KR19980701336A - 균류의 검출 및 확인을 위한 핵산 표지체(nucleic acid probes for the detection and identification of fungi) - Google Patents
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Abstract
식품 및 음료의 손상뿐 아니라, 사람 및 동물에게 질병의 원인이 되는 균류를 검출하기 위해 핵산 표지체 및 프라이머들이 기술된다. 상기 표지체들은 임상, 환경 또는 식품 표본에 존재하는 다수의 균류로부터 rDNA 또는 폴리머라제 연쇄 반응 산물을 검출할 수 있다. Acremonium 종, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus unguis, Aspergillus ustus, Beauvaria 종, Bipolaris종, Blastoschizomyces종, Blatomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Chrysosporium 종, Cladosporium 종, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans var gattii 혈청형 B, Crytococcus neoformans 혈청형 A, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus terreus, Curvularia종, Fusarium종, Filobasidium capsuligenum, Filobasidiella (Cryptoccus) neoformans var bacillisopora 혈청형 C, Filobasidiella(Cryptoccus) neoformans var neoformans 혈청형 D, Filobasidium uniguttulatum, Geotrichum 종, Histoplasma capsulatum, Malbranchea종, Mucor종, Paecilomyces종, Penicillum종, Pseudallescheria boydii, Rhizopus종, Sporothrix schenkii, Scopulariopsis brevicaulis, Scopulariopsis brumpti, Saccharomyces cerevisiae 및 Trichosporon beigelii에 특이적인 핵산 교잡 조사 표지체들이 또한 기술된다.
Description
[기술분야]
본 발명은 임상, 식품, 환경 및 다른 표본에 존재하는 많은 다른 균 유기체(fungal organism)를 검출할 수 있는 두 개의 핵산 (nucleic acid) 표지체 (probe)의 설계(design) 및 조성 (composition)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 임상, 식품, 환경 및 다른 표본에 존재하는 Acremonium 종, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus unguis, Aspergillus ustus, Beauveria종, Bipolaris종, Blastoschizomyces종, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, candida kefyr, Candida kursei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Chrysosporium종, Cladosporium종, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans var gattii 혈청형(serotype) B, Cryptococcus neoformans 혈청형 A, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus ferreus, Curvularia종, Fusarium종, Filobasidium capsuligenum, Filobasidiella(Cryptococcus) neoformans var bacillispora 혈청형 C, Filobasidiella(Cryptococcus) neoformans var neoformans 혈청형 D, Filobasidium uniguttulatum, Geotrichum종, Histoplasma capsulatum, Malbranchea종, Mucor종, Paecilomyces종, Penicillium종, Pseudallescheria boydii, Rhizopus종,Sporothrix schenkii, Scopulariopsis brevicaulis종, Scopulariopsis brumpti, Saccharomyces cerevisiae 및 Trichosporon beigelii를 특히 검출하고, 확인할 수있는 표지체의 설계 및 조성에 관한 것이다.
균류는 강범위하게 분포된 진핵 (eukaryotic) 미생물이다. 균류는 자연상태에서 식물 물질을 분해하는데 중요한 역할을 하는 반면, 그들은 또한 식품, 음료 및 약용 제제의 손상의 원인이 된다. 균학자에 의해 게시된 약 100,000 종의 균중에서, 약 150여종이 인간과 동물에게 병원체가 된다. 에이즈 (AIDS) 발병율의 증가 및 혈액 종양 (hematologic malignancies) 및 장기 이식의 새로운 치료법의 개발은 면역 감퇴 환자의 수를 증가시켰다. 상기 환자들은 균의 감염을 발전시킬 위험을 갖고 있으며, 상기 균의 감염은 조속히 진단하거나 치료하지 않으면 몇일내로 죽음을 야기시킬수 있다. 항균제 (antifungal drugs)의 수는 한정되어 있고, 환자에 대한 상기 항균제들의 독성 부작용은 비교할 수 있는 항박테리아(antibacterial) 치료법의 독성 부작용보다 더 크다. 상기 환자에게 있어서, 균감염에 대한 빠른 진단 및 치료의 시작이 시급하다. Sarosi 및 Davies와 함께, Kwon-Chung 및 Bennett에 의해 쓰여진 책들은 균류의 의학적 중요성에 대한 통찰을 제공한다.
균 유기체는 형태 (morpho1ogy) 및 영양 특성에 의해 확인된다. 균류는 어디에서나 2일 내지 몇주간 배양 (culture)으로 자랄수 있고, 종종 상기 유기체는 그 성장 조건에 의존하여 근본적으로 다른 형을 갖을 수 있다. 이러한 변이는 전통적으로 훈련된 전문가조차도 적시에 확인하기 어렵게 하며, 속 (genus) 및 종(species)의 빠른 확인이 의학적 잇점으로 작용하는 환자의 치료를 방해한다.
주요한 병원체 균류의 발병률 및 분포는 지리학적 위치에 의해 변한다. Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidiodes immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Pseudallescherisa boydii 및 Sporothrix schenkii는 진균(mycotic)의 감염을 일으키는 몇몇 원인으로 나타난다.
Aspergillus fumigatus는 병원에서 치료된 체계적 균 감염의 상위 3가지 원인중의 하나이다. 상기 균은 통상 창기 이식, 심각한 백혈병 (leukemias) 및 화상을 가진 환자에게 영향을 끼치며, 빨리 진단되지 않으면 매우 치명적일 수 있다. 150종 이상의 Aspergillus는 토양, 대기 및 물에 존재하며, Aspergillus fumigatus의 정확한 검출이 대단히 중요하게 되었다. Aspergillus clavatus, aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus nuguis 및 Aspergillus ustus는 임상표본에서 보여지는 Aspergillus종의 대부분을 나타나며, 그들의 존재는 진단상의 어려움을 야기시킬수 있다. Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus 및 Aspergillus niger는 북미에서 지배적인 병원체인 Aspergillus fumigatus와 함께 인류의 질병과 연관되어 왔다. Aspergillus fumigatus에 대한 몇몇 면역 테스트가 존재하지만, 이 테스트들은 한정된 민감성 (sensitivity) 및 특이성 (specificity)를 갖는다. 또한, Asp fl 항원 유전자 및 리보솜의 인터제닉 스페이서 (intergenic spacer)의 증폭에 근거한 Aspergillus fumigatus의 테스트에 기초된 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)의 개발에 대한 보고가 있다(스프레드버리 외). 상기 스프 레드버리 (Spreadbury) 기술은 큰 서브유니트 rRNA/인터제닉 스페이서 영역에 걸치는 401개의 염기쌍 (bp) 단편 (fragment)의 PCR 증폭에 기초한다. 상기 기술은 Aspergillus fumigatus로부터만 DNA를 특히 증폭시키는 한 쌍의 프라이머 (primer)에 의존하며, 다른 균류를 확인하는데는 유용하지 않다.
Aspergillus dermatitidis는 토양, 통상적으로 새 배설물 및 동물의 배설물에 존재한다. 감염은 종종 구축 자리 (construction site)에서 일어나며, 잇따른 폐 침투 및 폐렴은 일반적으로 면역 감퇴 환자에게 치명적이다. 배양에 의한 진단은 몇주일 걸릴 수 있고, 상기 유기체는 경우에 따라서 다른 균류로 오인될 수 있다. 존재하는 면역 진단 테스트는 믿을 수 없고, 진단 테스트에 기초한 빠르고 믿을 수 있는 DNA가 요구된다. 유사하게, Histoplasma capsulatum은 토양에 존재하며, 북미 인구의 적어도 20%가 감염된 것으로 알려져 있다. 대부분의 감염은 폐에서 시작하고 자발적으로 회복되지만, 경우에 따라서 다른 기관으로 퍼질수 있다. 에이즈 환자는 히스토플라즈마증 (Histoplasmosis)의 경우의 수의 증가를 나타낸다. 면역 테스트는 종종 감염의 처음 4 내지 6 주동안 음성 (negative)이기 때문에 진단이 어렵다. Coccidioides immitis는 미국 남서부의 토양에서 풍부하게 발견된다. 먼지, 폭풍, 농장, 건물 축조, 지진 및 심지어 도보 여행조차도 질병 발생과 관련되어 왔다. 캐비테이션 (cavitation)에 따른 폐의 감염 및 전이된 립진의 콕시디오이데즈진균증 (coccidioidomycosis)이 나타난다. 뇌막염(meningitis)은 통상 치명적이며, 다른 균류와 함께 할 때 쇠약해진 숙주에서 사망률이 최대이다. 사람에게 있어서, Cryptococcus neoformans의 네가지 혈청이 A, Cryptococcus neoformans var gatti 혈청형 B, Filobasidiella(Cryptococcus) neoformans var bacillispora 혈청형 C 및 Filobasidiella(Cryptococcus) neoformans var meoformans 혈청형 D이다. 상기 질병의 발병율은 빠르게 증가하고 았으며, 크립토코커스증 (cryptococcosis)을 유발시키는 HIV 감염 환자의 10% 이상을 차지한다. 크립토코커스형 뇌막염과 같은 생존을 위협하는 감염에 대한조기 진단 및 치료에 4가지 혈청형 모두를 검출할 수 있는 DNA 표지체가 요구된다. 스톡맨 (Stockman) 등에 의한 보고서는 18S rRNA (Gen-Probe,Inc., San Diego,CA)에 기초한 Histoplasma, blastomyces, Coccidioides, 및 Cryptococcus에 대한 상업적 테스트법을 게시하고 있다. 저자는 87.8 내지 100% 범위의 민감도 및 100%의 특이성을 보고하고 있다. 상기 표지체의 한가지 단점은 상기 표지체가 균류 배양에서 추출된 rRNA에 사용된다는 점이다. 몇몇 균류는 배양하는데 3주 이상 필요하기 때문에 상기 기술은 배양이 유용하게 될 때까지 진단을 신속히 처리하는데 사용될 수 없다.
Candida albicans는 인간에게 있어서 균 감염의 가장 흔한 원인중의 하나이다. 상기 균은 건강한 사람의 호흡기, 위장 및 여성 생식기의 통로에 존재하며, 스테로이드 (steroid) 및 화학 치료법상에 있는 쇠약해진 사람에게 있어서는 기회주의적인 병원체로서 작용한다. 당뇨병 및 내재하는 카테터 (catheter)는 다른 감염되기 쉬운 원인이 된다. 면역 감퇴된 숙주는 균류의 빠른 혈액성(hematogenous) 전염을 보인다. 치료되지 않은 경우에 있어서 환자수 및 사망률이 매우 높다. 또한 Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis 및 Candida tropicalis는 인체 내에서 발생시키는 것으로 알려져 있다. 상기 각각의 종을 확인할 수 있는 DNA 표지체는 많은 혈액 배양 및 생화학적 분화에 대한 요구를 감소시킬 것이다.
최근 분자 생물학적 기술에 있어서의 진보는 리보좀 유전자의 DNA 서열에 기초한 미생물 검출 및 확인의 접근을 이끌었다. 통상적으로 이용되는 검출 기술은 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 리보좀 DNA (rDNA) 유전자의 직접적인 증폭, 또는 cDNA의 폴리머라제 연쇄 반응에 따르는 리보좀 RNA (rRNA)의 상보적 DNA (cDNA)로의 역전사 (reverse transcryption)를 포함한다. 리보좀은 단일한 rRNA 및 메센저 (messenger) RNA의 단백질로의 번역에서 작용하는 단백질 종들의 합성물이다. 진화론은 모든 현존하는 생명체는 하나의 유기체에서 진화했다는 해석과 일치한다. 그러므로, 모든 세포 기관은 rRNA를 함유하며, 상기 rRNA들은 진화에 의해 관련된다. 상기 진화 과정은 각 종의 기관이 그 자체의 리보좀 유전자내에서 서열의 단일한 영역을 보인다는 것이다. 상기 단일한 종의 특정한 영역의 존재는 교잡(hybridization) 조건하에서 특이하게 결합하고, 상기 폴리머라제 연쇄 반응으로 단일한 하나의 종으로부터 증폭된 DNA를 확인시킬 DNA 표지체를 고안시켰다. 본 출원의 목적을 위해, 프라이머 라는 단어는 주형 (template)에서 유모된 중합화에 의해 확장될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 표지체는 교잡에 의해 자체의 상보적 서열을 검출할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 또한, 본 출원의 목적을 위해, 뉴클레오타이드 서열이라는 문구는 DNA 또는 RNA 형 또는 그의 변형을 포함할 것이다. 더군다나, 상기 기술에 정통한 자는 프라이머 서열이 표지체로 사용될 수 있으며, 그 역도 또한 같음을 인지할 것이다. 또한 관심의 대상이 되는 특정 핵산 서열을 검출하기 위한 핵산 교잡의 이용이 콘 (Kohne)에 의해 게시되었다 (미합중국 특허 제 4,851,330,7/1989).
원핵생물 및 진핵생물에서 리보좀 RNA 및 해당되는 rDNA 유전자는 상기 RNA의 크기에 의해 확인된다. 상기 크기는 침강 속도(sedimenatation velocity) 및 침강 계수값 (S value)에 관련된다. 결과적으로, 원핵생물에 대해서는 상기 값은 5S,16S 및 23S이고 진핵생물에 대해서는 상기 값은 5S, 5.8S, 18S 및 28S이다. 모든 리보좀은 세포 생존에 필수인 동일한 기능을 수행하기 때문에, 리보좀의 서열은 대부분 보존되나, 각 리보좀 종들의 어떤 영역은 기능화에 영향받지 않고, 더 많은 변화를 필요로 한다. 상기 초가변 영역 (hypervariable regions)은 같은 속중에서 서로 다른 종들을 확인시킨다. 상기 참조에서 언급된 바와 같이, 5S, 18S 및 5.8S 및 28S rDNA 사이의 인터제닉 스페이서가 균류의 확인 및 검출에 이용되어 왔다는 몇몇 보고가 있다 (홈즈 외 (Holmes et. a1.), 호퍼 외 (Hopfer et. al.), 로트 외 (Lott et. a1.), 마이월드 외(Maiwald et. al.), 마키무라 외 (Makimura et.al.), 미첼 외(Mitchellet.al.), 나카무라 외(Nakamuraet.al.)). 홈즈는 인접 비전사된 스페이서 영역에 기초한 PCR을 게시하고 있다. 상기 5S rDNA의 공증폭 (co-amplification) 및 상기 방법은 단지 Candida albicans만을 확인시키며 각 유기체를 확인하지 않고 다른 Candida 종을 검출한다. 홈즈 및 마이월드는 둘 다 Candida 종, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans 및 Trichosporon종을 포함하는 몇몇 균류로부터 18S rDNA를 증폭시키는 만능 프라이머 (universal primer)를 사용한다. 상기 앰플리콘 (amplicons)은 제한 효소로 가수분해되며, 절단된 단편은 젤-전기영동 (ge1-electrophoresis)에 의해 크기에 따라 분류된다. 상기 제한 조각 길이 (restriction frement length)의 다형태성(polymorphism) 양상은 대부분의 유기체를 확인할 수 있게 하지만, 모든 유기체를 확인할 수 있는것은 아니다. 상기 기술은 순수한 균배양으로부터 증폭된 DNA에 사용될 수 있다. 타액 (sputum)과 같은 임상 표본은 일반적으로 다양한 균 유기체를 함유하기 때문에, 균류의 혼합으로부터 얻어진 다수의 겹침 (overlapping) 단편이 거의 해석하기 불가능할 것이므로 상기 기술은 진단용으로는 실용성이 거의 없다. 로트는 Candida albicans 및 동류의 Candida종을 확인하고 분화시키기 위해 상기 5.8S 및 내부 전사된 스페이서 (ITS2)를 사용한다. Makimura는 25개의 의학적으로 중요한 균류의 18S rDNA로부터 687 염기쌍의 단편을 증폭시키고, 임상 표본에서 Candida albicans 진단에 상기 단편을 이용한다. 미첼은 5.8S를 증폭시키기 워해 안긴 PCR (nested PCR)을 이용하고, Cryptococcus neoformans를 확인하기 위해 내부 전사된 스페이서 (ITS)를 이용한다. 증폭된 DNA의 확인을 검증하기위해 차후의 테스트는 없었다. 나카무라는 폐의 Aspergillus fumigatus 감염을 검출하기 위해 18S 프라이머를 사용한다. 상기 참조에서 주어진 대부분의 방법들은단지 임상 표본으로부터 극도의 제한된 수의 균류를 검출하기 위해서 이용될 수 있다. 호퍼 및 마이월드는 순수한 배양으로부터 다양한 유기체를 검출할 수 있으나, 다양한 균 종을 함유하고 있는 임상 표본에 대한 그들의 유용성은 기껏해야 제한된다.
와이스버그 (Weisburg et. al.)는 균류에서 18S의 작은 서브유니트 리보좀 RNA 서열을 검출하기 위한 개선된 표지체에 대한 미합중국 특허를 등록받았다. 상기 표지체는 많은 종으로부터 균류를 검출할 것이지만, 어떠한 단일한 종을 쉽게 확인하기 위해 이용될 수 없다. 밀리만 (Milliman)은 또한 16S 리보좀 서열에 기초한 Staphylococcus aureus 박테리아의 특정 검출을 위한 개선된 표지체에 대한 미합중국 특허를 등록받았다. 호간 (Hogan et. a1.,유럽 특허출원 제 0,272,009호)은 18S rRNA에 대한 하나의 균 표지체 및 28S rRNA 서열에 대한 세 개의 균 표지체를 게시하고 있다. 상기 28S rRNA 표지체 중 두 개는 약간 다른 균류를 검출하고, 이에 반해 세 번째 표지체는 열 개 균의 제한된 패널 (panel)로부터 Candida krusei를 검출한다. 호간에 의해 기술된 상기 28S 표지체 중 어느것도 본 발명에서 기술된 표지체와 관련이 없다. 본 발명에서 주장된 모든 표지체는28S 유전자의 처음 900 염기쌍 내에 배치될 수 있다. 호간에 의해 개시된 표지체는 염기 쌍 1000 및 2000 (상기 수는 Saccharomyces cerevisiae 28S rRNA 유전자의 1차 서열과 비교될 수 있다. 유전자은행 점수 번호:J01355) 사이에서 상기 28S 서열상의 3' 이상에 배치된다. 러클럭 등(Leclerc et. al.)은 그들에 의해 서열화된 몇몇 균의 28S 유전자의 부분적인 DNA 서열에 기초한 균류 사이에서 계통 발생적(phylogenetic) 관계를 분석하는 보고서를 공개했다. 러클럭에 의해 서열화되었다고 주장된 상기 몇몇 유기체는 우리에 의해 서열화된 몇몇 유기체와 동일하다. 상기 유기체들은 Sporothrix schenckii, Pseudallescheria boydii, Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum 및 Chrysosporium종이다. 러클럭은 그들의 보고서에서 어떠한 서열 데이타도 공개하지 않았으며, 우리가 알고 있는 바로는, 그들은 상기 서열을 유전자 은행에서 공개적으로 이용 가능하게 하지 않았다. 그들의 시퀀싱 프라이머 401 (TCCCTTTCAA CAATTTCACG)의 역-상보 서열(reverse-complement sequence)은 우리의 SEQ ID NO:1 (GTGAAATTGT TGAAAGGGAA)와19개의 뉴클레오티드가 겹치며, 그들의 시퀀싱 프라이머 636 (GGTCCGTGTT TCAAGACGG)는 우리의 SEQ ID NO:2 (GACTCCTTGG TCCGTGTT)와 10개의 뉴클레오티드가 겹친다. 우리는 종 특이 진단용 표지체의 개발을 위해 표적으로 사용되고 있는 균류의 28S rRNA 유전자로부터 가변 영역의 연구에 대한 어떠한 보고도 없다는 것을을 안다.
상기 논의된 바와 같이, 균류의 분자적 검출을 위한 대부분의 현존하는 기술은 단지 하나의 균 종의 PCR 증폭을 위한 매우 특정한 프라이머의 이용에 의존한다. 다양한 유기체로부터 분리된 DNA의 PCR 증폭을 위한 만능 프라이머를 사용하는 것은 균류의 순수한 배양에서만 유용한 전-PCR 앰플리콘 확인 기술을 이용한다. 상기 기술은 다양한 균류 유기체를 함유하는 임상 표본으로부터 균류를 확인할 수 없다. 본 발밍의 첫 번째 목적은 상기 28S 유전자에 대한 만능 프라이머를를 개발하는것이었다. 상기 프라이머는 대부분의 균류로부터 분리된 28Sr RNA를 PCR내에서 증폭시킬 수 있을 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 대상 균류에 대한 종 특이 표지체 (species specific probe)를 개발하는 것이었으며, 상기 표지체는 본 발명의 만능 28S 앰플리콘을 분석하기 위해 사용될 것이다. 상기 종 특이 표지체는 혼합된 균 종을 함유하는 상황에서조차도 대상 균류의 존재를 검출할 수 있을 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 대부분의 균류의 DNA 또는 RNA로부터 28S 서열을 검출할 수 있는 핵산 프라이머를 제공하는 것이다. 상기 프라이머는 임상용, 식품, 환경 또는 다른 표본에 존재하는 어떠한 균으로부터 28S 서열을 증폭하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응에서 만능 프라이머로서 사용될 것이다. 또한, 상기 만능 프라이머는 중폭된 DNA를 서열화하는데 사용될 것이다. 얻어진 상기 서열은 알려진 균 서열의 데이타베이스와 비교함으로써 상기 균류를 확인하는데 사용될 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 병원체인 Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis,cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus flavus, aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida defyr, candida drusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Pseudallescheria boydii, Sporothrix schenckii 및 다른 종들을 어떠한 몇몇 다른 형(format)들을 이용하여, 핵산 교잡에 의하여 검출하고 확인할 수 있는 핵산 표지체를 제공하는 것이다. 더군다나, 뉴클레오티드 서열 정보는 DNA 서열 비교 (도 2) 또는 부가적 표지체의 축조에 의해 상기 병원체 및 다른 균류를 확인하는데 제공된다.
[배경기술]
핵산 표지체 및 프라이머들은 식품 및 음료의 부패뿐 아니라 인간 및 동물에게 질병의 원인이 되는 균류를 검출하기 위해 기술된다. 상기 표지체는 임상, 환경 또는 식품 표본에 있는 대부분의 균류로부터 rRNA, rDNA 또는 폴리머라제 연쇄 반응 생성물을 검출할 수 있다. 또한 Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis,cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus flavus, aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida defyr, candida drusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Pseudallescheria boydii, Sporothrix schenckii 및 다른 종들 (표 1 및 도 2)에 특정한 핵산 교잡법 표지체가 기술된다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 첫 번째 목적은 임상용 표본에 존재할 것 같은 모든 균류로부터 28S 유전자를 증폭시키는 폴리머라제 연쇄 반응에 사용하기 위한 핵산 프라이머를 개발하는 것이었다. 상기 증폭된 DNA는 결국 몇몇 다른 종 특이 표지체와 함께 표지체화되어 분석할 수 있다. 교잡 조건하에서, 각각의 상기 종 특이 표지체는 단지 하나의 균 종으로부터 분리된 28S 리보좀 DNA에 부착되며, 그것에 의해 임상용 표본에 존재하는 균종을 검출하고 확인한다. 상기 28S 유전자가 표적으로 선택되었는데, 이는 상기 유전자가 균류 사이에 보존되는 영역을 가지고 있으며, 상기 영역이 만능 균 표지체에 대한 강력한 어닐링 (annealing) 자리를 제공하기 때문이다. 또한, 상기 리보좀 28S 유전자는 종 특이 표지체에 대한 자리를 제공하기에 충분하게 독특한 초가변 영역을 가질 것으로 기대되었다. 상기 큰 rRNA 유전자는 원핵생물에서는 23S rRNA 유전자를 일컬으며, 진핵생물에서는 28S 유전자를 일컫는다. 상기 정의는 길이에 기초한 것이며, 결과적으로 상기 rRNA 분자의 침강계수 (sedimentation coefficient)에 기초한 것이다. 균의 큰 서브유니트 rRNA는 다른 유기체 사이에서 크기에 따라 다양하며, 종종 25S, 26S 또는 28S인 것으로 간주된다. 균류는 진핵생물이며, 본 출원에서 일관성을 유지하기 위해, 균의 큰 서브유니트 rRNA를 28S rRNA로 칭한다.
Cryptococcus neoformans, 두 개의 Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae 및 두 개의 Schizosaccharomyces pombe 28S 전자로부터 공개된 서열은 길이가 약 3.5킬로베이스 (kb)이다(유전자은행 접수 번호: L14068, L28817, X70659, J01355, Z19136 Z19578). 상기 네 개의 서열은 배열되었으며, 서열 가변성의 영역이 상기 유전자의 5' 말단으로부터 코디네이트 (coordinate) 200 및 700사이에 밀집되어 발견되었다. 개시 출발점으로서, 상기 언급된 네 개의 유기체 모두에 교잡할 수 있으며, 사람의 28S 서열 (유전자은행 접수 번호:M11167)에는 교잡할 수 없는 두 개의 핵산 프라이머 P1 (ATCAATAAGC GGAGGAAAAG) 및 P2(CTCTGGCTTC ACCCTATTC) (도 1 참조)가 고안되었으며, 엄격함이 낮은 교잡 조건하에서, 폴리머라제 연쇄 반응에 이용되고, 상기 폴리머라제 연쇄 반응은 마이오 클리닉 (Mayo Clinic) 균 수집으로 얻은 하기 34개의 균류에서 상기 초가변 영역에 걸치는 DNA의 약 800 염기쌍을 증폭시킨다: Acremonium 종, Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus unguis, Aspergillus ustus, Beauveria종, Bipolaris종, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida kursei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Chrysosporium종, Cladosporium종, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans 혈청형 A, Curvularia종, Geotirchum종, Histoplasma capsulatum, Mucor종, Penicillium종, Pseudallescheria boydii, Saccharomyces cerevisiae Sporothrix schenkii 및 Trichosporon beigelii.
DNA는 다음 방법에 의해 상기 나열된 균류로부터 추출되었다. 균 배양의 한 고리모양을 멸균 접종 루프(sterile inoculation loop)를 이용하여 배양판으로부터 긁어내었다. 상기 균을 1.5㎖ Sarsted(Newton, North Carolina) 스크류 캡 (screw cap) 마이크로-원심분리 튜브에 있는 1㎖ 멸균수에 첨가시켰다. 상기 균을 용균시키고 상기 세포에서 DNA를 용출시키기 위해, 상기 튜브를 끓는 물중탕에서 20분간 방치시켰다. 상기 전체 세포 용균액 2㎕가 PCR 내에서 28S rDNA를 증폭시키는데 이용되었다. 모든 PCR 증폭은 50㎕의 반응 부피내에서 Perkin-Elmer (Norwalk, CT) 0.5㎖의 얇은 막 폴리프로필렌 (polypropylene) 튜브 및 Perkin-Elmer 열적 사이클러 (thermal cycler)를 이용하여 열-개시 (hot-start) 반응으로서 수행되었다. 처음으로 튜브에 첨가되는 반응물은 2.5㎕의 10X PCR 완충액 (100mM 트리스(tris) pH 8.3, 500mM KC1,15mM MgC12), 5.0㎕의 50% 글리세롤(glycero1)/1mM 크레졸 레드 (cresol red), 8.0㎕의 dNTP 혼합 (dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP 각각 1.25mM), 12피코몰 (picomole)의 각 핵산 프라이머 및 25㎕ 부피를 맞추기 위한 멸균수이었다. 왁스 거품 (wax bead, Ampliwax Gem-100, Perkin-Elmer)이 첨가되었고, 상기 튜브를 77℃에서 1분간 가열시키고, 왁스 경계(wax barrier)롤 형성하기 위해 실내온도로 냉각시켰다. 2.5㎕의 10X PCR 완충액, 5.0㎕의 50% 글리세롤/1mM 크레졸 레드, 0.2㎕의 타크 폴리머라제 (Taq polymerase, AmpliTaq 5U/㎕, Perkin-Elmer) 및 15.3㎕의 멸균수가 상기 균의 전체 세포 용균액으로부터 분리된 2.0㎕의 DNA와 함께 첨가되었다. 열적 회로의 50 사이클이 94℃에서 30초간, 40℃에서 1분간, 72℃에서 2분간 수행되었다. 상기 증폭된 DNA를 전기영동시키고, 트리스로 완충된 폐놀 (pheno1) pH 8.0, 페놀/클로로포름 (chloroform)/이소아밀 알코올 (isoamyl alcoho1)(부피비 25:24:1) 및 3번의 에테르 추출 후 이소프로판올 침전법 및 70% 에탄올 세척을 수행하여 저융점의 아가-겔 (agarose-gel)로부터 분리시켰다.
상기 나열된 유기체로부더 증폭된 DNA의 양 가닥 (strand)을 완전히 서열화하였다. 모든 서열화는 Applied Biosystems 373A 서열 장치상에서 수행되었다. 발생된 상기 서열에서 모든 뉴클레오티드는 두 번째 가닥의 서열로부터 상보적인 뉴클레오티드를 검사함으로써 검증되고 확인되었다. 우리는 지금 의학적으로 중요한 균류의 다양한 수집으로부터 28S rDNA의 가변 영역에 걸치는 핵산 서열로 이루어진 신규한 데이타베이스를 얻었다.
Candian albicans, Cryptococcus neoformans 및 Saccharomyces cerevisiae 28S 유전자에 대한 완전한 서열이 이전에 공개되고, 유전자 은행에 예치된 것에 반하여, 상기 세 개의 유기체 사이에서 어떠한 서열상 동일 영역이 모든 대상 균류 사이에서 또한 보존될 것인지는 분명하지 않고, 단정지을 수도 없다. 본 발명의 신규한 28S 데이타베이스에서 상기 모든 균류로부터 분리된 DNA 서열은 만능 28S 표지체를 개발하기 위해 분석되어야 했다. 모든 서열은 유사한 영역을 확인하기 위해 만능 표지체를 이용하여 최적의 상대적 배열을 확인하는 광범위한 조작에 따랐다. 상기 선택된 표지체 서열은 대부분의 균 종으로부터 분리된 28S 유전자에 존재하는 조건을 제의하고 몇멎 중요한 특징을 충족시켜야 했다. 각 표지체 서열은 알맞은 열적 프로파일(profile), 2차 구조 및 DNA 증폭 반응에서의 유용성을 요구했다. 상기 표지체들은 임상 표본의 경우에 있어서 다양한 원료로부터 분리된 DNA의 존재하에서 뿐만아니라 균의 순수한 배양에서도 PCR 증폭을 작동하기 위해 최적화되었다. 상기 표지체는 또한 상기 증폭된 DNA의 직접적인 서열화를 촉진시키기 위해 고안되었다. 본 발명의 분석으로 (SEQ ID NO:1) 및 (SEQ ID N0:2) (이들의 위치에 대해서는 도 2 참조)에서 나열된 올리고뉴클례오티드 표지체가 발견되었다. 상기 두 표지체 ((SEQ ID N0:1) 및 (SEQ ID N0:2))의 성공적인 확인은 교잡시킬 핵산 표지체를 개발하고 균류의 대부분에서 분리된 28S rRNA 및 rDNA를 검출하는 우리의 것 번째 목적을 달성시켰다 (도 1 및 표 1). 본 발명의 후반에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 만능 표지체의 이용에 의해 생긴 신규한 서열 정보는 19개의 다른 질병-원인 균들을 확인할 수 있는 종-특이 표지체 ((SEQ ID NO:3) 및 (SEQ ID NO:23))을 개발하게 하였다.
(표 1a)
28S 핵산 서열에 있는 표지체 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2를 위한 교잡 위치의 존재
(표 1b)
28S 핵산 서열에 있는 표지체 SEQ ID N0:1 및 SEQ ID NO:2를 위한 교잡 위치의 존재
표지체 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2는 다음 49개의 유기체로부터 분리된 상기 가변 영역에 걸친 서열 DNA (도 2)를 성공적으로 증폭 (표 2)하고 서열화하는 데 사용되었다:Acremonium종, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus unguis, Aspergillus ustus, Beauveria종, Bipolaris종, Blastomyces dermatitidis, Blastoschizomyces종, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Chrysosporium종, Cladosporium종, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans 혈청형 A, Cryptococcus neoformans var. gattii 혈청형 B, Cryptococcus terreus, Cryptococcus laurentii, Curvularia종, Filobasidiella(Cryptococcus) neoformans var bacillispora 혈청형 C, Filobasidiella(Cryptococcus) neoformans var neoformans 혈청형 D, Filobasidium capsulatum, Filobasidium capsuligenum Filobasidium uniguttulatum, Fusarium종, Geotrichum종, Histoplasma capsulatum, Malbranchea종, Mucor종, Paecilomyces종, Penicillium종, Pseudallescheria boydii, Rhizopus종, Saccharomyces cerevisiae, Scopulariopsis brevicaulis, Scopulariopsis brumptii, Sporothrix schenkii 및 Trichosporon beigelii.
상기 리스트는 Cryptococcus neoformans의 모든 4가지 혈청형(A,B,C 및 D)를 함유한다. 표지체 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2의 이용에 의해 얻은 상기 서열 정보는 균의 28S 서열로 이루어진 본 발명의 데이타베이스의 크기를 확장시켰다. 모든 증폭된 DNA는 얻어진 상기 데이터의정확성을 확인하기 위해서 각 유기체의 최소한의 두개의 다른 격리 집단으로부터 얻어진 양 가닥에 걸쳐 서열화되었다.
(표 2a)
표지체 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2를 이용한 28S rDNA 의 폴리머라제 연쇄 반응 증폭
(표 2b)
표지체 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2를 이용한 28S rDNA 의 폴리머라제 연쇄 반응 증폭
본 발명에서 서열화된 균류의 상기 리스트는 인간에게 피하 및 깊은 진균의 감염의 대부분의 원인이 되는 유기체를 나타내며, 또한 임상용 격리 집단에서 공통적으로 발견되는 기생생물(saprohytes, 비병원체 균류)을 포함한다. 상기 두 개의 표지체(SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2)는 상기 나열된 모든 균류로부터 얻은 28S rDNA에 교잡되기 때문에, 임상 표본에 존재하기 쉬운 대부분의 균류의 존재를 진단할 수 있다. 상기 표지체들은 균류를 전체적으로 검출하기 위한 프라이머일것으로 생각된다.
또한, SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 나열된 표지체들은 유전자 은행에 등록된 539 박테리아의 23S 유전자 사이에서 교잡 위치를 조사함으로써 박테리아로부터의 23S 서열에 교잡시키고 증폭시키는(폴리머라제 연쇄 반응내에서) 그들의 잠재력에 대해 검사된다. 박테리아의 23S rDNA는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 적당한 교잡 위치를 갖지 않으며, 상기 두 표지체는 엄격한 조건에서 박테리아 DNA를 증폭할 수 없어야 한다.
본 발명의 두 번째 목적은 교잡 조건하에서 Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus flavus, Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus,, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropiclis, Pseudallescheria boydii 및 Sporothrix schenckii를 검출하는 종 특이 표지체를 개발하는 것이었다. 본 발명에서는 본 발명에 의해 서열화된 모든 유기체의 다중 서열 배열을 만드는 균의 28S 핵산 서열의 데이타베이스를 이용하였다. 모든 각각의 서열은 대상 군에서만 존재하며, 다른 모든 균류에는 존재하지 않는 서열의 독특한 영역을 발견하기 위해 우리의 데이타베이스 내의 다른 모든 서열과 칠저히 비교되었다. 서열의 특정 부분(stretch)이 확인될 때, 상기 특정 부분은 열적 프로파일 및 2차 구소에 대해 분석되었다. 본 발명에서 제조된 각 표지체는 교잡 조건하에서, 유일한 하나의 특정 표적 균의 특정 영역으로부터의 핵산 서열에 특히 교잡시키고 검출할 것이다. 상기 기술에 언급된 것을 통해 단일 가닥의 DNA 서열의 상세는 두 개의 균등한 RNA 서열 뿐아니라 상보적 DNA 서열의 유용성을 내포함을 알게 될 것이다. 더군다나, 핵산(즉, 염기, 당 또는 뼈대)를 포함하는 어떠한 일부분의 서열 삽입 변형은 상기 서열과 기능적으로 균등물이다. 또한, 상기 부가적인 서열이 표지체 또는 프라이머로서 작용하는 것이 인지되어야 한다. 결과적으로, 상기 기술에서 언급된 것은 광범위한 DNA 서열의 비교가 유기체(도 2)를 분화시키기에 총분한 변이성(variability) 및 유일성(uniqueness)을 제공한다는 것을 알려준다.
상기 종 특이 합성 표지체에 대한 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3 내지 SEQ ID NO:23에 나열되어 있다. 상기 서열에는 Cryptococcus neoformans에 대해 특정한 두 개의 표지체, Sporothrix schenckii에 대해 특정한 두 개의 표지체 및 Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Aspergillus flavus, Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis 및 Pseudallescheria boydii의 28S rRNA 및 rDNA에 특정한 하나의 표지체가 존재한다(표 3 내지 6 및 하기 부가 설명 참조).
본 발명에서 개발된 모든 종 특이 표지체는 신규하며, 우리가 알고 있는 한, 논문에 보고되지 않았다. 본 발명에서 서열화된 모든 28S 유전자는 종마다 서로 다르게 분석되는 몇몇 영역을 갖는 반면, 교잡 조건 하에서 종 특이 표지체로서 가장 기능을 잘 나타내는 영역은 자명하지 않았다. 각 28S 서열의 광범위한 분석으로 몇몇 잠재적인 표지체 위치를 얻었다. 상기 표지체 자리는 테스트 조건하에서 최적 교잡 특성을 얻기 위한 요구에 기초하여, 각 탐침에 대한 최적의 특정 위치를 선택할 수 있도록 하기 위해 더 상세히 연구되었다. 우리에 의해서 서열화된 모든 표지체 서열의 매우 특이적인 교잡 특성은 실험 결과에 의해 입증되었다. 유전자 은행에서 Candida albicans 및 Cryptococcus neoformans 28S 유전자의 단지 하나의 혈청형에 대한 서열의 선행 존재는 본 명세서에서 언급된 하나의 개체에 대해 상기 두 유기체 중 하나에 대한 종 특이 표지체를 개발하는 것을 가능하게 하기에 본질적으로 충분하지 않다. 우리는 우리가 상기 나열된 그 의의 유기체들과 교차(across) 반응하지 않는 상기 두 군 유기체에 대한 종 특이 표지체의 개발을 위해 강력한 영역을 확인할 수 있기 전에, Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida drusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans 혈청형 A, Crytococcus neoformans var. gattii 혈청형 B, Cryptococcus terreus, Cryptococcus laurentii, Filobasidiella(Cryptococcus) neoformans var bacillispora 혈청형 C, Filobasidiella(Cryptococcus) Neoformans var neoformans 혈청형 D, Filobasidium capsuligenum 및 Filobasidium uniguttulatum로 부터 신규한 28S 서열을 얻어야 했다.
Chomczynski 방법(하기 실시예 2 참조)의 변형으로 서로 관련성 없는(테스트된 임상용 표본의 다양성에 대한 표 8 참조) 임상용 표본으로부터 3 시간이내에 DNA서열을 얻올 수 있다. PCR 증폭과 연속적인 표지체화는 24시간내에 쉽게 완성될 수 있다. 결과적으로, 전통적인 방법에서 요구되는 몇일 또는 몇주와는 반대로 하루내에 최종 확인이 가능하다. 진단의 상기 속도 및 감도는 미확인 원인에 의한 균 질병과 싸우고 있는 쇠약해진 환자의 삶과 죽음에 영향을 미친다. 빠른 진단은 환자들이 미확인 균에 지배당하면서 몇일 또는 몇주를 기다리는 것보다 오히려 확인묀 원인이 되는 균을 치료하는 것에 대해 그들의 처방을 직접적으로 지시할 수 있게 한다.
본 발명의 표지체는 그들의 높온 수준의 특이성 때문에 혼합된 균 감염에서조차도 정확한 표적 유기체를 가려내는 능력을 갖는다. 호퍼 및 마이월드 등의 방법으로는 혼합된 균 감염에서 개개의 종들을 확인할 수 없는데, 이는 제한 단편 길이 다형태성(restriction fragment 1ength po1ymorphism) 결과가 다중 유기체들이 언제 상기 제한 단편에 기여하는지를 해석하는 것이 거의 불가능하게 하기 때문이다. 그들의 방법은 결과적으로, 순수한 배양에서만 이용될 수 있으며, 상기 방법은 또한, 상기 균이 우선 배양으로 자라야 하기 때문에, 진단 시간을 절약할 수 없다.
본 발명에서 개발된 표지체는 DNA의 단지 하나의 PCR 증폭 단편에 대해서 다중 표지체를 이용함으로써 많은 수의 병원 균류의 빠른 종 확인을 가능하게 한다. 본 발명의 변형된 DNA 추출 기술 및 혼합된 유기체의 경우에 있어서 정확하게 진단하는 능력이 결합되어, 상기 전략은 최소한의 시간내에 최대한의 진단 정보를 제공할 수 있다. 또한, 상기 진단 전략은 자동화로 분석할 수 있으며, 상기 자동화는 심지어 시간, 비용 및 노력의 더 많은 절약을 가져올 수 있다.
상기 서열의 변형과 함께, 본 명세서에서 청구된 서열 및 상보적 서열은 상기 기술의 앞으로의 향상 및 변경뿐 아니라 몇몇 현존하는 방법론들에 기초한 균류의 확인을 위한 방법에 잠재적으로 이용될 수 있다. 상기 기술은 교잡, 결찰(ligation), 중합화, 해중합화(depolynerization), 서열화(sequencing), 화학 분해, 효소 가수분해, 전기영동, 크로마토그래피(chron1atography) 및 증폭화에 기초한 방법을 포함하지만, 상기 방법에 한정되지 않는다. 더군다나, 모든 상기 변형은 궁극적으로 몇몇 선택 또는 증폭 방법, 몇몇 리간드 또는 본 출원에서 청구된(SEQ ID NO:1) 내지(SEQ ID NO:23)의 서열을 인지하거나 이용하는 몇몇 핵산의 일부분에 기초한다. 상기 변형은 수 많은 형태의 PCR, 상기 리가아제(ligase) 연쇄 반응, Q-베타 레플리아제(Q-beta repliase) 등과 같은 다양한 직선의 또는 지수의 표적 증폭 도식의 사용;상기(SEQ ID NO:3) 내지(SEQ ID NO:23) 군으로부터 선택된 표지체를 이용한 순수 군 배양으로부터 정제되거나 추출된 종 특이 핵산의 직접적 검출;(SEQ ID NO:1) 내지(SEQ ID NO:23)의 상보적 DNA의 이용;상기 서열 및 상보적 서열의 RNA 형태의 이용; 및 핵산 서열, 단백질, 아크리디늄 에스테르(acridinium ester)와 같은 신호 발생 리간드 및/또는 상자기성(para1llagnetic) 입자를 포함하는 다양한 라벨(label)로부터 하나 또는 그 이상의 리포터(reporter) 부위의 첨가에 의해 상기 DNA 또는 RNA 서열의 유도체의 이용을 포함하지만, 상기 이용에 한정되지 않는다. 상기 기술은 DNA, RNA 또는 표적 또는 검출 분자로 이용되는 변형된 유도체와 함께 이용될 수 있다.
SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:23의 23개의 서열에 부가하여, 우리는 또한 SEQ ID NO:24 내지 SEQ ID NO:74의 51개의 부가적인 서열을 기술한다. 상기 51개의 서열은 SEQ ID NO:3 내지 SE.Q ID NO:23을 포함하며, 대조용 S. cerevisiae 28S rRNA 유전자의 염기 번호 431에 일치하는 배위 1(coordinate 1)과 함께 다양한 서열 배열(도 2)로서 나타난다.(상기 수는 대조용 S. cerevisiae 28S rRNA 유전자의 일차 서열과 비교된다. 유전자 접수 번호:JO1355). 상기 서열은 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2의 프라이머와 함께 다양한 균류로부터 28S rDNA를 증폭하고 서열화함으로써 얻어졌다.(상기 SEQ ID NO:1은 대조용 S. cerevisiae의 배위 403 내지 422와 일치하며, 상기 SEQ ID NO:2는 대조용 S. cerevisiae의 배위 645 내지 662와 일치한다).
상기 배열된 서열의 분석은 상기 종 특이 표지체 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23을 개발하게 하였으며, 상기 표지체 위치는 밑줄로 표시된다. 상기 51 개의 배열된 서열은 당업자가 10 내지 50의 뉴클레오티드 길이에서 종 특이 교잡 표지체를 개발하기에 충분한 다양성을 포함한다. 유사하게, 전체 200+ 뉴클레오티드 길이를 포함하는 더 긴 종 특이 교잡 표지체도 또한 고안될 수 있다. 또한 종확인은 프라이머 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 함께 증폭된 어떠한 DNA의 직접적인 DNA서열 결정에 의해 수행될 수 있다. 만일 상기 유도된 서열이 SEQ ID NO:24 내지 SEQ ID NO:74 내의 어떠한 서열과 약 98% 또는 그이상 일치된다면, 상기 유기체의 정체가 확인될 수 있을 것이다.
더군다나, 우리는 SEQ ID NO:24 내지 SEQ ID NO:74의 일부분이 속 또는 그이상의 단계에서 계통 발생학적으로 정렬된 균류의 군에 대해 특이적이라는 것을 알고 있다. 또한, SEQ ID NO:24 내지 SEQ ID NO:74, 그들의 상보적 서열은 상기 서열들의 변헝과 함께, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:23에 대해 상술한 바와같이 현존하는 방법론 및 장래 기술에 기초한 균류의 확인을 위한 조사에 매우 유용할 것이다.
도 2에 대한 설명:
상기 다중 서열 배열은 프라이머 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2로 증폭된 28S 리보좀 RNA 유전자의 서열을 나타낸다. 21개의 종 특이 표지체들(SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23)은 밑줄로 표시된다. 같은 유기제의 두 격리체 사이의 소수의 서열 변형은 적절한 코드(code)로 나타내었다(하기 약어 참조). Rhizopus 종 사이의 주요한 차이는 배열 내에서 3개의 분리된 Rhizopus 서열을 포함시킨 것으로써 나타난다.(본 도의 상기 유기체는 그들의 서열 관련도에 따라 나열된다.)
상징 약어:
(.) 서열 내에서 배열을 촉진시키기 위한 간격
(R) A 또는 G
(W) A 또는 T
(Y) T 또는 C
(M) A 또는 C
(K) T 또는 G
(S) G 또는 C
(B) T, G 또는 C
상기 명명된 서열을 이용한 본 발명의 더욱 가해진 변형은 당업자에게는 분명해질 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 다양한 목적을 예시하고 있지만, 그 유용성을 한정하지는 않는다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 균류의 28S 서브유니트 상에서 기록된 상기 서열의 상대적 위치를 나타낸다.
도 2A, B, C 및 D는 모두(SEQ ID NO:24) 내지(SEQ ID NO:74)에 걸쳐 다양한 서열 정렬을 나타낸다.
[실시예]
실시예 1
표지체 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23의 교잡 특이성에 대한 테스트
SEQ ID NO:3 내지 또Q ID NO:23에서 나열된 표지체는 그들의 표적 유기체에 대한 특이성에 대하여 테스트되었다. Candida albicans의 표지체 SEQ ID NO:5는 상기 마이오 클리닉 수집으로부터 얻은 균류의 패널에 대해 첫 번째로 테스트된 것이다. Acremonium 종, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus unguis, Aspergillus ustus, Aspergillus 종, Beauvaria 종, Bipolaris 종, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Chrysosporium 종, Cladosporium 종, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans 혈청형 A, Curvularia 종, Fusarium 종, Geotrichum 종, Histoplasma capsulatum, Mucor 종, Penicillium 종, Pseudallescheria boydii, Rhizopus 종, Saccharomyces cerevisiae, Scopulariopsis brevicaulis, Sporothrix schenkii 및 Trichosporon beigelii에서 얻은 28S rDNA는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2의 올리고뉴클레오티드 표지체를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응에서 증폭된다. 모든 PCR 증폭은 50μl의 반응 부피내에서 Perkin-Elmer(Norwalk, CT) 0.5ml의 얇은 막 폴리프로필렌(polypropylene) 튜브 및 Perkin-Elmer 열적 회로를 이용하여 열-개시(hot-start)반응으로서 수행되었다. 처음으로 튜브에 첨가되는 반응물은 2.5μl의 10X PCR 완충액(100mM 트리스 pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2), 5.0μl의 50% 글리세롤/1mM 크레졸 레드, 8.0μl의 dNTP 혼합(dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP 각각 1.25mM), 11 피코몰의 각 핵산 프라이머 및 25μl 부피를 맞추기 위한 멸균수이었다. 왁스 거품(wax bead, Ampliwax Gem=100, Perkin-Elmer)이 첨가되었고, 상기 튜브가 77℃에서 30초간 가열되었으며, 왁스 경계를 형성하는 실온으로 냉각되었다. 2.5μl의 1OX PCR 완충액, 5.0μl의 50% 글리세롤/1mM 크레졸 레드, 0.2μl의 타크 폴리머라제(Taq po1ymerase, AmpliTaq 5U/1μl, Perkin-Elmer) 및 15.3μl의 멸균수가 상기 균의 전체 세포 용균액으로부터 추출한 2.0μl의 DNA와 함께 첨가되었다. 열적 회로의 50 사이클이 94℃에서 30초간, 50℃에서 1분간, 72℃에서 2분간 수행되었다. 상기 나열된 각 균으로부터 얻어진 28S rDNA의 성공적인 증폭을 가시적으로 확인하기 위해, 각 표본으로부터 폴리머라제 연쇄 반응 혼합물 5μl가 5% 플리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel) 상에 전개되었다. 40μl의 잔류의 증폭된 28S rDNA가 1N NaOH에서 변성되었고, 상기 변성된 rDNA의 반이 0.5N NaOH에서 평형된 막(equilibrated membrane)을 이루는 양으로 하전된 폴리설폰(polysulphone)에 점적되었다. 상기 막은 15분간 공기 건조되었고, 80℃의 진공오븐에서 30간 구워졌다. 각 종으로부터 증폭된 rDNA가 비로소 결합되고, 막위의 분리된 점에서 고정되었다. 막 위의 자유로운 결합 위치는 교잡 완충액에서 40℃에서 약 3시간동안 막을 인큐베이션(incubation)시킴으로써 저지되었다(상기 교잡 완충액 100ml는 비지망 우유 분말 1g, 6g의 NaH2PO4, 7g SDS, 20Oμl의 0.5M EDTA를 사용하여 제조되고, NaOH를 이용하여 pH 7.2로 조정되었다). 0.5M EDTA를 사용하여 제조되고, NaOH를 이용하여 pH 72로 조정되었다). Candida albicans(SEQ ID NO:5)에 대해 특이한 표지체는32P ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(kinase)를 이용하여 방사성 인(radioactive phosphorus)으로 말단에 라벨되었다. 상기 표지체 50 피코몰온 70ml의 교잡 완충액에 첨가되고, 상기 막은 40℃에서 하룻밤동안 표지체화되었다. 상기 막은 40℃에서 15분간 교잠 완충액으로 세척된 후 40℃에서 15분간 2X SSC로 세척되었다. 상기 막은 세척된 후 적어도 1시간동안 엑스레이 필름상에 노출되었다. 상기 올리고뉴클레오티드 표지체 SEQ ID NO:5는 Candida albicans에 대해 대단히특이적이다. 올리고뉴클레오티드 표지체 SEQ ID NO:5는 하나 또는 두 개의 염기만큼 Candida의 다른 종의 서열과 구별되나, 상기 불일치는 안정한 교잡이 다른 Candida종과 함께 형성되는 것을 방해하기에 충분하다.
Candida albicans 표지체 SEQ ID NO:5에 대해 상술한 바와 같이, 표지체 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23는 이전 문단에서 나열된 균류의 동일한 패널에 대한 특이성에 대해 테스트되었다. Candida albicans 표지체 SEQ ID NO:5로 표지체화된 막을 이루는 상기 양으로 하전된 폴리실폰은 주변의 모든 Candida albicans 표지체를 제거하기 위해 40℃에서 10분간 0.5N NaOH로 세척하였다. 상기 막은 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23에 나열된 모든 표지체를 이용하여 연속적으로 표지체화되었다. 각각의 연속적으로 테스트된 표지체에 대해, 상기 막은 적어도 30분간 저지되었고, 표지체 교잡이 40 내지 42℃에서 적어도 3시간동안 수행되었으며, 교잡후(post-hybridization) 세척은 2X SSC용액으로 약 20분간 행해졌다. 상기 막은 40 내지 42℃에서 0.5 내지 1.0N NaOH 용액으로 세척함으로써 표지체 사이에서 제거되었다. 표 3 내지 6에 결과가 나열된다.
표 3 내지 6에서 나타난 바와 같이, SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23에 나열된 각 표지체는 단지 하나의 표적 균의 28S 핵산 서열에 특이적으로 교잡된다. 상기 특이성은 높은 수준의 신뢰성을 가진 혼합된 군 유기체를 함유하는 임상용 표본에서, 주어진 종의 균을 확인하는데 필수적이다. 상기 표에서 나열된 39개의 유기체들은 임상용 표본으로부터 공통적으로 분리된 대부분의 유기체를 나타낸다. 우리가 19개의 개개의 유기체 전체를 확인시키는 21개의 종 특이 표지체(SEQ ID NO:3 내지SEQ ID NO:23)를 개발하는 동안, 본 발명의 표지체가 임상용 표본에 존재하기 쉬운 다른 균류와 어떠한 교차-결합성도 갖지 않는다는 것을 확인하기 위해 상기 테스트 패널에 나열된 부가적인 유기체들이 사용되었다. 정확하고 신뢰성있게 진단하고, 종 수준으로 상기 많은 수의 병원체를 확인할 수 있는 능력은 다른 어떤 보고로도 대항할 수 없다. 한 쌍의 만능 표지체(SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO: 2)에 의해 증폭된 DNA를 표지체화함으로써 우리가 이를 얻올 수 있다는 사실은 21개의 다른 표지체(SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23)로 하나의 증폭된 표적을 테스트할 수 있는 능릭을 제공함으로써 진단이 시간, 비용 및 노력을 절약한다는 점에서 많은 잇점이 있다.
유전자 은행 조사는 유사한 서열이 상기 데이타베이스에 존재하는지를 결정하기 위해 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23에 나열된 모든 표지체를 이용하여 수행되었다. Candida albican 및 Cryptococcus neoformans의 한가지 혈청형에 대한 28S 서열은 유전자 은행에 이미 존재하며, 기대한 바와 같이, Candida albicans 및 Cryptococcus neoformans에 대한 표지체는 상기 두 유기체로부터 분리된 28S 서열과 정확하게 일치하였다. 또한 10개의 다른 표지체들이 상기 28S 유전자(표 7)와 관련이 없는 다양한 속으로부터 분리된 DNA와 상응하였다. 짧게 뻗어 있는 서열의 동일성이 같은 또는 다른 유기체로부터 분리된 관련 없는 유전자에 있는 조회(query) 서열에 대해 종종 발견될 수 있기 때문에 상기 사실은 기대되었다. 상기 관찰 사실은 본 기술에서 언급된 것으로 알려진다. 모든 경우에 있어서, 표지체 서열과 상응되는 서열은 상기 28S rRNA 유전자내에 위치하지 않았다. 본 발명의 표지체는 표지체 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 함께 폴리머라제 연쇄 반응내에서 미리 증폭된 28S DNA를 분석하는데 이용된다. 염격한 조건하에서, 상기 두 표지체는 군의 28S rRNA 유전자로부터 DNA를 증폭시킨다. 그러므로, 표 7에 나열된비-28S 유전자로부터 증폭되지 않은 DNA는 표지체 SEQ ID NO: 3 내지 SEQ ID NO:23의 교잡에 유용할 것이다. 비-28S에서 관련된 유전자의 존재, 즉 증폭되지 않은 유전자는 검출되지 않을 것이며, 결과적으로 본 발명의 검출 및 확인 전략의 민감성 또는 특이성에는 어떠한 영향도 미치지 않을 것이다.
(표 3a)
표지체 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:8을 이용한 종 특이 28S 서열의 검출
(표 3b)
표지체 SEQ ID N0:3 내지 SEQ ID N0:8을 이용한 종 특이 28S 서열의 검출
(표 4a)
표지체 SEQ ID NO:9 내지 SEQ ID NO:14를 이용한 종 특이 28S 서열의 검출
(표 4b)
표지체 SEQ ID N0:9 내지 SEQ ID N0:14를 이용한 종 특이 28S 서열의 검출
(표 5a)
표지체 SEQ ID NO:15 내지 SEQ ID NO:20을 이용한 종 특이 28S 서열의 검출
(표 5b)
표지체 SEQ ID N0:15 내지 SEQ ID N0:20을 이용한 종 특이 28S 서열의 검출
(표 6a)
표지체 SEQ ID NO:21 내지 SEQ ID NO:23을 이용한 종 특이 28S 서열의 검출
(표 6b)
표지체 SEQ ID NO:21 내지 SEQ ID NO:23을 이용한 종 특이 28S 서열의 검출
(표 7a)
표지체 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23와 100% 동일성을 갖는 다른 유기체로부터 분리된 유전자를 나열한 유전자 은행 조사 결과
(표 7b)
표지체 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23에 100% 동일성읕 갖는 다른 유기체로부터 분리된 유전자를 나열한 유전자 은행 조사 결과
*주의:본 명세서에서 상술한 바와 같이, 28S와 관련 없는 유전자내에서 표지체 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23과 유사한 서열의 존재는 본 발명의 진단 전략의 특이성 또는 민감성에 어떠한 영향도 미치지 않는다. 본 발명의 종 특이 표지체는 본 발명의 표지체 SEQ ID N0:1 및 SEQ ID N0:2를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응에서 미리 증폭된 28S DNA 를 분석하는데 이용된다. 상기 두 표지체는 칼럼 #4 (필적되는 유전자)에 있는 28S 이의에 어떠한 유전자의 DNA도 증폭시키지 않으며, 그러므로 상기 비-28S 유전자로부터 증폭된 어떠한 DNA도 표지체 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23의 교잡에 유용하지 않을 것이다.
실시예 2
특정 균 유기체에 대한 임상용 표본을 테스트하기 위해 실시예 1의 방법의 이용
건강한 사람의 호흡기 및 식도로부터 얻은 임상용 표본은 거의 항상 몇몇 균식물군(flora)을 함유한다. 상기균의 대부분은비-병원체이나,병원체균류에 대한 전통적인 면역화학적 진단 테스트에 대해서 부정확한 양성반응을 나타낼 수도 있다.
우리는 타액 및 절단 배수관 (incision drainage tube)에서 추간 연골(intervertebrak disc) 및 폐 생검 (1ung biopsies)에 걸친 다양한 출처원으로부터 44개의 임상 표본을 얻었다. 전형적인 표본 및 배양 결과는 모든 44개의 표본이 적어도 한가지 형태의 균을 함유한다는 것을 보여주었다. 본 발명의 표지체의 효율성을 테스트하기 위해, 우리는 모든 44개의 표본으로부터 DM를 추출했으며, 상기 표본에 존재하는 균의 28S 서열을 증폭시키기 위해 폴리머라제 연쇄 반응에서 표지체 SEQ ID N0:1 2를 사용하였다.
세포 및 조직으로부터 RNA를 우선적으로 추출하기 위해 산 구아니디늄 티오시아네이트-폐놀-클로로포름 (acid guanidinium thiocyanate-pheno1-chloroform)의 사용을 최초로 기술한 촘친스키(Chomczynski) 및 싸키(Sacchi) 기술을 변형하여 모든 임상용 표본에서 DNA를 추출하였다. 우리는 세포로부터 우선적으로 DNA를 추출하기 위해, 실은 세포 용균작용(room temperature lysis)을 끓는온도 용균작용(boiling lysis)으로 대치시켰으며, 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름을 알칼린 페놀-구아니딘 티오시아네이트로 대치시켰다. 0-링 봉합을 이용한 1.5(㎕)의 Sarsted(Newton, North Carolina) 폴리프로필렌 스크류 캡 튜브가 추출에 사용되었다. 표본 200㎕가 GTP 시약(트리스 pH 8.0에서 완충된 동일 부피의 페놀과 혼합된 50mM 트리스 pH 8.3 용액에 용해된 구아니딘 티오시아네이트 6M) 500㎕에 첨가되었다. 상기 용액은 교반시킴으로써 혼합되며 즉시 끓는 물 중탕에서 15분간 방치되었다. 상기 튜브는 5초간 마이크로원심분리기에서 돌려졌으며, 클로로포름/이소아밀 알코을 용액 (부피비 24:1) 250㎕가 첨가되었고, 교반시켜 혼합되었다. 상기 용액을 10분간 원심분리하여 액체상을 분리시켰으며, 수용액 (위쪽) 상의 450㎕를 새로운 튜브에 옮졌다. 상기 수용액 상은 100% 이소프로판을 500㎕에 혼합되있으며, -20℃에서 적어도 1시간동안 방치되었다. 상기 방치시간의 거의 끝 부분에서 상기 튜브를 15분간 원심분리시켰으며, 핵산 침전물을 흐트러뜨리지 않고 상등액을 제거했다. 상기 침전물은 GTP 시약의 잔존부분을 제거하기 위해 500㎕의 얼음 냉각된 70% 에탄을 용액으로 2번 조심스럽게 상하로 흔들어서 세척되었다. 상기 에탄올은 제거되고, 상기 침전물은 스피드-진공 오븐 (speed vac)에서 10분간 건조되었다. 상기 침전물은 25㎕의 멸균 탈이온화 증류수로 재 혼탁되었고, 상기 혼탁 용액 5(㎕)가 50(㎕) PCR 증폭에 사용되었다. 상기 PCR은 실시예 1에서 기술된 표지체 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 대한 열적 회로 조건을 이용하여 열-개시 반응으로 수행되었다. 젤-전기영동은 표지체 SEA ID NO:1 및 SEQ ID NO:2이 모든 44개의 표본에서 분리된 DNA를 성공적으로 증폭시켰다는 것을 보여주었다.
각 표본으로부터 증폭된 DNA는 막을 이루는 양으로 하전된 폴리실폰에 옮겨졌다. 우리는 본 발명의 종 특이 표지체 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO:6, SEQ ID NO:7을 방사능으로 라벨시켰으며, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Coccidioides 및 Cryptococcus neoformans로부터 분리된 28S rDNA의 존재에 대해 개별적으로 테스트하기 위해 상기 막을 계속적으로 표지체화시켰다. 막 저지, 표지체 교잡 및 세척은 실시예 1에서 기술된 바와 동일하게 행해졌다. 상기 결과는 표 8에 나타내었다.
테스트된 임상용 표본에서, 어떠한 부정확한 양성반응도 관찰되지 않았으며, 상기 4개의 표지체에 대해 100% 특이성을 나타내었다. Aspergillus fumigatus에 대해서는 12개의 배양 양성 표본 중 10개가, Candida albicans에 대해서는 13개의 표본 중 11개가 확인되었으며, 상기 두 표지체에 대해 약 85%의 검출 민감도를 나타내고 있다. 더군다나, 두 개의 Coccidioides immitis 중 두 개 및 두 개의 Cryptococcus neformans 중 두 개가 정확하게 확인되있다 (100%의 검출 민감도).
상기 결과에 의해 나타내어진 바와 같이, 본 발명에서 기술된 상기 표지체는 높은 효율성을 가지고 다양한 임상 표본에서 사용될 수 있다.
(표 8a)
임상용 표본에서 종 특이 표지체를 이용한 Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Coccidioides immitis 및 Cryptococcus neoformans의 검출
(표 8b)
임상용 표본에서 종 특이 표지체를 이용한 Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Coccidioides immitis 및 Cryptociccus neoformans의 검출
실시예 3
미확인 균 유기체의 확인에 기초한 DNA 서열
본 발명의 표지체의 또다른 유용성은 균의 순수 배양의 확인에 기초한 빠른 DNA 서열에 있다. 표지체 SEQ ID N0:1 및 SEQ ID N0:2는 폴리머라제 연쇄 반응에서 미확인 균의 28S rDNA를 증폭시키는데 사용된다. 표지체 SEQ ID N0:1 또는 SEQ ID NO:2는 결과적으로 상기 미확인 균에 속하는 증폭된 상기 28S rDNA로부더 DNA 서열을 얻기 위한 서열화 프라이머로써 사용된다. 상기 DNA 서열은 본 명세서의 데이타베이스에서 나타난 상기 군의 28S DNA 서열과 비교되며, 서열 조화나, SEQ ID N0:3 내지 SEQ ID N0:74에 있는 상기 표지체 서열의 어느 하나를 증폭시키는 것은 상기 균의 확인을 확실시 할 것이다. 상기 기술은 하나의 균 이상에서 분리된 DNA를 함유하고 있기 때문에, 임상용 표본에 직접적으로 사용될 수 없으며, 산출된 DNA 서열은 몇몇 유기체의 중복 서열로 이루어질 것이다. 상기 기술은 배양 판, 임상용 표본, 식품, 약용, 환경 또는 단지 하나의 균 종을 함유하는 다른 표본상에서 하나의 균의 콜로니 (co1onies)를 빠르고 신뢰성있게 확인하는데 이용된다.
실시예 4
표적 DNA 또는 RNA의 포획 및 확인
본 발명의 명세서에서 기술된 모든 프라이머 및 표지체는 방사성 동위원소(radioisotopes), 효소, 항원, 항체, 화학 발광제(chemiluminescent) 및 형광시약 (fluorescent chemica1)을 포함하지만, 그것에 한정되지 않는 어떠한 검출 가능한 리포터 또는 신호 부분으로 라벨될 수 있다. 더군다나, 상기 표지체는 제한위치 또는 다른 유용한 서열에 삽입되도록 고안된 뉴클레오티드의 최종 첨가에 의해, 그들의 목적 물질을 변화시키지 않으면서 변형될 수 있다. 또한, 상기 표지체는 포획 부분 (상자기성 입자, 바이오틴 (biotin), 플루오레세인 (fluorescein), 디옥시제닌 (didxigenin), 항원, 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않음)의 첨가에 의해 변형되거나, 상기 표지체 및 상기 표지체에 교잡된 어떠한 DNA 또는 RNA의 고체상 포획 및 정제를 돕기 위해 미세적정 트레이 (microtiter tray)의 벽에 부착될 수 있다. 상기 플루오례세인은 포획 부분으로서 뿐 아니라 신호 부분으로서 사용 될 수 있으며, 상기 포획 부분은 항-플루오레세인 항체와 상호작용함으로써 사용된다.
상기 변형의 전형적 이용은 다음과 같다. 프라이머 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2는 이전에 기술된 바와 같이 표본으로부터 28S rDNA 를 증폭시키기 위해 실용화될 것이다. 프라이머들은 그들의 5' 말단에서 바이오틴 부분을 함유하기 위해 변형될 것이다. 상자기성 입자와 같은 스트렙타비딘 (streptavidin) 고체상은 상기 반응 혼합물로부터 PCR 생성물을 분리시키는데 이용될 것이다. 상기 증폭된 표적은 균의 어떤 종이 상기 주어진 표본 내에 존재하는지를 결정하는 검출 가능한 부분에 부착된 세 번째 표지체 ((SEQ ID N0:3 내지 SEQ ID N0:74 또는 그들의 상보 서열)에 연속적으로 교잡될 것이다. 다른 검출 가능한 부분으로 각각 라벨된 다양한 표지체는 상기 증폭된 표적을 분석하는데 동시에 이용될 수 있다.
선택적으로, 표지체 SEQ ID N0:1 및 SEQ ID N0:2는 상술한 바와 같이, 표본으로부터 28S rDNA를 증폭시키는데 이용될 것이다. 분리 반응에서, 독립적으로, SEQ ID N0:1 또는 SEQ ID N0:2 중 하나가 상자기성 입자와 같은 고체상 포획 부분에 부착됨으로써 변형될 것이머, SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID N0;74 (또는 그들의 상보 서열)는 검출 가능한 부분의 첨가에 의해 변형될 것이다. 선택적으로, 상기 앰플리콘내에서, SEQ ID N0:3 내지 SEQ ID NO:74를 포함하지만 이에 한정되지 않으며, SEQ ID NO:1 및 SEQ ID N0:2에 의해 한정된 어떠한 서열은 포획 표지체의 고안에 이용될 수 있다. 고체상 (SEQ ID N0:1 및 SEQ ID N0:2) 또는 어떠한 다른 적절하게 고안된 서열에 부착된 상기 표지체 중 하나 및 검출 가능한 부분(SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:74 또는 그들의 상보 서열)에의 부착에 의해 변형된 상기 표지체 증 하나는 용액상태에서, 만일 그들이 생산된다면, 상기 PCR 생성물에 함께 교잡될 것이다. 상기 잡종(hybrid)은, 만일 존재한다면, 상기 용액으로부터 포획될 것이며, 상기 검출 가능한 부분에 적합한 방법에 의해 분석될 것이다. 상기 교잡된 표지체의 검출은 어떠한 균 종이 주어진 표본에 존.재하는지를 지시할 것이다. 다양한 검출 가능한 부분으로 각각 라벨된 다수의 표지체는 상기 증폭된 표적을 분석하는데 동시에 이용될 수 있다.
실시예 5
균 DM의 종-특이 증폭
본 발명에서 기술된 상기 표지체의 또다른 유용성은 핵산 증폭 반응에 의해서 특정한 균 종의 직접적인 검출에 있어서 프라이머로써 그들의 쓰임에 있다. 본 구체적 실시예에서는, 하나의 프라이머는 (SEQ ID NO:1) 또는 (SEQ ID NO:2)와 같은 만능의 프라이머이며, 다른 하나는 (SEQ ID NO:3) 내지 (SEQ ID NO:23) 또는 그들의 상보 서열로 이루어진 상기 균으로부터 선택된 종-특이 프라이머이다. 상기 접근의 한 변형은 상기 종-특이 프라이머에 근접하게 위치한 어떠한 작용기 서열과 (SEQ ID NO:1) 또는 (SEQ ID NO:2)의 치환이다. 상기 접근의 또다른 변형은 SEQ ID N0:24 내지 SEQ ID N0:74의 어떠한 적절한 종 특이 프라이머 쌍의 선택이다.
서열 목록
(1) 일반정보
(i) 출원인:
(A) 샌드휴, 걸프리트 에스.
(B) 클라인, 브루스 시.
(ii) 발명의 명칭:균류의 검출 및 확인을 위한 핵산 표지체
(iii) 서열의 수:23
(iv) 수취인 주소:
(A) 수취인:시바 코녕 다이아그노스틱스 코오포레이션
(B) 거리:노오쓰 스트리트 63
(C) 시:메드필드
(D) 주:메사추세츠
(D 국가:미합중국
(F) 우편번호:02052
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 형태:디스켓 3.5인치,1.44Mb 저장
(B) 컴퓨터: IBM PS/2
(C) 운영 체계:MS-DOS 6.2
(D) 소프트웨어:워드 6.0
(vi) 현행 응용 데이타:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(vii) 선행 응용 데이타:
(viii) 변리사 정보:
(A) 성명:모겐스테른, 아써 에스.
(B) 등록 번호:28,244
(C) 사건 번호:CCD-180
(ix) 통신 정보:
(A) 전화:508-359-3836
(B) 팩스:508-359-3885
(2) SEQ ID N0:1에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이: 20
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:균 유기체를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열1
(3) SEQ ID NO:2에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:18
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:군 유기체를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 2
(4) SEQ ID N0:3에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Aspergillus fumigatus를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 3
(5) SEQ ID N0:4에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:13
(B) 타입:핵산
) 쇄의 수:1본쇄
) 토폴로지:직쇄상
ii) 분자 타입:Blastomyces dermatitidis를 위한 핵산 표지체
iii) 추정서열:아니오
iv) 앤티센스:아니오
서열 4
(6) SEQ ID N0:5에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Candida albicans를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 5
(7) SEQ ID N0:6에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Coccidioides immitis를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 6
(8) SEQ ID N0:7에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이: 14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Cryptococcus neoformans를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 7
(9) SEQ ID NO:8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Cryptococcus neoformans를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 8
(10) SEQ ID N0:9에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Histoplasma capsulatum을 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 9
(11) SEQ ID NO:1O에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Aspergillus glaucus를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 10
(12) SEQ ID NO:11에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 좨의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Aspergillus niger를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 11
(13) SEQ ID NO:12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Aspergillus terreus를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열12
(14) SEQ ID NO:13에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Candida glabrata를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열13
(15) SEQ ID NO:14에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이: 14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Candida guilliermondii를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열14
(16) SEQ ID N0:15에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:헥산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Candida kefyr를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열15
(17) SEQ ID N0:16에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Candida krusei를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열16
(18) SEQ ID N0:17에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Candida lusitaniae를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열17
(19) SEQ ID NO:18에 대한 졍보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Candida parapsilosis를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열18
(20) SEQ ID N0:19에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Candida tropicalis를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열19
(21) SEQ ID NO:20에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Pseudallescheria boydii를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 20
(22) SEQ ID NO:21에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Aspergillus flavus를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 21
(23) SEQ ID NO:22에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Sporothrix schenckii를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 22
(24) SEQ ID N0:23에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:14
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:Sporthrix schenckii를 위한 핵산 표지체
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 23
(25) SEQ ID N0:24에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:208
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Acremonium 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 24
(26) SEQ ID NO:25에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:212
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토푤로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus clavatus 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 25
(27) SEQ ID N0:26에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:212
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus flavus 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 26
(28) SEQ ID NO:27에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:212
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus fumigatus 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 27
(29) SEQ ID NO:28에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:212
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus glaucus 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 28
(30) SEQ ID NO:29에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:213
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus nidulans 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 29
(31) SEQ ID NO:30에 대한 겅보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:212
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus niger 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 30
(32) SEQ ID NO:31에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:212
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus ochraceus 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 31
(33) SEQ ID NO:32에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus terreus 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 32
(34) SEQ ID NO:33에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:213
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus unguis 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 33
(35) SEQ ID N0:34에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:212
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Aspergillus ustus 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 34
(36) SEQ ID NO:35에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:208
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Beauveria 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 35
(37) SEQ ID N0:36에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:213
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Bipolaris 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 36
(38) SEQ ID N0:37에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:105
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Blastoschizomyces 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 37
(39) SEQ ID NO:38에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:214
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 B1astomuces dermatitidis 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 38
(40) SEQ ID NO:39에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:213
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Chrypsosporium 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 39
(41) SEQ ID N0:40에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:207
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Cladosporium 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 40
(42) SEQ ID NO:41에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:213
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Curvularia 종 특이 영역
(iii) 추정서얼:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 41
(43) SEQ ID NO:42에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:213
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Candida albicans 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 42
(44) SEQ ID N0:43에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:223
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Candida g1abrata 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
iv) 앤티센스:아니오
서열 43
(45) SEQ ID N0:44에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:212
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Candida guillier'11ondii 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 44
(46) SEQ ID N0:45에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:214
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Coccidioides im11litis 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 45
(47) SEQ ID N0:46에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:187
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Candidakefyr 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 46
(48) SEQ ID NO:47에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:213
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Candidalkrusei 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 47
(49) SEQ ID N0:48에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:236
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Cryptococcus laurentii 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 48
(50) SEQ ID NO:49에 대한 정보:
( i ) 서열 특깅:
(A) 길이:173
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Candida lusitaniae 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 엔티센스:아니오
서열 49
(51) SEQ lD NO:50에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:238
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Cryptococcus neoformans var gattii (혈청형 B) 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 50
(52) SEQ ID N0:51에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:238
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Cryptococcus neoformans var gattii (혈청형 B) 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 51
(53) SEQ ID NO:52에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:2l1
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Candida parapsilosis 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 52
(54) SEQ ID N0:53에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:238
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Cryptococcus terreus 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 엔티센스:아니오
서열 53
(55) SEQ ID NO:54에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:211
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Candida tropicalis 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 54
(56) SEQ ID N0:55에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:211
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Fusarium 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 55
(57) SEQ ID N0:56에 대한 졍보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:238
(B) 타입 1:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Filobasidiumlcapsuligenum 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 56
(58) SEQ ID NO:57에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이: 238
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Filobasidiella neoforlnans varbacillispora (혈청형 C) 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 57
(59) SEQ ID N0:58에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:238
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Filobasidiella neoformans varneoformans (혈청형 D)종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 58
(60) SEQ ID N0:59에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:236
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Filobasidium uniguttulatum 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 59
(61) SEQ ID NO:60에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 204
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Geotrichum 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 60
(62) SEQ ID N0:61에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:214
(B) 다입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로시:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Histoplasnla capfulatum 송 특이 엉역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 61
(63) SEQ ID NO:62에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:215
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Malbtanchea 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 62
(64) SEQ ID NO:63에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:237
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Mucor 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 엔티센스:아니오
서열 63
(65) SEQ ID NO:64에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:209
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Paecilomyces 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 64
(66) SEQ ID NO:65에 대한 정보:
( i ) 서열 특징:
(A) 길이:199
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Penicillium 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 65
(67) SEQ ID NO:66에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:210
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Pseudallescheria boydii 종 특이 영역
(iii) 추정서언:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 66
(68) SEQ ID NO:67에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 244
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Rhizopus 종 (NO:1) 특이 잉역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 67
(69) SEQ ID NO:68에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:215
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Rhizopus 종 (NO:2) 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 68
(70) EQ ID NO:69에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:215
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Rhizopus 종 (NO:3) 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 69
(71) SEQ ID NO:70에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:210
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Sporothrix 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 엔티센스:아니오
서열 70
(72) SEQ ID NO:71에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:208
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Scopulariopsis brevicaulis 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 71
(73) SEQ ID NO:72에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:210
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Scopulariopsis brumptii 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 72
(74) SEQ ID NO:73에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:214
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄
(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Sacchlaromyces cerevisiae 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 73
(75) SEQ ID NO:74에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이:236
(B) 타입:핵산
(C) 쇄의 수:1본쇄(D) 토폴로지:직쇄상
(ii) 분자 타입:28S 유전자의 Tric11osporon beigelii 종 특이 영역
(iii) 추정서열:아니오
(iv) 앤티센스:아니오
서열 74
Claims (9)
- Acremonium 종, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus unguis, Aspergillus ustus, Beauvaria 종, Bipolaris종, Blastoschizomyces종, Blatomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Chrysosporium 종, Cladosporium 종, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans var gattii 혈청형 B, Crytococcus neoformans 혈청형 A, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus terreus, Curvularia종, Fusarium종, Filobasidium capsuligenum, Filobasidiella (Cryptoccus) neoformans var bacillisopora 혈청형 C, Filobasidiella(Cryptoccus) neoformans var neoformans 혈청형 D, Filobasidium uniguttulatum, Geotrichum 종, Histoplasma capsulatum, Malbranchea종, Mucor종, Paecilomyces종, Penicillum종, Pseudallescheria boydii, Rhizopus종, Sporothrix schenkii, Scopulariopsis brevicaulis, Scopulariopsis brumpti, Saccharomyces cerevisiae 및 Trichosporon beigelii로 이루어진 군으로부터 선택된 한 종을 확인할 수 있는 군의 28S 서브유니트에 대한 올리고뉴클레오티드 표지체.
- 제 1항에 있어서, 해당 균종을 확인할 수 있는 SEQ ID NO:3으로부터 SEQ ID NO:74에 걸친 상기 서열의 어느 하나 또는 기능적으로 균등한 서열의 어느 하나의 전부 또는 일부분을 구성하고 있는 올리고뉴클레오티드 표지체.
- 제 1항에 있어서, 균의 상기 종의 하나 또는 그 이상을 확인할 수 있는 SEQ ID NO:3으로부터 SEQ ID NO:74에 걸친 상기 서열의 어느 하나 또는 기능적으로 균등한 서열의 어느 하나의 전부 또는 일부분을 구성하고 있는 올리고뉴클레오티드 표지체.
- a. 표본에 함유된 균으로부터 헥산 물질을 추출하는 단계;b. 상기 대상군에 존재하는 28S rDNA 또는 rRNA상의 대상 영역을 브라켓하는 두 개의 알려진 프라이머, (SEQ ID NO 1) 및 (SEQ lD NO 2), 또는 기능적으로 균등한 프라이머를 첨가하는 단계;c. 상기 프라이머사이의 서열을 증폭시키는 단계; 및d. 상기 균류 중 어떠한 군류가 존재하는지를 결정하기 위해 하나 이상의 3번째 라벨된 표지체를 사용하는 단계로 이루어지며, 상기 3번째 표지체는 (SEQ ID NO:3) 내지 (SEQ ID NO:74)와, 이의 어떠한 부분 및 기능적으로 균등한 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표본에 존재하는 한 군의 균류로부터 선택된 하나 또는 그이상의 균종이 존재하는지를 결정하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 증폭시키는 절차가 폴리머라제 연쇄 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭화 단계 다음으로d. 상기 균의 어떠한 종이 존재하는지를 결정하기위한 두 개 또는 그 이상의 세 번째 표지체를 이용하는 단계를 포함하며, 상기 세 번째 표지체 중 하나가 상기 표지체 및 라벨된 부분에 연결된 하나 또는 그 이상의 표지체로부터 분리시키는 부분에 부착되며, 상기 세 번째 표지체가 (SEQ ID NO 3) 내지 (SEQ ID 74)와, 이의 어떠한 부분 및 그와 기능적으로 균등한 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 증폭 단계를 제외시키는 것을 특징으로하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 균종이 Acremonium 종, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus unguis, Aspergillus ustus, Beauvaria종, Bipolaris종, Blastoschizomyces종, Blatomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Chrysosporium 종, Cladosporium 종, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans var gattii 혈청형 B, Crytococcus neoformans 혈청형 A, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus terreus, Curvularia종, Fusarium종, Filobasidium capsuligenum, Filobasidiella (Cryptoccus) neoformans var bacillisopora 혈청형 C, Filobasidiella(Cryptoccus) neoformans var neoformans 혈청형 D, Filobasidium uniguttulatum, Geotrichum 종, Histoplasma capsulatum, Malbranchea종, Mucor종, Paecilomyces종, Penicillum종, Pseudallescheria boydii, Rhizopus종, Sporothrix schenkii, Scopulariopsis brevicaulis, Scopulariopsis brumpti, Saccharomyces cerevisiae 및 Trichosporon beigelii 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 하나 이상의 표지체가 사용되며, 각각의 세 번째 표지체가 다른 신호 부분 또는 상기 세 번째 표지체로부터 분리시키는 부분에 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8/373,127 | 1995-01-13 | ||
| US08/373,127 US5763169A (en) | 1995-01-13 | 1995-01-13 | Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi |
| US08/435,684 US5707802A (en) | 1995-01-13 | 1995-05-05 | Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi |
| US8/435,684 | 1995-05-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19980701336A true KR19980701336A (ko) | 1998-05-15 |
Family
ID=66175077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019970704725A Withdrawn KR19980701336A (ko) | 1995-01-13 | 1996-01-12 | 균류의 검출 및 확인을 위한 핵산 표지체(nucleic acid probes for the detection and identification of fungi) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR19980701336A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160141612A (ko) * | 2015-06-01 | 2016-12-09 | 전남대학교산학협력단 | 대한민국 남서부지역 나주시에 서식하는 신종 진민물게인 나주게의 뉴클레오타이드 서열 |
| KR20200009054A (ko) * | 2017-05-17 | 2020-01-29 | 마이크로바이오 피티와이 엘티디 | 바이오마커 및 그의 용도 |
-
1996
- 1996-01-12 KR KR1019970704725A patent/KR19980701336A/ko not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160141612A (ko) * | 2015-06-01 | 2016-12-09 | 전남대학교산학협력단 | 대한민국 남서부지역 나주시에 서식하는 신종 진민물게인 나주게의 뉴클레오타이드 서열 |
| KR20200009054A (ko) * | 2017-05-17 | 2020-01-29 | 마이크로바이오 피티와이 엘티디 | 바이오마커 및 그의 용도 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 19970710 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| PN2301 | Change of applicant |
Patent event date: 20000425 Comment text: Notification of Change of Applicant Patent event code: PN23011R01D |
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| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |