KR20000070460A - 메토트렉세이트와 공동으로 내성화를 사용한 자기면역질병의 치료 - Google Patents
메토트렉세이트와 공동으로 내성화를 사용한 자기면역질병의 치료 Download PDFInfo
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Abstract
점막으로 투여가능한 방관자 항원과, 경구로, 장내로, 또는 비경구로 투여가능한 메토트렉세이트의 배합을 사용하여 약학제제를 제조하고 자기면역질병을 치료나 예방한다. 방관자 항원및 메토트렉세이트의 양은 공동으로 자기면역질병에 관련된 자기면역반응의 억제에 유효한 양이다.
Description
자기면역질환의 특징은 정상적인 자가조직에 대한 비정상적인 면역반응이다.
관련 면역반응(response)(또는 면역 반응(reaction))에 기초하여, 포유동물에서 자기면역질환은 일반적으로 다음 두가지 분류중 하나로 구분된다: 세포-매개성(즉, T-세포 매개성) 또는 항체-매개성(즉, β세포 매개성) 질환. T-세포 매개성 자기면역질환의 비제한적 예로는 다발성 경화증(MS), 류마티스 관절염(RA), 당뇨병 (아동-개시 또는 유형 I 당뇨병) 및 자기면역 포도막염(uveoretinits_을 포함한다. 항체-매개성 자기면역질환으로는 중증관절무력증(MG), 자기면역 갑상선염 (AT), 및 전신 낭창 홍반 (SLE)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
현재 비정상적인 면역반응만을 선택적으로 억제할 수 없는 약물, 즉 비특이적인 방식으로 전신에 면역반응을 억제하는 약물로 자기면역질환의 두 부류를 치료하고 있다. 그러한 약물중 하나는 메토트렉세이트이며, 메토트렉세이트는 성장속도가 빠른 세포만을 선택적으로 저해하는 생물학적 반응 개질제이다. 그러나, 메토트렉세이트는 상당한 독성과 다른 부작용을 가지며, 결국 치료대상에서 "전신 (global)" 면역억제를 유도한다. 즉, 정상적인 과정으로 메토트렉세이트를 장기간 치료하면 병원체에 대한 정상적인 보호 면역반응을 저하(downregulation)시킴으로써, 감염의 위험성을 증가시킨다. 추가로, 치료로 인해 장기간 전신 면역억제가 환자에서는 악성, 간, 및 신장의 기능장애(failure)와 같은 심각한 의학적 합병증의 발생위험이 증가된다.
자기면역질환을 치료하기 위해서, 메토트렉세이트는 정상적으로 고복용량, 예를 들면, 7.5 내지 25mg으로 일주일에 1회 투여한다. 상기 치료는 류마티스 관절염에 일반적으로 사용되며, 다발성 경화증을 치료하는데 효과적이다(Goodkin et al., Ann. Neurology. 37:30, 1995). 경구 투여가 가장 흔한 방식이지만, 메토트렉세이트는 또한 이러한 치료용으로 비경구 투여용을 구입할 수 있다.
최근에, 자기면역질환(그리고 타가이식 거부 및 레트로바이러스-관련 신경학상 질환과 같은 T-세포 매개성 관련 염증 질병)의 치료에 유용한 새로운 방법과 새로운 약학 제제가 발견되었다. 내성화제 자기항원, 방관자(bystander)항원, 또는 자기항원 또는 방관자 항원의 질병-억제 단편이나 동족체를 경구나 흡입과 같은 점막으로 투여하는 방법은 내성을 유도한다. 이러한 치료는 다음의 문헌에 기재되어 있다.
1993년 2월 25일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US93/01705, 1991년 3월 4일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/01466, 1990년 12월 17일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US90/03989, 1991년 10월 10일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/07475, 1993년 8월 17일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US93/017786, 1993년 9월 24일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US93/09113, 1991년 10월 31일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/08143, 1991년 3월 29일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/02218, 1993년 4월 9일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US93/03369, 1991년 10월 15일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/017542.
TGF-β 및/또는 IL-4과 IL-10자기항원(이들 분자의 면역우세성 에피토프 영역을 포함하는 이들의 단편)을 정맥조사로 투여함으로 인해, 클론의 면역성결핍 (클론성 아네르기(anergy)라고 불리는 기작으로 면역억제를 유도한다. 클론의 면역성결핍은 구체적인 항원에 특이적인 면역 공격 T-세포의 불활성화를 유도한 결과, 이 항원에 대한 면역반응이 상당히 감소한다. 따라서, 어떤 자기항원에 특이적인 자기면역반응-촉진 T-세포가 일단 결핍되면, 그 항원에 대해서는 더 이상 증식(proliferation)이 되지 않는다. 이러한 증식 감소는 또한 자기면역질환 증상(MS에서 관찰되는 신경조직 손상등)의 원인이 되는 면역반응을 감소시킨다. 또한, 단일 투여량 및 "활성적 억제(active suppression)"를 개시하는 양보다 실질적으로 다량의 자기항원(또는 면역우세성 단편)은 면역성 결실( 또는 클론 결실)을 통한 내성을 유도할 수 있다. 또한 활성적 억제에 의해 진행되는 치료방법이 개시되어 있다. 활성 억제는 클론의 면역성 결실의 것과는 다른 기작으로 작용한다. 이 방법은 PCT/US93/01705에 자세히 논의되어 있으며, 자기면역 공격하에 있는 어떤 조직에 대한 특이적인 항원의 경구 또는 점막투여를 포함한다. 이들은 "방관자 항원"이라고 부르며, 다음에서 정의된다. 이 치료는 조절 (서프레서)T-세포를 소화관-관련 림프조직(GALT), 기관지 관련 림프조직(BALT), 가장 일반적으로는 점막 관련 림프조직(MALT)(MALT는 GALT와 BALT를 포함한다)에서 유도시킨다. 이러한 조절세포들은 혈액이나 림프조직에서 방출되어 자기면역질환에 걸린 조직이나 기관으로 이동하여 병든 조직이나 기관의 자기면역 공격을 억제한다. 방관자(이들은 유도에 사용된 방관자 항원의 하나이상의 면역 결정소(determinant)를 인식한다)에 의해 유도된 T-세포는 자기면역 공격의 부위로 표적화되어 거기서 형질전환 성장인자 베타(TGF-β), 인터루킨-4 (IL-4) 및/또는 인터루킨-10 (IL-10)과 같은 어떠한 면역조절인자 및 사이토키닌의 국소적 방출을 조절한다. 이들 중에서, TGF-β는 항원-비특이적 면역억제 인자이며, 발병을 개시한 항원에 관계없이 면역공격을 억제한다. (그러나, 방관자항원에 의한 경구나 점막 내성화는 자기면역 발명의 부위에서 TGF-β의 방출만을 야기하기 때문에, 전신의 면역억제를 보장할 수 없다.)
IL-4 및 IL-10은 또한 항원-비특이적인 면역조절 사이토키닌이다. 특히, IL-4는 Th2반응을 증가시켜, 즉 T-세포 전구체로 작용하여 Th1세포를 희생하고 T-세포 전구체가 Th2 세포로 우선적으로 분화되게 한다. IL-10은 Th1 반응의 직접적인 저해자이다. 방관자항원으로 자기면역질환에 걸린 포유동물을 경구로 내성화한 후에, 증가된 수준의 TGF-β, IL-4, IL-10가 자기면역 발병에서 관찰된다(Chen, Y. et al., Science, 265: 1237-1240, 1994). 방관자 억제 기작이 von Herreth et al., J. Clin. Invest., 96:1324-1331, September 1996에 기재되어 있다.
또한, 유형 I 인터페론 유형 I 인터페론의 활성을 갖는 폴리펩타이드를 단독으로 또는 자기항원이나 방관자 항원의 경구나 점막투여와 함께 경구 또는 비경구 투여는 자기면역질환의 증후를 감소시키는데 유효하다. 유형 I (α또는 β) 인터페론의 부분최적 투여량은 자기항원 및 방관자 항원의 내성화 효과를 증가시킨다. 이러한 연구는 PCT출원 제 PCT/US95/04120에 자세히 기재되어 있다. 유형 I 인터페론, 특히 IFN-β은 면역조절능, 예를 들면, 감마-인터페론(IFN-γ) 의 활성 저해등을 갖는 것으로 알려져 있다. IFN-γ는 MS를 악화시키는 것으로 나타났고 MS손상의 발병에 관련되는 것 같다. 따라서, IFN-β는 T-세포에 의한 IFN-γ의 발현을 그 능역으로 부분적으로 저해하는 유리한 효과를 가지는 것 같다.
1995년 7월 4일에 출원된 PCT/US95/14512는 자기항원이나 방관자항원을 사용하는 경구 내성화와 관련된 Th-2-향상 사이토키닌의 용도를 개시하고 있다.
그러나, 상기 특허출원중 어느 것도 메토트렉세이트 치료와 결합한 내성화의 어떠한 형태도 개시하고 있지 아니하다. 또한 본 발명의 전에, 세포분열을 저해하는 메토트렉세이트가 자기면역질환의 치료에서 점막 내성을 조절하는데 관련된 세포를 저해하는 것에 대해서는 알려져 있지않다.
본 발명의 한가지 목적은 자기면역질환의 치료에 독성이 적은 양의 메토트렉세이트를 투여하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 1회 투여량을 감소시키기 위해서 더 자주 메토트렉세이트를 투여하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 메토트렉세이트 단독 투여 또는 내성화제 단독으로 경구, 더욱 일반적으로는 점막 내성화보다는 더 효과적인 자기면역질환의 치료를 제공하는 것이다.
발명의 요약
일예에서, 본 발명은 자기면역질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 방관자항원의 점막 투여를 포함한다. 또한 이 방법은 메토트렉세이트의 경구, 장내, 또는 비장내 투여를 포함한다. 방관자항원 및 메토트렉세이트의 양은 자기면역질환과 관련된 자기면역 반응억제와 관련하여 효과적인 양이다. 또다른 일예에서, 본 발명은 자기면역질환을 치료하기 위한 경구 또는 장내 투여용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 배합물은 방관자항원과 메토트렉세이트을 자기면역질환과 관련된 자기면역반응의 억제에 효과적인 양으로 메토트렉세이트와 방관자항원을 포함한다.
또다른 일예에서, 본 발명은 자기면역질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 자기항원의 점막 투여에 관련된다. 또한 메토트렉세이트의 경구, 장내, 또는 비경구 투여도 관련된다. 자기항원과 메토트렉세이트의 양은 상기 질병에 관련된 자기면역반응을 억제에 유효한 양이다.
또다른 일예에서, 본 발명은 자기면역질환을 치료하기 위해 경구 또는 장내 투여용 약학 배합물에 관한 것이다. 이 배합물은 자기면역질환과 관련된 자기면역반응의 억제와 관련하여 자기항원과 메토트렉세이트의 효과적인 양으로, 자기항원과 메토트렉세이트를 포함한다.
본 발명은 내성화에 의해 자기면역질환의 치료 분야에 관한 것이다. 또한 본 발명은 메토트렉세이트의 투여에 의한 자기면역질환의 치료 분야에 관한 것이다.
도 1은 최적 또는 부분-최적 투여량으로 투여된 메토트렉세이트의 EAE 임상 점수에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 2는 최적투여량으로 투여된 메토트렉세이트 또는 1mg 투여량으로 투여된 MBP의 EAE 임상점수에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 3은 최적투여양으로 단독으로 투여된 메토트렉세이트와 비교하여, MBP와 함께 최적투여량으로 투여된 메토트렉세이트의 EAE 임상점수에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 4는 각각의 단독투여와 비교하여, 40 ㎍의 부분-최적 투여량으로 메토트렉세이트 및 1mg투여량으로 MBP를 함께 투여한 경우에 이들이 EAE 임상점수에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 5는 각각의 단독투여와 비교하여, 20 ㎍의 부분-최적 투여량으로 메토트렉세이트 및 1mg투여량으로 MBP를 함께 투여한 경우에 이들이 EAE 임상점수에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 6은 경구 메토트렉세이트와 경구 유형II 콜라겐의 배합물 (비워진 마름모) 또는 경구 유형II 콜라겐 단독(채원진 네모) 투여한, 임상연구 8주에 개시된 류마티스 관절염 환자에서 부은 관절수를 측정한 것을 보여주는 그래프이다.
도 7은 경구 메토트렉세이트와 경구 유형II 콜라겐의 배합물 (비워진 마름모) 또는 경구 유형II콜라겐 단독(채원진 네모) 투여한, 임상연구 8주에 개시된 류마티스관절염 환자에서 연한 관절수를 측정한 것을 보여주는 그래프이다.
도 8은 유형 II콜라겐 단독 도는 유형 II콜라겐 및 메토트렉세이트의 배합물을 투여한 환자에 있어서 축적 파울루스 20 반응(cumulative Paulus 20 response)을 달성한 환자의 퍼센트를 나타낸다.
메토트렉세이트의 경구나 비경구 투여와 함께, 방관자항원(자기항원)의 경구, 또는 더욱 일반적으로는 점막투여의 결과가 각각의 단독 치료의 효과에 비해 자기면역반응의 억제가 실질적으로 증가된다는 것이 발견되었다.
일예에서, 본발명에 의해 본 발명 이외에서 필요한 양(부분최적 투여량)보다 더 적은 양으로 메토트렉세이트를 자기면역질환의 치료에 투여할 수 있다. 이것은 메토트렉세이트의 높은 독성을 고려하면 매우 유리한 것이다. 따라서, 예를 들면, 메토트렉세이트와 MBP의 배합물의 억제효과가 각자 단독 투여시보다 더 효과적임을 발견하였다. 메토트렉세이트가 세포분열을 저해한다고 알려져 있을 지라도, 점막 내성화에 의한 메토트렉세이트가 치료를 방해하지 않는다. 즉 메토트렉세이트는 내성하에 의해서 자기면역질환의 치료를 조절하는 세포에 치명적인 영향을 미치지 않는다. 더욱이, 내성화제의 투여가 메토트렉세이트의 저해효과를 방해하지 않는 것을 발견하였다.
더욱이, 메토트렉세이트의 투여와 관련된 "리바운드(rebound)" 효과가 감소될 수 있다. EAE 래트와 사람에서 메토트렉세이트를 투여한 결과, 억제에 이어서 질병의 리바운드를 가져왔다(투여 과정이 완료된 후에). MBP와 메토트렉세이트의 배합은 리바운드 효과가 없었다. 따라서, 메토트렉세이트의 투여는 점막 내성화의 이러한 장점을 방해하지 않는다.
추가로, 메토트렉세이트와 내성화제의 배합으로 종종 매 투여당 감소된 투여량으로 투여할 수 있다는 것을 알았다. 일반적으로 자기면역질환을 치료하기 위해서 메토트렉세이트를 고투여량으로 일주일에 1회 투여하는 반면에, 본 발명의 배합물은 더 낮은 투야량으로 일주일에 3회 투여한 경우에 효과적임을 알았다. 상술한 바와 같이, 본 발명에 따라 전체적으로 적은 투여량으로 투여함으로써 독성을 감소시킬 수 있다. 일주일동안 일정간격으로 세부류 형태로 더 적은 양을 투여함으로써 추가로 독성을 감소시킬 수 있다.
따라서, 예를 들면, 자기면역 질환의 치료를 위해 메토트렉세이트 그자체가 일반적으로 일주일에 10mg의 최적 투여량으로 투여된다면, 유효량의 내성화제와 함께 일주일에 3회 약 3mg인 투여량의 메토트렉세이트를 투여하는 것이 가능하다. 또는, 유효량의 내성화제와 함께, 부분최적 투여량, 예컨대 5mg을 일주일에 1회 투여할 수 있다. 또는, 유효량의 내성화제와 함께 일주일에 3회 부분최적 투여량인 2mg으로 투여할 수 있다.
본 발명은 메토트렉세이트로 자기면역 조건의 치료를 향상시켰으며, 또한 경구 (또는 점막) 내성화에 의해서 자기면역질환의 치료를 향상시켰음을 보여준다.
정의
본명세서에서 사용된 용어는 아래와 같은 의미를 가진다:
"방관자항원" 또는 "방관자(bystander)"라 함은 (i) 자기면역 공격을 받는 조직이나 기관에 특이한 성분이나, 이로부터 유래된 단백질, 단백질 단편, 펩타이드, 당단백질, 또는 다른 면역성 물질 (즉, 면역반응을 일으킬 수 있는 물질); ii)경구 또는 장내 투여시에 면역억제 공격하에 있는 조직이나 기관에서 분비되는 하나 이상의 항원-비특이적 면역억제 인자 또는 면역조절 사이토키닌(예, TGF-β, IL-4, 또는 IL-10)을 야기하여 자기면역파괴를 일으키는 면역공격을 억제하는 조절 (억제)T-세포(이는 CD4+, CD8+ 유형일 수 있다)를 일으키는 단백질, 단백질 단편, 펩타이드, 당단백질, 또는 다른 면역성 물질 (즉, 면역반응을 일으킬 수 있는 물질)이다. 이 용어는 자기면역 공격에 관련된 자기항원이나 자기항원의 단편에 한정되는 것은 아니다. 추가로, 상기 용어는 자기면역 조직파괴의 결과로 자기면역 공격부위에 노출된 면역 시스템에 일반적으로 나타나지 않는 항원을 포함한다. 예로는 히트쇼크(heat shock) 단백질이 포함되며, 이는 구체적인 조직에 특이적이지 않지만 면역시스템과의 접촉으로부터 일반적으로 보호된다.
"방관자 억제"는 자기면역 파괴에 기여하는 세포의 자기면역공격 부위에서의 억제를 말한다; 이 억제는 방관자 항원의 섭취 (또는 흡입)에 의해서 유발되어 자기면역파괴에 기여하는 세포가 나타나는 자리로 이동되는 서프레서 T-세포로부터 하나이상의 면역억제인자(Th-2 인핸싱 사이토키닌 및 Th-1 저해 사이토키닌)의 방출에 의해서 조절된다. 상기 결과는 항원-비특이적이나, 조직파괴에 원인이 되는 자기면역반응의 국소적으로 제한된 다운레귤레이션이다.
"자기면역질환 (autoimmune disease)"는 본명세서에서 사람을 포함한 포유동물의 면역시스템의 자발적인 또는 유도된 기능장애로 정의되며, 여기서 면역시스템이 포유동물 및/또는 자가물질 중에서 외부 면역성 물질과 구별을 하지 못하여, 이들이 외부물질인 것과 마찬가지로 자가조직 및 물질을 처리하고 이들에 대한 면역반응을 일으킨다. 이 용어는 사람의 자기면역질환 및 이들에 대한 동물 모델을 포함한다.
"자기항원(autoantigen)"이라 함은 자기면역질환에서 면역시스템에 의해 주요한 공격 표적이 되는 포유동물내의 정상적으로 발견되는 어떠한 물질 또는 이들의 단편을 말한다. 이 용어는 또한 포유동물에 투여시에 자기면역질환의 특성을 갖는 상태를 유도하는 항원성 물질을 포함한다. 추가로, 이 용어는 자기항원의 면역우세성 에피토프 또는 이들의 면역우세성 영역으로 본질적으로 이루어지는 펩신의 서브클래스를 포함한다. 유도된 자기면역 상태에서 상기 질환을 유도하기 위해서, 전체대신에 자기항원의 단편이 사용될 수 있다. 자기면역질환을 갖는 사람에서, 자기항원의 면역우세성 에피토프나 그 영역은 자기면역 공격하에 있는 조직이나 기관에 특이적이고 자기면역 공격 T-세포의 실질적인 퍼센트(예, 절대다수일 필요는 없으나 대다수)에 의해 인식되는 항원의 단편이다.
"치료(treatment)"는 자기면역공격의 감소 및 자기면역 조직파괴의 방지나 둔화에 의해서, 자기면역질환의 징후가 나타난 이후에 치료적인 억제나 경감뿐만 아니라, 자기면역질환의 개시를 예방하거나 연기시키는 예방적 치료(또는 임상적이나 잠재적인, 예를 들면, 이들의 병력 등의 증상의 징후를 방지) 모두를 포함하려는 의도이다. 자기면역 공격이나 반응의 "경감(abatement)", "억제(suppresssion)", 또는 "감소(reduction)"은 하나이상의 상기 공격이나 반응의 부분적 감소 또는 완화를 포함한다. 자기면역효과의 "실질적인(substantially)" 증가 (또는 경감이나 감소)는 자기면역 반응이나 질환의 하나이상의 병력적이나 임상적 지시자(indicator) 또는 표시자(marker)상에서 상당한 감소를 의미한다. 비제한적인 예로는 사지마비 점수나 관절염 점수에서 적어도 1 단위만큼의 감소, 자기반응적 T-세포의 빈도의 상당한 감소, 및 인슐린염(insulinitis)에서 적어도 약 0.5 단위의 감소이다(예, Zhang et al., PNAS, 1991, 88: 10252-10256에 기재된 대로 측정).
"경구(oral)"투여란 경구, 장내 또는 위내 투여를 포함한다. 흡입 투여도 또한 자기면역질환에서 내성화 효과를 달성한다.
"비경구(paraenteral)"투여는 피하, 경피, 경점막, 정맥, 복막, 또는 뇌척수강(intrathecal)투여를 포함한다.
"공동(in conjunction with)"투여는 분리형태 또는 배합형태의 투여분만 아니라 순차적 투여 및 동시투여를 포함한다.
동물모델들
본명세서 전체에서, 자기면역 질환을 연구하기 위해서 개발된 다양한 모델 시스템을 참고로 하였다. 실험적인 자기면역 뇌척수염(EAE)을 마우스 및 다른 설치류에서 다발성 경화증(MS)에 대한 모델로서 연구하였다. 본 기술분야에서 통상의 지식을 갖는 자는 이러한 동물모델에서 MS에 대한 많은 잠재적인 면역치료법을 먼저 테스트했음을 알 수 있다. 상기 질환은 미엘린 염기성 단백질(MBP), 미엘린 올리고덴트로사이트 단백질(MOG), 또는 프로테오리피드 단백질(PLP)과 부형제 (예를 들면, complete Freund's Adjuvant, "CFA")로 면역화함으로써 유도된다. 상기 질환을 유도하기 위한 항체는 상기 모델에서의 자기항원이다. 또는 항원으로 처리하는, 이러한 처리로 단상형(monophasic) 또는 악화/경감형 신경수초를 파괴라는 질병(설치류의 유형 및 종과, 공지된 유도기작에 따라서 다름)을 유도한다. 유도된 질병은 자기면역질환 MS의 다양한 특성을 가지며 이들에 대한 동물모델로 사용된다. 게다가, 경구 내성화에 의한 성공적인 EAE 치료, 사람에서 질병-유도 세포의 빈도를 감소시킴을 동시에 성공, 및 여러 경우에 MS증상의 경감, 미엘린 경구 투여의 사용은 다른 경구 면역화 방법의 성공을 예측할 수 있는 모델 시스템으로서 EAE의 사용을 유효하게 한다.
오일에 있는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 또는 CFA를 감염되기 쉬운 포유류의 척추꼬리뼈(dorsal root tail)에 면역화하여 사람의 관절염에 대한 모델로서 질병을 유도한다. 이와 유사한 방식으로, 부형제와 유형II 콜라겐으로 면역화함으로써 또한 사람의 관절염에 대한 모델로 작용하는 질병(콜라겐-유도 염증 또는 "CIA")을 유도할 것이다. 이러한 동물 모델은 또한 방관자항원을 사용하는 경구 내성화의 성공여부에 대한 좋은 예측자로 작용한다.
루이스 래트를 S-항원이나 IRBP-항원(InterPhotoReceptor Binding Protein) 및 부형제로 면역화하여 자기면역 포도막염(uveoretinits)를 유도한다. 마지막으로, 유형I 당뇨병에 대한 모델은 NOD마우스에서 자발적으로 발전된다.
본 발명이 제공한 향상된 치료 및 효과를 설명하기 위해서, 상기 기술한 모델시스템중 하나이상을 사용할 수 있다. 사실상, 억제기작인 항원에 비특이적이기 때문에, 방관자 억제에 관련된 치료법의 테스트를 위해 상기 동물모델이 특히 적합하다. 따라서, 경구 내성화의 경우에, 상기 동물모델에서 얻은 증상억제는 사람의 자기면역 질환과 이들의 동물모델과의 실제상 또는 잠재적인 다수의 차이에 독립적이다.
따라서, 상기 동물모델은 본 발명의 성공적인 용도를 설명하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 이중 블라인드(blind) 연구에서 사람에게 경구로 투여된 다발성 경화증의 자기항원, 소의 미엘린은 심각한 환자 집단에 상당한 잇점을 제공하였다(Weiner, H. et. al. Science 259:1321-1324, 1993). 추가로, 경구로 콜라겐(0.1-0.5mg을 하루에 한번 투여)을 수여한 사람에서 관절연화, AM뻣뻣함, 악력 등과 같은 관절염 증상을 성공적으로 억제하였다(Trentham, D. et al., Science 261:1727, 1993).
마지막으로, 경구 S-항원으로 사람에 대한 예비실험은 포도막염에 대한 고무적인 결과를 나타냈다. 다발성 경화증, 포도막염, 류마티스관절염 및 당뇨병에 대해 많은 사람에 대한 연구가 행해졌다. 자기면역질환의 경구 내성화에 대한 동물모델의 예측치는 이러한 사람의 임상실험에 의해서 뒷받침된다.
방관자 억제의 설명
클론성 아네르기와 대조적으로, 방관자항원의 점막투여에 의해 조절되는 억제는 형질전환 성장인자-베타(TGF-β);및/또는 인터루킨 4(IL-4)과 같은 Th-2 인핸싱 사이토키닌; 및/또는 자기면역공격 부위에서 인터루킨 10(IL-10)과 같은 하나이상의 면역억제 인자를 방출하는 표적이 되는 면역조절 T-세포를 유발함으로써 초래될 수 있다. 이러한 조절 T-세포는 IL-2 또는 γ-IFN을 높은 수준으로 방출하지는 않는다. 조절 T-세포가 유도되기 때문에, 이에 작용하는 기작을 활성적 억제(active suppression)라고 한다. 점막으로 투여된 항원에서의 항원적 결정소와 동일한 것에 의해서 개시될 때에만 면역조절 사이토키닌을 이들 조절 T-세포가 방출(또는 방출의 유도) 한다고 할지라도, 유도된 조절세포에 의해서 방출된 면역조절 사이토키닌은 항원에 비특이적이다. 조직이나 기관의 자기면역적 파괴에 기여하는 세포가 있는 포유류내의 부위로 면역조절 T-세포를 보충하는 것으로 가지면역공격의 희생에서 면역조절 물질의 방출과 이러한 발병의 원인인 모든 유형의 면역시스템 세포를 억제하는 것을 설명한다.
조직-특이적 항원이나 기관-특이적 항원으로 점막 내성화에 대한 반응으로 서프레서 T-세포가 유도되었기 때문에, 억제 T-세포의 표적은 파괴적인 세포가 집중되어 있는 구체적인 자기면역질환에서 면역공격하에 있는 조직이나 기관이 된다. 따라서, 방관자항원은 자기항원이나 자기항원의 면역우세성 에피토프를 함유한 펩타이드일 수 있다. 혹은, 방관자는 자기항원이 아닌 또다른 조직-특이적 항원일 수 있다; 따라서, 치료가 필요한 구체적인 질병에 관련된 자기항원(들)을 동정할 수 없다.
더욱 자세하게는, 조직-특이적(방관자) 항원에 대한 방관자억제의 활성적 억제 기작의 예는 다음과 같다: 조직-특이적(방관자)항원을 경구(또는 장내, 즉 직접 위로) 투여한 후에, 이는 소장을 통과하면서 장벽아래에 위치한 다수의 면역구가 집중되는 페이에르의 패치 및 융모와 접촉하게 된다. 차례로, 이들 세포는 이자나 림프구를 포함한 면역시스템과 상호작용하게 된다. 그 결과, 억제(CD8+ 또는 CD4+) T-세포가 유도되어 혈액이나 림프순환으로 방출된 후에, 자기면역공격 지역으로 보충되어 여기서 포유동물의 자기 조직을 공격하는 활성화된 B-세포뿐만 아니라 활성화된 헬퍼 T-세포를 다운조절하는 TGF-β 및/또는 다른 면역조절물질의 방출을 야기하게 된다(Chen, Y. et al., Science, 1994 supra). 이러한 방식으로 유도된 억제는 항원에 비특이적이다. 그러나, 방관자항원이 자기면역공격하에 있는 조직에 특이적이며 방관자 항원의 분해에 의해 유도되는 억제세포가 손상되는 조직이나 그 근처에서 발견되는 면역공격 세포를 억제한다는 사실에 의해서, 결과적인 내성은 구체적인 자기면역질환에 특이적이며, 즉, 자기면역공격하에 있는 구체적인 조직이다.
방관자 항원 및 자기항원(이외에 이들의 단편 및 동족체)을 자연원(이들이 정상적으로 존재하는 조직이나 기관)에서 정제할 수 있고, 또한 본 기술분야의 전문가에게 잘 알려진 기술을 사용하여 박테리아, 효모, 곤충(예, 바쿨로바이러스) 및 포유류 세포에서 재조합 DNA기술을 사용하여 얻을 수도 있다. 다수의 잠재적인 방관자 항원 및 실제 방관자 항원에 대한 아미노산서열이 알려져 있다 : 예, Hunt, C. et al PNAS(USA), 82:6455-6459, 1985(히트 쇼크 단백질 hsp70); Burkhardt, H., et al., Eur. J. Immunol. 21:49-54, 1991(항원성 콜라겐 II 에티토프); Tuohy, V.K., et al., J. Immunol. 142:1523-1527, 1989(마우스에서 마우스 PLP의 뇌척수염유발성 결정소); Shinohara, T. et al., In progress in Retinal Reserch, Osborne, N.& Chader, J. Eds, Pergamon Press 1989, pp. 51-55 (S-항원); Donoso, L.A., et al., J. Immunol. 143:79-83, 1989 (IRBP); Borst, D.E., et al., J. Biol. Chem. 264:115-1123, 1989(IRBP); Yamaki, K. et al., REBS 234: 39-43, 1988 (S-항원); Donoso, L.A. et al., Eye Res. 7:1087, 1988(IRBP); Wyborski, R, J., et al., Mol. Brain Res. 8:193-198, 1990(GAD).
소와 마우스 PLP에 대한 아미노산 서열; 소, 사람, 침팬지, 래트, 마우스, 돼지, 토끼, 기니아 피그 MBP; 사람 및 소의 콜라겐 알파-1(II) 및 소의 콜라겐 알파-1(I); 닭 콜라겐 II, 및 사람 인슐린등이 잘 알려져 있으며, 이들 항원은 본 기술분야에서 잘 알려진 재조합 기술에 의해서 합성할 수도 있다. 이들 항원의 단편을 화학적으로 합성하거나, 또한 재조합 기술로 합성할 수 있다.
몇몇 조직-특이적 항원은 상업적으로 구입할 수 있다: 예, 인슐린, 글루카곤, 미엘린 염기성 단백질, 미엘린, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 프로테오리피드 단백질등.
방관자 항원은 일반적으로 동정할 수 있다. 감염된 조직으로부터 얻은 어떠한 항원은 잠재적인 방관자이다. 잠재적인 방관자를 포유동물에 주입할 수 있고, 예를 들면 EAE나 MS의 경우에 혈액이나 뇌척수액으로부터 얻은 순환하는 T-세포나 이자세포를 이들 동물에서 분리하여 동일한 항원으로 시험관에서 자극할 수 있다. 자극으로 유도된 T-세포를 분리하고 상등액에서 TGF-β, IL-4, IL-10또는 다른 면역조절 물질의 함량에 대해 테스트한다. 구체적으로, 바람직하게는 TGF-β에 대한 상업적으로 판매하는 적절한 다클론 항체 또는 가장 바람직하게는 단클론 항체(예, R&D Systems, Minneapolis, MN; Celtrix Pharmaceuticals, Santa Clara, CA)를 사용한 ELISA에 의해서 정량적 및/또는 정성적으로 TGF-β를 측정할 수 있다(Miller, A. et al., J. Immunol., 148:1106, 1992). 또는, 다음에 기재된 예에서와 같이, 상업적으로 구입 가능한 밍크의 허파 상피세포주을 사용하는 또다른 알려진 TGF-β 탐지방법을 사용할 수 있다. 만약 방관자항원이 TGF-β를 방출하지 못하는 T-억제세포를 유도한다면, 유사하게 IL-4, 또는 IL-10 (IL-4 및 IL-10에 대한 항체는 상업적으로 구입할 수 있다. 예, Pharmingen, San Diego, CA)의 분비해 대해 상기 T-세포를 테스트할 수 있다. 억제효과를 갖는 염증 부위로부터 멀리서 방출된 염증조절 사이토키닌이 제거되도록, 효과적인 방관자가 아닌 세포-특이적 항원은 염증부위에서 분리된다.
점막으로 유도된 방관자억제의 효과를 다음의 방법으로 측정한다: 예를 들면 자기면역공격의 표적인 조직이나 기관에 대한 활성화된 T-세포수와 같은 어떤 염증 표시자의 감소; 동일한 부위에서 IL-2 또는 IFN-γ의 감소; 감염된 조직이나 기관의 병력적 측정(예, 생체절개나 전자공명이미지화); 또는 자기면역질환과 관련된 임상 증상의 수 및/또는 심각성의 감소.
내성화제의 용도-투여량
본발명의 방관자항원에 의해 유도된 내성화는 경구(또는 장내) 투여량 또는 흡입 투여량의 광범위한 범위에 걸쳐 투여량-의존적이다. 그러나, 최소 유효투여량과 최대 유효투여량이 있다. 즉, 자기면역질환의 병력적 증상 및 임상적 증상의 활성억제는 특정 투여량 범위내에서 일어나나, 이러한 특정 투여량 범위는 질병마다, 포유동물마다, 방관자 항원마다 다르다. 예를 들면, 마우스에서의 PLP-유도 EAE 질병인 경우에, MBPf를 방관자로 사용하는 때에는 억제 투여량은 약 0.1-1 mg/마우스/주입(예를 들면 10-14일 동안 5,7회 투여와 같은 약 이틀에 한번씩 주입함) 범위이다. MS를 가진 사람에 대한 유효 투여량은 MBP를 경구 내성화제로 사용하는 경우에 하루에 약 1 내지 약 100, 바람직하게는 약 1 내지 약 20mg MBP 범위이고, (수개월 내지 수년에 걸쳐서 하루에 한번이나 이틀에 한번씩 투여), 최적은 하루에 7 내지 10mg이다.
류마티스 관절염의 경우, 유형I, 유형 II, 유형 III 콜라겐중 어느 것을 투여받는 환자에 대한 유효 투여량은 하루에 약 0.005 내지 1 mg이다. 바람직한 투여량은 하루에 약 0.005 내지 0.5mg이다.
투여량과 투여빈도를 최적화하기 위해서 환자를 조사하는 것이 바람직할 수도 있다. 환자에 대한 정확한 투여량과 투여빈도는 본 기술분야에서 잘 알려진 대로, 단계, 발현빈도, 질병의 심각성 및 환장의 생체 상태에 따라 다양할 수 있다. 바람직하게는 상기 최적화는 매 건에 영향을 받게 된다. 면역억제에 필요한 투여량의 최적화는 본명세서에서 기술된 지침에 따라 일반적인 실험이 포함된다.
질병의 심각성을 측정하는 방법은 질병의 유형에 따라 잘 알려진 방법으로 행해질 수 있다. 이러한 방법은 다음과 같으며 이에 한정되는 것은 아니다:
MS:일정기간동안의 발병의 횟수와 심각도; 신체장애의 진전된 누적(Expanded Disability Status Scale과 같은 것으로 측정할 수 있다); 뇌에서 손상의 정도와 수(예를 들면 자기 공명이미지화에 의해 나타남); 그리고 자기반응 T-세포의 빈도.
EAE: 다음과 같이 점수화할 수 있는 사지마비; 1-활성도 감소, 림프테일(limp tail); 2-약한 마비, 불안정한 걸음걸이; 3-중간 마비, 탈구된 사지부분; 4-사지마비; 및 5-사망.
RA: 관절팽창, 관절연화, 아침에 뻣뻣함, 악력, 관절 이미지화 기술.
AUR: 눈의 예민함; 눈에 T-세포수 및 눈에 "흐림(cloudiness)".
유형 I 당뇨병: 췌장 베타세포 기능(예, OGTT 글루코스 내성 테스트로 측정함)
NOD 모델: 인슐린염 및 당뇨병 발병의 지연
CIA: 사지 각각에서 영향받은 관절의 수에 근거한 관절염 점수 및 다음과 같은 1-4의 임의 눈금으로 각각의 등급: 0 = 정상; 1 = 붉음만 있음; 2 = 붉음에 더하여 부음; 3 = 심각히 부음; 4 = 관절의 기형. 전체 관절염 점수는 모든 사지에 대한 점수의 총합이다. 최대 관절염 점수는 질병의 진행과정에 걸쳐서 어느 동물에서 가장 높은 점수이다. 이러한 점수화 방법에 따라서 가능한 최대 관절염 점수는 16이다(4 사지 X 각 사지당 4점).
대조 환자나 대조 동물이 증상악화를 경험하는 조건하에서, 증상의 안정화는 억제치료 약효에 대한 하나의 지시자이다. 향상의 또다른 측정방법은 다른 약물치료, 예를 들면 스테로이드 또는 다른 항-염증 약물 및 생물학적 반응 개질제를 중단하거나 감소하는 능력이다. 방관자 항원이나 자기항원의 최적 투여량은 이상에서 기술한대로 측정된 유리한 최대효과를 나타내는 양이다. 유효투여량은 상술한 대로 처리된 질병의 특성을 갖는 병역적 증거, 표시자, 증상 또는 병력 증거등 적어도 하나이상의 통계적으로나 임상적으로 상당한 약화를 초래한다.(임상적으로 상당한 약화라함은 구체적인 자기면역질환의 분야에서 일반적인 기술의 임상자가 관찰한 것임)
메토트렉세이트 치료와 공동으로, 자기면역 반응을 감소하는데 공동투여가 더 유효한 경우를 제외하고 방관자 항원(또는 자기항원)의 투여량은 각각 단독 투여한 경우에 사용되는 것과 같은 양일 수 있다.
메토트렉세이트의 투야량은 메토트렉세이트 단독투여만큼이나 높은 경우에, 방관자 항원이나 자기항원과 공동투여로 억제효과를 일으킨다. 혹은, 메토트렉세이트의 독성효과를 감소시키기 위해서 메토트렉세이트를 부분-최적 투여량으로 투여할 수도 있다. 이러한 경우에, 공동으로 투여하여 증가된 억제는 예를 들면, 메토트렉세이트 단독 투여의 최적 투여량에 의해서 달성될 수 있는 것과 같다.
방관자 항원의 최적양뿐만 아니라 유효 투여량의 범위를 본 출원 및 종래의 방법으로 결정하였다. 예를 들면, 상대적으로 낮은 투여량으로 시작하여(예, 1mg), TGF-베타(및/또는 IL-4 또는 IL-10)를 분비하는 세포수를 측정 및/또는 혈액에서 자기면역 T-세포 공격의 수 및 활성화를 측정(예, 제한 희석 분석 및 증식 능력) 및/또는 상술한 바와 같이 질병의 심각도를 측정함으로써 사람이나 동물의 투여량을 결정할 수 있다. 최적 투여량은 질병 증상의 최대 감소를 일으킴 또는/ 및 혈액에서 최대 향의 억제 사이토키닌을 생성한다. 유효 투여량은 처리된 질병의 특성을 갖는 증상이 적어도 통계적적으로나 임상학적으로 상당한 감소를 일으킨다.
동물에서 점진적으로 더 높은 투여량으로 테스트한 후에 사람에게 추정함으로써 방관자 항원의 최대 유효 투여량을 확인할 수 있다. 예를 들면, 설치류에 대해 상기에서 주어진 투여량에 기초하여, 사람에 대한 MBP의 최대 유효투여량은 50-100 mg/주입으로 추정된다. 이와 유사하게, 사람에 대한 콜라겐 유형 II의 최대 유효량은 약 1 mg/day로 추정된다.
또한 본 발명은 자기면역에 걸리기 쉬운 사람에서 자기면역질환의 개시를 방지하는 데 사용될 수 있다는 장점이 있다. 예를 들면, 유형 I당뇨병에 걸린 위험이 있는 환자를 동정하기 위한 방법이 현존하고 믿을 말하며 America Diabets Association(ADA)에 의해 보증되었다(Diabets Care 13: 762-775, 1990). 한가지 바람직한 스크리닝 방법이 본 기술분야의 전문가에게 이용할 수 있도록 자세히 기재되어 있다(Bonifacio, E. et al., The Lancet 335: 147-149, 1990).
실제적인 관점에서, 자기면역질환의 발병의 방지는 유형 I당뇨병에서 가장 중요하다. 실제적인 조직 파괴가 일어나기 전에, 다른 자기면역 질환(예, MS, RA, AT 및 AUR)이 조직파괴의 더 초기단계에서 일어난다; 따라서, 이러한 질병의 예방적 치료는 유형 I 당뇨병에서는 중요하지 않다. 유형 I 당뇨병에서, 모든 췌장섬 세포의 실질적인 파괴가 일어나기 전에, 효과적인 치료로 중지시키는 것이 최상이다. 췌장섬 세포가 파괴된 후에, 상기 치료는 췌장섬 세포의 이식과 함께 사용되지 않는 경우에는 효과가 없을 것이다.
자기면역질환, 경구나 흡입 형태로 투여시에 이러한 질병의 치료에 유효한 조직특이적이나 기관특이적인, 확인된 또는 잠재적인 방관자 항원 및 자기항원의 비제한적인 예는 다음의 표에 나타난 것과 같다. 각 개인의 질병에 대한 열거된 항원의 결합으로 또한 투여될 수 있다.
방관자 항원 및 자기항원은 또한 흡입으로 투여될 수 있다. 흡입에 필요한 방관자의 양은 일반적으로 경구 투여에 대한 것보다 적다. 흡입치료에 대한 유효량을 상기에서 제공된 것과 동일한 방법으로 측정할 수 있다.
| 자기면역 질병 | 감염된 조직 | 방관자 항원 | 출처 | 유형 |
| 유형 I 당뇨병 | 췌장 베타세포 | 글루카곤;인슐린;글루탐산 데카르복실라제(GAD);히트 쇼크 단백질 | ||
| 다발성 경화증 | 미엘린 뉴런 | MBP;PLP;DM20;미엘린 관련 당단백질(MAG);미엘린 올리고덴드로사이트;당단배질(MOG);히트 쇼크 단백질; | J. Chromatog.Biomed. Appl.526:535(90) | 정제 |
| 류마티스 관절염 | 결합조직 | 콜라겐 I, II, III;RO/SS-A;RO/SS-B-LS;히트쇼크 단백질 | J. Immunol. Meth 121:219 (89)151:177(92) | 정제정제 |
| 자기면역 포도막염 | 눈 | S-항원IRBP; | Exp.Eye Res.56:463(93) | cDNA |
| 중증관절무력증 | 근육 | 아세틸콜린 수용체;히트 쇼크 단백질 | Eur.J.Pharm.172:231 (89) | 정제 |
| 수컷의불임 | 정자 | NSAP(post-acrosomal sperm protein) | Biol.Repord.43:59(90) | cDNA |
| 근염 | 근육 | Jo-1항원;히트 쇼크 단백질 | Biol.Chem. H-S55:200 (91) | 정제 |
| 천포창 | 피부 | 데스모글레인 | Eur.J.Cell Biol.55:200(91) | cDNA |
| 자기면역 갑상선염 | 갑상선 | 틱로글로불린 |
어떤 자기면역질환에 있어서, 특이적인 방관자 항원이나 이들의 단편뿐만 아니라, 관련 조직의 추출물을 점막 내성화제로 사용할 수도 있다. 즉, 방관자 항원을 정제할 필요가 없다. 예를 들면, 미엘린(이는 여러 가지 종에서 유래될 수 있다)는 MS에 사용되고, 췌장세포 추출물은 유형 I당뇨병에 사용되고, 이자세포 추출물은 타가이식 거부반응(이는 자기면역현상이 아님)에 사용되고, 근육추출물은 근염(myositis)에 사용되어 왔다. 그러나, 하나이상의 각 항원이나 이드의 단편을 투여하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에 따르면, 유형 I 당뇨병을 치료하는 경우에는 유효량의 글루카곤을 경구로 투여할 수 있다. 글루카곤은 췌장에 특이적으로 존재한다. 그러나, 글로카곤은 유형 I 당뇨병의 과정에서 파괴된 췌장 베타 세포(글루카곤은 다른 유형의 세포인 알파세포에서 지배적으로 발현된다)에서 발현되지 않기 때문에 글루카곤은 분명히 자기항원이 아니다. 따라서, 글루카곤은 "순수" 방관자이다: 그것은 어떠한 자기항원의 활성을 가지고 있지 않는 것 같다. (아마도, 글루카곤의 방관자 활성은 알파세포로부터 분비되기 때문에 췌장의 세포간 환경에서 국소적인 고농도에서 유래된다).
인슐린은 유형 I 당뇨병에 대해 방관자 활성을 가진다. 항-인슐린 자기항체가 유형 I 환자에서 발견되지만, 현재 인슐린이 자기항원인지는 모른다. 그러나, 작용기작에 관계없이, 경구, 장내, 또는 흡입 투여 인슐린 제제는 췌장 베타 세포의 자기면역적 파괴를 방지함으로써 유형 I 당뇨병을 억제하는 데 유효하고 이들에 대한 동물모델에서도 유효하다.
다발성 경화증 및 이에 대한 동물모델에서, MBP유도 및 비유도 단편 모두가 MBP-유도 질병뿐만 아니라 PLP-유도 질병에 대해 방관자 활성을 가진다. 래트에서, 방관자 항원의 주입으로 대부분 글래스 I 에 제한된 CD8+ 조절세포을 생성하며, 이에 반하여 마우스에서는 CD8+ 서프레서 및 CD4+조절세포 둘다가 생성된다(마우스는 아마도 클래스II에 한정되는 것 같다). Chen, Y. et al. Science, 1994, supra.
류마티스 관절염 및 이에 대한 동물모델에서, 유형-I, 유형-II, 유형-III 콜라겐은 점막 내성화제로서의 활성을 갖는다. 다른 콜라겐은 유사하게 활성이 있는 것 같다.
포도막염 및 이에 대한 동물모델에서, S-항원 및 IRBP 및 이들의 단편이 방관자 활성을 갖는다.
방관자 항원의 단편도 또한 사용될 수 있다. 중첩 펩타이드 방법을 사용하여, 유용한 단편을 동정할 수 있으며, 주입된 동물에서 얻은 T-세포를 TGF-β 및/또는 IL-4 및 IL-10의 분비에 대해 테스트할 수 있으며, 추가로 서브 유형(CD8+ 및/또는 CD4+)에 의해서 동정할 수 있다.
점막으로 투여된 방관자 항원이 조절 T-세포를 유도함으로써 TGF-β 및/또는 IL-4 및 IL-10의 방출 및/또는 생산을 유도한다. 그러한 T-세포는 EAE에 대해 경구로 내성화한 마우스에서 동정할 수 있으며, 래트에서는 CD4+ 서프레서 T-세포 및 CD8+ 서프레서 T-세포을 동정할 수 있다. MBP와 같은 자기항원의 면역우세성 에피토프는 그러한 조절 T-세포를 유도할 수 있다. 방관자 항원을 포유동물에 주입하고 그 항원의 단편을 인식한 포유동물 T-세포에서부터 분리하거나, 주입되지 않은 동물에 보호를 전달할 수 있는 방관자 주입 동물로부터 T-세포를 동정함으로써 추가로 그러한 에티토프를 확인할 수 있다.
자기항원을 다음 문헌에 기재된 대로 투여할 수 있다.
1993년 2월 25일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US93/01705, 1991년 3월 4일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/01466, 1990년 12월 17일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US90/03989, 1991년 10월 10일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/07475, 1993년 8월 17일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US93/017786, 1993년 9월 24일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US93/09113, 1991년 10월 31일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/08143, 1991년 3월 29일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/02218, 1993년 4월 20일자 출원된 PCT/US93/03708, 1993년 4월 9일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US93/03369, 1991년 10월 15일자 출원된 PCT 특허출원번호 제 PCT/US91/017542.
추가로, 메토트렉세이트에 의한 경구 면역화의 효과를 높이기 위해서 다른 사이토키닌 및 비-사이토키닌 상승제를 함께 치료에 사용할 수 있다. 다른 사이토키닌 상승제(유형 I 인터페론)의 경구 및 비경구 사용은 1995년 7월 4일자 출원된 PCT/US95/04120에 기재되어 있다. Th2 인핸싱 사이토키닌의 투여는 1995년 7월 4일자 출원된 PCT/US95/04512에 기재되어 있다. 예들 들어, IL-4 및 IL-10을 PCT/US95/01512에 기재된 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명용의 비-사이토키닌 상승제의 비제한적인 예로는 다양한 서브타입의 E. coli 및 살모넬라(LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Difco, Detroit, MI; BIOMOL Res. Labs., Plymouth, PA)와 같은 그램 음성 박테리아의 박테리아 리포폴리사카라이드, 리피드 A(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO; ICN Biochemicals, Cleveland, OH; Polyscience, Inc., Warrington, PA); 면역조절 리포프로테인, 예를 들면, Deres, K.et al., (Nature, 342: 561-564, 1989)에 기재대로 얻을 수 있는 트리팔미토일-S-글리카릴시스테인일-세릴-세린(P3C55)에 공유결합된 펩타이드 또는 Braun, V., Biochim. Biophys.Acta 435:335-337, 1976에 기재된 대로 얻을 수 있는 E. coli의 "Braun's" 리포프로테인; 그리고, Sun, J-B et al., 1994 PNAS (USA) 91, November 1994에 의해서 기재된 (비목 자기면역 반응의 감소와 관련되지 않을 지라도)상승제 능력의 콜레라 톡신 베타-사슬(CTB)을 포함한다.
리피드 A는 전체 LPS분자보다 독성이 적기 때문에, 리피드 A는 본 발명에 있어 LPS보다 더 바람직하다. 본 발명용의 LPS는 Galanes et al.(Eur. J. Biochem. 9:245, 1969) 및 Skelly, R.R., et al(Infect. Immun. 23.:187, 1979)의 방법을 사용하여 그람 음성 박테리아로부터 추출하고 정제할 수 있다. 포유동물에 대해 비사이토키닌 상승제의 유효 투여량의 범위는 약 15㎍ 내지 15mg/kg, 바람직하게는 300㎍-12mg/kg이다. 포유동물에 대해 경구 유형 I 인터페론에 대한 유효 투여량 범위는 구별되는 최대 유효 투여량이 없이 1,000-15,000 유니트이다.
내성화제와 메토트렉세이트 모두를 투여하기 위한 최적 방법은 방관자 항원,자기항원, 및 메토트렉세이트와 관련된 본명세서에 기술된 정보 및 잘 알려진 정보에 비추어 결정한다. 일반적인 다양한 투여량, 조합, 및 치료기간은 자기면역의 심각성을 결정할 수 있는 환경하에서 수행하였다. 유용한 투여량과 투여 인자는 자기반응 T-세포 수의 감소나 적어도 하나의 임상적이나 병력적 증상의 심각성 또는 발병의 감소를 포함하는 자기면역반응의 감소를 가져오는 것이다.
바람직하게는 내성화제를 메토트렉세이트의 투여 24시간내에 투여하는 것이다. 더욱 바람직하게는, 메토트렉세이트와 동시에 투여하는 것이다. 가장 바람직하게는, 둘다는 혼합된 경구 제제로 투여하는 것이다.
본발명용의 메토트렉세이트는 경구 및 비경구 투여형태로 흔히 상업적으로 이용가능할 수 있다. 혹은, 담체 및 다음에 기재된 다른 작용제를 사용하여 메토트렉세이트는 경구나 비경구 투여형태로 종래의 방법으로 제조된다.
본 발명의 각 경구(또는 비경구) 제제는 본기술분야에서 잘 알려져 있는 것과 같이 약리적으로 허용되는 담체, 희석체, 충진제, 용해제 또는 유화제 및 염을 포함하는 안정화 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 본 기술분야에서 잘 알려진 고체 담체를 사용하여 종래의 방법에 따라 정제를 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용된 캡슐은 겔라틴이나 셀룰로스 유도체와 같은 약리적으로 허용되는 물질로 제조될 수 있다. 다음과 같이 문헌에서와 같이 지속적인 방출 경구 전달 시스템 및/또는 경구 투여형태를 위한 장 코팅도 또한 생각할 수 있다: 1987년 11월 3일에 공표된 US특허 제 4,704,295호, 1985년 12월 3일에 공표된 US특허 제 4,556, 552호, 1982년 1월 5일에 공표된 US특허 제 4,309,404호, 1982년 1월 5일에 공표된 US특허 제 4,309,406호.
고체 담체의 예로는 녹말, 슈가, 벤토나이트, 실리카 및 상용되는 다른 담체가 포함된다. 본 발명의 제제에서 사용할 수 있는 담체 및 희석제의 비제한적인 예는 식염수, 시럽, 덱스트로스 및 물을 포함한다.
흡입으로 투여되는 내성화제를 위한 제제예는 1990년 12월 17일자 출원된 PCT/US90/07455에 기재되어 있다. 본 발명의 흡입 투여을 위한 약학 제제는 임의의 성분으로서, 약리적으로 허용되는 담체, 희석제, 용해화제 및 유화제, 및 본 기술분야에서 알려진 유형의 염을 포함할 수도 있다. 그러한 물질의 예로는 일반적인 식염수 용액, 예를 들면, 생리적 완충 식염용액 및 물이다.
본 발명의 또다른 예에 따른 내성화제의 투여경로는 에어로졸형태나 흡입형태이다. 항원을 건조한 분말 입자나 담체 가스(예, 공기나 질소)에 현탁 및 분무화된 수용액으로 투여할 수 있다. 바람직한 에어로졸 약학 제제는 예를 들면 약 1mg 내지 300 mg 의 항체를 함유한 생리적으로 허용되는 완충 식염용액으로 이루어질 수 있다.
액체에 용해되지 않거나 현탁되지 않는 내성화 항원의 미세하게 세분된 고체 입자의 형태로 건조 에어로졸은 또한 본 발명의 입자에 유용하다. 내성화제는 평균입자 크기가 약 1 내지 5 마이크론, 바람직하게는 2 내지 3 마이크론으로 미세하게 세분된 입자로 이루어진 분발형태일 수 있다. 본 기술분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 분쇄하고 체여과를 하여 미세하게 세분된 입자를 제조할 수도 있다. 일정량의 미세하게 세분된 물질(분말형태일 수 있음)을 흡입으로 투여할 수 있다.
흡입 약학 제제에 유용한 담체 및/또는 희석제의 비제한적인 예로는 물, 생리적으로 허용되는 완충 식염 용액, 예를 들면 pH7.0-8.0인 인산 완충 식염용액이 포함된다. 본발명의 흡입 약학제제나 투여형태용에 적합한 담체나 희석제의 추가적인 비제한적 예는 1987년 4월 21일자 공표된 미국특허 제 4,659,696, 1989년 9월 5일자 공표된 미국특허 제 4,863,720, 그리고 1987년 10월 6일자 공표된 미국특허 제 4,698,332에 기재되어 있다.
본발명의 약학제제를 예를 들면, 다음에 기재된 분무제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 투여할 수 있다: 1986년 11월 25일자 공표된 미국특허 제 4,624,251, 1972년 11월 21일자 공표된 미국특허 제 3,703,173, 1971년 2월 9일자 공표된 미국특허 제 3,561,444, 1971년 1월 13일자 공표된 미국특허 제 4,635,627.
본발명의 실시할 때에, Newman, S.P. in Aerosols and the Lung, Clarke, S.W. and Davia, D. eds. pp. 197-224, Butterworths, London, England, 1984에 기재된 압축된 미터 투여량 흡입기(MDI) 및 건조 분말 흡입기와 같은 다른 에어로졸 전달 시스템이 사용될 수 있다.
본명세서에 기재된 에어로졸 전달 시스템은 Fisons corporation(Bedford, MA), Schering Corp. (Keniworth, NJ) 및 America Pharmoseal Co. (Valencia, CA) 다양한 상업적 구입처에서 이용 가능하다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허출원, 특허 및 참고문헌은 전체로서 참고문헌으로 병합되어 있다. 충돌하는 경우에, 본 명세서의 정의와 해석이 우선한다.
다음의 실시예는 본발명의 예시적인 것이며 그 보호범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 최적 투여량의 메토트렉세이트와 내성화제로 래트에서 EAE의 억제
아래의 실시예에서 다음의 재료와 방법이 사용되었다.
동물: 암컷 루이스 래트를 Harlan-Sprgue Dawley Inc.(Indianapolis, IN)에서 구입했다. 표준 실험 먹이와 임의의 물로 동물을 유지하였다. Committee on Care of Laboratory Animals of the Laboratory Research Council (Pub. #DHEW: NIH, 85-23, 1985개정판)의 지침서에 따라 동물을 유지하였다.
항원 및 시약: 변형된 방법의 Deibler et al.(Prep. Biochem. 2:139, 1972)에 의해서 뇌조직에서 기니아 피그 MBP를 정제하였다. 겔전기영동 및 아미노산 분석으로 단백질 함량과 순도를 모니터하였다. Roxane Lab. In.(Columbus, OH)로부터 메토트렉세이트를 구입하였다. 메토트렉세이트 정제(2.5mg)을 완충액(1:1비율로 H2O:PBS)과 혼합하여 2.5 mg메토트렉세이트/ml완충액 농도를 얻었다.
내성유도: 경구 내성을 위해, 18 게이지 스테인레스 스틸 동물 주입 바늘(Thomas Scientific, Swedesboro, NJ)로 PBS(0.5 X)에 용해된 MBP를 장내로 투여하였다. 면역화하기 전에 7투여 또는 14투여동안 월, 수 및 금("QOD")에 3회 투여하였다.
EAE 유도: 활성적으로 유도된 질병에 대하여, 루이스 래트를 Complete Freund's 부형제(CFA)에서 마이코박테리움 투베르쿨로시스 200㎍과 기니아 피그 MBP 25㎍을 함유한 에멀젼 각 0.1㎖의 50㎕을 발로 면역화하였다.
임상 측정: 매일 EAE의 증거에 대해 블라인드 방식으로 동물을 측정하였다. EAE의 임상적 심각성은 다음과 같이 점수를 매겼다: 0, 질병이 없음; 1, limp tail; 2, 뒷발 마비; 3, 뒷발 마비, 실금; 4, 사지마비; 그리고 5, 사망. "MMCS"는 최대 임상 점수를 말한다. 질병의 기간을 질병 발병일로부터 각 동물에 대한 완전한 회복(또는 사망)까지의 일수를 계산하여 측정하였다.
통계 분석: 점수 샘플에 대해 double-tail Wilcoxon rank sum test로 임상 점수를 분석하였고, chi square를 사용하여 그룹간의 질병 발생을 비교하였고, Student's t-test를 사용하여 평균값을 비교하였다. 각각의 실험에 대해, 매그룹당 5 동물을사용하였다.
다음의 표는 각 그룹의 래트에게 투여하는 프로토콜을 보여준다. "QOD X 7"은 전체 7회 투여동안 일주일에 3회 투여를 나타낸다. "QOD X 14"는 전체 14회 투여동안 일주일에 3회 투여를 나타낸다. 상기 프로토콜을 2회 수행했다(연구 #1, 연구 #2).
80㎍ 메토트렉세이트만을 투여하고, GP-MBP (기니아 피그 MBP) 1mg을 함께 투여하였다. 80㎍ 메토트렉세이트를 일주일에 3회 빈도로 투여하는 것은 몸무게에 맞추면 사람에게 투여한 최적 투여량의 메토트렉세이트에 해당된다. 구체적으로, 60kg의 사람의 추천량은 매주 10mg의 메토트렉세이트이다. 래트 투여량에 대해 7의 National Cancer Institute 전환인자를 화학요법에서 고려하면, 이는 매주 238㎍의 메토트렉세이트를 212.2 g의 래트에게 투여하는 것에 해당되거나, 매누 3회 80㎍의 메토트렉세이트에 해당된다.
14회 항원의 투여에 관련된 실험결과가 아래 표에 나타나 있다. 이러한 결과에 의하면, 메토트렉세이트와 함께 MBP를 투여한 경우에 MBP는 메토트렉세이트의 작용을 방해하지 않고, 또한 최적 억제는 80㎍의 메토트렉세이트 단독투여로 달성할 수 있음을 확인하여 준다.
다음의 표에 의하면, 항원 7회 투여로 얻은 결과를 나타낸다. 이러한 결과에 의하면, 메토트렉세이트와 MBP의 공동투여가 각각 투여보다 더 억제가 크며, 이러한 억제는 실질적으로 각각의 물질에 의한 것보다 큼을 나타낸다.
실시예 2: 부분 최적 투여량의 메토트렉세이트와 내성화제의 공동으로 래트에서 EAE의 억제
실시예에 기재된 방법으로 실험하였으며, 프로토콜은 다음에 나타냈다. 부분최적 투여량인 40㎍ 및 20㎍을 14일간 1mg의 MBP와 함께 투여하였다. 최적 투여량인 80㎍을 또한 투여하였다.
도 1-5는 Complete Freund's 부형제에서 MBP로 면역화한 후에 20일동안 실험에서 얻은 임상자료를 나타낸다.
도 1은 메토트렉세이트 단독 투여 결과를 나타낸다. 최적투여량(80㎍)과 부분최적 투여량(40㎍ 및 20㎍)의 메토트렉세이트로 EAE의 억제는 투여량 의존적임을 나타낸다. 이 그래프는 메토트렉세이트 투여과 관련된 리바운드 효과를 보여주며, 여기서 18일에 최고의 억제후에 질병의 임상 증상이 다시 나타난다.
도 2는 최적 투여량의 MBP와 비교한 최적 투여량의 메토트렉세이트 투여의 임상 점수에 대한 영향을 보여준다. 메토트렉세이트가 투여된 래트에서는 20일에 리바운드 효과가 나타났고, MBP투여된 래트에서는 나타나지 않았다.
도 3은 최적 투여량의 MBP와 최적 투여량의 메토트렉세이트의 공동투여와 비교하여 최적투여량이 메토트렉세이트의 투여에 의한 임상점수에 대한 효과를 나타낸다. 최적 투여량의 메토트렉세이트에 MBP를 첨가하더라도 메토트렉세이트의 효과에는 방해가 되지 않는다. 메토트렉세이트도 MBP효과를 방해하지 않으며 20일에 리바운드 효과가 없어졌다. 따라서, MBP와 심지어 최적 투여량의 메토트렉세이트와 공동으로 투여한 효과가 각각 단독투여보다 더 우수하다.
도 4는 MBP단독 투여 및 부분최적 투여량인 40㎍의 메토트렉세이트 단독투여의 효과를 두 가지의 공동투여와 비교하여 나타낸다. 공동투여는 단독투여보다 더 높은 억제를 나타냈으며, 메토트렉세이트 단독 투여시의 리바운드 효과를 방지하였다. 억제의 정도는 본질적으로 최적투여량의 메토트렉세이트에서 관찰되는 것과 동일하다.
도 5는 MBP단독 투여 및 20㎍의 메토트렉세이트 단독투여의 효과를 공동투여와 비교하여 나타냈다. 공동투여가 단독투여보다 더 큰 억제를 나타낸다. 억제의 정도는 최적투여량의 메토트렉세이트 단독 투여와 본질적으로 동일하다.
따라서, 본 발명에 따르면, 최적 투여량보다 낮은 투여량의 메토트렉세이트를 투여할 수 있으나, MBP와 공동으로 투여한 결과 억제효과가 최적 투여량의 메토트렉세이트의 단독 투여효과와 유사한 효과가 달성되었다. 또한, 공동투여로 메토트렉세이트 단독 투여와 관련된 리바운드 효과를 제거하였다.
실시예3: 메토트렉세이트와 내성화제 공동으로 마우스에서 콜레겐으로 유도된 관절염의 억제
DBA/J1 마우스에 유형II 콜라겐(0.25ml중에 300㎍), 메토트렉세이트(0.25ml 중에 10㎍), 이들의 배합, 또는 대조용액으로 0.1 N 아세트산(0.25ml)으로 연속적인 5일동안 하루에 한번 경구로 투여하였다. 상기 유형 II 콜라겐은 닭의 흉골 유형 II콜라겐(1.2mg/ml)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)이었다. 2.5 mg정제로 메토트렉세이트를 구입할 수 있다(Lab. Inc.).
상기 정제를 0.1N 아세트산과 혼합하여 2.5mg/ml 용액으로 제조하였다. 투여된 메토트렉세이트의 양을 마우스당 평균 무게 26g 및 마우스에 대한 전환인자 12(Chemotherapy National Cancer Institute)를 사용하여 사람 60kg에 대해 10mg/주에 최적투여량에 기초하여 결정하였다.
마지막 경구투여후에 3일에, 각 동물을 피하고 털을 깍은 등으로 100㎍의 유형II 콜라겐과 100㎍의 마이코박테리움 부티리컴을 함유하는 0.1ml의 에멀젼을 주입하였다. 3주후에, 0.1 N 아세트산중에 100㎍의 유형II 콜라겐을 복막내로 두 번째로 주사하였다. 60일간 관절염 발병에 대해 동물을 모니터하였다. +10에 시작하여 눈금을 0에서 4까지로 관절염 징후에 대해 점수화하였다. 각 동물에 대한 관절염 점수는 4발의 각각에 점수의 합이다.
DBA/1 수컷 마우스에서 콜라겐 유도된 관절염은 류마티스 관절염보다 임상적으로 휠씬 심각하고, 비록 사람에서 10mg 투여량의 메토트렉세이트에 기초하여 계산한 것이지만, 마우스에서 10㎍의 메토트렉세이트는 콜라겐 유도된 관절염을 억제할 만큼 충분히 높지 않았다. 사실상, 질병의 심각도는 대조구 완중액을 투여한 경우보다 더 심했다. 면역화에 앞서 메토트렉세이트의 투여를 중단했기 때문에, 이것은 리바운드 효과의 결과이다.
그러나, 이러한 결과는 단독으로 투여한 경우보다 유형 II 콜라겐을 메토트렉세이트와 함께 처리한 경우에 콜라겐 유도 관절염은 실질적으로 더 큰 수준으로 감소되었다는 것을 나타낸다.
실시예 4: TGF-β 유도의 측정
혈청이 없는 배양 상등액에서 TGF-β활성의 측정
테스트 동물의 세포로부터 혈청이 없는 배양 상등액을 모았다. 예를 들면, Kehri, et al. J. Exp. Med. 163:1037-1050, 1986; 그리고 Wahl, et al. J. Immunol. 145: 2514-2419, 1990을 참조. 요컨대, 증식배지에서 항원(50㎕/ml)으로 8시간동안 먼저 조절세포를 배양하였다. 그런 다음에, 세포를 3회 세척하고 72시간동안 나머지에대해서 혈청이 없는 배지에서 재현탁하고, 상등액을 모으고, 그런 다음에 측정까지 냉동한다. 상등액에서 TGF-β함량 및 이소형태 유형을 밍크 허파 상피세포주(Danierpour et al.(Danierpour, D., et al. J. Cell. Physiol. 138:79-86, 1989)에 따라서 American Type Culture Collection, Bethesda, MD#CCl-64를 사용하여 결정하였고, Danielpour, D., et al. Growth Factor 2:61-71, 1989에 기재된 대로 SELISA(Sandwith Enzyme Linked Immunosorbent Assay)에 의해서 확인하였다.
샘플의 활성화 없이 분석으로 활성 TGF-β 퍼세트을 결정하였다.
이러한 분석을 방관자 억제의 유도자 후보인 어떠한 항체에 대해 적용하였다. 이 측정법으로 측정한 최고 농도의 TGF-β이러한 항체, 항체 단편 및/또는 항체의 양이 본발명의 치료방법에 적합하다.
또는, 이하에서 설명할 트랜스웰(transwell) 배양 시스템을 사용하여 생산된 TGF-β 수준을 나타낼 수도 있다. 이 배양 시스템은 세포 증식억제의 함수로서 TGF-β의 생산을 측정한다.
항체-자극 세포의 배양상등액셍서 IL-4 및/또는 IL-10의 출현은 또한 항체가 방관자 지시자로서 적합함을 나타낸다. Chen, Y. et al., Science, 1994, supra에 기재된 각 폴리펩타이드에 대한 상업적으로 구입 가능한 항체를 사용하는 ELISA방법으로 IL-4, IL-10(그리고 TGF-β)을 분석하였다.
트랜스웰 배양: 이중 챔버 트랜스웰 배양 시스템()은 직경이 24.5mm이고 구멍크기가 0.4㎛인 반투성 폴리카본네이트 박으로 분리된 두 구획으로 이루어져 있으며, 이를 사용한다. 두 챔버는 1mm씩 분리되어 있어, 세포를 세포와 세포의 접촉없이 근접한 거리에서 함께 배양할 수 있게 한다. 트랜스웰 배양에서 증폭반응의 시험관내 억제를 측정하기 위해서, 예를 들면, 5X104항체 특이적 세포주를 앞에서 기술한 대로(Ben-Num, A. et al., Eur. J. Immunol. 11:195, 1981) 낮은 웰에서 600㎕의 증폭배지에서 106조사(2,500 rad) thymocyte로 배양하였다. 경구로 내성화된 동물(예, 래트)나 대조구(BSA 투여)로부터 얻은 이자세포를 위쪽 셀에(200㎕중에 5X 105세포)에 첨가하였다. 마지막 주입 후 7-14일 후에 이자를 제거하고, 스테인레스 스틸 체로 이자를 통과시켜 단일세포 현탁액을 제조하였다. 항체(50㎍/ml)를 20㎕ 부피로 첨가하였다. 반투막에 의해서 반응세포로부터 조절세포가 분리되기 때문에, 이들은 조사가 필요하지 않다. 몇몇 실험에서, 반응세포와 함께 조절세포를 하부 웰에 첨가하고, 이 경우에 배양물에 넣은 즉시 조절세포에 조사한다(1,250 rad). 증폭배지는 RPMI 1640(Gibco Laboratories, Grand Island, NY)에 2 X 105M 2-메르캅토에탄올, 1% 비필수 아미노산, 1% 페니실린, 및 1% 자가혈청을 보충하여 구성한다.4회 각 트랜스웰을 수행한다. 6% CO2와 94% 공기압에서 72시간동안 37℃에서 상기 트랜스웰을 배양한다. 54시간 배양후에, 각 하부 웰을 4 μ Ci [3H]티미딘으로 72시간 간격으로 펄스를 주고, 유리섬유 필터에서 수확하기 위해서 둥근 바닥의 96-웰 플레이트에서 3웰로 재접종하고, 표준액체분산기술로 계측한다. 퍼센트 억제 + 100 X ((1 - 조절자로 배양한 반응자의 △ cpm/반응자의△ cpm).
실시예 5: 류마티스 관절염의 치료
메토트렉세이트 치료를 갑자기 중단한 후에 위약으로 경구 유형 II콜라겐을 투여를비교하기 위해서 고안된 임상연구의 일부로서, 류마티스 관절염을 가진 환자에게 유형 II콜라겐만을 단독으로 경구 투여하거나 경구 유형 II콜라겐과 경구 메토트렉세이트를 함께 투여한다.
이 연구에서 환자는 모두 이전에 최대 투여량인 일주일에 20mg의 메토트렉세이트를 투여받은 적이 있으며, 기능적인 분류로 클래스 I, II, 및 III 모두 심각한 류마티스 관절염으로 고생하고 있었다. 기능적 클래스 IV로 분류된 환자만 제외하였다. 기능적 클래스 IV는 통상의 자가-치료, 직업상이나 비직업상의 활동을 수행하고 있는 환자를 포함한다. 모든 환자는 적어도 6 관절연화, 적어도 3 부운 관절을 나타냈다. 안정한 스테로이드, NSAIDS (비스테로이드성 항-염증제 및 어떠한 진통제를 사용하기를 원하는 환자에게 투여하였다)
연구에 203명의 환자를 모집했다. 연구를 시작하기 전에, 메토트렉세이트의 사용을 완전히 중단했다. 그런 후에 모든 환자에게 오렌지 주스중에 유형 II콜라겐 20㎍/day를 그날 첫 번째 식사를 하기 전에 경구로 투여하였다.
그러한 유형II코라겐의 제조방법은 WO 97/25435에 기재되어 있다. 이 연구에 사용된 콜라겐 유형 II는 텔로펩타이드를 제거하기 위해 아세트산에서 통상의 펩신으로 처리하였다. 유형 II콜라겐 20㎍을 함유한 조성물, 그러한 투여량의 투여방법 및 그러한 투여의 유익한 효과는 WO 97/02837에 기재되어 있다.
24주간 지속된 연구동안, 연화 관절수와 부은 관절수를 포함하여 수차례 환자를 평가하였다. 축적 팔루스 20 반응(cumulative Palulus 20 response)는 류마티스 관절염을 측정하는 알려진 방법이며, 효과를 측정하는데 사용된다. Paulus et al., Arthritis and rheum. 1990; 33; 477-484.
연구시작후 8주에, 병이 돌발한("촉발(spiked)")한 환자에게는 7.5 내지 10mg/주의 투여량으로 상업적으로 구입 가능한 메토트렉세이트를 다시 투여하였다. 연구를 완료한 전체 101명 환자중에, 유형II 콜라겐과 메토트렉세이트를 함께 투여한 47명의 환자와 단지 유형II콜라겐만을 투여한 54명의 환자를 비교하였다. 연구결과는 도 6-8에서 나타냈다. 도 6은 연구동안 측정된 부은 관절수를 나타낸다. 8주에 악화된 증후를 나타낸 환자 그룹은 이때 부은 관절을 나타냈다. 유형 II 콜라겐 치료와 함께 메토트렉세이트를 받은 후에, 이 그룹의 환자는 부은 관절수가 감소하였고, 공동치료(도 6의 16주에 해당함)로부터 8주 후에 유형II콜라겐을 투여받은 환자보다 부은 관절이 더욱 감소하였다. 도 7의 결과는 비슷한 패턴을 따르는 연화 관절수를 나타낸다.
도 8에서 나타난 축적 팔루스 20 반응을 달성한 환자의 퍼세트는 유형 II 콜라겐만을 투여받은 환자보다 공동투여를 받은 환자에 대해 더욱 높았다. 메토트렉세이트공동치료를 받은 환자에 대한 팔루스 반응을 8주에 유형 II콜라겐과 배합한 메토르렉세이트의 시간으로부터 계산하였다.
따라서, 경구 유형II 콜라겐과 메토트렉세이트의 공동사용은 유형 II콜라겐만을 사용한 것에 비해 억제가 증가됨을 나타낸다.
Claims (23)
- (a) 방관자 항원을 점막으로 투여하고,(b) 메토트렉세이트를 경구로, 장내로, 또는 비경구로 투여하며,상기 방관자 항원 및 메토트렉세이트의 양은 공동으로 자기면역질병에 관련된 자기면역반응을 억제하기에 유효한 양으로 투여하는 것으로 이루어지는 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방관자 항원과 상기 메토트렉세이터는 각각 단독으로 투여하여 달성할 수 있는 억제효과에 비해 공동으로 투여한 경우에 상기 자기면역반응을 더욱 효과적으로 억제하는, 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방관자 항원은 경구로, 장내로, 또는 흡입으로 투여되는, 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 메토트렉세이트는 비경구로 투여되는 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 메토트렉세이트는 경구로 투여되는 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 질병이 다발성 경화증인 자기면역질병의 치료방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 방관자 항원이 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테오리피드 단백질(PLP), 미엘린 관련성 당단백질(MAG), 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(MOG) 히트 쇼크 단백질, 및 이들의 자기면역억제 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 자기면역질병의 치료방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 방관자 항원이 미엘린인 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 질병이 류마티스 관절염이고, 상기 방관자 항원이 유형 I 콜라겐, 유형 II 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 및 이들의 자기면역억제 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 질병이 유형 I 당뇨병이고, 상기 방관자 항원인 글루카곤, 인슐린, 글루탐산 데카르복실라제, 히트 쇼크 단백질, 및 이들의 자기면역 억제 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 질병이 포도막염(Uveoretinitis)이고, 상기 방관자 항원이 S-항원, 인터포토리셉터 레티노이드 결합 단백질(IRBP), 및 이들의 자기면역억제 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방관자 항원와 상기 메토트렉세이트가 실질적으로 동시에 투여되는 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 질병이 다발성 경화증이고, MBP와 메토트렉세이트로 이루어지는 조성물이 경구로 투여되는 자기면역질병의 치료방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자기면역질병이 T-세포 매개성인 자기면역질병의 치료방법.
- (a) MBP로 이루어진 조성물의 일정량을 경구로, 장내로, 흡입으로 투여하고,(b) 메토트렉세이트 일정량을 경구로, 장내로, 또는 비경구로 투여하며,상기 MBP로 이루어진 조성물 및 메토트렉세이트의 양은 공동으로 자기면역질병에 관련된 자기면역반응을 억제하기에 유효한 양인 것으로 이루어지는 다발성 경화증의 치료 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 조성물은 미엘린으로 이루어지는 것인 다발성 경화증의 치료 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 조성물 및 상기 메토트렉세이트는 경구로 투여되는 다발성 경화증의 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 조성물 및 상기 메토트렉세이트는 실질적으로 동시에 투여되는 다발성 경화증의 치료 방법.
- 제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 소의 미엘린인 것인 다발성 경화증의 치료 방법.
- (a) 자기항원을 점막으로 투여하고,(b) 메토트렉세이트를 경구로, 장내로, 또는 비경구로 투여하며,상기 자기항원 및 메토트렉세이트의 양은 공동으로 자기면역질병에 관련된 자기면역반응을 억제하기에 유효한 양으로 이루어지는 자기면역질병의 치료방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 질병은 중증관절근무력증(myasthenia gravis)이고, 상기 자기항원은 아세틸콜린 리셉터와 히트 쇼크 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 자기면역질병의 치료방법.
- 방관자 항원 및 메토트렉세이트가 공동으로 자기면역질병에 관련된 자기면역반응을 억제하는 유효한 양으로 방관자 항원과 메토트렉세이트를 포함하며, 자기면역질병을 치료하기 위한 경구 또는 장내 투여용 약학 제제.
- 자기항원 및 메토트렉세이트가 공동으로 자기면역질병에 관련된 자기면역반응을 억제하는 유효한 양으로 자기항원과 메토트렉세이트를 포함하며, 자기면역질병을 치료하기 위한 경구 또는 장내 투여용 약학 제제.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 19990724 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |