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KR20000023111A - 아베르멕틴 생성을 증가시키기 위한 스트렙토마이시즈아베르미틸리스 조절 유전자 - Google Patents

아베르멕틴 생성을 증가시키기 위한 스트렙토마이시즈아베르미틸리스 조절 유전자 Download PDF

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KR20000023111A
KR20000023111A KR1019990039097A KR19990039097A KR20000023111A KR 20000023111 A KR20000023111 A KR 20000023111A KR 1019990039097 A KR1019990039097 A KR 1019990039097A KR 19990039097 A KR19990039097 A KR 19990039097A KR 20000023111 A KR20000023111 A KR 20000023111A
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스튜츠만-엥왈킴조넬
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실버스타인 아써 에이.
화이자 프로덕츠 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 아베르멕틴을 생성하는 조성물 및 방법에 관한 것이고, 특히 동물 건강 분야에서의 아베르멕틴을 생성하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)에서 아베르멕틴 폴리케타이드 신타아제(PKS) 발현 및 아베르멕틴 생합성을 조절하는데 관여하는 신규한 2개 유전자(본원에서 aveR1 또는 aveR2 유전자로 칭함)를 확인하고 특징화하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 상기 유전자를 불활성화시키면 스트렙토마이시스 아베르미틸리스에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이 증가한다는 발견에 근거한 것이다.

Description

아베르멕틴 생성을 증가시키기 위한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 조절 유전자{STREPTOMYCES AVERMITILIS REGULATORY GENES FOR INCREASED AVERMECTIN PRODUCTION}
본 발명은 아베르멕틴을 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이고, 주로 동물 건강 분야에서의 상기 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스에서의 아베르멕틴 폴리케타이드 신타아제(PKS) 발현 및 아베르멕틴 생합성의 조절에 관련된, 본원에서 aveR1 및 aveR2 유전자로 지칭되는 두개의 신규한 유전자를 확인하고 특성을 밝히는 것에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 유전자들의 불활성화가 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스에 의해 생성되는 아베르멕틴의 양을 증가시킨다는 발견에 기초한다.
스트렙토마이시즈 종은 강력한 구충 및 살충 활성을 갖는 일련의 8개의 동족 16원 거대고리 락톤을 포함하는 아베르멕틴을 비롯한 매우 다양한 이차 대사산물을 제조한다. 구별되지만 밀접하게 연관된 8개 화합물은 A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a 및 B2b로서 나타낸다. 화합물의 "a" 시리즈는 C25 위치에서 치환기가 (S)-이급-부틸인 천연 아베르멕틴을 나타내고, "b" 시리즈는 C25 위치에서 치환기가 이소프로필인 화합물을 나타낸다. "A" 및 "B"라는 표시는 C5에서 치환기가 각각 메톡시 및 하이드록시인 아베르멕틴을 나타낸다. 숫자 "1"은 이중 결합이 C22 및 C23 위치에 존재하는 아베르멕틴을 나타내고, 숫자 "2"는 C22 위치에 수소를 갖고 C23 위치에 하이드록시를 갖는 아베르멕틴을 나타낸다. 동족 아베르멕틴중에서, B1 유형의 아베르멕틴은 가장 효과적인 구충 및 살충 활성을 갖는 것으로 인지되어 있고, 결국 가장 상업적으로 바람직한 아베르멕틴이다.
아베르멕틴, 및 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 호기성 발효에 의한 그의 제조 방법은 다른 문헌중에서 미국 특허 제 4,310,519 호 및 제 4,429,042 호에 기재되어 있다.
이차 대사물질 및 다른 스트렙토마이시즈 항생물질의 제조에 포함되는 많은 유전자와 같이, 아베르멕틴(ave) 유전자는 박테리아 염색체상에서 클러스터 상태로 발견된다. 아베르멕틴 생합성을 위한 ave 유전자 클러스터는 아베르멕틴 폴리케타이드 신타아제(PKS)를 코딩하는 DNA를 포함하는 DNA의 95kb 게놈 단편에 이른다(맥테일(MacNeil) 등의 문헌[1992년, Gene 115: 119-125]).
스트렙토마이시즈에서의 항생물질 생합성의 조절은 스트렙토마이시즈 코엘리칼라 종에서 가장 특징화되어 있다. 스트렙토마이시즈 코엘리칼라에 의해 제조된 4가지의 항생물질은 안티노로딘(Act), 운데실프로디지오신(Red), 칼슘 의존성 항생물질(CDA) 및 메틸레노마이신(Mmy)을 포함한다. 이러한 각각의 항생물질은 유전적으로 구별되는 유전자의 상이한 클러스터에 의해 코딩된다. 유전자들은 Act 생합성 유전자 클러스터 또는 Red 생합성 유전자 클러스터의 발현을 각각 특이적으로 조절하는 생성물을 코딩하는 Act 유전자 클러스터 또는 Red 유전자 클러스터중 하나에 연결된 것으로 확인되어 왔다. 항생적 생합성 유전자 클러스터중 하나 이상을 전반적으로 조절하는 유전자를 함유하는 다수의 위치가 또한 확인되었다. 예를 들면, 두개의 독립적인 위치, 즉 absA 및 absB에서의 스트렙토마이시즈 코엘리칼라에서의 4개의 모든 항생물질의 합성을 차단하는 것으로 나타났다(브라이언(Brian) 등의 문헌[1996, J. Bact. 178: 3221-3231]). absA 유전자 위치는 클로닝되고 특징화되었고 그의 유전자 산물은 스트렙토마이시즈 코엘리칼라에서의 항생물질 합성의 전반적인 음성 조절자로서 주로 작용하는 신호 형질전환 경로에 관련된 것으로 나타났다(브라이언 등의 전술한 1996년 문헌).
데노야(Denoya)에게 허여된 미국 특허 제 5,707,839 호 및 데노야 등에게 허여된 미국 특허 제 5,728,561 호는 스트렙토마이시즈의 분지쇄 알파-케토산 데하이드로제나제 착체를 코딩하는 DNA 서열 및 신규한 아베르멕틴의 생성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.
유형 I의 폴리케타이드 신타아제 발현이 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스에서 조절되는 것으로 메카니즘을 이해하게 되면 ave 유전자의 유전적 조작을 통해 아베르멕틴의 제조를 증가시킬 수 있다.
본 발명에서는 증가된 양의 아베르멕틴을 생성할 수 있도록 하는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 종 또는 균주의 aveR1 또는 aveR2 유전자를 확인하고 그 특성을 밝혀서, 상기와 같은 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자 및 이러한 분자를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
도 1a에 따르면, 스트렙토마이시즈 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor) 히스티딘 키나아제 상동체(absA1)에 의해 코딩되어 도출된 아미노산 서열과 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR1 유전자에 의해 코딩되어 도출된 아미노산 서열의 비교에 의해 약 32% 서열이 동일함을 나타낸다.
도 1b에 따르면, 스트렙토마이시즈 코엘리칼라 반응 조절제 상동체(absA2)에 의해 코딩되어 도출된 아미노산 서열과 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR2 유전자에 의해 코딩되어 도출된 아미노산 서열의 비교에서 약 45%의 서열이 동일함을 나타낸다. 고도로 보호된 아미노산은 진하게 표시된 부분이다.
도 2a는 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF를 함유하는 플라스미드 벡터 pSE201(ATCC 203182)을 나타낸다.
도 2b는 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF를 함유하는 플라스미드 벡터 pSE210을 나타낸다.
도 3a는 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF의 일부를 치환한 ermE 유전자를 함유하는 유전자 치환 벡터 pSE214를 나타낸다.
도 3b는 aveR2 ORF로 삽입된 ermE 유전자를 함유하는 유전자 치환 벡터 pSE21을 나타낸다.
도 4는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 아베르멕틴 폴리케타이드 신타아제 유전자 클러스터의 BamHI 제한 지도를 나타내며, 여기서 5개의 중첩되는 코스미드 클론(즉, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69)이 확인되었다.
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR1 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 바람직한 태양에서, aveR1 유전자 산물은 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함한다. 비제한적인 태양에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 비제한적인 태양에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호:1 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호:2의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 언급된 본 발명의 임의의 aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자중 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 바람직한 태양에서, aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR1 유전자 산물의 펩타이드 단편 또는 본 발명의 aveR1 유전자-관련된 동형의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 제한적이지 않은 특정 태양에서, 본 발명은 서열번호:2의 아미노산 서열의 하부 서열로 구성되는 펩타이드 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹(flanking)시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 이러한 플랭킹 서열은 서열번호:1 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 1111 및 대략 뉴클레오타이드 2318 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자중에서 각각의 플랭킹 서열 또는 그의 상동체는 바람직하게는 길이가 약 200뉴클레오타이드 이상이다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹시키는 상기 언급한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 추가로 예를 들면 서열번호:1 의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317 또는 그의 상당 부분으로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열과 같은 본 발명의 상기 언급된 aveR1-관련 뉴클레오타이드 서열중 하나를 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 바람직한 태양에 있어서, aveR2 유전자 산물은 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함한다. 비제한적인 태양에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:3(서열번호:3은 서열번호:1과 동일함을 주지)의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 비제한적인 태양에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:3의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호:4의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
본 발명은 상기 언급된 본 발명의 임의의 aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 바람직한 태양에서, aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR2 유전자 산물의 펩타이드 단편 또는 본 발명의 aveR2-관련된 동형의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 제한적이지 않은 특정 태양에서, 본 발명은 서열번호:4의 아미노산 서열의 하부 서열로 구성되는 펩타이드 단편을 코딩시키는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 이러한 플랭킹 서열은 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 2313 및 대략 뉴클레오타이드 3022 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자중에 각각의 플랭킹 서열의 길이는 바람직하게는 약 200뉴클레오타이드 이상이다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 상기 언급한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 추가로 예를 들면 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021 또는 그의 상당 부분에 나타나는 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열과 같은 본 발명의 상기 언급된 aveR2-관련 뉴클레오타이드 서열중 하나를 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 및 aveR2 유전자 산물 둘다를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 바람직한 태양에서, aveR1 및 aveR2 유전자 산물은 각각 서열번호:2 및 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함한다. 비제한적인 태양에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021에 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 비제한적인 태양에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 3021의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 비제한적인 태양에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 및 aveR2 ORF 둘다의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021에 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
본 발명은 서열번호:2의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 제 1 폴리펩타이드 및 서열번호:4의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 제 2 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 및 aveR2 유전자 산물 둘다를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 언급한 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분 또는 이에 동형인 상기 언급한 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 제한적이지 않은 특정 태양에서, 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 나타나는 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열로 구성된다. 제한적이지 않은 다른 특정 태양에서, 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021에 나타나는 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열로 구성된다.
본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 및 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 이러한 플랭킹 서열은 서열번호:1 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 1111 및 대략 뉴클레오타이드 3022 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택될 수 있다. 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 및 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자중의 각 플랭킹 서열 또는 그의 상동체의 길이는 바람직하게는 약 200뉴클레오타이드 이상이다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 및 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 상기 언급한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 뉴클레오타이드 서열에 동형인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 추가로 예를 들면 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021 및 그의 상당 부분에서 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열과 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 및 aveR2 유전자 산물중 하나 또는 둘다를 코딩하는 본 발명의 상기 언급한 하나의 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명의 상기 언급한 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 그의 일부를 증폭시키는 프라이머로서 유용하거나 또는 ave 유전자 발현 및 아베르멕틴 생성을 조절하는 데에 유용한 안티-센스(a뉴클레오타이드i-sense) 분자로서 코딩하거나 작용하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
본 발명은 클로닝 벡터, 발현 벡터, 임의의 상기 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포, 및 그로부터 유도된 신규한 균주 또는 세포주를 비롯한, 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 올리고뉴클레오타이드 분자를 클로닝하고 발현시키기 위한 조성물 및 방법을 추가로 제공한다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현에 필요한 하나 이상의 조절 요소와 작용가능하게 결합된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 제한적이지 않은 특정 태양에서, 본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 및 aveR2 유전자 둘다의 완전한 ORF를 포함하는 플라스미드 pSE201(ATCC 203182)를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 코딩된 실질적으로 정제되거나 단리된 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 비제한적인 특정 태양에서, 폴리펩타이드는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 aveR1 유전자 산물이다. 비제한적인 다른 특정 태양에서, 폴리펩타이드는 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 aveR2 유전자 산물이다. 본 발명은 본 발명의 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물중 하나와 동형인 실질적으로 정제되거나 단리된 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 본 발명은 본 발명의 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 실질적으로 정제되거나 단리된 폴리펩타이드 단편 또는 이와 동형인 폴리펩타이드를 추가로 제공한다.
본 발명은 특정한 코딩된 유전자 산물, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편의 발현에 도움이 되는 조건하에 본 발명의 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 유전자 산물, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 세포 배양물로부터 수거함을 포함하는, 본 발명의 실질적으로 정제되거나 단리된 aveR1 유전자 산물, aveR2 유전자 산물, 동형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 예를 들면 유전자 치환 벡터와 같은 유전적 구조물을 비롯한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 조성물 및 방법을 추가로 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 바와 같이, 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포는 유전적으로 변형되어, 이와 같이 변형되지 않은 동일한 종 또는 균주의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양과 검출될만큼 다른 양의 아베르멕틴을 생성한다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포는 유전적으로 변형되어, 이와 같이 변형되지 않은 동일한 종 또는 균주의 세포에 의해 생성된 양에 비해 검출될 만큼 증가된 양의 아베르멕틴을 생성한다. 추가의 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈의 종은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스이다. 본 발명에 따라서, 상기의 유전적 변형은 바람직하게는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다를 변이시킴을 포함하고, 이러한 변이는 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 균주 세포에 비해 검출될 만큼 증가된 양의 아베르멕틴을 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다에서의 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생성한다. aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다의 변이는 화학적 변이 유발물질 또는 방사선에 노출시킴을 비롯한 표준 변이적 기술을 사용하거나, 뉴클레오타이드의 첨가, 제거 또는 치환에 의해서, 또는 프레임-시프트(frame-shift)를 도입하여서, 또는 상이한 또는 이형의 뉴클레오타이드 서열을 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자로 삽입하거나, 또는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다의 일부 또는 전부를 제거하거나 상이한 또는 이형의 뉴클레오타이드 서열로 치환시키거나 또는 이러한 변이의 조합에 의해 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다를 변이시키는, 예를 들면 유전자 치환 벡터와 같은 본 발명에 의해 제공된 유전적 구조물의 사용에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 (a) 특정한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; (b) 상기 종 또는 균주 세포의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다에 변이를 도입하는 단계; 및 (c) (b) 단계에서 생성된 바와 같은 유전자 변이를 수행한 세포에 의해 제조된 아베르멕틴의 양을 유전자 변이를 수행하지 않은 (a) 단계의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양과 비교하는 단계를 포함하여, 만약 (b) 단계에서 생성된 바와 같이 유전자 변이를 수행하는 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이 유전자 변이를 수행하지 않은 (a) 단계의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양보다 검출가능할 정도로 많으면, 아베르멕틴의 양을 검출가능할 정도로 증가시킬 수 있는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다의 변이가 확인되는, 스트렙토마이시즈 종 또는 균주에서 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다의 변이를 확인하는 방법을 추가로 제공하는데, 상기 변이는 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을 검출가능할 정도로 증가시킬 수 있다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 종은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스이다.
본 발명은 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에서 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다를 변이시키는 단계 및 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 비해 변이의 결과로서의 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 특정한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주로부터 유전적으로 변형된 세포를 제조하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 변형된 세포는 종 또는 균주의 비변형 세포에 비해 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성한다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈의 종은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스이다. 하기 2.9.1 단락에 기재된 비제한적인 특정 태양에서, 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다는 각 유전자의 ORF의 일부를 이형 유전자로 치환함으로써 변이시켜, aveR1 유전자 및 aveR2 유전자가 상기와 같이 변이되지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 세포에 비해 검출가능하게 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스를 생성하게 되었다. 하기 2.9.2 단락에 기재된 비제한적인 특정 태양에서, 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 유전자는 이형 유전자를 aveR2 ORF에 삽입함으로써 변이시켜, 이로써 aveR2 유전자가 상기와 같이 변이되지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 세포에 비해 검출가능하게 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스를 생성하게 되었다.
본 발명은 스트렙토마이시즈의 신규한 균주를 추가로 제공하고, 이 때 상기 스트렙토마이시즈의 세포는 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 균주의 세포에 비해 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다에 대한 하나 이상의 변이의 결과로서 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성시킨다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 균주는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 종으로부터 유래된다. 본 발명의 신규한 균주는 상업적으로 바람직한 도라멕틴(doramectin)과 같은 아베르멕틴의 대규모의 제조에 유용하다.
본 발명은 특정한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포를 배양하는 단계(이 때, 상기 세포는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자, 또는 aveR1 유전자 및 aveR2 유전자 둘다에서의 변이를 포함하고, 상기 유전자 변이는 아베르멕틴 생성을 허용하거나 유도하는 조건하의 배양물 배지에서 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 종 또는 균주의 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈의 종 또는 균주의 세포에 의해 제조된 아베르멕틴의 양을 측정가능하게 증가시키도록 작용한다) 및 배양물로부터 아베르멕틴을 수거하는 단계를 포함하는, 스트렙토마이시즈의 배양에 의해 생성되는 아베르멕틴의 양을 증가시키기 위한 방법을 추가로 제공한다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 종은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스이다. 이러한 공정은 아베르멕틴의 생산 효율을 증가시키는데 유용하다.
본 발명은 또한 본 발명의 aveR1 유전자 산물, aveR2 유전자 산물, 동형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편에 대한 항체를 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 및 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 확인하고 특성을 밝히고, 이러한 유전자의 변이가 아베르멕틴의 생성량을 조절할 수 있음을 발견한 것에 관한 것이다. 실시예에 의해서, 본 발명은 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317로 나타내거나 또는 플라스미드 pSE201(ATCC 203182)에 존재하는 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자, 서열번호:3(서열번호:3은 서열번호:1과 동일함을 주지)의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타내거나 또는 플라스미드 pSE201(ATCC 203182)에 존재하는 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자 및 그로부터 유도된 변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 대해 하기 단락에서 설명된다. 서열번호:1 및 3으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 및 그의 상당 부분에 대한 언급은 달리 언급되지 않는한 플라스미드 pSE201(ATCC 203182)에 존재하는 대응하는 뉴클레오타이드 서열 및 그의 상당 부분을 각각 나타내는 것이다. 또한, 서열번호:2 및 4로 나타내는 아미노산 서열 및 그의 펩타이드 단편에 관한 본원의 언급은 달리 언급되지 않는한 플라스미드 pSE201(ATCC 203182)에 존재하는 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 대응하는 AveR1- 및 AveR2-에 의해 코딩된 대응하는 아미노산 서열 및 그의 펩타이드 단편을 각각 나타내는 것이다.
1.1. 폴리뉴클레오타이드 분자
본원에 사용되는 "폴리뉴클레오타이드 분자", "폴리뉴클레오타이드 서열", "코당 서열" 및 "개방-판독기(ORF)" 등의 용어는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있는 DNA 및 RNA 둘다를 나타낸다. 코딩 서열 또는 ORF는 원핵성 서열, cDNA 서열, 게놈 DNA 서열 및 화학적으로 합성된 DNA 및 RNA 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자 및 올리고뉴클레타이드 분자의 생산 및 조작은 당해 분야의 기술 범주내에 있고 특히 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY], 아우수벨(Ausubel) 등의 문헌[1989, Greene Publishing Associates & Wiley I뉴클레오타이드erscience, NY], 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY], 인니스(Innis) 등이 편집한 문헌[1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego], 엘리취(Erlich)가 편집한 문헌[1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York] 및 홉우드(Hopwood) 등의 문헌[1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K.]에 기재된 재조합 기술에 따라 수행될 수 있고, 이들 문헌 모두는 본원에 참고로 인용되어 있다.
1.1.1. aveR1-관련된 폴리뉴클레오타이드 분자
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 바람직한 태양에서, aveR1 유전자 산물은 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함한다. 비제한적인 태양에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 비제한적인 태양에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 이런 측면에서 사용되는 경우 "동형"이라는 용어는 (a) 동일한 폴리펩타이드를 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317로 코딩하지만 유전자 코드의 축퇴에 따라서 뉴클레오타이드 서열에 대한 하나 이상의 불활동 변화를 포함하거나, (b) 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA에 대한 하이브리드 형성 및 42℃의 0.2 x SSC/0.1% SDS에서의 세척의 적절히 엄격한 조건하에서 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성하며 본 발명을 실시하는데 유용한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다(아우수벨 등이 편집한 문헌[1989, Curre뉴클레오타이드 Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.,and John Wiley & Sons, Inc., New York, p2.10.3] 참조). 바람직한 태양에서, 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA로 하이브리드 형성 및 68℃의 0.1 x SSC/0.1% SDS에서의 세척의 매우 엄격한 조건(아우수벨 등의 전술한 1989년 문헌)하에서 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성하고, 본 발명을 실시하는 데에 유용하다. 추가의 바람직한 태양에서, 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 매우 엄격한 조건하에서 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성하고, 본 발명을 실시하는 데에 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자는 "본 발명을 실시하는데 유용하고", 여기서 폴리뉴클레오타이드 분자는 동형 재조합과 같은 부위 특이적 변이유발에 의해 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF에 변이를 도입시키거나 표준 증폭 기술을 사용하여 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 스트렙토마이시즈 코엘리칼라를 제외한 다른 스트렙토마이시즈 종 또는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 다른 균주에 존재하는 자연 발생하는 aveR1 유전자 뿐만 아니라 자연적으로 발생하거나, 화학적으로 합성되거나 유전적으로 처리되거나에 관계없이 변이된 aveR1 대립 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호:2의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 유전자 산물의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 나타내기 위해 본원에서 사용되는 "동형"이라는 용어는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하지만, 그의 하나 이상의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 보존적으로 치환되고, 이 때 생성된 폴리펩타이드는 본 발명을 실시하는 데에 유용하다. 보존적 아미노산 치환은 당해 분야에 널리 알려져 있다. 이러한 치환을 수행하기 위한 규칙은 특히 데이호프(Dayhof, M. D.)의 문헌[1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3]에 기재된 것을 포함한다. 더욱 특정적으로는 보존적 아미노산 치환은 산성, 극성 또는 측쇄 부피도에 연관된 아미노산의 한 부류내에서 일반적으로 발생하는 것이다. 유전적으로 코딩된 아미노산은 일반적으로, (1) 산성인 아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성인 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (3) 비극성인 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판; 및 (4) 전하를 띠지 않은 극성인 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 티로신의 4개 군으로 분류된다. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 또한 방향족 아미노산으로 함께 분류된다. 임의의 특정 군내에서의 1회 이상의 치환, 예들 들면 류신을 이소류신 또는 발린으로, 또는 아스파르테이트를 글루타메이트으로, 또는 트레오닌을 세린으로, 또는 임의의 다른 아미노산 잔기를 구조적으로 연관된 아미노산 잔기(예를 들면 유사한 산성, 극성, 부피도를 갖거나 그의 몇몇의 조합에서 유사성을 갖는 아미노산)로 치환시킴은 일반적으로 폴리펩타이드의 기능에 그다지 영향을 미치지 않을 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, aveR1-관련 폴리펩타이드는 "본 발명을 실시하는데 유용하고, 이 때 폴리펩타이드는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 유전자 산물에 대한 항체를 생성하거나 스트렙토마이시즈에서의 AveR1 활성 또는 아베르멕틴 생성을 조절하는 화합물에 대해서 차폐하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 언급한 본 발명의 임의의 aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 구성된 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에 사용될 때 aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 "상당 부분"이란 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR1 유전자 산물 또는 본 발명의 aveR1-관련된 동형의 폴리펩타이드의 완전한 코딩 서열로 이루어지지 않지만, 약 20% 이상, 더욱 바람직하게는 약 30% 이상의 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 본 발명을 수행하는 데에 유용한 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다(유용성은 aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자에 대하여 상기와 같이 정의된다).
비제한적인 태양에서, aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 본 발명의 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR1 유전자 산물의 펩타이드 단편 또는 aveR1-관련된 동형의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된다. aveR1-관련 폴리펩타이드의 "펩타이드 단편"이란 완전한 길이의 aveR1 유전자 산물 또는 동형 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 하부 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 나타내고, 상기 하부 서열은 완전한 길이의 aveR1 유전자 산물 또는 동형 폴리펩타이드보다 길이가 짧고 본 발명을 실시하는 데에 유용하다(유용성은 aveR1-관련 폴리펩타이드에 대하여 상기 정의된 바와 같다). 바람직한 태양에서, 본 발명은 서열번호:2의 아미노산 서열의 부분-서열로 구성된 펩타이드 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 본 발명의 펩타이드 단편의 길이는 바람직하게는 약 15개 이상의 아미노산 잔기이다.
본원에 개시된 aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자는 aveR1 유전자 산물을 발현시키고, aveR1 유전자가 변이된 스트렙토마이시즈의 신규한 균주를 제조하고, 공지된 기술을 이용하여 다른 박테리아 종 또는 균주에서 aveR1 상동체 유전자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 aveR1 상동체 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에서 사용될 때, "aveR1 상동체 유전자 산물"은 aveR1 상동체 유전자에 의해 코딩된 유전자 산물로서 정의되며, 이 유전자는 다시 스트렙토마이시즈의 상이한 종 또는 밀접하게 연관된 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora) 속으로부터의 유전자로서 정의되며, 당해 분야의 숙련가에 의해 약 80% 이상의 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖거나 2개의 성분 신호 시스템의 히스티딘 키나아제 성분에서 전형적으로 발견되는 보존된 활성 부위 잔기를 함유함으로써 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 유전자의 상동체로서 인지된다. 예를 들면, aveR1 상동체와 Nar/Deg 아군으로부터의 유박테리아성 2-성분 시스템의 비교는 자동-인산화의 부위인 히스티딘 잔기(H) 및 오토키나아제 활성을 위해 필요한 아스파라긴 잔기(N)의 100% 보존을 보여준다.
aveR1 상동체 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 클론을 확인하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR1 ORF의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 검출가능하게 라벨링될 수 있고 관심있는 유기체로부터 유도된 DNA로부터 구성된 게놈 라이브러리(library)를 차폐하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리드 형성 조건의 엄격함은 기준 유기체, 본원의 경우 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 관심있는 유기체에 대한 관계에 기초하여 선택될 수 있다. 상이한 엄격한 조건에 대한 요구사항은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있고, 이러한 조건은 라이브러리와 라벨링된 서열이 유도되는 특정 유기체에 따라서 예측가능하게 변화될 것이다. 게놈 DNA 라이브러리는 특히 박테리오파이지 라이브러리에 대해서는 벤튼(Be뉴클레오타이드on) 및 데이비스(Davis)의 문헌[1977, Science 196:180], 및 플라스미드 라이브러리에 대해서는 그룬스타인(Grunstein) 및 호그니스(Hogness)의 문헌[1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965]에 설명된 기술을 사용하여 aveR1 상동체 유전자 코딩 서열에 대하여 차폐될 수 있으며, 상기 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용되어 있다. 서열번호:1에 나타나는 aveR1 ORF를 포함하는 것으로 알려진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 그의 일부를 나타내는 올리고뉴클레오타이드 분자가 이러한 스크리닝 실험에서 프로브(probe)로서 사용될 수 있다. 다르게는, 정제된 aveR1 유전자 산물의 아미노산 서열로부터 도출된 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프로브가 합성될 수 있다.
aveR1 상동체 유전자 코딩 서열을 함유하는 것으로 확인된 클론은 적절한 생물학적 기능에 대하여 시험될 수 있다. 예를 들면, 클론은 개시 및 말단 신호 뿐만 아니라 적합한 판독기를 확인하기 위해 서열 분석될 수 있다. 이어서, 클로닝된 DNA 서열은 적합한 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 이어서 aveR1을 상보에 대해서 시험되는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 세포로 형질전환된다. 이어서, 형질전환된 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 숙주 세포는 예를 들면 하기 2.6 단락에 기재된 바와 같이 발효 생성물의 HPLC 분석과 같은 방법을 사용하여 아베르멕틴 생성에 대하여 분석될 수 있다.
본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 이러한 플랭킹 서열은 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 1111 및 대략 뉴클레오타이드 2318 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택될 수 있다. 본 발명은 원래 동일계내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에 사용될 때, 뉴클레오타이드 서열은 원래 동일계 내에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형이고, 여기서 동형 뉴클레오타이드 서열은 상당히 엄격한 조건(즉, 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA로의 혼성 및 42℃의 0.2xSSC/0.1% SDS에서의 세척, 아우수벨 전술한 1989년 문헌 참조)하에서 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열의 보체로 하이브리드 형성되고 본 발명을 실시하는 데에 유용하다(유용성은 aveR1-관련 폴리뉴클레오타이드 분자에 대해 상기 정의되어 있다). 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자에서 각각의 플랭킹 서열 또는 그의 상동체의 길이는 바람직하게는 약 200뉴클레오타이드 이상이다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹시키거나 상기 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 본 발명의 상기 언급된 aveR1-관련 뉴클레오타이드 서열중 하나(예를 들면 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317 또는 그의 상당 부분으로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열)를 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
1.1.2 aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 바람직한 태양에서, aveR2 유전자 산물은 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함한다. 비제한적인 태양에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 비제한적인 태양에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:3의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 이런 측면에서 사용되는 경우 "동형"이라는 용어는 (a) 동일한 폴리펩타이드를 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 코딩하지만 유전자 코드의 축퇴에 따라서 뉴클레오타이드 서열에 대한 하나 이상의 불활동 변화를 포함하거나, (b) 적절히 엄격한 조건(즉, 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA로의 하이브리드 형성 및 42℃의 0.2 x SSC/0.1% SDS에서의 세척: 아우수벨 등의 전술한 1989년 문헌 참조)하에서 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 본 발명을 실시하는데 유용한 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 바람직한 태양에서, 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 매우 엄격한 조건(즉, 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA로의 하이브리드 형성 및 68℃의 0.1 x SSC/0.1% SDS에서의 세척: 아우수벨 등의 전술한 1989년 문헌 참조)하에서 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성시키며, 본 발명을 실시하는 데에 유용하다. 추가의 바람직한 태양에서, 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 매우 엄격한 조건하에서 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성하고, 본 발명을 실시하는 데에 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자는 "본 발명을 실시하는데 유용하고", 여기서 폴리뉴클레오타이드 분자는 동형 재조합과 같은 부위 특이적 변이에 의해 aveR2 ORF로 변이를 도입시키거나 표준 증폭 기술을 사용하여 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 스트렙토마이시즈 코엘리칼라를 제외한 다른 스트렙토마이시즈 종 또는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 다른 균주에 존재하는 자연발생되는 aveR2 유전자 뿐만 아니라 자연적으로 발생하거나, 화학적으로 합성되거나 유전적으로 처리되었는 지에 관계없이 변이된 aveR2 대립 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호:4의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR2 유전자 산물의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 나타내기 위해 본원에서 사용하는 경우, "동형"이라는 용어는 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하지만, 그의 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 보존적으로 치환된 폴리펩타이드를 의미하고, 이 때 생성된 폴리펩타이드는 본 발명을 실시하는 데에 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, aveR2-관련 폴리펩타이드는 "본 발명을 실시하는데 유용하고, 이 때 폴리펩타이드는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR2 유전자 산물에 대한 항체를 발생시키거나 스트렙토마이시즈에서의 AveR2 활성 또는 아베르멕틴 생산을 조절하는 화합물에 대해서 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 언급한 본 발명의 임의의 aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 구성된 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 "상당 부분"이란 본 발명의 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR2 유전자 산물 서열 또는 aveR2-관련된 동형의 폴리펩타이드의 완전한 코딩 서열로 이루어지지 않지만, 약 25% 이상, 더욱 바람직하게는 약 30% 이상의 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 본 발명을 수행하는 데에 유용한 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다(유용성은 aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자에 대하여 상기와 같이 정의된다).
비제한적인 태양에서, aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 본 발명의 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR2 유전자 산물의 펩타이드 단편 또는 aveR2-관련된 동형의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된다. aveR2-관련 폴리펩타이드의 "펩타이드 단편"이란 완전한 길이의 aveR2 유전자 산물 또는 상동체 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 하부 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 나타내고, 상기 하부 서열의 길이는 완전한 길이의 aveR2 유전자 산물 또는 동형 폴리펩타이드보다 짧고 본 발명을 실시하는 데에 유용하고, 이 때 상기 유용성은 ave-R2-관련 폴리펩타이드에 대하여 상기와 같이 정의된다. 바람직한 태양에서, 본 발명은 서열번호:4의 아미노산 서열의 하부 서열로 구성된 펩타이드 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 본 발명의 펩타이드 단편의 길이는 바람직하게는 약 15개 이상의 아미노산 잔기의 길이이다.
본원에 개시된 aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자는 ave-R2 유전자 산물을 발현시키고, aveR2 유전자가 변이된 스트렙토마이시즈의 신규한 균주를 제조하고, 공지된 기술을 사용하여 다른 박테리아 종 또는 균주에서 aveR2 상동체 유전자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 aveR2 상동체 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에 사용될 때, "aveR2 상동체 유전자 산물"은 aveR2 상동체 유전자에 의해 코딩된 유전자 산물로서 정의되며, 상기 유전자는 다시 상이한 스트렙토마이시즈 종 또는 밀접하게 연관된 사카로폴리스포라 속으로부터의 유전자로서 정의되며, 당해 분야의 숙련가에 의해 약 80% 이상의 동일한 뉴클레오타이드 서열을 함유하거나 2-성분 신호 시스템의 반응 조절 성분에서 전형적으로 발견되는 보존된 활성 부위 잔기를 함유함으로써 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 유전자의 상동체로서 인지된다. 예를 들면, aveR2 상동체와 Nar/Deg 아군으로부터의 유박테리아성 2-성분 시스템의 비교는 그중 하나는 인산화 부위인 두개의 아스파르테이트 잔기(H) 및 보존된 리신 잔기(K)의 100% 보존을 보여준다.
aveR2 상동체 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 클론을 확인하기 위한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR2 ORF의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 검출가능하게 라벨링될 수 있고 관심있는 유기체로부터 유도된 DNA로부터 구성된 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리드 형성 조건의 엄격함은 기준 유기체, 본 실시예에서는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 관심있는 유기체에 대한 관계에 기초하여 선택될 수 있다. 게놈 DNA 라이브러리는 상기 1.1.1에 주지된 기술을 사용하여 aveR2 상동체 유전자 코딩 서열에 대하여 스크리닝될 수 있다. 서열번호:3으로 나타나는 aveR2 ORF를 포함하는 것으로 공지된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 그의 일부를 나타내는 올리고뉴클레오타이드 분자가 이러한 스크리닝 실험에서 프로브로서 사용될 수 있다. 다르게는, 정제된 aveR2 유전자 산물의 아미노산 서열로부터 도출된 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프로브가 합성될 수 있다.
aveR2 상동체 유전자 코딩 서열을 함유하는 것으로 확인된 클론은 적절한 생물학적 기능에 대하여 시험될 수 있다. 예를 들면, 클론은 개시 및 말단 신호 뿐만 아니라 적합한 판독기를 확인하기 위해 서열 분석될 수 있다. 이어서, 클로닝된 DNA 서열은 적합한 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 이어서 ave-R2를 상보에 대해서 시험하게 하는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 세포로 형질전환된다. 이어서, 형질전환된 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 숙주 세포는 예를 들면 하기 2.6 단락에 기재된 바와 같이 발효 생성물의 HPLC 분석과 같은 방법을 사용하여 아베르멕틴 생성에 대하여 분석될 수 있다.
본 발명은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 이러한 플랭킹 서열은 서열번호:3 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 2313 및 대략 뉴클레오타이드 3022 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택될 수 있다. 본 발명은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단기된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 서열은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형이고, 여기서 동형 뉴클레오타이드 서열은 상당히 엄격한 조건(즉, 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA로의 하이브리드 형성 및 42℃의 0.2 x SSC/0.1% SDS에서의 세척, 아우수벨 등의 전술한 1989년 문헌 참조)하에서 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열의 보체로 하이브리드 형성되고, 본 발명을 실시하는 데에 유용하다(이 때, 유용성은 aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자에 대해 상기와 같이 정의된다). 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자에서 각각의 플랭킹 서열 또는 그의 상동체의 길이는 바람직하게는 약 200뉴클레오타이드 이상이다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키거나 또는 이러한 상기 뉴클레오타이드 서열에 동형인 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열중 하나 이상을 포함하고, 본 발명의 상기 언급된 aveR2-관련 뉴클레오타이드 서열중 하나(예를 들면 서열번호:3 의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021 또는 그의 상당 부분으로 나타나는 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열)를 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
1.1.3 aveR1/aveR2-관련된 폴리뉴클레오타이드 분자
본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR1 및 aveR2 유전자 산물(하기에서 "aveR1/aveR2"로 나타냄)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 바람직한 태양에서, aveR1 및 aveR2 유전자 산물은 서열번호:2 및 서열번호:4의 아미노산 서열을 각각 포함한다. 비제한적인 태양에서, 단리된 aveR1/aveR2 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 비제한적인 태양에서, 단리된 aveR1/aveR2 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 3021의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 비제한적인 태양에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열은 aveR1 및 aveR2의 ORF 사이에서의 부분적인 중첩을 보이지만, 본 발명은 또한 aveR1 및 aveR2에 대한 ORF가 중첩하지 않는 aveR1/aveR2 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
본 발명은 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 이런 측면에서 사용되는 경우 "동형"이라는 용어는 (a) 동일한 폴리펩타이드를 각각 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317 및 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 aveR1 및 aveR2로서 코딩하지만 유전자 코드의 축퇴에 따라서 뉴클레오타이드 서열에 대한 하나 이상의 불활동 변화를 포함하거나, (b) 적절히 엄격한 조건(즉, 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA로의 하이브리드 형성 및 42℃의 0.2 x SSC/0.1% SDS에서의 세척: 아우수벨 등의 전술한 1989년 문헌 참조)하에서 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 제 1의 폴리펩타이드 및 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 제 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 본 발명을 실시하는데 유용한 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 바람직한 태양에서, 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 매우 엄격한 조건(즉, 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA로의 하이브리드 형성 및 68℃의 0.1 x SSC/0.1% SDS에서의 세척: 아우수벨 등의 전술한 1989년 문헌 참조)하에서 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 제 1의 폴리펩타이드 및 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 제 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성하고, 본 발명을 실시하는데 유용하다. 추가의 바람직한 태양에서, 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 매우 엄격한 조건하에서 각각 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317 및 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 각각 나타내는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 및 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체로 하이브리드 형성되고, 본 발명을 실시하는 데에 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, aveR1/aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자는 "본 발명을 실시하는 데에 유용하고", 여기서 폴리뉴클레오타이드 분자는 동형 재조합과 같은 부위 특이적 변이에 의해 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF 또는 aveR2 ORF, 또는 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF 둘다로 변이를 도입시키거나 표준 증폭 기술을 사용하여 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF 또는 aveR2 ORF, 또는 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF 둘다의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 동형 폴리뉴클레오타이드 분자는 스트렙토마이시즈 코엘리칼라를 제외한 다른 스트렙토마이시즈 종 또는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 다른 균주에 존재하는 자연 발생되는 aveR1/aveR2 유전자 뿐만 아니라 자연적으로 발생하거나, 화학적으로 합성되거나 유전적으로 처리되는 지에 관계없이 변이된 aveR1 또는 aveR2 대립 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호:2 및 서열번호:4 각각의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 제 1 및 제 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR1 및 aveR2 유전자 산물의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 나타내기 위해 본원에서 사용하는 경우, "동형"이라는 용어는 서열번호:2 및 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하지만, 그의 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 보존적으로 치환된(보존적 아미노산 치환은 상기 정의된 바와 같다) 폴리펩타이드를 의미하며, 이 때 생성된 폴리펩타이드는 본 발명을 실시하는 데에 유용하다.
본 발명은 상기 언급한 본 발명의 임의의 aveR1/aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 구성된 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, aveR1/aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 "상당 부분"이란 본 발명의 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 및 aveR2 유전자 산물 또는 aveR1 및 aveR2-관련된 동형 폴리펩타이드 둘다를 코딩하는데 필요한 완전한 코딩 서열로 구성되지 않지만, 약 10% 이상, 더욱 바람직하게는 약 20% 이상의 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 본 발명을 수행하는 데에 유용한 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미하고, 유용성은 aveR1/aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자에서 상기 정의되어 있다. 바람직한 태양에서, aveR1/aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 본 발명의 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR1 유전자 산물 또는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 동형 폴리펩타이드로 구성된다. 비제한적인 특정 태양에서, aveR1/aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317로 나타나는 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열로 구성된다. 비제한적인 다른 특정 태양에서, aveR1/aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분은 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열로 구성된다.
본 발명은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1/aveR2 ORF를 플랭킹시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 이러한 플랭킹 서열은 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 1111 및 대략 뉴클레오타이드 3022 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택될 수 있다. 본 발명은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1/aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형인 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 서열은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1/aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열에 동형이고, 여기서 동형 뉴클레오타이드 서열은 상당히 엄격한 조건(즉, 65℃의 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA에서 여과 및 결합된 DNA로의 하이브리드 형성 및 42℃의 0.2xSSC/0.1% SDS에서의 세척, 아우수벨 등의 전술한 1989년 문헌 참조)하에서 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1/aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열의 보체로 하이브리드 형성되고 본 발명을 실시하는데 유용하다(유용성은 aveR1/aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 분자에 대해 상기에 정의되어 있다). 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자에서 각 플랭킹 서열 또는 그의 상동체의 길이는 바람직하게는 약 200뉴클레오타이드 이상이다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1/aveR2 ORF를 플랭킹시키거나 상기 뉴클레오타이드 서열에 동형인 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열중 하나 이상을 포함하고, 본 발명의 상기 언급된 aveR1/aveR2-관련 뉴클레오타이드 서열중 하나(예를 들면 서열번호:1 의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 3021로 나타나는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 및 aveR2 ORF중의 하나 또는 둘다를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열)를 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
1.2. 올리고뉴클레오타이드 분자
본 발명은, 본 발명의 임의의 상기 언급한 폴리뉴클레오타이드 분자로 하이브리드 형성되거나 본 발명의 임의의 상기 언급한 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자로 하이브리드 형성되는 올리고뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 상기 올리고뉴클레오타이드 분자는 바람직하게는 길이가 약 10개 이상의 뉴클레오타이드이지만, 본 발명의 임의의 상기 언급한 폴리뉴클레오타이드 분자의 임의의 하부 서열 길이로 확장될 수 있고, 적절하게 엄격한 또는 매우 엄격한 조건하에서 상기 언급한 폴리뉴클레오타이드 분자중 하나 이상으로 하이브리드 형성시킬 수 있다. 더욱 짧은 올리고뉴클레오타이드 분자의 경우, 매우 엄격한 조건의 예는 14-염기의 올리고뉴클레오타이드 분자를 위해서는 약 37℃, 17-염기의 올리고뉴클레오타이드 분자를 위해서는 약 48℃, 20-염기의 올리고뉴클레오타이드 분자를 위해서는 약 55℃, 23-염기의 올리고뉴클레오타이드 분자를 위해서는 약 60℃의 6 x SSC/0.5% 소듐 피로포스페이트에서의 세척을 포함한다. 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드 분자(즉, 약 100뉴클레오타이드보다 긴 분자)의 경우, 적절하게 엄격한 또는 매우 엄격한 조건의 예가 동형 폴리뉴클레오타이드 분자에 대하여 상기 1.1 단락에 기재되어 있다. 하이브리드 형성 조건은 사용되는 특정 올리고뉴클레오타이드 분자에 따라서 당해 분야에 공지된 바와 같이 적절하게 조정될 수 있다.
바람직한 태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 분자는 매우 엄격한 조건하에서 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열의 보체인 뉴클레오타이드 서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드 분자로 하이브리드 형성된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭시킬 때의 프라이머, 또는 스트렙토마이시즈에서의 ave 유전자 및 아베르멕틴 생합성을 조절하는 데에 유용한 안티-센스 분자를 비롯한 여러가지 목적을 위해 유용하다. 증폭은 적합하게 고안된 올리고뉴클레오타이드 분자에 폴리머라아제 쇄반응(PCR: polymerase chain reaction)과 같은 표준 기술을 접목하여 수행될 수 있지만, 당해 분야에 공지된 다른 증폭 기술(예를 들면, 리가제 쇄반응)도 사용될 수 있다. 예를 들면, PCR의 경우, 적합하게 고안된 프라이머, 증폭시킬 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 주형, 및 적합한 PCR 효소와 완충액을 포함하는 혼합물을 제조하여, 주형의 특이적 aveR1- 또는 aveR2-관련 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시키기 위한 표준 방법에 따라서 가공한다.
1.3. 재조합 발현 시스템
1.3.1 발현 벡터
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 클로닝 벡터 및 재조합 발현 벡터를 추가로 제공하고, 상기 벡터는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF 또는 aveR2 ORF, 또는 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF 둘다를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 비롯한 폴리뉴클레오타이드 분자의 클로닝 또는 발현에 유용하다. 비제한적인 태양에서, 본 발명은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 전체 aveR1 ORF 및 전체 aveR2 ORF를 포함하는 플라스미드 pSE201(ATCC 203182)를 제공한다.
하기의 설명은 달리 언급되지 않는한 상기 정의된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 aveR1 및 aveR2 ORF중 하나 또는 둘다 및 그들의 유전자 산물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자, 모든 동형 폴리뉴클레오타이드 분자, 동형 폴리펩타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분, 및 상기 유전자 산물 및 폴리펩타이드의 펩타이드 단편을 비롯한 본 발명의 모든 상기 언급한 폴리뉴클레오타이드 분자 및 폴리펩타이드에 적용된다.
다양한 상이한 벡터들이 파아지, 고 복제수의 플라스미드, 저 복제수의 플라스미드, 자살 플라스미드, 감온성 플라스미드 및 특히 이 콜라이(E coli)-스트렙토마이시즈 셔틀(shuttle) 벡터를 비롯한 스트렙토마이시즈에서의 특정 용도를 위해 개발되어 왔다. 다수의 약제 내성 유전자가 또한 스트렙토마이시즈로부터 클로닝되었고, 이러한 다수의 유전자들은 선택가능한 마커로서 벡터에 혼입되었다. 스트렙토마이시즈에서 사용하기 위한 현재 벡터의 예는 특히 헛친슨(Hutchinson)의 문헌[1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190]에 제시되어 있다.
본 발명의 재조합 벡터, 특히 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 위한 코딩 서열이 폴리펩타이드를 생성하는 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 하나 이상의 조절 요소와 작용가능하게 결합하도록 바람직하게 구성된다. 본원에 사용된 바와 같이, "조절 요소"라는 용어는 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열의 발현을 추진하고/하거나 조절하도록 작용하는 당해 분야에 공지된 유도가능한 프로모터, 인헨서(enhancer), 오퍼레이터 및 다른 요소, 및 유도가능하지 않은 프로모터, 인헨서, 오퍼레이터 및 다른 요소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본원에 사용된 바와 같이, 코딩 서열은 하나 이상의 조절 요소와 "작용가능하게 결합"하고, 여기서 조절 요소는 효과적으로 코딩 서열의 전사 또는 그의 mRNA의 번역 또는 둘다를 조절하고 허용한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 함유하도록 처리될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 특히, pCR-블런트(Blu뉴클레오타이드), pCR2.1(인비트로겐: Invitrogen), pGEM3Zf(프로메가: Promega) 및 셔틀 벡터 pWHM3[바라(Vara) 등, 1989, J. Bact. 171:5872-5881]를 포함한다.
이러한 벡터의 조절 요소의 농도 및 특이성은 다양할 수 있다. 사용되는 숙주/벡터 시스템에 따라서, 임의의 다수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 박테리아에 대한 전사 조절 영역 또는 프로모터의 비제한적인 예는 β-gal 프로모터, T7 프로모터, TAC 프로모터, λ 좌우 프로모터, trp 및 lac 프로모터, trp-lac 융합 프로모터 및 더욱 특별하게는 스트렙토마이시즈에 대해 ermE, me/C 및 tipA 등의 프로모터를 포함한다.
적절한 조절 요소와 작용가능하게 결합된 특정 코딩 서열을 함유하는 재조합 벡터를 구성하기 위한 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이들중 임의의 방법이 본 발명의 실시를 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 기술, 합성 기술 및 생체내 유전적 재조합을 포함한다. 예를 들면, 마니아티스 등의 문헌(1989, 상기와 동일); 아우수벨 등의 문헌(1989, 상기와 동일); 샘브룩 등의 문헌(1989, 상기와 동일); 인니스 등의 문헌(1995, 상기와 동일); 엘리치의 문헌(1992, 상기와 동일); 및 홉우드 등의 문헌(1985, 상기와 동일)에 기재된 기술을 참조한다.
융합 단백질 발현 벡터가 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물-융합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 정제된 융합 단백질은 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물에 대해 항혈청을 생성시키고, aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 생화학적 특성을 연구하고, 상이한 생화학 활성도를 갖는 aveR1 또는 aveR2 융합 단백질을 처리하고, 재조합 발현 시스템에서의 발현된 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 확인 또는 정제를 돕기 위해서 사용될 수 있다. 가능한 융합 단백질 발현 벡터는 β-갈락토시다아제와 trpE 융합물, 말토즈 결합 단백질 융합물, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 융합물 및 폴리히스티딘 융합물(담체 영역)을 코딩하는 서열을 혼입시키는 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
AveR1 또는 AveR2 융합 단백질은 정제에 유용한 영역을 포함하도록 처리될 수 있다. 예를 들면, AveR1- 또는 AveR2-말토즈-결합 단백질 융합물은 아밀로즈 수지를 사용하여 정제될 수 있고, AveR1- 또는 AveR2-글루타티온-S-트랜스퍼라아제 융합 단백질은 글루타티온-아가로즈 비드(bead)를 사용하여 정제될 수 있고, AveR1- 또는 AveR2-폴리히스티딘 융합물은 이가 니켈 수지를 사용하여 정제될 수 있다. 다르게는, 담체 단백질 또는 펩타이드에 대한 항체가 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제에 사용될 수 있다. 예를 들면, 단클론성 항체의 타겟(target) 항원결정기에 대한 뉴클레오타이드 서열 코딩은 조절 요소와 작용가능하게 결합한 발현 벡터로 처리되고 발현된 항원결정기가 AveR1 또는 AveR2 폴리펩타이드로 융합되도록 위치될 수 있다. 예를 들면, 친수성 마커 펩타이드인 FLAGTM항원결정기 태그(tag)(인터내셔날 바이오테크놀러지스 인코포레이티드(I뉴클레오타이드ernational Biotechnologies Inc.))에 대해 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 AveR1 또는 AveR2 폴리펩타이드의 아미노 또는 카복실 말단에 상응하는 지점에서 표준 기술에 의해 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 이어서, 발현된 AveR1 또는 AveR2 폴리펩타이드-FLAG 항원결정기 융합 생성물은 시판중인 항-FLAG 항체를 사용하여 검출되고 친화-정제될 수 있다.
또한, AveR1 또는 AveR2 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터는 발현된 AveR1 또는 AveR2 폴리펩타이드가 특정 프로테아제에 의한 처리에 의해 담체 영역 또는 융합짝으로부터 이탈될 수 있도록 특정 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 폴리링커(polylinker) 서열을 함유하도록 처리될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 벡터는 특히, 트롬빈 또는 인자 Xa 절단 부위를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
aveR1 또는 aveR2 ORF를 갖는 판독기로부터 및 판독기에서의 신호 서열 상류는 발현된 유전자 산물의 트래픽킹(trafficking) 및 분비를 조종하는 공지된 방법에 의해 발현 벡터로 처리될 수 있다. 신호 서열의 비제한적인 예는 특히, α-인자, 면역글로블린, 외벽 단백질, 페니실리나아제 및 T-세포 수용체로부터의 것을 포함한다.
본 발명의 클로닝 또는 발현 벡터에 의해 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포의 선별을 돕기 위해, 벡터는 기록 유전자 산물 또는 다른 선택가능한 마커를 위한 코딩 서열을 추가로 포함하도록 처리될 수 있다. 상기의 코딩 서열은 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 조절 요소 코딩 서열과 작용가능하게 결합되어 있다. 본 발명에 유용할 수 있는 기록 유전자는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 특히 녹색 형광 단백질, 루시페라아제, xyIE 및 티로시나아제를 코딩하는 것을 포함한다. 선택가능한 마커를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 공지되어 있고, 항생제 또는 항-대사물질에 대하여 내성을 제공하는 유전자 산물을 코딩하거나 영양요구 필요조건을 공급하는 것을 포함한다. 이러한 서열의 예는, 특히 에리트로마이신, 티오스트렙톤 또는 카나마이신에 대한 내성을 코딩하는 것이다.
1.3.2 숙주 세포
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포 및 그로부터 유도된 신규한 균주 또는 세포주를 추가로 제공한다. 본 발명을 실시하기에 유용한 숙주 세포는 바람직하게는 스트렙토마이시즈 세포이지만, 다른 원핵 세포 또는 진핵 세포도 또한 사용될 수 있다. 상기 형질전환된 숙주 세포는 전형적으로, 특히 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 벡터로 형질전환된 박테리아 또는 재조합 벡터로 형질전환된 이스트와 같은 미생물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
박테리아 세포가 일반적으로 숙주 세포로서 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자는 스트렙토마이시즈 세포에서 작용하도록 의도되지만 예를 들면 클로닝 또는 발현 목적을 위해서 다른 박테리아 또는 진핵 세포로 형질전환될 수 있음을 주지한다. 예를 들면, 미국 미들랜드주 록빌 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC) 또는 상업적 공급자[스트라타겐(stratagene)로부터 구할 수 있는 DH5α 균주(수탁번호 제 31343 호)와 같은 이 콜라이의 균주가 전형적으로 사용될 수 있다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 이스트 세포를 포함하지만, 포유류 세포 또는 곤충 세포도 또한 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 세포의 실질적인 균질 배양물의 하나 이상의 숙주 세포로 바람직하게 형질전환되거나 형질감염된다. 발현 벡터는 일반적으로, 예를들면 원형질 형질전환, 인산 칼슘 침전, 염화 칼슘 처리, 미세 주입, 전기영동, 재조합 바이러스와의 접촉에 의한 형질감염, 리포좀-매개된 형질감염, DEAE-덱스트란 형질감염, 형질도입, 접합, 또는 미세발사 충격과 같은 공지된 기술에 따라서 숙주 세포로 도입된다. 상기 기재된 바와 같은 재조합 벡터와 결합된 선택가능한 마커(예를 들면, 항체 내성)를 발현시키는 세포의 선택과 같은 형질전환체의 선택이 표준 절차에 의해 수행될 수 있다.
발현 벡터가 숙주 세포에 일단 도입되면, 호스트 세포 염색체에서 또는 에피좀에 의해 aveR1-, aveR2- 또는 aveR1/aveR2-관련 코딩 서열의 통합 및 유지는, 예를 들면 서던(Southern) 하이브리드 형성 분석, 제한 효소 분석, 역전사효소 PCR(rt-PCR)을 비롯한 PCR 분석 등의 표준 기술에 의하거나 또는 예상 유전자 산물을 검출하기 위한 면역학적 검정에 의해 확인될 수 있다. 재조합 aveR1-, aveR2- 또는 aveR1/aveR2-관련 코딩 서열을 함유하고/하거나 발현시키는 숙주 세포는 당해 분야에 잘 알려진 다음의 4개 이상의 임의의 일반적인 방법에 의해 확인될 수 있다: (i) DNA-DNA, DNA-RNA 또는 RNA-안티센스 RNA 하이브리드 형성; (ii) "마커" 유전자 작용 존재의 검출; (iii) 숙주 세포에서의 aveR1- 또는 aveR2-특이적 mRNA 전사의 발현에 의해 측정되는 경우 전사 수준의 평가; 및 (iv) 예를 들면 면역검정 또는 AveR1 또는 AveR2 생물학적 활성도의 존재에 의해 측정되는 숙성된 폴리펩타이드 생성물의 존재 검출.
1.3.3 재조합 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 발현 및 특징화
aveR1-, aveR2- 또는 aveR1/aveR2-관련 코딩 서열이 적합한 숙주 세포에 안정하게 도입되면, 형질전환된 숙주 세포는 클론 면에서 증식되고, 생성된 세포는 aveR1- 및/또는 aveR2-관련 유전자 산물의 최대 생성에 도움이 되는 조건하에 성장된다. 이러한 조건은 전형적으로 최대 밀도까지 성장하는 세포를 포함한다. 발현 벡터가 유도가능한 프로모터를 포함하는 경우, 예를 들면 온도 변화, 영양소의 고갈, 무상의 유도제의 첨가(예를 들면, 이소프로필-β-D--티오갈락토피라노사이드(IPTG)와 같은 탄수화물 유사물) 및 과량의 대사 부산물의 축적 등과 같은 적합한 유도 조건이 발현을 유도하기 위해 요구되는 경우 사용된다.
발현된 aveR1- 및/또는 aveR2-관련 유전자 산물이 숙주 세포내에 유지되는 경우, 세포는 수거되어 분해되고, 생성물은 단백질 열화를 최소화시키기 위해, 예를 들면 4℃에서 또는 프로테아제 억제제의 존재하에서, 또는 둘다의 조건에서와 같은 당해 분야에 공지된 추출 조건하에 분해물로부터 단리되고 정제된다. 발현된 aveR1 및/또는 aveR2 유전자 산물이 숙주 세포로부터 분비되는 경우, 고갈된 영양소 배지는 단순히 모아져서 이로부터 생성물이 단리될 수 있다.
발현된 aveR1- 및/또는 aveR2-관련된 유전자 산물은 황산 암모늄 침전법, 크기 분별법, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, 밀도 원심분리법 및 친화성 크로마토그래피와 같은 방법의 임의의 조합을 비롯한(그러나, 이에 한정되는 것은 아니다) 표준 방법을 사용하여, 적절한 경우 세포 분해물 또는 배양물 배지로부터 단리되거나 실질적으로 정제될 수 있다. 발현된 aveR1- 및/또는 aveR2-관련 유전자 산물이 생물학적 활성을 나타내는 경우, 제조 순도의 증가는 적합한 검정법의 사용에 의한 정제 절차의 각 단계에서 관측될 수 있다. 발현된 aveR1- 및/또는 aveR2-관련 유전자 산물이 생물학적 활성을 나타내는 지에 상관없이 각각은 예를 들면 크기, 또는 AveR1 또는 AveR2에 대해 특이적인 항체와의 반응성에 기초하거나 융합 택의 존재에 의해 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 코딩된 실질적으로 정제되거나 단리된 폴리펩타이드를 제공한다. 비제한적인 특정 태양에서, 폴리펩타이드는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR1 유전자 산물이다. 비제한적인 다른 특정 태양에서, 폴리펩타이드는 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR2 유전자 산물이다. 본 발명은 본 발명의 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물중 하나에 동형인 실질적으로 정제되거나 단리된 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 본 발명은 본 발명의 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 펩타이드 단편 또는 동형 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 본 발명의 실질적으로 정제되거나 단리된 폴리펩타이드는 예를 들면 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물 작용을 변화시키는 화합물을 차폐하고, 이에 의해 아베르멕틴 생합성을 조절하고, aveR1 또는 aveR2 유전자 산물에 대한 항체를 성장시키는 것과 같은 다양한 목적에 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드가 특정 제조에서 물질 중량의 대부분을 구성하는 경우 폴리펩타이드는 "실질적으로 정제된다". 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 폴리펩타이드가 특정 제조에서 물질의 약 90중량% 이상을 구성하는 경우 폴리펩타이드는 "단리"된다.
본 발명은 특정 유전자 산물, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편의 발현에 도움이 되는 조건하에 재조합 발현 벡터를 가지고 형질전환되거나 형질감염된 호스트 세포를 배양하고(이 때, 재조합 발현 벡터는 각각 aveR1 유전자 산물, aveR2 유전자 산물, 동형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 상기 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 조절 요소와 작용가능하게 결합된다), 발현된 유전자 산물, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 실질적으로 정제되거나 단리된 형태로 세포 배양물로부터 수거함을 포함하는, 실질적으로 정제되거나 단리된 본 발명의 aveR1 유전자 산물, aveR2 유전자 산물, 동형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
일단 충분한 순도를 갖는 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물이 얻어지면, 이들은 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피, 아미노산 서열 분석, 아베르멕틴 생합성 경로로 적합한 생성물을 생성시킬 때의 생물학적 활성도 등을 비롯한 표준 방법에 의해 특징지워질 수 있다. 예컨대, aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 아미노산 서열은 표준 펩타이드 시퀀싱 기술을 이용하여 결정할 수 있다. aveR1 또는 aveR2 유전자 산물은 친수성 분석(예컨대, 호프(Hopp)와 우즈(Woods)의 문헌[1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824]을 참조한다) 또는 유사한 소프트웨어 알고리즘을 이용하여 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 소수성 및 친수성 영역을 확인하여 추가로 특징지워질 수 있다. 구조적 분석은 특정한 2차 구조를 가정한 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 영역을 확인하기 위해 실시될 수 있다. X-선 결정도(엥스트롬(Engstrom)의 문헌[Biochem. Exp. Biol. 11:7-13, 1974]), 컴퓨터 모델링(플레터릭(Fletterick)과 졸러(Zoller)가 편집한 문헌[Curre뉴클레오타이드 Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986]) 및 핵자기 공명법(NMR)과 같은 생물리학 방법을 이용하여 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물 및 이들의 기질간의 상호작용 부위를 맵핑(mapping)하고 연구할 수 있다. 이러한 연구로부터 얻어진 정보는 aveR1 또는 aveR2 ORF에서의 변이에 대한 새로운 부위를 선별하여 보다 바람직한 아베르멕틴 생성 특징을 갖는 신규한 스트렙토마이시즈 균주를 개발시키는데 사용될 수 있다.
1.4. aveR1 또는 aveR2 변이체의 구조물
본 발명은 또한 유전자 치환 벡터와 같은 유전자 구조물을 비롯한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포는 유전적으로 변형되어서 이와 같이 변형되지 않은 동일한 종 또는 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양과는 검출가능하게 다른 아베르멕틴 양을 생성한다. 보다 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주 세포는 유전적으로 변형되어서 이와 같이 변형되지 않은 동일한 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴 양에 비해 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성한다. 본 발명에 따르면, 이러한 유전자 변형은 바람직하게는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다를 변이시키는 것을 포함하며, 이 때 상기 변이로 인해 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 균주 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이 검출가능할 정도로 증가한다.
본 발명에 따르면, 변이는 현재 공지되어 있거나 또는 이후에 개발될 임의의 기술을 사용하여 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에 도입될 수 있다. 예컨대, 무작위 변이 유발은 스트렙토마이시즈 세포를 자외선, X선 또는 화학적 변이원(예컨대, N-메틸-N'-니트로소구아니딘, 에틸 메탄 설포네이트, 아질산 또는 질소 머스타드)에 노출시키는 것을 포함한 표준 변이 기술을 사용한 후, aveR1 및/또는 aveR2 유전자에서 하나 이상의 변이의 결과로서 검출될 정도로 증가된 아베르멕틴 생성을 나타내는 세포를 선별함으로써 수행될 수 있다. 변이 유발 기술을 재검토하기 위해서는 전술한 아우수벨의 1989년 문헌을 참조한다.
다르게는, aveR1 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 aveR1 및 aveR2 유전자 둘다에 대한 변이는 실수하기 쉬운 PCR 또는 카셋트 변이 유발을 비롯한 각종 공지된 임의의 재조합 방법을 이용하여 부위 지향성 방식으로 수행될 수 있다. 예컨대, 동형 재조합을 이용하는 부위 지향성 변이 유발은 유전자에 하나 이상의 변이를 선택적으로 도입하기 위해 aveR1 또는 aveR2 ORF중 하나 또는 플랭킹 서열을 특수하게 변형시키거나 또는 aveR1과 aveR2 ORF 둘다 또는 플랭킹 서열을 특수하게 변형시키는데 이용할 수 있다. 또한, 무작위 분열, 반복되는 변이유발 주기 및 뉴클레오타이드 셔플링(shuffling)을 비롯한 미국 특허 제 5,605,793호에 기재된 방법이 aveR1 및/또는 aveR2 변이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자의 커다란 라이브러리를 발생시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명을 실시하는데 유용한 aveR1 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에 대한 변이는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다 또는 플랭킹 조절 영역에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 추가, 제거, 치환 또는 이들의 몇몇 조합을 포함하며, 이는 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이 검출가능할 정도로 증가되는 바람직한 결과를 발생시킨다. 이러한 변이는 하나 이상의 신규한 제한 부위, 말단 코돈, 또는 프레임 이동중 하나 이상을 ORF 서열중 하나 또는 둘다에 또는 유전자 전사에 관련된 플랭킹 조절 영역에 도입하도록 작용할 수 있다. 기타 유용한 변이는 상이한 또는 이형의 뉴클레오타이드 서열을 aveR1 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에 삽입시키거나, 또는 aveR1 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 둘다의 전부 또는 일부를 제거하거나, 또는 aveR1 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 둘다의 전부 또는 일부를 상이한 또는 이형의 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 것을 포함하고, 이러한 변이는 원하는 결과를 발생시켜 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴 양이 검출가능할 정도로 증가한다.
부위 특이적 변이는 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물중 하나 또는 aveR1 및 aveR2 유전자 산물 둘다에 하나 이상의 보존된 아미노산 잔기를 변형시키도록 작용하는 경우에 특히 유용하다. 예컨대, 도 1a와 도 1b에 제시된 바와 같이, 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 도출된 아미노산 서열과 스트렙토마이시즈 코엘리칼라의 유사한 유전자 산물의 비교는 이들 종 사이에 아미노산 잔기의 상당한 보존 부위를 나타낸다. 이들 보존된 아미노산 잔기중 하나 이상을 제거하거나 또는 비보존적으로 치환시키는 부위 특이적 변이유발은 아베르멕틴 제조시에 바람직한 변형을 나타내는 신규한 변이체 균주를 생성시킬 때 특히 효과적일 수 있다.
바람직한 태양에서, 하나 이상의 변이는 본 발명에 의해 제공된 유전자 구조물, 예컨대 유전자 치환 벡터 등을 이용하여 aveR1 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다로의 동형 재조합에 의해 도입된다. 유전자 구조물은 전체 aveR1 ORF 또는 이들의 동형 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 이들중 상당 부분; 전체 aveR2 ORF 또는 이들의 동형 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 이들의 상당 부분; 전체 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF 또는 이들의 동형 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 이들의 상당 부분; 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF 또는 aveR2 ORF중 하나 또는 aveR1 ORF와 aveR2 ORF 둘다를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열; 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있으며, 이들 유전자 구조물은 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에 변이를 도입시키는데 사용될 수 있으며, 이러한 변이는 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 종 또는 균주 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을 검출가능할 정도로 증가시킨다.
비제한적인 특정 태양에서, 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 유전자 구조물은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR1 ORF 또는 aveR2 ORF중 하나 또는 이들 둘다 또는 이들중 상당 부분의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 플라스미드이지만, 이들은 하나 이상의 변이, 예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드의 제거, 삽입, 치환 또는 이들의 조합을 추가로 포함하며, 상기 플라스미드는 스트렙토마이시즈 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있으며, 이로써 변이를 aveR1 유전자, aveR2 유전자 또는 이들 둘다에 도입시켜서 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다 각각의 활성 또는 생물학적 기능을 파괴시키거나 변형시키거나, 또는 aveR1 유전자 산물, aveR2 유전자 산물중 하나 또는 이들 둘다 각각의 활성 또는 생물학적 기능을 파괴시키거나 변형시켜서 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 종 또는 균주 세포에 비해 검출가능할 정도로 증가하게 된다. 이러한 플라스미드는 바람직하게는 선택가능한 마커를 추가로 포함한다.
일단 스트렙토마이시즈의 숙주 세포로 형질전환되면, 유전자 구조물의 폴리뉴클레오타이드 분자는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자 또는 이들 둘다에 대한 동형 재조합에 의해 특정하게 타겟이 될 수 있고, aveR1 유전자 또는 그의 일부, 또는 aveR2 유전자 또는 그의 일부, 또는 aveR1 유전자와 aveR2 유전자 둘다 또는 그의 일부를 대체하거나 또는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자에 삽입된다. 이러한 재조합의 결과로서, 숙주 세포의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자 또는 이들 둘다, 또는 이에 의해 코딩된 유전자 산물은 부분적으로 또는 완전히 무력하게 된다. 형질전환된 세포는 바람직하게는 유전자 구조물에서 선택가능한 마커를 이용하여 선택되고, 이와 같이 형질전환되지 않은 동일한 균주 세포에 비하여 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는 세포에 대해서는 2.6 단락에 기재된 바와 같은 표준 기술에 의해 차폐한다.
2.9.1 단락 이하에 예시된 비제한적인 특정 태양에서, 유전자 치환 벡터는 각 유전자의 ORF의 일부를 이형 뉴클레오타이드 서열(ermE)로 치환함으로써 aveR1 및 aveR2 유전자 둘다를 파괴시키는데 사용되었다. 2.9.2 단락 이하에 예시된 비제한적인 특정 태양에서, 유전자 치환 벡터는 이형 뉴클레오타이드 서열(ermE)을 aveR2 ORF로 삽입시킴으로써 aveR2 유전자를 파괴시키는데 사용되었다. 이러한 유전자 치환 벡터 각각은 별도로 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 균주 세포로 형질전환되고 동형 재조합에 의해 염색체내로 통합된다. 이들 신규한 스트렙토마이시즈 형질전환체 각각의 발효 분석은 이러한 유전자 변이중 어떠한 것도 수행하지 않은 동일한 균주 세포에 비해 상기 유전자 변이를 수행한 세포에 의해 생성된 아베르멕틴 양이 상당히 증가함을 나타낸다.
또한, 본 발명은 (a) 특정한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계, (b) (a) 단계의 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 aveR1와 aveR2 유전자 둘다에 변이를 도입하는 단계, 및 (c) (b) 단계에서 생성된 바와 같은 유전자 변이를 수행한 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을, 유전자 변이를 수행하지 않은 (a) 단계의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양과 비교하는 단계를 포함하여, 만약 (b) 단계에서 생성된 바와 같은 유전자 변이를 수행한 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이 유전자 변이를 수행하지 않은 (a) 단계의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양보다 검출가능할 정도로 많다면, 아베르멕틴의 생성량을 검출가능할 정도로 증가시킬 수 있는 aveR1 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 aveR1와 aveR2 유전자 둘다의 변이가 확인되도록 한, 스트렙토마이시즈 종 또는 균주에서 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다의 변이를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 유전자 변이는 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이 검출가능할 정도로 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에서 스트렙토마이시즈의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 aveR1와 aveR2 유전자 둘다를 변이시키는 단계와 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 비해 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는 변이된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 스트렙토마이시즈 종 또는 균주로부터 유전적으로 변형된 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 변형된 세포는 동일한 종 또는 균주의 변형되지 않은 세포에 비해 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성한다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 종은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스이다.
본 발명은 또한 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 비해, aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 aveR1와 aveR2 유전자 둘다에 대한 하나 이상의 변이의 결과로서 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는 세포인 스트렙토마이시즈의 신규한 균주를 제공한다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 종은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스이다. 본 발명의 신규한 균주는 상업적인 측면에서 바람직한 도라멕틴과 같이 아베르멕틴의 대규모 제조에서 유용하다.
본 발명은 또한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포를 배양시키는 단계와 배양물로부터 아베르멕틴을 수거하는 단계를 포함하는, 스트렙토마이시즈 배양물에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 세포는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 aveR1와 aveR2 유전자 둘다에서의 변이를 포함하며, 상기 유전자 변이는 아베르멕틴의 생성을 허용하거나 유도하는 조건하의 배양물 배지에서 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 종 또는 균주 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주 세포에 의해 생성된 아베르메틱의 양을 검출가능할 정도로 증가시키는 작용을 한다. 바람직한 태양에서, 스트렙토마이시즈 종은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스이다. 이러한 공정은 아베르멕틴의 생성 효율을 증가시키는데 유용하다.
1.5 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 리보자임
본 발명의 범주에는 aveR1 또는 aveR2 mRNA의 번역에 결합, 이를 저하 및/또는 억제시키는 작용을 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 및 리보자임을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열이 있다.
안티센스 RNA 분자와 안티센스 DNA 분자를 비롯한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 목적하는 mRNA에 결합하고 단백질 번역을 못하게 함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 역할을 한다. 예컨대, 약 15개 이상의 염기와 AveR1 또는 AveR2 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 독특한 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예컨대 통상적인 포스포디에스테르 기술에 의해 합성될 수 있다.
리보자임은 RNA의 특정한 절단을 촉진시킬 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임의 작용 기작은 상보적 타겟 RNA로의 리보자임 분자의 서열 특이적 하이브리드 형성 및 이후의 엔도뉴클레오타제 분해성 절단을 포함한다. aveR1 또는 aveR2 mRNA 서열의 엔도뉴클레오타제 분해성 절단을 특이적 및 효율적으로 촉진시키는 처리된 해머헤드 모티프(hammerhead motif) 리보자임 분자도 또한 본 발명의 범주내에 있다.
임의의 가능한 RNA 타겟내에 있는 특정한 리보자임 절단 부위는 하기의 서열 GUA, GUU 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위에 대해 타겟 분자를 스캐닝함으로써 초기에 확인된다. 일단 확인되면, 절단 부위를 함유하는 타겟 유전자 영역에 상응하는 약 15 내지 20개 리보뉴클레오타이드의 짧은 RNA 서열이 올리고뉴클레오타이드 서열을 부적합하게 만들 수 있는 2차 구조물과 같은 예측된 구조적 특징에 대해 평가될 수 있다. 또한, 후보 목표에 대한 적합성은 예컨대 리보뉴클레아제 보호 어세이를 사용하여 상보적 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드 형성될 수 있음을 시험하여 평가할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 리보자임 둘다는 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 이들은 예컨대 고체상 포스포아마이트 화학 합성와 같은 화학적 합성을 위한 기술을 포함한다. 다르게는, 안티센스 RNA 분자는 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열의 생체외 또는 생체내 전사에 의해 발생할 수 있다. 이러한 DNA 서열은 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터와 같은 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터를 혼입시키는 각종 광범위한 벡터에 혼입될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 대한 여러 변형이 세포간 안정성 및 반감기를 증가시키는 방법으로서 도입될 수 있다. 가능한 변형은 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 플랭킹 서열을 첨가하는 것 또는 올리고뉴클레오타이드 주쇄내에 포스포디에스테라제 연결이 아닌 포스포로티오에이트 또는 2'-O-메틸을 사용하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
1.6. 항체
본 발명은 또한 본 발명의 aveR1 유전자 산물, aveR2 유전자 산물에 결합되거나, 동형 폴리펩타이드에 결합되거나, 펩타이드 단편에 결합되는 다클론 또는 단클론 항체를 제공한다. 이러한 항체는 음성 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물을 정제시키거나 aveR1 또는 aveR2 유전자 산물의 활성 또는 생물학적 기능을 분석하기 위한 친화성 시약으로서 사용될 수 있다.
항체는 본 발명의 aveR1- 또는 aveR2-관련 폴리펩타이드중 어떠한 것에 대해서도 발생할 수 있다. 소, 말, 토끼, 염소, 양 및 마우스를 비롯한(그러나, 이에 제한되는 것은 아니다) 다양한 숙주 동물이 안티-AveR1 또는 안티-AveR2-특이적 항체를 생성하는 공지된 방법에 따라 사용될 수 있다. 당해 분야에 공지된 다양한 부형제가 항체 생성을 강화시키기 위해 사용될 수 있다.
다분지성 항체는 면역된 동물로부터 얻어질 수 있으며, 표준 기술을 이용하여 안티-AveR1 유전자 또는 안티-AveR2 유전자 특이성에 대해 시험할 수 있다. 다르게는, AveR1 또는 AveR2 폴리펩타이드에 대한 단분지성 항체는 배양물중 연속적인 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이들은 콜러(Kohler)와 밀스타인(Milstein)의 문헌[Nature, 1975, 256: 495-497]에 최초 기재된 하이브리도마(hybridoma) 기술; 코스보(Kosbor) 등의 문헌[1983, Immunology Today 4:72], 코테(Cote) 등의 문헌[1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030]에 기재된 인간의 B-세포 하이브리도마 기술; 코테 등의 문헌[1985, Monoclonal A뉴클레오타이드ibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]에 기재된 EBV-하이브리도마 기술을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다르게는, 단일 쇄 항체의 제조를 위해 기재된 기술(예컨대, 미국 특허 제 4,946,778호를 참조한다)은 AveR1- 또는 aveR2-특이적 단일 쇄 항체를 제조하도록 적용될 수 있다. 이들 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용된다.
AveR1 또는 AveR2 폴리펩타이드에 대한 특이적 결합 부위를 함유하는 항체 단편은 본 발명의 범주에 포함되며, 공지된 기술에 의해 발생될 수 있다. 이러한 단편은 완전한 항체 분자의 펩신 분해에 의해 발생될 수 있는 F(ab')2단편 및 F(ab')2단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 발생될 수 있는 Fab 단편을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다르게는, Fab 발현 라이브러리는 AveR1 또는 AveR2 폴리펩타이드에 대해 원하는 선택성을 갖는 Fab 단편을 신속하게 확인할 수 있도록 제작될 수 있다(휴즈(Huse) 등의 문헌[1989, Science 246: 1275-1281]을 참고한다).
단분지 항체 및 항체 단편을 제조하기 위한 기술은 당해 분야에 충분히 공지되어 있으며, 특히 할로우(Harlow)와 래인(Lane)의 문헌[1988, A뉴클레오타이드ibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory]와 고딩(J.W.Goding)의 문헌[1986, Monoclonal A뉴클레오타이드ibodies: Principles and Practice, Academic Press, London]에 추가로 기재되어 있다. 전술한 문헌 모두는 본원에서 참고문헌으로 인용된다.
1.7. 아베르멕틴의 용도
아베르멕틴은 구충제, 체외 기생충제, 살충제 및 살진제로서 특정한 용도를 갖는 매우 활성적인 구충제이며, 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 제조된 아베르멕틴은 이러한 모든 목적에 유용하다.
본 발명에 따라 제조된 아베르멕틴은 인간의 각종 질환 또는 질병, 특히 당해 기술에 공지된 바와 같이 기생충 감염에 의해 발생된 인간의 여러 질환 또는 질병을 치료하는데 유용하다. 예컨대, 이케다(Ikeda)와 오무라(Omura)의 문헌[1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609]을 참조한다.
본 발명에 따라 제조된 아베르멕틴은 기생충 선충류 군에 의해 가장 빈번히 발생되고 인간에게 질병을 유발시키고 돼지, 양, 가금류, 말 및 소에게서 심한 경제적 손실을 발생시킬 뿐만 아니라 가축의 건강에 영향을 미칠 수 있는 기생충 병을 비롯한 체내 기생충에 의해 유발된 각종 증상을 치료하는데 효과적이다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 아베르멕틴은 인간 뿐만 아니라 여러 종의 동물에 영향을 미치는 선충류(예컨대, 개의 디로필라리아(Dirofilaria)); 앤실로스토마(Ancylostoma), 네케이토(Necator), 아스카리스(Ascaris), 스트론길로이데스(Strongyloides), 트린키넬라(Trinchinella), 캐필라리아(Capillaria), 트리쿠리스(Trichuris), 엔테로비우스(E뉴클레오타이드erobius)와 같은 위장 기생충를 비롯하여 인간에게 영향을 미치는 기생충; 및 혈액 또는 기타 조직 또는 기관에서 발견되고(예컨대, 사상충) 탈장 질환에서 발견되는(스트론길로이데스 및 트리키넬라) 기생충에 대해 효과적이다.
본 발명에 따라 제조된 아베르멕틴은 또한 진드기(ticks, mites), 이, 벼룩, 금파리, 교역(biting) 곤충, 또는 여러 동물중에서도 소와 말에 영향을 미칠 수 있는 유주성 쌍씨류 유충에 의해 유발되는 체외 기생충 감염(예컨대, 포유동물 및 조류에 절지동물의 침입)을 치료하는데 유용하다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 아베르멕틴은 특히 바퀴, 옷좀나방, 동글수시렁이유 및 집파리와 같은 집 해충 뿐만 아니라 보관된 곡물 및 농작물의 해충에 대해서도 살충제로서 유용하며, 상기에서 해충에는 특히 거미, 진드기, 진디, 모충 및 메뚜기목(예: 메뚜기)이 포함된다.
본 발명의 아베르멕틴으로 치료할 수 있는 동물에는 양, 소, 말, 사슴, 염소, 돼지, 가금류를 비롯한 조류, 개 및 고양이가 포함된다.
본 발명에 따라 제조된 아베르멕틴은 특정한 목적 용도, 처리될 숙주 동물의 구체적인 종 및 관련된 기생충 또는 곤충에 적절한 제형으로 투여된다. 구충제로서 사용하기 위해 본 발명의 아베르멕틴은 캡슐, 환괴, 정제 또는 액체 물약 형태로 경구 투여하거나 또는 푸어-온(pour-on) 또는 주사 또는 임플란트(impla뉴클레오타이드)에 의해 투여될 수 있다. 이러한 제형은 표준 수의 관행에 따라 통상적인 방식으로 제조된다. 따라서, 캡슐, 환괴 또는 정제는 활성 성분을 적합한 미분된 희석제, 또는 분해제 및/또는 결합제(예: 전분, 락토즈, 활석, 마그네슘 스테아레아데 등)를 추가로 포함하는 담체와 혼합하여 제조될 수 있다. 물약 제형은 수용액중에 활성 성분을 분산제 또는 습윤제 등과 함께 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 제형은 용액을 혈액과 등장성으로 만들기에 충분한 염 및/또는 글루코즈와 같은 기타 물질을 함유할 수 있는 무균액 형태로 제조될 수 있다.
이러한 제형은 환자, 처리할 숙주 세포의 종, 감염의 중증도 또는 유형, 및 숙주의 체중에 따라 활성 화합물의 중량에 대해서도 다양해진다. 일반적으로 경구 투여의 경우, 환자 또는 동물 체중 1㎏당 약 0.001 내지 10㎎의 활성 화합물의 복용량을 단일 복용량 또는 1 내지 5일동안의 분할 복용량으로 주어지는 경우가 만족스럽다. 그러나, 의사 또는 수의사에 의해 임상 증후를 기준으로 결정되는 경우에는 보다 많거나 적은 복용량 범위가 지시되는 예도 있을 수 있다.
대안으로서, 본 발명에 따라 제조된 아베르멕틴은 동물 사료와 함께 투여될 수 있으며, 이러한 목적을 위해서는 농축 사료 첨가물 또는 프리믹스(premix)가 일반적인 사료와의 혼합을 위해 제조될 수 있다.
살충제로서 사용하거나 또는 농작물 해충을 처리하기 위해서는 본 발명의 화합물은 표준 농작물 관행에 따라 분무, 분진, 유화액 등으로 적용될 수 있다.
하기의 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
aveR1와 aveR2 유전자의 단리
본 실시예는 aveR1 및 aveR2 유전자 산물을 코딩하고 아베르멕틴 생합성을 조절하는데 관여하는 2개의 신규한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 유전자의 단리 및 특징을 기술한다.
2.1. DNA 단리를 위한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 증식
스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 ATCC 31272(단일 콜로니 단리물 #2)의 단일 콜로니를 디프코(Difco) 이스트 추출액 5g, 디프코 박토(Bacto)-펩톤 5g, 덱스트로즈 2.5g, MOPS 5g, 디프코 박토 아가 15g을 함유하는 1/2 농도 YPD-6 배지상에서 단리시켰다. dH2O를 사용하여 최종 부피를 1ℓ로 조정하고 pH를 7.0으로 조정하였으며, 배지를 121℃에서 25분동안 오토클레이브에 두었다. 상기 배지에서 증식한 균사를 이용하여, 28℃에서 48 내지 72시간동안 진탕(300rpm)하에 유지한 25mm X 150mm 튜브에 있는 TSB 배지(121℃에서 25분동안 오토클레이브에 넣어둔 dH2O 1ℓ중 디프코 트립틱 소이 브로쓰(Tryptic Soy Broth)) 10㎖를 접종시켰다.
2.2. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 염색체 DNA의 단리
전술한 바와 같이 증식한 균사 분액(0.25㎖ 또는 0.5㎖)을 1.5㎖들이 마이크로원심분리 튜브에 넣고, 60초동안 12,000 x g에서 원심분리하여 세포를 농축시켰다. 상청액을 따라내고 세포를 2㎎/㎖ 리소자임을 함유하는 TSE 완충액(1.5M 수크로즈 20㎖, 1M 트리스 HCl 2.5㎖(pH 8.0), 1M EDTA 2.5㎖(pH 8.0) 및 dH2O 75㎖) 0.25㎖에 재현탁시켰다. 샘플을 37℃에서 20분동안 진탕시키며 항온처리하고, AutoGen 540(등록상표) 자동화 핵산 단리 장비(미국 매사츄세츠주 내틱 소재의 인티그레이티드 세퍼레이션 시스템즈(I뉴클레오타이드egrated Separation Systems))에 로딩시켜서, 제조자 지시에 따라 사이클 159(장비 소프트웨어)을 이용하여 게놈 DNA를 단리시켰다.
다르게는, 균사 5㎖를 17mm x 100mm 튜브에 넣고, 세포를 3,000rpm에서 5분동안 원심분리하여 농축시키고, 상청액을 제거하였다. 세포를 TSE 완충액 1㎖중에 재현탁시키고, 3,000rpm에서 5분동안 원심분리하여 농축시키고, 상청액을 제거하였다. 세포를 2㎎/㎖ 리소자임을 함유하는 TSE 완충액 1㎖에 재현탁시키고, 30 내지 60분동안 진탕시키며 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 10% SDS 0.5㎖을 첨가하고, 용균이 완료될 때까지 세포를 37℃에서 항온처리하였다. 용균물을 10분동안 65℃에서 항온처리하고, 실온으로 냉각시키고, 2개의 1.5㎖들이 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 나누고, 0.5㎖ 페놀/클로로포름(0.5M Tris로 미리 평형화시킨 50% 페놀, pH 8.0; 50% 클로로포름)으로 1회 추출하였다. 수상을 제거하고, 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)로 2 내지 5회 추출하였다. 3M 아세트산 나트륨(pH 4.8)의 1/10 부피를 첨가하고, 혼합물을 얼음위에서 10분동안 항온처리하고 혼합물을 5분동안 15,000rpm으로 5℃에서 원심분리하고 상청액을 깨끗한 튜브로 제거하고 여기에 이소프로판올 1부피를 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 이어서, 혼합물을 얼음위에서 20분동안 항온처리하고, 20분동안 5℃에서 15,000rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, DNA 펠릿을 70% 에탄올로 1회 세척하였다. 펠릿을 건조시킨 후, DNA를 TE 완충액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)중에 재현탁시켰다.
2.3. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터 플라스미드 DNA의 단리
균사 분액(1.0㎖)을 1.5㎖들이 마이크로원심분리 튜브에 놓고, 세포를 12,000 x g에서 60초동안 원심분리하여 농축시켰다. 상청액을 따라내고, 세포를 10.3% 수크로즈 1.0㎖에 재현탁시키고, 12,000 x g에서 60초동안 원심분리하여 농축시키고, 상청액을 따라내었다. 이어서, 세포를 2㎎/㎖ 리소자임을 함유한 TSE 완충액 0.25㎖에 재현탁시키고, 37℃에서 20분동안 진탕시키며 항온처리하고, AutoGen 540 자동화 핵산 단리 장비에 로딩시켰다. 플라스미드 DNA를 제조자 지시에 따라 사이클 106(장치 소프트웨어)를 사용하여 단리시켰다.
다르게는, 균사 1.5㎖를 1.5㎖들이 마이크로원심분리 튜브에 넣고, 세포를 12,000 x g에서 60초동안 원심분리하여 농축시켰다. 상청액을 따라내고 세포를 10.3% 수크로즈 1.0㎖에 재현탁시키고 12,000 x g에서 60초동안 원심분리하여 농축시키고, 상청액을 따라내었다. 세포를 2㎎/㎖ 리소자임을 함유한 TSE 완충액 0.5㎖에 재현탁시키고, 37℃로 15 내지 30분동안 항온처리하였다. 항온처리후, 알칼리성 SDS(0.3N NaOH, 2% SDS) 0.25㎖를 첨가하고, 세포를 55℃에서 15분 내지 30분동안 또는 용액이 투명해질 때까지 항온처리하였다. 이어서, 아세트산 나트륨(0.1㎖, 3M, pH 4.8)을 DNA 용액에 첨가하고, 이를 10분동안 얼음상에서 항온처리하였다. DNA 샘플을 14,000rpm에서 10분동안 5℃로 원심분리하였다. 상청액을 깨끗한 튜브에 따라내고, 페놀:클로로포름(50% 페놀:50% 클로로포름) 0.2㎖을 첨가하고 서서히 혼합하였다. DNA 용액을 14,000rpm에서 10분동안 5℃로 원심분리하고, 상층을 깨끗한 에펜도르프 튜브에 따라내었다. 이소프로판올(0.75㎖)을 첨가하고, 용액을 서서히 혼합한 후, 20분동안 실온에서 항온처리하였다. DNA 용액을 5℃에서 15분동안 14,000rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 건조하고, DNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고, DNA를 TE 완충액에 재현탁시켰다.
2.4. 이 콜라이로부터의 플라스미드 DNA의 단리
형질전환된 이 콜라이 단일 콜로니를 100㎍/㎖ 앰피실린으로 보충한 루리아-버타니(Luria-Bertani: LB) 배지(dH2O 1ℓ중 박토-트립톤 10g, 박토 이스트 추출물 5g 및 NaCl 10g, pH 7.0, 121℃에서 25분동안 오토클레이브에 둠)에 접종시켰다. 배양물을 밤새 항온처리하고, 1㎖ 분액을 1.5㎖들이 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 배양물 샘플을 AutoGen 540 자동화 핵산 단리 장비에 로딩하고, 플라스미드 DNA를 제조자 지침서에 따라 사이클 3(장치 소프트웨어)을 이용하여 단리시켰다.
2.5. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 원형질의 제조 및 형질전환
스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 단일 콜로니를 1/2 농도의 YPD-6상에서 단리시켰다. 균사를 이용하여 25㎜ x 150㎜ 튜브에 있는 TSB 배지 10㎖를 접종시키고, 이어서 진탕시키며(300rpm) 28℃에서 48시간동안 항온처리하였다. 균사 1㎖를 이용하여 YEME 배지 50㎖를 접종하였다. YEME 배지는 1ℓ당 디프코 이스트 추출물 3g, 디프코 박토-펩톤 5g, 디프코 맥아 추출물 3g 및 수크로즈 300g을 함유하였다. 121℃에서 25분동안 오토클레이브에 둔 후, 2.5M MgCl2·6H2O(121℃에서 25분동안 각각 오토클레이브에 둠) 2㎖ 및 글리신(20%)(여과 및 멸균됨) 25㎖을 첨가하였다.
균사를 30℃에서 48 내지 72시간동안 증식시키고, 50㎖들이 원심분리 튜브(팔콘(Falcon)) 튜브에서 3,000rpm으로 20분동안 원심분리하여 수거하였다. 상청액을 따라내고, 균사를 수크로즈 205g, K2SO40.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, H2O 600㎖, K2PO4(0.5%) 10㎖, 잔량의 원소 용액 20㎖, CaCl2·2H2O(3.68%) 100㎖, MES 완충액(1.0M, pH 6.5) 10㎖을 함유하는 P 완충액에 재현탁시켰으며, 상기에서 잔량의 원소 용액은 1ℓ당 ZnCl240㎎, FeCl3·6H2O 200㎎, CuCl2·2H2O 10㎎, MnCl2·4H2O 10㎎, Na2B4O7·10H2O 10㎎, (NH4)6Mo7O24·4H2O 10㎎을 함유하였다. pH는 6.5으로 조정하였고, 최종 부피는 1ℓ로 조정하였으며, 배지는 0.45마이크론 필터를 통해 한외 여과하였다.
균사를 3,000rpm에서 20분동안 펠릿화시키고, 상청액을 따라내고, 균사를 2㎎/㎖ 리소자임을 함유한 P 완충액에 재현탁시켯다. 균사를 35℃에서 15분동안 진탕시키며 항온처리하고, 현미경으로 검사하여 원형질 형성의 정도를 결정하였다. 원형질 형성이 완료되었을 때, 원형질을 10분동안 8,000rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 원형질을 P 완충액 10㎖에 재현탁시켰다. 원형질을 8,000rpm으로 10분동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 원형질을 P 완충액 2㎖에 재현탁시키고, 약 1 x 109원형질을 극저온 물질의 보존에 적당한(cryogenic) 바이알(날로겐(Nalogen))에 분포시켰다.
1 x 109원형질을 함유하는 바이알을 10분동안 8,000rpm에서 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 원형질을 P 완충액 0.1㎖에 재현탁시켰다. 형질전환중인 DNA 2 내지 5㎍을 원형질에 첨가하고, 이후 즉시 발효중인(working) T 완충액 0.5㎖을 첨가하였다. T 완충액 기제는 PEG 1000(시그마(Sigma)) 25g, 수크로즈 2.5g 및 H2O 83㎖을 함유한다. pH를 1N NaOH(여과-멸균됨)를 사용하여 8.8로 조정하고, T 완충액 기재를 여과 멸균하고, 4℃에서 보관하였다. 사용 당일에 제조된 발효중인 T 완충액은 T 완충액 기제 8.3㎖, K2SO4(4mM) 1.0㎖, CaCl2·2H2O(5M) 0.2㎖ 및 TES(1M, pH 8) 0.5㎖을 함유하였다. 발효중인 T 완충액의 각 성분을 여과 멸균하고 4℃에서 보관하였다.
원형질에 T 완충액을 첨가한지 20초 이내에, P 완충액 1.0㎖을 다시 첨가하고, 원형질을 8,000rpm으로 10분동안 원심분리하였다. 상청액을 따라내고 원형질을 P 완충액 0.1㎖에서 재현탁시켰다. 이어서, 원형질을 수크로즈 205g, K2SO40.25g, MgCl2·6H2O 10.12g, 글루코즈 10g, 디프코 카사미노산(Casamino Acids) 0.1g, 디프코 효모 추출물 5g, 디프코 오트밀 아가 3g, 디프코 박토 아가 22g 및 H2O 800㎖을 함유한 RM14 배지상에 편평하게 놓아 배양시켰다. 상기 용액을 121℃에서 25분동안 오토클레이브에 두었다. 오토클레이브 후에 K2SO410㎖(0.5%), CaCl2·2H2O(5M) 5㎖, L-프롤린(20%) 15㎖, MES 완충액(1.0M, pH 6.5) 10㎖M, 잔량의 원소 용액(전술한 바와 같은 용액) 2㎖, 시클로헥스이미드 원액(25㎎/㎖) 40㎖ 및 1N NaOH 2㎖의 멸균 원액을 첨가하였다. RM14 배지 25㎖을 플레이트당 나누고, 플레이트를 사용전 24시간동안 건조시켰다.
원형질을 95% 습도에서 30℃로 20 내지 24시간동안 항온처리하였다. 에리트로마이신 내성 형질전환체를 선별하기 위해 부가(overlay) 완충액 1㎖과 에리트로마이신 125㎍(5㎍/㎖ 최종 농도의 에리트로마이신을 제공하기 위함)을 RM14 재생 플레이트에 균일하게 도포하였다. 부가 완충액은 100㎖당 수크로즈 10.3g, 잔량의 원소 용액(전술한 바와 동일함) 0.2㎖ 및 MED(1M, pH 6.5) 1㎖을 함유한다. 원형질을 95% 습도에서 37℃로 7 내지 14일동안 에리트로마이신 내성(Ermr) 콜로니가 육안으로 보일 때까지 항온처리하였다.
2.6. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 발효 분석
1/2 농도의 YPD-6상에서 4 내지 7일동안 증식시킨 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스를 수행 배지 8㎖와 2개의 5㎜ 유리 비드를 함유한 1 x 6인치 튜브에서 접종시켰다. 수행 배지는 가용성 전분(얇은 딱딱한 전분 또는 KOSO, 일본 나고야 소재의 재팬 콘 스타치 캄파니(Japan Corn Starch Co.)) 20g/L, 파마미디아(Pharmamedia)(미국 테네시주 멤피스 소재의 트레이더스 프로틴(Trader's Protein)) 15g/l, 아다민(Ardamine) pH(미국 뉴저지주 클리프톤 소재의 챔플레인 인코포레이티드(Champlain, Inc.)) 5g/L, CaCO32g/L, 2-(±)-메틸 부티르산 50ppm, 이소부티르산 60ppm 및 이소발레르산 20ppm의 배지중에서 일정한 최종 농도를 함유한 2x bcfa("bcfa"란 분지된 쇄 지방산을 말한다)를 함유한다. pH는 7.2로 조정하고 배지는 121℃에서 25분동안 오토클레이브에 두었다.
튜브를 17°각에서 215rpm으로 29℃로 3일동안 진탕시켰다. 씨드 배양물 2㎖ 분액을 사용하여, 전분(얇은 딱딱한 전분 또는 KOSO) 160g/L, 누트리소이(Nutrisoy)(미국 일리노이주 데카투르 소재의 아커 다니엘스 미들랜드(Archer Daniels Midland)) 10g/L, 아다마인 pH 10g/L, K2HPO42g/L, MgSO4·4H2O 2g/L, FeSO4·7H2O 0.02g/L, MnCl20.002g/L, ZnSO4·7H2O 0.002g/L, CaCO314g/L 및 2x bcfa(전술한 바와 동일함)를 함유한 제조 배지 25㎖를 함유한 300㎖들이 엘렌메이어 플라스크를 접종시켰다. pH를 6.9로 조정하고, 배지를 121℃에서 25분동안 오토클레이브에 두었다.
접종 후, 플라스크를 29℃에서 12일동안 200rpm으로 진탕시키며 항온처리하였다. 항온처리 후, 샘플 2㎖을 플라스크로부터 꺼내어 메탄올 8㎖로 희석시키고, 혼합물을 10분동안 1250x g로 원심분리하여 펠릿 부스러기로 만들었다. 이어서, 벡크만 울트라스피어(Beckman Ultrasphere) ODS 컬럼(25㎝ x 4.6㎜ ID)을 이용하는 고속 액상 크로마토그래피(HPLC)에서 유속을 0.75㎖/분으로 하여 240㎚에서 흡수 측정치를 검출함으로써 상청액을 분석하였다. 이동상은 86/8.9/5.1의 메탄올/물/아세토니트릴이었다.
2.7. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 PKS 유전자의 확인 및 단리
스트렙토마이시즈 아베르미틸리스(ATCC 31272) 염색체 DNA의 코스미드 라이브러리를 제조하고, 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea) 폴리켑타이드 신타제(PKS) 유전자 단편으로부터 제조된 케토신타아제(Ketosy뉴클레오타이드hase: KS) 프로브로 하이브리드 형성시켰다. 코스미드 라이브러리의 제조방법에 대한 상세한 설명은 전술한 샘브룩의 전술한 1989년 문헌에서 찾을 수 있다. 스트렙토마이시즈 염색체 DNA 라이브러리의 제조방법에 대한 상세한 설명은 홉우드 등의 전술한 1985년 문헌에 제시되어 있다. 케토신타아제-하이브리드 형성 영역을 함유한 코스미드 클론은 pEX26(영국 캠브릿지의 리들리(P. Leadley) 박사가 공급함)로부터의 2.7Kb NdeI/Eco47III 단편으로 하이브리드 형성시킴으로써 확인하였다. pEX26 약 5㎍을 엔도뉴클레아제 NdeI/Eco47III을 이용하여 분해하였다. 반응 혼합물을 0.8% 시플라크(SeaPlaque: 등록상표) GTG 아가로즈 겔(미국 록클랜드 소재의 FMC 바이오 프러덕츠(BioProducts))상에 로딩하였다. 2.7KbNdeI/Eco47III 단편을 전기영동 후에 겔로부터 절단하고, DNA를 패스트 프로토콜(Fast Protocol)을 이용하여 GELase(등록상표)(에피센트레 테크놀로지스(Epice뉴클레오타이드re Technologies))를 이용하여 겔로부터 수거하였다. 2.7KbNdeI/Eco47III 단편을 BRL 닉 트랜슬레이션 시스템(Nick Translation System)(미국 미들랜드주 개터스버그 소재의 BRL 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(BRL Life Technologies, Inc.))을 공급자 지시서에 따라 이용하여 [α-32P]dCTP(데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 테트라(트리에틸암모늄)염, [α-32P]-)으로 라벨링하였다. 전형적인 반응을 0.05㎖ 부피에서 실시하였다. 5㎕ 정지 완충액을 첨가한 후, 라벨링된 DNA를 공급자 지침에 따라 G-25 세파덱스 퀵 스핀(Sephadex Quick Spin: 등록상표) 컬럼을 이용하여 혼입되지 않은 뉴클레오타이드로부터 분리하였다.
약 1800개의 코스미드 클론을 콜로니 하이브리드 형성에 의해 차폐시켰다. 사카로폴리스포라 에리트라에아 KS 프로브로 강하게 하이브리드 형성된 10개의 클론을 확인하였다. 코스미드 DNA를 함유한 이 콜라이 콜로니를 LB 액상 배지에서 증식시키고, 제조자 지시에 따라 사이클 3(장치 소프트웨어)을 이용하여 AutoGen 540 자동화 핵산 단리 장비에서 각각 배양물로부터 코스미드 DNA를 단리시켰다. 제한 엔도뉴클레아제 맵핑 및 서던 블롯 하이브리드 형성 분석을 실시하여 클론중 5개가 중첩된 염색체 영역을 함유함을 밝혀내었다. 5개 코스미드(즉, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69)의 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 게놈 BamHI 제한 맵을 중첩 코스미드 및 하이브리드 형성의 분석에 의해 제작하였다(도 4).
2.8. 조절 유전자 ORF의 확인
하기의 방법을 pSE68 클론으로부터 유도된 단편을 서브클론시키는데 사용하였다. pSE68(5㎍)을 Xbal과 EcoRI를 사용하여 분해하였다. 반응 혼합물을 0.8% 시플라크 GTG 아가로즈 겔(FMC 바이오프러덕츠)상에 로딩시키고, 전기 영동후에 19Kb Xbal/EcoRI 단편을 겔로부터 절단하고, 패스트 프로토콜을 사용하는 GELase(에피센트레 테크놀로지스)를 이용하여 겔로부터 DNA를 수거하였다. pGEM7Zf(+)(프로메가(Promega)) 5㎍을 Xbal과 EcoRI를 사용하여 분해하였다. 19Kb EcoRI/Xbal 단편 약 0.5㎍과 분해된 pGEM7Zf(+) 0.5㎍을 혼합하고 공급자 지시에 따라 총 부피 20㎕중에서 15℃로 리가제(미국 매사츄세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.)) 1유닛을 사용하여 밤새 항온처리하였다. 항온처리후에, 결찰(ligation) 혼합물 5㎕을 70℃에서 10분동안 항온처리하고, 실온까지 냉각시키고, 제조자의 지시에 따라 경쟁 이 콜라이 DH5α 세포(BRL)를 형질전환시키는데 사용하였다. 플라스미드 DNA를 앰피실린 내성 형질변환체로부터 단리시키고, 19Kb Xbal/EcoRI 삽입물이 존재함을 제한 분석에 의해 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE200으로 지정하였다.
pSE200은 제조자 지시에 따라 Erase-a-Base 시스템(프로메가)을 이용하는 엑소뉴클레아제 III 분해에 의해 더욱 변형되었다. pSE200 5㎍을 ClaI으로 분해시켰다. ClaI은 제조자의 지시에 따라 α-포스포로티오에이트 데옥시리보뉴클레오타이드로 충진됨으로써 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호된 5' 돌출부를 발생시킨다. 이어서, pSE200은 EcoRI에 의해 분해하고, 분액은 30초 내지 12분로 다양한 시간동안 S1 뉴클레아제로 분해시켰다. S1 뉴클레아제로 처리된 pSE200 샘플을 밤새 결찰시키고, 제조자 지시에 따라 이 콜라이 HB101(BRL) 경쟁 세포로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 앰피실린 내성 형질전환체로부터 단리시키고, 삽입물 DNA의 크기를 제한 효소 분석에 의해 결정하였다. 5.9Kb 삽입물을 함유한 1개의 단리체가 확인되었으며 이를 pSE201이라 지정하였고(도 2 참조), ATCC(수납번호 제 203182호)로 기탁되었다. 8.8Kb 삽입물을 함유한 두 번째 단리체가 확인되었으며, 이 단리체를 pSE210이라 지정하였다(도 2b 참조).
pSE201 약 10㎍을 제조자 지시에 따라 플라스미드 DNA 단리 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐(Qiagen))를 이용하여 단리시켰다. 이 DNA는 ABI 373A 자동화 DNA 시퀀싱기(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 이용하여 서열화하였다. 서열 자료를 조합하고, 제네틱 컴퓨터 그룹 프로그램즈(Genetic Computer Group programs)(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 GCG)를 이용하여 편집하였다. 조절 유전자 aveR1과 aveR2의 ORF의 DNA 서열은 서열번호:1과 서열번호:3으로 동일하게 제공된다. aveR1 ORF는 서열번호:1의 뉴클레오타이드 1112 내지 뉴클레오타이드 2317이다. aveR2 ORF는 서열번호:1의 뉴클레오타이드 2314 내지 뉴클레오타이드 3021이다.
스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF로부터 유도된 아미노산 서열의 비교는 스트렙토마이시즈 코엘리칼라의 도출된 absA1 유전자 산물과 32%의 동일성을 나타낸다(도 1a)(브리안(Brian) 등의 문헌[1996, J. Bacteriology 178: 3221-3231]). 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF로부터 도출된 아미노산 서열의 비교는 스트렙토마이시즈 코엘리칼라의 도출된 absA2 유전자 산물과 45%의 동일성을 나타낸다(도 1b).
2.9. 유전자 치환 벡터의 제작 및 용도
스트렙토마이시즈 유전자에 변이를 도입하기 위한 기술에 대한 일반적인 설명은 키에저(Kieser)와 홉우드의 문헌[1991, Meth. Enzym. 204:430-458]에 의해 제공된다. 보다 상세한 설명은 안자이(Anzai)등의 문헌[1998, J. A뉴클레오타이드ibiot. XLI(2): 226-233], 스튜츠만(Stutzman)-엥왈(Engwall) 등의 문헌[1992, J. Bacteriol. 174(1): 144-154] 및 오(Oh)와 채터(Chater)의 문헌[1997, J. Bact. 179:122-127]에 제공되어 있다. 이들 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용되어 있다.
2.9.1. aveR1 및 aveR2 유전자 둘다의 불활성화
aveR1 및 aveR2 유전자 둘다는 하기와 같이 pSE210중의 988 bp Bg/II/StuI 단편(도 2b)을 사카로폴리스포라 에리트라에아로부터의 에리트로마이신 내성 유전자(ermE)로 치환시켜서 불활성화시켰다. pSE210 약 5㎍을 Bg/II와 StuI에 의해 분해하여 10.8Kb 단편을 이탈시켰다. Bg/II 말단을 1x 클레노우(Klenow) 완충액과 1U 클레노우 효소(베링거 맨하임(Boehringer Mannheim))중에서 100μM의 d뉴클레오타이드P 최종 농도로 DNA를 30분동안 37℃로 항온처리하여 충전시켰다. 10.8Kb 단편을 아가로즈 겔로부터 정제하고, 1x 알칼리성 포스파타제 완충액과 1U 알칼리성 포스파타제중에서 50℃로 1시간동안 항온 처리하여 말단을 디포스포릴레이트화시켰다. 항온처리 후에 디포스포릴레이트화된 단편을 2.3. 단락에 기재된 바와 같이 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제시키고, TE 완충액에 재현탁시켰다. ermE 유전자를 Bg/II에 의해 분해시켜 plJ4026으로부터 단리시키고(영국 노르위치 소재의 존 인즈 인스티튜트(John Innes Institute)에서 공급되며, 또한 비브(Bibb) 등의 문헌[1985, Gene 41: 357-368]을 참조한다) 1x 클레노우 완충액과 1U 클레노우 효소중 100μM의 d뉴클레오타이드P 최종 농도와 함께 ermE 단편을 30분동안 37℃에서 항온 처리하여 Bg/II 말단을 충전시켰다. 1.7Kb ermE 단편을 아가로즈 겔로부터 정제시키고, 0.5㎍dmf 10.8Kb 단편 0.5㎍과 혼합시키고, 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 이용하여 제조자 지시에 따라 경쟁 이 콜라이 HB101 세포(BRL)를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 앰피실린 내성 형질전환체로부터 단리시키고, ermE 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. pSE214(도 3a)로 지정된 상기 플라스미드는 이 콜라이 DM1(BRL)으로 형질전환시키고, 플라스미드 DNA는 앰피실린 내성 형질전환체로부터 단리시켰다. 988 bp Bg/II/StuI 단편 대신에 ermE 유전자의 삽입은 aveR1 유전자로부터 752 bp를 제거하고, aveR2 유전자로부터 232bp를 제거한다.
스트렙토마이시즈 아베르미틸리스에서 독립적으로 복제되지 않는 pSE214는 하기와 같이 통합적인 유전자 치환을 위해 유전자 치환 벡터로서 사용되었다. pSE214 DNA 8㎕(1㎍)은 전술한 오 및 채터의 전술한 1997년 문헌의 절차에 따라 1M NaOH 2㎕을 첨가하고, 37℃에서 10분동안 항온 처리한 후, 얼음상에서 신속히 급냉시키고, 1M HCl 2㎕을 첨가하였다. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 원형질을 변성된 pSE214에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체를 플라스미드의 통합적인 유전자 재조합을 숙주 세포 염색체내로 유도시키기 위하여 에리트로마이신 유전자의 발현을 필요로 하는 선택적인 조건하에서 재생시켰다. 플라스미드는 독립적으로 복제하지 않으므로, 에리트로마이신 내성 형질전환체는 ermE 유전자를 플랭킹시키는 2개의 DNA 단편중 하나 및 염색체내 그의 동형 상대짝 간의 일회의 동형 재조합(이로 인해 전체 pSE214 벡터가 통합된다) 또는 변이를 플랭킹시키는 두 번째 DNA 및 염색체내 그의 동형 상대짝 간에 두 번째 재조합이 발생하는 이중 교차(이로 인해 플라스미드로부터 염색체로의 aveR1/aveR2(불활성화) 서열의 교환이 일어나고 크로모좀으로부터 야생형 대립유전자 및 벡터 서열이 부수적으로 손실된다)에 의해 염색체로 통합된 플라스미드 서열을 가져야 한다. 에리트로마이신 내성 형질전환체를 단리시켜, 벡터 주쇄의 존재에 대해 PCR에 의해 차폐시켰다. 모든 형질전환체는 벡터 주쇄를 갖지 않으며, 이는 이중 교차가 발생하고 염색체의 aveR1/aveR2 서열이 aveR1/aveR2 제거된 서열로 치환되었음을 의미한다. 에리트로마이신 내성 형질전환체는 발효 생성물의 HPLC 분석에 의해 분석하였다. aveR1/aveR2 제거된 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주는 대조 균주보다 평균 3.4배 많은 총 아베르멕틴을 생성시켰다(표 1).
2.9.2. aveR2 유전자의 불활성화
ermE 유전자를 pSE210내의 Bg/II 부위(도 2b)에 삽입시키고 하기와 같이 생성된 플라스미드를 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스중의 유전자 치환 벡터로서 사용하여 aveR2 유전자를 불활성화시켰다. pSE210 약 5㎍을 Bg/II에 의해 분해하였다. 이어서, 선형 pSE210을 말단을 디포스포릴레이트화시키기 위하여 1x 알칼리성 포스파타제 완충액 및 1U 알칼리성 포스파타제중에서 1시간동안 50℃로 항온처리하였다. ermE 유전자를 Bg/II에 의해 분해시켜 plJ4026으로부터 단리시키고, 이어서 전기 영동시키고 1.7Kb ermE 유전자를 겔로부터 정제하였다. 선형 pSE210 약 0.5㎍과 ermE 단편 0.5㎍을 함께 혼합하여 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 제조자 지시에 따라 경쟁 이 콜라이 HB101(BRL)으로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 앰피실린 내성 형질전환체로부터 단리시키고, ermE 삽입물이 존재하는 지를 제한 분석에 의해 확인하였다. pSE216(도 3b)로 지정된 상기 플라스미드를 제조자 지시에 따라 이 콜라이 DM1(BRL)로 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 앰피실린 내성 형질전환체로부터 단리시켰다.
스트렙토마이시즈 아베르미틸리스에서 독립적으로 복제되지 않는 pSE216은 하기와 같이 통합적인 유전자 치환을 위한 유전자 치환 벡터로서 사용하였다. pSE216 DNA 8㎕(1㎍)을 1M NaOH 2㎕을 첨가하고, 10분동안 37℃로 항온 처리한 후, 얼음위에서 신속하게 급냉시키고, 1M HCl 2㎖을 첨가하여 변성시켰다(전술한 오 및 채터의 1997년 문헌). 이어서, 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 원형질을 변성된 pSE216에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체를 플라스미드의 숙주 세포 염색체내로 통합적인 유전자 재조합시키도록 유도시키기 위하여 에리트로마이신 유전자의 발현을 필요로 하는 선택적인 조건하에서 발생시켰다. 플라스미드는 독립적으로 복제되지 않으므로, 에리트로마이신 내성 형질전환체는 ermE 유전자를 플랭킹시키는 2개의 DNA 단편중 하나 및 염색체내의 그의 동형 상대짝 간에 단일 동형 재조합(이로 인해 전체 pSE214 벡터의 통합이 발생한다) 또는 변이를 플랭킹시키는 두 번째 DNA 및 염색체내의 그의 동형 상대짝 간에 두 번째 재조합이 발생하는 이중 교차(이로 인해 플라스미드로부터 염색체로의 aveR2(불활성화) 서열의 교환이 발생하고 염색체로부터 야생형 대립유전자 및 벡터 서열이 부수적으로 손실된다)에 의해 염색체로 통합된 플라스미드 서열을 가져야 한다. 에리트로마이신 내성 형질전환체를 단리시키고, 벡터 주쇄 존재에 대하여 PCR에 의해 차폐시켰다. 모든 형질전환체는 벡터 주쇄를 갖지 않으며, 이는 이중 교차가 발생하고 염색체 aveR2 서열이 불활성화 aveR2 서열로 치환되었음을 의미한다. 에리트로마이신 내성 형질전환체는 발효 생성물의 HPLC 분석에 의해 분석하였다. 불활성화된 aveR2 유전자를 함유한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주는 대조 균주보다 총 아베르멕틴을 평균 3.1배 많이 생성시켰다(표 1).
대조군(5개 배양물의 평균) aveR1/aveR2 제거(4개 배양물의평균) aveR2 삽입(6개 배양물의평균)
아베르멕틴의 총 상대량 1 3.4 3.1
미생물 기탁
하기의 미생물을 미국 미들랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 1998년 9월 9일자로 기탁하였으며, 다음과 같은 수탁 번호를 부여받았다.
플라스미드 수탁 번호
플라스미드 pSE201 203182
상기에 기재된 모든 특허, 특허원 및 문헌은 본원에서 참고를 위해 전체적으로 인용되었다.
본 발명은 본원에 기재된 특정한 태양에 의해 그 범위가 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 각 측면의 하나의 예시로서 간주되며, 기능적으로 동일한 방법 및 구성요소가 본 발명의 범주내에 포함된다. 실제로, 본원에 기재된 것 이외에 본 발명의 여러 변형이 당해 기술의 숙련자들에게는 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 명확해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주내에 포함되는 것이다.
본 발명에 따라, 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 종 또는 균주 세포의 aveR1 또는 aveR2 유전자를 변이시켜 이들 유전자를 불활성화시킴으로써 상기와 같은 변이를 수행하지 않은 동일한 종 또는 균주 세포에 비해 평균 3.1배 증가한 양의 아베르멕틴의 양이 생성될 수 있으며, 이로써 아베르멕틴 폴리케타이드 신타아제(PKS) 발현 및 아베르멕틴 생합성을 적절하게 조절할 수 있다.

Claims (63)

  1. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)로부터의 aveR1 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  2. 제 1항에 있어서,
    aveR1 유전자 산물이 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  3. 제 2항에 있어서,
    서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  4. 제 3항에 있어서,
    서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  5. 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자와 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  6. 제 5항에 있어서,
    적당히 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되고, 본 발명을 실시하는데 유용한 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  7. 제 6항에 있어서,
    매우 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  8. 제 7항에 있어서,
    매우 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  9. 서열번호:2의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  11. 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 1111의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2318 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹(flanking)시키는 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 플랭킹 서열에 동형인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  12. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  13. 제 12항에 있어서,
    aveR2 유전자 산물이 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  14. 제 13항에 있어서,
    서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  15. 제 14항에 있어서,
    서열번호:3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  16. 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  17. 제 16항에 있어서,
    적당히 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되고, 본 발명을 실시하는데 유용한 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  18. 제 17항에 있어서,
    매우 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  19. 제 18항에 있어서,
    매우 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  20. 서열번호:4의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  21. 제 12항 내지 제 20항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  22. 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 2313의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 3022 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 플랭킹 서열에 동형인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  23. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR1 유전자 산물 및 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  24. 제 23항에 있어서,
    aveR1 유전자 산물이 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하고, aveR2 유전자 산물이 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  25. 제 24항에 있어서,
    서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 도시된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021에 도시된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  26. 제 25항에 있어서,
    서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 3021에 도시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  27. 제 26항에 있어서,
    서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  28. 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 도시된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021에 도시된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  29. 제 28항에 있어서,
    적당히 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩타이드 및 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되고, 본 발명을 실시하는데 유용한 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  30. 제 29항에 있어서,
    매우 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩타이드 및 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  31. 제 30항에 있어서,
    매우 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 도시된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021에 도시된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 보체가 되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  32. 서열번호:2의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 제 1 폴리펩타이드 및 서열번호:4의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 제 2 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  33. 제 23항 내지 제 32항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  34. 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1 내지 대략 뉴클레오타이드 1111의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 3022 내지 대략 뉴클레오타이드 5045의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이 플랭킹 서열에 동형인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  35. 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드 형성하여, 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 서열번호:1의 뉴클레오타이드 서열의 보체인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 분자가 되는 올리고뉴클레오타이드 분자.
  36. (a) 서열번호:2 또는 서열번호:4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자; (b) (a)의 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형 폴리뉴클레오타이드 분자; (c) 서열번호:2 또는 서열번호:4의 아미노산 서열에 동형인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자; 또는 (d) (a), (b) 또는 (c)의 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자중 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  37. 제 36항에 있어서,
    폴리뉴클레오타이드 분자가 하나 이상의 조절 요소와 작용가능하게 결합된 재조합 벡터.
  38. 제 36항에 있어서,
    선택가능한 마커 또는 리포터 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 재조합 벡터.
  39. 제 36항에 있어서,
    서열번호 1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  40. 제 36항에 있어서,
    서열번호:3의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  41. 제 36항에 있어서,
    서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 1112 내지 대략 뉴클레오타이드 2317에 도시된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호:1의 대략 뉴클레오타이드 2314 내지 대략 뉴클레오타이드 3021에 도시된 바와 같은 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  42. 제 41항에 있어서,
    플라스미드 pSE201(ATCC 203182)인 재조합 벡터.
  43. 제 36항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
  44. 서열번호:2의 아미노산 서열, 서열번호:4의 아미노산 서열, 그의 동형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 포함하는 실질적으로 정제되거나 단리된 폴리펩타이드.
  45. 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편의 발현에 도움이 되는 조건하에 제 43항에 따른 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 발현된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 실질적으로 정제되거나 단리된 형태로 세포 배양물로부터 수거하는 단계를 포함하는,
    서열번호:2의 아미노산 서열, 서열번호:4의 아미노산 서열, 그의 동형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 포함하는 실질적으로 정제되거나 단리된 폴리펩타이드의 제조 방법.
  46. (a) 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스로부터의 aveR1 유전자 산물 또는 aveR2 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자, (b) (a)의 폴리뉴클레오타이드 분자에 동형인 폴리뉴클레오타이드 분자, (c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드 분자의 상당 부분인 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 분자, 및 (d) 원래 동일계에서 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF 또는 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 균주의 세포에 비해 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에서 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생성되는 아베르멕틴의 양을 검출가능할 정도로 증가시키는 하나 이상의 변이를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  47. 제 46항에 있어서,
    완전한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR1 ORF 또는 그의 동형 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 그의 상당 부분; 완전한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR2 ORF 또는 그의 동형 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 그의 상당 부분; 완전한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF 또는 그의 동형 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 그의 상당 부분; 동일계에서 원래 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열, 동일계에서 원래 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR2 ORF를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열 또는 동일계에서 원래 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 ORF 및 aveR2 ORF 둘다를 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
    스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다를 변이시키는데 유용하여서, aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에서 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이, 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 균주의 세포에 비해 검출가능할 정도로 증가되는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  48. 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에 변이를 도입하는데 유용한, 제 46항 또는 제 47항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 유전자 구조물.
  49. 제 48항에 있어서,
    스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 일부를 각각 제거하거나 또는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 일부를 각각 상이하거나 이형인 뉴클레오타이드 서열로 치환시켜서 상기 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자를 변이시킬 수 있는 유전자 구조물.
  50. 제 49항에 있어서,
    스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 유전자와 aveR2 유전자중 일부를 각각 제거하거나 또는 aveR1 유전자와 aveR2 유전자중 일부를 각각 상이하거나 이형인 뉴클레오타이드 서열로 치환시켜서 상기 aveR1 유전자와 aveR2 유전자 둘다를 변이시킬 수 있는 유전자 구조물.
  51. 제 48항에 있어서,
    스트렙토마이시즈 아베르미틸리스의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자 각각에 상이하거나 이형인 뉴클레오타이드 서열을 삽입함으로써 상기 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자를 변이시킬 수 있는 유전자 구조물.
  52. (a) 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; (b) (a) 단계의 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에 변이를 도입하는 단계; 및 (c) (b) 단계에서 생성된 바와 같이 유전자 변이를 수행한 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을, 유전자 변이를 수행하지 않은 (a) 단계의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양과 비교하는 단계를 포함하고; 이 때, (b) 단계에서 생성된 바와 같이 유전자 변이를 수행한 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양이 유전자 변이를 수행하지 않은 (a) 단계의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양보다 검출가능할 정도로 더 많은 경우에, 아베르멕틴의 생성량을 검출가능할 정도로 증가시킬 수 있는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자 또는 이들 둘다의 변이를 확인하는,
    유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 의해 생성된 아베르멕틴의 양을 검출가능할 정도로 증가시킬 수 있는, 스트렙토마이시즈 종 또는 균주에서의 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다의 변이를 확인하기 위한 방법.
  53. 제 52항에 있어서,
    스트렙토마이시즈 종이 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스인 방법.
  54. 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에서 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다를 변이시키는 단계 및 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 비해 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는 변이된 세포를 선별하는 단계를 포함하는,
    스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 비변형 세포에 비해 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는, 스트렙토마이시즈 종 또는 균주로부터의 유전자 변형된 세포를 제조하는 방법.
  55. 제 54항에 있어서,
    스트렙토마이시즈 종이 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스인 방법.
  56. 제 54항에 있어서,
    aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 일부를 제거하거나 또는 aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 일부를 상이하거나 이형인 뉴클레오타이드 서열로 치환시켜서 변이를 수행하는 방법.
  57. 제 54항에 있어서,
    aveR1 유전자와 aveR2 유전자 둘다의 일부를 제거하거나 또는 aveR1 유전자와 aveR2 유전자 둘다의 일부를 상이하거나 이형인 뉴클레오타이드 서열로 치환시켜서 변이를 수행하는 방법.
  58. 제 54항에 있어서,
    aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자내로 상이하거나 이형인 뉴클레오타이드 서열을 삽입하여서 변이를 수행하는 방법.
  59. aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에 대한 하나 이상의 변이의 결과로서, 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 비해 검출가능할 정도로 증가된 양의 아베르멕틴을 생성하는 세포로 이루어진 스트렙토마이시즈 균주.
  60. 제 59항에 있어서,
    그 종이 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스인 균주.
  61. 아베르멕틴의 생성을 허용하거나 유도하는 조건하의 배지에서, aveR1 유전자 또는 aveR2 유전자중 하나 또는 이들 둘다에서의 변이(이 때, 이 유전자 변이는 유전자 변이를 수행하지 않은 동일한 종 또는 균주의 세포에 비해 유전자 변이를 수행한 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포에 의해 생성되는 아베르멕틴의 양을 검출가능할 정도로 증가시키는 작용을 한다)를 포함하는 스트렙토마이시즈 종 또는 균주의 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양물로부터 아베르멕틴을 수거하는 단계를 포함하는, 스트렙토마이시즈의 배양에 의해 증가된 양의 아베르멕틴을 생성시키는 방법.
  62. 제 61항에 있어서,
    스트렙토마이시즈의 종이 스트렙토마이시즈 아베르미틸리스인 방법.
  63. 본 발명의 aveR1 유전자 산물, aveR2 유전자 산물, 동형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편에 대한 항체.
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