KR20000057225A - 병해충 방제용 바쿨로바이러스 - Google Patents
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Abstract
병해충 제어에 사용되는 신규한 플루텔라 자이로스텔라 바쿨로바이러스(Plutella xylostella baculovirus)(PxMNPV)가 분리되었다. 다양한 병해충은 살충에 효과적인 양의 바쿨로바이러스를 표적 곤충의 궤적 또는 근처에 적용하므로써 조절된다.
Description
선행기술의 설명
화학적 살충제 및 살균제가 산림 및 농작물 병해충에 대한 방제제로서 가장 일반적으로 사용된다. 미국에서는 연간 3천 5백억 파운드의 상기 방제제가 산림, 농작물 및 거주지의 충해 및 질병을 방제하기 위하여 사용된다. 불행하게도 광범위한 살충제 및 살균제는 그 표적 생물체 뿐만아니라 익충, 유익한 곰팡이 및 결과적으로는 전체 생태계에 대한 부작용을 갖는다. 병해충은 그러한 화학물에 대해 내성을 가질 수 있고, 이에 따라 새로운 병해충군은 상기 살충제에 대한 내성을 나타낼 수 있다. 뿐만아니라, 화학적 잔존물은 환경오염과 이와 관련된 건강우려를 가져온다.
생물학적인 곤충 및 균 방제제 대한 관심은 화학 살충제의 사용과 관련한 우려의 결과로서 증가하고 있다. 생물학적인 병해충 방제는 종합적인 충해 방제에 있어서 하나의 선택적인 수단을 제시하며, 화학 살충제에 대한 의존을 감소한다. 일반적으로 천연 방제제는 그 표적 숙주에 대한 특이성 때문에 환경에 미치는 역효과가 거의 없다. 생물학적인 방제제에 있어서는 화학 잔유물이 없으므로 장기적인 환경에 대한 해악 및 건강에 대한 우려가 없다. 그러나 생물학적인 방제제는 생산가, 효율 및 안정성 등에 있어서 화학 살충제와 비교할 때 몇가지 단점이 있다.
생물학적 살충제로서 개발된 곤충병원체(entomopathogens)에 속하는 바이러스는 곤충류에 있어서 천연적인 외기생출성(epizootic) 질환을 야기한다. 바쿨로바이러스를 포함하는 다양한 종류의 바이러스는 유용한 생물학적 방제제로 알려졌다. 바쿨로바이러스는 절지동물에만 감염되는 거대 바이러스군이다(L.K.Miller, Virus Vector for Genetic Engineering in Invertebrates, in "Genetic Engineering in the Plant Sciences", N. Panopoulous, Ed., Praeger Publ., N.Y., pp. 203-224, 1981; Carstens, 1980, "Baculoviruses-- Friend of Man, Foe of Insect?, "Trends and Biochemical Science, 52;107-110; Harrap and Payne, "The Structural Properties and Identification of Insect Viruses"in Advences in Virus Research, M. A. Lawfer, F. B. Bang, K. Maramorosh and K. M. Smith, Eds., Vol. 25, pp. 273-355, Academic Press, New York, 1979).
천연상태에서, 감염은 곤충이 바쿨로바이러스 입자, 전형적으로는 바이러스-코드된 단백 결정내에 삽입된 다양한 바이러스성 성분으로 구성된 폐색체
(occlusion bodies, OB)의 형태로 오염된 음식을 섭취할 때 개시된다. 감염성 곤충에 의하여 섭취되면, 폐색체의 단백 결정은 곤충의 중장(midgut)의 염기조건에서 중장의 상피 세포에 침투하는 개개의 바이러스 성분을 방출하면서 용해된다. 세포내에서, 상기 바쿨로바이러스는 복제(replication)가 이루어지는 핵(nucleus)로 이주한다. 일반적으로 두가지 형태의 바이러스, 폐색된 것과 세포외 바이러스(ECV)가 바이러스성 복제 과정에서 생성된다. 폐색체 자체는 물론 이들 바이러스성 입자는 모두 외막(envelope)을 가지고 있다.
초기에, 세포외 바이러스(ECV)는 세포의 표면으로부터 발아시에 외막을 획득하면서 생성된다. 다음 이 세포외 바이러스(ECV)는 지질체 세포(fat body cells), 표면세포(epidermal cells) 및 임파세포(hemolymph)를 포함하는 곤충의 다른 세포를 감염시킨다. 이러한 감염의 초기단계 이후, 폐색체에서 폐색된 바이러스가 생성된다. 폐색체의 생성은 세포가 궁극적으로 사멸하거나 분해될 때까지 계속된다. 어떤 바쿨로바이러스는 실질적으로 숙주 곤충의 모든 조직을 감염시키므로써 감염과정의 종료시점에서 다른 곤충으로 감염을 확산하는 매우 많은 수의 폐색체를 방출하면서 곤충 전체가 액화분해된다. 이에 관한 참조문헌으로는 "바쿨로바이러스 생물학(The biology of baculoviruses)" R. G. Granados and B. A. Federici, Eds., Vol.Ⅰand Ⅱ, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1986.
많은 바쿨로바이러스가 상업적으로 중요한 농업 및 산림단의 병해충을 감염시킨다. 따라서, 그러한 바쿨로바이러스는 생물학적인 방제제로서 잠재적인 가치가 있다. 오늘날, 수개의 다른 종류의 바쿨로바이러스가 살충제로서 미국 환경 보호 기관에 의하여 등록되었다. 이중 하나인 오토그라파 캘리포르니카
(Autographa californica) 핵 다면성 바이러스증 바이러스(multiple nuclear polyhedrosis virus)(AcMNPV)는 레피도프테라(Lepidoptera) 목 내에서의 광범위한 숙주범위로 인하여 생물학적 방제제로서의 용도가 잘 알려져 있다.
또 다른 바쿨로바이러스, 아나그라파 팔시페라(Anagrapha falcifera) 핵 다면성바이러스증(multiple nuclear polyhedrosis) 바이러스 (AfMNPV)가 최근에 셀러리 루퍼(celery looper)로부터 분리되었으며, REN 형식 및 헬리오씨스 서브플렉사 (Heliothis subflexa) 유충에 대한 보다 큰 감염성에 있어서 AcMNPV와 구별된다. AfMNPV는 헬리코베르파 지아(H. zea) 및 헬리오씨스 바이레신스(H. virescence) 유충(larvae)에 대하여 거의 동등하게 감염성이고, 레피도프테라(Lepdoptera) 목에 있어서 10과에서 30종이상 광범위한 감염성을 갖는다.
발명의 배경
발명이 속하는 분야
본 발명은 병해충의 생물학적 제어에 사용되는 플루텔라 자이로스텔라 바쿨로바이러스(Plutella xylostella baculovirus)에 관계한다.
발명의 요약
병해충 방제에 유용한 신규 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella) 바쿨로바이러스를 발견하였다. 다양한 병해충는 표적 곤충의 궤적 또는 근처에 살충에 효과적인 양의 바쿨로바이러스를 적용함에 의하여 조절될 수 있다.
본 발견에 따른 본 발명의 목적은 병해충 방제용 생물학적인 방제제로서 유용한 신규 바쿨로바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 화학 살충제의 사용없이 플루텔라 자일로스텔라 (Plutella xylostella)를 포함하며 광범위한 병해충에 효과적인 바쿨로바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적인 방제제로서 바쿨로바이러스를 사용하는 병해충 제어방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적이자 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명인 신규 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella) 바쿨로바이러스는 바쿨로바이러스과에 속하는 핵 다면성바이러스증 바이러스이며 PxMNPV로 언급된다. 이 바쿨로바이러스는 다이아몬드백(diamondback) 나방의 유충, 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella)로부터 최초 분리되었으며, 플라크(Plaque)는 헬리오씨스 바이레신스 세포상에서 3차례 정제되었다. 현미경적으로, 감염된 유충에서 분리된 바이러스는 수 개의 단위로 폐색되어 단백성 결정 또는 폐색체(OB)가 된다. 다른 알려진 바쿨로바이러스와는 달리 PxMNPV는 플루텔라 자일로스텔라(P. xylostella)에 대하여 고도로 효과적이다. 또한, PxMNPV는 동족의 숙주 뿐만아니라, 다른 병해충에 대하여도 감염성이다.
본 발명인 상기 PxMNPV는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 1996년 9월 27일자로 부다페스트 조약(the Budapest Treaty)에 따라 기탁되었고(12301 Parklawn Drive, rockkville, Maryland, 20852, USA), 기탁번호는 No. ATCC VR-2543을 부여받았다.
본 발명의 목적을 위하여, ATCC VR-2543를 확인하는 특성 및 병해충, 특히 플루텔라 자일로스텔라(P. xylostella)에 대한 감염력을 갖는 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella) 핵 다면성바이러스증 바이러스(PxMNPV)의 분리물 또는 클론(clone)이 효과적이다.
PxMNPV의 대량 생산은 공지의 생체내 또는 생체외 기법을 사용하므로써 이루어질 수 있다. 양자의 경우에 있어서, 생성된 바이러스는 세포배양 내에서는 물론 숙주내에서 생산된 폐색체의 형태로 존재한다. 생체내 생산의 한 예에 있어서, 상기 바이러스는 전형적으로는 플루텔라 자일로스텔라(P. xylostella), 헬리오씨스 바이레신스(Heliothis virescens), 헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea), 트라이코플루시아 나이(Trichoplusia ni), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 헬리오씨스 서브플렉사(Heliothis subflexa) 및 스포도프테라 엑사이구아(Spodoptera exigua) 등의 감염성 곤충종의 유충에서 증식한다. 그러나, T. ni, H. virescens 및 P. xylostella 가 선호되는데 이는 이들이 가장 감염성이 큰숙주이기 때문이다. 요약하면, 숙주 곤충의 유충은 공지의 인위적인 먹이로 배양되고, PxMNPV 폐색체의 부유물로 처리된다. 수집된 감염 유충은 대개는 사멸즉시 또는 약 2-5일안에 액화되기에 앞서 균질화 되고, 조입자를 제거하기 위해 여과된다. 균등질결과물(homogenate)은 큰 분쇄물이 침강되도록 원심분리되고, 상징액이 제거된 후, 침강물은 멸균수 또는 다른 담체에 현탁되고 다시 원심분리된다.
소디움 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate)와 같은 적절한 세포 용해제가 어떤 오염 박테리아 또는 세포를 제거하기 위한 상기 과정중에 부유물에 첨가된다. PxMNPV OB를 함유하는 최종 세척된 부유물은 계속적인 사용을 위하여 보존 및 저장된다. 한 예로서, 여기에서의 용도에 알맞는 생체내 증식공정이 그 내용이 본 명세서에서 참고로 반영되는 호스테터(Hosteter) 및 푸틀러(Puttler)(미국특허 제4,911,913호)에 의해 상세히 기재되어 있다.
비록 바이러스가 상기 기술한 바와 같이 생체내에서 증식한다고 하더라도 그러한 방법은 오염에 민감하고 많은 노력이 필요하다. 따라서, 바람직한 실시예에 있어서, 바이러스는 세포배양으로 생산된다. 바이러스의 생체외 대량 생산은 매킨토시(미국특허 제5405770호, 1995. 4. 11.) 또는 매켄토시 및 이그노포(McIntosh and Ignofo)(1989, J. Invertebrate Pathology, 54:97-102)에 의해 기술된 것과 같은 공지의 방법을 사용하므로써 이룰 수 있다. 이 방법에 따르면, 적절한 곤충 셀라인(cell line)의 세포들은 공지의 배지에 제공되고, PxMNPV 세포외 (extracellular) 바이러스(ECV)로 접종된다. 접종원은, 예를들어, 감염후 약 2일째에 감염된 곤충을 출액(bleeding)하여 수집한 감염성 헤모림프(hemolymph) 또는 염기 처리로 OB로부터 분리한 바이러스를 포함한다. 물론, 일단 셀라인이 감염되면 ECV는 하기에 기술하는 것과 같이 수집되고 신선한 세포배양을 감염하는데 사용된다. 헬리오씨스 서브플렉사(Heliothis subflexa)(BCIRL-HS-AMI)(McIntoch, U.S. PATENT NO. 5,405,770) 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella)(BCIRL-PxEM1)(Kariuki,C.,1996,PhD thesis), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(IPlB-SF21)(Vaughn et al., 1977, In Vitro, 13:213-217), 트라이코플루시아 나이(Trichoplusia ni)(TN-CL1)(McIntoch et al., 1974, In Vitro, 10:1-5) 헬리오씨스 바이레신스(Helithio virescens)(BCIRL-HV-AMI)(McIntoch et al., 1981, U. Invertebr. pathol., 37:258-264) 및 헬리오씨스 지아(Heliothis zea)(BCIRL-HZ-FB33)(McIntoch et al., unpublished) 등을 포함하는, 그러나 이에 한정되는 것이 아닌, 다양한 곤충 셀라인이 여기서의 이용에 적합하다. 최고의 폐색체 생산성은 트라이코 플루시아 나이(T. ni) 셀라인(TN-CL1)을 사용하여 얻었으며, 따라서 이를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 용도에 적합한 다른 종류의 레피도프테라(Lepidoptera) 셀라인은 당업계의 공지의 기술을 사용하므로써 제조될 수 있다. 접종후에, 세포 배양물은 바이러스의 생산에 효과적인 조건에서 충분한 시간동안 배양된다.
생체외 세포배양 동안, 폐색된 바이러스(OB)와 자유로운 세포외 바이러스(ECV)가 모두 생산되나, 그 상대적인 비율은 사용되는 특정 셀라인에 다라 변한다(예를들어 TN- Cl1은 0B의 비율이 높다). ECV 및 OB는 생물학적 방제제로서 효과적이나, OBS가 건조와 같은 환경요인에 대해 보다 내성이 있다. 바이러스제(ECV 및 OB)는 당업계에서 공지의 기술수단을 이용하므로써 배양 상징액으로부터 수집되거나 수확된다. 예를들면, 바이러스는 본 명세서에 그 각각의 내용이 참고로 반영된 McIntosh and Ingnoffo(1981, J. Invert. Pathology, 37:258-264) Ignoffo and McIntosh(1986, J. Invert. Pathology, 48:289-295)에 기술된 것과 같이 배양 배지의 상징액을 원심분리 및 농축하여 회수된다.
다음으로 상기 바이러스는 공지의 수크로스(scrose) 구배 원심분리 및 플라크(plaque) 분석으로 정제된다. 세포 농도, 감염의 복합성, 시간, 온도 및 배지를 포함하는 배양조건은 당업자의 숙련된 전문가에 의하여 손쉽게 결정된다. 실제적인 문제에 있어서, 본 바이러스성 살충제의 상업적인 제형(formulation)은 세포 배양, 유충 균질물(homogenates) 또는 상기 균질물로부터 얻어진 파편으로부터 직접 제조되는 것이 기대되고, 이에 따라 순수한 형태의 바이러스를 분리할 필요성이 없어진다. 다른 적합한 수단이 숙련된 전문가에 의하여 손쉽게 결정될 수 있다. 물론, 고도의 특이성, 즉 표적 또는 비표적 유기체에 의한 의도하는 반응에 대한 고도의 예측가능성을 요구하는 적용에 있어서는, 순수한 또는 본질적으로 순수한 바이러스로부터 제형을 준비하는 것이 바람직하다. 예를들어, 유충내의 외계 물질은 의도하는 반응과는 달리 바람직하지 않은 효과를 가질 수 있다.
PxMNPV는 당해 기술분야에서 알려진 농업적으로 수용가능한 담체 또는 운반체와 결합하여 적용될 수 있다. 적절한 화학담체의 예로는, 활석(talc), 질석(vermiculite), 셀룰로스 또는 당(sugar), 가용성 분말과 같은 불활성 고체 및 물 또는 식물성유와 같은 불활성 액체가 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 바이러스는 살충효과를 증가시키기 위하여 유착제, 곤충 유인제(즉, 유인 살충제), 계면활성제, 습윤제(wetting agent), 자외선 안정제(UV stabilizer) 또는 다른 생물학적인 방제제 또는 화학 살충제와 같은 공지의 첨가제와 결합하여 조성될 수 있다.
기질, 표적 종, 적용방법 및 요구되는 반응형태에 따라, 최종 조성물에서의 바이러스의 농도가 상당량 변화되나 전형적으로는 적어도 약 5×1011내지 5×1012bodies/acre 이어야 한다. 처리되는 식물에 대한 식물독성 및 비표적 종의 내성과 같은 요인은 최대수준을 결정함에 있어서 숙련된 전문가에게 이용될 수 있다.
바이러스와 같은 곤충 병원체의 경우에는 병원체를 분배하는 생물학적 담체를 사용하는 것이 바람직하다. 그와 같은 생물학적 담체로는, 예를들어, 표적종에 밀접하게 관련되었으나 그 자체는 병원체에 감염되지 않는 곤충 종이 있다. 본 명세서에서는, "담체"란 생물학적 및 불활성 화학 담체를 모두 포함하는 것으로 정의된다.
바이러스는 일반적인 실험에 의한 예측에 따라 감염을 감소시키는데 유효한 양으로 투여된다. 궁극적인 반응은 살충에 있으므로, "유효량" 및 "살충 유효량"은 대조군과 비교할 때 실험군에 있어서 현저한 치사율을 초래할 수 있는 바이러스의 양으로 정의된다. 유효량은 해충의 종, 유충의 발전단계, 기질의 성질, 운반체 또는 담체의 형태, 처리기간 및 기타 관련요인에 따라 변한다.
효과적으로는, 바이러스는 곤충에 의해 섭취되어야 한다; 따라서, 바이러스가 제어되는 표적 곤충에 직접 적용되거나 또는 곤충의 궤적 또는 근체에 적용되어야 한다. 표적 곤충으로 감염된 식물에 있어서, 바이러스는 전형적으로는 분무 또는 살포에 의하여 군엽과 같은 식물 표면에 적용된다.
본 발명에 포함되는 바이러스성 살충은 다양한 종류의 곤충을 조절하는데 효과적이다. 처리에 취약한 것으로 알려진 특히 흥미있는 곤충은 농업적으로 중요한 곤충으로, 특히 레피토프테라(Lepidoptera)목 및 보다 특이적으로는 다이아몬드백 나방(diamondback moth)(Plutella xylostella), 담배벌레(tobacco budwarm)(Heliothis virescens), 옥수수벌레(corn earworm)(Helicoverpa zea), 양배추벌레(cabbage looper)(Trichoplusia ni), 비트벌레(beet armyworm)(Spodoptera exigua), 헬리오씨스 서브플렉사(Heliothis subflexa) 및 폴 아미웜(fall armyworm)(Spodoptera frugiperda).
다음의 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것이며, 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.
실험예 1
엔도뉴클리아제 제한효소 분석
PxMNPV의 DNA는 다음의 바쿨로바이러스의 DNA와 비교되었다: 오토그라파 캘리포르니카(Autographa californica)(AcMNPV), 아나그라파 팔시페라(Anagrapha falcifera)(AfMNPV), 헬리오씨스 지아(Heliothis zea)(HzSNPV), 헬리코베르파 아미게라(Helicoverpa armigera)(HaMNPV) 및 안티카르시아 게마탈리스(Anticarsia gemmatalis)(AgMNPV). 각 바이러스의 DNA는 HindⅢ, XhoⅠ, BstⅡE 및 BamHⅠ 등 4개의 다른 종류의 효소를 사용하는 엔도뉴클리아제 제한효소 분석에 적용되었다. 그 내용이 본 명세서에 참고로 반영되는 McIntosh 및 Ignoffo(1986, Intervirology, 25:172-176)에 기술된 것과 같은 공지의 방법으로 효소 분해 프로필(Profile)이 준비되고 분석되었다. 양자를 비교함에 있어서, 분해 프로필은 PxMNPV DNA가 모든 다른 바이러스와, 특히 HindⅢ 및 BamHⅠ에 의해 생성되는 제한 단편 길이 다형성(RELP)에 있어서, 다르다는 것이 입증되었다.
또한, 바쿨로바이러스 DNA의 교잡에 대한 연구가 PxMNPV DNA의 비-방사성 표식 프로브(probe)를 사용하여 수행되었다. 그 결과는, PxMNPV DNA가 비록 AcMNPV와 관련되나 분명한 차이가 있음을 보여주었다.
실험예 2
중화 실험
PxMNPV가 항체 중화 분석을 통하여 AcMNPV 및 AfMNPV과 비교되었다. 표 1에 제시된 AcMNPV-토끼 항혈청의 다양한 희석이 수개의 각 바이러스와 혼합되고 28℃에서 2시간 동안 배양되었다. 처리된 샘플은 감염성 세포 배양에 접종, 배양된후 접종후 7일째에 실험되었다. 알려진 고 희석된 항혈청에 의한 바이러스 분리물 감염성의 완전한 중화는 상기 분리물이 항혈청을 제조하는데 사용되는 바이러스와 일치하거나 매우 밀접하게 관련된다는 것을 보여주었다. CPE{폐색체(OBs)의 생성}가 전혀 없는 결과를 초래한 최고 희석된 항혈청은 중화 역가로 간주되었다.
그 결과는 표1a, b 및 c에 제시되었다. 접종된 세포내에서 폐색체(OBs)의 생성이 없는 세포병리(Cytopathic) 효과(CPE)는 바이러스가 항체에 의해 중화되었음을 지시한다. 표1a에서 제시되는 바와 같이, 103TCID50투여량에서 AcMNPV의 중화 적정량은 1:512 인 반면에, PxMNPV의 중화 적정량은 1:8(표1b) 이다. 반면에, AcMNPV의 변종인 AfMNPV는 AcMNPV에 대한 밀접한 연관성을 확증하며, 1:256(표1c)의 중화 적정량을 갖는다.
실험예 3
곤충 세포 배양
6개의 다른 종류의 레피도프테라 셀라인에 대하여 PxMNPV의 증식 및 복제력에 대한 비교가 있었다. 사용된 셀라인은 헬리오씨스 서브플렉사(Heliothis subflexa)(BCIRL-HS-AMI)(McIntosh U.S. patent no. 5,405,770), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(IPLB-SF21)(Vaughn et al., 1977, In Vitro, 13:213-217), 트라이코플루시아 나이(Trichoplusia ni)(TN-CL1)(McIntosh et al., 1974, In Vitro, 10:1-5), 플루텔라 자이일로스텔라(Plutella xylostella) BCIRL-PxEM1(Kariuki, C., 1996, PhD these), 헬리오씨스 바이레신스(Heliothis virescens)(BCIRL-HV-AM1)(McIntosh et al., 1981, In Vitro, 17:649-650) 및 헬리오씨스 지아(Heliothis zea)(BCIRL-HZ-FB33)(McIntosh et al., unpublished) 등이다.
PxMNPV의 클론(clone)이 모든 셀라인 배양물을 접종하는데 사용되었다. 접종된 세포는 10%의 태아기 소 혈청, 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유하는 TC199-MK 배지에서 7일간 28℃의 온도로 배양되었다. 바이러스 적정(TCID5o)은 매킨토시 등(1985, Intervirology 23:150-156 및 1989, J. Invertebrate Pathology, ibid)이 제시한 바와 같이 지표 셀라인 및 폐색체의 수를 셈하는 방법으로, TN-CL1 세포를 사용하여 분석되었다.
상기 6개의 모든 셀라인은 가장 높은 수치의 OB/cell을 생성하였고, PxMNPV에 감염성이 있었다.
실험예 4
생체분석
PxMNPV는 두개의 다른 바쿨로바이러스, AcMNPV 및 AfMNPV에 대해 그 내용이 본 명세서에서 참고로 반영되는 Ignoffo(1966, J. Invertebr. Pathol., 8:531-536) 및 Ignoffo 등(1974, Environmental Entomol., 3:117-19)이 제시한 표준 생체분석을 사용하여 7개의 레피도프테라 해충에 대한 그 효력을 비교하였다. 다음의 곤충에 대한 그 효력이 조사되었다: 다이아몬드백 나방(diamondback moth)(Plutella xylostella), 담배벌레(tobacco budwarm)(Heliothis virescens), 옥수수벌레(corn earworm)(Helicoverpa zea), 양배추벌레(cabbage looper)(Trichoplusia ni), 비트벌레(beet armyworm)(Spodoptera exigua), 헬리오씨스 서브플렉사(Heliothis subflexa) 및 폴 아미웜(fall armyworm)(Spodoptera frugiperda). 24시간 성장한 상기 각 종은 연속적 먹이 공급 분석하에서 다양한 농도의 폐색체로 접종된 인공먹이 표면에 놓여졌다.
그 결과는 표2a,b 및 c에 제시된다. 표2에서 확인되는 바와 같이, 단지 5.54 OB/㎠의 LC50적용량만을 요구하는 PxMNPV가 플루텔라 자일로스텔라(P. xylostella)에 대하여 가장 효과적인 바쿨로바이러스였다. 이와 대조적으로, 플루텔라 자일로스텔라(P. xylostella)에 대한 AcMNPV 및 AfMNPV의 LC50값은 각각 11,600 OB/㎠ (표2b) 및 9,224 OB/㎠ (표2c) 였다. 조사된 다른 병해충과 비교하여도 PxMNPV가 AcMNPV 및 AfMNPV에 비해 효과적이었다. 또한, PxMNPV는 미국의 서부 및 남서부에서 가장 주요한 해충인 비트 벌레(S. exigua)에 대하여 가장 효과적이었다. 이 해충에 대한 상기 3개의 바쿨로바이러스의 LC50값은 69.61 OB/㎠ (PxMNPV), 200.84 OB/㎠ (AcMNPV), 167.59 OB/㎠ (AfMNPV)(표2a,b 및 c) 였다.
플루텔라 자일로스텔라(P. xylostella)에 대한 PxMNPV, AcMNPV, AfMNPV의 LT50은 각각 6일, 100일(extroplated) 및 32일(extroplated)로서, 이는 PxMNPV가 다른 바쿨로바이러스 보다 신속하게 다이아몬드백 나방 유충을 사멸하는 것을 보여주었다. 보다 신속한 사멸은 병해충 처리한 식물에 대하여 보다 적은 손상을 가져온다.
상기 상세한 설명은 단지 하나의 예시일 뿐이며, 본 발명의 본질 및 범위를 벗어나지 않는 범위에서 수정 및 변형이 가능하다.
표 1
오토그라파 켈리포니카(Autographa californica) 핵 다면성바이러스증 바이러스 (Multiple nuclear Polyhedrosis virus) 토끼 항혈청에 의한 3개의 다른 종류의 바쿨로바이러스의 중화반응.
a) AcMNPV(wt)/AcMNPV-항혈청
| 항혈청 희석 | 바이러스 적정(TCID50/㎖) | |||
| 105 | 104 | 103 | 102 | |
| 1:8 | -- | -- | -- | -- |
| 1:16 | -- | -- | -- | -- |
| 1:32 | [--] | -- | -- | -- |
| 1:64 | ++ | -- | -- | -- |
| 1:128 | ++ | [--] | -- | -- |
| 1:256 | ++ | -+ | -- | -- |
| 1:512 | ++ | ++ | [--] | -- |
| 1:1024 | ++ | ++ | -+ | -- |
| 1:2048 | ++ | ++ | ++ | -- |
| 1:4096 | ++ | ++ | ++ | -- |
| 1:8192 | ++ | ++ | ++ | -- |
| 대조 | ++ | ++ | ++ | -- |
+ OB 있음
- OB 없음
[--] 다양한 바이러스 적용량에 있어서 중화적정량
b) PxNPVCL1/AcMNPV-항혈청
| 항혈청 희석 | 바이러스 적정(TCID50/㎖) | |||
| 105 | 104 | 103 | 102 | |
| 1:8 | ++ | -+ | [--] | -- |
| 1:16 | ++ | ++ | -+ | -- |
| 1:32 | ++ | ++ | -+ | [--] |
| 1:64 | ++ | ++ | -+ | -+ |
| 1:128 | ++ | ++ | ++ | -+ |
| 1:256 | ++ | ++ | ++ | -+ |
| 1:512 | ++ | ++ | ++ | -+ |
| 1:1024 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 1:2048 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 1:4096 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 1:8192 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 대조 | ++ | ++ | ++ | ++ |
+ OB 있음
- OB 없음
[--] 다양한 바이러스 적용량에 있어서 중화적정량
c) AfNMPVCL1(wt)/AcMNPV-항혈청
| 항혈청 희석 | 바이러스 적정(TCID50/㎖) | |||
| 105 | 104 | 103 | 102 | |
| 1:8 | -- | -- | -- | -- |
| 1:16 | [--] | -- | -- | -- |
| 1:32 | +- | [--] | -- | -- |
| 1:64 | ++ | +- | -- | -- |
| 1:128 | ++ | +- | -- | -- |
| 1:256 | ++ | +- | [--] | -- |
| 1:512 | ++ | ++ | +- | -- |
| 1:1024 | ++ | ++ | +- | -- |
| 1:2048 | ++ | ++ | +- | -- |
| 1:4096 | ++ | ++ | +- | -- |
| 1:8192 | ++ | ++ | +- | -- |
| 대조 | ++ | ++ | +- | -- |
+ OB 있음
- OB 없음
[--] 다양한 바이러스 적용량에 있어서 중화적정량
표 2
다양한 종류의 발생초기 레피도프테라 유충의 바쿨로바이러스에 대한 감염성
a) PxMNPVCL3
| 곤 충 | Slope±SE | LC50(95% FL)a | RRb |
| Plutella xylostella | 0.60±0.03 | 5.54(3.10-8.91) | - |
| Helicoverpa zea | 0.88±0.03 | 36.79(26.37-50.85) | 6.64 |
| Heliothis subflexa | 1.38±0.05 | 24.06(18.53-30.87) | 4.34 |
| Heliothis virescens | 1.39±0.05 | 6.38(4.96-8.12) | 1.15 |
| Trichoplusia ni | 1.17±0.04 | 7.36(5.49-9.67) | 1.33 |
| Spodoptera frugiperda | 0.57±0.03 | 576.53(331.27-1186.48) | 104.07 |
| Spodoptera exigua | 2.09±0.09 | 69.61(55.84-85.45) | 12.56 |
a=OB/㎠ (FL=신뢰한계) b=내성비율 n=150
b) AcMNPV(wt)
| 곤 충 | Slope±SE | LC50(95% FL)a | RRb |
| Plutella xylostella | 1.02±0.04 | 11600.22(8534.89-15776.59) | 4658.63 |
| Helicoverpa zea | 1.02±0.04 | 3.06(2.07-4.27) | 1.23 |
| Heliothis subflexa | 1.18±0.04 | 22.12(16.81-28.86) | 8.88 |
| Heliothis virescens | 1.52±0.06 | 4.73(3.71-5.95) | 1.89 |
| Trichoplusia ni | 1.31±0.06 | 2.49(1.83-3.28) | - |
| Spodoptera frugiperda | 1.04±0.05 | 606.72(435.10-900.31) | 243.66 |
| podoptera exigua | 1.59±0.06 | 200.84(161.27-250.94) | 80.66 |
a=OB/㎠ (FL=신뢰한계) b=내성비율 n=150
c) AFMNPVCL1
| 곤 충 | Slope±SE | LC50(95% FL)a | RRb |
| Plutella xylostella | 0.82±0.03 | 9224.48(6480.63-13229.39) | 3859.6 |
| Helicoverpa zea | 0.86±0.03 | 76.23(54.36-107.19) | 31.89 |
| Heliothis subflexa | 1.86±0.08 | 4.29(3.46-5.28) | 1.79 |
| Heliothis virescens | 1.50±0.06 | 3.37(2.61-4.27) | 1.41 |
| Trichoplusia ni | 1.34±0.07 | 2.39(1.77-3.10) | - |
| Spodoptera frugiperda | 1.00±0.04 | 186.31(137.47-256.14) | 77.95 |
| podoptera exigua | 1.47±0.06 | 167.59(131.88-212.46) | 70.12 |
a=OB/㎠ (FL=신뢰한계) b=내성비율 n=150
상기 다수의 실험예로부터 확인되는 바와 같이 본 발명에 따른 신규 플루텔라 자일로스텔라 바쿨로바이러스는 생물학적 방제제로서 플루텔라 자일로스텔라를 포함한 광범위한 병해충에 유효하고, 이를 표적 곤충의 궤적 또는 근처에 살충에 효과적인 양으로 적용하므로써, 환경오염 및 건강우려가 없는 생물학적 방제제로 사용될 수 있다.
Claims (8)
- ATCC VR-2543의 모든 특성을 포함하고 생물학적으로 순수한 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella) 핵 다면성바이러스증 바이러스를 포함하는 것을 특징으로하는 바이러스성 곤충 제어제.
- 제1항에 있어서, 상기 바이러스가 폐색체인 것을 특징으로하는 바이러스성 곤충 제어제.
- 제1항의 바이러스 및 농업적으로 수용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로하는 살충 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 담체가 불활성인 것을 특징으로하는 살충 조성물.
- 곤충의 궤적에 제1항의 바이러스성 곤충 제어제를 살충에 효과적인 양으로 적용하는 것을 포함하는 곤충 제어방법.
- 제5항에 있어서 상기 곤충이 레피도프테라(Lepidiptera) 목인 것을 특징으로하는 곤충제어방법.
- 제6항에 있어서, 상기 곤충은 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella), 헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea), 헬리오씨스 서브플렉사(Heliothis subflexa)헬리오씨스 바이레신스(Heliothis virescens), 트라이코플루시아 나이(Trichoplusia ni), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 스포도프테라 엑사이구아(Spodoptera exigua)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로하는 곤충 제어방법.
- 제6항에 있어서, 상기 곤충은 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella), 헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea), 헬리오씨스 바이레신스(Heliothis virescens) 및 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로하는 곤충 제어방법.
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