KR102741293B1

KR102741293B1 - 직장 신경내분비종양 예후 예측용 바이오마커로서 세로토닌, 소마토스타틴 및 pyy의 용도

Info

Publication number: KR102741293B1
Application number: KR1020220150154A
Authority: KR
Inventors: 홍승모; 김지섭
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단; 울산대학교 산학협력단; (의료)길의료재단; 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2022-11-11
Filing date: 2022-11-11
Publication date: 2024-12-17
Anticipated expiration: 2042-11-11
Also published as: KR20240072324A

Abstract

본 발명은 직장 신경내분비종양 예후 예측용 바이오마커로서 세로토닌, 소마토스타틴 및 PYY의 용도에 관한 것으로, 본 발명 특유의 직장 신경내분비종양(직장 NET) 예후 예측 마커들 및 이들을 이용하여 직장 NET의 아형을 분류하고 이에 따른 환자의 예후를 예측하는 방식은, 직장 NET 환자의 생존(무질병 생존 또는 무재발 생존) 예후를 보다 신뢰성 있게 효과적으로 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 세로토닌 및 소마토스타틴(추가로 크로목라닌 A) 조합은 직장 NET 환자의 불량한 예후(고위험군) 예측에 있어서 상승효과(시너지 효과)가 있다.

Description

직장 신경내분비종양 예후 예측용 바이오마커로서 세로토닌, 소마토스타틴 및 PYY의 용도 {Use of serotonin, somatostatin and PYY as a prognostic biomarker for rectal neuroendocrine tumor}

본 발명은 직장 신경내분비종양 예후 예측용 바이오마커로서 세로토닌, 소마토스타틴 및 PYY의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세로토닌, 소마토스타틴, PYY 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물 및 키트, 직장 신경내분비종양 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

소화관계에서 발생한 신경내분비종양(일례로, gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor, GEP NET) 중에서, 특히 직장에서 발생한 신경내분비종양(rectal neuroendocrine tumor)의 발생 빈도가 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 소화관계라고 하더라도, 구체적으로 신경내분비종양(NET)이 발생한 위치(즉, 원발성 위치) 및 해당 위치에서의 종양을 구성하는 신경내분비세포의 종류에 따라 다양한 생물학적, 임상적 행동을 보이기 때문에, 직장 신경내분비종양(NET)의 이질적 특성에 따른 이의 진단(또는 예후 예측) 및 치료 전략이 필요한 실정이다.

한편, 직장 NET에서 종양을 구성하는 신경내분비세포의 종류(유형) 또는 이들의 펩티드 호르몬 발현과 관련해서, 그 어느 것도 현재 직장 NET와 관련하여 임상병리학적 특성 및 예후와 관련하여 연구되고 있지 않다. 일례로 2019년 세계보건기구(WHO) 분류체계에서 L-cell NET는 다른 세포 유형의 직장 NET과 마찬가지로 악성 신생물로 분류되고 있는 실정이다(비특허문헌 1).

WHO Classification of Tumours Editorial Board. Digestive System Tumours. 5th ed. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2019. WHO Classification of Tumours; vol 1.

이에 본 발명자들은 직장 NET(neuroendocrine tumor)에 대한 연구를 진행하던 중, 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 가 상기 질환에 대한 예후 예측용 바이오 마커로서 기능함을 최초로 규명하였으며, 특히 이들을 이용하여 직장 NET의 아형을 분류하고 이에 따른 환자의 예후를 예측하는 방식은, 직장 NET 환자의 생존(무질병 생존 또는 무재발 생존) 예후를 보다 신뢰성 있게 효과적으로 예측하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였을 뿐만 아니라, 상기 마커들 중 특정 조합들이 직장 NET 환자의 불량한 예후(고위험군) 예측에 있어서 상승효과(시너지 효과)가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은, 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물, 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 피검체 유래의 생물학적 시료에서 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 상기 마커 조성물은 추가로 크로모그라닌 A(chromogranin A) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물, 또는 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물은, 추가로 크로모그라닌 A(chromogranin A) 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 키트는, 후술하는 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 포함하는 내용이 교시된 설명서를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은, 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 직장 신경내분비종양의 예후 예측 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 제제를 제조(생산)하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 단백질에 특이적인 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는, 이에 제한되지 않으나 상기 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제일 수 있다. 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제는, 일례로 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 피검체 유래의 생물학적 시료에서 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, 추가로 크로모그라닌 A(chromogranin A) 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준 측정을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 예후 예측은 환자의 무질병 생존 또는 재발 여부를 예측하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 생물학적 시료는, 환자로부터 분리된 직장 신경내분비종양 조직 및 체액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 상기 단백질 발현수준은, 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자의 발현 수준 측정은, 이에 제한되지 않으나, 상기 유전자의 mRNA 발현수준 측정을 의미하는 것일 수 있다. 상기 유전자의 mRNA 발현수준은, 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), 형광 인 시투 하이브리드화(FISH), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, 추가로 상기 측정된 발현수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, 상기 대조군과 비교하여, PPY 단독 발현은 L-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류하고, 세로토닌 단독 발현은 EC-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류하며, 소마토스타틴 단독 발현은 D-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, D-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류된 피검체는 고위험군으로 분류하고, EC-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류된 피검체는 중간위험군으로 분류하며, L-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류된 피검체는 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, PPY, 세로토닌 및 소마토스타틴이 모두 검출되지 않은 피검체는 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, 하기 (i) 또는 (ii)의 조합에 대해 이들의 단백질, 또는 이들을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

(i) 세로토닌 및 소마토스타틴; 또는

(ii) 세로토닌, 소마토스타틴 및 크로모그라닌 A.

상기 본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, 대조군과 비교하여

세로토닌 및 소마토스타틴이 공동 발현; 또는

세로토닌, 소마토스타틴 및 크로모그라닌 A가 공동 발현된 피검체는 고위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명 특유의 직장 신경내분비종양(직장 NET) 예후 예측 마커들 및 이들을 이용하여 직장 NET의 아형을 분류하고 이에 따른 환자의 예후를 예측하는 방식은, 직장 NET 환자의 생존(무질병 생존 또는 무재발 생존) 예후를 보다 신뢰성 있게 효과적으로 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 세로토닌 및 소마토스타틴(추가로 크로목라닌 A) 조합은 직장 NET 환자의 불량한 예후(고위험군) 예측에 있어서 상승효과(시너지 효과)가 있다.

도 1은 직장 NET 조직의 H&E 염색 결과 양상과, 직장 NET에서의 각 펩타이드 호르몬(PYY, glucagon, serotonin, somatostatin, insulin 및 gastrin)의 면역조직화학적 발현을 보여주는 대표적인 이미지이다.
도 2a는 소마토스타틴 발현이 있는 직장 NET 환자와, 소마토스타틴 발현이 없는 직장 NET 환자의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 나타낸다.
도 2b는 세로토닌 발현이 있는 직장 NET 환자와, 세로토닌 발현이 없는 직장 NET 환자의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 나타낸다.
도 2c는 글루카곤 발현이 있는 직장 NET 환자와, 글루카곤 발현이 없는 직장 NET 환자의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 나타낸다.
도 2d는 PYY 발현이 있는 직장 NET 환자와, PYY 발현이 없는 직장 NET 환자의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 나타낸다.
도 2e는 크로모그라닌 A 발현이 있는 직장 NET 환자와, 크로모그라닌 A 발현이 없는 직장 NET 환자의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 나타낸다.
도 3은 세로토닌, 소마토스타틴 및 펩타이드 YY(PYY) 발현 상태에 따른 직장 신경내분비종양(NET) 아형의 대표적인 이미지이다. A through C, PYY-expressing L-cell type NET. D through F, Serotonin-expressing enterochromaffin-cell type NET. G through I, Somatostatin-expressing D-cell type NET. J through L, Null-expression NETcase without any serotonin, somatostatin, or PYY expression. M through O, Mixed-expression NET case showing codominant immunoreactivity of somatostatin and PYY peptide hormones (serotonin immunolabeling, original magnification x 200 [A, D, G, J, and M]; somatostatin immunolabeling, original magnification x 200 [B, E, H, K, and N]; PYY immunolabeling, original magnification x 200 [C, F, I, L, and O])
도 4a는 세로토닌 및 소마토스타틴 공동 발현 직장 NET 조직의 면역화학염색 결과를 나타낸다.
도 4b는 소마토스타틴 및 PYY 공동 발현 공동 발현 직장 NET 조직의 면역화학염색 결과를 나타낸다.
도 5는 직장의 L-세포 NET(우세한 PYY 발현), EC-세포 NET(우세한 세로토닌 발현), D-세포 NET(우세한 소마토스타틴 발현), Null-expression NET(세로토닌, 소마토스타틴 또는 PYY 모두 비발현), mixed-expression NET('소마토스타틴 및 PYY 공동 발현' 및 '세로토닌 및 소마토스타틴 공동발현', 총 증례 4) 환자군의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 나타낸다.
도 6은 세로토닌 및 소마토스타틴 발현 여부를 달리하는 4개의 경우에 대하여, 각각의 대표적 직장 NET 조직 이미지를 나타내었다(+, 발현(양성); -, 비발현(음성)).
도 7a는 세로토닌 및 소마토스타틴을 모두 발현하는 직장 NET 환자군(Both), 소마토스타틴 단독 발현 환자, 세로토닌 단독 발현 환자, 세로토닌 및 소마토스타틴 발현이 모두 없는 직장 NET 환자(Neither)군의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 나타낸다.
도 7b는 도 7a의 결과 중, 소마토스타틴 단독 발현 환자 및 세로토닌 단독 발현 환자를 하나의 군으로 하여(Either), 이를 세로토닌 및 소마토스타틴을 모두 발현하는 직장 NET 환자군(Both) 및 세로토닌 및 소마토스타틴 발현이 모두 없는 직장 NET 환자(Neither)군의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 비교적으로 나타낸 것이다.
도 7c는 세로토닌, 소마토스타틴 및 크로모그라닌 A 3종 마커를 모두 발현하는 직장 NET 환자군(All), 상기 마커들 중 1 ~ 2개의 마커를 발현하는 직장 NET 환자군(One or two), 어떠한 마커도 검출되지 않은 직장 NET 환자군(None)의 DFS(Disease-free survival) 곡선을 비교적으로 나타낸 것이다.

정의

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 용어 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산(ex. mRNA)의 생성을 의미한다. 본 명세서에서 용어'발현 수준(expression level)'은 시료 내 목적 단백질 또는 핵산(ex. mRNA)의 존재 수준의 의미를 모두 포함한다.

본 발명에서 용어 '단백질'은 '폴리펩티드(polypeptide)'와 호환성 있게 사용될 수 있으며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 '세로토닌(serotonin)'단백질은, 당업계에 세로토닌 단백질 또는 폴리펩타이드로 공지된 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명에서 인간(homo sapiens) 유래의 세로토닌으로서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(NCBI(Genbank) Accession No. AGB76027 참조)일 수 있다. 본 발명에서 상기 세로토닌은 이의 기능적 동등물을 포함한다.

본 발명에서 '소마토스타틴(somatostatin)'단백질은, 당업계에 소마토스타틴 단백질 또는 폴리펩타이드로 공지된 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명에서 인간(homo sapiens) 유래의 소마토스타틴으로서 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(NCBI(Genbank) Accession No. AAH32625, KAI4033008, 또는 KAI2532932 참조)일 수 있다. 본 발명에서 상기 소마토스타틴은 이의 기능적 동등물을 포함한다.

본 발명에서 'PYY(peptide YY)'단백질은, 당업계에 PYY 단백질 또는 폴리펩타이드로 공지된 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명에서 인간(homo sapiens) 유래의 PYY 로서 서열번호 12, 서열번호13, 서열번호 14 또는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 12, 서열번호13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(NCBI(Genbank) Accession No. KAI2583331, KAI4049837, AAA36433, KAI2583330, KAI4049836, 또는 AAH41057 참조)일 수 있다. 본 발명에서 상기 PYY는 이의 기능적 동등물을 포함한다.

본 발명에서 '크로모그라닌 A(chromogranin A)'단백질은, 당업계에 크로모그라닌 A 단백질 또는 폴리펩타이드로 공지된 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명에서 인간(homo sapiens) 유래의 크로모그라닌 A로서 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(NCBI(Genbank) Accession No. KAI2572520, KAI4062145, AAA52017, KAI2572519, AAB53685, KAI4062144, 또는 AAA52018 참조)일 수 있다. 본 발명에서 상기 크로모그라닌 A는 이의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 기능적 동등물이란, 상기 각각의 단백질들을 구성하는 아미노산 서열(바람직한 일례로, 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호13, 서열번호 14, 서열번호 15; 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열)과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 모태가 된 상기 단백질들(바람직한 일례로, 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호13, 서열번호 14, 서열번호 15; 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25로 표시되는 폴리펩티드)과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서 '실질적으로 동질의 생리활성'이란, 직장 신경내분비종양의 예후 예측 마커로서 기능하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에서 상기 기능적 동등물은 모태가 된 상기 단백질들의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys,Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는, 모태가 된 상기 단백질들의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 모태가 된 상기 단백질들의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 모태가 된 상기 단백질들의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 모태가 된 상기 단백질들의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은, 원본 서열(아미노산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호13, 서열번호 14, 서열번호 15; 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25; 또는 핵산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후, 원본 서열에 대한 후보 서열의 동일 매칭 잔기(아민노산 잔기 또는 염기)의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한 단백질 서열 상동성 또는 동질성 판단의 경우에 있어서, 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

본 발명에서 용어 '핵산','DNA 서열','RNA 서열' 또는 '폴리뉴클레오티드'는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 발명에서 용어 '코딩' 또는 '암호화'는 천연 상태에서 또는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩티드 및/또는 그의 단편에 대한 mRNA를 제조하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있는 경우, 폴리펩티드를 '코딩' 또는 '암호화'한다고 언급되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본 발명에서 '세로토닌을 암호화하는 폴리뉴클레오티드'는 일례로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 세로토닌을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는, DNA, cDNA 및 RNA(일례로, mRNA) 등을 모두 포함하는 의미이다. 일례로 본 발명에서 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다(NCBI(Genbank) Accession No. AF498982, EU796424, EU796429, EU796434, JX682563 또는 AB037513 참조).

본 발명에서 '소마토스타틴을 암호화하는 폴리뉴클레오티드'는 일례로 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 소마토스타틴을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는, DNA, cDNA 및 RNA(일례로, mRNA) 등을 모두 포함하는 의미이다. 일례로 본 발명에서 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다(NCBI(Genbank) Accession No. BC032625, AY890707, AY893658, AY888125 또는 AY893194 참조).

본 발명에서 'PYY를 암호화하는 폴리뉴클레오티드'는 일례로 서열번호 12, 서열번호13, 서열번호 14 또는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 PYY를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12, 서열번호13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는, DNA, cDNA 및 RNA(일례로, mRNA) 등을 모두 포함하는 의미이다. 일례로 본 발명에서 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다(NCBI(Genbank) Accession No. D13897, D13902, D13899, BC041057 또는 L25648 참조).

본 발명에서 '크로모그라닌 A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드'는 일례로 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 크로모그라닌 A을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는, DNA, cDNA 및 RNA(일례로, mRNA) 등을 모두 포함하는 의미이다. 일례로 본 발명에서 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다(NCBI(Genbank) Accession No. J03483, J03915, NM_001301690, XM_005267292, XM_006725160, NM_001275, AH005196, U03742, U03743, U03744, U03745, U03746, U03747, U03748 또는 U03749 참조).

본 발명에서 상기 발현 목적 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈(codon)의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서 용어 "프라이머"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 프라이머와 관련하여 사용되는 용어 "실질적으로 상보적인 (substantially complementary)"은 소정의 어닐링 조건하에서 프라이머가 주형 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 어닐링된 프라이머는 중합효소에 의해 연장되어 주형의 상보체를 생성한다. 따라서, 상기 용어는 용어 "완전히 상보적인 (perfectly complementary)" 또는 이와 관련된 용어와 다른 의미를 갖는다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적(실질적으로 상보적)이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응 (ligase chainreaction : LCR)에서는 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 표적 핵산의 서열을 가지고, 상보적 염기쌍에 의해 이중 구조를 형성하는, 통상적으로 표지화된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 표적 서열의 지역에 해당하는, 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드 및 일부 경우에, 50개 이상 뉴클레오티드로 이루어진 "혼성화 지역"을 포함할 것이다. "상응하는"은 지정된 핵산과 동일하거나 상보적인 것을 의미한다. 프로브는, 바람직하게는, PCR을 준비하는데 사용된 서열(들)에 상보적인 서열을 함유하지 않을 수 있다. 일반적으로, 프로브의 3' 말단은 프라이머 신장 생성물 속으로 프로브의 일체화를 억제하도록 "차단될" 것이다. "차단"은 비-상보적 염기를 사용하거나 비오틴, 인산염기 또는 형광체와 같은 화학적 모이어티를 선택된 모이어티에 따라, 표지에 부착된 핵산의 후속 탐지 또는 포획을 위한 표지로서 작용함으로써 이중 목적을 만족시킬 수 있는 염기 뉴클레오티드의 3' 하이드록실에 첨가함으로써, 얻을 수 있다. 차단은 3'-OH를 제거하거나 다이데옥시뉴클레오티드와 같은 3'-OH가 없는 뉴클레오티드를 사용함으로써 성취될 수 있다.

본 발명의 프로브 또는 프라이머는, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 '(항) 세로토닌 항체' 또는 '세로토닌에 대한 항체(세로토닌에 특이적인 항체)'는 세로토닌의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 세로토닌 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직할 수 있다. 본 발명에서 '소마토스타틴 항체','PYY 항체' 또는 '크로모그라닌 A 항체'가 언급 또는 지시될 때, 상기 '세로토닌 항체'에 관한 설명에 준하여 그 의미가 당업자에게 자명히 이해된다.

상기한 바와 같은 세로토닌, 소마토스타틴, PYY 또는 크로모그라닌 A에 대한 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 세로토닌, 소마토스타틴, PYY 또는/및 크로모그라닌 A 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method), 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

또한 본 발명에서 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 바람직하게 상기 단편은 모(母)항체의 세로토닌, 소마토스타틴, PYY 또는 크로모그라닌 A 결합 친화도의 적어도 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.

본 발명에 적용되는 항체는 이에 제한되지 않으나 일례로 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다.

본 발명에서 단백질 발현수준의 측정은, 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 일례로 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 유전자 발현수준의 측정은, 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있다. 구체적 일 실시 양태에서 유전자 발현수준의 측정은, 상기 유전자의 mRNA의 발현수준 측정을 통해 수행되는 것일 수 있다. 이때 유전자의 mRNA 발현수준 측정은 당업계에 공지된 방법이라면 제한b이 사용될 수 있으며, 일례로 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), 형광 인 시투 하이브리드화(FISH), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 가 직장 NET(neuroendocrine tumor)에 대한 예후 예측용 바이오 마커로서 기능함을 최초로 규명하였으며, 특히 본 발명에 따라 이들을 이용하여 직장 NET의 아형을 분류하고 이에 따른 환자의 예후를 예측하면 직장 NET 환자의 생존(무질병 생존 또는 무재발 생존) 예후를 보다 신뢰성 있게 효과적으로 예측하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라 상기 마커들을 조합하는 경우에 직장 NET 환자의 불량한 예후(고위험군) 예측에 있어서 상승효과(시너지 효과)가 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은, 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시 양태엥서, 본 발명의 상기 마커 조성물은 추가로 크로모그라닌 A(chromogranin A) 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 세로토닌, 소마토스타틴, PYY 및 크로모그라닌 A는 마커 단백질 또는 마커 유전자 등의 용어로 통칭될 수 있다.

구체적으로 본 발명은, 세로토닌(serotonin), 소마토스타틴(somatostatin), PYY(peptide YY) 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물은, 추가로 크로모그라닌 A(chromogranin A) 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, 당업계에 공지된 수단이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 상기 단백질(하나 또는 2 이상의 단백질)에 특이적인(특이적으로 결합하는) 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는, 이에 제한되지 않으나 상기 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제일 수 있다. 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제는, 당업계에 공지된 수단이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 상기 유전자(하나 또는 2 이상의 유전자)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 측정 제제들은 주어진 조건에서 이의 확인, 검출, 측정 및 정량을 용이하게 하기 위하여 검출가능한 표지(detectable label)로 표지 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, 알파-글루쿠로니다제(glucuronidase), 알파-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³²P 및 ³⁵S), 형광 표지(예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학 발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다. 유사하게, 상기 검출가능한 그룹은 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다.

상기 측정 제제의 확인, 검출, 측정 및 정량은 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

또한 본 발명은, 전술한 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물을 포함하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 본 발명의 키트의 종류는, 전술한 공지의 단백질 발현수준 측정 방법 또는 유전자(mRNA) 발현수준 측정방법에 사용되는 키트라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 일례로 상기 키트는 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 상기 본 발명의 키트는, 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제와 별도로 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 전술한 표지, 이의 검출에 사용되는 물질, 및 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일 양태로서, 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, 추가로 크로모그라닌 A(chromogranin A) 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준 측정을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 '예후(prognosis)'는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부, 재발여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측 (또는 예후의 진단)은 암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 바람직하게는 본 발명에서 상기 예후란 직장 신경내분비종양 환자의 원발성 종양 제거 수술 후 생존 예후 또는 재발 여부에 대한 예후를 의미하는 것일 수 있고, 상기 생존은 무질병 생존율(disease-free survival rate) 또는 무재발 생존율(recurrence-free survival rate)를 의미하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 '고위험군'은, 불량한 예후를 나타내는 환자(피검체)군을 의미하는 것으로, 구체적으로 종양(암) 절제 수술 후 생존율이 낮거나 또는/및 재발 가능성이 높은 것으로 예측되는 환자(피검체)군을 의미한다.

본 명세서에서 용어 '저위험군'은, 좋은 예후를 나타내는 환자(피검체)군을 의미하는 것으로, 구체적으로 종양(암) 절제 수술 후 생존율이 높거나 또는/및 재발 가능성이 낮은 것으로 예측되는 환자(피검체)군을 의미한다.

본 명세서에서 용어 '중간위험군'은, 상기 고위험군보다는 불량한 예후를 나타낼 가능성이 낮지만 여전히 좋은 예후를 담보할 수 없는 것으로 예측되는 환자(피검체)군을 의미한다.

본 발명의 바람직한 일 실시앙태에서, 상기 예후 예측은 환자의 무질병 생존 또는 재발 여부를 예측하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 '시료'란 측정하고자 하는 목적 정보가 포함되어 있는 분석 대상물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 특정 질병(본 발명에서는 직장 NET)이 있는 것으로 의심되거나 이의 존재가 확정된 개체(피험자 또는 환자)의 검체로부터 수득되는 것 일 수 있다. 상기 목적 정보는, 본 발명에서 마커의 발현 여부 또는/및 발현 수준(발현량)을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 시료는 검체 자체일 수 있고, 또는 상기 검체에 분쇄, 추출, 정제 등의 임의의 처리를 가한 가공물 일 수 있다. 상 기 검체란 검사에 필요한 재료를 의미하는 것으로, 기관, 조직 또는 세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 상기 생물학적 시료는, 환자로부터 분리된 직장 신경내분비종양 조직(직장신경내분비 종양 세포를 포함하는 의미) 및 체액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 상기 체액은 바람직하게 복수, 흉수, 타액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 시료(특히, 생물학적 시료)는, 구체적으로 대상체로부터 분리된 신선 검체(fresh tissue), 생검 검체(biopsy), 절단 검체(excision), 내시경 절제 검체(endoscopic resection procedure; 일례로 내시경적 점막 절제술(EMR) 또는 내시경 점막밑 절제술(ESD) 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 시료는 1개의 피험자로부터 수득되는 시료가 다수개의 절편 시료(슬라이드 시료)로 나누어져 관찰될 수 있다.

본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 직장 NET 환자의 암 조직일 수 있다. 구체적 일 실시 양태에서, 상기 시료는 원발성 종양 제거 수술을 통해 환자로부터 분리된 직장 NET 종양 조직일 수 있다. 상기 종양 조직에는 일부 정상 세포도 포함되어 있을 수 있으며, 바람직하게는 환자의 암세포를 포함하는 조직의 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed paraffin-embedded, FFPE) 처리된 시료일 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, 추가로 상기 측정된 발현수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 '대조군'은, 바람직하게 직장 신경내분비종양이 없는 대조군(바람직한 일례로, 직장 신경내분비종양이 없는 직장 조직(정상 직장 조직))을 의미한다.

피검체로부터 분리된 시료에서 측정된 세로토닌, 소마토스타틴, PYY, 또는 추가로 크로모그라닌 A의 발현수준을 대조군과 비교하여, 상기 대조군에 비해 세로토닌, 소마토스타틴 PYY, 또는/및 추가로 크로모그라닌 A의 수준이 증가되어 있는 것을 '고발현' 또는 '양성'이라고 판정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에서 상기 '양성' 판정은, 어떤 마커가 시료(ex. 조직) 내 전체적으로(ex. 면적 기준 등) 발현 또는 검출되는 것을 100%으로 할 경우를 기준으로(이하 동일), 상기 마커의 검출 면적 비율이 5% 이상인 경우(즉, 5% 이상 내지 100% 이하인 경우)에 이를 양성으로 판정하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 '단독 발현(검출)'은 당업자가 볼 때 '실질적으로 단독 발현(검출)'되는 것으로 보이는 양상을 의미하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시 양태에서 1개의 마커 검출 면적의 비율이 5% 이상인 것(즉, 5% 이상 내지 100% 이하인 것)으로 검출된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 하나의 마커의 양성 발현이 현저히 우세한(dominant) 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 '공동 발현(검출)'은 당업자가 볼 때 '실질적으로 공동 발현(검출)'되는 것으로 보이는 양상을 의미하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 상기 '공동 발현(검출)'은 2 이상의 복수 개의 마커가 각각 검출 면적의 비율이 5% 이상인 것(즉, 5% 이상 내지 100% 이하인 것)으로 검출된 것일 수 있고, 더욱 바람직한 실시양태에서 상기 '공동 발현(검출)'은 2이상의 마커의 양성 발현이 당업자가 실질적으로 우열(크고 작음)을 가리기 힘든 동등한 수준으로 상호 우세한(dominant) 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은,

상기 대조군과 비교하여,

PPY 단독 발현은 L-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류하고, 세로토닌 단독 발현은 EC-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류하며, 소마토스타틴 단독 발현은 D-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

이의 구체적 일 실시양태에서, 상기 D-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류된 피검체는 고위험군으로 분류하고, 상기 EC-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류된 피검체는 중간위험군으로 분류하며, 상기 L-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류된 피검체는 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 바람직한 다른 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, PPY, 세로토닌 및 소마토스타틴이 모두 검출되지 않은 피검체는 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법은, 하기 (i) 또는 (ii)의 조합에 대해 이들의 단백질, 또는 이들을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다:

(i) 세로토닌 및 소마토스타틴; 또는

(ii) 세로토닌, 소마토스타틴 및 크로모그라닌 A.

대조군과 비교하여 세로토닌 및 소마토스타틴이 공동 발현; 또는

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험방법]

1. 시료 준비

이 연구는 기관생명윤리위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았다(승인 번호: 2014-0580). 2006년 ~ 2015년 사이에 내시경 또는 수술로 절제된 직장 신경내분비종양(NET) 증례 중, 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 블록이 있는 잘 분화된 grade 1 및 grade 2 직장 NET 증례 446례를 선택했다. 전자의무기록 검토를 통해 얻은 데이터는, 연령, 성별, 치료에 필요한 절차, 생존결과 등을 포함하였다.

2. 병리학적 평가

수술 병리 보고서에서 얻은 데이터에는, 종양의 1차 진단, 위치 및 크기가 포함되었다. 모든 H&E(hematoxylin & eosin) 염색 슬라이드를 검토하였고, 침윤 깊이, 림프혈관 및 신경주위 침윤, 절제연 상태(resection marginal status), 결절 전이 및 원격 전이를 포함한 병리학적 특징을 재평가하였다. 침윤 깊이는 AJCC(American Joint Committee on Cancer) cancer staging scheme 8판에 따라 평가되었다(Amin MB ES, Greene F, Byrd DR, Brookland RK, Washington MK, Gershenwald JE, Compton CC, Hess KR, et al. AJCC Cancer Staging Manual (8th edition). American Joint Commission on Cancer: Springer International Publishing; 2017.). 종양 등급은 2019 WHO classification system scheme에 따라, 총 10개의 고배율 2 mm² 필드 내에서 필드당 유사분열 수(mitotic counts per field in a total of 10 high-powered fields) 및 Ki-67 라벨링 인덱스를 기준으로 분류되었다(Board WCoTE. Digestive System Tumours. WHO Classification of Tumours- 5th edition. 1 vol. 5th ed. Lyon (France): International Agency for Research on Cancer: IRAC Publications; 2019).

3. 조직 마이크로어레이(microarray) 구축 및 면역조직화학염색(immunohistochemistry)

조직 마이크로어레이(TMA)는 manual tissue microarrayer(Uni TMA Co. Ltd, Seoul, Korea)를 사용하여, 보관된 FFPE 조직 블록으로부터 구축되었다. 각 종양 FFPE 블록으로부터 단일 대표 조직의 중심을 2.0 mm 직경으로 펀칭(punching)한 것을, 수용블록(recipient block) 내에 병렬로 옮겼다. 면역조직화학염색은, 상기 TMA 블록들로부터 4 μm 두께의 연속 조직 절편에서 수행되었다. 조직 절편을 탈파라핀화하고, 자일렌 및 일련의 서로 다른 농도의 에탄올 수용액에 순차적으로 침지하여 수화시켰다. 내인성 과산화효소는 조직을 3% H₂O₂에서 10분 동안 배양하여 차단되었으며, 그 후 열 유도된 항원 회수(heat-induced antigen retrieval)가 이루어졌다.

염색 절차는 Optview DAB IHC Detection Kit(Ventana Medical Systems)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여, 자동화된 면역염색기(Benchmark XT; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA)에서 수행되었다. 조직 절편을 insulin(1:100, 2D11-H5; Novocastra, New Castle, UK), glucagon(1:400, 295A-15; Cell Marque, Rocklin, CA), serotonin(1:200, 5HTH209; DAKO, Glostrup, Denmark), somatostatin(1:4000, A0566; DAKO), gastrin(prediluted, A0568; DAKO), PYY(1:1000; rabbit, polyclonal, ab131246, Abcam, Cambridge, United Kingdom), synaptophysin(rabbit, dilution 1:200, MRQ-40; Cell Marque), chromogranin A(mouse, dilution 1:1600, DAK-A3; DAKO), 및 Ki-67(1 mouse, dilution 1:200, MIB1; DAKO)에 대한 각각의 일차항체와 함께 실온에서 32분간 인큐베이션 하였다. 헤마톡실린으로 가벼운 대조염색을 수행한 후, 면역염색된 절편을 일련의 농도의 에탄올 및 자일렌을 이용해 연속적으로 탈수하고, 마운팅(mounting)하였다. 면역조직화학적 발현(immunohistochemical expression)은 대상 시료 환자의 임상병리학적 정보에 대해 사전 정보가 없는 2명의 병리학자(JSK 및 SMH)에 의해 평가되었다.

시냅토피신, 크로모그라닌 A 및 6가지 펩타이드 호르몬(insulin, glucagon, serotonin, somatostatin, gastrin 및 PYY)에 대한 면역염색 결과는, 마커가 염색(검출, cytoplasmic staining)된 종양 세포가 차지하는 면적의 비율에 따라, 다음의 4가지 범주로 등급이 매겨졌다: 발현없음(no; ≤1%), 점상(spotty; >1% 및 <5%), 국소성(focal; 5% ~ 50%) 또는 확산성(diffuse; >50%) 표현. 이전 연구(Kim J, Kim JY, Oh EH et al. Chromogranin A Expression in Rectal Neuroendocrine Tumors Is Associated With More Aggressive Clinical Behavior and a Poorer Prognosis. Am J Surg Pathol. 2020;44(11):1496-1505.)에서처럼 Synaptophysin 및 chromogranin A는 국소성 또는 확산성 발현을 나타내는 경우(즉, 마커 염색 면적의 비율이 5% 이상인 경우) 이들 마커에 대해 양성으로 분류되었다. 펩타이드 호르몬의 경우에도, 염색 결과가 마커 염색 면적의 비율이 5% 이상인 경우 이들 마커에 대해 양성으로 분류되었다. 별다른 언급이 없는 한, '공동 발현(검출)'은 2 이상의 마커의 양성 발현이 실질적으로 우열(크고 작음)을 가리기 힘든 동등한 수준으로 상호 우세할(dominant) 경우에 '공동 발현(검출)'로 판단하였다.

4. 결과 측정(Outcome measures)

DFS(Disease-free survival, 무재발 생존)는 종양 절제부터 국소부위 재발까지의 기간으로 정의되었으며, 일차적 성과(primary outcome) 지표로 사용되었다. 동시성 원격전이(synchronous distant metastasis)가 있었던 2개의 증례는 생존 분석에서 제외되었다. 직장 신경내분비종양 환자 추적에 대한 엄격한 프로토콜은 적용되지 않았지만, 모든 환자는 종양 특성에 따라, 3 ~ 12개월마다 대장내시경, 컴퓨터 단층촬영 유무에 관계없이 S상 결장경검사, 자기공명영상촬영 또는 ⁶⁸Ga-DOTATOC 양전자방출단층촬영을 주기적으로 평가하였다. 국소 재발은, 이전 절제 부위(prior resection site), 직장 내강(rectal lumen) 또는 국소 림프절(regional lymph nodes)의 종양층(tumor bed)에서 NET 재출현의 조직학적 확인으로 정의되었다.

5. 통계적 분석(Statistical analysis)

연속변수(continuous variable)의 비교를 위해, independent two-sample t-test 또는 Mann-Whitney U test를 사용했다. 범주형 변수(categorical variable)의 비교를 위해, chi-square test 또는 Fisher's exact test 를 사용하였다. 생존 곡선은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 플롯팅(plotting)되었고, log-rank test를 사용하여 비교되었다. DFS(Disease-free survival)와 관련된 임상병리학적 인자를 확인하기 위해, Univariable Cox regression analysis 를 수행하였다.

Multivariable Cox regression analysis 는 독립적인 예후 유의성을 평가하기 위해 수행되었다. 모든 통계 테스트는, SPSS, version 21.0(IBM Corp., Armonk, NY, USA) 및 R software version 4.0.3(R Foundation, Vienna, Austria)을 사용하여 수행되었다. 통계적 유의성은 양측 P-값 <0.05로 설정되었다.

실시예 1. 직장 신경내분비종양(rectal NET, 직장 NET) 환자의 기본 특성

직장 NET을 가진 환자의 임상병리학적 특징을 표 1에 요약하여 나타내었다. 평균 환자 연령은 48.4±11.9세(범위, 19-80세)였으며, 남:녀 비율은 1: 1.4였다. 395 례(88.6%; 395/446)은 NET grade 1, 51 례(11.4%; 51/446)는 NET grade 2였다. 3등급은 포함되지 않았다. 평균 종양 크기는 0.6±0.4 cm였다. 종양 크기를 기준으로 이분화한 경우, 1cm 이하 크기가 407 례(91.3%; 407/446)로 확인되었고, 1초과 크기가 39/446 례(8.7%; 39/446)로 확인되었다. AJCC cancer staging system 8판의 T category에 따르면, 434 례(97.3%; 434/446)가 pT1, 8 례(1.8%; 8/446)가 pT2, 2 례(0.5%; 2/446)가 pT3, 2 례(0.4%; 2/446)가 pT4였다. 림프혈관 침윤 및 신경주위 침윤은, 각각 20 례(4.5%; 20/446) 및 7 례(1.6%; 7/446)에서 확인되었다. 절제연(resection margin)의 침범은, 62 례(13.9%; 62/446)에서 관찰되었다. 결절 전이는 6 례(1.3%; 6/446)에서 확인되었고, 동시성 원격전이는 2 례(0.4%; 2/446)에서 확인되었다. 내시경 절제술은 401 례(89.9%; 401/446), 항문경 절제술(transanal excision)과 근치적 수술(radical surgery)을 포함한 외과적 절제술은 45 례(10.1%; 45/446)에서 수행된 것으로 확인되었다. 생존 분석에 포함된 환자의 추적관찰 기간 중앙값(median follow-up period)은 50.7개월(범위 1 - 143.4개월)이었다.

실시예 2. Synaptophysin 및 chromogranin A 발현

chromogranin A에 대한 면역조직화학적 발현은 57 례(12.8%; 57/446)에서 확인되었다. 대조적으로, synaptophysin 발현은 확산 발현 패턴으로 446 례의 모든 직장 NET(100%)에서 검출되었다.

실시예 3. 직장 NET 환자의 펩타이드 호르몬 발현과 임상병리학적 상관관계 분석

도 1은 직장 NET에서의 각 펩타이드 호르몬(PYY, insulin, glucagon, serotonin, somatostatin, and gastrin)의 면역조직화학적 발현을 보여주는 대표적인 이미지이다. 면역표지화 결과는 각각 PYY 261 례(67.1%; 261/389), 글루카곤 205 례(46.0%; 205/446), 세로토닌 36 례(8.1%; 36/446), 소마토스타틴 33 례(7.4%; 33/446), 인슐린 2 례(0.4%; 2/446), 가스트린 1/446(0.2%; 1/446)으로 발견되었다. 전반적으로, 직장 NET의 345 례(77.4%; 345/446)는 펩타이드 호르몬에 대한 면역반응성을 나타내었다.

각 펩타이드 호르몬의 발현상태와 임상병리학적 인자의 연관성을 비교하여 표 1에 나타내었다. 글루카곤의 발현은 젊은 연령(≤50세, P=0.005), 고유 근육 침윤 결여(P=0.02), 절제연(resection margin)이 명확하거나 불확실한 종양(P=0.04)과 관련이 있었다. 세로토닌 발현은 남성(P=0.03), 림프혈관 침윤(P=0.003) 및 신경주위 침윤(P=0.01)이 있는 종양과 관련이 있었다. 소마토스타틴 발현은 림프혈관 침윤과 관련이 있었다(P=0.01). PYY 발현은 grade 1 (P=0.04), 작은 종양 크기(≤1 cm; P=0.02), 고유 근육 침윤 결여(P=0.005), 림프혈관 침윤 없음(P=0.001) 및 신경주위 침윤 없음(P<0.001)과 관계있었다. 크로모그라닌 A 발현은, 세로토닌 및 소마토스타틴 발현과 유의한 관련이 있었다(모두 P<0.001).

대조적으로, 크로모그라닌 A 발현은 글루카곤 발현의 결여(P=0.02) 및 PYY 발현 결여(P<0.001)와 관련이 있었다.

인슐린 또는 가스트린 발현과 임상병리학적 인자 사이의 연관성은 인슐린(2 례) 및 가스트린(1 례) 발현의 적은 수(례)로 인해 평가되지 않았다.

실시예 4. 펩타이드 호르몬의 발현 상태에 따른 DFS(Disease-free survival) 분석 결과

직장 NET 전체 환자들의, 전체 10년 DFS(overall 10-year DFS)는 97.6%였다.

소마토스타틴 발현이 있는 직장 NET 환자(10-year DFS=76.0%)는, 소마토스타틴 발현이 없는 환자보다 더 나쁜 DFS를 나타냈다(99.1%, log-rank test, P<0.001; hazard ratio [HR], 21.158; 95% CI, 4.719-94.857; Cox regression, P<0.001; 도 2a 및 표 2 참조).

세로토닌 발현이 있는 직장 NET 환자(10-year DFS, 89.1%)는, 세로토닌 발현이 없는 환자보다 더 나쁜 DFS를 나타냈다(98.3%, log-rank test, P<0.001; HR, 9.472; 95% CI, 2.118-42.360; Cox regression, P=0.003; 도 2b 및 표 2 참조).

PYY 발현이 있는 직장 NET 환자(10-year DFS, 99.5%)는, PYY 발현이 없는 환자보다 더 좋은 DFS를 나타냈다 (92.4%; log-rank test, P= 0.002; HR, 0.078; 95% CI, 0.009-0.645; Cox regression, P=0.02; 도 2d 및 표 2 참조).

그러나, 글루카곤 발현 상태에 따른 생존 차이는 없었다(도 2c 및 표 2 참조).

인슐린 발현(2 례) 또는 가스트린 발현(1 례)이 있는 경우는 매우 적었기 때문에, 인슐린 또는 가스트린 발현 상태에 따른 생존 분석은 수행하지 않았다.

한편, 크로모그라닌 A 발현이 있는 직장 NET 환자(10-year DFS, 92.9 %)는, 크로모그라닌 A 발현이 없는 환자보다 더 나쁜 DFS를 보였다(98.3%, log rank test, P=0.01; HR, 5.555; 95% CI, 1.243-24.820; Cox regression, P=0.02, 도 2e 및 표 2 참조).

실시예 5. 직장 NET에서, 다른 임상 병리학적 요인의 단변수 생존 분석(univariable survival analysis)

DFS에 대한, 다른 임상병리학적 요인의 영향은 표 2에 나타낸 바와 같다. 나쁜 DFS 예후와 관련된 요인은, grade 2(HR=9.877; 95 % CI=2.209-44.171; P=0.003), 고유 근육 침윤(HR=13.305, 95 % CI=2.575-68.739; P=0.002), 림프혈관 침윤(HR=8.490; 95 % CI=1.641-43.920; P=0.01), 신경 주위 침윤(HR=11.559, 95 % CI=1.387-96.310; P=0.02), 림프절 전이(HR=10.340; 95 % CI=1.243-86.002; P=0.03) 및 수술적 절제(HR=21.680; 95 % CI=4.203-111.825; P<0.001) 였다.

실시예 6. 직장 NET 환자의 DFS(무질병 생존) 결과와 관련된 요인: 다변수 생존 분석(multivariable survival analysis)

단변수 Cox 회귀분석(실시예 5)을 통해 세로토닌, 소마토스타틴 및 PYY가 생존에 대해 유의성을 가지는 변수임이 확인되었기 때문에, 이들은 multivariable Cox analysis에 개별 변수로서 통합되었다. 단변수 Cox 회귀분석(univariable Cox regression)에서 유의성을 보인 임상병리학적 요인들은, 다변수 Cox 회귀분석(multivariable Cox regression analysis)에 보정되었다(adjusted).

직장 NET에서 소마토스타틴 발현(HR, 137.568; 95% CI, 7.891-999.999; P=0.001)은 DFS에 대한 독립적인 불량한 예후 지표였다(표 3 참조). 다변수 생존 분석에서, 직장 NET에 대한 외과적 절제의 필요성(HR, 94.150; 95% CI, 3.903-999.999; P=0.005)은 나쁜 DFS 예후와 관련이 있었다.

실시예 7. 펩타이드 호르몬 발현 상태에 따른 직장 NET 아형(subtype) 분석

위에서 밝힌 것과 같이, 소마토스타틴 발현이 직장 NET의 예후 예측에 있어서 독립적인 인자로서 유의성을 지닌다는 사실에 기반하여, L-세포 NET 및 EC- 세포 NET과 별도로, 우세한 소마토스타틴 발현을 나타내는 경우를 D-세포 NET으로 분류했다.

따라서 본 발명에서는 직장 NET의 분류에 대하여 PYY, 세로토닌 및 소마토스타틴 발현 상태를 기반으로 하는 L-세포, EC-세포 및 D-세포 아형(subtype, 하위유형)이 포함되었다.

구체적으로 우세한(dominant) PYY 발현을 나타내는 NET은 'L-세포 NET'으로 분류되었다(도 3, A~C). 우세한 세로토닌 발현을 나타내는 NET은 'EC-세포 NET' 으로 분류되었다(도 3, D~F). 우세한 소마토스타틴 발현을 나타내는 NET은 'D-세포 NET'으로 분류되었다(도 3, G~I). 세로토닌, 소마토스타틴 또는 PYY 모두에 대한 면역반응성이 없는 NET은, 'Null-expression NET'으로 분류되었다(도 3, J~L). 세로토닌, 소마토스타틴 및 PYY 중 공동 발현을 나타내는 NET은 'Mixed-expression NET'으로 분류되었다(도 3, M~O). 우리는 세로토닌 및 소마토스타틴의 공동 발현 직장 NET 1 례(도 4a), 소마토스타틴 및 PYY 발현 공동 발현 직장 NET 3 례(도 4b)를 관찰하였고, 또한 dual immunohistochemical staining 으로, 2개의 펩타이드 호르몬의 혼합 발현 패턴을 확인했다. '세로토닌 및 소마토스타틴 공동발현', 그리고 '소마토스타틴 및 PYY 공동 발현'을 보이는 경우를 혼합-발현 NET(Mixed-expression NET)로 분류하였다.

L-세포 NET은 258 례(57.8%; 258/390), EC-세포 NET은 24 례(5.4%; 24/390), D-세포 NET은 9 례(2.0%; 9/390)로 확인되었다. Null-expression NET 은 95례(21.3%; 95/390), mixed-expression NET은 4 례(0.9%; 4/390)로 확인되었다.

직장 NET 아형과 임상병리학적 요인들 간의 연관성은 표 4에 나타내었다. L-세포 NET은 더 작은 종양 크기(≤1cm, P=0.04), 고유근육 부재(P=0.005), 림프혈관 침습(P<0.001), 신경주위 침습(P=0.003), 크로모그라닌 A 발현 부재(P<0.001, 표 4)와 관련이 있었다.

대조적으로, EC-세포 NET은 더 큰 종양 크기(> 1cm)(P=0.04), 고유 근육(P=0.005), 림프혈관 침윤(P<0.001), 신경주위 침윤(P=0.003), 및 크로모그라닌 A 발현(P<0.001, 표 4)과 관련이 있었다.

D-세포 NET은 림프혈관 침윤(P<0.001) 및 크로모그라닌 A 발현(P<0.001; 표 4) 과 관련이 있었다.

Null-expression NET은 림프혈관 침윤의 부재(P<0.001) 및 크로모그라닌 A 발현의 부재(P<0.001, 표 4)와 연관되었다.

Mixed-expression NET 은 림프혈관 침윤과 관련이 있었다(P<0.001; 표 4).

실시예 8. 펩타이드 호르몬 발현 상태에 따른 직장 NET 아형(subtype)과 DFS 결과 간의 상관관계 분석

본 실시예에서 DFS 결과는 NET 아형에 따라 분석되었다. D-cell NET 환자는 가장 나쁜 DFS rate(10-year DFS, 54.5%)을 보였으며, 다음으로 EC-cell NET(89.5%), null-expression NET(97.0%), L-cell NET(99.6%), Mixed-expression NET(100%; P<0.001; 도 5) 순서로 그 뒤를 이었다. 혼합-발현 NET(Mixed-expression NET)의 경우 증례가 매우 작아, 통계적인 의미는 없었으며, 예후가 좋다고 보기 어려웠다.

쌍별 비교 결과, EC-cell NET(Bonferroni corrected log-rank test, P=0.004) 및 D-cell NET(P<0.001)을 가진 환자가 L-cell NET 환자보다 더 나쁜 DFS를 보였다(도 5). 유사하게, D-cell NET 환자는 null-expression NET 환자보다 더 나쁜 DFS를 보였다(P=0.01, 도 5). 그러나, 나머지 아형들 간에(L-cell versus null expression, L-cell versus mixed expression, EC-cell versus D-cell expression, EC-cell versus null-expression, EC-cell versus mixed-expression, D-cell versus mixed expression, and null-expression versus mixed-expression (all, P>0.99; 도 5)) DFS에는 차이가 없었다.

실시예 9. 다른 마커 조합에 따른 DFS 결과 간의 관계 분석

9-1. 세로토닌 및 소마토스타틴의 2종 마커 조합

이에 이하에서는, '세로토닌 및 소마토스타틴'의 2종 마커 조합에 대한 생존(DFS) 예후 결과를 분석하였다. 세로토닌과 소마토스타틴이 모두 발현된 12 례의 직장 NET 조직을 대상으로, 세로토닌 및 소마토스타틴에 대한 면역조직화학염색을 추가로 시행하였다. 세로토닌 및 소마토스타틴에 대한 면역표지(immunolabeling)는 한 경우를 제외하고 모두 별도의 세포에서 발생했다.

세로토닌 또는 소마토스타틴 발현이 있는 직장 NET 환자는, 이를 발현하지 않는 환자에 비해 DFS가 더 나빴으므로, 세로토닌과 소마토스타틴의 조합된 발현 상태를 기반으로 하는 하위 그룹 분석을 수행했다. 도 6에 세로토닌 및 소마토스타틴 발현 여부를 달리하는 4개의 경우에 대하여, 각각의 대표적 직장 NET 조직 이미지를 나타내었다.

세로토닌 및 소마토스타틴 발현이 모두 없는 직장NET 그룹(도 6, A-B)은 370례(83.0%; 370/446)였으며, 소마토스타틴만 발현하는 직장NET 그룹(도 6, C-D)은 34례(7.6%; 34/446), 세로토닌만 발현하는 직장NET 그룹(도 6, E-F)은 30 례(6.7%; 30/446), 세로토닌 및 소마토스타틴 모두 발현하는 직장NET 그룹(도 6, G-H)은 12례(2.7%; 12/446)에 존재했다(각각 표 5 및 표 6참조).

세로토닌 발현 및/또는 소마토스타틴 발현은 림프혈관 및 신경주위 침윤과 관련이 있었다(각각 P=0.004 및 P=0.04; 표 5 및 표 6 참조). 세로토닌 단독 발현, 그리고 세로토닌 및 소마토스타틴 조합의 발현은, 크로모그라닌 A 발현과 관련이 있었다(P<0.001; 표 5 및 표 6 참조).

도 7a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세로토닌 및 소마토스타틴을 모두 발현하는 직장 NET 환자는, 최악의 DFS 비율(10-year DFS, 78.4%)을 보였고, 그 뒤로 소마토스타틴 단독 발현 환자(85.9%), 세로토닌 단독 발현 환자(95.1%)가 그 뒤를 이었다. 세로토닌 및 소마토스타틴 발현이 모두 없는 직장 NET 환자는 최고의 생존율 즉, DFS 비율(99.3%)을 나타냈다(P<0.001; 도 7a). 쌍별 비교에 따르면, 소마토스타틴 단독 발현 직장 NET 환자군, 그리고 세로토닌 및 소마토스타틴을 모두 발현하는 직장 NET 환자군은, 세로토닌 및 소마토스타틴 발현이 모두 없는 환자보다 더 나쁜 DFS를 나타냈다(Bonferroni-corrected P=.005 and <.001, respectively; 도 7a).

다중 펩타이드 호르몬의 발현이, 나쁜 DFS결과에 대해, 서로 상승적인 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 유해한 예후인자인 세로토닌 및 소마토스타틴 중 양성 마커 수와 DFS 사이의 연관성을 분석하여 이들의 상승 효과를 확인했다.

발현된 펩타이드 호르몬의 수가 많을수록 DFS 비율이 나쁜 것을 확인하였다(P<0.001; 도 7b). 세로토닌 또는 소마토스타틴 단독 발현이 있는 직장 NET환자(10-year DFS, 90.5 %)는, 세로토닌 및 소마토스타틴 발현이 모두 없는 환자 보다 유의하게 더 나쁜 DFS를 보였다(99.3%; Bonferroni-corrected log-rank, P=0.005; HR=10.413; 95% CI=1.739-62.337; P=0.01; 도 7b). 세로토닌과 소마토스타틴 발현이 모두 있는 직장 NET 환자(78.4%)는, 세로토닌과 소마토스타틴 발현이 모두 없는 환자 보다 더 나쁜 DFS를 보였다(99.3%; Bonferroni-corrected log-rank P<0.001; HR=39.065; 95% CI=5.469-279.064; P<0.001; 도 7b, 표 5).

9-2. 세로토닌, 소마토스타틴 및 크로모그라닌 A의 3종 마커 조합

직장 NET 환자의 나쁜 DFS예후에 대해, 세로토닌 및 소마토스타틴과 크로모그라닌 A의 상승 효과를 확인하였다. 이에, 세로토닌, 소마토스타틴 및 크로모그라닌 A 중 양성 마커 수와 DFS 사이의 연관성을 분석했다. 본 실시예에서는, 마커의 양성 발현의 우열(크고 작음)을 가리지 않고, 세로토닌, 소마토스타틴 또는/및 크로모그라닌 A에 대하여 이들 중 복수 개 마커의 검출 비율(염색 면적 비율)이 5% 이상인 경우에는 모두 '공동 발현(검출)'으로 판단하였다(즉, 우열을 가리지 않고 5% 이상인 것이 몇 개 마커인지만 판단함).

도 7c에 나타낸 바와 같이, 양성 마커 수가 많은 그룹은 DFS 비율이 더 나빴다(P<0.001; 도 7c 참조). 상기 3개의 마커를 모두 발현하는 직장 NET 환자군(76.2%; Bonferroni-corrected log-rank P<0.001; HR=7.156; 95% CI=1.196-42.833; P=0.03)과 상기 마커들 중 1 ~ 2개의 마커를 발현하는 직장 NET 환자군(93.1%; Bonferroni-corrected log-rank P=0.04; HR=38.952; 95% CI=5.458-278.005; P<0.001)은, 어떠한 마커도 검출되지 않은 직장 NET 환자군(99.2%; 도 7c, 표 2)과 비교하여 더 나쁜 DFS를 나타냈다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

세로토닌(serotonin) 단백질, 소마토스타틴(somatostatin) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 추가로,
크로모그라닌 A(chromogranin A) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 마커 조성물.
세로토닌(serotonin) 단백질, 소마토스타틴(somatostatin) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 추가로,
크로모그라닌 A(chromogranin A) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제인 것을 특징으로 하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는,
상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는, 직장 신경내분비종양의 예후 예측용 키트.
피검체 유래의 생물학적 시료에서
세로토닌(serotonin) 단백질, 소마토스타틴(somatostatin) 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는,
직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
제9항에 있어서, 상기 방법은 추가로,
크로모그라닌 A(chromogranin A) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준 측정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 예후 예측은,
환자의 무질병 생존 또는 재발 여부를 예측하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 생물학적 시료는
환자로부터 분리된 직장 신경내분비종양 조직 및 체액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것임을 특징으로 하는, 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 단백질의 발현수준은
웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준 측정은, 유전자의 mRNA 발현수준 측정인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 mRNA의 발현수준은
역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), 형광 인 시투 하이브리드화(FISH), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 방법은, 대조군과 비교하여
세로토닌 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 단독 발현은 EC-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류하며,
소마토스타틴 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 단독 발현은 D-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 방법은,
D-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류된 피검체는 고위험군으로 분류하고,
EC-세포형의 직장 신경내분비종양 아형으로 분류된 피검체는 중간위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 방법은,
세로토닌 및 소마토스타틴 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 모두 검출되지 않은 피검체는 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 조합은 하기 (i) 또는 (ii)인 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 세로토닌 및 소마토스타틴 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는
(ii) 세로토닌, 소마토스타틴 및 크로모그라닌 A 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자.
제19항에 있어서, 상기 방법은, 대조군과 비교하여
세로토닌 및 소마토스타틴 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 공동 발현; 또는
세로토닌, 소마토스타틴 및 크로모그라닌 A 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 공동 발현된 피검체는 고위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 키트는
제9항 또는 제10항의 직장 신경내분비종양의 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 포함하는 내용이 교시된 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.