KR20000072988A - 로즈마린산 및 그 유도체의 면역억제제 또는 ｓｈ２ 억제제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 로즈마린산 (rosmarinic acid) 및 그 유도체를 T 임파구 세포 키나아제 (Lymphocyte Cell Kinase ; Lck) SH2 도메인의 활성억제제 또는 면역억제제로 사용하는 방법에 관한 것으로서, 상기 화합물 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 장기 또는 조직의 이식 시 일어나는 거부반응, 자가면역질환, 염증성 질환 등의 치료, 진단 또는 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

로즈마린산 및 그 유도체의 면역억제제 또는 ＳＨ２ 억제제로서의 용도{Use of rosmarinic acid and derivatives thereof as an immunosuppressant and an inhibitor of SH2-mediated process}

본 발명은 로즈마린산 또는 그 유도체를 T 임파구 세포 키나아제(Lymphocyte cell kinase, 이하 "Lck"라 약칭함)의 SH2 (Src homology region 2) 도메인의 활성억제제 또는 면역억제제로 사용하는 방법에 관한 것으로서, 상기 화합물 또는 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 장기 또는 조직의 이식 시 일어나는 거부반응, 자가면역질환, 염증성 질환 등의 치료, 진단 또는 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

장기 이식은 신부전증, 심부전증, 간부전증 및 폐부전증의 말기 환자에게 흔히 이루어지고 있으며, 특히 신장, 심장, 폐, 간, 골수, 췌장 (도세포), 각막, 소장 및 피부의 동종이식 (allograft)이 널리 수행되고 있을 뿐 아니라 돼지의 심장판막을 이용하는 이종이식 (xenograft)도 수행되고 있다. 그러나 이러한 장기 이식은 이식된 환자에게 다양한 면역반응을 일으켜 이식거부와 이식편-대-숙주 질환 (graft-versus-host disease, 이하 "GVHD"라 약칭함)을 야기하기도 한다.

면역반응은 주로 T 세포가 동종이계항원 (alloantigen)을 인식함으로써 발발하며, 이식거부반응에서 일어나는 면역반응의 주된 공격 대상은 자신과 다른 형태의 MHC (Major Histocompatibility Complex) I과 MHC II 항원이다. 급성 이식거부반응이 일어날 때, 장기 수여자의 수지상 세포 (dendrite cells) 또는 단핵구 (monocyte) 등과 같은 항원보유 세포가 이식부위에서 주변의 림프절로 이동하여 피이식자의 CD4⁺T_H세포에 의해 외부물질로 인식되며 그 결과 피이식자의 T_H세포의 증식을 자극하게 된다. T_H세포가 증식하면, 세포독성 (cytotoxic) CD8⁺T 세포 및 CD4⁺T 세포 등의 세포군이 생성되고 이식부위로 이동 및 침투하여 이식거부반응을 매개한다 (Noelle, R.J. et al., FASEB 5(13) : 2770, 1991).

급성 이식거부 반응이 T 세포에 의존적인 반응인 반면, 이후 나타나는 이식조직파괴 기전은 광범위한 일련의 과정으로서, 사이토카인 (cytokine)이 분비되고 세포간의 상호작용을 통해 CD4⁺T 세포, CD8⁺세포독성 T 세포, 항체를 형성하는 B 세포, 기타 초기염증 백혈구 (proinflammatory leukocyte)를 포함하는 다양한 조합의 임파구들이 항 동종이식 반응 (anti-allograft response)에 참여한다. 구체적으로, 항원을 보유하는 이식된 세포는 세포독성 CD8⁺T 세포에 의해 직접 파괴되고, 활성화된 CD4⁺T 세포가 생산하는 인터루킨-2 (interleukin-2, IL-2; 이하 인터루킨을 "IL"이라 약칭함)가 CD8⁺T 세포와 B 세포를 활성화시킨다. 또한, CD4⁺T 세포는 인터페론 감마 (이하, "IFN-γ"로 약칭함) 또는 인터루킨-4 (IL-4)와 같은 이식조직 파괴에 참여하는 사이토카인을 생산한다. IFN-γ은 이식 조직의 MHC I 분자와 MHC II 분자의 발현을 유도하여 이식조직이 더욱 쉽게 공격받도록 할 뿐 아니라, 대식세포 (macrophage)의 활성을 증가시키고 염증반응에 관련된 세포들에 영향을 주어, 지연성 과민반응 (delayed-type hypersensitivity, 이하 "DTH"로 약칭함)과 염증을 일으켜 이식조직에 대한 비특이적 손상을 가한다. 이러한 반응이 이식 후 수주일 이내에 일어나는 초기 급성 거부반응의 주원인으로 알려져 있으며, 이러한 급성 거부반응을 방치하면 며칠 이내로 이식조직의 파괴가 급속히 일어난다.

골수 이식의 경우, 특히 GVHD (graft-versus-host disease)가 이식수술을 받은 환자의 생존율을 좌우한다. GVHD는 이식된 골수 세포가 피이식자의 세포를 공격하는 것으로서 (Storb, "Pathophysiology and prevention of graft-versus-host disease." IN Advances in Immunobiology: Blood cell antigens and bone marrow transplantation, McCullogh and Sandler, editors, Alan, R., Liss, Inc., New York, p 337, 1984), GVHD에 걸린 환자는 대부분 사망하게 된다 (Weiden et al., "Graft-versus host disease in allogeneic marrow transplantation" IN Biology of Bone-Marrow Transplantation, Gale and fox, editors, Academic Press, New York, p37, 1980).

상기와 같은 치명적 이식거부 증상을 막기 위해 다양한 면역억제제가 사용된다. 현재 동종이식 거부반응의 조절에 사용되는 면역억제제로는 시클로스포린 A (cyclosporine A), 아자티오프린 (azathioprine), 프레드니손 (prednisone) 또는 메틸프레드니손 (methylprednison)과 같은 코르티코스테로이드 (corticosteroids) 및 시클로포스파미드 (cyclophosphamide) 등이 있다. 이중에서 시클로스포린 A는 가장 강력하고 흔히 사용되는 면역억제제로서 장기이식 외과의술 분야에 혁신을 가져왔으며, FK506, 라파마이신 (rapamycin), 마이코페놀산 (mycophenolic acid), 15-디옥시스퍼구알린 (15-deoxyspergualin), 미조리빈 (mizoribine), 미소프로스톨 (misoprostol), OKT3, IL-2 수용체에 대한 항체 등 기타 면역억제제들도 장기이식 거부반응의 치료 또는 예방에 사용되어 왔다 (Briggs, Immunology letters Jul. 29(1-2): 89-94, 1991; FASEB 3:3411, 1989). 그 결과, 이와 같은 신규한 면역억제제는 환자들이 생존하는데 상당한 기여를 했다. 그러나, 이들 억제제는 면역조직 이외의 조직에서도 억제기능을 나타내기 때문에, 신장 또는 간에 대한 독성 등의 부작용이 높다는 문제점을 지니고 있다.

이식거부반응에서 일어나는 면역반응은 주로 T 세포에 의존하기 때문에, T 세포의 기능을 억제하는 약품이 보다 높은 효능을 보이게 된다. 시클로스포린 A와 FK506은 사이토카인 유전자의 전사를 억제하여 T 세포의 활성화를 억제하는데, 그 작용 기전은 다음과 같이 요약된다.

클로스포린 A와 FK506은 시클로필린 (Cyclophilins)과 FK506 결합 단백질 (FKBPs)과 같은 이뮤로필린 (immunophilins)에 결합하여 약품-이뮤로필린 복합체 (drug-immunophilin complex)를 형성한다. 이 복합체는 칼슘 및 칼모듈린 (calmodulin) 의존적 세린/트레오닌 포스파타아제인 칼시뉴린 (calcineurin)에 결합하여 그 효소 활성을 저해한다. 이 효소의 불활성화가 일어나면, 세포질에 있던 전사 인자 (transcription factor) NF-AT가 핵 내부로 전위 (translocation)될 수 없어서, 인터루킨-2 등의 사이토카인 유전자가 발현되지 않는다. 그러나, 시클로스포린 A는 유효 용량으로 사용될 때에도 독성과 부작용을 나타낸다.

FK506는 시험관내 인터루킨-2 전사 억제와 생체내 이식거부반응의 억제에 있어서 시클로스포린 A보다 10배 내지 100배 더 강력하지만, 역시 신경독성 및 신장독성과 같은 부작용을 나타낸다.

또다른 강력한 면역억제제인 라파마이신은 인터루킨-2에 의존적인 임파구 증식을 억제한다. 라파마이신-FKBP 복합체의 세포내 표적인 mTOR는 포스포이노시티드 키나아제 활성을 가지고 있으며, 사이토카인에 반응하는 mTOR 신호전달과정의 결과로 세포주기 (cell cycle)가 진행된다.

이와 같이 상기 면역억제제는 모두 T 세포의 기능에 영향을 준다. 시클로스포린 A와 FK506이 T 세포의 활성화 단계를 방해하는 반면, 라파마이신은 T 세포의 증식 단계를 억제한다. 그러나, 이들 억제제의 표적은 면역조직 이외의 조직에서도 발현된다. 따라서, 면역세포, 특히 T 세포에서 특이적으로 발현되는 표적 분자를 선택적으로 저해하는 물질이 이상적이고 보다 효율적인 면역억제제이므로, 현재 그 개발이 절실히 요구되고 있다.

이식거부반응 뿐 아니라 자가면역질환과 같은 T 세포가 매개하는 면역병리 현상에 있어서도, T 세포 활성화와 그 작용 기능에 대한 저해작용은 그 치료제를 개발하기 위한 표적이 된다. 항원특이적 T 세포 활성화는 T 세포 수용체 (T cell receptor, 이하 "TCR"로 약칭함)가 매개하는 신호전달과정에 의해 개시되는데, 상기 신호전달과정에는 여러가지 타이로신 키나아제 또는 인산화단백질이 관련되어 있으며, 활성화된 T 세포가 세포 증식으로 이어지는 과정은 인터루킨-2와 인터루킨-2 수용체의 상호작용에 의해 조절된다.

한편, Lck는 T 세포에 특이적인 Src계 타이로신 키나아제로서, TCR이 매개하는 신호전달과 T 세포의 활성화, 증식 및 분화에 있어 핵심적 역할을 한다. 이와같은 Lck의 필수적 역할이 수행되기 위해서는, Lck의 키나아제 활성을 가지는 도메인 (domain) 뿐 아니라 신호전달의 표적 물질과 Lck에 존재하는 SH2 또는 SH3 도메인의 상호작용이 중요하다.

SH2 도메인은 100 아미노산 정도의 단백질 부위로서, 포스포타이로신을 포함하는 단백질과의 결합을 통하여 세포 내 임의의 단백질에서 다른 단백질로 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 한다. SH2 도메인을 포함하는 단백질 중 다수는 세포내 신호전달체계 (signal transduction system)에 관여하고 있는 것으로 알려져 있으며, 특정 단백질의 SH2 도메인과 그에 결합하는 단백질간의 결합특이성은 결합부위에 위치하는 인산화타이로신, 그 주변 아미노산의 서열 및 구조에 의해 결정된다 (Pawson, Nature, 373: 573-580, 1995).

SH2 도메인은 SH3 도메인과 더불어 Lck 조절부위의 하나로서, 효소가 불활성화된 상태에서는 Lck 단백질의 카르복시 말단 부위에 존재하는 인산화타이로신(pY505)과 분자내 결합을 이룸으로써 자가조절을 받고 있으나, 활성화된 상태에서는 SH2 도메인이 노출되고 노출된 SH2 도메인이 T 임파구 세포내의 다른 단백질과 결합하여 외부자극에 대한 신호를 전달한다 (Peri et al., Oncogene Res., 8: 2765-2772, 1993).

T 임파구 세포의 활성화에 있어서 Lck의 SH2 도메인의 중요성에 대해서는 SH2 도메인과 인산화타이로신 간의 결합을 하지 못하는 돌연변이 Lck를 이용한 여러 가지 실험을 통해 보고되었다. 이 돌연변이 Lck를 가진 세포는 T 임파구 세포 활성화 신호에 의해 유도되는 세포 내 칼슘 신호전달, T 임파구 세포 증식에 필요한 인터루킨-2 (Interleukin-2) 합성 및 분비신호 전달 등이 저해되는 것으로 확인되었다 (Xu and Littman, Cell 74: 633-643, 1993; Straus et al., J. Biol. Chem., 271: 9976-9981, 1996); Lewis et al., J. Immunol., 159: 2292-2300, 1997). 이와 같이, Lck의 SH2 도메인은 효과적인 ζ사슬 인산화; T 세포 활성화로 유도되는 세포내부 칼슘의 이동; 및 T 세포에서의 인터루킨-2 유전자 발현 등에 필수적이다.

세포 신호전달계에서 SH2 도메인이 중요함에도 불구하고, 개별적인 SH2 도메인에 대한 상세한 연구는 거의 없었다. TCR의 기능에 있어서 Lck 같은 타이로신 키나아제의 기능을 밝히기 어려웠던 이유는 특이적인 약리학적 저해제가 없었기 때문이다. 허비마이신 (herbimycin) 및 PP1/PP2와 같은 몇몇 저분자 타이로신 키나아제 저해제가 개발되기는 했으나, 이들은 타이로신 키나아제를 억제하나 T 세포에 특이성이 없어서 다른 세포에도 작용한다는 문제점이 있다.

본 발명자들은 Lck가 T 세포에서 특이적으로 발현되며 Lck의 SH2 도메인이 T 세포의 활성화, 증식 및 분화에 중요한 역할을 한다는 사실에 주목하고, 이에 Lck의 SH2 도메인의 활성을 선택적으로 저해함으로써 T 세포에 특이적으로 작용하는 면역억제 효과를 발휘하는 물질을 개발하고자 노력한 결과, 로즈마린산 및 그 유도체가 Lck의 SH2 도메인을 선택적으로 억제하는 것을 발견하고 동물실험을 통해 장기이식시 면역억제제로서 성능이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이와 같이 로즈마린산 및 그 유도체는 SH2 도메인을 선택적으로 억제하므로, SH2 도메인 또는 그의 천연 리간드를 포함하는 단백질이 신호전달 복합체로서 매개하는 질환 또는 그 병리학적 증상을 치료 또는 예방하는데 유용하게 쓰일 수 있으며, 아울러 기존의 면역억제제와 같은 용도로, 즉 이식거부 반응, 자가면역 질환, 염증성 질환 등의 치료, 진단 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 로즈마린산 및 그 유도체의 임파구 세포 키나아제 (Lck)의 SH2 도메인 억제제 또는 면역억제제로서의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

도 1 은 Lck의 SH2 도메인와 이에 특이적인 포스포타이로신 펩타이드 간의 결합을 로즈마린산이 저해하는 것을 나타내고,

도 2 는 저캣(Jurkat) T 세포에서 CD3와 CD4 항체에 의해 유도되는 세포내 칼슘 농도의 증가가 로즈마린산의 처리 농도에 따라 억제되는 것을 나타내고,

도 3 은 저캣 T 세포에서 CD3와 CD4 항체에 의한 인터루킨-2 프로모터 부위의 활성을 로즈마린산 또는 기존의 면역억제제가 억제하는 것을 나타내고,

도 4 는 저캣 T 세포에서 CD3와 CD4 항체에 의한 인터루킨-2 프로모터 부위의 활성을 로즈마린산, 로즈마린산의 유도체 또는 (S)-로즈마린산이 억제하는 것을 나타내고,

도 5 는 MLR (mixed lymphocyte reaction)에서 T 세포의 증식을 로즈마린산이 저해하는 것을 나타내고,

도 6 는 T 세포 수용체가 자극하는 T 세포 활성화를 로즈마린산이 저해하는 것을 나타내고,

도 7 은 동종이식된 신장 조직에서의 사이토카인 합성을 로즈마린산이 저해하는 것을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 임파구 세포 키나아제의 SH2 도메인 활성을 특이적으로 억제하는 로즈마린산의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 로즈마린산의 제조방법을 제공한다.

로즈마린산은 하고초 (Prunella vulgaris)로부터 Lck의 SH2 도메인에 대한 결합 저해활성을 갖는 분획을 용매추출하고 이를 크로마토그래피법으로 분리, 정제함으로써 얻어진다.

또한 본 발명은 로즈마린산 유도체의 Lck SH2 도메인 억제제 또는 면역억제제로서의 용도를 제공한다.

본 발명의 로즈마린산 유도체로는 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 로즈마린산의 에틸에스테르, 로즈마린산의 터뷰틸다이메틸실릴에테르, (S)-로즈마린산 등이 포함된다.

또한 본 발명은 로즈마린산, 로즈마린산 유도체, 또는 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 Lck의 SH2 도메인 억제제 및 면역억제제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 장기 또는 조직의 이식 시 일어나는 거부반응, 자가면역 질환, 염증성 질환 등에 유용하다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 로즈마린산, 로즈마린산 유도체 및 하고초 추출물을 Lck SH2 도메인 억제제 및 면역억제제로 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명이 제공하는 로즈마린산의 용도는 공지의 용도와 구별된다. 즉, 로즈마린산은 생체 내에서 다양한 활성을 가지는 것으로 알려져 있는데, 특히 항바이러스 활성 (국제공개 제 9213523호), 종양괴사인자 (TNF; Tumor Necrosis Factor)의 합성에 대한 저해 활성 (일본 특허 제 721584호), 5-리폭시게나아제 활성 (일본 특허 제 1121217호), 항생식선자극호르몬 활성 (독일 특허 제 3247610호, 독일 특허 제 2952114호, 유럽 특허 제 34214호, 미국 특허 제 4329361호 등)을 가지며, 그밖에 항산화 활성 및 항세균 활성을 가지는 것으로도 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 로즈마린산 및 그 유도체에는 (R)-로즈마린산, (S)-로즈마린산, 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 로즈마린산의 에틸에스테르, 로즈마린산의 터뷰틸다이메틸실릴에테르 등이 포함된다.

본 발명의 로즈마린산은 다년생 초본인 하고초(Prunella vulgaris)를 포함하는 식물의 추출물로부터 얻어진다. 상기 로즈마린산은 Lck의 SH2 도메인과 그와 특이적으로 결합하는 펩티드를 이용하여 이들의 상호작용을 저해하는 물질을 스크리닝함으로써 탐색되었다.

하고초로부터 로즈마린산을 분리하기 위해 메탄올로 추출한 다음 에틸 아세테이트로 용매추출하고, 활성분획을 크로마토그래피법으로 분리한 다음, 다시 클로로포름, 메탄올과 증류수의 혼합용매로 용출하고 다양한 크로마토그래피로 활성분획을 모으는 과정을 반복함으로써 상기 Lck의 SH2 도메인의 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산을 분리한다.

또한 본 발명에서는 다양한 로즈마린산의 유도체를 제공하는데, 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 에틸에스테르 및 (S)-로즈마린산의 터뷰틸다이메틸실릴에테르를 포함하고, 상기 유도체들은 로즈마린산 또는 타이로신 및 카페인산 등으로부터 합성될 수 있으며, 보다 많은 유도체들이 상기 유도체로부터 용이하게 합성될 수 있다.

본 발명의 로즈마린산 및 그 유도체는 Lck SH2 도메인과 이에 특이적으로 결합하는 펩티드 간의 시험관내 결합을 저해한다 (도 1 참조). 보다 상세하게는, 로즈마린산 및 그 유도체는 GST와 융합된 Lck SH2 도메인을 선택적으로 저해하고, 하나 이상의 SH2 도메인과 그 자연적 리간드를 포함하는 단백질들의 신호전달 복합체의 형성을 막거나 불안정하게 하므로, 상기 신호전달 복합체가 매개하는 질환의 예방 또는 치료에 로즈마린산 및 그 유도체가 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 로즈마린산 및 그 유도체는 면역반응으로 야기되는 T 세포 내부의 칼슘 신호전달과정에 영향을 미친다 (도 2 참조). T 임파구의 표면항원(sIg)인 CD3와 CD4에 대한 항체를 처리하면 세포내 칼슘 이온의 증가와 T 임파구의 활성화가 일어나고 이같은 일련의 과정 중에 Lck가 관련되어 있음이 알려져 있다. CD3와 CD4에 대한 항체 처리에 따른 세포내 칼슘 이온의 증가는 로즈마린산 및 그 유도체 처리에 의해 저해되므로, 로즈마린산 및 그 유도체는 SH2 도메인의 결합을 저해하고 그 결과로 일어나는 T 임파구의 활성화를 억제할 수 있다.

본 발명의 로즈마린산 및 그 유도체는 세포내 IL-2 유전자 발현을 억제한다 (도 3 및 도 4 참조). 본 발명에서는 IL-2 유전자 발현 수준에 관한 로즈마린산 및 그 유도체의 효과를 알아보기 위해 IL-2/루시페라제 리포터 시스템을 이용한다. IL-2 합성 및 분비는 T 세포 증식을 야기하므로, IL-2 합성 및 분비를 억제하는 로즈마린산 및 그 유도체는 T 세포 증식을 억제할 수 있다.

상기와 같은 결과에 근거하여, 로즈마린산 및 그 유도체는 Lck SH2 도메인, Src계 단백질 타이로신 키나아제의 SH2 도메인 또는 다양한 사이토카인의 합성을 저해할 뿐 아니라, 이들이 매개하는 면역 반응 및 질환 등을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 로즈마린산 및 그 유도체는 시험관내 면역반응 및 생체내 면역반응을 저해한다 (도 5 및 도 6 참조). 본 발명에서는 혼합 임파구 반응 (Mixed Lymphocyte Reaction) 시험 및 DNFB (2,4 - dinitrofluorobenzene) 접촉에 대한 과민반응을 수행하여 로즈마린산 및 그 유도체가 T 세포 증식 및 면역 반응을 억제하는 능력이 있음을 확인한다.

본 발명의 로즈마린산 및 그 유도체는 동물에서의 동종이식 거부반응을 억제한다 (표 1 참조). 본 발명에서 상기 억제 효과는 이식 피부의 생존 시간을 측정하는 생체내 표준 약리 테스트 과정으로 확인한다

본 발명의 로즈마린산은 이식조직에서의 사이토카인 유전자 발현을 억제한다 (도 7 참조). 이식조직에서는 높은 수준으로 사이토카인 유전자가 발현되므로, 본 발명에서는 사이토카인 유전자 발현에 대한 로즈마린산의 억제효과를 RT-PCR 방법으로 조사하여, 로즈마린산 및 그 유도체가 면역억제 치료에 사용될 수 있고 상기 사이토카인이 증가됨으로써 유발되는 기타 질환에도 사용될 수 있음을 확인한다.

상기와 같은 결과를 종합해 보면, 로즈마린산 및 그 유도체는 심장, 신장, 간장, 골수 및 피부 이식 등의 이식거부 증상; 루푸스, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 건선과 같은 자가면역 질환; 피부염, 습진, 지루, 염증성 장 질환 같은 염증성 질환; 및 진균 감염 등의 치료에 유용하다.

또한 본 발명에서는 상기 로즈마린산, 로즈마린산의 유도체 또는 하고초 추출물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명이 제공하는 약학적 조성물은 면역억제요법에 이용되고 특히 이식거부 증상, 자가면역 질환 및 염증성 질환을 위한 치료법에 이용된다.

본 발명의 약학적 조성물은 장기이식 거부반응, 만성 이식거부반응, 자가면역질환 및 만성 염증성 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, 구체적으로는 포유류의 GVHD, 루푸스, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 건선, 피부염, 습진, 지루, 염증성 장 질환, 크론 병 (Crohn's disease), 원발성 담즙성간경변 (primary biliary cirrhosis) 등의 진단, 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

그 밖에도 Src계의 단백질 타이로신 키나아제의 SH2 도메인이 매개하는 세포 기능을 저해하는 용도로도 본 발명의 약학적 조성물을 사용할 수 있는데, 상기 Src계의 단백질 타이로신 키나아제는 Src, Fyn, Yes, Lyn 및 Blk를 포함한다.

상기 약학적 조성물은 로즈마린산 또는 그 유도체 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 필요에 따라 다양한 면역억제제를 조합하여 조제할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물과 조합하여 사용할 수 있는 면역억제제로는, 시클로스포린 A 및 그 유사체, FK506 및 그 유사체, 코르티코스테로이드, 아자티오프린, 미코페놀산, 라파마이신, 15-디옥시스퍼구아린, 미조리빈, 레플루노미드, OKT3, IL-2 수용체에 대한 항체, 미소프로스톨, 메토트렉세이트, 시클로포스파미드 및 항임파구/흉선세포 혈청, 프레드니손 또는 메틸프레드니손과 같은 코르티코스테로이드를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 물질이 이용될 수 있다. 이와 같이 두가지 이상의 면역억제제를 병용하여 조제된 조성물은, 로즈마린산 또는 기타 면역억제제를 각각 단독으로 투여할 때의 약리적 효과의 총합보다 더 높은 면역억제 활성을 상승적으로 가질 뿐 아니라, 독성이나 부작용을 덜 유발하면서도 동일한 면역억제 활성을 가진다.

이식거부 반응에 대한 치료에 사용되는 경우에 본 발명의 약학적 조성물은 동종이식 또는 이종이식의 거부반응을 치료하거나 GVHD이 야기하는 합병증을 치료하는데 사용될 수 있는데, 상기 이식거부 반응의 치료에 쓰이는 약학적 조성물은 로즈마린산 및 사이클로스포린 A를 포함한다.

또한, 상기 약학적 조성물은 비스테로이드 항염증제을 포함할 수 있는데, 상기 비스테로이드 항염증제는 아스피린, 이부프로펜 (ibuprofen), 나프록센 (naproxen), 인도메타신 (indomethacin), 디클로페낙 (diclofenac), 설린닥 (sulindac), 피록시캄 (piroxicam), 에토돌락 (etodolac), 케토프로펜 (ketoprofen), 메클로페나메이트 (meclofenamate), 수프로펜 (suprofen) 및 톨메틴 (tolmetin)을 포함하는 그룹 중에서 선택되며, 포유류의 기관이식 거부반응, GVHD, 건선, 자가면역 질환 및 만성 염증 질환을 치료하거나 예방하기 위해 상기 로즈마린산 및 그 유도체와 상기 비스테로이드 항염증제가 조합되어 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 로즈마린산 또는 그 유도체는 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 로즈마린산 또는 그 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 서당 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

로즈마린산 또는 그 유도체의 유효용량은 0.01∼1000 mg/kg 이고, 바람직하기로는 0.1∼500 mg/kg 이며, 하루 0.5~3 회 투여될 수 있다.

이하 로즈마린산 및 로즈마린산 유도체의 제조방법을 제조예에 의거하여 설명한다.

제조예 1. 로즈마린산의 제조 방법

(단계 1) Lck SH2 도메인에 대한 결합저해 물질의 탐색

본 발명에서는 Lck의 SH2 도메인과의 특이적 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하기 위한 시스템을 개발하였다. 상기 스크리닝 시스템에서, Lck의 SH2 도메인은 GST와 융합되어 발현되며, 이때 GST는 아미드 결합을 통해 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 공유적으로 고정되었다. Lck의 SH2 도메인에 매우 높은 친화력이 있는 리간드로 알려져 있는 바이오틴화 포스포타이로신 (biotinylated pY)을 함유한 합성펩티드(biotin-SGSGEEPQpYEEIPI) (Kim, J. et al., Journal of Biochemistry and Molecular Biology 31: 370-376, 1998)을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 더하면 합성펩티드는 상기 고정된 융합단백질과 연속적으로 결합하였다.

정제된 1μM 농도의 글루타치온-S-전이효소(Glutathione-S-transferase : 이하, GST라 함)-Lck SH2 부위의 단백질을 상온에서 2시간 반응시켜 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (96-well microtiter plate)에 부착시켰다. 여기에, 1μM의 바이오틴-SGSGEEPQpYEEIPI 펩타이드 및 각종 스트렙토마이세스 속 미생물, 진균 및 약초를 포함하는 수천가지 천연물질 중 한가지를 혼합하여 반응시키고, 시료가 펩타이드와 GST-Lck SH2와의 결합을 경쟁적으로 저해할 수 있도록 상온에서 다시 2시간 방치하였다. 그 다음, 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘 (Streptavidin, Pierce사 제품, 미국)을 첨가하여 반응시킨 후 세척하고, 바이오틴-펩타이드와 결합하여 남아있는 과산화효소의 활성을 발색반응을 이용하여 측정하였다. 다시말해, 3,3,5,5-테트라메틸 벤지딘 (3,3,5,5-tetramethyl benzidine)을 기질로 첨가하고 30분간 반응시킨 다음, 0.8N 황산으로 효소활성을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정함으로써, SH2 도메인과 포스포타이로신을 포함하는 펩타이드의 결합을 정량하였다.

발색반응이 저해된 시료 중에서 각 천연물 추출액 내의 저해물질의 존재를 탐색한 결과, 가장 저해활성이 높고 재현성을 보이는 하고초 (Prunella vulgaris) 추출액을 선정하였다.

(단계 2) 하고초 추출액으로부터 로즈마린산의 분리와 정제

시중의 약재상으로부터 건조된 하고초 600g을 구입하여 메탄올 10∼20 ℓ에 침지시킨 뒤, 상온에서 3∼5 일간 방치하여 활성물질을 추출하였다. 메탄올 추출물을 감압건조하여 증류수에 현탁한 뒤, 에틸아세테이트로 용매추출하여 Lck의 SH2 도메인에 대한 결합 저해활성이 가장 높은 에틸아세테이트 분획을 얻었다.

얻어진 에틸아세테이트 분획을 감압농축한 뒤, 클로로포름과 메탄올 20:1 혼합액 소량에 녹여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 클로로포름과 메탄올의 20:1 혼합액으로 Lck의 SH2 도메인에 대한 결합 저해활성이 없는 부분을 용출 제거한 다음, 클로로포름, 메탄올과 증류수의 20:10:1∼10:5:1 혼합액을 전개용매로 사용하여 Lck의 SH2 도메인에 대한 결합 저해물질을 용출하였다.

얻어진 활성분획을 감압농축하여 소량의 메탄올에 녹인 뒤, 메탄올을 전개용매로 하여 세파덱스(Sephadex) LH-20(시그마사 제품) 칼럼 크로마토그라피를 실시하였다.

여기서 얻어진 SH2 도메인에 대한 결합 저해활성을 나타내는 분획은 20% 메탄올과 1% 인산 혼합액을 전개용매로 하여 역상 저압(Lobar, 머크사 제품) 크로마토그라피하고, 얻어진 활성분획을 모아 다이아이온(Diaion) HP-20에 흡착시켜 100% 메탄올로 활성물질을 용출하였다.

용출된 활성분획을 45% 메탄올:0.5% 인산 혼합액을 전개용매로 하고, 칼럼으로 YMC-Pack C18(내경 2cm×외경 15cm)를 사용하여 유속 4㎖/분, UV 254nm의 분리조건에서 고압액상 크로마토그라피 (HPLC)하여 결합 저해활성을 나타내는 용출시간 22분의 피크만을 모으고, 모아진 활성분획을 다이아이온 HP-20에 흡착시켜 100% 메탄올로 용출하여 Lck의 SH2 도메인 결합 저해물질을 50 mg 얻었다.

얻어진 물질의 물리화학적 특성은 다음과 같다;

1) 외관 : 연한 초록색 액상

2) 자외선(UV)-분광광도 스펙트럼, λ_max(nm) : 210, 220, 230(s), 250(s), 285, 340(중성 및 산성 메탄올), 208, 225, 250-260, 300-310, 370(염기성 메탄올)

3) 적외선(IR)-분광광도 스펙트럼, ν_max(cm^-1, KBr) : 3300(하이드록실), 1700(카보닐), 1600, 1500, 1450(방향족)

4) 고속원자폭격 질량분석 스펙트럼 : m/z 361[M+H]

5)¹H-핵자기공명 스펙트럼(300MHz, DMSO), δ(ppm) : 7.5(1H, d, J=15.8Hz, H-8), 7.03(1H, d, J=2.3Hz, H-2), 6.92(1H, dd, J=2.3, 8.3Hz, H-6), 6.76(1H, d, J=8.3Hz, H-5), 6.77(1H, d, J=2.3Hz, H-2'), 6.67(1H, d, J=8.3Hz, H-5'), 6.62(1H, dd, J=2.3, 8.3Hz, H-6'), 6.25(1H, d, J=15.8Hz, H-7), 6.62(1H, dd, J=3, 9.8Hz, H-8'), 3.10(1H, dd, J=3, 14.3Hz, H-7α), 2.93(1H, dd, J=9.8, 14.3HZ, H-7β)

6)¹³C-핵자기공명 스펙트럼(75MHz, DMSO), δ(ppm) : 127.9(C-1), 115.6(C-2), 149.4(C-3), 146.7(C-4), 116.5(C-5), 122.9(C-6), 146.7(C-7), 115.6(C-8), 169.1(C-9), 131.1(C-1'), 117.5(C-2'), 145.9(C-3'), 144.8(C-4'), 116.2(C-5'), 121.8(C-6'), 38.79(C-7'), 77.6(C-8'), 177.9(C-9').

결과적으로 확인된 순수 분리정제 물질은 로즈마린산임을 알 수 있었다.

제조예 2. 로즈마린산의 이소프로필에스테르

로즈마린산 (75 mg, 0.21 mmol)을 DMF 4 ml에 녹이고, 이소프로필알코올 (33 mg, 0.26 mmol)과 O-벤조트리아졸-일-N,N,N'N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트 (TBTU, 75 mg, 0.23 mmol)를 첨가하여 질소기류하에 실온에서 교반한 다음, 메틸벤젠아민 (34 mg, 0.28 mmol)을 첨가하여 실온에서 24시간동안 교반하였다. 이 반응액을 에틸아세테이트 50 ml로 희석한 후 탄산수소나트륨 용액 (3 x 20 ml), 10 % 염산으로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조하고 감압농축한 다음, 잔사를 플래시 크로마토그래피 (flash chromatography, 용리(熔離) 시스템, n-헥산 : 에틸아세테이트 85 : 15 내지 6 : 4)하여 노란색 고체를 얻었다 (79 mg, 82 %).

제조예 3. 로즈마린산의 에틸에스테르

로즈마린산 (75 mg, 0.21 mmol)을 에탄올에 녹이고 24시간 동안 가열환류하였다. 이 용액을 에틸아세테이트 50 ml로 희석한 후 포화 탄산수소나트륨 용액 (3 x 20 ml), 10 % 염산으로 세척하였다. 유기층을 황산 마그네슘으로 건조하고 감압농축한 다음, 잔사를 플래시 크로마토그래피 (용리(熔離) 시스템, n-헥산 : 에틸아세테이트 85 : 15 내지 6 : 4)하여 흰색 고체를 얻었다 (79 mg, 82 %).

제조예 4. (S)-로즈마린산의 터뷰틸다이메틸실릴에테르

(단계 1) 히드록시페닐 알라닌 염산염의 아세틸화

S-타이로신 (1.45 g, 8 mmol)을 미리 증류한 니트로벤젠에 녹인 다음 염화 알루미늄 (4.24 g, 31.8 mmol)을 서서히 적가하여 교반하고, 여기에 아세틸클로라이드 (0.78 ml, 11 mmol)를 첨가하여 6시간 동안 가열환류하였다. 반응액에 얼음을 포함하는 진한 염산을 가하고 80 ml의 에틸아세테이트를 첨가한 후, 유기층을 분리하여 감압농축하였다. 고체의 표제 화합물을 5 M 염산용액으로 재결정하였다.

¹H-NMR (D₂O) : δ 2.67 (s, 3 H), 3.22 (dd, 1 H) 3.32 (dd, 1 H), 4.27 (dd, 1 H), 7.00 (d, 1 H), 7.49 (dd, 1 H), 7.82 (d, 1 H); MS m/z 223([M]-HCl)⁺

(단계 2) 아세틸 히드록시페닐 젖산

상기 (단계 1)에서 합성된 화합물 (1.0 g, 3.5 mmol)을 20 ml의 물에 녹이고 얼음-수조에서 냉각하였다. 이를 아질산 나트륨 (0.4 g, 5.8 mmol)을 12 ml의 물에 녹인 용액에 서서히 적가하면서 교반하였다. 이 용액을 20 시간 동안 실온에서 교반하고 황산 암모늄 (204 mg, 1.54 mmol)을 첨가하여 1시간 동안 교반하였다. 이를 에틸아세테이트로 추출하고 유기층을 분리한 다음 황산 마그네슘으로 건조하고 감압농축하여 과잉 용매를 제거하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (용리(熔離) 시스템, n-헥산 : 에틸아세테이트 85 : 15 내지 6 : 4)하여 주(主)표제 화합물인 노란색 오일을 얻었다 (0.7 mg, 81 %).

¹H-NMR (CDCl₃): δ 2.62 (s, 3 H), 2.97 (dd, 1 H), 3.16 (dd, 1 H), 4.50 (dd, 1 H), 6.92 (d, 1 H), 7.37 (dd, 1 H), 7.63(d, 1 H), 12.16 (s, 1 H); MS m/z 224(M⁺)

(단계 3) 3-(3,4-다이히드록시페닐)-(S)-젖산

상기 (단계 2)에서 합성된 화합물(1 g, 4.5 mmol)을 수산화나트륨 용액 (0.64 g, 16 mmol)을 포함하는 30 % 과산화수소 용액에 첨가하여 12시간 동안 교반하였다. 이 반응액을 진한 염산 1 ml로 산성화하고 에틸아세테이트로 추출하여 분리된 유기층을 황산 마그네슘으로 건조하고 감압농축하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피하여 노란색 고체를 얻었다 (0.55 mg, 61 %).

¹H-NMR (acetone-d₆) δ 2.78 (dd, 1 H), 2.97 (dd, 1 H), 4.32 (dd, 1 H), 6.60 (dd, 1 H), 6.71 (d, 1 H), 6.78 (d, 1 H); MS m/z 198(M⁺)

(단계 4) 3-(3,4-다이히드록시페닐)-(S)-젖산의 다이알릴에테르 알릴에스테르

상기 (단계 3)에서 합성된 화합물(940 mg, 4.7 mmol)을 아세톤 14 ml에 용해한 다음 알릴브로마이드 (7 ml, 80 mmol)와 탄산칼륨 (1.97 g, 14.3 mmol)을 첨가하고 실리콘-유욕(油浴)에서 22시간 동안 가열환류하였다. 여과하여 얻은 불용성 염을 염화 메틸에 녹이고 물 (10 ml)로 세척한 다음, 유기층을 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피하여 무색 고체를 얻었다 (640 mg, 42 %).

¹H-NMR (CDCl₃) δ 2.91 (dd, 1 H), 3.06 (dd, 1 H), 4.44 (dd, 1 H), 4.58 (d, 4 H), 4.65 (dt, 2 H), 5.23-5.44 (m, 2 H), 5.84-5.97 (ddt, 1 H), 6.01-6.14 (m, 1 H), 6.73 (dd, 1H), 6.78 (d, 1H), 6.82 (d, 1H); MS m/z 318(M⁺)

(단계 5) 카페인산의 터뷰틸다이메틸실릴에테르

카페인산 (caffeic acid, 4 g, 22.2 mmol)을 염화 메틸에 녹이고 테트라부틸다이메틸실릴트리플레이트(24mL, 100 mmol)와 트리에틸아민(20.5 ml, 147 mmol)을 첨가하여 17시간 동안 교반하였다. 이 반응액을 10 % 염산 용액 (2 x 20 ml), 물 (2 x 20 ml)로 세척하고, 유기층을 황산 마그네슘으로 건조한 다음 농축하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피하여 정제된 무색 고체(2.15g, 86%)를 얻었다. 이 무색 고체를 메탄올 물 1:1의 비율로 된 200mL 용액에 녹인 후 탄산칼륨 (1.8 g, 11 mmol)을 첨가하고 상온에서 6시간 동안 저어준다. 반응물을 여과한 후 용매를 제거한 후 소량의 염산을 넣어서 산성화 시킨 후 에틸 아세테이트(100 mL)에 녹인 후 물 (20 ml X 3)로 세척한 다음, 유기층을 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피하여 무색 고체를 얻었다

(단계 6) 카페인산의 터뷰틸다이메틸실릴에테르와 3-(3,4-다이히드록시페닐)-(S)-젖산의 다이알릴에테르 알릴에스테르와의 합성

상기 (단계 5)에서 얻은 정제된 카페인산의 비스(테트라부틸다이메틸실릴)에테르 (4.31 g, 10.5 mmol)를 염화 티오닐 (2.4 ml, 33 mmol)과 사염화탄소를 용매로 하여 반응시키고 과잉 용매를 제거한 다음, 상기 (단계 4)에서 합성된 화합물 (2.4 ml, 6.0 mmol)을 첨가하여 염화 메틸을 용매로 하여 교반하다가 트리에틸아민 (5.9 ml, 42 mmol)을 가하여 질소기류하에서 4시간 동안 교반하였다. 이 반응 용액을 10 % 염산 용액과 포화-염화나트륨 수용액으로 세척한 다음, 유기층을 분리하여 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (헥산 : 에틸아세테이트 = 5 : 1) 하여 밝은 노란색 고체 (4.6 g, 90 %)를 얻었다.

(단계 7) (S)-로즈마린산의 터뷰틸다이메틸실릴에테르

상기 (단계 6)에서 합성된 고체 (600 mg, 1.2 mmol)를 30 ml의 에탄올 : 벤젠 : 물 (7:3:1, v/v)의 혼합용액에 녹이고, 트리스(트리페닐포스핀)로디움(I)클로라이드 (700 mg, 0.757 mmol)를 첨가하여 가열 환류하였다. 과잉 용매를 제거하고 40 ml의 에틸아세테이트에 용해하였다. 유기층을 40 ml의 포화-탄산수소나트륨 용액 (3 x 20 ml), 10 % 염산으로 세척한 다음, 유기층을 분리하여 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (용리(熔離) 시스템, n-헥산 : 에틸아세테이트 85 : 15 내지 6 : 4)하여 무색 고체 (120 mg, 29 %)를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ 0.22 (s, 6H), 0.23 (s, 6H), 0.99 (s, 9H), 1.00 (s, 9H), 3.03 (dd, 1H), 3.13 (dd, 1H), 5.22 (dd, 1H), 6.29 (d, 1H), 6.67 (dd, 1H), 6.75 (d, 1H), 6.86 (m, 2H), 7.05 (dd, 1H), 7.16 (d, 1H), 7.56 (d, 1H); MS m/z 592([M]+H)⁺

제조예 5. (S)-로즈마린산의 합성

상기 제조예 4에서 얻은 정제된 고체 (4.23 g, 5.97 mmol)를 질소기류하에서 테트라히드로푸란 (THF)에 녹이고, 테트라-n-부틸암모늄플루오라이드 (1.0 M in THF, 12 ml, 12 mmol)를 첨가하여 15분간 교반하였다. 이 반응액을 물로 세척하고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 분리하여 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피하여 주(主) 표제 화합물로서 노란 오일을 얻었다 (1.47 g, 51 %).

¹H-NMR (acetone-d₆) δ 3.03 (dd, 1H), 3.13 (dd, 1H), 5.22 (dd, 1H), 6.29 (d, 1H), 6.67 (dd, 1H), 6.75 (d, 1H), 6.86 (m, 2H), 7.05 (dd, 1H), 7.16 (d, 1H), 7.56 (d, 1H); MS m/z 361([M]+H)⁺

이하 로즈마린산 및 로즈마린산 유도체의 Lck SH2 도메인 활성억제제 또는 면역억제제로서의 효과를 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Lck SH2 도메인과 특이적 포스포티로실펩티드 간의 시험관내 결합에 대한 저해 효과

본 발명에서는 로즈마린산 및 그 유도체가 Lck의 SH2 도메인에 결합하는 활성을 가지는지 조사하기 위해, 제조예 1의 시험관내 결합 분석시스템을 이용하였다.

로즈마린산 및 그 유도체의 저해 효과를 알아보기 위해서 다양한 농도의 로즈마린산 및 그 유도체를 포스포펩티드 용액과 혼합하여 단백질로 코팅한 마이크로-웰에 더하였고, 바이오틴화 pY 펩티드의 결합을 확인하기 위해서 스트렙타비딘(streptavidin)이 접합된 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)을 사용하였다. 즉, 로즈마린산 및 그 유도체를 0.03∼300 ㎍/㎖ 농도 범위에서 상기 제조예 1의 방법에 따라 Lck의 SH2 도메인과 바이오틴-펩타이드와의 결합에 대한 저해활성을 측정하였다.

도 1의 결과로부터 본 발명의 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 처리함으로써 Lck의 SH2 도메인과 바이오틴-펩타이드와의 결합이 농도의존적으로 저해되었으며, 50% 저해농도 (IC₅₀)는 3 ㎍/㎖임을 알 수 있다.

한편, 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 에틸에스테르, 터뷰틸다이메틸실릴에테르 등 로즈마린산의 유도체와 (S)-로즈마린산을 이용하여 동일한 방법으로 실험하였을 때에도, 상기 유도체와 (S)-로즈마린산은 Lck의 SH2 도메인과 그 특이적 펩타이드 간의 결합을 저해하는 효과를 보였으며, 50% 저해농도는 각각 1, 4, 13, 10 ㎍/㎖ 였다.

실시예 2. T 세포 증식을 일으키는 신호전달계에 대한 억제 효과

하고초로부터 분리된 로즈마린산 및 그 유도체가 Lck SH2 도메인에 대한 결합을 저해하므로, 상기 저해 효과가 T 세포내의 칼슘 이온 흐름에 대해 미치는 영향을 알아 보았다.

항원특이적 T 세포 활성화는 T 세포 수용체 (T cell receptor; TCR)가 매개하는 신호전달과정에 의해 개시되는데, 상기 신호전달과정에는 여러가지 타이로신 키나아제 또는 인산화단백질이 관련되어 있으며, 활성화된 T 세포가 세포 증식으로 이어지는 과정은 IL-2와 IL-2 수용체의 상호작용에 의해 조절된다. 즉, T 임파구의 표면항원(sIg)인 CD3와 CD4에 대한 항체를 처리하면 활성화 자극으로 작용하여 T 임파구가 활성화되고, 이때 세포내 칼슘 이온의 증가가 일어남이 알려져 있다. 또한, 이같은 일련의 과정 중에 Lck가 관련되어 있음이 알려져 있으므로, 로즈마린산 및 그 유도체가 T 임파구 활성화에 따른 세포내 칼슘 이온량의 증가를 저해하는지를 알아보았다.

세포내 칼슘 이온과 결합하여 형광을 내는 물질인 Fura-2/AM (Calbiochem, San Diego, CA, USA)을 처리한 저캣(Jurkat) 세포에 상기 실시예 2에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 10분 처리한 후, 여기에 CD3와 CD4 항체를 처리하면서 세포내 칼슘 이온의 증가를 방출된 형광의 양으로 탐지하였다. 이때, 로즈마린산을 처리하지 않는 것을 대조구로 하고, 로즈마린산의 처리량을 각각 0.5μg, 1μg, 10μg, 50μg으로 하여 세포내 칼슘 이온의 증가를 측정하였으며, 그 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다.

도 2로부터 본 발명에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 처리한 경우 농도의존적으로 세포내의 칼슘 이온의 흐름에 대한 저해활성을 나타냄을 알 수 있다. 또한 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 에틸에스테르, 터뷰틸다이메틸실릴에테르 등 로즈마린산의 유도체와 (S)-로즈마린산을 이용하여 동일한 방법으로 실행한 결과, 이들 화합물의 처리로도 세포내 칼슘 이온의 증가를 막을 수 있었다.

실시예 3. TCR이 유도하는 IL-2 유전자 발현에 대한 억제 효과

상기와 같이 로즈마린산 및 그 유도체가 선택적으로 Lck 기능을 저해하므로 본 발명의 화합물이 T세포 증식을 진행시키는 IL-2 합성을 억제하는지 알아보게 되었다. 본 발명에서는 IL-2 유전자 발현 수준에 관한 로즈마린산 및 그 유도체의 효과를 알아보기 위해 IL-2/루시페라제 리포터 시스템을 이용한다.

IL-2의 프로모터 부위와 루시페라제의 구조유전자 부위를 융합한 플라스미드로 10⁶저캣 (Jurkat) T 세포를 Superfect^TM(Qiagen Inc.)를 이용한 리포터 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 24시간동안 배양한 후, T 세포를 활성화시키기 전에 다양한 시약(로즈마린산, 시클로스포린 A, FK506, LY294002; 각각 8 μM 씩 처리)으로 30분 동안 처리하였다. 5㎍/㎖ anti-CD3 항체(UCHT1, Pharmingen) 또는 anti-CD3 항체(RPA-T4, Pharmingen)로 도포된 35㎜ 접시에서 14시간동안 배양하고 수확함에 의해 T 세포를 활성화시켰다. PMA와 이오노마이신(ionomycin) 자극을 위하여, PMA 5ng/㎖과 500ng/㎖의 이오노마이신을 배양 세포에 첨가하고 14시간 동안 배양하였다. 루시페라제 활성은 Berthold 광도측정기(luminometer) LB953으로 측정하되, 각 실험을 중복하여 3회 실시하여 결정하였다.

로즈마린산은 사이클로스포린 A나 FK506보다 IL-2 합성에 대한 저해활성이 우수했다 (도 3 참조). 한편, 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 에틸에스테르, 터뷰틸다이메틸실릴에테르 등 로즈마린산의 유도체와 (S)-로즈마린산을 이용하여 동일한 방법으로 루시페라제 활성을 조사한 결과, 로즈마린산과 비교할 때 모두 유사한 저해 활성을 보였다 (도 4 참조). 이와 같이 로즈마린산 및 그 유도체가 T 세포 활성을 효과적으로 억제하므로, 이식거부증상과 GVHD 뿐만 아니라 자기면역 질환이나 만성 염증성 질환과 같은 T 세포 매개성 반응에 관련된 병을 예방하거나 치료하는데 로즈마린산 및 그 유도체가 이용될 수 있다.

실시예 4. T 세포 증식에 대한 억제 효과

Lck는 T 세포 활성화 및 증식을 일으키는 T 세포 특이적 타이로신 키나아제이기 때문에, 본 발명에서는 로즈마린산 및 그 유도체의 T 세포 증식에 대한 억제 활성을 시험해 보았다. 하기에 설명한 혼합 임파구 반응 (Mixed Lymphocyte Reaction, 이하 "MLR"이라 약칭함) 시험에 의해 본 발명의 화합물이 면역세포의 반응을 억제하는 능력이 있음을 알 수 있다. MLR은 이식자와 피이식자 사이의 이식 적합성을 결정하는데 이용되는 반응으로서 (Park and Good, 71쪽, 이식조직 적합검사와 기관이식, 1973, 아카데믹 프레스 Inc.,NY), 서로 다른 두 종 또는 계열의 생체에서 분리한 임파구를 혼합하여 면역 반응을 야기한 후 이들의 세포성장 속도를 측정하여 면역 반응의 활성 정도를 나타낸다.

Balb/c 마우스와 C57BL/6 마우스로부터 분리된 비장 세포 (1×10⁵splenocytes/well)를 혼합하고 가습 인큐베이터 내에서 37℃로 배양하였다. 5일째에, [메틸-³H]-티미딘(0.5μCi/웰)을 배양세포에 첨가하고 다음날 배양세포 속으로의 흡입량 (incorporation amounts)를 측정하였다. 상기한 과정동안, 시클로스포린 A, 로즈마린산, (S)-로즈마린산 또는 로즈마린산의 유도체를 처리하였다.

본 발명에서 이용되는 로즈마린산은 투여량에 비례하여 T 세포 증식을 10^-1내지 1000nM 범위에서 억제하였고 (도 5 참조), 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 에틸에스테르, 터뷰틸다이메틸실릴에테르 등 로즈마린산의 유도체와 (S)-로즈마린산의 경우에도 1 nM 에서부터 T 세포 증식을 억제하였다.

MLR은 시험관내 (in vitro) 면역 반응이며, 로즈마린산과 로즈마린산의 유도체에 의해 MLR 면역 반응이 억제되었다는 것은 로즈마린산 및 그 유도체가 생체내 (in vivo)에서도 면역억제 활성이 있음을 암시하므로, 본 발명의 화합물은 장기이식거부 증상과 GVHD을 방지하는데 효과적이다. 따라서, 로즈마린산 및 그 유도체는 상기 질환을 치료하는데 효능이 있다.

실시예 5. 생체내 면역반응에 대한 억제 효과

로즈마린산 및 그 유도체가 생체내 면역억제 활성을 가지고 있다는 사실을 밝히기 위해, DNFB (2,4 - dinitrofluorobenzene) 접촉에 대한 과민반응을 수행하였다. 동물을 이용한 접촉 민감반응 모델은 항염증제의 약학적 스크리닝이나 자가면역 질환의 치료를 위하여 여러 실험실에서 일상적으로 수행하고 있다.

접촉 감수성 반응의 감작 및 유도는 Scheynius 등의 방법으로 수행하였으며 (Scheynius et al., 1804, JI), 그 절차는 다음과 같다. 8주령의 Balb/c 자성 마우스의 복부 피부에서 털을 제거한 뒤, 4:1 아세톤:올리브유 (시그마화학 Co.)에 녹인 20㎕ 0.5% DNFB (시그마화학 Co.)를 이틀에 걸쳐 피부에 바르고, 4일 후 같은 부형제에 녹인 10㎕의 0.2% DNFB를 마우스의 양쪽 귀 양면에 투여하였다. 시클로스포린 A와 로즈마린산을 5일간 표시된 양으로 근육내 투여한 후, 24시간 후에 귀의 두께를 공학용 마이크로미터 (미투토요 Co. Mfg. Ltd., 동경)로 측정하였으며, 귀의 부풀림의 억제 정도로 로즈마린산과 시클로스포린 A의 면역억제 활성을 추정하였다.

유도단계 6일동안 연속적으로 로즈마린산(5-50㎎/㎏/day)를 처리하면, DNFB에 의한 접촉 민감성이 억제되었다. 시클로스포린 A 또한 반응의 억제 활성을 보여주었다 (도 6 참조). 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 에틸에스테르, 터뷰틸다이메틸실릴에테르 등 로즈마린산의 유도체와 (S)-로즈마린산으로 접촉 민감성 억제 반응을 실시한 경우에도, 그 투여량에 비례하여 억제효과를 보였다. 결론적으로 로즈마린산 및 그 유도체는 생체내에서 보조 T 세포 (helper T cell)의 기능과 기억 T 세포 (memory T cell) 형성을 억제할 수 있다.

상기 표준 약리학 실험의 결과를 근거로 하여, 본 발명의 화합물은 심장, 신장, 간장, 골수 및 피부 이식 등의 이식거부 증상; 루푸스, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 건선과 같은 자가면역 질환; 피부염, 습진, 지루, 염증성 장 질환 같은 염증성 질환; 및 진균 감염 등의 치료에 유용하다.

실시예 6. 이식거부 반응에 대한 억제 효과

면역 억제를 야기하는 로즈마린산 및 그 유도체의 효능은 이식 피부의 생존 시간을 측정하는 생체내 표준 약리 테스트 과정으로 확인될 수 있다.

동종이식 거부반응은, 동종이계 C57BL/6(H-2b) 마우스 꼬리 피부를 Balb/c(H-2d) 마우스에 이식함으로서 수행하였다. 로즈마린산 및 그 유도체는 이식한 날부터 거부하는 날까지 근육내(i.m) 투약하였으며, 시클로스포린은 실험대조군으로 이용하였고 처리를 하지 않은 쥐는 거부대조군으로 이용하였다. 꼬리 피부를 2.0×2.0 ㎝ 넓이로 절단하여 피이식마우스의 가슴 측면에 이식하고 살균된 살균용거즈로 덮어 놓았다. 이후 가슴 전체를 부드러운 붕대로 감아놓았다. 로즈마린산, 그 유도체 (15㎎/㎏/day) 또는 시클로스포린 A (50㎎/㎏/day)를 리포솜제의 형태로 근육내 투여하되, 매일 피이식마우스에 거부전까지 투여하였다. 6일째에 붕대를 제거한 후 피부이식 조직을 매일 관찰하였으며, 거부반응의 정의는 이식된 상피조직의 90% 이상이 괴사한 것으로 하였다.

표 1에서 볼 수 있는 바와같이 부형제 처리만 한 대조군에서는 동종 이식의 거부 반응이 7일째에 시작되었으며 9일째에는 동종이식조직의 약 50%가 거부되었다. 15㎎/㎏/day 양의 로즈마린산 및 그 유도체는 피부이식 생존을 상당히 연장하는 효과를 보여주었다. 평균생존기간은 대조군에서 9.6일이었으며 15㎎/㎏/day 양의 로즈마린산을 처리한 실험군에서는 14.0일이었다 (P<0.01). 본 시스템에서 50㎎/㎏/day 양의 시클로스포린 A 또한 상기한 결과와 유사하게 효과적이다 (평균생존기간 13.4일). 상기 생체내 표준 약학적 실험의 결과에 따르면, 로즈마린산 및 그 유도체 처리는 면역 억제를 야기하여 피부이식 거부를 방지한다.

또한 본 발명에서 이용되는 로즈마린산은 시클로스포린 A와 함께 사용하면 생체내 피부이식 거부를 방지하는데 더욱더 효과적이다. 이와 같이 로즈마린산을 시클로스포린 A와 함께 사용하여 투여량을 줄이게 되면, 면역억제요법에서 부작용을 막을 수 있다.

면역저해제	투여량 (mg/kg/day)	이식조직의 생존기간 (days)	평균생존기간 ± 표준편차 (days)
부형제 (대조구)	-	7, 9, 10, 10, 11	9.4 ± 1.5
시클로스포린 A	50 (p.o.)	13, 14, 14, 14, 14	13.8 ± 0.5
시클로스포린 A	50 (i.m.)	13, 13, 13, 14, 14	13.4 ± 0.5
로즈마린산	25 (i.m.)	16, 17, 18, 18, 25	18.8 ± 3.6
로즈마린산	15 (i.m.)	13, 13, 14, 15, 15	14.0 ± 1.0
로즈마린산의 이소프로필에스테르	15 (i.m.)	13, 13, 13, 15, 17	14.2 ± 1.8
로즈마린산의 에틸에스테르	15 (i.m.)	12, 14, 14, 15, 17	14.4 ± 1.8
로즈마린산의 터부틸다이메틸에테르	15 (i.m.)	12, 12, 13, 13, 16	13.2 ± 1.6
(S)-로즈마린산	15 (i.m.)	13, 14, 15, 15, 17	14.8 ± 1.5
시클로스포린 A + 로즈마린산	17 + 10 (i.m.)	14, 14, 15, 15, 17	15.0 ± 1.4

실시예 7. 이식조직에서 증가하는 사이토카인 유전자 발현에 대한 억제 효과

동종이식 조직에서는 높은 수준으로 사이토카인 유전자가 발현된다. 로즈마린산이 면역억제 치료에 사용될 수 있고 상기 사이토카인이 증가됨으로써 유발되는 기타 질환에도 사용될 수 있는지 확인하기 위해, 상기 사이토카인 유전자 발현에 대한 로즈마린산의 억제효과를 RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) 방법으로 조사하였다. C57BL/6 마우스로부터 Balb/c 마우스로 하피막 신장(subcapsular kidney)을 이식하고, 로즈마린산 (25 mg/kg/day) 또는 시클로스포린 A (50 mg/kg/day)를 7일간 근육내 주사하여 그 효과를 알아보았다. 이식 후 7일째에 마우스를 희생시켜 신장 이식조직으로부터 총 세포내 RNA를 분리하였고 이를 다양한 사이토카인 mRNA의 발현 분석에 이용하였다. 반정량적 (semiquantitative) PCR 방법으로 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 및 IFN-γ의 시간별 mRNA 수준을 분석하되, PCR 산물의 수준은 β-actin mRNA의 대조구로서 보정하였다.

RT-PCR 분석을 이용하여 사이토카인 전사체 수준을 분석한 결과, 로즈마린산은 동종이식 조직에서 IL-2, IL-4, IFN-γ, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 전사를 두드러지게 억제한 반면, 사이클로스포린 A는 IL-2, IFN-γ 및 IL-1β의 발현을 억제하였다 (도 7 참조). IL-4 및 IL-6 유전자의 발현은 로즈마린산에 의해 상당히 저해되었으나, 사이클로스포린 A에 의해서는 저해되지 않았다. 즉, 로즈마린산은 Th1 사이토카인 및 Th2 사이토카인 발현을 모두 억제하는 반면 사이클로스포린 A는 주로 Th1 사이토카인을 억제한다.

사이토카인이 증가됨으로써 유발되는 기타 질환에도 사용될 수 있음을 암시한다. 상기 결과에 따라서, 이식거부반응이나 T 세포 매개성 면역약리현상에 관련된 다양한 면역반응에 대해 효과를 갖는 유망한 면역억제제로 로즈마린산을 사용할 수 있다.

하피막 신장 이식 기술을 이용하여, C57BL/6 마우스의 신장 절편을 이인자형 (allogeneic) Balb/C 마우스에 이식하였다. 이식 후에 로즈마린산 (25 mg/kg/day) 및 시클로스포린 A (50 mg/kg/day)를 올리브유 (시그마)와 함께 조제한 것을 7일간 매일 근육내 주사하였다.

로즈마린산 (25mg/kg/day)를 7일간 처리한 피이식 마우스로부터 신장 이식조직을 제거하여 즉시 액체질소로 얼렸다. 이식조직에서 총 RNA를 TRIZOL LS 시약 (Life Technologies)을 이용하여 다음과 같이 분리하였다. 즉, 클로로포름을 이식조직에 더하여 15분간 상온에서 방치한 후, 페놀/클로로포름으로 추출하고 이소프로파놀로 핵산을 침전시켰고, 이와 같이 분리된 총 RNA는 분광광도측정하여 정량화하였다.

이식조직에서 분리된 1㎍ 총 RNA와 Titan^TMone tube RT-PCR system (BM사 제품)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 RT-PCR을 수행하였다. PCR은 50㎕ 부피에서 수행하였고 반응액의 조성은 1×RT-PCR 완충액 (Mg²⁺함유), 0.2mM dNTP, 10U RNase 저해제, 효소 혼합액 (AMV 및 Expand^TMHigh Fidelity PCR-System), 5mM DTT 및 0.4μM의 적당한 프라이머 조합으로 하였다. IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-1β 및 β-액틴에 대한 프라이머 서열은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 서열 번호 9 및 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12에 기재되어 있고, 그 어닐링 온도 (annealing temperature)는 각각 52℃, 52℃, 52℃, 52℃, 52℃, 56℃였다. IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-1β 및 β-액틴에 대한 PCR 산물의 크기는 각각 226, 222, 229, 336, 320, 568 bp였다. 증폭 주기의 수는 25회로 하였으며, PCR 산물 15㎕를 2% 아가로스젤에 전기영동한 후, 증폭된 DNA 절편을 이티디움 브로마이드 (EtBr)로 염색하여 분석하였다.

실시예 10. 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험

로즈마린산 및 그 유도체의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 로즈마린산 및 그 유도체 (1 g/㎏)를 리포솜제의 형태로 단회 근육내 주사하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 주사 투여 시 1 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 주사 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 1 g/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산과 그 유도체는 Lck의 SH2 도메인을 저해한다. 그 결과, 로즈마린산 및 그 유도체는 면역반응으로 야기되는 T 세포 내부의 칼슘 신호전달과정에 영향을 미치고, 세포내 IL-2 유전자 발현을 억제하며, 시험관내 및 생체내 면역반응을 저해하며, 동물에서의 동종이식 거부반응 및 이식조직에서의 사이토카인 유전자 발현을 억제한다. 따라서, 본 발명의 로즈마린산 및 그 유도체는 Lck의 SH2 도메인 또는 Src계 단백질 타이로신 키나아제의 SH2 도메인을 억제하거나 다양한 사이토카인의 합성이 매개하는 면역반응 등을 억제하는데 유용하게 사용할 수 있을 뿐 아니라, 장기이식거부 증상, 자가면역 증상, 염증 등을 완화하는데 사용할 수 있고, T 임파구에 특이적인 단백질인 Lck의 기능을 저해하므로 투여 시 부작용이 적다.

Claims (15)

1. 로즈마린산 또는 로즈마린산의 유도체를 유효성분으로 하는 면역억제제용 또는 SH2 도메인 저해제용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 로즈마린산은 로즈마린산 라세미체, (R)-로즈마린산 또는 (S)-로즈마린산인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 로즈마린산의 유도체는 로즈마린산의 이소프로필에스테르, 로즈마린산의 에틸에스테르 또는 (S)-로즈마린산의 터뷰틸다이메틸실릴에테르인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 하고초 (Prunella vulgaris) 추출물을 유효성분으로 하는, 면역억제제용 또는 SH2 도메인 저해제용 약학적 조성물.
5. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 장기 또는 조직의 이식 거부반응, 만성 이식거부반응, 이식편-대-숙주 질환 (graft-versus-host disease)의 치료, 진단, 또는 예방을 목적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 이식되는 장기 또는 조직은 신장, 심장, 간장, 폐, 골수, 췌장, 각막, 소장, 피부 및 심장 판막을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 자가면역 질환의 치료, 진단 또는 예방을 목적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 자가면역 질환은 루푸스, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 중증 근무력증, 다발성 경화증을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
9. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 유효성분은 인터루킨-1β의 합성 또는 분비를 억제하여 백혈병, 간염, 연골 흡수 상승 (increased cartilage absorption), HIV 감염, 알츠하이머 질환, 근육 쇠약, 뇌막염, 미소세균 감염, 혈전증, 동맥경화성 침착 (arteriosclerotic deposition), 지방 수준 상승, 또는 관절 파괴로 고통받는 인간 또는 동물을 치료하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
10. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 유효성분은 인터루킨-4의 합성 또는 분비를 억제하여 백혈병, 간염, 연골 흡수 상승 (increased cartilage absorption), HIV 감염, 알츠하이머 질환, 근육 쇠약, 뇌막염, 미소세균 감염, 혈전증, 동맥경화성 침착 (arteriosclerotic deposition), 지방 수준 상승, 또는 관절 파괴로 고통받는 인간 또는 동물을 치료하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
11. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 유효성분은 인터루킨-6의 합성 또는 분비를 억제하여 백혈병, 간염, 연골 흡수 상승 (increased cartilage absorption), HIV 감염, 알츠하이머 질환, 근육 쇠약, 뇌막염, 미소세균 감염, 혈전증, 동맥경화성 침착 (arteriosclerotic deposition), 지방 수준 상승, 또는 관절 파괴로 고통받는 인간 또는 동물을 치료하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, SH2 도메인은 임파구 세포 키나아제 (Lck)의 일부분인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기에 더하여 하나 이상의 면역억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 면역억제제는 시클로스포린 A 및 그 유도체, FK506 및 그 유도체, 마이코페놀산 및 그 2-(N-모폴리노) 에틸에스터, 마이코페놀산 모페틸, 아자티오프린, 코르티코스테로이드, 레플루노미드, 시클로포스파미드, 라파마이신, OKT3, ATG, 15-디옥시스퍼구알린, 미조리빈, 미소프로스톨, 메토트렉세이트, 인터루킨-2 수용체에 대한 항체, 및 임파구/흉선세포에 대한 혈청으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 1) 하고초를 메탄올에 침지시킨 후 방치하여 활성물질을 추출하는 단계;

    2) 메탄올 추출물을 감압건조하고 에틸아세테이트로 용매추출하여 활성분획을 얻는 단계;

    3) 감압농축된 활성분획을 칼럼 크로마토그라피법을 통해 정제하되, 클로로포름과 메탄올 혼합용매로 비활성분획을 용출제거하고, 클로로포름과 메탄올 혼합용매로 활성물질을 용출하는 단계;

    4) 용출된 활성분획을 메탄올을 전개용매로 하여 크로마토그라피법을 통해 활성분획을 모으는 단계;

    5) 메탄올과 인산 혼합용매로 크로마토그라피법을 통해 활성분획을 모으는 단계; 및

    6) 메탄올과 인산 혼합용매로 크로마토그라피법을 통해 로즈마린산을 얻는 단계를 포함하는 하고초로부터 로즈마린산을 분리정제하는 방법.