KR102750700B1 - Compositions for stabilizing or extracting nucleic acids in biological samples and methods using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복합적인 조성을 가지는 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 상세하게 킬레이트화제, 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물에 생물학적 샘플을 혼합하여 보관하면 상온에서도 핵산이 장기간 안정적으로 보존될 수 있을 뿐만 아니라, 보관된 샘플 내 핵산은 추가적인 핵산의 추출 및 정제 과정 없이도 안정적으로 핵산 분석에 이용될 수 있다.The present invention relates to a composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample having a complex composition, a kit comprising the same, and a method using the same, and more particularly, to a composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a sample, comprising a chelating agent, an ionic surfactant, and a nonionic surfactant. When a biological sample is mixed with the composition and stored, not only can the nucleic acids be stably preserved for a long period of time even at room temperature, but also the nucleic acids in the stored sample can be stably used for nucleic acid analysis without an additional nucleic acid extraction and purification process.
Description
본 발명은 복합적인 조성을 가지는 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 상세하게 킬레이트화제, 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample having a complex composition and a method using the same, and more particularly, to a composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a sample comprising a chelating agent, an ionic surfactant, and a nonionic surfactant.
인간의 장 속에는 수만 종의 미생물이 살고 있으며, 이 중 각각의 개인은 수백 종 정도의 미생물을 가지고 살아간다. 이러한 장내 미생물은 일생동안 사람과 공생하면서 소화, 분비 등에 많은 영향을 미치고 있는 것으로 나타나고 있다. 최근에는 장-뇌 축(gut-brain axis)이란 이론이 나올 정도로 장내 미생물, 특히 이들의 집합으로서의 장내 미생물군(gut microbiome 또는 gut microbiota)은 인간의 육체적인 건강 및 정신적인 건강에 지대한 영향을 주는 것으로 나타나고 있으며 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Augusto J. et al., Front. Integr. Neurosci., 2013). 또한 장내 미생물이 아토피나 천식과 같은 자가 면역 질환, 자폐나 우울증 같은 정신적인 질환과도 밀접한 관계가 있다는 사실이 생리학, 면역학, 역학 등 다양한 각도에서 증명되고 있다. There are tens of thousands of microorganisms living in the human intestines, and each individual carries hundreds of microorganisms. These intestinal microorganisms are shown to have a great influence on digestion, secretion, etc. while coexisting with humans throughout their lives. Recently, the theory of the gut-brain axis has emerged, showing that intestinal microorganisms, especially the gut microbiome or gut microbiota as a collection of these microorganisms, have a significant influence on human physical and mental health, and research on this is being actively conducted (Augusto J. et al., Front. Integr. Neurosci ., 2013). In addition, it has been proven from various perspectives such as physiology, immunology, and epidemiology that intestinal microorganisms are closely related to autoimmune diseases such as atopy and asthma, and mental illnesses such as autism and depression.
이러한 이유로 장내 미생물, 특히 장내 미생물군을 검출 및 분석하고자 하는 요구가 대두되고 있다. 일반적으로 장내에 서식하는 미생물은 혐기성이거나 공생하는 다른 미생물(및 이들이 분배하는 특수한 영양물질) 등의 배양조건을 필요로 하는 등 배양이 쉽지 않은 경우가 많으므로 특히 장내 미생물군 전체를 파악하고자 하는 목적에 배양을 통한 분석은 적합성이 떨어질 수 있다. 이에 따라 이들의 유전물질을 분석하는 방법이 주를 이루고 있다. For this reason, there is an increasing demand to detect and analyze intestinal microorganisms, especially intestinal microbiota. In general, microorganisms living in the intestines are often difficult to cultivate, such as being anaerobic or requiring culture conditions such as other symbiotic microorganisms (and special nutrients distributed by them), so analysis through culture may not be suitable for the purpose of understanding the entire intestinal microbiota. Accordingly, methods that analyze their genetic material are the main focus.
유전물질의 분석은 대체로 부피가 큰 장비를 필요로 하고, 산업적으로는 다수의 샘플을 한 번에 처리하는 것이 유리하며, 여러 샘플이 서로 다른 일시에 모이게 되는 등의 이유로 샘플을 운반하고 보관할 필요가 있다. 다만, 대변, 점막 생검 조직 등이 될 수 있는 이러한 생물학적 샘플은 일반적으로 유전물질인 핵산 외에도 다양한 물질과 생물(미생물 등)을 포함하고 있어, 이들에 의한 핵산의 분해가 쉽게 일어날 수 있으므로, 이에 따라 샘플을 안정적으로 보관할 수 있는 기술이 요구된다. 일반적으로는 냉동하는 등 저온 보관을 통해 샘플을 보관하게 되나, 샘플 채취 장소, 운송수단과 분석 장소 모두에 구비하는 것은 비용과 공간 측면에서 부담이 될 수 있다. Analysis of genetic material generally requires bulky equipment, and it is advantageous industrially to process a large number of samples at once, and since several samples are collected at different times, it is necessary to transport and store the samples. However, these biological samples, which can be feces, mucosal biopsy tissues, etc., generally contain various substances and organisms (microorganisms, etc.) in addition to nucleic acids, which are genetic materials, and thus the nucleic acids can easily be decomposed by these, and therefore a technology for stably storing the samples is required. Generally, samples are stored through low-temperature storage such as freezing, but it can be a burden in terms of cost and space to have them at the sample collection site, transportation means, and analysis site.
본 발명자들은 이처럼 복합적인 조성을 가진 생물학적 샘플 내의 핵산을 상온에서도 장기간 안정적으로 보관할 수 있는 조성물과 키트, 상기 조성물을 이용하여 생물학적 샘플 내의 핵산을 안정화, 추출 또는 분석할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have developed a composition and kit capable of stably storing nucleic acids in a biological sample having such a complex composition for a long period of time even at room temperature, and a method for stabilizing, extracting, or analyzing nucleic acids in a biological sample using the composition, thereby completing the present invention.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 발명의 목적은 복합적인 조성을 가진 생물학적 샘플 내의 핵산을 상온에서도 장시간 안정적으로 보관할 수 있으며, 이렇게 보관된 핵산의 분석을 위해 추가적인 핵산 추출 및 정제 단계가 필요하지 않은 조성물, 이를 이용한 키트 및 방법을 제공하는 것이다. The present invention has been made to solve the problems described above, and the purpose of the invention is to provide a composition capable of stably storing nucleic acids in a biological sample having a complex composition for a long period of time even at room temperature, and which does not require additional nucleic acid extraction and purification steps for analysis of the nucleic acids stored in this manner, as well as a kit and method using the same.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problems to be achieved by the present invention are not limited to the technical problems mentioned above, and other technical problems not mentioned can be clearly understood by a person having ordinary skill in the technical field to which the present invention belongs from the description below.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 킬레이트화제, 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물을 제공한다. To achieve the above technical task, one embodiment of the present invention provides a composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, comprising a chelating agent, an ionic surfactant, and a nonionic surfactant.
여기서, 상기 킬레이트화제는 상기 조성물 내에 100 내지 300 mM 포함되고, 에틸렌디아민트리아세트산(EDTA), 1,2-사이클로헥산디아민 테트라아세트산 (CDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산 (DOTA), 테트라아자사이클로테트라데칸테트라아세트산 (TETA), 데스페리옥시민, 이들의 킬레이터 유사체 또는 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.Here, the chelating agent may be included in the composition in an amount of 100 to 300 mM and may be selected from ethylenediaminetriacetic acid (EDTA), 1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid (CDTA), diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA), tetraazacyclododecanetetraacetic acid (DOTA), tetraazacyclotetradecanetetraacetic acid (TETA), desferrioximin, chelator analogues thereof, or combinations thereof.
상기 이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 0.1 내지 5 %(v/v) 포함되고, 도데실 황산 나트륨(SDS), 라우릴 황산나트륨(SLS) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.The ionic surfactant may be included in the composition at 0.1 to 5% (v/v), and may be selected from sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium lauryl sulfate (SLS), and combinations thereof.
상기 비이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 5 내지 15 %(v/v) 포함되고, 폴리소르베이트 20 (TWEEN 20), 폴리소르베이트 40 (TWEEN 40), 폴리소르베이트 60 (TWEEN 60), 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80), 옥실페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100), 이들의 유사체 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.The above nonionic surfactant may be included in the composition at 5 to 15% (v/v) and may be characterized by being selected from polysorbate 20 (TWEEN 20), polysorbate 40 (TWEEN 40), polysorbate 60 (TWEEN 60), polysorbate 80 (TWEEN 80), oxylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), analogs thereof, and combinations thereof.
상기 조성물은 pH가 7 내지 11인 것을 특징으로 할 수 있다.The above composition may be characterized by having a pH of 7 to 11.
상기 생물학적 샘플은 대변, 소변, 체액, 토양, 물, 공기 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.The above biological sample may be characterized as being selected from feces, urine, body fluid, soil, water, and air.
상기 핵산은 DNA, RNA 및 그 조합에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.The above nucleic acid may be characterized as being selected from DNA, RNA, and combinations thereof.
상기 조성물은 상기 핵산을 상온에서 30일 이상 안정하게 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다.The above composition may be characterized by maintaining the nucleic acid stably at room temperature for 30 days or more.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 일실시예는 전술한 조성물; 및 재밀봉이 가능한 용기를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 키트를 제공한다.In order to achieve the above technical task, another embodiment of the present invention provides a kit for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, comprising the above-described composition; and a resealable container.
상기 키트는 추가로 생물학적 샘플을 상기 용기로 옮기기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.The kit may further be characterized by comprising means for transferring a biological sample to the container.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 일실시예는 전술한 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출 방법을 제공한다.In order to achieve the above technical task, another embodiment of the present invention provides a method for stabilizing or extracting nucleic acid in a biological sample, comprising a step of mixing the above-described composition with a biological sample containing nucleic acid.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 일실시예는 전술한 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하여 제1혼합물을 수득하는 단계; 및 상기 제1혼합물을 분석하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법을 제공한다. In order to achieve the above technical task, another embodiment of the present invention provides a method for analyzing nucleic acid in a biological sample, comprising the steps of: mixing the above-described composition and a biological sample containing nucleic acid to obtain a first mixture; and analyzing the first mixture.
상기 방법은 추가로 핵산을 추출, 정제하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.The above method may be characterized in that it does not additionally include a step of extracting or purifying nucleic acids.
상기 분석은 정량, 검출, 유전형 분석 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.The above analysis may be characterized by being selected from quantitative, detection, genotyping and combinations thereof.
상기 분석은 PCR 기반의 방법, NGS, 마이크로어레이, ChIP(chromatin immunoprecipitation), 핵산지문법(nucleic acid fingerprinting), 서던블롯(southern blot) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.The above analysis may be characterized by being selected from PCR-based methods, NGS, microarray, chromatin immunoprecipitation (ChIP), nucleic acid fingerprinting, southern blot, and combinations thereof.
상기 분석은 메타게놈 분석인 것을 특징으로 할 수 있다.The above analysis may be characterized as a metagenomic analysis.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.The above-described problem solving means are merely exemplary and should not be construed as limiting the present invention. In addition to the above-described exemplary embodiments, additional embodiments may exist in the drawings and detailed description of the invention.
본 발명의 일실시예에 따른 조성물, 이를 포함하는 키트 및 상기 조성물을 이용한 방법은 생물학적 샘플 내의 핵산을 상온에서도 장시간 안정적으로 보관될 수 있도록 한다. 또한, 이렇게 보관된 핵산은 분석을 위해 추가적인 추출이나 정제를 필요로 하지 않아, 생물학적 샘플 내의 핵산의 분석을 좀더 간편하게 진행할 수 있도록 할 뿐만 아니라, 상기 추가 추출/정제 과정에서 일어날 수 있는 핵산의 소실을 방지할 수 있다. 이는 예컨대 대변, 혈액, 토양, 하수 등 복합적인 조성을 가지는 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산을 이용하여 미생물 군집 프로파일, 병원균, 기타 유전정보 등을 검출하고 분석하는 데에 사용될 수 있다. 이는 상기 검출된 정보와 상관성이 높은 질병, 증상, 환경영향 등이 있다면 이를 진단하거나 변화 양상을 예측하고 관련 증상이나 좋지 않은 영향을 예방, 치료, 또는 경감하는 데에 이용될 수 있을 것이다.A composition according to one embodiment of the present invention, a kit including the same, and a method using the composition enable nucleic acids in a biological sample to be stably stored for a long period of time even at room temperature. In addition, since the nucleic acids stored in this manner do not require additional extraction or purification for analysis, not only can the analysis of nucleic acids in a biological sample be performed more conveniently, but also the loss of nucleic acids that may occur during the additional extraction/purification process can be prevented. This can be used to detect and analyze microbial community profiles, pathogens, and other genetic information using nucleic acids present in biological samples having complex compositions such as feces, blood, soil, and sewage, for example. This can be used to diagnose diseases, symptoms, environmental impacts, etc. that are highly correlated with the detected information, predict changes in these, and prevent, treat, or alleviate related symptoms or adverse effects.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The effects of the present invention are not limited to the effects described above, and should be understood to include all effects that can be inferred from the composition of the invention described in the description or claims of the present invention.
도 1은 pH를 달리한 본 발명의 표 1에 따른 조성물에 균질화한 대변 샘플을 직접 16S rRNA 유전자 증폭 PCR한 산물을 각각 젤 전기영동한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 균질화한 대변 샘플과 동일 대변 샘플에 시판 대변 핵산 추출 키트를 사용하여 얻은 핵산을 각각 16S rRNA 유전자 증폭 PCR한 산물을 각각 젤 전기영동한 이미지이다.
도3은 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 균질화한 대변 샘플과 동일 대변 샘플에 시판 대변 핵산 추출 키트를 사용하여 얻은 핵산에 대해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 alpha rarefaction 분석한 데이터이다.
도 4는 상온에서 서로 다른 기간 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 보관한 대변 샘플(직접 또는 추가로 핵산 추출 및 정제 후)과 동일 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 동일한 기간 보관 후 이로부터 추출 및 정제한 핵산을 각각 16S rRNA 유전자 증폭 PCR한 산물을 젤 전기영동한 이미지이다.
도 5는 상온에서 7일 동안 본 발명의 실시예 1에 따른 조성물에 보관한 대변 샘플과 동일 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 동일한 기간 보관 후 이로부터 추출 및 정제한 핵산에 대해 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 alpha rarefaction 분석한 데이터이다.
도 6은 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 7일 상온 보관한 대변 샘플의 희석 방법 및 희석 배율을 달리 하여 16S rRNA 유전자 증폭 PCR한 산물을 젤 전기영동한 결과를 비교한 이미지이다.
도7은 1일, 4일 및 7일(A)과 30일(B) 상온 보관한 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 대변 샘플(직접 또는 추가로 핵산 추출 및 정제 후)과 동일 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 각 동일한 기간 보관 후 이로부터 추출 및 정제한 핵산으로부터 각각 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 Bray-Curtis dissimilarity 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예1에 따른 조성물 또는 이로부터 비이온성 계면활성제인 TWEEN 20을 뺀 조성물의 사용 시 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 Bray-Curtis dissimilarity 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따른 조성물 또는 이로부터 비이온성 계면활성제인 TWEEN 20을 뺀 조성물의 사용 시 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 alpha rarefaction 분석한 데이터이다.Figure 1 is an image of gel electrophoresis of products obtained by directly amplifying 16S rRNA gene of stool samples homogenized in compositions according to Table 1 of the present invention with different pHs.
Figure 2 is an image of a gel electrophoresis of each of the products of 16S rRNA gene amplification PCR obtained from a stool sample homogenized with a composition according to Example 1 of the present invention and the nucleic acid obtained from the same stool sample using a commercially available stool nucleic acid extraction kit.
Figure 3 is data obtained by alpha rarefaction analysis of microbial profiles based on the 16S rRNA gene for a stool sample homogenized with a composition according to Example 1 of the present invention and for nucleic acids obtained using a commercially available stool nucleic acid extraction kit for the same stool sample.
Figure 4 is a gel electrophoresis image of the 16S rRNA gene amplification PCR product of nucleic acids extracted and purified from fecal samples (directly or additionally after nucleic acid extraction and purification) stored in a composition according to Example 1 of the present invention for different periods at room temperature and the same fecal sample stored in a conventional fecal nucleic acid stabilization kit for the same period.
Figure 5 shows data obtained by alpha rarefaction analysis of microbial profiles based on the 16S rRNA gene using NGS for nucleic acids extracted and purified from a stool sample stored in a composition according to Example 1 of the present invention for 7 days at room temperature and the same stool sample stored in a conventional stool nucleic acid stabilization kit for the same period of time.
Figure 6 is an image comparing the results of gel electrophoresis of 16S rRNA gene amplification PCR products obtained by varying the dilution method and dilution ratio of a stool sample stored at room temperature for 7 days in a composition according to Example 1 of the present invention.
Figure 7 shows the results of Bray-Curtis dissimilarity analysis on microbial profiles based on the 16S rRNA gene obtained using NGS from stool samples (directly or additionally after nucleic acid extraction and purification) and nucleic acids extracted and purified from the same stool samples stored at room temperature for 1, 4, and 7 days (A) and 30 days (B) according to Example 1 of the present invention, respectively, after storing them in a conventional stool nucleic acid stabilization kit for the same period of time.
FIG. 8 shows the results of Bray-Curtis dissimilarity analysis on a microbial profile based on the 16S rRNA gene obtained using NGS when using a composition according to Example 1 of the present invention or a composition from which the nonionic surfactant TWEEN 20 is omitted.
FIG. 9 is data obtained by alpha rarefaction analysis of a microbial profile based on the 16S rRNA gene obtained using NGS when using a composition according to Example 1 of the present invention or a composition excluding the nonionic surfactant TWEEN 20 therefrom.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described with reference to the attached drawings. However, the present invention can be implemented in various different forms and therefore is not limited to the embodiments described herein.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part is said to be "connected (connected, contacted, joined)" to another part, this includes not only the case where it is "directly connected" but also the case where it is "indirectly connected" with another member in between. Also, when a part is said to "include" a certain component, this does not mean that other components are excluded, unless otherwise specifically stated, but that other components can be included.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting of the present invention. The singular expression includes the plural expression unless the context clearly indicates otherwise. As used herein, the terms "comprises" or "has" and the like are intended to specify the presence of a feature, number, step, operation, component, part or combination thereof described in the specification, but should be understood to not exclude in advance the possibility of the presence or addition of one or more other features, numbers, steps, operations, components, parts or combinations thereof.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the attached drawings.
본 발명의 일측면은 킬레이트화제, 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물을 제공한다. One aspect of the present invention provides a composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, comprising a chelating agent, an ionic surfactant and a nonionic surfactant.
일반적으로 생물학적 샘플, 예컨대 타액, 혈액, 대변 및 소변 등에서 DNA 및 RNA를 화학적으로 안정화시키기 위한 수단의 하나로 금속의 산화환원 사이클링 또는 핵산의 인산 골격으로 금속 이온이 결합하는 것을 방지할 수 있는 킬레이트화제를 들 수 있다. 본 명세서에서 "킬레이트화제“(chelator)는 특정 금속 이온과 안정된 복합체를 형성함으로써 이온을 격리시킬 수 있는 물질을 말한다. 예컨대 위장관에는 췌장 분비물이나 장내 미생물로부터 분비된 핵산을 분해할 수 있는 효소, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 또는 엔도뉴클레아제(예컨대, I, II 및 III 형 제한 엔도뉴클레아제) 및 엑소뉴클레아제(예로, 3'→5' 엑소뉴클레아제)가 다량 존재하는데, 이들 효소는 예컨대, Ca2+, Zn2+, Mg2+ 등과 같은 2가의 금속 이온에 의존적으로 핵산 분해 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 금속 이온은 핵산과 쉽게 결합하는 것으로 알려져 있으며, 특히 서로 다른 몇 가지 산화 상태를 가지는 철(Fe)이나 코발트(Co) 등의 전이금속(transition metal) 이온은 라디칼 형성에 관여하여 핵산을 손상시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며, 킬레이트화제를 통해 이러한 금속 이온을 제거할 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 킬레이트화제는 생물학적 샘플의 핵산 분해효소 및 미생물 성장을 저해할 수 있다. Chelating agents, which can prevent redox cycling of metals or binding of metal ions to the phosphate backbone of nucleic acids, are commonly used as a means for chemically stabilizing DNA and RNA in biological samples such as saliva, blood, feces and urine. In this specification, the term "chelator" refers to a substance capable of sequestering ions by forming a stable complex with a specific metal ion. For example, the gastrointestinal tract contains a large amount of enzymes capable of decomposing nucleic acids secreted from pancreatic secretions or intestinal microorganisms, such as deoxyribonuclease (DNase) or endonucleases (e.g., type I, II, and III restriction endonucleases) and exonucleases (e.g., 3'→5' exonucleases). These enzymes are known to exhibit nucleic acid decomposition activity dependent on divalent metal ions such as Ca2 + , Zn2 + , and Mg2 + . In addition, metal ions are known to readily bind to nucleic acids, and in particular, transition metal ions such as iron (Fe) or cobalt (Co) having several different oxidation states are known to be involved in radical formation and can damage nucleic acids, and such metal ions can be removed through a chelating agent. In the composition of the present invention, Chelating agents can inhibit nucleases and microbial growth in biological samples.
상기 킬레이트화제는 조성물 내에 50 mM 이상, 바람직하게 100 내지 300 mM, 더욱 바람직하게 150 내지 250 mM 포함될 수 있다. 상기 킬레이트화제는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), (2-하이드록시에틸)에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 니트릴로트리아세트산(NTA), 에틸렌디아민트리아세트산(EDTA), 1,2-사이클로헥산디아민테트라아세트산(CDTA), N,N-비스(카복시메틸)글리신, 트리에틸렌테트라아민(TETA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산(DOTA), 데스페리옥시민, 시트레이트 무수물, 나트륨 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 제2 철 암모늄 시트레이트, 리튬 시트레이트 또는 그 조합 중에서 선택될 수 있다. 상기 킬레이트화제는 바람직하게 에틸렌디아민트리아세트산(EDTA), 1,2-사이클로헥산디아민 테트라아세트산 (CDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산 (DOTA), 테트라아자사이클로테트라데칸테트라아세트산 (TETA), 데스페리옥시민, 이들의 킬레이터 유사체 또는 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.The chelating agent may be included in the composition in an amount of 50 mM or more, preferably 100 to 300 mM, and more preferably 150 to 250 mM. The chelating agent may be selected from ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), (2-hydroxyethyl)ethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), nitrilotriacetic acid (NTA), ethylenediaminetriacetic acid (EDTA), 1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid (CDTA), N,N-bis(carboxymethyl)glycine, triethylenetetramine (TETA), tetraazacyclododecanetetraacetic acid (DOTA), desferrioximin, citrate anhydride, sodium citrate, calcium citrate, ammonium citrate, ammonium bicitrate, citric acid, diammonium citrate, ferric ammonium citrate, lithium citrate, or a combination thereof. The above chelating agent may be preferably characterized by being selected from ethylenediaminetriacetic acid (EDTA), 1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid (CDTA), diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA), tetraazacyclododecanetetraacetic acid (DOTA), tetraazacyclotetradecanetetraacetic acid (TETA), desferrioximin, chelator analogues thereof, or a combination thereof.
본 명세서에서 사용되는 용어 "계면활성제"는 친수성과 소수성 부분을 모두 가지고 있는 화합물로, 단백질의 비공유 결합을 손상시켜 이를 원래 가지는 구조를 잃게 만들 수 있는 임의의 유기 화합물을 의미한다. 상기 계면활성제는 예컨대 도데실 황산 나트륨(SDS), 도데실 황산 리튬, 라우릴 황산 나트륨(SLS), 라우릴 황산 암모늄 등의 음이온성 계면활성제, 사차 암모늄 염(예컨대, 세트리모늄 브로마이드/세틸트리메틸암모늄 브로마이드/헥사데실-트리메틸-암모늄 브로마이드(CTAB), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC)), 세틸피리디늄 클로라이드(CPC), 벤잘코늄 클로라이드(BAC) 등의 양이온성 계면활성제, 베타인, 3-[(3-클로아미도프로파일)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 레시틴 등의 쯔비터이온성(zwitterionic) 계면활성제, Tween, Triton X, Brij 등의 비이온성 계면활성제 등이 있다. 계면활성제는 효소의 복잡한 구조를 파괴함으로써 DNase 등 핵산 분해 효소의 작용을 저해하고, 본 발명의 조성물 내 생물학적 다양한 화학종의 가용화(solubilization)를 도우며, 이를 통해 샘플로부터 핵산 추출이 될 수 있도록 할 수 있다. The term "surfactant" as used herein means any organic compound that has both hydrophilic and hydrophobic moieties and can damage the non-covalent bonds of a protein, causing it to lose its original structure. The surfactants include, for example, anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS), lithium dodecyl sulfate, sodium lauryl sulfate (SLS), and ammonium lauryl sulfate; cationic surfactants such as quaternary ammonium salts (e.g., cetrimonium bromide/cetyltrimethylammonium bromide/hexadecyl-trimethyl-ammonium bromide (CTAB), cetyltrimethylammonium chloride (CTAC)), cetylpyridinium chloride (CPC), and benzalkonium chloride (BAC); zwitterionic surfactants such as betaine, 3-[(3-chloroamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), and lecithin; and nonionic surfactants such as Tween, Triton X, and Brij. Surfactants can inhibit the action of nucleic acid-decomposing enzymes such as DNase by destroying the complex structure of the enzyme, and can help solubilize various biological chemical species in the composition of the present invention, thereby enabling nucleic acid extraction from a sample.
상기 이온성 계면활성제는 상기 음이온성 계면활성제, 상기 양이온성 계면활성제 또는 상기 쯔비터이온성 계면활성제 중에서 선택된 것일 수 있고, 바람직하게 음이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제 중에서 선택된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게 음이온성 계면활성제인 것일 수 있고, 가장 바람직하게 도데실 황산 나트륨(SDS), 라우릴 황산 나트륨(SLS) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 0.01 내지 10 %(v/v), 바람직하게 0.1 내지 5 %(v/v), 더욱 바람직하게 0.3 내지 1%(v/v) 포함될 수 있다.The ionic surfactant may be selected from the anionic surfactant, the cationic surfactant or the zwitterionic surfactant, preferably selected from the anionic surfactant or the cationic surfactant, more preferably selected from the anionic surfactant, and most preferably selected from sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium lauryl sulfate (SLS) and combinations thereof. The ionic surfactant may be included in the composition in an amount of 0.01 to 10% (v/v), preferably 0.1 to 5% (v/v), more preferably 0.3 to 1% (v/v).
상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20 (TWEEN 20), 폴리소르베이트 40 (TWEEN 40), 폴리소르베이트 60 (TWEEN 60), 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80), 옥실페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100), 이들의 유사체 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게 TWEEN 20, Triton X-100 및 그 조합 중에서 선택될 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 1 내지 20 %(v/v), 바람직하게 5 내지 15 %(v/v), 더욱 바람직하게 10 내지 15 %(v/v) 포함될 수 있다.The nonionic surfactant may be characterized by being selected from polysorbate 20 (TWEEN 20), polysorbate 40 (TWEEN 40), polysorbate 60 (TWEEN 60), polysorbate 80 (TWEEN 80), oxylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), analogues thereof and combinations thereof, and preferably TWEEN 20, Triton X-100 and combinations thereof. The nonionic surfactant may be included in the composition in an amount of 1 to 20 % (v/v), preferably 5 to 15 % (v/v), more preferably 10 to 15 % (v/v).
본 발명의 발명자들은 후술할 실시예에서 계면활성제 중 이온성 및 비이온성 계면활성제를 모두 포함한 조성물이 이온성 계면활성제만 포함한 조성물에 비해 핵산을 안정적으로 보존하고 잘 추출할 수 있다는 것을 확인하였다.The inventors of the present invention confirmed in the examples described below that a composition containing both ionic and nonionic surfactants among surfactants can stably preserve and extract nucleic acids better than a composition containing only ionic surfactants.
일반적으로 DNA와 RNA 등 핵산을 안정화하는 데에는 전술한 킬레이트화 외에도 pH가 중요한 역할을 할 수 있다. 일반적으로 핵산은 낮은 pH에서 불안정하고, 이중 가닥(double-stranded)의 DNA는 pH 5 내지 9에서, RNA는 pH 4 내지 5에서 안정한 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 상기 조성물은 pH가 7 이상, 바람직하게 7 내지 11, 더욱 바람직하게 8 내지 10, 가장 바람직하게 8.5 내지 9.5인 것을 특징으로 할 수 있다. 후술할 실시예로부터 확인할 수 있듯 본 발명의 발명자들은 후술할 실시예에서 본 발명에 따른 조성물이 최소한 pH 8 내지 10 범위에서 안정적으로 작용하며, 상기 각 조성물에 생물학적 샘플을 혼합하여 균질화하면 추가적인 핵산의 추출 및 정제 과정 없이도 바로 핵산 분석에 사용 가능하다는 것을 확인하였다. 핵산의 추출 및 정제 과정은 핵산 분석을 방해할 수 있는 불순물을 제거하기도 하나 핵산이 일부 소실되는 원인이 되기도 하며, 특히 이는 샘플 내 카피 수가 낮은 핵산이 포함되어 있는 경우 이의 검출이 되지 않도록 만들 수 있으므로, 기존의 핵산 보관용 조성물에 비해 이러한 과정을 생략할 수 있는 본 발명의 핵산 안정화 및 추출용 조성물은 큰 비교우위를 가질 수 있다.In addition to the chelation described above, pH can play an important role in stabilizing nucleic acids such as DNA and RNA. In general, nucleic acids are unstable at low pH, and double-stranded DNA is known to be stable at pH 5 to 9, and RNA is known to be stable at pH 4 to 5. The composition according to the present invention may be characterized by having a pH of 7 or higher, preferably 7 to 11, more preferably 8 to 10, and most preferably 8.5 to 9.5. As can be confirmed from the examples described below, the inventors of the present invention confirmed that the composition according to the present invention functions stably at least in the pH range of 8 to 10, and that when a biological sample is mixed with each of the compositions and homogenized, it can be used for nucleic acid analysis without an additional nucleic acid extraction and purification process. The process of extracting and purifying nucleic acids removes impurities that may interfere with nucleic acid analysis, but it may also cause some nucleic acids to be lost. In particular, this may prevent the detection of nucleic acids containing low copy numbers in the sample. Therefore, the nucleic acid stabilization and extraction composition of the present invention, which can omit this process compared to existing nucleic acid storage compositions, may have a great comparative advantage.
상기 조성물의 pH는 하나 이상의 버퍼를 이용하여 적절한 범위로 유지할 수 있다. 이때, 버퍼는 전술한 pH 범위, 즉 pH 7 이상을 유지할 수 있도록 pKa가 7 이상인 것을 사용하는 것이 좋다. 그 예로는 EPPS, HEPPS, 트리신, Tris, Gly-Gly, 바이신, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, AES, CHES(2-(사이클로헥실아미노)에탄설폰산), 에탄올아민, 에페드린, CAPSO, 하이드록시프롤린, AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), 류신, 글리신, 히스타민, 트리메틸아민, TETA, 니트릴로트리아세트산, 알파-알라닌, 에틸렌디아민, 아스파트산, 베타-알라닌, 알라닌, 티로신, CAPS(3-사이클로헥실아미노)-1-(프로판설폰산), 시스테인, 감마-아미노부티르산, n-프로필아민, 메틸아민, 에틸아민, n-부틸아민, 프롤린, 오르니틴, CABS(4-(사이클로헥실아미노)-1-부탄설폰산), 트리에틸아민 등이 있다. 상기 버퍼의 농도는 25 내지 500 mM 범위에서 적절하게 선택될 수 있다. 상기 버퍼는 바람직하게 Tris일 수 있고, 상기 조성물 내에 25 내지 300 mM, 바람직하게 150 내지 250 mM로 포함될 수 있다.The pH of the above composition can be maintained within an appropriate range using one or more buffers. At this time, it is preferable to use a buffer having a pKa of 7 or higher so as to maintain the above-mentioned pH range, i.e., pH 7 or higher. Examples include EPPS, HEPPS, tricine, Tris, Gly-Gly, bicine, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, AES, CHES (2-(cyclohexylamino)ethanesulfonic acid), ethanolamine, ephedrine, CAPSO, hydroxyproline, AMP (2-amino-2-methyl-1-propanol), leucine, glycine, histamine, trimethylamine, TETA, nitrilotriacetic acid, alpha-alanine, ethylenediamine, aspartic acid, beta-alanine, alanine, tyrosine, CAPS (3-cyclohexylamino)-1-(propanesulfonic acid), cysteine, gamma-aminobutyric acid, n-propylamine, methylamine, ethylamine, n-butylamine, proline, ornithine, CABS (4-(cyclohexylamino)-1-butanesulfonic acid), triethylamine. The concentration of the above buffer may be appropriately selected in the range of 25 to 500 mM. The buffer may preferably be Tris, and may be included in the composition at 25 to 300 mM, preferably 150 to 250 mM.
상기 조성물은 추가로 거품을 억제하는 소포제가 포함될 수 있으며, 상기 소포제는 실리콘 소포제, 불용성 오일, 스테아레이트, 글리콜 등일 수 있고, 상기 조성물 내에 0 내지 1%(v/v) 포함될 수 있다. 바람직하게 상기 소포제는 실리콘 소포제이고, 상기 조성물 내에 약 0.01 % 이내 포함될 수 있다.The composition may further include a foam suppressing defoaming agent, which may be a silicone defoaming agent, an insoluble oil, a stearate, a glycol, or the like, and may be included in the composition in an amount of 0 to 1% (v/v). Preferably, the defoaming agent is a silicone defoaming agent, and may be included in the composition in an amount of no more than about 0.01%.
본 명세서 상의 “생물학적 샘플”은 핵산을 포함한 생체분자를 함유하는 시료를 의미한다. 상기 생물학적 샘플은 용액, 세포, 조직, 생검, 분말 또는 그 조합을 포함할 수 있으며, 동물이나 식물 등의 생물에서 유래한 분비물, 체액, 배설물 등일 수 있고, 토양, 물, 공기 등의 환경 샘플일 수 있으며, 그 외에도 식품, 약품, 수사 증거물, 조리시설, 의료시설, 전염병 발발 지역의 시설 등 생체분자로 오염되었거나 오염되었을 가능성이 있는 조성물이나 표면 등으로부터 채취된 것일 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 대변, 소변, 체액, 토양, 물, 공기 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 생물학적 샘플은 다양한 물질을 포함하는 복합적인 샘플이며, 특히 생물 유래의 분해 효소 등을 포함하여 보관을 위해서는 핵산의 안정화를 위한 처리가 필요하다. The term “biological sample” in this specification refers to a sample containing biomolecules including nucleic acids. The biological sample may include a solution, cell, tissue, biopsy, powder, or a combination thereof, and may be a secretion, body fluid, excretion, etc. derived from a living organism such as an animal or plant, an environmental sample such as soil, water, or air, and in addition, may be collected from a composition or surface that is contaminated or may be contaminated with biomolecules, such as food, medicine, investigative evidence, cooking facilities, medical facilities, or facilities in an area where an infectious disease outbreak has occurred. The biological sample may be characterized by being selected from feces, urine, body fluid, soil, water, or air. Such a biological sample is a complex sample containing various substances, and in particular, requires treatment to stabilize nucleic acids for storage, including decomposition enzymes derived from living organisms.
상기 핵산은 DNA, RNA 및 그 조합에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게 DNA일 수 있다.The above nucleic acid may be characterized as being selected from DNA, RNA and combinations thereof, and preferably may be DNA.
상기 조성물은 상기 핵산을 상온에서 7일 이상, 바람직하게 30일 이상, 더욱 바람직하게 60일 이상 안정하게 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 상온은 15 내지 40°C이며, 이는 일반적으로 핵산 분해 효소를 포함하는 미생물의 생명활동 내지 효소의 활성이 높거나 어느 정도 유지되는 수준의 온도이다. 일반적으로 생체분자가 포함된 샘플은 미생물의 생명활동 내지 효소의 활성이 높을수록 더 쉽게 변성, 분해될 수 있으며, 온도가 지나치게 높아지면 열에 의한 생체분자 손상이 일어날 수 있다. 후술할 실시예에서 확인한 것과 같이 본 발명에 따른 조성물은 상온에서도 최소한 30일 이상 안정적으로 핵산을 보관할 수 있는 것으로 나타났으므로, 이보다 낮은 온도, 예컨대 일반적으로 생물학적 샘플을 보관하는 4℃, -20℃, -80℃ 등의 온도에서는 그보다 장기간 안정적으로 핵산을 보관할 수 있을 것임을 예상할 수 있다.The composition may be characterized in that it stably maintains the nucleic acid at room temperature for 7 days or more, preferably 30 days or more, and more preferably 60 days or more. Here, the room temperature is 15 to 40°C, which is generally a temperature at which the vital activity of microorganisms including nucleic acid-decomposing enzymes or the activity of enzymes is high or maintained to a certain extent. Generally, a sample containing biomolecules may be more easily denatured or decomposed as the vital activity of microorganisms or the activity of enzymes is high, and if the temperature is too high, damage to biomolecules due to heat may occur. As confirmed in the examples described below, the composition according to the present invention was found to be able to stably store nucleic acids for at least 30 days even at room temperature, and therefore, it can be expected that the composition will be able to stably store nucleic acids for a longer period of time at lower temperatures, such as 4°C, -20°C, and -80°C, at which biological samples are generally stored.
본 발명의 다른 일측면은 전술한 조성물; 및 재밀봉이 가능한 용기를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, comprising the composition described above; and a resealable container.
상기 키트는 추가로 생물학적 샘플을 상기 용기로 옮기기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 면봉, 스패츌러(spatula) 또는 스푼 등일 수 있다. 그 외에도, 추가로 샘플을 균질화할 수 있는 수단이나 상기 키트의 사용 지침 등이 포함될 수 있다. 상기 키트에 포함된 구성요소 중 샘플과 닿는 것은 멸균상태로 제공되는 것이 바람직하다.The kit may further be characterized by comprising a means for transferring a biological sample to the container. This may be a swab, a spatula or a spoon. In addition, a means for homogenizing the sample, instructions for use of the kit, etc. may be included. It is preferred that the components included in the kit, which come into contact with the sample, are provided in a sterile state.
본 발명의 또 다른 일측면은 전술한 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출 방법을 제공한다. 상기 혼합시에는 상기 조성물과 생물학적 샘플이 최대한 균질화(homogenize)되도록 해야 한다. 상기와 같이 상기 조성물과 혼합된 생물학적 샘플 내 핵산은 후술할 실시예에서 확인할 수 있듯이 상온에서도 안정적으로 30일 이상 유지될 수 있으며, 추가적인 추출 및 정제 단계 없이도 핵산 분석 등에 이용되어 신뢰할 만한 결과를 낼 수 있다.Another aspect of the present invention provides a method for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, comprising a step of mixing the composition described above with a biological sample containing nucleic acids. During the mixing, the composition and the biological sample should be as homogenized as possible. As described above, the nucleic acids in the biological sample mixed with the composition can be stably maintained for more than 30 days at room temperature, as can be confirmed in the examples described below, and can be used for nucleic acid analysis, etc., without additional extraction and purification steps, thereby producing reliable results.
본 발명의 또 다른 일측면은 전술한 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하여 제1혼합물을 수득하는 단계; 및 상기 제1혼합물을 분석하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법을 제공한다. Another aspect of the present invention provides a method for analyzing nucleic acid in a biological sample, comprising the steps of: mixing the aforementioned composition with a biological sample containing nucleic acid to obtain a first mixture; and analyzing the first mixture.
상기 방법은 추가로 핵산을 추출, 정제하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 추가로 핵산 추출 및 정제 단계를 포함시켜 불순물을 제거하는 효과를 얻을 수 있으나, 이 경우 핵산이 일부 소실될 수 있다.The above method may be characterized in that it does not additionally include a step of extracting and purifying nucleic acids. The effect of removing impurities can be obtained by additionally including a step of extracting and purifying nucleic acids, but in this case, some of the nucleic acids may be lost.
상기 분석은 정량, 검출, 유전형 분석 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 정량은 샘플 내 핵산의 양을 확인하는 것으로 대표적으로 260 nm에서의 흡광도나 형광표지 후 측정하는 방법이 이용될 수 있다. 검출은 샘플 내 핵산의 유무를 확인하는 것으로, 일반적으로는 특정 서열을 포함하는 핵산 유무를 확인(동정)하며, 이때 검출은 혼성체화(hybridization) 기반의 방법, 서열 특이적 증폭 기반의 방법 또는 그 조합을 통해서 통상적으로 이루어질 수 있다. 유전형 분석은 관심 유전자의 유전자 차이를 밝히는 것으로, 이는 번역 구간 또는 비번역 구간의 결실, 단일염기변이, 반복서열의 반복수, 전체 서열 등 서열의 변화를 확인할 수 있는 방법을 선택하여 진행할 수 있다.The above analysis can be characterized by being selected from quantitation, detection, genotyping, and a combination thereof. Quantitation is a method for confirming the amount of nucleic acid in a sample, and a representative method can be used, such as absorbance at 260 nm or a method for measuring after fluorescent labeling. Detection is a method for confirming the presence or absence of nucleic acid in a sample, and generally, the presence or absence of nucleic acid containing a specific sequence is confirmed (identified). At this time, detection can be usually performed through a hybridization-based method, a sequence-specific amplification-based method, or a combination thereof. Genotyping is a method for revealing genetic differences in a gene of interest, and this can be performed by selecting a method capable of confirming changes in the sequence, such as deletion of a translated or untranslated region, a single nucleotide mutation, the number of repetitions of a repetitive sequence, or the entire sequence.
상기 분석은 PCR 기반의 방법, NGS, 마이크로어레이, ChIP(chromatin immunoprecipitation), 핵산지문법(nucleic acid fingerprinting), 서던블롯(southern blot) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. The above analysis may be characterized by being selected from PCR-based methods, NGS, microarray, chromatin immunoprecipitation (ChIP), nucleic acid fingerprinting, southern blot, and combinations thereof.
상기 분석과 관련된 방법은 다양한 문헌에서 다루고 있으며(예컨대, Keer & Birch(2008), “of nucleic acid analysis: a robust approach”& “”“Diagnostic molecular biology” 이 분야의 통상의 기술자가 목적(예컨대 정량, 검출, 유전형 분석)과 구체적인 관심사항에 따라 선택, 조합할 수 있는 사항이므로, 이에 대한 설명은 생략한다.Methods related to the above analysis are covered in various literature (e.g., Keer & Birch (2008), “of nucleic acid analysis: a robust approach” & “Diagnostic molecular biology”), and since those skilled in the art can select and combine them according to the purpose (e.g., quantitation, detection, genotyping) and specific interests, their descriptions are omitted.
상기 분석은 메타게놈 분석인 것을 특징으로 할 수 있다. 군유전체 또는 메타게놈(metagenome)은 특정 샘플 내 모든 유전물질로, 해당 샘플에 존재하는 바이러스, 박테리아, 균류(fungi) 등 모든 종으로부터 유래한 유전물질 또는 관심 생물군에 속하는 모든 종으로부터 유래한 유전물질을 의미할 수 있다. 메타게놈 분석은 예컨대 장내 미생물군(gut microbiome), 즉 장내 미생물의 프로파일을 동정하는 것일 수 있으며, 환경단위 내 생물 다양성(biodiversity)을 밝히기 위한 것일 수 있다. The above analysis may be characterized as a metagenomic analysis. A metagenome or a metagenome is all genetic material in a specific sample, and may mean genetic material derived from all species, such as viruses, bacteria, and fungi, present in the sample, or genetic material derived from all species belonging to a group of organisms of interest. Metagenomic analysis may be, for example, to identify the gut microbiome, i.e., the profile of gut microbes, and may be intended to reveal biodiversity within an environmental unit.
장내 미생물군 동정은 일반적으로 원핵생물(prokaryote)을 관심사로 하는 경우가 많으며, 이 경우 이들에 공통적으로 존재하는 기본 번역체인 리보솜에 포함되는 16S rRNA 유전자 분석을 포함할 수 있다. 장내 미생물군 동정을 위해서는 샘플을 직장에서 직접 채취(장액 흡입, 점막 생검 등)할 수 있고, 대변을 채취하여 샘플로 이용할 수 있다. Identification of the gut microbiota is usually of interest to prokaryotes, and in this case, it may include analysis of the 16S rRNA gene, which is contained in the ribosome, the basic translation unit common to these organisms. For identification of the gut microbiota, samples can be collected directly from the rectum (e.g., intestinal aspiration, mucosal biopsy), or stool can be collected as a sample.
상기 메타게놈 분석은 포유동물 유래 샘플, 예컨대 인간 유래 샘플에 대하여 진행할 수 있다.The above metagenomic analysis can be performed on mammalian samples, such as human samples.
<실시예 1. 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물의 제조><Example 1. Preparation of a composition for stabilizing or extracting nucleic acids in biological samples>
생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물을 킬레이트화제로 EDTA, 이온성 계면활성제 도데실 황산 나트륨(SDS), 비이온성 계면활성제로 Tween 20를 포함하도록 하여 하기 표 1과 같은 조성으로 제조하였다. 이때, 상기 조성물의 pH는 NaOH (sodium hydroxide)를 이용하여 9로 조정하였다.A composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample was prepared by including EDTA as a chelating agent, sodium dodecyl sulfate (SDS) as an ionic surfactant, and Tween 20 as a nonionic surfactant, as shown in Table 1 below. At this time, the pH of the composition was adjusted to 9 using NaOH (sodium hydroxide).
<실시예 2. 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물의 대변 샘플에의 적용><Example 2. Application of a composition for stabilizing or extracting nucleic acids in biological samples to fecal samples>
공여자의 대변 샘플을 면봉을 이용하여 약 200 mg 채취한 후 실시예 1에 따른 조성물 3 ml에 접촉시킨 후 큰 덩어리가 보이지 않을 정도로 혼합하여 균질화하였다. 이때, 상기 샘플은 소변이나 변기 물이 섞이지 않도록 채취하였으며, 조성물과 혼합된 상기 샘플은 상온에서 보관하였다.A stool sample of about 200 mg from a donor was collected using a cotton swab, brought into contact with 3 ml of the composition according to Example 1, and then mixed until no large lumps were visible to homogenize the sample. At this time, the sample was collected without mixing with urine or toilet water, and the sample mixed with the composition was stored at room temperature.
<실시예 3. 핵산 안정화 또는 추출용 조성물과 혼합된 생물학적 샘플의 16S rRNA 유전자 증폭 PCR><Example 3. 16S rRNA gene amplification PCR of biological sample mixed with composition for stabilizing or extracting nucleic acid>
실시예 2에 따라 조성물과 혼합된 샘플은 직접, 물에 희석하여, 또는 추가로 추출 및 정제한 후에 하기 표 2와 같은 16S rRNA 유전자의 증폭용 PCR 반응액 20 μl 내에 2 μl가 되도록(표 2의 template) 포함시키고, 이렇게 제조된 반응액을 표 3과 같은 조건으로 반응시켰다.According to Example 2, the sample mixed with the composition was directly, diluted in water, or after further extraction and purification, and was included in 2 μl of a 20 μl PCR reaction solution for amplification of the 16S rRNA gene as shown in Table 2 below (template of Table 2), and the reaction solution thus prepared was reacted under the conditions as shown in Table 3.
<실시예 4. 핵산 안정화 또는 추출용 조성물과 혼합된 생물학적 샘플에 대한 NGS 분석><Example 4. NGS analysis of biological samples mixed with a composition for stabilizing or extracting nucleic acids>
실시예 2에 따른 조성물과 혼합된 대변 샘플은 상온에서 보관하다 직접, 물에 희석하여, 또는 추가로 추출 및 정제한 후에 실시예 3에 따라 PCR 후 NGS (next generation sequencing) 라이브러리를 제작한 다음, Nextseq 550Dx 장비를 이용하여 분석하였다. 최종적으로 공여자 대변 샘플 내 미생물 프로파일을 정성적으로 분석할 수 있는 alpha rarefaction 분석법을 이용하여 각 조건에서 공여자 대변 샘플 내 검출된 미생물 개수를 확인하고, 비유사성을 Bray-Curtis dissimilarity 분석을 통해 정량화하여 확인하였다.The stool sample mixed with the composition according to Example 2 was stored at room temperature, and then directly, diluted in water, or further extracted and purified, and then a next generation sequencing (NGS) library was created by PCR according to Example 3, and then analyzed using a Nextseq 550Dx device. Finally, the alpha rarefaction analysis method, which can qualitatively analyze the microbial profile in the donor stool sample, was used to confirm the number of microorganisms detected in the donor stool sample under each condition, and the dissimilarity was quantified and confirmed using Bray-Curtis dissimilarity analysis.
<실시예 5. 본 발명에 따른 조성물의 pH가 샘플 내 핵산에 미치는 영향 확인><Example 5. Confirmation of the effect of pH of the composition according to the present invention on nucleic acid in a sample>
표 1의 조성물의 pH를 NaOH를 이용하여 8, 9, 9.5 및 10으로 하여 제조한 후, 각 조성물에 실시예 2에 따라 공여자의 대변 샘플을 혼합하여 균질화하였다. 이렇게 혼합된 샘플을 최종 희석 배율이 1:1000이 되도록 표 2와 같은 PCR 반응액에 직접 혼합하고, 이를 표 3에 따라 증폭시킨 후, 아가로즈 젤에 로딩하여 전기영동한 결과가 도 1과 같았다. 즉, 실험한 모든 pH에서 16S rDNA 증폭이 정상적으로 일어난다는 것을 확인하였다. 이는 상기 pH에서 본 발명의 조성물이 유사한 수준으로 샘플 내 핵산을 안정적으로 유지하고 추출해낼 수 있음을 의미한다. 또한, PCR 반응에서 pH는 비정상적인 반응을 유도할 수 있으나, PCR 전 충분히 희석되어 반응에 영향을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.The pH of the composition of Table 1 was prepared using NaOH at 8, 9, 9.5, and 10, and then the donor's stool sample was mixed with each composition according to Example 2 and homogenized. The mixed sample was directly mixed with the PCR reaction solution as in Table 2 so that the final dilution ratio was 1:1000, and this was amplified according to Table 3, and then loaded onto an agarose gel and electrophoresed. The results were as shown in Fig. 1. That is, it was confirmed that 16S rDNA amplification occurred normally at all pHs tested. This means that the composition of the present invention can stably maintain and extract nucleic acids in a sample at a similar level at the above pH. In addition, it was confirmed that although pH can induce an abnormal reaction in a PCR reaction, it does not affect the reaction because it is sufficiently diluted before PCR.
<실시예 6. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플 및 시판 대변 핵산 추출 키트로 정제한 샘플 유래 핵산의 16S rRNA 유전자 증폭 PCR 결과 비교><Example 6. Comparison of 16S rRNA gene amplification PCR results of a sample homogenized with a composition according to the present invention and a sample-derived nucleic acid purified using a commercially available fecal nucleic acid extraction kit>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 추후 핵산 분석에 사용될 수 있는지 추가로 확인하기 위해, 상기 혼합된 샘플과, 시판 대변 핵산 추출 키트를 이용하여 동일한 대변 샘플로부터 추출한 핵산에 대해 16S rRNA 유전자 증폭 PCR을 수행하였다. 이때, 시판 대변 핵산 추출 키트는 QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen) 이었으며, 이를 이용하여 제조사 지침에 따라 대변 샘플로부터 핵산을 추출하였다.To further verify whether the homogenized sample according to the present invention can be used for subsequent nucleic acid analysis, 16S rRNA gene amplification PCR was performed on the mixed sample and nucleic acids extracted from the same stool sample using a commercial stool nucleic acid extraction kit. At this time, the commercial stool nucleic acid extraction kit was QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen), and nucleic acids were extracted from the stool sample using this according to the manufacturer's instructions.
본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 혼합된 대변 샘플을 직접 1:1000으로 PCR 반응물에 희석한 경우와 시판 대변 핵산 추출 키트로부터 얻은 핵산(4 ng)을 PCR 반응물에 포함시킨 경우에 대해 각각 실시예 3과 같이 16S rRNA 유전자 증폭 PCR을 수행하고, 각 PCR 결과물을 젤에 로딩 후 전기영동하여 확인한 결과는 도 2와 같았으며, 본 발명의 조성물을 사용한 경우와 시판 대변 핵산 추출 키트를 사용한 경우 모두 16S rRNA 유전자를 충분히 특이적으로 증폭시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.When the fecal sample mixed in the composition according to Example 1 of the present invention was directly diluted 1:1000 in the PCR reaction medium and when the nucleic acid (4 ng) obtained from a commercial fecal nucleic acid extraction kit was included in the PCR reaction medium, 16S rRNA gene amplification PCR was performed as in Example 3, and the results of loading each PCR result onto a gel and performing electrophoresis were as shown in Fig. 2, and it was confirmed that the 16S rRNA gene could be sufficiently specifically amplified both when the composition of the present invention was used and when the commercial fecal nucleic acid extraction kit was used.
<실시예 7. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플 및 시판 대변 핵산 추출 키트로 정제한 샘플 유래 핵산의 NGS 분석 결과 비교><Example 7. Comparison of NGS analysis results of nucleic acids from samples homogenized with a composition according to the present invention and samples purified using a commercially available fecal nucleic acid extraction kit>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 추후 핵산 분석에 사용될 수 있는지 추가로 확인하기 위해, 상기 혼합된 샘플과, 시판 대변 핵산 추출 키트를 이용하여 동일한 대변 샘플로부터 추출한 핵산에 대해 각각 NGS를 이용해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일을 얻고, 이에 대해 alpha rarefaction 분석하였다. 이때, 시판 대변 핵산 추출 키트는 QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen) 이었으며, 이를 이용하여 제조사 지침에 따라 대변 샘플로부터 핵산을 추출하였다.To further verify whether the homogenized sample according to the composition of the present invention can be used for subsequent nucleic acid analysis, microbial profiles based on the 16S rRNA gene were obtained using NGS for the mixed sample and nucleic acids extracted from the same stool sample using a commercially available fecal nucleic acid extraction kit, and alpha rarefaction analysis was performed thereon. At this time, the commercially available fecal nucleic acid extraction kit was QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen), and nucleic acids were extracted from the stool sample using this according to the manufacturer's instructions.
본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 혼합된 대변 샘플을 직접 1:100 및 1:1000으로 희석한 경우와 시판 대변 핵산 추출 키트로부터 얻은 핵산(4 ng 및 10 ng)에 대해 각각 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 alpha rarefaction 분석한 결과는 도 3과 같았으며, 본 발명의 조성물을 사용한 경우와 시판 대변 핵산 추출 키트를 사용한 경우 모두 사용된 핵산량에 비례하여 검출되는 미생물 프로파일의 정성적 결과의 변화 경향이 유사하게 나타난다는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 조성물에 혼합된 대변 샘플을 직접 PCR 반응액에 혼합한 결과 희석 배율이 높아질수록 검출되는 미생물 프로파일의 결과가 감소되는 양상을 확인할 수 있었다. 좀더 상세하게, depth에 따른 alpha rarefaction 수치를 확인한 결과, 기존 키트로 추출한 핵산 4 ng와 본 발명의 조성물에 혼합된 대변 샘플을 직접 1/1000로 희석하여 NGS 분석한 결과가 서로 거의 동일하고, 기존 키트로 추출한 핵산 10 ng와 본 발명의 조성물에 균질화한 샘플을 직접 1/100로 희석하여 NGS 분석한 결과가 서로 거의 동일하게 나타났다. 이는 동일한 대변 샘플 내의 미생물 프로파일 중 검출된 미생물의 종 수는 시판 대변 핵산 추출 키트를 이용하여 추출한 핵산과 본 발명의 조성물에 균질화한 샘플 간의 차이가 없다는 것을 의미한다. 이를 통해, 본 발명의 조성물은 생물학적 샘플과 혼합 후 추가적인 핵산의 추출 및 정제 과정 없이도 샘플로부터 핵산을 바로 추후 분석이 가능한 수준으로 추출할 수 있음을 추가로 확인할 수 있다.The results of alpha rarefaction analysis on microbial profiles based on the 16S rRNA gene obtained using NGS for the feces sample mixed in the composition according to Example 1 of the present invention, which was directly diluted 1:100 and 1:1000, and for the nucleic acids (4 ng and 10 ng) obtained from a commercial feces nucleic acid extraction kit, were as shown in Fig. 3. It was confirmed that the qualitative results of the microbial profiles detected in proportion to the amount of nucleic acids used were similar in both the cases of using the composition of the present invention and using the commercial feces nucleic acid extraction kit. That is, it was confirmed that the results of the detected microbial profiles decreased as the dilution ratio increased when the feces sample mixed in the composition of the present invention was directly mixed in the PCR reaction solution. In more detail, as a result of checking the alpha rarefaction value according to depth, the results of NGS analysis on 4 ng of nucleic acids extracted with an existing kit and on a stool sample mixed with the composition of the present invention and directly diluted 1/1000 were almost the same, and the results of NGS analysis on 10 ng of nucleic acids extracted with an existing kit and on a sample homogenized with the composition of the present invention and directly diluted 1/100 were almost the same. This means that the number of microorganisms detected in the microbial profiles in the same stool sample does not differ between the nucleic acids extracted using a commercially available stool nucleic acid extraction kit and the sample homogenized with the composition of the present invention. Through this, it can be additionally confirmed that the composition of the present invention can extract nucleic acids from a sample to a level that can be analyzed later without an additional nucleic acid extraction and purification process after mixing with a biological sample.
<실시예 8. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플(직접, 또는 추가 추출 및 정제 후) 및 기존 대변 핵산 안정화 키트에 보관 후 추가 추출 및 정제한 샘플 유래 핵산의 16S rRNA 유전자 증폭 PCR 결과 비교><Example 8. Comparison of 16S rRNA gene amplification PCR results of nucleic acids from samples homogenized in a composition according to the present invention (directly or after additional extraction and purification) and samples stored in a conventional fecal nucleic acid stabilization kit and then further extracted and purified>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 핵산을 안정적으로 보존하는지, 추후 핵산 분석에 사용될 수 있는지 추가로 확인하기 위해, 상기 본 발명에 따른 조성물에 혼합 후 1, 4 및 7일 간 상온에 보관한 샘플 또는 해당 샘플을 추가로 핵산 추출 키트를 이용하여 추출한 핵산과, 동일한 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 각 동일 기간 보관 후 핵산 추출 키트를 이용하여 추출한 핵산(대조군)에 대해 각각 실시예 3과 같이 16S rRNA 유전자 증폭 PCR을 수행하고, 그 PCR 산물을 각각 젤 전기영동하여 확인하였다. 이때, 기존 대변 핵산 안정화 키트는 OMNIgene® (Cat. No. OM-200, DNA Genotek), 핵산 추출 키트는 QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen) 이었다.In order to further confirm whether the sample homogenized in the composition according to the present invention stably preserves nucleic acids and can be used for nucleic acid analysis later, samples mixed with the composition according to the present invention and stored at room temperature for 1, 4, and 7 days, or nucleic acids additionally extracted from the samples using a nucleic acid extraction kit, and nucleic acids (control group) extracted from the same stool samples using a nucleic acid extraction kit after storing them in an existing stool nucleic acid stabilization kit for the same period of time, were subjected to 16S rRNA gene amplification PCR as in Example 3, and the PCR products were each subjected to gel electrophoresis to confirm. At this time, the existing stool nucleic acid stabilization kit was OMNIgene® (Cat. No. OM-200, DNA Genotek), and the nucleic acid extraction kit was QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen).
그 결과는 도 4와 같이 모든 경우 표적 유전자인 16S rRNA 유전자가 올바르게 증폭되었다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명에 따른 조성물을 이용한 경우, 본 발명에 따른 조성물에 혼합한 샘플을 직접 PCR 반응물에 이용한 경우와 이를 추가로 핵산 추출 키트를 이용하여 추출 및 정제한 핵산을 PCR 반응물에 이용한 경우 모두 표적 유전자를 충분히 특이적으로 증폭할 수 있는 것으로 나타나, 본 발명의 조성물에 보관된 샘플은 추가적인 핵산의 추출 및 정제 없이도 충분히 핵산 분석에 이용될 수 있음을 확인할 수 있다.The results were as shown in Fig. 4, confirming that the target gene, 16S rRNA gene, was correctly amplified in all cases. In particular, in the case of using the composition according to the present invention, both when the sample mixed in the composition according to the present invention was directly used in the PCR reaction and when the nucleic acid extracted and purified using a nucleic acid extraction kit was additionally used in the PCR reaction, it was shown that the target gene could be sufficiently and specifically amplified, confirming that the sample stored in the composition of the present invention can be sufficiently used for nucleic acid analysis without additional nucleic acid extraction and purification.
<실시예 9. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플 상온 보관 후 NGS 분석 결과의 재현성 확인><Example 9. Confirmation of reproducibility of NGS analysis results after storing a homogenized sample in a composition according to the present invention at room temperature>
본 발명에 따른 조성물을 이용한 결과가 안정적으로 재현되는지 확인하기 위하여 동일한 공여자로부터 채취한 동일한 대변 샘플을 실시예 2에 따른 조성물과 혼합하여 균질화한 다음 상온에서 7일 보관 후 직접 실시예 3에 따라 PCR 반응액에 투여하여 PCR하고, 반응물을 이용하여 NGS (next generation sequencing) 라이브러리를 제작한 다음, Nextseq 550Dx 장비를 이용하여 분석하는 과정을 각각 10회 진행하였다. 이렇게 얻은 미생물 프로파일 10건을 상관분석(correlation analysis) 방법으로 분석한 결과, 상관계수가 0.9357 (95% CI: 0.8833-0.9881)로 나타나, 결과 간 유사성이 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 조성물 및 이를 이용한 방법으로부터 재현성 높은 핵산 분석 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.In order to verify whether the results using the composition according to the present invention are stably reproducible, the same stool sample collected from the same donor was mixed with the composition according to Example 2, homogenized, stored at room temperature for 7 days, and then directly administered to a PCR reaction solution according to Example 3 to perform PCR, and the reactants were used to create an NGS (next generation sequencing) library, which was then analyzed using Nextseq 550Dx equipment. The process was performed 10 times for each of the 10 microbial profiles obtained in this way when analyzed using the correlation analysis method. As a result, the correlation coefficient was 0.9357 (95% CI: 0.8833-0.9881), confirming that the similarity between the results was very high. That is, it was confirmed that highly reproducible nucleic acid analysis results can be obtained from the composition according to the present invention and the method using the same.
<실시예 10. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플 및 기존 대변 핵산 안정화 키트에 보관 후 추가 추출 및 정제한 샘플 유래 핵산의 NGS 분석 결과 비교><Example 10. Comparison of NGS analysis results of nucleic acids from samples homogenized with a composition according to the present invention and samples further extracted and purified after storage in an existing fecal nucleic acid stabilization kit>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 핵산을 안정적으로 보존하는지, 추후 핵산 분석에 사용될 수 있는지 추가로 확인하기 위해, 상기 혼합 후 7일 간 상온에 보관한 샘플과 동일한 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 7일 보관 후 핵산 추출 키트를 이용하여 추출한 핵산에 대해 각각 NGS를 이용해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일을 얻고, 이에 대해 alpha rarefaction 분석하였다. 이때, 기존 대변 핵산 안정화 키트는 OMNIgene® (Cat. No. OM-200, DNA Genotek), 핵산 추출 키트는 QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen) 이었으며, 이를 순서대로 제조사 지침에 따라 이용하여 대변 샘플을 상온에 7일 보관 후 이로부터 핵산을 추출하였다. In order to further confirm whether the sample homogenized in the composition according to the present invention stably preserves nucleic acids and can be used for nucleic acid analysis later, the same stool sample as the sample stored at room temperature for 7 days after the mixing was stored in an existing stool nucleic acid stabilization kit for 7 days, and then the nucleic acids extracted using a nucleic acid extraction kit were each subjected to microbial profiles based on the 16S rRNA gene using NGS, and alpha rarefaction analysis was performed on these. At this time, the existing stool nucleic acid stabilization kit was OMNIgene® (Cat. No. OM-200, DNA Genotek), and the nucleic acid extraction kit was QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen), and these were used in that order according to the manufacturer's instructions, the stool sample was stored at room temperature for 7 days, and then nucleic acids were extracted from it.
분석 결과는 도 5와 같이 동일 샘플을 동일 기간(7일) 보관했을 때 본 발명의 조성물과 기존 대변 핵산 안정화 키트가 유사하게 나타나, 본 발명의 조성물이 대변 샘플 내에 포함된 핵산을 최소한 7일 이상 안정적으로 보관할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 조성물은 기존 대변 핵산 안정화 키트에 비해 추가적인 핵산 추출 및 정제 과정 없이 핵산을 추출할 수 있으며, 이렇게 추출된 핵산은 추후 핵산 분석 시 충분히 신뢰할 수 있는 결과물을 도출할 수 있다는 것 또한 확인할 수 있었다.The analysis results, as shown in Fig. 5, show that when the same sample was stored for the same period (7 days), the composition of the present invention and the existing fecal nucleic acid stabilization kit showed similar results, indicating that the composition of the present invention can stably store nucleic acids contained in a fecal sample for at least 7 days. In addition, it was confirmed that the composition of the present invention can extract nucleic acids without an additional nucleic acid extraction and purification process compared to the existing fecal nucleic acid stabilization kit, and that the nucleic acids extracted in this way can produce sufficiently reliable results in later nucleic acid analysis.
<실시예 11. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플의 사용 방법에 따른 16S rRNA 유전자 증폭 PCR 결과 비교><Example 11. Comparison of 16S rRNA gene amplification PCR results according to the method of using a sample homogenized in a composition according to the present invention>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플을 직접 PCR 반응액에 첨가하여 최종 희석 배율이 되도록 하는 경우와 미리 물에 희석 후 PCR 반응액에 최종 희석 배율이 되도록 하는 경우, 핵산 분석 결과에 차이가 있는지 확인해보았다. 이때, 상기 혼합된 샘플은 상온에서 7일 간 보관한 것을 사용하였으며, 최종 희석 배율은 1:100, 1:1000 및 1:10000으로 하였고, 각각 실시예 3과 같이 PCR 반응을 진행하였으며, 물에 희석하는 경우 멸균된 물을 사용하였다.In the case where a homogenized sample according to the present invention is directly added to a PCR reaction solution to make the final dilution ratio, and where it is diluted in water in advance and then added to the PCR reaction solution to make the final dilution ratio, it was checked whether there was a difference in the results of nucleic acid analysis. At this time, the mixed sample was stored at room temperature for 7 days, and the final dilution ratios were 1:100, 1:1000, and 1:10000, and the PCR reaction was performed as in Example 3, respectively. When diluting in water, sterilized water was used.
그 결과는 도 6과 같이 모든 조건에서 표적 유전자인 16S rRNA 유전자가 올바르게 증폭되었다는 것을 확인할 수 있었으며, 물에 희석시키는 단계를 추가로 포함하는가 여부에 관계없이 희석 비율과 특이적 증폭 밴드의 강도 간 상관 관계를 가지는 것으로 나타났다.The results, as shown in Fig. 6, confirmed that the target gene, 16S rRNA gene, was correctly amplified under all conditions, and showed a correlation between the dilution ratio and the intensity of the specific amplification band, regardless of whether an additional step of diluting in water was included.
<실시예 12. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플(직접, 또는 추가 추출 및 정제 후) 및 기존 대변 핵산 안정화 키트에 보관 후 추가 추출 및 정제한 샘플 유래 핵산의 보관 기간별 NGS 분석 결과 비교><Example 12. Comparison of NGS analysis results by storage period of nucleic acids derived from samples homogenized in a composition according to the present invention (directly or after additional extraction and purification) and samples further extracted and purified after storage in an existing fecal nucleic acid stabilization kit>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 핵산을 안정적으로 보존하는지 추가로 확인하기 위해 1, 4, 7 및 30일 간 보관 후 직접 또는 추가 추출 및 정제 후 수득된 핵산에 대하여 각각 NGS를 이용해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일을 얻었다. 이를 기존 대변 핵산 안정화 키트에 각 기간별로 보관된 대변 샘플을 핵산 추출 키트로 추출 및 정제하여 얻은 핵산으로부터 각각 얻은 결과와 함께 Bray-Curtis dissimilarity 분석하였다. 단, 30일 보관 후의 결과는 다른 보관 기간의 경우와 다른 샘플을 사용하여 미생물 프로파일이 다른 바, 다른 일자의 결과와 함께 분석할 수 없어 30일 보관 후 결과는 따로 분석하였다.In order to further confirm whether the sample homogenized in the composition according to the present invention stably preserves nucleic acids, 16S rRNA gene-based microbial profiles were obtained using NGS for the nucleic acids obtained directly or after additional extraction and purification after storage for 1, 4, 7, and 30 days, respectively. These were subjected to Bray-Curtis dissimilarity analysis together with the results obtained from the nucleic acids obtained by extracting and purifying the stool samples stored for each period with a nucleic acid extraction kit using a conventional stool nucleic acid stabilization kit. However, the results after 30 days of storage were different from those of other storage periods in that the microbial profiles were different, and therefore the results after 30 days of storage could not be analyzed together with the results from other days. Therefore, the results after 30 days of storage were analyzed separately.
그 결과는 도 7과 같이, 본 발명에 따른 조성물의 사용 여부나 추가 핵산 추출 및 정제 단계의 포함 여부와 관계없이 유사한 것으로 나타났다. 즉, 1, 4 및 7일 보관 후 수득된 결과는 모두 유사 그룹에 속하는 것으로 나타났으며, 30일 보관 후 수득된 결과 역시 서로 모두 유사 그룹으로 묶을 수 있었다.The results, as shown in Fig. 7, were similar regardless of whether the composition according to the present invention was used or whether an additional nucleic acid extraction and purification step was included. That is, the results obtained after 1, 4, and 7 days of storage were all found to belong to similar groups, and the results obtained after 30 days of storage could also all be grouped into similar groups.
<실시예 13. 본 발명에 따른 조성물의 조성 변화 시 NGS 분석 결과 비교><Example 13. Comparison of NGS analysis results when the composition of the composition according to the present invention is changed>
이온성 및 비이온성 계면활성제를 모두 포함하고 있는 본 발명의 조성물에서 비이온성 계면활성제를 제거했을 때 핵산 분석 결과에 어떤 영향이 있는지 알아보기 위해, 표 1에서 TWEEN 20를 제외한 조성물을 제조하고, 여기에 대변 샘플을 혼합하여 균질화하고 7일간 상온에서 보관한 다음, 상기 샘플을 직접 또는 그로부터 추가로 핵산 추출 키트를 이용한 핵산 추출 및 정제 후 각각 NGS를 이용해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일을 얻었다. To determine what effect the removal of a nonionic surfactant from a composition of the present invention containing both ionic and nonionic surfactants has on the results of nucleic acid analysis, a composition excluding TWEEN 20 in Table 1 was prepared, a stool sample was mixed therewith, homogenized, stored at room temperature for 7 days, and then the sample was directly or additionally subjected to nucleic acid extraction and purification using a nucleic acid extraction kit, and microbial profiles based on the 16S rRNA gene were obtained using NGS, respectively.
1) 상기 미생물 프로파일 결과를 동일 기간 단독 보관한 대변 샘플, 표 1의 조성물에 혼합, 보관된 대변 샘플 또는 그로부터 추가 추출 및 정제 과정을 거쳐 얻은 핵산, 및 기존 대변 핵산 안정화 키트에 보관된 대변 샘플을 핵산 추출 키트로 추출 및 정제하여 얻은 핵산으로부터 각각 얻은 미생물 프로파일 결과와 함께 Bray-Curtis dissimilarity 분석하였다.1) The microbial profile results obtained from the following samples were analyzed for Bray-Curtis dissimilarity: a microbial profile result obtained from a stool sample stored alone for the same period; a stool sample mixed and stored in the composition of Table 1; or nucleic acids obtained through an additional extraction and purification process therefrom; and a stool sample stored in a conventional stool nucleic acid stabilization kit; and nucleic acids extracted and purified using a nucleic acid extraction kit.
그 결과는 도 8과 같이, 본 발명에 따른 조성물을 사용한 두 경우와 기존 대변 핵산 안정화 키트를 사용한 경우는 모두 유사한 그룹에 속하는 것으로 나타났으나, 비이온성 계면활성제인 TWEEN 20가 제외된 조성물을 사용한 경우 미생물 프로파일에 차이가 발생하여 앞선 유사 그룹에 함께 묶이지 않았고, 추가로 대변 샘플을 상온에서 그대로 보관할 경우 미생물 프로파일 차이가 더욱 크게 나타남을 확인할 수 있었다.The results, as shown in Fig. 8, showed that both cases using the composition according to the present invention and cases using the existing fecal nucleic acid stabilization kit belonged to similar groups, but when the composition excluding the nonionic surfactant TWEEN 20 was used, a difference in the microbial profile occurred and the samples were not grouped together in the aforementioned similar group. In addition, it was confirmed that the difference in the microbial profile was even greater when the fecal sample was stored at room temperature.
2) 추가로, 상기와 같은 차이가 어떤 방향으로 나타나는지 확인하기 위하여 상기 미생물 프로파일 중 본 발명에 따른 조성물 및 표1의 조성에서 TWEEN 20을 넣지 않은 조성물을 사용하여 각각 직접 NGS 분석한 결과에 대하여 alpha rarefaction 분석하였다. 그 결과 도 9와 같이, TWEEN 20가 제외된 조성물을 사용한 경우 미생물 프로파일이 감소한 것으로 나타나, 이온성 및 비이온성 계면활성제를 모두 포함한 본 발명에 따른 조성물이 핵산을 안정적으로 보존하고 잘 추출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.2) Additionally, in order to confirm in which direction the above difference appears, alpha rarefaction analysis was performed on the results of direct NGS analysis using the composition according to the present invention and the composition of Table 1 without TWEEN 20 among the above microbial profiles. As a result, as shown in Fig. 9, when the composition without TWEEN 20 was used, the microbial profile was found to decrease, confirming that the composition according to the present invention including both ionic and nonionic surfactants can stably preserve and extract nucleic acids well.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art will understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical idea or essential characteristics of the present invention. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not restrictive. For example, each component described as a single component may be implemented in a distributed manner, and likewise, components described as distributed may be implemented in a combined form.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the claims set forth below, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalent concepts should be interpreted as being included in the scope of the present invention.
Claims (16)
상기 킬레이트화제는 에틸렌디아민트리아세트산(EDTA)이고 상기 조성물 내에 150 내지 250 mM 포함되며,
상기 비이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 5 내지 15 %(v/v) 포함되고,
상기 조성물과 혼합된 핵산은 상온에서 30일 이상 안정하게 유지될 수 있으며, 추가적인 추출 및 정제 단계 없이도 핵산 분석에 이용되어 신뢰할 만한 결과를 낼 수 있도록 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물. A composition comprising a chelating agent, an ionic surfactant and a nonionic surfactant,
The chelating agent is ethylenediaminetriacetic acid (EDTA) and is included in the composition in an amount of 150 to 250 mM.
The nonionic surfactant is contained in the composition at 5 to 15% (v/v),
A composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, wherein the nucleic acids mixed with the above composition can be stably maintained for more than 30 days at room temperature and can be used for nucleic acid analysis without additional extraction and purification steps to produce reliable results.
상기 이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 0.1 내지 5 %(v/v) 포함되고,
도데실 황산 나트륨(SDS), 라우릴 황산나트륨(SLS) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
In the first paragraph,
The ionic surfactant is contained in the composition at 0.1 to 5% (v/v),
A composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, characterized in that the composition comprises sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium lauryl sulfate (SLS), and combinations thereof.
상기 조성물은 pH가 7 내지 11인 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
In the first paragraph,
A composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, characterized in that the composition has a pH of 7 to 11.
상기 생물학적 샘플은 대변, 소변, 체액, 토양, 물, 공기 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
In the first paragraph,
A composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, characterized in that the biological sample is selected from feces, urine, body fluid, soil, water, and air.
상기 핵산은 DNA, RNA 및 그 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
In the first paragraph,
A composition for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, characterized in that the nucleic acids are selected from DNA, RNA and combinations thereof.
재밀봉이 가능한 용기를 포함하는,
생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 키트.
The composition of paragraph 1; and
Containing a resealable container,
A kit for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample.
상기 키트는 추가로 생물학적 샘플을 상기 용기로 옮기기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 키트.
In Article 9,
A kit for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample, characterized in that the kit further comprises means for transferring the biological sample to said container.
생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출 방법.
Comprising the step of mixing the composition of claim 1 and a biological sample containing nucleic acid,
A method for stabilizing or extracting nucleic acids in a biological sample.
상기 제1혼합물을 분석하는 단계를 포함하는,
생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
A step of mixing the composition of claim 1 and a biological sample containing nucleic acid to obtain a first mixture; and
Comprising a step of analyzing the first mixture,
A method for analyzing nucleic acids in biological samples.
상기 방법은 추가로 핵산을 추출, 정제하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
In Article 12,
A method for analyzing nucleic acids in a biological sample, characterized in that the method does not additionally include a step of extracting or purifying nucleic acids.
상기 분석은 정량, 검출, 유전형 분석 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
In Article 12,
A method for analyzing nucleic acids in a biological sample, wherein the analysis is selected from quantitation, detection, genotyping and combinations thereof.
상기 분석은 PCR 기반의 방법, NGS, 마이크로어레이, ChIP(chromatin immunoprecipitation), 핵산지문법(nucleic acid fingerprinting), 서던블롯(southern blot) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
In Article 12,
A method for analyzing nucleic acids in a biological sample, characterized in that the above analysis is selected from PCR-based methods, NGS, microarray, ChIP (chromatin immunoprecipitation), nucleic acid fingerprinting, southern blot, and combinations thereof.
상기 분석은 메타게놈 분석인 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
In Article 12,
A method for analyzing nucleic acids in a biological sample, characterized in that the above analysis is a metagenomic analysis.
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| FrontiersinMicrobiology, 2015, Vol.6, No.476, pp.1-25 1부.* |
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