KR19990022644A - 항-Ｆｃ 수용체 항체로 구성된 치료화합물 - Google Patents

Abstract

Fc 수용체 (FcR)에 특이적인 다중 특이적 다가 분자, 이들의 치료학적 용도, 및 이들 분자를 제조하는 방법이 기술되어 있다.

Description

항-Ｆｃ 수용체 항체로 구성된 치료화합물

면역글로불린 (Igs)는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성되며, 이들 각각은 NH₂말단의 항원 결합 가변영역 및 항체의 이펙터 기능을 담당하는 COOH 말단의 불변영역을 포함한다. 면역글로불린 중쇄의 COOH 말단 영역은 Fc 영역을 형성하고 Fc수용체 (FcRs)로 알려진 특정 수용체와 상호작용하여 세포의 활성을 촉발케 하는 것과 관련이 있다. 전체 Ig 클래스 또는 이소타입의 Fc 수용체들이 확인되었다(예를 들어, IgG(FcγR), IgE(FcεR), IgA (FcαR), IgM (FcμR) 및 IgD (FcδR). 상이한 이소타입의 항체들의 상이한 생물학적 활성은 상이한 면역(이펙터) 세포에서 발현되는 상이한 FcR에 결합하는 항체들의 능력에 부분적으로 기초로 두고 있다 (Fridman, W.H. (1991년 9월) The FASEB Journal Vol. 5. 2684-2690). FcRs에 대한 쥐과동물의 항체가 제조되었다(미국특허 제 4,954,617 호 Monoclonal Antibodies To Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes 및 국제특허출원 공개번호 제 WO91/05871 호 Monoclonal Antibody Specific For IgA receptor 참조).

쥐과동물의 단일클론성 항체는 인간치료에 유용하고, 간염바이러스 또는 인간의 면역결핍바이러스와 같은 인간병원체에 의한 오염없이 생산될 수 있다. 그러나, 일부 인간치료에서 쥐과동물의 단일클론성 항체의 사용은 외래의 쥐과동물 단백질에 대한 면역반응을 유발시켰다. 이러한 반응은 인간의 항-마우스 항체 또는 HAMA 반응이라고 명명되었는데, (Schroff, R. 등 (1985), Cancer Res. 45, 879-885), 이는 인간의 혈청약화를 유발하는 질환으로서 개체의 순환계로부터 쥐과동물의 항체의 신속한 제거를 유발하게 된다. 인간에서의 이러한 면역반응은 쥐과동물의 가변영역 및 불변영역에 대해 모든 일어나는 것으로 입증되었다.

재조합 DNA 기술은 예를 들어 하나의 종의 특정 면역글로불린 영역을 다른 종의 면역글로불린 영역으로 대체하여 항체를 변경시키는데 사용될 수 있다. Neuberger 등은 하나의 종의 Ig 분자의 상보적인 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 다른 종의 Ig 분자의 상보적인 중쇄 및 경쇄의 불변영역과 조합하는 방법을 기술하였다 (PCT 출원번호 제 GB85/00392 참조). 이러한 방법은 인간치료에 유용할 수 있는 키메라항체를 생산하기 위해 쥐과동물의 불변영역 도메인을 치환하는데 사용될 수 있다. 상기 Neuberger 등에 의해 기재된 바대로 제조된 키메라 항체는 항체매개의 이펙터 기능, 예를 들어, 보체 고정의 효과적인 자극을 위해 인간의 Fc 영역을 갖지만, 쥐과동물 (외래의) 가변영역에 대한 인간의 면역반응을 유발할 수 있는 가능성을 여전히 갖고 있다.

Winter는 상보성 결정영역 (CDRs)을 다른 종의 CDRs로 치환하여 항체를 변경하는 방법을 기술하였다 (영국특허출원 GB2188538A 참조). 이러한 방법은 소망하는 결합특성 (예를 들어 인간의 병원체에 대한 결합특성)을 지닌 쥐과동물의 단일클론성 항체의 가변영역 도메인으로부터의 CDRs을 인간의 중쇄 및 경쇄 Ig 가변영역 도메인으로 치환하는데 사용될 수 있다. 이러한 변형된 Ig 가변영역은 인간의 Ig 불변영역과 조합되어 치환된 쥐과동물의 CDRs를 제외하고는 조성에서 전적으로 인간의 것인 항체를 제조할 수 있다. 상기 Winter에 의해 기술된 새로운 형태 또는 인간화 항체는 키메라 항체에 비해 상당히 감소된 면역반응을 인간에서 유발시키는데, 이는 상당히 감소된 쥐과동물의 성분 때문이다. 또한, 상기 변형된 항체의 순환계에서의 반감기는 인간의 자연항체에 근접해야 한다. 그러나, Winter에 의해 언급된 바대로 CDRs을 바이러스 또는 세균 단백질과 같은 항원에 특이적인 다른 항체의 상보적인 CDRs로 대체하는 것만으로는 원하는 결합능력을 보유한 변형된 항체를 항상 얻을 수 있는 것이 아니다. 실제, 항체 가변영역의 프레임워크의 일부 아미노산들은 CDRs을 구성하는 아미노산 잔기들과 상호작용하여, 아마도 인간 Ig 가변영역으로의 아미노산 치환이 항원결합을 회복하는데 요구되는 것으로 보인다.

항-Fc 수용체 부분 및 항-표적 부분을 포함하는 양쪽 특이적인 분자 (예를 들어 헤테로항체)는 제형화되어 암(유방암 또는 난소암)치료 또는 병원체 감염 (예를 들어, HIV)의 치료를 위해 치료학적으로 사용되었다 (국제특허출원 공개번호 WO91/05871 Bispecific Heteroantibodies With Dual Effector Functions 및 국제특허출원 공개번호 WO91/00360 Bispecific Reagents for AIDS Therapy 참조). 또한, 항원과 항원제공세포를 인지하는 양쪽 특이적 분자는 면역반응을 자극하기 위해 환자에게 투여될 수 있다 (국제특허출원 공개번호 WO92/05793 Targeted Immunostimulation With Bispecific Reagents 참조).

도 1은 인간화된 FcγRⅠ 항체, H22의 한지영역 부분의 누클레오티드 및 아미노산 잔기 서열을 나타내는 도면이다. [A]는 양말단이 절단된 단일의 술프히드릴기 변형물 [B]를 제조하기 위해 변형되고, 이후, 조작되어 2개의 특이적인 클로닝 부위를 갖는 [C]로 추가로 변형된다. 밑줄친 누클레오티드는 앞선 서열로부터 변경된 것을 나타낸다. 윗줄로 표시된 누클레오티드는 지시된 제한 부위를 위한 인지서열이다.

도 2는 중쇄-EGF 융합 발현구조물 pJG055를 개략적으로 나타내는 도면이다.

도 3은 항-Fc 수용체-리간드 양쪽 특이성 분자의 생산을 나타내는 개략적인 도면이다.

도 4는 인간화된 Fcγ 수용체-표피생장인자의 융합단백질의 활성 시험을 위해 사용되는 유동 세포계수 분석법을 나타내는 개략적인 도면이다.

도 5는 다양한 농도의 표피생장인자 (EGF) 융합단백질 (H22-EGF 융합)과 완전히 인간화된 양쪽 특이적인 (BsAb) H447의 EGF 수용체 (EGFR)를 발현시키는 1483 세포에 대한 결합을 나타내는 평균 형광세기 (MFI)를 플롯팅한 그래프이다.

도 6은 EGFR에 결합하는 쥐과동물의 항체 M425의 존재 및 부재하에서 다양한 농도의 EGF 융합단백질 또는 BsAb H447의 A431 세포에 대한 결합을 플롯팅한 그래프이다.

도 7은 다양한 농도의 EGF 융합단백질, BsAb H447 또는 H425 항체의 A431 세포에 대한 결합으로부터 결과되는, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)를 플롯팅한 그래프이다.

도 8은 25% 인간 혈청 (HS) 또는 Fcγ수용체 항체 m22의 fab단편을 함유하는 배지 또는 단독배지의 존재하에서 EGF 융합단백질, BsAb H447 또는 H425 항체의 결합으로부터 결과되는, ADCC를 플롯팅한 막대그래프이다.

도 9는 다양한 양의 EGF, H22-EGF, H22의 Fab단편 (H22 Fab) 또는 H425의 F(ab')₂단편 (H425 F(ab')₂)의 존재하에서 배양된 살아있는 A431 세포의 수를 나타내는 개략적인 도면이다.

도 10은 H22Fd-HRG 융합단백질의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.

도 11은 인터페론-γ로 처리된 단핵세포 및 H-22 헤레굴린 융합단백질을 발현시키는 골수종 세포로부터의 1:3 또는 1:30로 희석된 상청액과 인큐베이션한 결과 나타난 PC-3 또는 SKBr-3 종양세포 사멸의 비율을 백분율로 나타낸 히스토그램이다.

도 12는 단핵세포 및 다양한 농도의 H22-봄베신 융합단백질 존재하에서 PC-3 종양세포 용균의 백분율을 나나내는 도면이다.

도 13은 o-PDM 또는 DTNB 법에 의해 생성된 BsAb447의 활성을 시험하기 위한 유동 세포계수 검정법을 개략적으로 나타내는 도면이다.

도 14는 다양한 농도의 o-PDM 및 DTNB 유래의 BsAb447의 EGFR 및 FcγRⅠ을 발현시키는 A431 세포에 대한 MFI를 플롯팅한 그래프이다.

도 15는 o-PDM 및 DTNB 유래의 BsAb447의 A431 세포에 대한 결합으로부터 결과된, 항체 의존성 세포독성을 플롯팅한 그래프이다.

도 16은 삼중 특이적인 항체의 구성을 묘사하는 흐름도이다.

도 17은 양쪽 특이적인 이가 항체의 양쪽 특이적인 3가 항체로의 변형을 묘사하는 도면으로서, 양쪽 특이적인 이가 컨쥬게이트는 감소되어 있고, 이는 o-PDM으로 처리된 520C9 Fab'와 혼합되어 TsAb로 된다

도 18은 HER2/neu(패널A) 및 EGFR(패널B)에 대한 이작용기성 형광활성된 세포 소팅분석을 묘사하는 도면이다.

도 19는 다양한 농도의 BsAb 또는 TsAb 항체의 표적세포에 대한 결합을 플롯팅한 도면이다. 평균 형광세기(MFI)는 항체 결합이 증가함에 따라 증가한다. 이는 TsAb가 SKBr-3 세포의 HER2/neu 및 가용성 FcγRⅠ와 투여량 의존성 방식으로 동시에 결합함을 나타낸다.

도 20은 TsAb가 A431 세포의 EGFR 및 가용성 FcγRⅠ와 투여량 의존성 방식으로 동시에 결합함을 나타낸다. 이 분석법은 도 19에서 사용된 것과 유사하다.

도 21은 TsAb, M22×H425×520C9 및 BsAb, M22×520C9는 SKBR-3 세포의 ADCC를 유도할 수 있지만, BsAb, M22×H425는 유도할 수 없음을 나타내는 그래프이다. 다양한 농도의 항체들이 SKBR-3 세포 및 미리 활성화된 PMNs와 인큐베이션되었다.

도 22는 TsAb, M22×H425×520C9 및 BsAb, M22×H425는 A431 세포의 ADCC를 유도할 수 있지만, BsAb, M22×520C9는 유도할 수 없음을 나타내는 그래프이다. 분석 방법은 도 21과 유사한 방식으로 수행되었다.

도 23은 전혈 조절 분석법 (패널A) 및 분석결과 (패널B)에 대한 흐름도이다. 3가의 항체는 단핵세포의 표면으로부터 FcγRⅠ를 신속하게 조절한다.

도 24의 패널A는 야생형 (TT830) 및 돌연변이형 (TT833) 파상풍 독소펩티드를 코드하는 올리고누클레오티드의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 패널B는 H22Fd-TT 융합단백질의 다이어그램이다.

도 25의 패널 A, B, C 각각은 MDXH210, Fab22-TT830 및 H22-TT833S의 FcγRⅠ 양성 세포 U937에 대한 결합을 나타내는 유동 세포계수 분석결과를 나타내는 도면이다. 쇄선은 음성 대조군을 나타내고 실선은 융합단백질에 의한 염색을 나타내며, 점선은 쥐과동물의 mAb22 F(ab')₂에 의해 차폐된 융합단백질의 결합을 나타낸다.

도 26은 다양한 양의 융합단백질 MDXH210, FAb22-TT830 및 Fab22-TT833S의 FcγRⅠ 양성 세포 U937에 대한 인큐베이션의 결과인 평균 형광세기를 도시하는 개략적인 도면이다.

도 27은 조사된 단핵세포 및 다양한 동도의 TT830, Fab22-TT830, TT, 또는 TT947과 인큐베이션된 T 세포의 증식을 그래프로 나타내는 도면으로서 융합단백질 Fab22-TT830이 TT830에 비해 Th 에피토프의 제공을 약 100배 증진시키는 것을 보여 주고 있다.

도 28은 1000nM의 TT830 또는 10nM의 FAb22-TT830, 및 T 세포 및 항원의 첨가전에 포화량의 mAb22 F(ab')₂로 미리 인큐베이션하거나 하지 않은 단핵세포와 인큐베이션한 T세포의 증식을 나타내는 히스토그램이다.

도 29는 IgG의 존재 또는 부재 (대조군) 하에서, 단핵세포 및 5nM의 Fab22-TT830 또는 1000nM의 TT830과 인큐베이션된 T 세포의 증식을 나타내는 히스토그램이다.

도 30의 패널A와 B는 단핵세포 및 다양한 농도의 TT830 또는 Fab22-TT830으로 2일간 배양된 T 세포의 상청액에서의 IFN-γ(패널A) 및 IL-4(패널B)의 농도를 나타내는 그래프이다.

도 31은 단핵세포 및 다양한 농도의 TT833S, Fab22-TT833S, 또는 TT830과 인큐베이션된 T 세포의 증식을 묘사하는 그래프이다.

도 32는 TT830 및 다양한 농도의 TT833S로 밤새 미리 인큐베이션한 단핵세포와 함께 2일간 인큐베이션된 T 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.

도 33은 TT830 및 다양한 농도의 TT833S 또는 FAb22-TT833S로 밤새 미리 인큐베이션한 단핵세포와 함께 2일간 인큐베이션된 T 세포의 증식억제 백분율을 나타내는 그래프이다.

도 34는 T 세포의 첨가전에 4시간 동안 TT830으로 최초 인큐베이션하고(프리펄스), 10μM의 TT833S 또는 0.1μM의 Fab22-TT833S (추적)으로 밤새 인큐베이션한 단핵세포와 함께 2일간 인큐베이션된 T 세포의 증식을 나타내는 히스토그램이다.

도 35는 단핵세포 및, TT830, FAb22-TT830, TT833S 및 Fab22-TT833S로 배양된 T 세포의 상청액에서의 인터페론-γ(IFN-γ) 및 IL-4의 농도를 나타내는 히스토그램이다.

도 36은 단독배지의 단핵세포, TT833S 또는 Fab22-TT833S로 하루동안 자극되고, 단핵세포 및 다양한 농도의 TT830으로 2일간 재자극된 T 세포의 증식을 나타내는 그래프로서 TT833S 및 Fab22-TT833S는 T 세포 아네르기를 유발하지 않음을 나타내고 있다.

도 37은 FcγRⅠ(H22)에 대한 하나의 결합특이성 및 태생기암 항원 (CEA)에 대한 하나의 결합특이성을 갖는 단일사슬의 양쪽특이성 분자를 코드하는 2개의 발현구조물 (구조물 321 및 323), FcγRⅠ에 대한 하나의 결합특이성을 갖는 단일사슬 항체를 코드하는 하나의 발현구조물을 나타내는 그래프이다. 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변영역외에 이들 구조물에 의해 코드되는 단백질들이 c-myc로부터의 펩티드 및 헥사-히스티딘 펩티드 (H-6)에 융합되어 있다.

도 38은 양쪽특이성 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 발현 구조물 321 (321-A5 및 321-B4) 및 323 (323-B2 및 323-C4)에 의해 코드되는 단일사슬 양쪽특이성 분자인 H-22-항-CEA, 및 구조물 225(225-C2)에 의해 코드되는 단일사슬 H22 항체의 결합수준을 나타내는 히스토그램이다.

도 39는 단일사슬의 인간화된 FcγRⅠ 항체의 핵산서열 및 상기 핵산에 의해 코드되는 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.

도 40은 FcγRⅠ에 대한 하나의 결합특이성 및 CEA에 대한 하나의 결합특이성을 갖는 단일사슬 양쪽특이성 분자의 핵산서열 및 상기 핵산서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니되는 하기의 실시예에 의해 추가로 설명된다. 본 출원에서 인용되는 모든 참고문헌의 내용, 출원중인 특허출원, 및 공개된 특허는 명백히 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.

발명의 개요

하나의 관점에서, 본 발명은 최소한 항-Fc 수용체 부분, 항-표적 부분 및 선택적으로 항-증진인자 (항-EF) 부분을 포함하는 다중 특이적인, 다가 분자를 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서 항-Fc 수용체 부분은 항체 단편 (예를 들어, Fab 또는 (Fab')₂단편)이며, 항-표적 부분은 리간드 또는 항체 단편이고, 항-EF 부분은 세포독성 활성과 관련된 표면단백질에 대한 항체이다. 특히 바람직한 구체예에서, 재조합 항-FcR 항체, 단편 또는 리간드는 인간화되어 있다 (예를 들어, 인간기원의 잔존부분을 지닌 비인간 항체 (예를 들어 쥐과동물)로부터 유래한 상보성 결정영역(CDR)의 적어도 일부를 갖는 것임).

다른 측면에서, 본 발명은 다중 특이적인 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 양쪽 특이성은 동일한 벡터에서 코드되어 숙주세포에서 발현 및 조립된다. 다른 구체예에서, 각각의 특이성은 재조합적으로 생성되며, 생성된 단백질 또는 펩티드는 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴기 결합을 통해 서로 접합되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 힌지 영역은 접합 전에 단지 하나의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형되어 있다.

재조합 항체 및 이로부터 생성된 다중 특이적 분자들은 친화성 및 특이성을 증가시키기 위해 조작될 수 있다. 더욱이, 인간화된 항체는 인간에 투여시 전형적으로 보다 덜 면역원성을 나타낸다. 본 발명의 다른 특성 및 장점은 하기의 상세한 설명과 청구의 범위를 참조하면 보다 잘 이해될 것이다.

상세한 설명

다중 특이성 분자

본 발명은 재조합 다중 특이성 분자에 관한 것이다. 다중 특이성 분자는 항-Fc 수용체 부분과 항-표적 부분으로 구성된 양쪽 특이성 분자를 포함할 수 있는데, 상기 부분들의 적어도 하나는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성된다. 또한, 다중 특이성 분자는 하나이상의 항-Fc 수용체 부분 또는 항-표적 부분으로 구성되는 분자, 또는 하나이상의 항-Fc 수용체, 항-표적 부분 및 추가로 다른 분자를 인지하는 부분 또는 부분들로 구성된 분자를 포함할 수 있는데, 상기 부분들 중 하나 이상은 재조합 DNA기술을 사용하여 구성된다.

항-Fc 수용체 부분은 항체, 기능성 항체단편 (예를 들어, Fab 단편) 또는 이펙터 세포상에서 Fc수용체를 인지하고 결합하는 리간드를 지칭한다. 본 발명에서 사용되기에 바람직한 항체는 내인성 면역글로불린에 의해 결합되지 않은 부위에서 이펙터 세포상의 Fc 수용체와 결합한다. 가장 바람직하게는, 항-Fc 수용체 부분은 인간의 FcγR (즉, FcγRⅠ, FcγRⅡ 또는 FcγRⅢ)과 결합한다. 바람직한 인간화된 항-FcγR 단일클론성 항체들은 PCT 출원 WO94/10332 및 미국특허 제 4,954,617 호에 기재되어 있고, 이들이 교시하고 있는 바는 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 이펙터 세포는 면역세포를 지칭한다. 특이적 이펙터 세포는 특이적인 Fc 수용체를 발현시키고, 특이적 면역기능을 수행한다. 예를 들어, FcγRⅠ을 발현시키는 단핵세포, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포가 특이적인 표적세포의 사멸 및 면역체계의 다른 성분들에 항원을 제공하는데 관련된다. 이펙터 세포상의 특정 FcR의 발현은 사이토킨과 같은 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어 FcγRⅠ의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상승조절되는 것으로 알려져 있다. 이러한 증진된 발현은 표적에 대한 FcγRⅠ세포의 세포독성 활성을 증가시킨다.

Fc 수용체에 특이적으로 결합하는 재조합 항체 또는 항체단편들은 인간항체로부터 유래한 즉, 인간화된 것이지만, 비인간 항체로부터 유래한 상보성결정영역 (CDR)의 적어도 일부를 갖는 것이 바람직하다. 상기 부분은 인간의 Fc 수용체에 대한 인간화된 항체의 특이성을 제공하도록 선택된다. 인간화된 항체는 비인간항체에서 유래한 CDRs를 가지며, 항체분자의 나머지 부분은 인간의 것이다.

항체는 전체, 즉 중쇄 및 경쇄 또는 이들의 임의의 단편, 예를 들어 Fab 또는 (Fab')₂단편을 가질 수 있다. 또한, 항체는 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 Fv 또는 Ladner 등이 기술한 단일사슬 구조물과 같은 최소 단편일 수 있다 (미국특허 제 4,946,778 호 참조)

인간화된 항체 또는 단편은 비인간 CDRs을 보유할 수 있는 인간항체일 수 있다. 바람직한 인간항체는 공지의 단백질인 중쇄가변영역 (VHs)의 NEWM 및 KOL, 그리고 Ig 카파사슬 가변영역 (VKs)의 REI로부터 유래한 것이다.

인간항체로 삽입된 비인간 CDR 부분은 Fc 수용체에 인간화된 항체가 결합되기에 충분한 정도로 선택된다. 상기 충분한 부분은 CDR부분을 인간항체로 삽입하고, 효소 결합 면역흡수제 분석법 (ELISA)을 사용하여 제조된 인간화된 항체의 결합능력을 시험하여 선택될 수 있다.

특정 인간 항체의 모든 CDRs는 비인간 CDR의 적어도 일부로 대체될 수 있거나, 이들 CDRs의 일부만이 비인간 CDRs로 대체될 수 있다. 인간화된 항체의 Fc 수용체에 대한 결합에 필요한 CDRs의 수를 대체하는 것만이 필요하다. 쥐과동물의 단일클론성 항체(mab), mab22로부터 유래한 비인간 CDR은 국제특허출원 공개번호 WO94/10332에 기술되어 있으며, 이들 내용은 본 명세서의 일부로 통합된다. 상기 mab22 항체는 Fc 수용체에 특이적이며, 본 명세서의 일부로 통합되는 미국특허 제 4,954,617 호에 기술되어 있다. 인간화된 mab22 항체를 생산하는 세포주는 HA022CL1으로 명명되어 기탁번호 CRL 11177로서 1992년 11월 4일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다.

항체는 인간항체의 CDR의 적어도 일부를 비인간 항체에서 유래한 CDR로 대체할 수 있는 방법에 의해 인간화될 수 있다. Winter는 본 발명의 인간화된 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 방법을 기술하고 있는데 참고문헌으로서 본 명세세에 명백히 통합된다(1987년 3월 26일 출원, 영국특허출원 GB2188638A). 인간의 CDRs는 올리고누클레오티드 특정부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)을 사용하여 비인간 CDR로 대체될 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 94/10332 Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes).

항-Fc 수용체 부분외에 청구된 다중 특이적 분자들은 항-표적 부분, 즉 항체, 기능성 항체 단편, 또는 병원체(예를 들어, 바이러스, 세균, 곰팡이), 병원체에 감염된 세포, 암 또는 종양세포(예를 들어, 유방암, 난소암, 전립선 암 등), 환자(예를 들어 인간 또는 동물)에서의 다른 원하지 않는 세포, 또는 항원 또는 이들의 변형된 형태를 인지하고 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 또한, 표적부분은 항원을 포함할 수 있거나, 항원에 대해 지향될 수 있다. 바람직한 구체예는, 예를 들어 순환계에서 항원을 고갈시키는 만성감염의 경우, 면역체계를 자극하고, 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있는 항원을 포함한다. 특히 바람직한 구체예는 항-FcR 항체를 함유하는 다가 분자에 부착된 항원을 갖는다.

본 발명의 특정 구체예에서, 다중 특이적인 분자는 리간드를 함유한다. 상기 리간드는 분자와 상호작용하는 임의의 리간드일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 리긴드는 단백질, 예를 들어, 암세포와 같은 표적세포상의 표면단백질에 결합한다. 바람직한 리간드는 성장 또는 분화 인자와 같은 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 예를 들어, 다가분자는 표피생장인자, 또는 표피생장인자 수용체와 같은 수용체와 상호작용할 수 있는 부분 또는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 구쳬예에서, 리간드는 봄베신, 가스트린 방출 펩티드 (GRP), 리토린 (litorin), 뉴로메딘 B, 또는 뉴로메딘 C와 같은 작은 펩티드이다. 상기 펩티드의 서열은 미국특허 제 5,217,955 호에 나타나 있으며 이는 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다. 또한, 상기 리간드는 이들 펩티들의 변형된 형태일 수 있다. 변형은 수용체에 대한 결합을 증가, 감소, 또는 결합에 무영향을 나타낼 수 있다. 또한, 리간드의 변형은 애고니스트를 길항제로 변형시켜 리간드가 세포증식을 자극하기 보다는 억제하도록 하게 한다. 리간드의 변형은 부가, 결실, 치환, 또는 하나이상의 아미노산의 변형일 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 다가 또는 양쪽 특이적 분자는 항원을 포함한다. 여기서 사용된 용어 항원은 자연 또는 합성 면역원성 물질, 면역원성 물질의 단편 또는 부분, 펩티드 에피토프, 또는 합텐를 의미한다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 양쪽 또는 다중 특이적인 분자는 항원을 세포에 표적화하는데 사용되는데, 이는 이들 세포의 내부이행 및 프레젠테이션 과정을 증진시키고, 궁극적으로는 내부의 면역반응을 자극하게 된다. 특정 구체예에서, 양쪽 특이적인 결합원은 항원(직접적으로 항원의 에피토프, 또는 간접적으로 항원에 부착된 에피토프)에 특이적으로 결합하고, 동시에 프로세싱 및 프레젠테이션을 위해 항원을 내부도입할 수 있는 항원제공 세포의 표면수용체에 결합한다. 다른 구체예에서, 항원은 다중 또는 양쪽 특이적 분자에 연결되어, 동시에 항원제공세포의 표면 수용체에 결합한다. 이들 양쪽 또는 다중 특이적 분자의 수용체 결합 성분(따라서, 그 자체로 양쪽 또는 다중 특이적 분자임)은 항원제공세포의 수용체에 결합한다. 어떤 경우에는, 상기 분자의 결합은 수용체에 대한 자연 리간드에 의해 실질적으로 차폐되는 분자가 없이 일어난다. 그 결과 수용체에 대한 항원의 표적화는 리간드의 생리학적 수준에 의해 방해되지 않고, 표적화된 수용체는 리간드 결합과 기능성을 보유한다.

한가지 유형의 항원은 알레르겐일 수 있다. 알레르겐은 민감한 환자에서 알레르기 또는 천식을 유발할 수 있는 물질을 지칭한다. 알레르겐의 리스트는 광범위하며, 꽃가루, 곤충독액, 동물피부가루, 곰팡이 포자 및 약제(예를 들어, 페니실린)을 포함할 수 있다. 자연, 동물 및 식물의 알레르겐의 예는 다음의 속에 특이적인 단백질을 포함한다 :

수많은 알레르겐은 두드러기 쑥, 잔디, 또는 나무의 공기중의 꽃가루, 곰팡이, 동물, 집의 먼지 또는 음식 중에서 발견된다. 통상, 이들은 단백질 분해적인 절단에 비교적 내성이 있다. 바람직한 알레르겐은 주세포 및 호염기성 세포상의 IgE에 결합하는 것들로서, 이들은 타입Ⅰ 아나필락시스 고감수성 반응을 야기한다. 다가 작용제의 하나이상의 특이성이 IgG의 리간드 결합 도메인의 외부에 존재하는 고친화성 Fc 수용체의 에피토프에 대한 것인 경우, 이러한 양쪽특이성 결합제는 환자에서의 고감수성을 감소시킬 수 있다. 이는 알레르겐이 주세포 또는 호염기성 세포상의 IgE에 결합하기 전에 양쪽 특이성 결합제가 IgE 결합 알레르겐에 대해 경쟁할 때 달성되는데, 이로써 타입Ⅰ 고감수성 반응의 가능성이 감소된다. 또한, 알레르겐을 FcγR에 향하게 함으로써, T 세포의 알레르겐에 대한 면역관용 상태가 유도되어, IgE 매개의 타입Ⅰ 반응을 간섭할 수 있다. 면역관용은 일반적으로 사용되는 것보다 실질적으로 낮은 알레르겐의 투여량을 사용하여 알레르겐에 대한 결합에 대해 IgE와 경쟁하는 IgG을 유도함으로써 달성될 수 있다.

어떤 경우에는, 투여를 위해, 합텐과 같이 본래 약한 항원성 또는 비항원성의 물질을 거대 면역원성 단백질 (예를 들어, 박테리아 톡신)과 같은 담체분자와 커플링하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우에, 양쪽특이성 결합제는 상기 물질 그 자체의 에피토프 보다는 상기 물질과 커플되는 담체의 에피토프에 결합하도록 제조될 수 있다.

본 발명의 다중 또는 양쪽 특이성 분자에 직접 또는 간접으로 연결될 수 있는 항원은 가용성이거나 미립자일 수 있는데, B 세포 에피토프, T 세포 에피토프, 또는 양자를 운반할 수 있다. 항원은 그 기원이 세균성, 바이러스성, 기생충성일 수 있다. 종종, 상기 항원은 병원성 생명체의 표면구조의 성분을 포함한다. 예를 들어, 인간의 면역결핍바이러스 (HIV)의 외막 당단백질과 같은 바이러스성 표면구조 또는 간염바이러스의 표면항원을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항원은 종양세포와 같은 환부세포와 결합되어, 이에 대한 면역반응이 상기 질환의 치료를 위해 일어날 수 있다. 상기 항원은 인간의 유방암세포 및 난소암세포에서 발현되는 Her2/뉴 프로토-온코진 산물과 같은 종양 특이적 또는 종양관련 항원을 포함할 수 있다 (Slamon 등, 1989, Science 244:707).

환자의 세포는 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 다가 분자에 노출될 수 있다. 다가 분자는 항원을 배양되는 항원제공 세포에 표적화하기 위해서 사용될 수 있다. 면역적격세포가 환자의 혈액에서 분리정제된다. 다음, 상기 세포는 항원을 포함하는 다가 분자에 노출되거나, 항원에 대한 결합특이성을 갖는 다가분자와 함께 항원에 노출될 수 있다. 표적화된 항원제공세포는 세포표면에서 항원을 프로세스하고 단편을 제공하게 된다. 자극후, 상기 세포들은 환자에게 복귀될 수 있다.

본 발명의 방법은 항원에 대한 면역반응을 증진 또는 강화시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 간염 및 AIDS와 같은 만성감염(도움없는 면역체계는 이러한 감염을 극복할 수 없음)의 치료를 위해 유용하다. 또한, 침입하는 생명체에 대한 면역반응의 강화가 필수적일 때, 감염의 급성단계의 치료에서 본 발명은 사용될 수 있다.

본 방법은 숙주가 항원에 반응하지 않거나 최소한도로 반응하는 경우에 예방적인 또는 치료적인 면역반응을 얻는데 요구되는 항원의 투여량을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 바람직하지만, 유효투여량를 낮추는 것은 알레르기의 경우와 같이 항원이 숙주에 대해 독성일 때, 특히 바람직할 수 있다. 항원을 포함하거나, 리간드, 예를 들어, 항원과 상호작용하는 항체를 포함하는 양쪽 특이적 또는 다중 특이적 분자를 사용하는 방법 및 용도는 공개된 PCT 출원 US91/07283에 추가로 기술되어 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, T 세포 활성에 대한 다중특이적 분자의 효과가 항원제공세포에 의해 변형된 항원을 T 세포에 제공할 때 변형되도록, 다중 특이적 분자는 변형된 항원을 포함한다. 사실, Allan 등은 T 세포를 자극하는, 예를 들어 T 세포증식을 자극하는 펩티드의 하나이상의 아미노산의 치환이 T세포의 자극에 실패하거나 T 세포의 아네르기를 유도하는 항원을 생성하는 것을 입증하였다. 이러한 변형된 펩티드는 변형 펩티드 리간드 (APL)로 명명된다. 따라서, 이러한 APLs는 FcγRⅠ에 대해 하나이상의 결합특이성을 갖는 양쪽 또는 다중 특이적 분자에 연결될 수 있다. 항원제공세포에 의한 상기 분자의 식세포작용 및 T 세포로의 제공은 T 세포의 증식을 억제하거나 약화시킬 수 있다. 따라서, (a) 통상 T 세포를 자극하지만, 투여시 T 세포의 아네르기를 유도하는 변형된 하나이상의 항원펩티드 및 (b) 하나이상의 항-FcγRⅠ 항체를 포함하는 다중 특이적 분자의 환자투여는 상기 항원에 대한 환자의 면역관용을 유도하게 된다. 따라서, 이러한 다중 또는 양쪽 특이성 분자는 다양한 항원, 예를 들어 지기항원에 대한 환자의 면역관용화를 위해 사용될 수 있다. 따라서 사용된 항원에 따라, 본 발명의 방법은 T 세포를 자극하는 항원을 사용하여 면역반응을 증가시키는 방법을 제공하고, 또한, T세포의 자극을 억제하거나 T 세포의 아네르기를 유도함으로써 면역반응을 감소시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다중 특이적, 다가분자는 항-증진인자 (항-EF) 부분을 포함할 수 있다. 상기 항-증진인자 부분은 항원에 결합하여 항-Fc 수용체 부분 또는 항-표적부분의 효과를 증진시키는 항체, 기능성 항체단편 또는 리간드일 수 있다. 상기 항-증진인자 부분은 Fc 수용체 또는 표적과 결합할 수 있다. 하나의 표적세포 항원에 결합하는 항-표적부분 및 상이한 표적항원에 결합하는 항-증진인자 부분을 포함하는 다가 분자는 상기 표적세포가 항원변조 및 항원변화를 진행시키는 경우(예를 들어 일부 기생충, 트리파노조마의 경우 알려진 바와 같이) 특히 유용하다. 다른 방법으로, 항-증진인자 부분은 항-표적 또는 항-Fc 수용체 부분이 결합하는 것과는 상이한 것에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진인자 부분은 세포독성 T 세포에 결합할 수 있다(예를 들어, 표적에 대해 증가된 면역반응을 일으키는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역세포를 통해).

다중 특이적 분자를 제조하는 방법

상기 기술된 다중 특이적 분자는 수 많은 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 양 특이성은 동일한 벡터에서 코드되어, 동일한 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이러한 방법은 다중 특이성 분자가 하기 실시예 2에서 기술된 리간드×fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 또한, 본 발명의 양쪽 특이성 분자는 단일사슬 양쪽 특이성 항체와 같은 단일사슬 양쪽 특이성 분자, 하나의 단일사슬 항체 및 리간드를 포함하는 단일 사슬 양쪽 특이성 분자, 또는 2개의 리간드를 포함하는 단일사슬 양쪽 특이성 분자일 수 있다. 또한, 다가분자는 단일사슬 분자이거나, 2개이상의 단일사슬 분자를 포함할 수 있다. 이가 또는 다가 항체를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국특허 제 5,260,203 호, 미국특허 제 5,455,030 호, 미국특허 제 4,881,175 호, 미국특허 제 5,132,405 호, 미국특허 제 5,091,513 호, 미국특허 제 5,476,786 호, 미국특허 제 5,013,653 호, 미국특허 제 5,258, 498 호 및 미국특허 제 5,482,858 호에 기술되어 있다.

특정 표적에 대한 단일사슬 분자의 결합은 하기 실시예에 기술된 양쪽 특이적 ELISA 법에 의해 확인될 수 있다.

다른 방법으로, 다중 특이적 분자의 각각의 특이성은 별도로 생성되어, 생성된 단백질 또는 펩티들이 서로 접합될 수 있다. 예를 들어, 2개의 인간화된 항체는 2개의 중쇄의 C말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 바람직하게는 하나의 술프히드릴 잔기를 포함하도록 변형된다.

본 발명의 양쪽 특이성 분자는 하기 실시예에 기술된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 항-FcR 및 항-표적부분을 접합하여 제조될 수 있다. 예를 들어 다양한 커플링제 또는 교차결합제가 공유결합 접합에 사용될 수 있다. 교차결합제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)가 있다 (Karpovsky 등, 1984, J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA 등, 1985, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 참조). 다른 방법은 하기 문헌에 기재된 것들을 포함한다(Paulus, Behring Ins. Mitt., 1985, No.78, 118-132; Brennan 등, Science, 1985, 229:81-83; 및 Glennie 등, J. Immunol., 1987, 139:2367-2375). 바람직한 접합 시약으로는 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)에서 구입가능한 SATA 및 술포-SMCC이다.

다중 특이적 분자의 치료적 용도

FcR을 지닌 면역세포 및 특정 표적세포에 결합할 수 있는 능력에 기초하여, 특정 다중 특이적 분자는 다양한 질병 또는 질환(암, 예를 들어, 유방암, 난소암, 폐의 작은세포 암종; 병원성 감염, 예를 들어, HIV와 같은 바이러스성 감염; Toxoplasma gondii와 같은 원생동물; 칸디다증과 같은 곰팡이; 자기면역, 예를 들어, 면역 혈소판감소증 자반병 및 전신성 낭창)의 치료를 위해 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 다중 특이적 다가분자는 표적세포에 의한 감염에 대해 환자를 백신접종하기 위해 예방학적으로 투여될 수 있다.

치료용도를 위해, 효과적인 양의 적절한 다중 특이적 분자는 상기 분자가 의도하는 치료학적 효과를 발휘하도록 하는 방식으로 환자에게 투여될 수 있다. 바람직한 방식의 투여는 구강 및 피부적용 투여(예를 들어 패치를 통한 투여)를 포함한다. 다른 방식의 투여의 예로는 주입(피하, 정맥내, 비경구, 복강내, 협막내 주사 등)을 포함한다. 상기 주입은 환약 또는 연속주입으로 수행된다.

다중 특이적 분자는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 문장 약제학적으로 허용가능한 담쳬는 다중 특이적 분자와 함께 동시에 투여되어 의도된 기능을 상기 분자가 수행할 수 있도록 하게 하는 물질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 담체의 예로는 용액, 용매, 분산매질, 지연제, 유탁액 등이 있다. 약제학적으로 할성인 물질의 이러한 매질 사용은 당기술분야에서 공지되어 있다. 상기 분자와 사용하기에 적합한 다른 통상의 담체는 본 발명의 범위내에 있다.

다중 특이적 분자의 유효량이라는 용어는 원하는 생물학적 효과를 실현시키기에 필요한 또는 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 항-표적 부분이 병원성 세포를 인지하는 경우의 다중 특이적 분자의 유효량은 종양, 암 또는 세균성, 바이러스성 또는 곰팡이성 감염을 제거하기에 필요한 양일 수 있다. 특정 외용의 유효량은 치료대상의 질병 또는 질환, 투여되는 특정 다중 특이적 분자, 환자의 크기 또는 질환 또는 질병의 심각성과 같은 인자에 따라 가변될 수 있다. 당업계의 통상의 기술 중 하나는 과도한 실험없이도 특정 다중 특이적 분자의 유효량을 실험적으로 측정할 수 있다.

실시예 1

Fc 수용체 및 항-her2 neu 항체에 특이적인, 쥐과동물 또는 인간화된 항체를 포함하는 양쪽 특이적 항체의 제조

단일클론성 항체

항-FcγRⅠ 단일클론성 항체 (mAbs), M22, M32.2 및 197을 이온교환크로마토그래피에 의해 하이브리도마의 상청액으로부터 정제하고, DZ33, 인간의 항-HIV-1 IgG1 mAb는 단백질 A 친화성 크로마토그래피(Pharmacia, Piscataway, NJ) 및 겔여과법에 의해 하이브리도마 상청액으로부터 정제하였다. M32.2는 1987년 7월 1일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852)에 ATCC 기탁번호 HB9469로 가탁되었다.

세포주

쥐과동물 골수종 NSO (ECACC 85110503)는 비-Ig 합성세포주로서, 재조합 mAbs의 발현을 위해 사용되었다. NSO 세포는 10% 우태아혈청이 추가된 DMEM (FBS, Gibco, Paisley, U.K.)에서 배양되었다. SKBR-3은 HER2/neu 프로토온코진을 과도하게 발현시키는 인간 유방암종 세포주이며 (ATCC, Rockville, MD), Iscove의 변형된 둘베코 배지 (IMDM, Gibco, Grand Island NY)에서 배양되었다. U937는 FcγRⅠ를 발현시키는 단구 세포주로서 ATCC에서 입수하여 10% FBS가 첨가된 RPM-1640 (Gibco, Grand Island, NY)에서 생장시켰다.

쥐과동물의 면역글로불린 V 영역 유전자의 클론닝

쥐과동물의 하이브리도마 22로부터의 세포질 RNA는 Favaloro 등에 의해 기술된 방식으로 제조하였다(Favaloro, J.R. Treisman 및 R. Kamen (1982) Transcription maps of polyoma-specific RNA: anaysis by two-dimensional S1 gel mapping. Meth. Enzynol. 65:718). Ig V 영역의 cDNA는 프라이머 CG1FOR 및 CK2FOR로부터 개시되는 역전사효사를 사용하여 RNA로부터 제조되었다 (국제특허출원 공개번호 WO94/10332 Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes 참조). 상기 cDNA 합성은 100U의 MMLV 역전사 효소를 사용하여 표준조건하에서 수행되었다 (Life Technologies, Paisley, UK). V_H및 V_kcDNA는 국제특허출원 공개번호 WO94/10332에 기술된 SH2BACK 및 VK7BACK과 함께 cDNA 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다 (Orlandi, R., D.H. Gussow, P.T. Jones 및 G. Winter (1989), Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833). 증폭된 V_H및 V_KDNA는 정제되고, M13으로 클론되어, T7 DNA 중합효소를 사용한 디데옥시 방법에 의해 서열화되었다 (Pharmacia, Piscataway, NJ).

키메라 항체 유전자의 구성

쥐과동물의 V 영역 DNA를 발현벡터로 클론닝하는 것을 용이하게 하기 위해 제한부위를 M22 V 영역 유전자 말단에 근접하여 위치시켰다. V_H의 경우 5'PstⅠ 및 3'BstEⅡ 부위가 VH1BACK 및 VH1FOR (Ⅰd.)를 사용하여 PCR에 의해 클론된 쥐과동물의 V_H유전자로 도입되었다. V_K의 경우 5'PvuⅡ 부위 및 3' BglⅡ 부위가 VK1BACK 및 VK1FOR (Ⅰd.)를 사용하여 PCR에 의해 클론된 쥐과동물의 V_K유전자로 도입되었다. 이러한 경우에, 이들 프라이머는 자연발생의 아미노산을 하나이상 변경하게 된다. 이들 V 영역 유전자들 (ChVH 및 ChVK)는 적당한 제한효소에 의해 절단되어 Ig 프로모터, 신호서열 및 절접부위를 포함하는 M13VHPCR1 및 M13VKPCR1(Ⅰd.)으로 클론되었다. 상기 DNA는 M13으로부터 HindⅢ-BamHⅠ 단편으로 절출되어, 인간 IgG1 (Takahashi, N. 등, 1982, Structure of human immunoglobulin gamma genes:implications for evolution of a gene family, Cell, 29:671) 및 인간의 카파 불변영역 게놈 DNA (Hieter, R.A. 등, 1980, Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments, Cell 22:197)을 포함하는 발현벡터 pSVgpt 및 pSVhyg로 클론되었다.

인간화된 항체 유전자의 구성

2개의 인간화된 중쇄가 구성되었는데, 이는 NEWM (Poljak, R. J. 등, Amino acid sequence of the VH region of a human myeloma immunoglobulin, (IgG New), Biochemistry, 16:3412)및 KOL (Marquat, M.등, 1980, Crystallographic refinement and atomic models of the intact immunoglobulin molecule Kol and its antigen-binding fragment at 3.0A and 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 141:369)의 인간 VHs에 기초하고 있다. 인간화된 경쇄는 약간의 프레임워크 영역(FR)의 변형으로 인간의 벤스-존스 단백질 REI로부터 유도되었다 (Epp, O. 등, 1974, Crystal and molecular structure of a dimer composed of the vandible portion of the Bence-Jones protein REI, Eur. J. Biochem. 45:513). 이러한 변형은 V_K도메인을 보다 인간의 하위그룹Ⅰ에 전형적인 것이 되도록 하고, Thr39, Leu104, Gln105 및 Thr107을 Lys39, Val104, Glu105 및 Lys107로 대체하는 것을 포함한다. 또한, Met4는 PvuⅡ 제한 부위를 수용하기 위해 Leu4로 변경되었다.

관련이 없는 CDRs와 NEWM V_H및 REI V_KFRs를 포함하는 DNA는 벡터 M13VHPCR1 및 M13VKPCR1으로 클론되었다 (Favaloro 등 상기 참조). KOL V_H를 코드하는 DNA는 KOL FR 아미노산을 코드하는 올리고데옥시리보누클레오티드 및 관련없는 CDRs를 사용하여 일련의 순차적인 PCRs에 의해 구성되었다. 다음, 상기 구성물은 M13VHPCR1으로 클론되었다.

인간의 FRs에 해당하는 누클레오티드에 의해 플랭킹된 mAB M22 CDRs를 코드하는 올리고데옥시리보누클레오티드가 합성되었다. NEWM에 기초한 인간화된 V_H의 경우, 프라이머는 쥐과동물의 FR 아미노산 Phe27, Ile28 및 Arg71를 포함하는데, 이는 이들이 항원결합에 영향을 줄 수 있기 때문이다 (Chothia, C. 및 A.M. Lesk (1987), Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol., 196:901; Tramontano, A. 등 (1990), Framework residue 71 is a major determinant of the position and conformation of the second hypervariable region in V_Hdomains of immunoglobulins, J. Mol. Biol., 215:175). 인간화된 V_K의 경우, 유사하게 쥐과동물 아미노산 Phe71은 친화성에 영향을 줄 수 있는 잔기로서 포함된다 (Foote, J. 및 G. Winter, (1992), Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops, J. Mol. Biol. 224:487). 쥐과 동물의 FR 잔기들은 KOL V_H에 포함되지 않는다. 올리고데옥시리보누클레오티드는 5'쪽이 인산화되었고, 인간 V영역 유전자에 어닐링되는 M13 만능 전방향 프라이머를 사용하여, M13 단일가닥 DNA 주형을 함유하는 반응물에서 클론되었다. 상기 DNA는 2.5U의 T7 DNA 중합효소 (United States Biochemicals, Cleveland, OH)와 0.5U의 T4 DNA 리가아제 (Gibco BRL, Grand Island, NY)를 사용하여 연장되고 연결되었다. 돌연변이된 가닥은 1U의 Vent DNA 중합효소 (New England Biolabs, Beverly, MA)와 M13 역서열화 프라이머를 사용하여 연장/연결반응 혼합물로부터 우선적으로 증폭되었고, 이어서, M13 전방향 및 후방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 생성물 DNA는 BamHⅠ 및 HindⅢ에 의해 절단되고, M13으로 클론되어 DNA 서열화에 의해 삼중 CDR-이식 돌연변이체를 확인하였다.

인간화된 V 영역을 함유하는 M13 클론은 의사 돌연변이의 부재를 확실하게 하기 위해 전체를 서열화하였다. 확인된 클론으로부터의 RF DNA는 HindⅢ 및 BamHⅠ에 의해 소화되고, pSVgpt 또는 pSVhyg로 클론되며, 인간의 IgG1 또는 인간의 카파 불변영역은 키메라 항체의 구성에서 기술한 바와 같이 정확히 추가되었다.

재조합 mABs의 발현 및 정제

중쇄 (5㎍) 및 경쇄 (10㎍) 발현벡터를 PvuⅠ으로 소화시키고, 에탄올 침전후, 50㎕ 물에 용해시켰다. NSO 세포 (1-2×10⁷)들을 원심분리에 의해 수확하고, 0.5ml의 DMEM에서 재현탁시킨 후, 0.4cm 일렉트로포레이션 큐벳에서 상기 DNA와 혼합하였다. 5분후, 얼음상에서 상기 세포들에게 170 볼트, 960μF (GenePulser, Bio-Rad, Melville, NY)의 단일펄스가 주어지고, 추가의 15분 동안 얼음상에서 인큐베이션하였다. 상기 세포들은 24-48시간 동안 DMEM에서 회복되도록 허용되었다. 그 다음, 배지를 미코페놀산 (0.8 ug/㎖) 및 크산틴 (250 ug/㎖)을 첨가하여 선택성 배지로 만들었다. 200㎕의 분취액을 96-웰 플레에트에 분배하였다. 10-12일 후, ELISA로 측정된 최고수준의 항체를 함유하는 웰로부터 세포들이 선택되어 제한된 희석에 의해 클론되었다.

항체는 과도 생장된 배양액에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다 (Boehringer Mannheim, Lewes, U.K.). 농도는 A_280nm를 측정하여 결정되었고, ELISA 및 SDS-PAGE에 의해 확인되었다.

항체 결합 측정을 위한 ELISA

미소적정 플레이트의 웰을 50mM의 중탄산염 완충용액 (pH 9.6)에서 염소의 항인간 IgM 항체 (Sera-Lab, Crawley Down, U.K.)로 코팅하였다. 상기 플레이트는 1% BSA로 차폐되고, 인간 FcγRⅠ의 세포외 도메인과 일과성 트랙스펙션된 COS 세포로부터 수득된 인간 IgM 중쇄 (sFcγRⅠ-μ)로 구성된 가용성 융합단백질을 첨가하였다 (COS 세포의 발현벡터는 Massachusetts General Hospital, Boston, MA의 Dr. Brian Seed에 의해 제공된다). 재조합 22 또는 대조군 mAbs는 Fc 부분을 통해 시험 mAbs에 대한 비특이적인 결합을 차폐하는 λ 경쇄를 함유하는, 과량의 (2.2μg/웰) 인간 IgG1 항체의 존재하에서 추가되었다 (Sigma, St. Louis. MO). 결합된 22 mAbs는 과산화효소로 표지된 염소의 항인간 카파 사슬 항체 (Sera-Lab, Crawley Down, U.K.) 및 o-페닐렌디아민으로 검출하였다.

항체의 플루오레세인화

mAb 용액의 pH를 0.1M의 Na₂CO₃의 첨가에 의해 9.3으로 조정하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (Sigma, St. Louis, MO)를 2mg/ml의 농도로 DMSO에 용해시켰다. 40 μg의 FITC는 1밀리그램의 mAbs 마다 첨가되고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플루오레세인화된 mAb는 G-25 크로마토그래피에 의해 결합되지 않은 FIFC로부터 분리되었다.

혈구의 제조

버피 코드 (buffy coat)가 헤파린화된 정맥 전혈로부터 제조되었다. 전혈을 5% 덱스트란을 함유하고 있는 RPMI로 2.5:1 (v/v)의 비율로 희석하였다. 상기 적혈구는 얼음상에서 45분간 침전되도록 하고, 상청액의 세포들을 새로운 튜브로 옮긴 후, 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 잔존 적혈구는 저장성의 용균에 의해 제거하였다. 잔존 임파구, 단핵세포 및 호중구은 결합분석법에 사용될 때 까지 얼음에서 보관하였다. 어떤 실험에서는 호중구를 피콜 하이패크 경사분리법 (ficoll hypaque gradient separation, Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 단핵세포로부터 분리하였다. FcγRⅠ를 상승 조절하기 위해서, 호중구 및 단핵세포들은 사이토킨으로 처리하였다. 단핵세포의 배양액은 37℃에서 5% CO₂의 조건에서 48시간 동안 2.5% 정상 인간혈청 AB형(Sigma, St. Louis, MO) 및 500 IRU/ml IFN-γ (RD Systems, Minneapolis, MN)를 함유하는 4×10⁶세포/ml의 RPMI의 테프론 접시에서 인큐베이션하였다. 호중구는 50 ng/ml G-CSF (R. Repp, U. of Erlanger, Germany에 의해 제공) 및 500 IRU/ml의 IFN-γ을 가진 AIM V 배지 (Gibco, Grand Island, NY)에서 48시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

유동 세포계수

세포결합분석법은 전술한 바와 같이 96-웰의 미소적정 플레이트를 사용하여 수행되었다 (Guyre, P.M. 등 Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on FcγR are able to trigger receptor function. J. Immunol., 143:1650). 간단히, 세포는 2mg/ml의 BSA 및 0.05%의 NaN₃(PBA)를 함유하는 PBS (pH 7.4)에서 세척하고, PBA로 2.0×10⁷세포/ml로 조정하였다. 세포(25㎕), 항체 (25㎕) 및 인간 혈청 (25㎕) 또는 인간 IgG (10mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) (25㎕), 또는 PBA (25㎕)가 미소적정 플레이트에 첨가되고, 45-60분간 얼음위에 방치하였다. 결합되지 않은 항체는 PBA로 세포를 3회 세척하여 웰로부터 제거하였다. 세포들은 1% 파라포름알데히드로 고정하였다. 세포와 관련된 형광은 벡톤 디킨슨 팩스캔 (Becton Dickinson FACScan)으로 분석하였다.

BsAb 커플링 과정

BsAb는 Glennie 등의 방법을 사용하여 구성하였다 (Glennie, M.J. 등, 1987, Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma)², antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragment, J. Immunol., 139:2367). mAbs 22 (쥐과동물 및 인간화된 것임) 및 520C9 (항-HER2/neu) 항체는 시험관내에서 각각의 하이브리도마 세포의 배양에 의해 생산되었다. 상기 항체들은 펩신으로 분리소화되어 F(ab')₂가 되고, 이어서 10mM의 머캅토에탄올아민(MEA)을 30℃에서 30분간 첨가하여 Fab'로 환원시켰다. 상기 Fab' 단편을 50mM의 나트륨 아세테이트, 0.5mM의 EDTA, (pH 5.3, 4℃)에서 평형화된 세파덱스 G-25 칼럼에 적용시켰다. 디메틸 포름아미드에 용해되고 메탄올/얼음 배쓰에서 냉각된 오르토페닐렌디말레이미드 (o-PDM, 12mM)를 M22×520C9의 경우 쥐과동물의 22 Fab'에 절반(부피) 첨가하고, H22×520C9의 경우 520C9 Fab'에 절반첨가한 후, 얼음에서 30분간 인큐베이션하였다. 그 다음, Fab'-말레이미드를 50mM의 나트륨 아세테이트, 0.5mM의 EDTA, (pH 5.3, 4℃)에서 평형화된 세파덱스 G-25 칼럼상에서 결합되지 않은 o-PDM으로부터 분리하였다. BsAbs의 제조의 경우, 1:1의 몰비율로 M22 Fab'-말레이미드가 520C9 Fab'에 첨가되거나, 520C9 Fab'-말레이미드가 H22 Fab'에 첨가되었다. 반응물은 질소하에서 아미콘 챔버(4℃)에서 디아플로 막 (Diaflo membrane)을 사용하여 출발부피로 농축되었다. 18 시간후, pH는 1M 트리스-염산 (pH 8.0)을 사용하여 8.0으로 조정하였다. 그 다음 상기 혼합물을 10mM의 MEA로 환원시키고 (30℃에서 30분간), 25mM의 요오드아세트아미드로 알킬화하였다. 양쪽 특이적 F(ab')₂는 PBS에서 평형화된 슈퍼덱스 200 컬럼(Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해, 반응하지 않은 Fab'와 다른 생성물로부터 분리되었다.

항체 의존성 세포독성 (ADCC)

HER2/neu를 과도하게 발현시키는 인간의 유방암종 세포, SKBR-3은 사이토킨으로 활성화된 호중구에 의한 용균을 위해 표적으로 사용되었다 (혈구제조편 참조).

표적은 U자형 바닥의 미소적정 플레이트에서의 호중구와 항체의 결합 전에 100μCi의⁵¹Cr로 1시간동안 표지되었다. 37℃에서 5시간동안 인큐베이션한 후, 상청액을 수집하고, 방사능을 분석하였다. 세포독성은 다음의 공식으로 계산하였다. : 용균 %=(실험 CPM-표적 누출 CPM/세정제 용균 CPM-표적 누출 CPM)×100%. 비용균(specific lysis)=항체에 의한 용균 %-항체없는 경우의 용균%.

상기 분석은 3중으로 수행되었다.

과산화물 유도

FcγRⅠ을 통해 과산화물의 폭발을 촉발하는 H22의 능력을 측정하기 위해 U937 세포들이 사용되었다 (Pfefferkorn, L.C. 및 G.R. Yeaman, 1994, Association of IgA-Fc receptors (Fc×R) with FcεRIγ2 subunits in U937 cells, J. Immunol. 153:3228; Hallet, H.B. 및 A.K. Campbell 1983, Two distinct mechanisms for stimulating of oxygen-radical production in polymorphonuclear leucocytes, Biochem. J. 216:459). U937 세포는 100U/ml의 IFN-γ (Genentech, S. San Francisco, CA)의 존재하에서 5일간 10% FBS (Hyclone, Logan, UT)를 지닌 RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY)에서 배양되어, 분화 및 FcγRⅠ의 증가된 발현을 유도하였다. 실험당일에, 이들 분화된 세포들을 37℃에서 10% FBS를 가진 신선한 RPMI-1640에서 20분간 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 펠릿화하고, 1mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 11mM 글루코오스 및 100μg/㎖의 BSA (Sigma, St. Louis, MO)가 보충된 PBS에서 3×10⁶세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 과산화물의 방출을 촉발하기 위해서 100㎕의 세포를 0.1mM의 루미놀 (Sigma, St. Louis. MO), 0.5mM의 바나듐산 나트륨 (Sigma, St. Louis. MO) 및 mAb M22, H22 또는 197을 함유하는 100㎕의 반응용액에 첨가하고, 22℃의 발광측정기에 위치시켰다. 과산화물의 자발적인 생성의 측정은 발광측정기의 반응용액에 세포를 추가하자마자, 30초 내지 40초 마다 실행되었다. M22, H22 또는 197로 FcγRⅠ를 교차결합함으로써 촉발되는 과산화물을 비교하기 위해 각각의 mAb는 10μg/㎖의 농도로 사용되었다. 과산화물의 생성은 mV/초의 단위로 20분간 모니터되었다. MAb M22, M32.2 및 197은 과산화물 생산의 투여량 반응성을 확립하기 위해 다양한 농도로 첨가되었다.

결과

쥐과동물의 Ig V 영역 유전자

Ig V 영역 cDNA를 쥐과동물의 중쇄 및 카파 불변영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 M22 하이브리도마로부터 제조하고, 알려진 신호의 서열 및/또는 완전한 V 영역의 5'서열에 기초한 일련의 프라이머를 추가로 사용하여 PCR로 이를 증폭하였다. 예견되는 크기의 V_H및 V_K의 PCR 생성물은 SH2BACK/CG1FOR 및 VK7BACK/CK2FOR 프라이머 조합을 사용하여 수득하였다. 증폭된 DNA를 적당한 제한 효소로 소화시키고, M13으로 클론한 후, 24개 이상의 독립클론으로부터 양 방향의 서열을 결정하였다. 추론된 아미노산 서열은 서열 29 및 서열 30에 도시되어 있다. V_K의 4개의 N-말단 잔기들은 VKBACK 프라이머에 의해 코드된다.

M22 V_H및 V_K는 각각 쥐과동물의 중쇄 하위그룹ⅢD 및 카파 하위그룹Ⅰ의 구성원이다 (Kabat, E.A. 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Service). L97의 잔기를 제외하고, M22 V_K의 아미노산 서열은 쥐과동물의 항 IgG mAb A17의 아미노산 서열과 동일하다 (Shlomchik, M. 등, Variable region sequences of murine IgM anti-IgG monoclonal autoantibodies (rheumatoid factors). Ⅱ Comparison of hybridomas derived bylipopolysaccharide stimulation and secondary protein immunization, J. Exp. Med. 165:970).

인간화된 mAbs 및 이들의 초기 결합특성확인

M22 V_HFR은 NEWM 보다는 (57% 상동성, 인간의 하위그룹Ⅱ) KOL (인간의 하위그룹Ⅲ)에 더 큰 상동성 (79%)를 나타내었다. 이러한 차이가 결합에 어떻게 영향을 주는가를 확인하기 위해, 중쇄는 쥐과동물의 잔기 Phe27, Ile28 및 Arg71을 포함하는 NEWM V_H또는 쥐과동물의 FR 아미노산이 없는 KOL V_H를 기초로 하여 구성하였다. 상기 인간화된 V_H양자 모두, 동일한 REI 유래의 인간화된 경쇄와 짝을 이루었다.

인간화된 mAbs의 친화성은 최초, FcγRⅠ/IgM 중쇄 융합단백질에 대한 결합을 ELISA로 측정하여 평가되었다. 상기 데이터는 KOL V_H/REI V_KmAb가 키메라 mAb와 동일한 결합능력을 가지는 반면, NEWM V_H/REI V_KmAb는 대략 5배 낮은 친화도를 나타낸다는 사실을 보이고 있다. 비특이적인 인간 IgG1 mAb의 낮은 결합도는 인간화된 mAbs의 95%이상의 결합이 Fc 도메인 보다는 Fv 부분을 통해 이루어 진다는 사실을 나타내고 있다.

NEWM FR에 대한 추가의 변형은 결합친화성을 회복시킬 수 있는 반면에, 이는 원하지 않은 면역반응을 유발하는 신규의 에피토프를 생성시킬 수 있다. 따라서, H22로 명명된 상기 KOL V_H/REI V_KmAb가 추가의 결합특성의 조사를 위해 선택되었다.

mAbH22의 기능적인 특성확인

일련의 결합실험은 H22 항체의 특이성과 이소타입을 확립하기 위해 수행되었다. 플루오레세인과 접합된 M22 또는 H22로 염색된 말초혈 백혈구는 세포당 약 10⁴개의 결합부위를 가진 단핵세포에 대해 특이적 결합을 하고 있음이 입증되었다. 대조적으로 임파구 또는 자극되지 않은 호중구는 특이적 결합이 없거나 극소수이다 (표 1).

H22의 단핵세포에 대한 특이적 결합

항체	단핵세포	임파구	PMNs
M22	10,000a	1000	1000
H22	10,500	1000	1000

^a세포당 항체 부위, 복제물 평균값

M22와 동일한 부위에서 H22가 FcγRⅠ과 결합하고 Fc 결합도메인에서 리간드로서 결합한다는 사실을 입증하기 위해, 2개의 항-FcγRⅠ 쥐과동물의 mAb (M22 및 M32.2) 및 인간의 IgG1 mAb와의 경쟁실험이 수행되었다. 접합되지 않은 H22 및 M22를 FcγRⅠ상의 Fc 결합부위들을 포화시키는 과량의 인간 IgG의 존재하에서 플루오레세인화된 M22 또는 H22에 대한 결합에 대해 동등하게 경쟁시켰다. 예상대로 M22 보다는 FcγRⅠ상의 상이한 부위에 결합하는 항-FcγRⅠ 항체 M32.2는 M22-FITC와 경쟁할 수 없었다 (Guyre, P. M. 등 J. Immunol. 143:1650). 또한, H22에 의해 H22-FITC가 억제되고, 관련없는 인간의 IgG1 mAb에 의해서는 억제되지 않는 것은 H22의 V영역을 통한 FcγRⅠ 결합특이성을 확인해 주었다.

H22 (M22는 아님)는 플루오레세인화된 인간 IgG1에 의한 FcγRⅠ에 대한 Fc 매개된 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 이러한 실험은 H22 (M22는 아님)의 Fc 부분이 FcγRⅠ의 Fc 결합도메인에 결합한다는 사실을 입증하고 있다. 이는 고친화성을 가지고, FcγRⅠ과 결합하는 인간의 IgG1항체의 Fc 부분의 능력 (그러나, 쥐과동물의 IgG1은 아님)과 일치한다.

M22의 인간화가 첫째로 면역치료능력을 증가시키기 때문에, 단핵세포 및 사이토킨 활성화된 호중구에 대한 H22의 결합활성이 인간 혈청의 존재하에서 측정되었다. H22-FITC는 유사한 친화도를 가지고, 인간혈청의 존재 또는 부재하에서 단핵세포상의 FcγRⅠ에 결합하였다. 대조적으로, Fc 매개된 관련없는 인간의 IgG-FITC의 결합은 인간혈청에 의해 완전히 억제되었다. 마찬가지로, H22-FITC는 인간의 혈청의 존재 또는 부재하에 유사한 친화성을 가지고 IFN-γ로 처리된 호중구에 결합하였다. 결국, 상기 데이터는 H22가 V 영역을 통하여 Fc 결합도메인과 구별되는 부위에 결합되고, Fc 영역을 통하여 FcγRⅠ의 리간드 결합 도메인에 결합된다는 사실을 입증하고 있는 것이다. 전자의 결합활성은 인간의 IgG1의 항체 봉쇄를 효과적으로 극복한다.

H22 BsAb의 기능적 활성

면역치료를 위한 항 FcγRⅠ 항체의 제 1의 응용은 FcγRⅠ를 지닌 이펙터 세포를 종양세포, 바이러스 또는 바이러스로 감염된 세포와 연결하는 BsAb의 개발이다. 이러한 BsAb는 M22에 의해 개발되었고, 따라서, M22 항-종양 BsAb (520C×M22)와 대응되는 H22 BsAb (520C9×H22)간의 세포독성을 매개하는 능력의 비교가 이루어 졌다. 이들 BsAb는 항-HER2/neu 항체 (520C9)의 Fab'에 화학적으로 접합된 H22 또는 M22 Fab'로 구성되어 있고, 따라서 이펙터 세포 트리거 분자인 FcγRⅠ 및 종양항원에 대해 특이적이다.

M22 및 H22 유래의 BsAb는 ADCC 분석에 의해 비교되었다. M22 및 H22 유래의 BsAb는 HER2/neu를 과도하게 발현시키는 SKBR-3 세포의 사멸을 매개한다. 쥐과동물 및 인간화된 BsAb는 모두 항원을 지진 표적세포의 용균 수준이 유사함을 나타내었다. 또한, 양 BsAb는 인간 혈청의 존재하에서 ADCC 활성을 보유하는 반면에, 과량의 M22 F(ab')₂는 세포사멸의 완전한 억제를 나타내었다. 이러한 결과들을 종합하면, 상기 결과들은 H22 BsAb에 의해 유도된 용균은 M22 에피토프를 통하여 매개되며, ADCC는 FcγRⅠ특이적임을 나타낸다.

최종적으로 단핵세포 유사 세포주 U937에 의한 과산화물 생산을 자극하는 H22 및 M22의 능력이 평가되었다. V 영역을 통해서만 FcγRⅠ에 결합하는 M22는 매우 낮은 수준의 산소 폭발을 유도하는데, 이는 수용체와 효과적으로 교차결합하지 못하기 때문이다. 그러나, Fc 도메인을 통해 리간드로서, 그리고 Fv을 통해 항체로서 FcγRⅠ와 교차결합할 수 있는 H22는 과산화물의 상당한 방출을 유도하였다.

실시예 2

기능성 H22-표피생장인자 융합단백질의 생산

재료 및 방법

발현 벡터 및 클론닝

H22의 중쇄 (pSVgpt) 및 경쇄 (pSVhyg) 유전자 클론을 발현시키는 벡터는 하기의 문헌에 기술되어 있다 (국제특허출원 공개번호 WO 94/10332 Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes). Fab-리간드 융합 구성의 경우, 경쇄를 변형할 필요가 없다. 그러나, 중쇄의 경우 CH2 및 CH3 도메인은 제거되고 상기 리간드를 코드하는 서열로 대체되어야만 한다. 중쇄벡터는 2개의 BamHⅠ 부위를 포함하는데, VH 및 CH1 사이의 인트론에 하나, 그리고 CH3의 다운스트림에 다른 하나를 포함하고 있다. BamHⅠ 제한 부위를 사용하여, 불변도메인을 코드하는 DNA를 단지 CH1과 대부분의 힌지를 코드하는 양말단이 절단된 변형물로 대체시켰다. 이를 위해, 중합효소 연쇄반응법 (PCR)이 도 1에 도시된 변형을 갖는 중쇄단편의 새로운 C 말단을 조작하기 위해 이용되었다.

클론닝 제한 부위인 XhoⅠ 및 NotⅠ의 다운스트림에 위치한 번역종결코돈 및 VH의 다운스트림에 위치한 PCR로 생성된 신규의 CHⅠ단편을 클론하기 위해 사용된 BamHⅠ 부위의 업스트림으로 구성된, 도 1의 [C]에 도시된 구조물이 융합 단백질 구조를 생산하기 위해 사용되었다. Fd 및 리간드 도메인 사이의 유연성을 보유하기 위해 대부분의 힌지의 다운스트림에 위치한 클로닝 부위는 EGF 또는 다른 리간드를 코드하는 DNA를 삽입하는데 사용되었다. 또한, 단일의 시스테인 잔기는 앞선 구성으로부터 보유되어 이량체 분자를 형성하는 접합을 허용한다.

리간드를 코드하는 DNA는 코딩 영역의 N 말단에 XhoⅠ부위를 갖고, C 말단에 NotⅠ부위를 갖기 위해 PCR에 의해 증폭된 후, 적절한 리딩 프레임 (reading frame)에서 전술한 바와 같은 새롭게 조작된, 양말단이 절단된 H22 중쇄 단편의 동일부위로 삽입되었다. 표피 생장인자(EGF)를 코드하는 cDNA가 ATCC (#59957)로부터 얻어졌다. 약 1200잔기의 전구체로부터 얻어진 성숙한 EGF의 53개 아미노산을 코드하는 DNA만이 클론되었는데, 이의 아미노산 서열은 Asn 971에서 출발하여 Arg 1023에서 종료된다 (Bell, G.I., Fong, N.M., Stempien, M.M., Wormsted, MA., Caput, D., Ku. L., Urdea, M.S., Rall, L.B. Sanchez-Pescador, R. Human Epidermal Growth Factor Precursor: cDNA Sequence, Expression in Vitro and Gene Organization. Nucl. Acids Res. 14:8427-8446, 1986).

발현

쥐과동물의 골수종 NSO (ECACC 85110503)은 비-Ig 합성 세포주이며 융합단백질의 발현을 위해 사용되었다. 인-프레임(in frame)으로 EGF에 융합된 H22 Fd를 코드하는 DNA를 지닌 최종 발현벡터, pSVgpt 구조물 (도 2에 도시됨)을 바이오래드 진 펄서 (BioRad Gene Pulser)를 사용하여, 이미 H22 경쇄를 코드하는 DNA를 함유하는 pSVhyg 구조물로 트랜스펙션된 NSO에 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션시켰다. 이들 폴리펩티드들은 벡터내에 존재하는 Ig 프로모터 및 Ig 인핸서에 의해 발현되고 구조물의 N 말단에 위치하는 mAb22 중쇄 신호서열에 의해 분비되었다. 트랜스펙션 후 1일 또는 2일 후, 미코페놀산 및 크산틴이 배지에 첨가되어 상기 DNA를 취한 세포에 대한 선택되었다. 개개의 생장콜로니들이 분리되었고, 서브클론된 후 결합활성이 ELISA에 의해 입증되었다.

정제

H22-EGF 융합단백질을 발현하는 세포들이 서브클론된 후, 확장되었다. 상기 융합 단백질을 발현하는 세포는 확장되고 회전배양으로 생장되었으며, 상청액은 정화되고 농축되었다. 소규모 정제가 항 인간 카파사슬 친화성 칼럼상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었다 (Sterogene. Carlsbad, CA). 정제된 단백질은 비환원 조건하에서 5-15% 아크릴아미드 경사 겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 도 3은 항-Fc 수용체-리간드 융합단백질의 생성을 개략적으로 나타내는 도면이다.

양쪽 특이적 유동 세포계수법

융합단백질이 FcγRⅠ 및 EGFR 양자에 동시에 결합할 수 있음을 보이기 위해, 유동 세포계수법이 개발되었다 (도 4). 이 분석법에서, 상이한 농도의 H22-EGF 융합단백질 또는 양쪽 특이적 항체, BsAB H447 (H22×H425, 리간드 결합부위에서 EGFR에 결합하는 쥐과동물의 단일클론성 항체 M425의 인간화된 변형물)가 EGF 수용체 (EGFR)를 발현시키는 세포주, A431 세포 (ATCC, Rockville, MD)와 함께 인큐베이션되었다. 세척후, FcγRⅠ의 세포외 도메인과 인간 IgM의 Fc 부분으로 구성된 융합단백질을 포함하는 상청액이 첨가되었다. 최종적으로, mAb22에 의해 결합된 부위와는 구별되는 부위에서 FcγRⅠ와 결합하는 피코에리트린(PE)으로 표지된 mAb (32.3)가 첨가되었다. 그 다음, 세포는 FACSCAN으로 분석되었다. 다른 방법으로, EGFR에 대한 결합은 과량 (100μg/ml)의 전체 쥐과동물의 mAb 425 (E. Merck)으로 차폐되었고, BsAb 또는 융합단백질의 결합은 PE 표지된 항인간 IgG에 의해 검출되었다.

ADCC

융합단백질에 의해 매개된 ADCC는⁵¹Cr 사멸분석법에 의해 측정되었다. EGFR을 과도하게 발현시키는 세포주, A431은 24시간동안 γ-인터페론에서 배양된 인간 단핵세포에 의한 용균의 표적으로 사용되었다. 표적은 U자형 바닥의 미소적정 플레이트에서 이펙터 세포와 항체를 결합시키기 전에 100μCi의⁵¹Cr으로 1시간동안 표지되었다. 37℃에서 5시간동안 인큐베이션한 후, 상청액은 수집되고 방사능에 대해 분석되었다. 세포독성은 다음의 공식에 의해 계산되었다 : 용균 %=(실험 CPM-표적 누출 CPM/세정제 용균 CPM-표적 누출 CPM)×100%. 비용균(specific lysis)=항체에 의한 용균 %-항체없는 경우의 용균%. ADCC를 매개하는 융합단백질의 능력은 각각의 BsAb의 능력과 비교되었다. 또한 이러한 검사법은 IgG 또는 인간혈청에서 발견되는 다른 인자가 융합 단백질이 매개된 ADCC를 억제하지 않는다는 사실을 입증하기 위해 25% 인간혈청의 존재하에서 수행되었다.

결과

정제

H22 카파 사슬을 발현하는 NSO 세포를 H22-EGF 중쇄구조물로 트랙스펙션시켰고, 미코페놀산 및 크산틴에 대한 내성에 대해 선택된 클론들이 확장되었으며, 융합단백질은 상청액으로부터 항인간 카파 칼럼상에서 친화성 정제되었다 (Sterogene, Carlsbad, CA). 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 상기 정제된 단백질은 겉보기 분자량 50-55kDa으로 이동하였으며, 이는 융합단백질이 단량체로 발현되고, 이황화물 다리로 연결된 이량체가 아님을 나타내고 있다. 또한, 밴드는 겉보기 분자량 25kKa에서 확인되었고, 이는 결합되지 않은 경쇄인 것으로 보인다.

결합특이성

융합단백질이 FcγRⅠ 및 EGFR에 동시에 결합하는 것을 보이기 위해 양쪽 특이적 FACS 분석법이 고안되었다. 도 5는 하기 실시예 3에 기술된 바에 따라 제조된, 화학적으로 연결되고 완전히 인간화된 BsAb H447 (H22 (항 FcγRⅠ)×H425) 및 H22-EGF 융합단백질이 투여량 의존적인 방식으로 A431 세포상의 EGFR 및 가용성 FcγRⅠ에 결합함을 나타낸다.

융합단백질의 EGFR 특이성은 리간드 결합부위에서 EGFR과 결합하여 융합단백질 또는 H22×H425 결합을 억제하는, 쥐과동물의 mAb, M425의 능력에 의해 입증되었다. 다양한 농도의 BsAb H447 또는 H22-EGF 융합단백질이 과량의 M425 존재 또는 부재하에서 A431 세포와 함께 인큐베이션되었다. 도 6은 BsAb 및 융합단백질 모두의 결합이 M425에 의해 억제됨을 보이는 도면으로서, 이는 EGFR에 대한 융합단백질의 특이성을 입증하고 있다.

ADCC

ADCC를 매개하는 융합단백질의 능력은 표적으로서 A431을 사용하여 분석되었다. IFN-γ의 존재하에서 24시간동안 배양된 인간의 단핵세포는 이펙터 세포로서 사용되었다. 도 7은 전체 항체, 즉 H425, BsAb H447 (H22×H425) 및 융합단백질이 A431 세포의 투여량 의존적 용균을 매개함을 나타낸다. 도 8은 전체 항체에 의해 매개된 ADCC가 25% 인간혈청 (25% HS)에 의해 억제되는 반면에, 융합단백질에 의해 매개된 ADCC는 인간혈청에 의해 억제되지 않는다는 사실을 입증하고 있으며, 특정 실험에서는 융합단백질이 매개된 ADCC가 인간 혈청에 의해 증진되다는 것을 보이고 있다. 이러한 결과들은 생체내에 존재가능한 FcγRⅠ를 발현시키는 이펙터 세포의 존재하에서 조차도, 융합단백질이 EGFR을 과도하게 발현시키는 세포를 사멸시킬 수 있음을 입증하여 이들 분자의 임상적인 유용성을 지지해 준다.

H22-EGF 융합단백질의 생장억제 특성

EGF가 비록 수용체를 발현시키는 정상 세포의 생장을 자극하지만, EGF는 또한 EGF-R을 과도하게 발현시키는 종양세포의 생장을 억제할 수 있다 (Barnes, D.W., 1982, J. Cell Bio. 93:1, MacLeod, C.L. 등, 1986, J. Cell. Physiol. 127:175). EGF 및 H22-EGF 융합단백질의 A431 세포의 생장을 억제하는 능력은 아래와 같이 조사되었다.

2×10⁴개의 A431 세포들이 완전배지만의, 또는 다양한 농도의 EGF, H22-EGF, H22의 Fab 단편 또는 H425의 F(ab')₂단편을 함유하는 배지의 6개 웰플레이트에 첨가되었다. 생존세포들이 혈구계수기 (hemocytometer)를 사용하여 7일후 계수되었다. 분석은 이중으로 수행되었고, 평균 +/- 표준편차로서 기록되었다.

상기 결과는 도 9에 제시되어 있다. 이들 결과는 EGF 및 H22-EGF가 투여량 의존적 방식으로 유의적 수준으로 세포생장을 방해함을 나타낸다. 반면에, 고농도에서만 억제활성을 갖는 H425의 F(ab')₂단편 및 H22의 Fab 단편은 생장억제 활성을 갖고 있지 않았다.

따라서, H22-EGF는 FcγRⅠ 및 EGF에 동시에 결합할 수 있으며, 이는 상기 분자가 적절하게 구부러져서 동시에 양 수용체를 결합하는데 요구되는 유연성을 유지함을 나타낸다. 더욱이, H22-EGF는 EGF-R을 발현하는 종양세포주, A431의 증식을 억제하는데, 이는 EGF와 유사하게, 상기 H22-EGF 융합단백질이 EGF-R을 통하여 신호화할 수 있음을 나타낸다. 또한, H22-EGF는 FcγRⅠ를 발현시키는 이펙터 세포의 존재하에서 A431 세포의 강력한 사멸을 매개한다. 따라서, H22-EGF는 EGF-R을 발현하는 세포에 대해 세포독성 및 세포증식억제의 효과를 모두 매개한다. 종양을 가진 환자에게 H22-EGF를 투여하면, 체내의 자연 세포독성 이펙터 세포가 증강되어 세포독성, 생장억제 및 식세포작용의 세가지 방식으로 종양세포의 사멸을 매개하게 된다. 또한, 종양세포의 세포매개성 세포독성외에 H22-EGF에 의해 증강된 이펙터 세포는 염증성 사이토킨을 분비 및/또는 종양항원을 프로세싱하여 종양 특이적 T 세포에 제공함으로써 항 종양 면역을 추가로 강화할 수 있다.

실시예 3

종양세포 사멸을 매개하는 H22-헤레굴린 (H22-gp30) 융합단백질

헤레굴린 (HRG)은 HER3 및 HER4 분자에 대한 리간드이다. 이들 양 수용체 들은 일부 유방암 세포에서 과도하게 발현되는 분자인, HER2와 이종이량체를 형성할 수 있다. HER3 및 HER4에 대한 HRG의 친화성은 이들 분자들이 HER2와 이종이량체를 형성할 때 상당히 증가한다. 이러한 예는 헤레굴린 및 FcγRⅠ에 대한 결합특이성을 포함하는 양쪽 특이성 분자가 종양세포주의 생장을 억제하고, FcγRⅠ를 지닌 세포독성 이펙터 세포의 존재하에서 이들 세포들의 융합단백질 의존적인 세포독성을 매개함을 입증한다.

상기 H22-헤레굴린 융합단백질은 실시예 2에 기술된 H22-EGF 융합단백질과 동일한 방식으로 구성되었다. 간단히, 인간화된 항 FcγRⅠmAb, H22의 Fd 단편을 코드하는 게놈 DNA는 HRG의 β2형태의 EGF 도메인을 코드하는 cDNA와 융합되었다. H22-HRG 융합단백질의 아미노산 서열 (서열 4)은 도 10에 도시되어 있다. 이러한 융합단백질은 미국특허 제 5,367,060 호에 도시된 헤레굴린 β2의 아미노산 171-239를 포함한다. 또한, 미국특허 제 5,367,060 호에 개시된 헤레굴린 β2의 다른 부분 및 기타 헤레굴린 분자의 부분들이 사용될 수 있다. 생성된 H22Fd-HRG 발현벡터는 H22 카파경쇄를 코드하는 DNA를 함유하는 벡터에 의해 미리 트랜스펙션된 골수종 세포주로 트랜스펙션되었다. 생성된 융합단백질은 비록 H22 Fab 성분의 힌지영역에서 결합되지 않은 시스테인 잔기를 포함하지만, 주로 단량체로서 발현되었다.

유동 세포계수법은 융합단백질이 FcγR 발현세포 뿐만아니라 HER2를 과도하게 발현시키는 종양세포주인 SKBR-3에 결합할 수 있음을 보여 주고 있다.

H22Fd-HRG 융합단백질의 생물학적 활성을 시험하기 위해, 이러한 융합단백질을 발현시키는 골수종 세포로부터의 상청액을 3배 또는 30배 희석하였고, 단핵세포 대 표적 종양세포의 비율이 100:1이 되도록, IFN로 처리된 단핵세포의 존재하에서 HER2, HER3 및 HER4을 발현시키는 PC-3 세포 또는 SKBR-3 종양세포에 융합단백질을 첨가하였다. 단핵세포는 IFN-γ로 처리되고, 표적세포는 실시예 2에서 기술된 바대로⁵¹Cr으로 표지화하였다. 비용균(specific lysis)의 %는 실시예 2에 지시된 바와 같이 계산되었다. 결과는 도 11에 제시되어 있다. 상기 결과는 3배로 희석된 상청액으로 세포를 인큐베이션할 때, 약 45%의 SKBR3 세포 및 약 49%까지의 PC-3 세포들이 용균되었음을 나타낸다.

이러한 융합단백질은 SKBR-3 종양세포의 생장을 억제하고, FcγRⅠ를 지닌 세포독성 이펙터 세포의 존재하에서, 이들 세포들의 융합단백질 의존성 세포독성을 매개한다. 따라서, 이러한 실시예의 결과는 항 FcγRⅠ-헤레굴린 융합단백질이 생리학적 조건하에서 항종양 세포독성 활성을 매개할 수 있는 것을 보여 주고 있으며, 상기 융합단백질이 다양한 종양의 치료에 치료학적인 유용성을 가질 수 있음을 지적하고 있다.

실시예 4

종양세포 사멸을 매개하는 H22-봄베신 융합단백질

H22-봄베신 융합단백질은 전술한 H22-EGF 융합단백질과 유사하게 제조되었다. 그러나 봄베신은 짧은 펩티드 (14개 아미노산 잔기)이기 때문에, PCR기술을 사용하여 봄베신을 코드하는 cDNA를 증폭하는 대신에, 봄베신의 센스 및 안티센스 가닥을 코드하는 DNA 올리고머를 잡종화하여 코딩영역을 제조하였다. H22 항체의 중쇄의 카르복실기 말단에 융합된 봄베신 펩티드의 아미노산서열은 아래와 같다 :

-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Gly- (서열 5).

상기 서열 5는 봄베신의 2-14 아미노산에 해당하며 (Anastasi 등, 1971, Experientia 27:166), 상기 펩티드의 카르복실기 말단에 추가의 글리신 잔기를 포함한다. 상기 올리고머는 하이브리드하지는 않지만 N 말단에서 XhoⅠ부위를 위한 부착말단 (sticky end)과 C 말단에서 NotⅠ부위를 위한 부착말단을 형성하는, 중복말단을 가져서, 전술한 H22 중쇄 발현벡터로 클론될 수 있다.

H22-봄베신 융합단백질의 종양세포 사멸에 대한 생물학적 활성은 H22-EGF 및 H22-헤레굴린 융합단백질에 대해 전술한 바와 같이 조사되었다. 간단히, 봄베신 수용체를 지닌 PC-3 종양세포들은⁵¹Cr로 표지되고, 단핵세포 및 다양한 농도의 H22-융합단백질과 인큐베이션된 후, 전술한 바와 같이 융합단백질 의존성 용균이 측정되었다. 도 12에 도시된 결과들은 표적세포들이 용균되고, 표적세포 용균의 수준은 분석을 위해 첨가되는 융합단백질의 양과 비례하여 증가함을 나타내고 있다.

또한, 하나의 결합단위로서 H22, 제 2의 결합단위로서 CD4 (AIDS 저장소) 또는 gp120 (AIDS 저장소)를 갖는 융합 단백질을 제조하였다.

실시예 5

변형된 인간화된 항체 단편으로부터 양쪽 특이적 항체의 생산

재료 및 방법

발현 벡터 및 클론닝

H22의 중쇄 (pSVgpt) 및 경쇄 (pSVhyg) 유전자 클론을 발현시키는 벡터는 하기의 문헌에 기술되어 있다 (국제특허출원 공개번호 WO 94/10332 Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes). Fab' 구성의 경우, 경쇄를 변형할 필요가 없다. 그러나, 중쇄의 경우 CH2 및 CH3 도메인은 제거되고 종결코돈으로 대체되어야만 한다. 중쇄벡터는 2개의 BamHⅠ부위를 포함하는데, VH 및 CH1 사이의 인트론에 하나, 그리고 CH3의 다운스트림에 다른 하나를 포함하고 있다. BamHⅠ 제한 부위를 사용하여, 불변도메인을 코드하는 DNA를 단지 CH1과 대부분의 힌지를 코드하는 양말단이 절단된 변형물로 대체시켰다. 이를 위해, 중합효소 연쇄반응법 (PCR)이 도 1에 도시된 변형을 갖는 중쇄단편의 새로운 C 말단을 조작하기 위해 이용되었다. 도 1의 [B]는 양 말단이 절단된 단일의 술프히드릴기 변형물의 생성을 위한 변형을 도시하고 있다.

발현

쥐과동물의 골수종 NSO (ECACC 85110503)은 비-Ig 합성 세포주이며 변형된 H22 항체의 발현을 위해 사용되었다. H22 Fd를 코드하는 DNA를 지닌 최종 발현벡터인, pSVgpt 구조물을 바이오래드 진 펄서 (BioRad Gene Pulser)를 사용하여, H22 경쇄를 코드하는 DNA를 함유하는 pSVhyg 구조물과 함께 일렉트로포레이션에 의해 동시에 트랜스펙션시켰다. 이들 폴리펩티드들은 벡터내에 존재하는 Ig 프로모터 및 Ig 인핸서에 의해 발현되고 구조물의 N 말단에 위치하는 mAb22 중쇄 신호서열에 의해 분비되었다. 트랜스펙션 후 1일 또는 2일 후, 미코페놀산 및 크산틴이 배지에 첨가되어 상기 DNA를 취한 세포에 대한 선택되었다. 개개의 생장 콜로니들이 분리되었고, 서브클론된 후 FcγRⅠ 결합활성이 입증되었다.

정제

단일의 술프히드릴기 형태의 H22 항체 및 전체 H425 (항 EGFR) 항체가 각각 트랜스펙션된 NSO 세포의 시험관내 배양에 의해 제조되었다. H425는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 단일의 술프히드릴기 형태의 H22 항체는 Q-세파로즈와 후속하는 SP-세파로즈를 사용한 이온교환 크로마토그래프에 의해 정제되었다(Pharmacia, Piscataway, NJ). 단일의 술프히드릴기 형태의 H22 항체의 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가되었다.

양쪽 특이적 항체의 생산 (BsAb)

BsAb는 Glennie 등의 방법을 사용하여 구성하였다 (Glennie, M.J. 등, 1987, Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma)², antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragment, J. Immunol., 139:2367). H425의 F(ab')₂는 0.1M의 구연산염 완충용액 (pH 3.5)에서 펩신의 제한된 단백질 가수분해에 의해 생성되었고, 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 상기 mAb는 20mM의 머캅토에탄올아민(MEA)을 30℃에서 30분간 첨가하여 환원시켰다. 상기 Fab'단편을 50mM의 나트륨 아세테이트, 0.5mM의 EDTA, (pH 5.3, 4℃)에서 평형화된 세파덱스 G-25 칼럼에 적용시켰다. 디메틸 포름아미드에 용해되고 메탄올/얼음 배쓰에서 냉각된 오르토페닐렌디말레이미드 (o-PDM, 12mM)를 H22 Fab'에 절반(부피) 첨가한 후, 얼음에서 30분간 인큐베이션하였다. 그 다음, Fab'-말레이미드를 50mM의 나트륨 아세테이트, 0.5mM의 EDTA (pH 5.3, 4℃)에서 평형화된 세파덱스 G-25 칼럼상에서 결합되지 않은 o-PDM으로부터 분리하였다. BsAbs의 제조의 경우, 1.2:1의 몰비율로 H22 Fab'-말레이미드가 H425 Fab'에 첨가되었다. 반응물은 질소하에서 아미콘 챔버(4℃)에서 디아플로 막 (Diaflo membrane)을 사용하여 출발부피로 농축되었다. 18 시간후, pH는 1M 트리스-염산 (pH 8.0)을 사용하여 8.0으로 조정하였다. 그 다음 상기 혼합물을 10mM의 MEA로 환원시키고 (30℃에서 30분간), 25mM의 요오드아세트아미드로 알킬화하였다. 양쪽 특이적 F(ab')₂는 PBS에서 평형화된 슈퍼덱스 200 컬럼(Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해, 반응하지 않은 Fab'와 다른 생성물로부터 분리되었다.

양쪽 특이적 유동 세포계수법

DTNB법 및 o-PDM 법에 의해 생성된 BsAb가 FcγRⅠ 및 EGFR 양자에 동시에 결합할 수 있음을 보이기 위해, 유동 세포계수법이 개발되었다 (도 13). 이 분석법에서, 상이한 농도의 2개의 BsAb가 EGF 수용체 (EGFR)를 발현시키는 세포주, A431 세포와 함께 인큐베이션되었다. 세척후, FcγRⅠ의 세포외 도메인과 인간 IgM의 Fc 부분으로 구성된 융합단백질을 함유하는 상청액이 상기 세포와 함께 인큐베이션되었다. 최종적으로, FITC로 표지된 항인간 IgM에 특이적인 항체와 상기 세포를 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포는 FACSCAN으로 분석되었다.

ADCC

BsAb에 의해 매개된 ADCC는⁵¹Cr 사멸분석법에 의해 측정되었다. EGFR을 과도하게 발현시키는 세포주, A431은 24시간동안 γ-인터페론에서 배양된 인간 단핵세포에 의한 용균의 표적으로 사용되었다. 표적은 평편한 바닥의 미소적정 플레이트에서 이펙터 세포와 항체를 결합시키기 전에 100μCi의⁵¹Cr으로 1시간동안 표지되었다. 37℃에서 16시간동안 인큐베이션한 후, 상청액은 수집되고 방사능에 대해 분석되었다. 세포독성은 다음의 공식에 의해 계산되었다 : 용균 %=(실험 CPM-표적 누출 CPM/세정제 용균 CPM-표적 누출 CPM)×100%. 항체 의존성 용균=항체에 의한 용균 %-항체없는 경우의 용균%.

결과

정제

양말단이 절단된 H22 중쇄 구조물과 천연의 카파 사슬구조물로 NSO 세포를 동시에 트랙스펙션시켰다. 미코페놀산 및 크산틴에 대한 내성에 대해 선택된 클론들이 확장되었으며, 단백질은 Q-세파로즈 및 후속하는 SP 세파로즈 이온교환 크로마토그래프에 의해 상청액으로부터 정제되었다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 상기 정제된 단백질은 겉보기 분자량 50kDa으로 이동하였으며, 이는 융합단백질이 단량체로 발현되고, 이황화물 다리로 연결된 이량체가 아님을 나타내고 있다.

H425의 Fab'에 연결된 단일의 술프히드릴기 H22로 구성된 BsAb의 구성 및 특성확인 (항-EGFR)

단일의 술프히드릴기 형태의 H22가 H425, 인간화된 항-EGFR mAB의 Fab'단편에 연결된 BsAb가 구성되었다. 상기 BsAb는 Glennie 등의 방법에 의해 o-PDM을 링커로서 사용하여 생성되었다(Glennie, M.J. 등, 1987, Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma)², antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragment, J. Immunol., 139:2367). 이러한 BsAb의 활성은 펩신소화 및 전체 H22의 환원으로부터 제조된 Fab' 단편을 사용한 DTNB 방법에 의해 제조된 것과 비교되었다. 상기 BsAbs가 FcγRⅠ 및 EGFR에 동시에 결합한다는 사실을 보이기 위해, 양쪽 특이적 FACS 분석법이 고안되었다. 도 14는 o-PDM 연결된 BsAb와 DTNB법에 의해 제조된 BsAb 모두가 투여량 의존적인 방식으로 A431 세포상의 EGFR 및 가용성 FcγRⅠ에 동시에 결합함을 보이고 있다.

ADCC를 매개하는 2개의 BsAb의 능력은 표적으로서 A431을 사용하여 분석되었다. IFN-γ의 존재하에서 24시간동안 배양된 인간의 단핵세포는 이펙터 세포로서 사용되었다. 도 15는 비교되는 방식으로 2개의 BsAb가 A431 세포의 투여량 의존적인 용균을 매개함을 나타낸다. 이러한 결과들은 양 말단이 절단된, 단일의 술프히드릴기 형태의 H22로부터 생성된 BsAb가 FcγRⅠ를 발현시키는 이펙터 세포의 존재하에서, EGFR을 과도하게 발현시키는 세포를 사멸시킬 수 있음을 입증하고 있다.

실시예 6

삼중 특이적 항체의 제조

재료 및 방법

세포주 및 항체, M22, 520C9, H425, SKBR3 및 A431

M22 및 520C9가 이온교환 크로마토그래피에 의해 하이브리도마 상청액으로부터 정제되고 (Pharmacia, Piscataway, NJ), 520C9는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되었다 (Pharmacia, Piscataway, NJ). H425는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 하이브리도마 상청액으로부터 정제되었다 (Pharmacia, Piscataway, NJ). M22 및 520C9를 생산하는 쥐과동물의 하이브리도마는 앞서 기술된 바와 같다 (Guyre, P.M. 등, 1989, Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on FcγRⅠ are able to trigger receptor function. J. Immunol., 143:5, 1650-1655; Frankel 등, 1985, Tissue distribution of breast cancer-associated antigens defined by monoclonal antibodies, J. Biol. Response Modifiers, 4:273-286). 쥐과동물의 골수종 NSO (ECACC 85110503)는 비-Ig 합성세포주로서, 인간화된 mAbs, H425의 발현을 위해 사용되었다 (Kettleborough 등, 1991, Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR-grafting: the importance of framework residues on loop conformation, Protein Eng., 4:773). HER2/neu 프로토온코진을 과도하게 발현시키는 인간 유방암종 세포주인 SKBR-3 (ATCC, Rockville, MD) 및 EGFR을 과도하게 발현시키는 인간의 편평상피 암종세포주, A431 (ATCC, Rockville, MD)은 Iscove의 변형된 둘베코 배지 (IMDM, Gibco, Grand Island NY)에서 배양되었다.

호중구의 제조

호중구는 피콜 하이패크 경사분리법 (ficoll hypaque gradient separation, Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 단핵세포로부터 분리된다. FcγRⅠ를 상승 조절하기 위해서, 호중구는 사이토킨으로 처리하였다. 호중구는 2.5%의 정상 인간 혈청 AB형 (Sigma, St. Louis, MO), 50 ng/ml G-CSF (R. Repp, U. of Erlanger, Germany에 의해 제공) 및 100 IRU/ml의 IFN-γ을 함유하는 AIM V 배지 (Gibco, Grand Island, NY)에서 24-48시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양한다.

접합 방법 (콘쥬게이션 방법)

BsAb는 Glennie 등의 방법을 사용하여 구성하였다 (Glennie, M.J. 등, 1987, Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma)², antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragment, J. Immunol., 139:2367). mAbs M22 (항 HER2/neu,33) 및 H425 (항-EGFR) 항체는 시험관내에서 각각의 하이브리도마 세포의 배양에 의해 생산되었다. 각 항체의 F(ab')₂는 0.1M의 구연산염 완충용액 (pH 3.5)에서 펩신의 제한된 단백질 가수분해에 의해 생성되었고, 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 상기 mAb M22 및 H425는 20mM의 머캅토에탄올아민(MEA)을 30℃에서 30분간 첨가하여 Fab'로 환원시켰다. 상기 Fab'단편을 50mM의 나트륨 아세테이트, 0.5mM의 EDTA, (pH 5.3, 4℃)에서 평형화된 세파덱스 G-25 칼럼에 적용시켰다. 디메틸 포름아미드에 용해되고 메탄올/얼음 배쓰에서 냉각된 오르토페닐렌디말레이미드 (o-PDM, 12mM)를 쥐과동물의 22 Fab'에 절반(부피) 첨가한 후, 얼음에서 30분간 인큐베이션하였다. 그 다음, Fab'-말레이미드를 50mM의 나트륨 아세테이트, 0.5mM의 EDTA (pH 5.3, 4℃)에서 평형화된 세파덱스 G-25 칼럼상에서 결합되지 않은 o-PDM으로부터 분리하였다. BsAbs의 제조의 경우, 1:1의 몰비율로 M22 Fab'-말레이미드가 H425 Fab'에 첨가되었다. 반응물은 질소하에서 아미콘 챔버(4℃)에서 디아플로 막 (Diaflo membrane)을 사용하여 출발부피로 농축되었다. 18 시간후, pH는 1M 트리스-염산 (pH 8.0)을 사용하여 8.0으로 조정하였다. 그 다음 상기 혼합물을 10mM의 MEA로 환원시키고 (30℃에서 30분간), 25mM의 요오드아세트아미드로 알킬화하였다. 양쪽 특이적 F(ab')₂는 인산염 완충용액 (PBS)에서 평형화된 슈퍼덱스 200 컬럼(Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해, 반응하지 않은 Fab'와 다른 생성물로부터 분리되었다. BsAb M22×520C9는 520C9가 H425 대신에 사용된 것을 제외하고는 유사한 방식으로 제조되었다.

M22×H425×520C9로 구성된 삼중 특이적 항체는 2단계로 제조되었다 (도 16). 제 1 단계에서, M22는 전술한 바와 같이 H425에 연결되어 M22×H425 BsAb가 제조되었는데, 상기 반응물은 마지막 단계에서 환원 및 알킬화되기 보다는 잔존하는 연결되지 않은 술프히드릴 그룹을 차폐시키기 위해 DTNB로 처리되었다. 이가의 BsAb가 슈퍼덱스 200 칼럼상에서 젤 여과법에 의해 정제되고, F(ab')₂(SH)로 환원되었으며, o-PDM으로 처리된 520C9와 1:1의 몰비율로 혼합되었다. 생성된 삼중 특이적 F(ab)₃은 슈퍼덱스 200 칼럼상에서 정제되었다. TsAb는 TSK 3000 칼럼 (ToJo Haas, Japan)을 사용한 HPLC 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 상기와 같은 동일한 과정을 사용하여 m22 Fab'×32.3 Fab'×m22Fab'를 포함하는 다른 TsAb가 구성되었다.

양쪽 특이적 유동 세포계수법

TsAb는 EGFR 및 FcγRⅠ에 동시에 결합하거나, HER2/neu 및 FcγRⅠ에 동시에 결합할 수 있다. A431 세포 (EGFR을 고도로 발현시키는 세포) 또는 SKBR-3 세포 (HER2/neu를 고도로 발현시키는 세포)가 다양한 농도의 BsAb (M22×520C9 또는 M22×H425) 또는 TsAb (M22×H425×520C9)와 함께 인큐베이션되었다. 상기 세포들을 세척한 후, 가용성 FcγRⅠ와 인큐베이션하였다. 가용성 FcγRⅠ 결합을 22 결합부위와는 구별되는 부위에서 FcγRⅠ와 결합하는 mAb 32.2-FITC로 검출하였다. 그 다음, 세포는 FACSCAN으로 분석되었다.

ADCC

SKBR-3 세포 또는 A431 세포가 사이토킨 활성화된 호중구에 의한 용균의 표적으로 사용되었다. 표적은 U자형 바닥의 미소적정 플레이트에서 이펙터 세포와 항체를 결합시키기 전에 100μCi의⁵¹Cr으로 1시간동안 표지되었다. 37℃에서 16시간동안 인큐베이션한 후, 상청액은 수집되고 방사능에 대해 분석되었다. 세포독성은 다음의 공식에 의해 계산되었다 : 용균 %=(실험 CPM-표적 누출 CPM/세정제 용균 CPM-표적 누출 CPM)×100%. 비용균(specific lysis)=항체에 의한 용균 %-항체없는 경우의 용균%. 분석은 삼중으로 실행되었다.

FcγRⅠ 조절 분석법

M22×32.2×M22 BsAb는 전혈의 단핵세포상에서의 FcγRⅠ의 조절을 위해 사용되었다. 이 분석과정은 동봉된 흐름도에 도시되어 있다 (도 23a 참조). 도 23b는 10μg/ml의 BsAb로 처리하면 단핵세포상의 FcγRⅠ 발현이 BsAB 처리전에 비해 약 50% 수준으로 감소함을 나타내고 있다.

결과

TsAb의 구성 및 생화학적 특성확인

TsAb는 도 16에 묘사된 흐름도에 따라 제조되었다. 상기 과정의 제 1 단계에서, M22는 DTNB로 처리된 H425와 커플되며, 생성된 양쪽 특이적 F(ab')₂는 겔 여과법에 의해 정제하였다. 제 2 단계에서, 양쪽 특이적 F(ab')2는 환원되고, o-PDM으로 처리된 520C9 Fab' 단편과 혼합되어 TsAb인 M22×H425×520C9이 생성되었다. 이 TsAb는 도 17에 개략적으로 묘사되어 있다. 상기 도면에서, Fab'-A는 M22를 나타내고, Fab'-B는 H425를 나타내며, Fab'C는 520C9를 나타낸다.

결합 (Bs FACS)

TsAb인 M22×H425×520C9이 FcγRⅠ 및 HER2/neu에 동시에 결합하는 것을 보이기 위해 양쪽 특이적 FACS 분석법이 고안되었다. 이 분석법은 도 18a에 개략적으로 묘사되어 있다. 도 19는 TsAb가 투여량 의존적인 방식으로 SKBR-3 세포상의 HER2/neu 및 가용성 FcγRⅠ에 동시에 결합함을 나타낸다. 상기 분석에서, BsAb인 M22×H425는 광범위한 영역의 농도에 대해 무시가능한 신호를 발생시켰다. TsAb인 M22×H425×520C9가 FcγRⅠ 및 EGFR에 동시에 결합할 수 있음을 입증하기 위해, EGFR을 과도하게 발현시키는 세포주인 A431을 사용한 유사한 분석법이 고안되었다. 이 분석법은 도 18b에 개략적으로 묘사되어 있다. 도 20은 TsAb 및 BsAb, M22×H425가 투여량 의존적 방식으로 A431 세포상의 EGFR 및 가용성 FcγRⅠ에 동시에 결합함을 보이고 있다. 상기 분석법에서 BsAb, M22×520C9는 광범위한 영역의 농도에 대해 무시가능한 신호를 발생시켰다.

ADCC

ADCC를 매개하는 TsAb의 능력은 표적으로서 SKBR-3 또는 A431을 사용하여 분석되었다. IFN-γ 및 G-SF의 존재하에서 24-48 시간동안 배양된 인간의 단핵세포는 이펙터 세포로서 사용되었다. 도 21은 BsAb, H22×520C9 및 TsAb, M22×H425×520C9 모두가 SKBR-3 세포의 용균을 매개하는 반면에, BsAb, M22×H425는 그렇지 않음을 나타낸다. 이에 반해서, 도 22는 BsAb, M22×H425 및 TsAb는 SKBR-3 세포의 용균을 매개하는 반면에, BsAb, M22×520C9는 그렇지 않음을 나타낸다. 이러한 결과들은 FcγRⅠ를 발현시키는 이펙터 세포의 존재하에서, TsAb가 HER2/neu 및 EGFR을 과도하게 발현시키는 세포를 사멸시킬 수 있음을 입증하고 있다.

전술한 삼중 특이적 항체는 M22, 쥐과동물의 항-FcγRⅠ mAb의 변형물을 포함한다. 이러한 삼중 특이적 항체는 단일의 술프히드릴기 형태의 인간화된 항-FcγRⅠ mAb, H22를 사용하여 제조될 수 있다. 유일한 차이는 단일의 술프히드릴기 형태가 상기 항체의 F(ab')₂단편으로서 분비된다는 것이다. 단일의 술프히드릴기 형태는 Q-세파로즈 및 후속하는 SP-세파로즈 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용한 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 배양액 상청액으로부터 정제된다. 일단 단일의 술프히드릴기 형태의 H22가 정제되면, 이러한 시약을 이용한 삼중 특이적 항체의 제작은 전술한 바와 같은 M22의 F(ab')₂를 사용한 경우와 동일하다.

실시예 7

H22-항원 융합 단백질에 의해 증진된 항원제공성

본 실시예는 항-FcγRⅠ 항체의 불변영역으로 이식된 항원 펩티드가 일반적으로 항원단독에 비해 항원의 항원제공성 및 T 세포 자극에 상당히 효율적임을 입증하고, 아울러 항-FcγRⅠ의 불변영역으로 이식된 길항 펩티드가 일반적으로 길항 펩티드 단독에 비해 T 세포 자극억제에 상당히 효율적임을 입증하고 있다. 따라서, 이러한 융합단백질은 생체내에서 항원제공세포 (APCs)에 펩티드 전달을 효과적으로 증가시키고, 다양한 치료방법에서 유용하다.

재료 및 방법

시약

AIM V (GIBCO, Grand Island, NY)가 배지로서 사용되었다. 파상풍 톡소이드 (TT)는 Accuracte Chemical Co. (Westbury, NY)에서 구입하였다. 멸균되고 낮은 내독소의 마우스 항-FcγRⅠ mAb 22의 F(ab')₂단편 및 양쪽 특이적 Ab, MDXH210 (항-Her2/neu 종양항원 mAb 520C9에 화학적으로 연결된 인간화된 Ab 22의 Fab'로 구성)은 메다렉스 인코포레이티드 (MEDAREX, INC. Annandale, NJ)에 의해 제공된다. TT의 범용 Th 에피토프인 TT830-844 (QYIKANSKFIGITEL (서열 6), 이하, TT830이라고 칭함 ; Valmori D 등, 1994, J. Immunol. 152:2921-29 참조) 및 상기 에피토프의 돌연변이 형태인 TT833S (QYISANSKFIGITEL (서열 9), 833 위치에서 리신이 세린으로 변경)는 PEPTIDOGENIC CO. (Livermore, CA)에 의해 합성되어 95% 이상으로 정제되었다. 다른 TT의 범용 Th 에피토프인, TT947-967 (FNNFTVSF WLRVPKVSASHLE (서열 12), 이하, TT947이라고 칭함, 80% 이상의 순도, 상기 문헌 Valmori. D 참조)는 본 연구에서 대조 펩티드로서 사용되었다. 정맥내 주사 (IVI)를 위한 구입가능한 인간의 IgG는 차폐 실험에서 사용되었다.

세포

FcγRⅠ을 발현하는 단핵세포주인 U937는 ATCC에서 입수하였다. CD4⁺, 펩티드 TT830에 특이적인 T 세포를 제조하는 방법은 앞서 기술한 TT 특이적인 세포주의 프로토콜로부터 변형되었다 (Gosselin E.J., 1992, J.Immunol. 149:3477-81). 간단히, 단핵세포는 피콜 하이패크 (Ficoll Hypaque)를 사용하여 말초혈로부터 분리하였다. 150×10⁶개의 단핵세포가 50ml의 AIM V 배지에서 10μM의 TT830으로 자극되었다. 5% CO₂인큐베이터에서 37℃에서 3일간 인큐베이션한 후, HEPES로 완충된 RPMI로 플라스크 1X를 세척하여 부착되지 않은 것들 (대부분 비-특이적인 세포)을 제거하였는데, 이때 부착성 단핵세포와 함께 특이적 T 세포 콜로니들은 플라스크에 잔존하였다. 20U/ml의 인간 IL-2 (IMMUNEX, Seattle WA)이 더해진 50 ml의 AIM V 및 1 ml (최종농도 2%)의 집단화된 인간혈청이 상기 플라스크에 첨가되었다. 전체 인큐베이션 10-14 일후, T 세포를 수확하고, 죽은 세포들을 피콜 하이패크에 의해 펠릿화하여, 고도로 풍부하게 된, 생존 CD4⁺, 항원특이적인 T 세포 집단 (95%-98%)을 수득하였다. 상기 T 세포들은 도 3에 도시된 바와 같이 TT830 펩티드에 대해 특이적임이 확인되었다. 다량의 단핵세포들을 저온 응집법 (Mentzer S.J. 등, 1986, Cell. Immunol. 101:132)를 사용하여 류코포레시스 팩 (leukophoresis packs)으로부터 정제하였다 (순도는 80%-90%). 단핵세포 및 T 세포 모두 나중에 사용하기 위해 나누어 냉각하였고 해동시 이들은 정상적인 기능을 나타내었다.

항원 제공 분석법

증식분석법에서, T 세포 (5×10⁴), 조사된 단핵세포 (3000rad, 10⁵/웰) 및 다양한 농도의 펩티드 TT830 융합단백질 Fab22-TT830을 웰당 최종부피가 200㎕가 되도록 편평한 바닥의 96-웰 조직 배양플레이트에서 2일간 인큐베이션하였다. 10㎕의³H-티미딘 (1μCi/웰)이 각각의 웰에 첨가되었다. 밤새 인큐베이션 한 후, 플레이트에서 세포를 수확하고 액체섬광계수기에서 계수하였다. T 세포증식은 3개의 레플리카의 평균 CPM 값±SD로 표현되었다. 바탕 CPM (항원이 없는 T 세포와 단핵세포)은 모든 데이터 값에서 공제되었다. APL에 의한 실험은 Sette 등이 발표한 프로토콜과 유사하게 실행되었다 (De Magistris, 1992, Cell 68:625). 억제분석을 위해, 간단히, 조사된 단핵세포가 다양한 농도의 TT 833S 또는 Fab 22-TT833S로 밤새 처리되었다. 그 다음, 20nM의 TT830 및 T세포가 첨가되었다. 추가의 2일간의 인큐베이션 후에, T 세포 증식은 전술한 바와 같이 측정되었다. 프리-펄스 (pre-pulsing) 실험에서, 조사된 단핵세포는 10μM의 TT833S 또는 0.1μM의 Fab22-TT833S의 첨가전에 20nM의 TT830로 4시간 펄스화하였다. 밤새 인큐베이션 한 후, T 세포가 첨가되었다. 추가의 2일간의 인큐베이션후, T 세포는 조사된 단핵세포 및 TT833S 또는 Fab22-TT833S로 하루동안 자극되었으며, 피콜 하이패크에 대한 원심분리 후 회수되고, 단핵세포 및 다양한 농도의 TT830으로 2일간 재자극되었다. 그 다음, T 세포 증식은³H-티미딘 혼입에 의해 측정되었고, 3개의 레플리카의 평균 CPM이 플롯팅되었다. 어떤 경우에는, 억제의 백분율이 다음의 공식에 의해 계산되었다: 억제%=(CPM_{억제제없음}-CPM_억제제)/CPM_{억제제 없음}×100. 모든 실험은 3회이상 반복되었다.

염색 및 유동 세포계수법

염색과정은 전술한 방법으로부터 개조되었다 (Gosselin E.J. 등, 1990, J.Immunol. 144:1817-22). 간단히, 4℃에서 96웰 플레이트의 각각의 웰에 가변농도의 Fab22-TT830, Fab22-TT833S, 또는 BsAb MDXH210 중의 하나의 단백질을 함유하는 30㎕의 RPMI+1mg/ml의 BSA가 첨가되었다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한후, 플레이트를 원심분리하고, 상청액은 버린 후, 세포를 4℃에서 PBS/BSA로 3회 세척하였다. 그 다음, 세포를 웰당 40㎕의 FITC 표지된 F(ab')₂염소의 항인간 IgG로 1시간 동안 인큐베이션한 후 (JACKSON IMMUNORESEARCH LABORATORIES, INC. West Grove, PA), PBS/BSA로 3회 세척하고, 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS/BSA에서 재현탁하였다 (KODAK, Rochester, NJ). 그 다음, 세포들은 FACSan (BECTON DICKINSON CO., Mountain View, CA)에 의해 조사된 후, 평균 형광세기가 (MFI)가 측정되었다.

사이토킨 측정

항원제공 분석에서 2일간 자극된 후의 96웰 플레이트로부터 상청액을 수집하고 사용을 위해 냉동시켰다. 이들 시료들의 IFN-γ 및 IL-4 수준이 특이적 ELISA에 의해 측정되었다. IFN-γ 및 IL-4 특이적인 ELISA의 항체 쌍은 PHARMINGEN (San Diego, CA)로부터 구입하였다. ELISA 분석법은 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 실행되었다.

H22-TT 펩티드 융합단백질의 생성

융합단백질 Fab22-TT830 및 Fab22-TT833S을 생성하기 위해, 하기 기술된 방법에 따라 각각의 펩티드를 코드하는 합성 올리고누클레오티드는 개별적으로 인간화된 항-FcγRⅠ mAb22 (H22)의 중쇄에서의 힌지영역에 조작이 가해졌다.

발현 및 클론닝 벡터

mAb22은 CDR 영역을 인간의 IgG1 프레임워크로 이식하여 인간화되었다 (상기 참조, Graziano R.F.등, 1995, J. Immunol. 155:4996-5002). H22의 중쇄 (pSVgpt)의 유전자 클론을 위한 발현벡터가 변형되어, 다른 분자(본원에서는 TT 펩티드)를 코딩하는 서열의 통합을 허용하게 된다. CH1, 힌지 및 새로이 조작된 XhoⅠ 및 NotⅠ 클론닝 부위를 포함하는 본 벡터의 BamHⅠ단편은 pUC19의 BamHⅠ으로 삽입되어 pUC19/H22CH1(X+N)을 생성하게 된다 (도 2 참조). 이러한 벡터는 하기에 기술되는 바와 같이 TT 펩티드를 코드하는 올리고누클레오티드 서열을 클론하는데 사용되었다.

파상풍 독소 (TT)를 코드하는 올리고누클레오티드 서열은 코딩영역의 N-말단에 XhoⅠ 부위 및 C-말단에 NotⅠ 부위를 갖도록 디지인되었다 (도 24a). 이러한 올리고누클레오티드 서열은 GENOSYS Biotechnologies (The Woodlands, TX)에 의해 합성되고 정제되었다. 그 다음, 합성 올리고누클레오티드는 어닐링되고, 클론닝 벡터 pUC19/H22CH1(X+N)로 연결되었다. TT 펩티드를 코딩하는 서열이 통합된 클론은 제한지도에 의해 선별되었다. CH1, 힌지 및 TT830 또는 TT833S를 함유하는 BamHⅠ 단편은 pUC19로부터 절단되고, 이미 VH를 함유하는 발현벡터로 삽입되었다. TT 펩티드와 융합된 H22 중쇄의 최종 발현구조물은 도 24b에 도시되어 있다.

H22-TT 융합단백질의 발현

쥐과동물의 골수종 NSO (ECACC 85110503)은 비-Ig 합성 세포주이며 H22-TT 융합단백질의 발현을 위해 사용되었다. 최초, NSO 세포는 H22 경쇄를 코드하는 서열을 함유하는 pSVhyg 벡터로 트랜스펙션시켰다. 그 다음, H22경쇄를 발현시키는 NSO 세포가 인-프레임(in frame)으로 TT 코딩서열에 융합된 H22 중쇄 Fd서열을 함유하는 발현벡터로 트랜스펙션되었다 (도 24b). 트랜스펙션을 위해 200 볼트 및 960μF을 채택하는 바이오래드 진 펄서 일렉트로포레이션 기구(BioRad Gene Pulser electroporation apparatus)가 사용되었다. 트랜스펙션 후 1일 또는 2일 후, 미코페놀산 (0.8μg/ml; SIGMA)및 크산틴(2.5μg/ml; SIGMA)이 배지에 첨가되어 상기 발현벡터를 성공적으로 취한 트랜스펙턴트(transfectant)에 대해 선택되었다. 유동 세포계수법에 의해 입증된 바와 같이 U937 세포상의 FcγRⅠ에 대한 배양 상청액의 결합활성에 기초하여 개개의 콜로니들이 분리되었다. 양성클로니들은 제한된 희석에 의해 서브클론되었다.

Fab22-TT 융합단백질의 정제

Fab22-TT830 융합단백질을 발현하는 클론 pW5 및 Fab22-TT833S 융합단백질을 발현하는 클론 pM4가 회전병 배양에서 확장되었다. 상청액은 정화되고 농축되었다. 소규모 정제가 항-H22 친화성 칼럼상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 비환원 조건하에서 5-10% 아크릴아미드 경사겔의 SDS-PAGE는 융합단백질의 순도가 90% 이상이고 예상되는 바대로 50kDa의 분자량을 갖는 것을 보여주고 있다. 단백질 농도는 IgG Fab'의 흡광계수가 1.53인 것을 사용하여 280nm에서의 흡광도에 의해 결정되었다.

결과

U937 세포에 결합하는 H22Fd-TT 융합단백질

최초, H22 융합단백질, Fab22-TT830 및 Fab22-TT833S의 FcγRⅠ에 대한 결합능력이 조사되었다. 앞서 기술하였으며, 동일한 FcγRⅠ 결합성분 (인간화된 mAb22의 Fab')을 포함하는 양쪽 특이적 Ab, MDXH210가 양성 대조군으로 사용되었다 (Valone F.H. 등, 1995, J.Clin. Oncol. 13:2281-92). 일정하게 FcγRⅠ를 발현시키는 U937 세포에 대한 융합단백질 및 MDXH210의 결합은 인간 IgG에 대해 특이적인 FITC로 표지된 염소항체의 염색 및 유동 세포계수법에 의해 측정되었다. 도 24a 및 도 24b에 지시된 바와 같이 융합단백질 Fab22-TT830 및 Fab22-TT833S는 MDXH210의 경우와 유사한 투여량 의존적인 방식으로 U937 세포에 결합하였다. 융합단백질의 결합은 쥐과동물의 항인간 FcγRⅠ mAb22 F(ab')2에 의해 완전히 차폐되었으며, 이는 FcγRⅠ에 대한 융합단백질의 특이성을 입증하는 것이다.

TT 펩티드의 제공을 100-1000배 증진시키는 H22Fd-TT 융합단백질

융합단백질인 Fab22-TT830은 H22의 불변영역에서 Th 에피토프인 TT830이 발현되었을 때, 단핵세포에 의해 자가의 T 세포에 상기 에피토프가 효과적으로 제공될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 항원제공분석법에 사용되었다. 도 26에 도시돤 바와 같이, 동일한 T 세포의 증식수준을 달성하기 위해 TT830 펩티드 단독의 경우 보다 약 1000배 적은 Fab22-T830이 요구된다. 또한, 도 26은 Fab22-TT830의 제공이 천연 TT의 제공 보다 약 10,000배 효율적임을 나타내는데, 이는 TT830 펩티드와 대조적으로, 증진된 Fab22-TT830의 제공이 고분자량 뿐만아니라 증가된 안정성에 기인하는 것임을 암시한다. 다른 항원성 TT 에피토프인 TT947은 T 세포를 자극하는데 실패하였는데, 이는 T 세포가 TT830 펩티드에 특이적임을 확인해 준다. 따라서, 이러한 결과들은 H22의 불변영역에서 발현되는 Th 에피토프가 효과적으로 그리고 특이적으로 제공됨을 입증하는 명백한 증거를 제공한다.

H22Fd-TT 융합단백질의 항원제공성 증진을 없애는 단핵세포상에서의 FcγRⅠ의 봉쇄

융합단백질의 사용을 통한 펩티드 제공의 증진이 FcγRⅠ매개된 것인지를 직접 결정하기 위해, Fab22-TT830 또는 TT830 펩티드의 첨가 전에 항원제공성 단핵세포상의 FcγRⅠ에 대한 Fab22-TT830의 결합을 1시간동안 단핵세포를 mAb22 F(ab')₂로 처리하여 차페시켰다. 융합단백질에 의한 펩티드 제공증진은 mAb22 F(ab')₂에 의해 없어진 반면에, TT830의 제공은 영향을 받지 않았다 (도 27). mAb22 F(ab')₂의 FcγRⅠ에 대한 결합이 자유 펩티드의 제공증진을 유도하지 않는다는 사실은 FcγRⅠ에 대한 mAb 22의 결합만으로는 항원제공성을 향상시키도록 단핵세포의 기능적 상태가 변경되지 않음을 암시한다. 따라서, 펩티드의 항 FcγRⅠ Ab22에 대한 연결은 항원제공성에 대한 영향을 증진시키는데 필수적인 것으로 보이며, 이는 향상된 제공성이 아마도 FcγRⅠ을 통한 효율적인 항원포획의 결과임을 암시하고 있다.

인간 IgG의 존재에 의해 영향받지 않는, H22에 의한 펩티드 제공성의 증진

생리학적 조건하에서, FcγRⅠ의 리간드 결합 도메인은 상기 수용체에 대한 항원항체의 효과적인 표적화를 차폐하는 IgG에 의해 포화된다. FcγRⅠ 기능을 촉발하기 위해 mAb22의 유도체를 사용하는 독특한 장점은 Ab22이 리간드 결합 도메인 바깥쪽에서 에피토프에 결합한다는 것이다. 따라서, ADCC, 식세포작용 및 항원제공과 같이 mAB22에 의해 촉발되는 기능들은 IgG의 생리학적 수준에 의해 억제되지 않는다 (Gosselin E.J., 상기 문헌참조, Guyre P.M., 1989, J.Immunol. 143:1650-55). 유사하게, 융합단백질 Fab22-TT830을 사용한 TT830 펩티드의 제공성 증진은 IgG에 의해 억제되지 않으며 (도 28), 이는 H22를 기본으로 하는 융합단백질이 펩티드 항원들을 생체내에서 FcγRⅠ에 표적화시키는 효과적인 방법임을 암시한다.

H22Fd-TT 융합단백질에 의해 증진된 항원제공 이후의 IFN-γ 및 IL-4의 증가된 생산

활성화시, T 세포는 증식을 통해 클론의 확장을 진행할 뿐만아니라 IFN-γ 및 IL-4와 같은 사이토킨을 생산하여 B 세포의 분화와 단핵세포 활성화라는 이펙터 기능을 발휘하게 된다 (Paul W.E. 및 Seder, R.A., 1994, Cell 76:241-251). 따라서, H22 융합단백질로 증진된 항원제공 이후의 IFN-γ 및 IL-4의 생산이 조사되었다. 도 28a 및 도 28b에 도시된 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 생산수준 모두는 Fab22-TT830에 의해 향상되었는데, 특히 항원농도가 준적정 농도인 경우 향상되었다. 그러나, 이러한 실험에서 사이토킨 생산의 증진(약 20배)은 T 세포 증식 (약 600배)에 비해 적었다.

따라서, 항-FcγRⅠ mAb H22의 불변영역에서 발현되는 Th 에피토프가 효과적으로 프로세스되어, 인간의 단핵세포에 의해 제공될 수 있으며, 이는 증진된 T 세포의 활성화 및 사이토킨 생산을 유도하게 된다.

T 세포증식을 자극하는데 실패한 APL, TT833S 및 Fab22-TT833S의 제공

천연 T 세포 에피토프의 하나 또는 두 개의 아미노산 변경을 포함하는 펩티드 (Allen 및 그의 동료에 의해 변형된 펩티드 리간드이며 ALP로 명명)는 T 세포활성에 대해 애고니스트, 부분적 애고니스트 또는 길항제로 작용함이 입증되었다 (Sette 등, 1994, Ann. Rev. Immunol. 12:413 및 Evavlold 등, 1993, Immunol. Today 14:602) .어떤 경우에는 TCR을 통한 특이적 T 세포의 APL 인지는 부분적인 신호 도입을 촉발하여 초항원(superantigen)에 의한 T 세포자극(Evavlold 등, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2300), T 세포 아네르기 (Sloan-Lancaster 등, 1993, Nature 363:156 및 Sloan-Lancaster 등, 1994, J.Exp. Med. 185:1195), 또는 Th1/Th2 분화의 조절 (Nicholson 등, 1995, Immunity 3:397; Pfeiffer 등, 1995, J.Exp. Med. 181:1569; 및 Windhagen 등, 1995, Immunity 2:373)을 억제하게 된다. 부분적 애고니스트는 T 세포에 의한 IL-4생산과 같이 일부 T 세포 기능을 자극하지만, T 세포증식과 같은 다른 기능들은 자극하지 않는 것으로 입증되었다 (Evabold 등, 1991, Science 252:1308). 또한, 부분적인 애고니스트는 아네르기를 유도할 수 있다. 일정한 APL은 TCR와 상호작용할 때 검출가능한 신호화 사건을 촉발하지 않고, 야생형 펩티드 항원에 반응하는 T 세포증식을 억제하는 TCR 길항제로서 작용할 수 있다. 따라서, 이것은 TCR 길항제로서 명명된다 (De Magistris 등, 1992, Cell 68:625 및 Ruppert 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2671).

본 예는 파상풍 독소의 T 세포 에피토프 TT830에 대한 길항 펩티드인 펩티드 TT833S 및 Fab22-TT833S가 T 세포증식을 자극하는데 실패하였음을 입증하고 있다. 도 30에 도시된 바대로, 100μM의 TT833S 및 1μM의 Fab22-TT833S의 고농도의 투여량에서 조차 TT830 특이적인 세포의 상당한 증식은 관찰되지 않았다. 이는 833위치에서 리신을 세린으로 변경한 것이 이러한 T 세포 에피토프의 T 세포 반응성을 없앤 것을 나타내고 있다. 또한, 펩티드 TT830 및 TT833S가 동시에 TT833 특이적 T 세포에 제공된 경우, TT830에 반응하는 T 세포증식은 투여량 의존적인 방식으로 TT833S에 의해 억제되었으며, 이는 TT833S가 TT830 특이적 T 세포에 대해 길항제로서 작용할 수 있음을 보이고 있다 (도 31).

T 세포활성화를 억제하는데 있어서 TT833S 보다 100배 이상의 효율을 나타내는 Fab22-TT833S

본 예는 TT830에 반응하는 T 세포 증식의 억제에 있어서, TT833S 및 Fab22-TT833S의 상대적인 효율을 비교하는 것이다. 도 32에 도시된 바와 같이, Fab22-TT833S는 TT830으로 자극된 T 세포증식을 억제하는데 있어서, TT833S 보다 약 100배 이상 효율적이었다. 이는 mAb H22의 불변영역에서 발현되었을 때, APL, TT833S가 APC에 의해 정확하게 그리고 효과적으로 제공될 수 있음을 암시한다. T 세포증식에 대한 융합단백질 Fab22-TT833S의 증가된 길항효율은 아마도 자유 펩티드에 비교하여 보다 효율적인 FcγRⅠ에 의해 매개된 항원포획을 반영하는 것이다.

MHC 클래스Ⅱ 결합 보다는 T 세포 수용체 결합에 대한 경쟁에 의해 매개되는 T 세포 활성화의 억제

APL TT833S 및 융합단백질 Fab22-TT833S의 길항효과는 MHC 결합수준 또는 TCR 결합수준, 또는 이들 모두에서의 경쟁을 통하여 나타날 수 있다. 관련된 메카니즘에 대한 이해를 위해, Sette 및 그의 동료에 의해 최초 기술된 프리-펄스(pre-pulsing)실험이 수행되었다 (De Magistris, M.T. 등, 1992, Cell 68:625-634). 이러한 실험적인 세팅은 억제제(TT833S) 경쟁의 부재하에서 애고니스트 (TT830)가 MHC 클래스Ⅱ에 대해 결합되도록 하여, 단지 TCR 길항제만 (MHC 차폐제는 아님)이 애고니스트로 자극된 T 세포 증식의 억제에 유효하게 된다. 항원제공성 단핵세포는 4시간 동안 준최적 (20nM)의 TT830으로 펄스화되어, TT830이 TT833S로부터의 경쟁없이 MHC 클래스Ⅱ와 결합되게 한다. 그 다음, APL, TT833S 또는 Fab22-TT833S를 미리-펄스화된 단핵세포와 함께 16시간 동안 인큐베이션하였다. 반응하는 T 세포를 첨가하고 이들의 증식을 전술한 바와 같이 측정하였다. MHC차폐제가 최소한의 역할을 담당하는 조건하에서 조차, T 세포증식은 여전히 억제되었다 (도 33). 따라서, 억제는 MHC 클래스 Ⅱ 결합에 대한 경쟁의 결과라기 보다는 T 세포 수용체에 대한 경쟁의 결과로 보인다.

T 세포에 의한 IL-4 및 IFN-γ 생산을 자극하는데 실패한 TT833S 및 Fab22-TT833S의 제공

일부 환경에서, APL은 T 세포 사이토킨 생산을 자극할 수 있지만 T 세포증식을 자극하지 못한다 (Evavold B.D. 및 Allen P.M. (1951) Science 252:1308-1310). TT833S의 제공이 사이토킨의 생산을 자극하는지 여부를 결정하기 위해, 항원제공 분석과정에서 수득된 상청액의 IL-4 및 IFN-γ의 수준이 측정되었다. 도 34에 도시된 바와 같이, TT833S 및 Fab22-TT833S 모두는 T 세포에 의한 IFN-γ 및 IL-4 생산을 자극하는데 있어서 유효하지 않았다.

T 세포 아네르기를 유도하지 않은 TT833S 및 Fab22-TT833S의 제공

알렌과 그의 동료들은 일부 APL-MHC 클래스Ⅱ 복합체와 TCR의 상호작용이 T 세포 아네르기를 유도함을 보고하였다 (Sloan-Lancaster J. 등, 1993, Nature 363:156-159, Sloan-Lancaster J. 등, 1994, J.Exp. Med. 180:1195-1205). TT833S의 제공이 또한 T 세포 아네르기르 유발하는지 여부를 결정하기 위해 이들의 실험과 유사한 실험안이 사용되었다. 도 35에 도시된 바와 같이, T 세포들은 APC 및 TT833S 또는 Fab22-TT833S와 함께 1일, 2일 또는 4일간 인큐베이션 후, 회수되었을 경우, APC 단독으로 인큐베이션된 T 세포 뿐만아니라 후속하는 항원의 투여에 대해 반응하였다. 따라서, 펩티드 단독 또는 Fab22-TT833S의 사용을 통하여 제공된 길항제는 T 세포 아네르기를 유발하지 않았다. 더욱이, 동일한 백분율의 생존 T 세포 (약 50%)가 펩티드 TT833S 또는 Fab22-TT833S가 없는 배양액에서 회수되었으며, 이는 TT833S의 제공이 T 세포사멸을 증가시키지 않았음을 암시한다.

항-FcγRⅠ mAb 22를 기본으로 하는 융합단백질을 사용하여 항원 펩티드를 FcγRⅠ에 표적화함으로써 약 100배의 면역원성이 증가된 것이 관찰되었는데, 이는 이러한 융합단백질이 펩티드를 기본으로 하는 백신, 예를 들어, 감염성 질병 및 암을 위한 백신에 유용할 수 있음을 나타낸다. 펩티드들을 특정 APC 표면분자에 대해 특이적인 인간의 mAb의 불변도메인으로 조작하는 기술은 펩티드를 기본으로 하는 백신의 항원 잠재력을 증가시키는 일반적 접근법을 대표하고 있다.

더욱이, 자가면역 반응을 개선하기 위한 시도에서 부닥칠 수 있는 생체내 환경에 견줄만한 조건인, APC가 최초로 천연 펩티드로 펄스화되는 경우 조차에서도 FcγRⅠ로 표적화된 길항제 펩티드가 TT830 특이적 T 세포의 증식을 억제하는 것은 표적화된 길항펩티드의 제공이 항원 특이적인 질병, 예를 들어, T 세포 매개된 자기면역 질환의 치료에 사용될 수 있음을 보이고 있는 것이다. APL을 기본으로 하는 치료는 류마티스성 관절염, 다중 경화증과 같은 T 세포가 매개된 자기면역 질환에 대한 항원 특이적인 면역치료를 제공한다. 더욱이, FcγRⅠ에 대한 하나의 결합 특이성을 갖는 융합단백질 및 과도한 면역반응을 특징으로 하는 면역질병과 관련된 항원의 부분적 애고니스트인 펩티드의 사용은 항원 특이적 아네르기의 유도에 의해 상기 면역질환의 치료에 유용할 것이다. 따라서, 본 발명은 T 세포를 자극, T 세포 증식 및/또는 사이토킨 분비의 차페, 또는 T 세포에서 아네르기를 유도하는, 항원들의 증가된 항원 제공을 허용하는 방법을 제공함으로써 다양한 면역학적 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

실시예 8

기능성 단일사슬의 항-FcγRⅠ-항-CEA 양쪽 특이성 분자

본 실시예는 항-태생기암 (항-CEA)에 융합된 인간화된 항-FcγRⅠ 항체를 포함하는 재조합 양쪽 특이적 단일사슬 분자가 FcγRⅠ 및 CEA에 결합할 수 있음을 입증하는 것이다.

도 37은 FcγRⅠ에 대한 하나의 결합특이성 및 태생기암 항원 (CEA)에 대한 하나의 결합특이성을 갖는 제조된 양쪽 특이적 단일사슬 분자 (구조물 321 및 323)를 코드하는 포유류 발현 구조물의 개략적인 도면이다. 구조물 321에 의해 코드되는 양쪽 특이적 단일사슬 분자인 H22-항 CEA의 아미노산 서열 (서열 16) 및 이러한 융합단백질을 코드하는 핵산 서열(서열 15)은 도 40에 도시되어 있다. 구조물 323에 의해 코드되는 양쪽 특이적 단일사슬분자인 H22-항 CEA는 단지 H22의 VH 및 VL이 스위칭된 점에서 구조물 321에 의해 코드되는 융합단백질과 상이하다.

또한, FcγRⅠ에 대한 하나의 결합특이성을 갖는 단일사슬 항체를 코드하는 포유류 발현벡터 (구조물 225)가 제조되었다. 구조물 225에 의해 코드되는 단일사슬 항체 H22의 아미노산 서열 (서열 14) 및 이러한 단일 사슬 항체를 코드하는 핵산 (서열 13)이 도 39에 도시되어 있다.

이들 구조물 각각은 pcDNA3 (InVitrogen)의 HindⅢ 및 XbaⅠ 부위로 클론되고 이들의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동된다. 또한, 이들 구조물 각각은 세포배양액으로부터 재조합 단백질을 정제하는데 사용되는 c-myc로부터의 펩티드 및 헥사-히스티딘 펩티드를 코드하는 핵산서열을 함유한다. c-myc 택은 인간의 c-myc의 아미노산 410-420에 해당한다 (Evan 등, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3610). MFE-23으로 명명된 항-CEA 단일사슬 항체는 하기 문헌에 기재되어 있다 (Casey 등, 1994, J. Immunol. Methods 179:105 및 Chester 등, 1994, Lancet 343:455).

단일사슬의 양쪽 특이적 분자인 H22-항-CEA 및 단일사슬 H22 항체는 하기에서 실행된 결합분석법에서 사용되었다. ELISA 플레이트는 CEA로 코팅되었고, 5% PBA로 차폐되었다. 단일사슬 분자를 코딩하는 구조물로 트랜스펙션된 세포 (트랜스펙토마)의 상청액이 상기 플레이트에 첨가되었고, 가용성 FcγRⅠ/IgM-μ (상기 기재된 COS 트랜스펙션된 세포로부터의 상청액)가 첨가되었다. 알칼리 포스파타아제 (AP)가 접합된 염소의 항인간 IgM으로 플레이트를 인큐베이션하였고, PNPP로 현상하였으며, 405-650nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하여 결합을 검출하였다.

상기 결과들은 도 38에 제시되어 있다. 결과들은 구조물 321 및 323에 의해 코드되는, 단일사슬의 양쪽 특이성 H22-항 CEA 분자들이 FcγRⅠ 및 CEA에 모두 결합함을 나타내고 있다. 반면에, 단일사슬 H22 항체 (구조물 225에 의해 코드됨)는 예상되는 바대로, FcγRⅠ 및 CEA에 모두 결합하지 않았다.

균등물

당업자라면 통상의 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 수많은 균등물을 인지하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 또한, 이러한 균등물은 첨부되는 청구의 범위에 포함되도록 의도된 것이다.

서열목록

(1) 일반적 정보

(ⅰ)출원인 : 메다렉스 인코포레이티드

(ⅱ) 발명의 명칭 : 항-Fc 수용체 항체로 구성된 치료화합물

(ⅲ) 서열의 수 : 16개

(ⅳ) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매개형태 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성

(C) O/S : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn 발매 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)

(ⅴ) 현재 출원 데이타 :

(ⅵ) 우선권 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : US 08/484,172

(B) 출원일 : 1995년 6월 7일

(ⅶ) 통신가능한 주소

LAHIVE COCKFIELD

(ⅷ) 변리사/변호사 정보

Arnold, Beth E.

(2) 서열 1에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 24 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :

특징을 나타내는 이름/기호 : CDS

특징을 갖는 부위의 존재위치 : 1..24

(2) 서열 2에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 27 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :

특징을 나타내는 이름/기호 : CDS

특징을 갖는 부위의 존재위치 : 1..19

(2) 서열 3에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 42 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :

특징을 나타내는 이름/기호 : CDS

특징을 갖는 부위의 존재위치 : 1..34

(2) 서열 4에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 300 아미노산

서열의 형 : 아미노산

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : 중간부 단편

(2) 서열 5에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 14 아미노산

서열의 형 : 아미노산

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : 중간부 단편

(2) 서열 6에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 15 아미노산

서열의 형 : 아미노산

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : 중간부 단편

(2) 서열 7에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 54 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(2) 서열 8에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 53 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(2) 서열 9에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 15 아미노산

서열의 형 : 아미노산

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : 중간부 단편

(2) 서열 10에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 54 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(2) 서열 11에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 53 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(2) 서열 12에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 21 아미노산

서열의 형 : 아미노산

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드

(ⅴ) 단편형 : 중간부 단편

(2) 서열 13에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 913 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :

특징을 나타내는 이름/기호 : CDS

특징을 갖는 부위의 존재위치 : 11..911

(2) 서열 14에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 301 아미노산

서열의 형 : 아미노산

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질

(2) 서열 15에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 1679 염기쌍

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :

특징을 나타내는 이름/기호 : CDS

특징을 갖는 부위의 존재위치 : 11..1667

(2) 서열 16에 대한 정보

(ⅰ) 서열특징

길이 : 553 아미노산

서열의 형 : 아미노산

형태 : 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질

Claims (35)

1. 항-Fc 수용체 부분과 항-표적 부분을 포함하는 재조합 다중특이적 분자.
2. 제 1 항에 있어서, 하나이상의 항-Fc 수용체 부분 또는 항-표적 부분이 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
3. 제 2 항에 있어서, 항-Fc 수용체 부분이 항체 단편인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
4. 제 2 항에 있어서, 항-표적 부분은 항체 단편 또는 리간드인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
5. 제 2 항에 있어서, 항-Fc 수용체 부분은 내인성 면역글로불린에 의해 결합되지 않는 부위에서 이펙터 세포상의 Fc 수용체와 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
6. 제 2 항에 있어서, 항-Fc 수용체 부분은 Fcγ 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
7. 제 6 항에 있어서, Fcγ 수용체는 FcγRⅠ 수용체인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
8. 제 4 항에 있어서, 상기 표적은 암세포인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
9. 제 4 항에 있어서, 상기 표적은 감염성 병원체인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
10. 제 4 항에 있어서, 상기 표적은 항체생산 세포인 것을 특징을 하는 재조합 다중특이적 분자.
11. 제 8 항에 있어서, 상기 표적은 유방암 또는 난소암 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 표적은 HER2/neu를 발현시키는 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 항-표적 부분은 항체 520C9인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
14. 제 4 항에 있어서, 상기 리간드는 표피생장인자인 것을 특징으로 하는 재조합 다중특이적 분자.
15. 하나이상의 항-Fc 수용체 부분 및 하나이상의 항-표적 부분을 포함하는 다가 분자.
16. 하나의 항-FcR, 하나의 항-표적 부분 및 하나의 항-증진인자 부분을 갖는 다중 특이적 분자.
17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 항-표적 부분은 암세포와 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
18. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 항-표적 부분은 암종에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
19. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 항-표적 부분은 육종에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
20. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 항-표적 부분은 병원체에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
21. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 항-표적 부분은 최초 FcR 단일클론성 항체와 상이하고 구별되는 에피토프에서 FcR과 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
22. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 항-표적 부분은 가용성 단백질/펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
23. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 항-표적 부분은 면역반응 또는 단일클론성 항체를 생성할 수 있는 임의의 분자에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
24. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, Fc 수용체에 대한 항-FcR 부분의 결합이 인간의 면역글로불린 G에 의해 차폐되지 않는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
25. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 항-FcR부분은 FcR에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
26. 제 16 항에 있어서, 항-EF 부분은 T 세포 표면항원에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
27. 제 16 항에 있어서, 항-EF 부분은 CD3에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
28. 제 16 항에 있어서, 항-EF 부분은 FcR상의 제 2 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
29. 제 16 항에 있어서, 항-EF 부분은 표적세포에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
30. 제 16 항에 있어서, 항-EF 부분은 제 2 FcR에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가 분자.
31. 제 16 항에 있어서, 항-EF 부분은 골수와 관련된 세포독성 트리거 분자에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 다중 특이적 분자.
32. 제 16 항에 있어서, FcγRⅠ에 결합하는 부분, 표적 항원의 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 부분 및 동일한 표적세포상의 제 2 부위에 특이적으로 결합하는 부분을 가진 다중 특이적 분자.
33. 다가, 다중특이적 분자의 치료학적으로 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함하는 암치료 방법.
34. 다가, 다중특이적 분자의 치료학적으로 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환을 치료하는 방법.
35. 다가, 다중특이적 분자의 치료학적으로 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함하는 원하지 않는 병원체를 제거치료하는 방법.