조를 허용하는 건조, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다. 예를 들어, 단백질(특히 인간 혈청 알부민: FR96/03074), 폴옥사머 또는 하이드로겔과 같은 기타 부형제도 사용될 수 있다. 이 하이드로겔은 임의 생물적합성 및 비-세포독성(호모-또는 헤테로-)중합체로부터 제조될 수 있다. 이러한 중합체는 예를 들면, 출원 WO 93/08845에 기재되어있다. 이들 중 몇몇, 특히 에틸렌 옥사이드 및/또는 프로필렌에서 얻어진 것들이 시판되고 있다. 또한, 발현 시스템이 플라스미드 벡터로 이루어진 경우, 유전자 전달을 촉진하는 하나 이상의 화학 또는 생화학제를 조성물에 첨가함이 유리할 수 있다. 이와 관련하여, 좀더 상세하게는 출원 WO 95/219321에 기재된 폴리라이신(LKLK)n 또는 (LKKL)n 유형의 양이온 중합체, 폴리에틸렌이민(WO 96/02655) 및 DEAE-덱스트란 또는 양이온 지질 또는 리포펙탄트가 언급될 수 있다. 이들은 DNA를 응축하고 세포막과의 결합을 촉진하는 성질을 보유한다. 이들 중, 리포폴리아민(리포펙타민, 트랜스펙탐, 출원 WO 95/18863 또는 WO 96/17823에 기재), 각종 양성 또는 중성 지질(DOTMA, DOGS, DOPE 등) 및 임의로는 특정 조직을 표적화하는 기능을 하는 핵 기원 펩티드(WO 96/25508)가 언급될 수 있다. 이러한 화학 벡터를 이용하여 본 발명에 따른 조성물의 제조는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술에 따라, 일반적으로는 단순히 각종 성분을 접촉시켜 수행된다.

특히 바람직한 방법에서, 본 발명에 사용된 발현 시스템은 뉴로트로픽 인자를 암호화하는 결손 재조합 아데노바이러스로 이루어진다. 좀더 구체적으로 말하면, 뉴로트로픽 인자는 NT3이다. 본 발명에서 이들의 사용시, 아데노바이러스는 유리하게는 10⁴내지 10¹⁴pfu, 바람직하게는 10⁶내지 10¹⁰pfu의 용량 형태로 제형 및 투여된다. 용어 pfu("플라크 형성 단위")는 아데노바이러스 용액의 감염도에 상응하고, 적절한 세포 배양액을 감염시킨 다음 보통 15일 후, 감염된 세포 플라크의 수를 측정하여 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가를 측정하는 기술은 문헌에 상세히 실려있다. 하기 실시예는 사용량 10⁹과 10⁷이 (i) 절개된 뉴런 중으로 유전자의 효과적인 전달, (ii) 상기 뉴런에서 트랜스진의 지속적인 발현 및 (iii) 축색 연속성의 회복을 허용함을 상당히 뚜렷하게 보여준다.

발현 시스템은 다양한 방법, 특히 시린지에 의해 커프 중으로 도입될 수 있다. 마이크로시린지에 의한 주사가 바람직하다(Hamilton 또는 Terumo 마이크로시린지).

본 발명의 특히 유리한 적용 중 하나는 말초신경의 재생 자극이다. 이러한 치료법은 각종 병리학적 상태, 특히 외상 또는 신경 퇴화에 적용될 수 있다. 이것은 외과적으로 접근하기 쉬운 신경, 특히 상지에 대해서 방사 신경, 완척 신경, 중앙신경, 손가락의 측축색 신경 및 골격간 신경, 및 하지에 대해서 좌골 신경 (출생시 직경 약 1 cm) 또는 각(脚) 신경 (직경 6 내지 7 mm)에 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 특히 유리한 적용은 외상 뒤에, 상완 신경총 (직경 5 내지 6 mm) 근부의 수준에서 또는 척수 자체 내에서의 신경 연속성의 회복이다. 현재 이러한 형태의 병변 치료법은 존재하지 않는다. 본 발명의 방법은 주요 다발을 결합시키고 신경 연속성을 재생하기 위해서 골수 섹션 아래에 있는 섹션과 그 위에 있는 섹션간 브리징을 수행함을 가능하게 한다. 이러한 적용을 위해서, 사용된 커프는 바람직하게는 높이가 15 내지 20 mm 정도일 수 있는 내경을 지닌다. 특히, 상완 신경총의 수준에서 추출된 근부의 브리징을 위해서, 커프 직경은 근부 직경에 상응한다.

그러므로, 본 발명의 주제는 또한 뉴로트로픽 인자 발현 시스템이 도입되는 병변 상하 부분을 결합시킴을 가능하게 하는 생물적합성 커프로 이루어진 신경 병변의 수준에서 뉴로트로픽 물질의 국소 및 지속 방출을 위한 산물이다.

본 발명은 동물 및 인간 모두에서 생체내 신경 재생을 자극하기 위해서 사용될 수 있다. 이것은 또한 신규한 트로픽 인자 (신규 단백질, 돌연변이체 등)의 성질을 연구하기 위해서 동물에서 사용될 수 있다. 이를 위해서, 동물은 신경부로 투입되고, 이어서 처리될 인자를 발현하기 위한 시스템이 본 발명에 따른 장치로 도입된다. 신경 연속성을 회복시키는 인자의 능력은 실시예에 표시된 바와 같이 측정된다. 이러한 장치는 또한 다양한 인자를 비교하거나 다양한 인자의 공력 연계를 연구함을 가능하게 한다.

본 발명은 설명적이고 비-제한적인 것으로 생각되어야 하는 하기 실시예의 보조로 더욱 상세하게 기재될 것이다.

Claims (14)

1. 뉴로트로픽 인자 발현 시스템이 도입되는 생물적합성 커프를 포함하는 신경재생 자극장치.
2. 한편으로는 생물적합성 커프를 포함하고, 다른 한편으로는 뉴로트로픽 인자 발현 시스템을 포함하는 조성물을 포함하는 신경재생 자극키트.
3. 신경재생 자극용 조성물의 제조를 위한, 뉴로트로픽 인자 발현 시스템이 도입되는 생물적합성 커프의 용도.
4. 제 3 항에 있어서, 말초신경 재생 자극용 조성물의 제조를 위한 용도.
5. 제 3 항에 있어서, 척수내 축색 재생 자극용 조성물의 제조를 위한 용도.
6. 신경계의 외상성 병변 치료용 조성물의 제조를 위한, 뉴로트로픽 인자 발현 시스템이 도입되는 생물적합성 커프의 용도.
7. 병변의 상하 부분을 결합시킬 수 있고, 뉴로트로픽 인자 발현 시스템이 도입되는 생물적합성 커프로 이루어진, 신경병변 수준에서 뉴로트로픽 물질의 국소적이고 지속적인 방출을 위한 산물.
8. 제 3 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 커프가 무독한 생물적합성 물질로 제조된 튜브상 지지체로 이루어짐을 특징으로 하는 용도.
9. 제 3 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 신경 절편이 커프의 일단에 도입되어 여기에서 봉합 및/또는 아교에 의해 적소에 유지되며, 발현 시스템이 커프 중으로 도입된 다음, 제 2 신경 절편이 커프의 제 2 말단에 삽입되어 여기에서 봉합 및/또는 아교에 의해 유지됨을 특징으로 하는 용도.
10. 제 3 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시스템이 뉴로트로픽 인자를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 이루어짐을 특징으로 하는 용도.
11. 제 10 항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 용도.
12. 제 11 항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터임을 특징으로 하는 용도.
13. 제 10 항에 있어서, 뉴로트로픽 인자가 뉴로트로핀, 뉴로카인, β-TGF, FGF 및 IGF 계열의 인자 중에서 선택됨을 특징으로 하는 용도.
14. 제 13 항에 있어서, 뉴로트로픽 인자가 BDNF, GDNF, CNTF, NT3, FGFα 및 IGF-I 중에서 선택됨을 특징으로 하는 용도.