KR19990079922A

KR19990079922A - 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 포함하는 지질대사 개선및 혈압강하용 조성물

Info

Publication number: KR19990079922A
Application number: KR1019980012818A
Authority: KR
Inventors: 복성해; 손광희; 정태숙; 배기환; 박용복; 최명숙; 권용국; 현병화; 최양규; 이철호; 문석식
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 1999-11-05
Also published as: KR100296250B1

Abstract

본 발명은 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 포함하는 지질대사 개선 및 혈압강하용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 의약용 및 식품용 조성물을 포함한다. 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은, 동물에 투여되었을 때 간 질환, 고혈압증, 동맥경화증, 고지혈증 등의 성인병 및 암 예방 등의 효과를 나타낼 수 있다.

Description

대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 포함하는 지질대사 개선 및 혈압강하용 조성물

본 발명은 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 포함하는 지질대사 개선 및 혈압강하용 조성물에 관한 것이다.

대추는 생약제로서 예로부터 정신안정, 스트레스 해소, 불면증 치료, 간장해독작용 촉진 및 건위제로서 이용되어 왔으며(송효정,산야초치료법,228, (1994)), 이에는 혈압강하 및 콜레스테롤 강하 활성성분 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질(cholesterol ester transfer protein, CETP) 저해제가 포함되어 있다는 사실이 본 발명자들에 의해 밝혀진 바 있다(한국특허출원 제 97-59425 호 및 제 97-59426 호). 또한, 감귤류 과피 추출물 및 그로부터 분리된 헤스페리딘 또는 나린진은 동맥경화 예방효과가 탁월하다는 사실도 역시 본 발명자들에 의해 밝혀졌다(한국특허출원 제 97-55578 호, 제 97-55579 호 및 제 97-55580 호).

감귤류 과피는 각종 약리활성작용, 예를 들어, 심장순환기 질환과 관련된 지질대사 개선 효과, 항암 및 항바이러스 작용 등을 가진 것으로 알려져 있다. 예들 들어, 헤스페리딘 또는 헤스페리딘에서 배당체를 제거하여 얻은 헤스페레틴은 모세혈관 강화, 투과성(Permeability) 감소, 혈압 강하, 혈중 콜레스테롤 강하, 항혈소판 응집(Antiplatelet aggregation), 항염증 및 항바이러스 작용을 한다고 알려져 있고(Meyer, O. C.,Angiology, 45, 579-584(1994); Struckmann J. R., et al.,Angiol., 45, 419-428(1994); Matsubara, Y., et al.,Japan Organic Synthesis Chem. Association Journal., 52, 318-327(1994. Mar.); Galati E. M., et al.,Farmaco., 51(3), 219-221(1996, Mar.); Monforte MT., et al.,Farmaco., 50(9), 595-599(1995, Sep.); JP 95-86929; JP 95-86930; Chung, M. I., et al.,Chin. Pharm. J.(Taipei)., 46, 429-437(1994, Nov.); Galati, E. M., et al.,Farmaco., 40(11), 709-712(1994, Nov.); and Emim J. A., et al.,J. Pharm. Pharmacol., 46(2),118-122(1994)), 각종 바이오플라보노이드는 항산화, 혈압강하, 항암 및 항바이러스 작용을 한다고 알려져 있으며(Saija, A., et al.,Free Radical Biol. Med., 19, 481-486(1995); Matsubara, Y., et al., 상기 문헌; Galati E. M., et al., 상기 문헌; Felicia V., et al.,Nutr. Cancer, 26, 167-181(1996); EP 0352147 A2(1990.1.24); and Kaul, T. N., et al.,J. Med. Virol., 15,71-79(1985)), 나린진 또는 나린진에서 배당체를 제거하여 얻은 나린제닌은 콜레스테롤 강하, 항암 및 항위궤양(알콜로부터 보호) 작용을 한다고 알려져 있다(Monforte MT., et al., 상기 문헌; JP 95-86929; JP 95-86930; Felicia V., et al., 상기 문헌; EP 0352147 A2(1990.1.24); and Martin M. J., et al.,Pharmacol., 49,144-150(1994)).

또한, 감귤의 과피와 씨 속에는 리모노이드계 물질이 존재하는데 이들이 항암활성을 갖고 있다는 사실도 밝혀져 있다(Lam, L. K. T., et al., Inhibition of chemically induced carcinogenesis by citrus limonoids. InFood Phytochemicals for Cancer Prevention, Vol. I,ACS Symposium series No. 546, Huang, M. T., O. Osawa, C. T. Ho, R. Rosen(ed). 1993).

이에 본 발명자들은 지질대사 개선 및 혈압강하에 효과가 있는 성분을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중, 감귤류의 과피 성분과 대추 추출물을 혼합한 조성물을 동물에게 투여할 경우, 지질대사 개선 및 혈압강하 등의 효과를 얻을 수 있다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 포함하는 지질대사 개선 및 혈압강하를 위한 의약품 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물이 1 : 1 내지 100 : 1의 중량비율로 혼합된, 지질대사 개선 및 혈압강하용 조성물이 제공된다.

본 발명에서는 또한 대추 추출물 및 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 또는 이들의 혼합물이 1 : 0.001 내지 1 : 0.1의 중량비율로 혼합된, 지질대사 개선 및 혈압강하용 조성물이 제공된다.

아울러, 본 발명에서는 활성성분으로서 유효량의 상기 조성물들을 각각 함유하는 지질대사 개선 및 혈압강하용 약학 및 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 대추로부터 활성 성분을 추출하는 방법은 다음과 같다. 즉, 대추를 물로 깨끗이 씻은 후, 대추 1 kg 당 2 내지 5 ℓ의 70 내지 95%의 에탄올 또는 물을 가하고, 에탄올의 경우에는 50℃-60℃에서 1 내지 24 시간, 물의 경우에는 70 내지 121℃에서 30분 내지 12 시간 가열하여 활성물질을 추출할 수 있다. 일반적으로, 물 또는 에탄올을 이용하여 대추를 추출할 경우, 반응 시간, 반응 온도, 알콜 농도, 대추의 성숙도 등에 따라 추출물의 조성이 변할 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용되는 대추는 상기 약학 및 식품 조성물의 냄새 및 맛을 더욱 좋게 하는 역할을 한다.

본 발명에서 감귤류란 하귤, 당유자, 오렌지, 레몬, 감귤, 자몽 또는 유자 등을 말한다. 본 발명에 사용한 감귤류 과피를 얻기 위해서는 우선, 농약 처리를 하지 않고 감귤류를 생산하거나 인체에 무해한 저공해 농약, 또는 생물학적 방제제를 이용하여 감귤류를 생산해야 한다.

본 발명에서는 감귤류 과피 추출물을 제조하기 위하여 다음과 같은 방법들을 사용한다. 즉, 감귤류의 과피를 건조한 후, 건조 과피 1 kg당 20 내지 95 % 에탄올 3 내지 30ℓ를 가하고, 25 내지 80℃에서 1 내지 12 시간 동안 추출한 후, 이 추출물을 여과한 다음, 여액을 진공농축함으로써 추출물을 얻을 수 있다.

다른 한편으로는, 감귤류의 과피를 건조한 후, 건조 과피 1 kg당 0.1 내지 2 % Ca(OH)₂또는 NaOH 5 내지 30ℓ를 가하고, 25 내지 60℃에서 1 내지 5 시간 동안 추출한 후, 이 추출물을 여과한 다음, 여액에 1N HCl 용액을 가하여 혼합액의 pH를 4.0 내지 7.0으로 조절하고, 냉장실에서 10 내지 48 시간 방치하여 생성된 침전물을 회수한 후 건조하는 방법에 의해 추출물을 제조할 수도 있다.

상기와 같이 얻은 대추 추출물; 및 감귤류 과피 추출물, 또는 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진 또는 나린제닌의 혼합물은 쥐의 혈중 콜레스테롤 및 혈압을 강하시킨다. 현재까지 연구된 독성시험 결과, 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물은 각각 1,000 mg/kg의 용량으로 쥐에게 경구투여하였을 때 독성이 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 또한, 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물은 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않는다.

본 발명의 방법에 따라 대추 및 감귤류 과피로부터 얻어진 추출물의 혼합물은 흰쥐에게 0.05 내지 5 g/kg의 양으로 투여할 때 지질 대사 개선 효과 및 혈압강하 작용을 나타낸다.

또한 본 발명의 방법에 따라 대추 및 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 또는 이들의 혼합물의 혼합물은 흰쥐에게 0.01 내지 1 g/kg의 양으로 투여할 때 지질 대사 개선 효과 및 혈압강하 작용을 나타낸다.

지질 대사 개선 및 혈압을 강하시키기 위하여, 본 발명의 조성물을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 지질대사 개선 및 혈압 강하용 약학 조성물을 제조할 수 있다. 감귤류 과피로부터 분리된 플라보노이드인 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진 또는 나린제닌을 감귤류 과피 추출물 대신에 사용할 경우에는 대추 추출물과 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 또는 이들의 혼합물을 혼합하여 사용할 수 있다. 이 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물, 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진 또는 나린제닌을 유효성분으로 함유하는 지질대사 개선 및 혈압 강하용 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 대추 추출물 0.1 g 내지 5g, 바람직하게는 0.5 내지 1 g 및 감귤류 과피 추출물 0.1 g 내지 10g, 바람직하게는 0.5 내지 2 g 또는 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진 나린제닌 또는 이들의 혼합물은 1 mg 내지 2000 mg, 바람직하게는 2 mg 내지 20 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물이 혼합된 본 발명의 조성물은 또한 지질 대사 개선 및 혈압을 강하시키기 위한 목적으로 식품에 1 내지 100 중량%로 첨가될 수 있다.

또한, 대추 추출물 및 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 또는 이들의 혼합물이 혼합된 본 발명의 조성물은 지질 대사 개선 및 혈압을 강하시키기 위한 목적으로 식품에 1 내지 100 중량%로 첨가될 수 있다. 건강보조식품용 개발을 위하여 본 발명의 상기 혼합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 육류, 음료수, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알콜음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들 만으로 한정되는 것은 아니다.

실 시 예 1: 대추 추출물의 제조

(1) 에탄올 추출

대추 5 kg에 15ℓ의 95% 에탄올을 가하고 50-60℃의 수욕에서 3시간씩 2회 추출하였다. 추출된 에탄올 용액을 여과하고 여액을 감압 농축하여 에탄올 추출물 2 kg을 얻었다.

(2) 물 추출

대추 5 kg에 15ℓ의 물을 가하고 100℃에서 2시간 동안 끓인 후 여과하여 고형분을 제거하고, 여액을 감압농축하여 3 kg의 대추 추출물을 얻었다.

실 시 예 2 : 대추 추출물의 투여가 쥐의 혈장 콜레스테롤 농도에 미치는 영향 및 혈중 총콜레스테롤의 변화

(단계 1) 대추 추출물의 투여가 쥐의 혈장 콜레스테롤 농도에 미치는 영향

3주령의 스프라그 다울리(Sprague-Dawley) 흰쥐 30마리를 충북 음성군의 대한실험 동물센터로부터 구입하여 1주간 제일제당 실험동물 사료로 사육하고, 4주령(체중: 90∼110g)이 되었을 때, 난괴법(randomized block design)에 의해 3 개의 그룹으로 나누었다. 세 그룹의 쥐들에게 각각 세가지의 서로 다른 고콜레스테롤 식이, 즉, 정상식이(AIN-76 실험동물 식이)에 1% 콜레스테롤(대조군); 1% 콜레스테롤 및 1.2% 대추 에탄올 추출물(대추 에탄올 추출물 군); 그리고 1% 콜레스테롤 및 1.5% 대추 물 추출물(대추 물 추출물 군)이 각각 함유된 식이를 섭취시켰다. 세 그룹에게 섭취시킨 식이의 조성은 하기 표 1에 나타나 있다.

모든 식이들은 고콜레스테롤식이(1%, wt/wt)에 해당하고, 실험군 식이는 1.2 또는 1.5% 대추 추출물이 포함되었다. 흰쥐의 실험실 식이인 AIN-76 식이 조성 중 셀룰로즈, 미네랄 혼합물 및 비타민 혼합물 성분은 미국의 테크라드 프리미어사(TEKLAD premier, Madison, Wisconsin)로부터 구입하였다.

모든 식이군의 쥐들에게 6주동안 해당 식이를 물과 함께 자유로이 섭취하도록 하였으며, 식이섭취량을 매일 기록하고 7일마다 체중을 측정하였다. 동물사육이 종료된 후 사육일지의 자료를 분석한 결과, 식이 섭취량과 체중증가에 있어서는 3개군간 유의적인 차이가 없었으며 정상적인 성장을 보였다.

(단계 2) 실험동물의 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성 지질 함량 측정

대추 추출물의 투여가 흰쥐의 혈중 콜레스테롤 및 중성지질 함량에 미치는 영향을 다음과 같이 조사하였다.

세 식이군의 쥐들로부터 혈액 시료를 채취하고, 이로부터 덱스트란-설페이트를 포함한 HDL-콜레스테롤 시약(Sigma Chemical Co. Cat. No. 352-3)을 이용하여 혈장 HDL 분획을 분리하였다. 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤 농도는 시그마사의 총 콜레스테롤 키트(Cat. No. 352-100)를 사용한 효소발색법(Allain et al.,Clin. Chem., 20, 470-475(1974))에 의해 측정하였다. 중성 지질 농도는 시그마 진단 키트(Cat. No. 339-50)를 사용하여 측정하였다(Bucolo, G. and David, H.,Clin. Chem., 19, 476-482(1973)). 그 결과는 하기 표 2에 나타나 있는데, 혈장 총 콜레스테롤 농도는 1.2% 대추 에탄올 추출물 투여군에서 대조군에 비해 28% 감소하였고, 1.5% 대추 물 추출물 투여군에서는 대조군에 비해 30% 감소하였다.

실 시 예 3 : 대추 추출물의 혈압조절 효과 확인

(단계 1) 대추로부터 혈압조절물질 추출

대추 4 kg을 4ℓ의 물에 넣어 불린 후, 6ℓ의 아세톤을 넣어 18시간 교반하였다. 여과지로 여과하여 고형분을 제거하고 액상을 감압농축한 다음 여기에 4ℓ의 헥산을 넣어서 물층과 헥산층을 분리하였다. 같은 방법으로 두 번 더 헥산층을 분리하여 헥산층에 포함된 지방산 계열물질을 제거하였다. 수거된 물층에 동량의 에틸 아세테이트를 첨가하여 물층과 에틸 아세테이트층으로 분리하고, 에틸 아세테이트층을 모은 후 감압하에 농축 건조하여 황갈색물질 7.3g을 얻었다. 이렇게 얻은 대추 추출물을 혈압조절실험에 사용하였다.

(단계 2) 대추 추출물의 혈압조절 효과 확인

선천성고혈압쥐(SHR)를 일본 찰스리버(Charles River)사로부터 구입하였고, 웅성 스프라그 다울리(Sprague-Dawley) 흰쥐는 한국화학연구소 안전성센타에서 특정병원체부재(SPF) 상태로 사육한 4주령을 분양받아 일정한 온도(22℃)와 습도(55±5%)를 유지한 일반 사육실(12시간 명, 12시간 암 주기)에서 사료와 물을 자유롭게 섭취토록하여 사육한 후 각각 12주령 및 체중 350-450g 되었을 때 실험에 사용하였다.

스프라그 다울리 흰쥐의 우측 대퇴부 피하에 100 mg 데옥시코르티코스테론 아세테이트 펠렛(deoxycorticosterone acetate pellet, Innovative Research of America, USA)을 이식시킨 후 오토클립(autoclip)으로 봉합하였다. 흰쥐에게 4주간 1% NaCl을 경구투여하여 DOCA/식염 고혈압쥐를 확립 한 후, 평균동맥압이 170 mmHg이상으로 상승된 흰쥐를 혈압강하 작용 평가에 사용하였다.

스프라그 다울리 흰쥐(350-450g)를 에테르로 마취시키고 좌복부를 세로로 1 cm 가량 절개한 다음 복부 대동맥 가까이의 신동맥을 조심스럽게 분리하여 봉합사(4/0 sterile surgical silk, Ethicon)로 신동맥을 완전히 결찰하고 바늘이 달린 봉합사로 근육층 및 피부를 봉합하였다. 결찰 6-8일 후 수축기 혈압이 180mmHg 이상인 동물을 신성 고혈압쥐(renal hypertensive rat, RHR) 모델로 실험에 사용하였다.

상기와 같이 준비된 DOCA/식염 고혈압쥐, SHR 및 RHR 흰쥐들에게 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride)를 125 mg/kg의 양으로 복강내 투여하여 마취시킨 다음 폴리에틸렌 튜빙(polyethylene tubing) 50(PE50)을 PE10에 연결한 카테터(catheter)에 헤파린화된 식염수 용액을 채워서 대퇴 동맥에 캐뉼라를 삽입하였다. 카테터의 다른쪽 끝은 피하를 따라 목뒤로 뽑아낸 후 고정하였다.

흰쥐를 혈압측정용 우리에서 안정시킨 후 다음날 마취에서 깨어난 동물의 대퇴 동맥에 캐뉼라를 삽입하여 목 뒤에 고정한 카테터를 이소텍 압력 변환기(Isotec pressure transducer, Hugosachs, Germany)에 연결하여 신호 처리기(Modular signal processing center, Modular, USA)를 이용하여 혈압 및 심박동수를 측정하였다. 약 1시간 동안 혈압이 안정된 것을 확인한 후 단계 1에서 제조된 대추 추출물을 용량별로 경구 투여한 후 일정시간 간격으로 투여후 24시간까지 혈압 및 심박동수를 측정하여 그 결과를 약물 투여 전의 혈압 및 심박동수에 대한 변화율로 나타내었다.

그 결과는 표 3, 4 및 5에 나타낸 바와 같고, 대추 추출물은 0.3-1.0g/kg 의 양으로 흰쥐에게 투여시 24시간 동안 지속적인 혈압강하작용을 보였다.

DOCA 흰쥐에서 혈압 및 심박동수에 대한 대추 추출물의 영향

평균 혈압(%)
시간	대조군	0.3 g/kg 대추 추출물	1 g/kg 대추 추출물
0	0.00	0.00	0.00
10 분	0.30	7.70	2.50
20 분	-0.20	3.80	-4.70
30 분	0.20	-0.20	-9.50
60 분	-3.10	-11.50	-21.20
90 분	-1.30	-11.50	-22.90
2 시간	-6.00	-10.20	-25.10
4 시간	-6.60	-18.60	-29.90
6 시간	-7.20	-13.30	-30.20
22 시간	-3.20	-25.30	-14.30
24 시간	-6.40	-24.40	-18.30
기준선(mmHg)	144.00	158.00	173.00

평균 심박동수(%)
시간	대조군	0.3 g/kg 대추 추출물	1 g/kg 대추 추출물
0	0.00	0.00	0.00
10 분	0.00	-0.20	4.50
20 분	2.00	2.80	4.60
30 분	2.80	-1.10	4.60
60 분	-1.50	-8.90	-3.20
90 분	-2.80	-10.60	-8.20
2 시간	-4.70	-12.50	-3.60
4 시간	-1.80	-16.70	-10.10
6 시간	-5.00	-12.50	-13.80
22 시간	-11.90	-24.20	-3.60
24 시간	-12.00	-19.40	-2.70
기준선(mmHg)	184.00	298.00	290.00

SHR에서 혈압 및 심박동수에 대한 대추 추출물의 영향

평균 혈압(%)
시간	대조군	1g/kg 대추 추출물
0	0.00	0.00
10 분	-0.20	3.00
20 분	-1.90	-5.00
30 분	-3.20	-8.80
60 분	-2.30	-11.40
90 분	-3.00	-8.30
2 시간	-1.00	-7.60
4 시간	-0.60	-12.20
6 시간	-0.90	-13.70
22 시간		-7.30
24 시간	-0.10	-15.90
기준선(mmHg)	150.00	139.00

평균 심박동수(%)
시간	대조군	1 g/kg 대추 추출물
0	0.00	0.00
10 분	8.40	-0.80
20 분	7.10	-4.70
30 분	2.50	-7.20
60 분	-0.50	-11.30
90 분	1.70	-10.40
2 시간	-0.80	-6.40
4 시간	-5.00	-10.30
6 시간	-7.50	-12.70
22 시간		-11.10
24 시간	-10.10	-10.30
기준선(mmHg)	366.00	310.00

RHR에서 혈압 및 심박동수에 대한 대추 추출물의 영향

평균 혈압(%)
시간	대조군	1 g/kg 대추 추출물	3 g/kg 대추 추출물
0	0.00	0.00	0.00
10 분	-2.20	-2.20	-6.20
20 분	-0.60	-2.80	-6.30
30 분	-0.30	-2.10	-4.10
60 분	-1.20	-0.80	0.00
90 분	1.80	-3.00	-1.30
2 시간	3.00	-5.40	0.00
4 시간	-3.10	-6.20	-3.60
6 시간	-4.30	-8.60	0.10
22 시간	-1.50	-16.60	-11.90
24 시간	-0.20	-17.50	-10.40
기준선(mmHg)	182.00	163.00	171.00

평균 심박동수(%)
시간	대조군	1 g/kg 대추 추출물	3 g/kg 대추 추출물
0	0.00	0.00	0.00
10 분	5.90	4.30	10.00
20 분	6.50	2.80	2.50
30 분	2.00	2.30	-1.60
60 분	-0.10	0.60	1.40
90 분	0.10	5.20	8.60
2 시간	5.80	2.80	5.20
4 시간	5.10	3.20	0.00
6 시간	-2.20	-0.80	4.30
22 시간	0.80	3.40	4.60
24 시간	-5.80	-0.50	2.90
기준선(mmHg)	393.00	363.00	354.00

실 시 예 4 : 감귤류 과피 추출물로부터 바이오플라보노이드의 추출 및 정량, 및 감귤류 과피 추출물 제조

(단계 1) 바이오플라보노이드의 추출 및 정량

한국 제주도에서 생산된 하귤, 당유자, 감귤(tangerine), 전남에서 생산된 유자 및 수입품인 오렌지, 자몽 및 레몬의 껍질을 실온에서 건조한 후 입경 100㎛-200㎛의 크기로 분말화하였다. 이 분말을 500 ㎎씩 정밀하게 달아 메탄올 50 ㎖ 씩을 가하여 50℃에서 6시간 동안 수욕 추출한 다음 냉각 후 여과하고 다시 메탄올을 가하여 50㎖로 만든 용액을 검액으로 하였다. 필요한 경우에는 검량선의 작성에 사용한 범위내의 농도가 되도록 희석하여 사용하였다.

상기와 같이 얻어진 과피 추출물의 성분을 조사하기 위하여 다음과 같은 조건으로 HPLC 분석을 실시하였다. 상기 검액 5.0 μl를 37% 메탄올로 미리 평형화된 리크로소브(Lichrosorb) RP-8 컬럼(5 μm, 4 x 250 mm)이 장착된 HPLC에 주입하였다. 이 때 칼럼의 온도는 30℃로 조절하고, 37% 메탄올을 이동상으로 사용하여 1.0 ml/분의 유속으로 용출시켰다. 따로, 헤스페리딘과 나린진(Sigma Co.) 표준품을 메탄올에 용해시켜 최종 농도가 각각 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mg/ml 가 되도록 표준용액을 조제하여 동일한 조건에서 HPLC를 실시하였다. 용출물을 UV-VIS 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 280 nm에서 검출하고, 검량선과 과피추출물의 HPLC 프로필(profile)의 면적을 비교 분석하여 함량을 계산한 결과, 과피추출 농축액중 헤스페리딘 및 나린진의 함량은 다음과 같았다.

각종 감귤류 과피중 헤스페리딘 및 나린진의 함량(%)

감귤류 종류	헤스페리딘	나린진
하 귤당 유 자오렌지(orange)레몬(lemon)감귤(tangerine)자몽(grape fruit)유 자	-0.402.101.402.10-0.80	3.403.90미량미량미량4.700.80

(단계 2) 감귤 과피 추출물의 제조

(1) 에탄올을 이용한 방법

제주도산 감귤 껍질을 건조한 후 건조 감귤류 과피 500 g에 30% 에탄올 용액 5ℓ를 가하고 60℃에서 5시간 동안 추출하였다. 이 추출물을 면직물(cotton cloth)을 이용하여 여과한 다음 여액을 진공농축하여 190 g의 시럽상의 추출물을 얻었다. 상기 단계 1에서와 같은 방법으로 추출물중 헤스페리딘의 함량을 측정한 결과, 이 추출물 190 g 속에는 헤스페리딘 5.1 g이 들어 있었다. HPLC를 이용하여 추출물의 성분을 분석한 결과, 수분 65%, 당분 28%(과당 11%, 포도당 11%, 슈크로즈 6%), 헤스페리딘 2.7% 및 기타 회분 등의 미량성분으로 구성되어 있었다.

(2) Ca(OH)₂를 이용한 방법

제주도산 감귤 껍질을 건조한 후, 건조된 감귤류 과피 500 g에 0.5% Ca(OH)₂용액 5ℓ를 가하고 상온에서 저어주면서 1시간 동안 추출하였다. 이 추출물을 면직물로 여과한 후 여액에 1N HCl 용액을 가하여 혼합액의 pH가 4.0∼4.5, 또는 6.80∼7.0이 되게 한 후 5℃ 냉장실에서 24시간 방치하였다. 이때 생성된 침전물을 회수한 후 건조하여 각각 5 g 및 10 g의 건조된 분말을 얻었다. 침전된 분말을 단계 1에서와 같이 HPLC로 정량분석한 결과 헤스페리딘이 각각 3.2 g 및 6.55 g 포함되어 있어, 헤스페리딘의 순도는 각각 64% 및 65%였다.

(3) NaOH를 이용한 방법

제주도산 감귤 껍질을 건조한 후, 건조된 감귤류 과피 500 g에 0.5% NaOH 5ℓ를 가하고 상온에서 저으면서 1시간 동안 추출한 다음 면직물로 여과하였다. 여액에 1 N HCl 용액을 첨가하여 혼합액의 pH가 4.0∼4.5 또는 6.8∼7.0이 되게 한 후 5℃ 냉장실에서 24시간 방치하였다. 이때 생성된 침전물을 회수한 후 건조하여 각각 44 g 및 49 g의 건조분말을 얻었다. 건조 분말로부터 HPLC에 의해 각각 13.6 g, 9.8 g의 헤스페리딘을 회수하였다(순도: 각각 31%, 20%)

실 시 예 5 : 실험동물의 식이 조성과 알콜에 의한 감귤 과피 추출물의 동물 투여 실험

2 주령의 스프라그 다울리(Sprague-Dawley) 흰쥐 20마리를 충북 음성군의 대한실험 동물센터로부터 구입하여 1주간 제일제당 실험동물 사료로 사육하고, 4주령(체중: 90∼110g)이 되었을 때, 난괴법(randomized block design)에 의해 두 개의 그룹으로 나누었다. 두 그룹의 쥐들에게 각각 세가지의 서로 다른 고콜레스테롤 식이, 즉, 정상식이(AIN-76 실험동물 식이)에 1% 콜레스테롤(대조군); 1% 콜레스테롤과 0.1% 헤스페리딘에 상응하는 실시예 4의 단게 2(1)에서 제조된 감귤 과피 추출물이 각각 함유된 식이를 섭취시켰다. 두 그룹에게 섭취시킨 식이의 조성은 하기 표 7에 나타나 있다.

* 0.1% 헤스페리딘 상당량

모든 식이들은 고콜레스테롤식이(1%, wt/wt)에 해당하고, 헤스페리딘 및 나린진은 미국의 시그마사(Sigma Chemical company, St. Louis, Mo)로부터 구입하였으며, 실험용 흰쥐의 실험실 식이인 AIN-76 식이 조성 중 셀룰로즈, 미네랄 혼합물 및 비타민 혼합물 성분은 미국의 테크라드 프리미어사(TEKLAD premier, Madison, Wisconsin)로부터 구입하였다.

모든 식이군의 쥐들에게 6주동안 해당 식이를 물과 함께 자유로이 섭취하도록 하였으며, 식이섭취량을 매일 기록하고 7일마다 체중을 측정하였다. 동물사육이 종료된 후 사육일지의 자료를 분석한 결과, 식이 섭취량과 체중증가에 있어서는 두개군간 유의적인 차이가 없었으며 정상적인 성장을 보였다.

실 시 예 6 : 실험동물의 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성 지질 함량측정

감귤류 과피 추출물의 투여가 흰쥐의 혈중 콜레스테롤 및 중성지질 함량에 미치는 영향을 다음과 같이 조사하였다.

두 식이군의 쥐들로부터 혈액 시료를 채취하고, 이로부터 덱스트란-설페이트를 포함한 HDL-콜레스테롤 시약(Sigma Chemical Co. Cat. No. 352-3)을 이용하여 혈장 HDL 분획을 분리하였다. 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤 농도는 시그마사의 총 콜레스테롤 키트(Cat. No. 352-100)를 사용한 효소발색법(Allain et al.,Clin. Chem., 20, 470-475(1974))에 의해 측정하였다. 중성 지질 농도는 시그마 진단 키트(Cat. No. 339-50)를 사용하여 측정하였다(Bucolo, G. and David, H.,Clin. Chem., 19, 476-482(1973)). 그 결과는 하기 표 8에 나타나 있는데, 혈장 총 콜레스테롤 농도는 감귤 과피 추출물 투여군에서 대조군에 비해 35% 감소하였다.

실 시 예 7 : 대추 및 감귤 과피 추출물의 경구독성실험

7-8 주령의 특정 병원체 부재(specific pathogens free) ICR 마우스로서 체중 25-29 g의 암컷 12 마리와 체중 34-38 g의 숫컷 12 마리를 온도 22±1℃, 습도 55±5%, 조명 12L/12D의 동물실내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료((주)제일제당, 마우스 및 랫드용) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유섭취시켰다.

실시예 1의 (1)에서 얻은 대추 추출물과 실시예 4의 단계 2(1)에서 얻은 감귤 과피 추출물을 0.5% 트윈 80을 용매로 하여 각각 100 mg/ml 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20g 당 각 0.2 ml씩 경구투여하였다. 시료는 1회 경구 투여하였으며 투여 후 10일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에 그리고 투여 익일부터 10일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 10일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 대추 및 감귤 추출물에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.

본 실험은 대추 및 감귤류 과피 추출물에 대하여 경구경로에서의 급성독성의 정도를 파악함으로써 일반약리 및 약효시험에서의 가용 약용량에 대한 정보를 제공하고 독성에 대한 기초 자료를 도출함을 목적으로 실시하여 아래와 같은 결과를 얻었다.

급성 경구독성의 경우는 감귤류 과피 추출물 1,000 mg/kg의 용량에서 10일동안 치사동물이 관찰되지 않았다. 10일 후 생존동물에 대한 부검을 실시한 바, 특별한 병변 육안 소견이 없었으며, 투여 익일부터 10일간 어떠한 체중의 감소 없이 정상적인 체중의 증가가 관찰되었다.

결론적으로 대추 및 감귤류 과피 추출물은 상기의 농도로 경구투여시 독성이 관찰되지 않았다.

실 시 예 8 : 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 함유하는 약학 조성물 제조

상기 실시예들에서 제조된 대추 추출물 및 감귤 과피 추출물, 또는 나린진, 나린제닌, 헤스페리딘, 헤스페레틴 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 지질대사 개선 및 혈압 강하용 약학 조성물 제조하였다.

(1) 대추 추출물 500 mg

감귤 과피 추출물 500 mg

담체 또는 부형제(전분, 락토스, 펙틴 등) 500 mg

총 1,500 mg

(2) 대추 추출물 500 mg

감귤 과피 추출물 100 mg

담체 또는 부형제(전분, 락토스, 펙틴 등) 900 mg

총 1,500 mg

(3) 대추 추출물 200 mg

나린진 또는 나린제닌 100 mg

담체 또는 부형제(전분, 락토스, 펙틴 등) 200 mg

총 500 mg

(4) 대추 추출물 200 mg

헤스페리딘 또는 헤스페레틴 100 mg

담체 또는 부형제(전분, 락토스, 펙틴 등) 200 mg

총 500 mg

(5) 대추 추출물 200 mg

나린진 50 mg

헤스페리딘 50 mg

담체 또는 부형제(전분, 락토스, 펙틴 등) 200 mg

총 500 mg

실 시 예 9 : 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 이용한 식품 조성물 제조

(1) 햄버거 제조시 사용되는 그라운드 비프(ground beef) 300g에 대추 추출물 50g 및 감귤 과피 추출물 10g을 첨가하여 제조하였다.

(2) 햄버거 제조시 사용되는 그라운드 비프 300g에 대추 추출물 50g 및 감귤 과피 추출물 5g을 첨가하여 제조하였다.

(3) 햄버거 제조시 사용되는 그라운드 비프 300g에 대추 추출물 50g 및 나린진 또는 나린제닌 300 mg을 첨가하여 제조하였다.

(4) 햄버거 제조시 사용되는 그라운드 비프 300g에 대추

추출물 50g 및 헤스페리딘 또는 헤스페레틴 300 mg을 첨가하여 제조하였다.

5) 햄버거 제조시 사용되는 그라운드 비프 300g에 대추 추출물 50g, 나린진 150 mg 및 헤스페리딘 150 mg을 첨가하여 제조하였다.

대추 추출물 및 나린진 및 헤스페리딘을 함유하는 감귤류 과피 추출물, 또는 을 포함하는 본 발명의 조성물은, 동물에 투여되었을 때 간 질환, 고혈압증, 동맥경화증, 고지혈증 등의 성인병 및 암 예방 등의 효과를 나타낼 수 있다.

Claims

유효량의 활성 성분으로서 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물이 1:1 내지 100:1의 중량비율로 혼합된 혼합물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 지질대사 개선 및 혈압강하용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 대추 추출물이 대추 1 kg 당 2 내지 5 ℓ의 70 내지 95%의 에탄올을 가하고, 50℃-60℃에서 1 내지 24 시간 추출하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 대추 추출물이 대추 1 kg 당 2 내지 5 ℓ의 물을 가하고, 70 내지 121℃에서 30분 내지 12 시간 추출하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 감귤류가 하귤, 당유자, 오렌지, 레몬, 감귤, 자몽 또는 유자인 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 감귤류 과피 추출물이 감귤류의 과피를 건조한 후, 건조 과피 1 kg당 20 내지 95 % 에탄올 3 내지 30ℓ를 가하고, 25 내지 80℃에서 1 내지 12 시간 동안 추출한 후, 이 추출물을 여과한 다음, 여액을 진공농축하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물의 유효량이 각각 0.1 g 내지 5g/kg 체중/일 및 0.1 g 내지 10g/kg 체중/일에 해당하는 조성물.
유효량의 활성 성분으로서 대추 추출물, 및 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 또는 이들의 혼합물이 1 : 0.001 내지 1 : 0.1의 중량비율로 혼합된 혼합물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 지질대사 개선 및 혈압강하용 약학 조성물.
제 7 항에 있어서,

상기 대추 추출물이 대추 1 kg 당 2 내지 5 ℓ의 70 내지 95%의 에탄올을 가하고, 50℃-60℃에서 1 내지 24 시간 추출하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서,

상기 대추 추출물이 대추 1 kg 당 2 내지 5 ℓ의 물을 가하고, 70 내지 121℃에서 30분 내지 12 시간 추출하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서,

상기 대추 추출물 및 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 또는 이들의 혼합물의 유효량이 각각 0.1 g 내지 5g/kg 체중/일 및 1 mg 내지 2000 mg/kg 체중/일에 해당하는 조성물.
대추 추출물 및 감귤류 과피 추출물을 1:1 내지 100:1의 중량비율로 포함하는 지질대사 개선 및 혈압강하용 식품 조성물.
대추 추출물 및 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 또는 이들의 혼합물을 1:0.001 내지 1:0.1의 중량비율로 포함하는 지질대사 개선 및 혈압강하용 식품 조성물.