KR102732761B1 - 생리학적 x 염색체 불활성화를 생성하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체세포 핵 전달 (SCNT)에 의해 생성된 임의의 배아의 세포를 비롯한 세포에서 생리학적 X-염색체 불활성화 (XCI)를 재현하기 위한 조성물 및 방법을 특색으로 한다. 한 측면에서, 본 발명은 SCNT를 통해 생성된 배아를 H3K27me3-특이적 데메틸라제 폴리펩티드 또는 상기 데메틸라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 주사하는 것을 포함하는, SCNT에 의해 생성된 배아에서 생리학적 X 염색체 불활성화를 생성하는 방법을 특색으로 한다. H3K27me3-특이적 데메틸라제를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나, 인간 H3K27me3-특이적 데메틸라제의 활성을 증가시키는 작용제를 포함하는 방법, 조성물, 및 키트가 본원에 개시된다.

Description

생리학적 X 염색체 불활성화를 생성하기 위한 조성물 및 방법

설치류를 비롯한 특정 진수류 포유동물의 암컷에서, 2개의 X 염색체 중 하나는 유전자 용량 보상을 달성하기 위해 불활성화된다. 발생 동안, X-염색체 불활성화 (XCI)는 각인된 또는 무작위 방식 중 어느 하나로 일어날 수 있다. 각인된 XCI에 대해, 부계 X 염색체 (Xp)는 착상전 발생 동안 선택적으로 불활성화된다. 각인된 XCI는 배아외 세포 계통에서 유지되지만, 이는 후기 배반포의 사전-외배판 세포 계통에서 소실된다. 착상-주위 단계에서, 외배판 세포는 무작위 XCI를 겪어, Xp 또는 모계 X 염색체 (Xm) 중 어느 하나의 침묵화를 초래한다. 이전의 연구는 각인된 및 무작위 XCI 둘 다에서, X-연관된 긴 비코딩 RNA인 Xist의 중요한 역할을 입증하였다. Xist RNA는 X 염색체를 시스로 코팅하고 불활성화시킴으로써 XCI에 참여한다.

착상전 발생 동안 Xp를 선택적으로 침묵시키기 위해, Xist는 오래 추구되어 왔지만 아직 확인되지 않은 메커니즘으로 Xm에서 각인된다. 핵 전달 접근법을 사용한 이전의 연구는 Xist의 게놈 각인이 난자형성 동안 확립됨을 시사하였다. 그러나, DNA 메틸트랜스퍼라제 모계 넉아웃 배아의 분석은 난모세포 DNA 메틸화가 Xist 각인에 불필요함을 밝혀내었다. 최근의 연구는 단위생식 (PG) 배아에서 H3K9me3 데메틸라제, Kdm4b의 과발현이 Xist를 부분적으로 탈억제함을 입증하였으며, 이는 각인된 Xist 침묵화에서의 H3K9me3의 관여를 시사한다. 그러나, PG 배아가 단일 모계 대립유전자의 비생리학적 Xist 탈억제를 겪는다는 사실은 H3K9me3-고갈된 PG 배아에서 관찰된 탈억제 효과가 생리학적으로 관련되는지 여부의 질문을 제기한다. 최근, 모계 H3K27me3은 DNA 메틸화-독립적 상염색체 유전자 각인을 위한 각인 마크로서 기능함이 밝혀졌다.

이러한 관찰은 체세포로부터의 공여자 핵이 제핵된 난모세포 내로 전달되는 치료적 및 생식적 클로닝에 관련된다. 이 프로세스는 체세포 핵 전달 (SCNT)로 용어화되며, 체세포의 제핵된 난모세포와의 융합, 제핵된 난모세포 내로의 핵의 주사에 의해, 또는 임의의 다른 방법에 의해 달성될 수 있다. 현재, SCNT의 단지 약 1 퍼센트가 생존성 배아의 성공적인 생성을 초래한다. SCNT의 낮은 성공률은 각인에서의 결함과 연관된다. 따라서, SCNT의 성공을 증가시키고, 각인에서의 결함을 교정하기 위한 신규한 조성물 및 방법이 요구된다.

발명의 요약

하기 기재된 바와 같이, 본 발명은 SCNT에 의해 생성된 임의의 배아의 세포를 비롯한 세포에서 생리학적 X-염색체 불활성화 (XCI)를 재현하기 위한 조성물 및 방법을 특색으로 한다.

한 측면에서, 본 발명은 체세포 핵 전달 (SCNT)을 통해 생성된 배아에 H3K27me3-특이적 데메틸라제 폴리펩티드 또는 상기 데메틸라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 주사하는 것을 포함하는, SCNT에 의해 생성된 배아에서 생리학적 X 염색체 불활성화를 생성하는 방법을 특색으로 한다. 한 실시양태에서, 배아에 H3K27me3-특이적 데메틸라제를 코딩하는 mRNA를 주사한다. 또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c 폴리펩티드를 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 배아에 약 1000 내지 2000 ng/μL의 mRNA를 주사된다. 또다른 실시양태에서, 배아에 1800 ng/μL의 mRNA를 주사된다. 또다른 실시양태에서, X 염색체는 체세포로부터 유래된 공여자 핵에 존재한다. 또다른 실시양태에서, 공여자 핵은 난모세포 또는 배아 줄기 세포 내로 전달된다. 또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 H3K27me3-특이적 데메틸라제의 효소 활성 단편을 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 포유동물 발현 벡터에 존재한다. 또다른 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 H3K27me3-특이적 데메틸라제의 구성적 또는 유도성 발현을 지시하는 프로모터를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 주사된 폴리펩티드는 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c이다. 또다른 실시양태에서, 방법은 X-연관된 유전자의 발현을 감소시킨다. 또다른 실시양태에서, 방법은 X-염색체 각인을 모면하는 유전자의 발현을 유의하게 변화시키지 않는다. 또다른 실시양태에서, 방법은 상염색체 유전자 발현을 유의하게 변화시키지 않는다. 또다른 실시양태에서, X-연관된 유전자의 모계 대립유전자 발현 편향은 약 35 내지 60％ 초과이다. 또다른 실시양태에서, X-연관된 유전자의 모계 대립유전자 발현 편향은 약 50％ 초과이다. 다른 실시양태에서, 배아는 초기 배반포 단계 배아이거나, 성체 체세포로부터 유래된다. 또다른 실시양태에서, 체세포는 인간 대상체로부터 얻어진다. 또다른 실시양태에서, 방법은 배아로부터의 세포를 배양하여 인간 대상체 내로의 이식에 적합한 조직을 얻는 것을 더 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 이전의 청구항의 방법에 따라 생성된 배반포를 특색으로 한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 이전의 측면의 방법에 따라 생성된 세포 또는 조직을 특색으로 한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 이전의 측면의 배반포를 숙주 자궁 내로 착상시킴으로써 생성된 클로닝된 유기체를 특색으로 한다.

본 발명의 다른 특색 및 이점은 상세한 설명으로부터, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

정의

달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 통상의 기술자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 제공한다: 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)]; [The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)]; [The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 사용된 바와 같은 하기 용어는 달리 명시되지 않는다면 하기에 그들에게 할당된 의미를 갖는다.

"H3K27me3-특이적 데메틸라제"란 트리메틸화 H3 'Lys-27을 특이적으로 탈메틸화하는 단백질을 의미한다. 예시적인 데메틸라제로는 Kdm6a, Kdm6b, 및 Kdm6c를 들 수 있다.

"KDM6A 폴리펩티드" (리신-특이적 데메틸라제 6A, 또한 히스톤 데메틸라제 UTX로 지칭됨)란 NCBI 참조 서열: O15550.2에 제공된 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖고, 데메틸라제 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 예시적인 KDM6A 아미노산 서열은 하기에 제공된다:

"KDM6A 폴리뉴클레오티드"란 KDM6A 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 KDM6A 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001291415.1에 제공된다.

"KDM6B 폴리펩티드" (리신-특이적 데메틸라제 6, 또한 JmjC 도메인-함유 단백질 3으로 지칭됨)란 NCBI 참조 서열: O15054.4에 제공된 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖고, 데메틸라제 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 예시적인 KDM6B 아미노산 서열은 하기에 제공된다:

"KDM6B 폴리뉴클레오티드"란 KDM6B 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 KDM6B 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001080424.2에 제공되고, 하기에 재현된다:

"KDM6C 폴리펩티드" (히스톤 데메틸라제 UTY, 또한 Y 염색체 상의 편재적으로-전사된 TPR 단백질로 지칭됨)란 NCBI 참조 서열: O14607.2에 제공된 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖고, 데메틸라제 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 예시적인 KDM6C 아미노산 서열은 하기에 제공된다:

"KDM6C 폴리뉴클레오티드란 KDM6C 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 KDM6A 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001258249.1에 제공되고, 이 서열은 하기에 재현된다:

"리신 27에서의 트리-메틸화 히스톤 H3 (H3K27me3)"이란 히스톤 H3 단백질 서브유닛 상의 리신 27의 트리메틸화를 의미한다. H3K27me3 변형은 일반적으로 유전자 억제와 연관된다.

"작용제"란 펩티드, 핵산 분자, 또는 작은 화합물을 의미한다.

"대립유전자"란 염색체 상의 동일한 장소에서 발견되는 유전자의 2개 이상의 대안적 형태 중 하나를 의미한다.

"변경"이란 본원에 기재된 것들과 같은 표준 기술 공지된 방법에 의해 검출된 바로, 유전자 또는 폴리펩티드의 발현 수준 또는 활성의 변화 (증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 변경은 발현 수준의 10％ 변화, 바람직하게는 발현 수준의 25％ 변화, 보다 바람직하게는 40％ 변화, 및 가장 바람직하게는 50％ 이상의 변화를 포함한다.

"개선시키다"란 질환의 발달 또는 진행을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나, 줄이거나, 정지시키거나, 안정화하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "포배"는 포배공간으로 지칭되는 유체-충전된 강을 둘러싸는 세포의 중공 구체로 이루어진 배아의 발생에서의 초기 단계를 지칭한다. 용어 포배는 때때로 배반포와 상호교환가능하게 사용된다.

용어 "할구"는 전반에 걸쳐 착상전 배아로부터 얻어진 적어도 1개의 할구 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 등)를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "2개 이상의 할구의 클러스터"는 할구의 시험관내 배양 동안 생성되는 세포를 지칭하기 위해 "할구-유래된 증식물"과 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 할구가 SCNT 배아로부터 얻어지고, 초기에 배양된 후, 이는 일반적으로 적어도 1회 분열하여 2개 이상의 할구의 클러스터 (또한 할구-유래된 증식물로 공지됨)를 생성한다. 클러스터는 배아 또는 태아 세포와 함께 더 배양될 수 있다. 궁극적으로, 할구-유래된 증식물은 분열하기를 계속할 것이다. 이들 구조로부터, ES 세포, 전능성 줄기 (TS) 세포, 및 부분적으로 분화된 세포 유형이 배양 방법의 과정에 걸쳐 발달할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "클로닝된 (또는 클로닝)"은 또다른 개체 단위와 동일한 유전자 세트를 갖는 새로운 개체 단위를 제조하기 위한 유전자 조작 기법을 지칭한다. 본 발명에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "클로닝된"은 또다른 세포, 배아 세포, 태아 세포, 분화된 세포, 및/또는 동물 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 유사하거나 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 세포, 배아 세포, 태아 세포, 및/또는 동물 세포를 지칭한다. 용어 "실질적으로 유사한" 및 "동일한"은 본원에서 기재된다. 클로닝된 SCNT 배아는 하나의 핵 전달로부터 발생할 수 있거나, 대안적으로, 클로닝된 SCNT 배아는 적어도 1회의 재-클로닝 단계를 포함하는 클로닝 프로세스로부터 발생할 수 있다.

이 개시내용에서, "포함하다 (comprise)", "포함하는 (comprising)", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 그들에게 할당된 의미를 가질 수 있고, "포함하다 (include)", "포함하는 (including)" 등을 의미할 수 있으며; "로 본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"는 마찬가지로 미국 특허법에서 할당된 의미를 갖고, 상기 용어는 인용된 것의 기본적 또는 신규한 특징이 인용된 것 초과의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 인용된 것 초과의 존재를 허용하는 개방-말단이지만, 선행 기술 실시양태는 배제한다.

"검출하다"는 검출되는 분석물의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 지칭한다.

"질환"이란 세포, 조직, 또는 기관의 정상적인 기능 또는 발달을 손상시키거나, 방해하는 임의의 상태 또는 장애를 의미한다. 장애의 예로는 배아에서의 X 염색체 각인의 붕괴와 연관된 결함 (예를 들어, 발생 결함, 생존성의 소실)을 들 수 있다.

"DNA"란 데옥시리보핵산을 의미한다. 다양한 실시양태에서, 용어 DNA는 게놈 DNA, 재조합 DNA, 또는 cDNA를 지칭한다. 특정 실시양태에서, DNA는 "표적 영역"을 포함한다. 본원에서 고려되는 DNA 라이브러리는 게놈 DNA 라이브러리, 및 RNA로부터 구축된 cDNA 라이브러리, 예를 들어, RNA 발현 라이브러리를 포함한다. 다양한 실시양태에서, DNA 라이브러리는 1개 이상의 추가의 DNA 서열 및/또는 태그를 포함한다.

"유효량"이란 세포를 생리학적 정상 조건으로 복원하는 데 요구되는 작용제의 양을 의미한다. 한 실시양태에서, 작용제의 유효량은 각인 결함을 교정하고, 생리학적 정상 각인 표현형을 세포에 부여하는 데 요구되는 양이다. 한 실시양태에서, Kdm6b mRNA의 주사는 비정상적 및/또는 비바람직한 X 염색체 불활성화와 연관된 각인 결함을 교정하는 데 충분하다. 질환의 치료적 치료를 위한 본 발명을 실시하는 데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여의 방식, 대상체의 연령, 체중, 및 일반적 건강에 따라 다양하다. 궁극적으로, 담당 의사 또는 수의사는 적절한 양 및 투여량 처방을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효"량으로 지칭된다.

"배아"란 의미한다.

"단편"이란 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분을 의미한다. 이 부분은 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 바람직하게는, 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 또는 90％를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.

용어 "단리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 천연 상태에서 발견되는 바와 같은 통상적으로 이를 수반하는 성분이 다양한 정도로 없는 물질을 지칭한다. "단리하다"는 원래 공급원 또는 환경으로부터의 분리의 정도를 나타낸다. "정제하다"는 단리보다 더 높은 분리의 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 물질적으로 영향을 미치지 않거나, 다른 유해 결과를 유발하지 않도록 다른 물질이 충분히 없는 것이다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩티드는 그것이 재조합 DNA 기법에 의해 생성되는 경우 세포성 물질, 바이러스성 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 경우 정제된다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석적 화학 기법, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 한 밴드를 발생시키는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화될 수 있는 단백질에 대해, 상이한 변형은 별개로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 발생시킬 수 있다.

"단리된 폴리뉴클레오티드"란 본 발명의 핵산 분자가 유래되는 유기체의 천연-발생 게놈에서 유전자를 플랭킹하는 유전자가 없는 핵산 (예를 들어, DNA)을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어, 벡터 내로; 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내로; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입된; 또는 다른 서열과 독립적인 별개의 분자 (예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 상기 용어는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자, 뿐만 아니라 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

"단리된 폴리펩티드"란 자연적으로 그것을 수반하는 성분으로부터 분리된 본 발명의 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 그것이, 그것이 자연적으로 회합되는 단백질 및 천연-발생 유기 분자로부터 적어도 60 중량％ 유리되는 경우 단리된다. 바람직하게는, 제제는 적어도 75 중량％, 보다 바람직하게는 적어도 90 중량％, 및 가장 바람직하게는 적어도 99 중량％ 본 발명의 폴리펩티드이다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터의 추출에 의해, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질을 화학적으로 합성함으로써 얻어질 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.

"감소시키다"란 적어도 10％, 25％, 50％, 75％, 또는 100％의 음성 변경을 의미한다.

"참조물"이란 표준 또는 대조군 상태를 의미한다.

"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 사용되는 한정된 서열이다. 참조 서열은 명시된 서열의 하위세트 또는 그의 전체; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 절편, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 폴리펩티드에 대해, 참조 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16개 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 20개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 25개 아미노산, 및 보다 더 바람직하게는 약 35개 아미노산, 약 50개 아미노산, 또는 약 100개 아미노산일 것이다. 핵산에 대해, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 60개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 약 75개 뉴클레오티드, 및 보다 더 바람직하게는 약 100개 뉴클레오티드 또는 약 300개 뉴클레오티드 또는 그 부근의 또는 그 사이의 임의의 정수일 것이다.

본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100％ 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 "실질적 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 한 가닥과 혼성화할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100％ 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 "실질적 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 한 가닥과 혼성화할 수 있다. "혼성화하다"란 다양한 엄격성의 조건 하에서 상보성 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 유전자), 또는 그의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하는 쌍을 의미한다. (예를 들어, 문헌 [Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399]; [Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조).

예를 들어, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산삼나트륨 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산삼나트륨 미만, 및 보다 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재 하에서 얻어질 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35％ 포름아미드, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 50％ 포름아미드의 존재 하에서 얻어질 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 30℃의, 보다 바람직하게는 적어도 약 37℃의, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 추가의 파라미터, 예컨대 혼성화 시간, 세정제, 예를 들어, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)의 농도, 및 운반체 DNA의 포함 또는 배제를 다양화하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄격성은 필요에 따라 이들 다양한 조건을 조합함으로써 달성된다. 바람직한: 실시양태에서, 혼성화는 30℃에서 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨, 및 1％ SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 37℃에서 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산삼나트륨, 1％ SDS, 35％ 포름아미드, 및 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA (ssDNA)에서 일어날 것이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 42℃에서 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산삼나트륨, 1％ SDS, 50％ 포름아미드, 및 200 μg/ml ssDNA에서 일어날 것이다. 이들 조건에 대한 유용한 변화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.

대부분의 적용을 위해, 혼성화에 이어지는 세척 단계는 또한 엄격성에 있어서 다양할 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도에 의해 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시킴으로써 또는 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산삼나트륨 미만, 및 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 25℃의, 보다 바람직하게는 적어도 약 42℃의, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 25℃에서 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1％ SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 42℃에서 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1％ SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 68℃에서 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1％ SDS에서 일어날 것이다. 이들 조건에 대한 추가의 변화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 혼성화 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Benton and Davis (Science 196:180, 1977)]; [Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)]; [Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)]; [Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기재되어 있다.

"체세포 핵 전달" 또는 "SCNT"란 제핵된 난모세포 내로의 체세포로부터의 공여자 핵의 전달을 의미한다. 상기 프로세스는 생식적 또는 치료적 클로닝 중 어느 하나에 사용될 수 있으며, 체세포와 제핵된 난모세포의 융합, 제핵된 난모세포 내로의 핵의 주사에 의해, 또는 임의의 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.

체세포의 핵은 유전 정보를 제공하는 반면, 난모세포는 배아의 발생에 필요한 영양분 및 다른 에너지-생성 물질을 제공한다. 융합이 일어나면, 세포는 전능성이고, 결국 배반포로 발달하며, 이 시점에서 내부 세포 덩이가 단리된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵 전달"은 제핵된 난모세포를 체세포의 세포 핵 유전 물질 또는 핵과 인공적으로 조합함으로써 획득된 동일한 특징 및 품질을 허용하는 유전자 조작 기법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 핵 전달 절차는 공여자 체세포로부터의 핵 또는 핵 유전 물질이 제핵된 난 또는 난모세포 (핵/전핵이 제거된 난 또는 난모세포) 내로 전달되는 경우이다. 공여자 핵은 체세포로부터 올 수 있다.

용어 "핵 유전 물질"은 개체에 관한 정보를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)를 포함하는 핵에서 발견되는 구조 및/또는 분자를 지칭한다. 핵 유전 물질은 염색체 및 염색질을 포함한다. 상기 용어는 또한 세포 분열, 예컨대 모 세포의 딸 세포로의 분열에 의해 생산된 핵 유전 물질 (예를 들어, 염색체)을 지칭한다. 핵 유전 물질은 미토콘드리아 DNA를 포함하지 않는다.

용어 "SCNT 배아"는 체세포의 핵 또는 핵 유전 물질과 융합된 제핵된 난모세포의 세포, 또는 그의 전능성 자손을 지칭한다. SCNT 배아는 배반포로 발달하고, 착상후에 살아 있는 후손으로 발달할 수 있다. SCNT 배아는 1-세포 배아, 2-세포 배아, 4-세포 배아, 또는 배반포가 되기 전의 임의의 단계의 배아일 수 있다.

용어 "공여자 인간 세포" 또는 "공여자 인간 체세포"는 핵 수용체 또는 수용자로서 수용자 난모세포 내로 전달된 인간 세포의 체세포 또는 핵을 지칭한다.

용어 "체세포"는 생식 세포 또는 생식 세포 전구체가 아닌 식물 또는 동물 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 분화된 세포는 배 세포가 아니다. 체세포는 다능성 또는 전능성 세포와 관련되지 않는다. 일부 실시양태에서, 체세포는 "비-배아 체세포"이며, 이는 배아에 존재하거나 그로부터 얻어지지 않으며, 시험관내에서 이러한 세포의 증식으로부터 발생되지 않는 체세포를 의미한다. 일부 실시양태에서, 체세포는 "성체 체세포"이며, 이는 배아 또는 태아 이외의 유기체에 존재하거나 그로부터 얻어지거나, 시험관내에서 이러한 세포의 증식으로부터 발생되는 세포를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "난모세포"는 감수분열의 중기 II에 도달한 성숙한 난모세포를 지칭한다. 난모세포는 또한 생식에 관여하는 자성 배우자 또는 배 세포를 기재하는 데 사용되며, 통상적으로 또한 난으로 지칭된다. 성숙한 난은 모계 염색체의 단일 세트 (23개, 인간 영장류에서 X)를 가지며, 중기 II에서 중단된다.

"하이브리드 난모세포"는 제1 인간 난모세포 ("수용자"로 용어화됨)로부터의 세포질을 갖지만, 수용자 난모세포의 핵 유전 물질을 갖지 않는 제핵된 난모세포를 지칭하며; 이는 "공여자"로 용어화되는 또다른 인간 세포로부터의 핵 유전 물질을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하이브리드 난모세포는 또한 수용자 난모세포로부터의 것이 아니지만, 공여자 세포로부터의 것인 (이는 핵 유전 물질과 동일한 공여자 세포, 또는 상이한 공여자로부터의, 예를 들어 공여자 난모세포로부터의 것일 수 있음) 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제핵된 난모세포"는 그의 핵이 제거된 인간 난모세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제핵"은 세포의 핵 물질이 제거되어, 세포질만 남기는 프로세스를 지칭한다. 난에 적용되는 경우, 제핵은 핵막에 의해 둘러싸이지 않은 모계 염색체의 제거를 지칭한다. 용어 "제핵된 난모세포"는 핵 물질 또는 핵이 제거된 난모세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "수용자 인간 난모세포"는 그의 원래 핵을 제거한 후에 인간 핵 공여자 세포로부터 핵을 받는 인간 난모세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합"은 핵 공여자 세포 및 수용자 난모세포의 지질 막의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 지질 막은 세포의 형질막 또는 핵막일 수 있다. 융합은 핵 공여자 세포 및 수용자 난모세포 사이의 전기적 자극의 인가 시 일어날 수 있는데, 이 때 이들은 서로 인접하게 위치하거나, 핵 공여자 세포는 수용자 난모세포의 난황주위 공간에 위치한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "살아 있는 후손"은 자궁 외에서 생존할 수 있는 동물을 의미한다. 바람직하게는, 이는 1초, 1분, 1일, 1주, 1개월, 6개월 또는 1년 초과 동안 생존할 수 있는 동물이다. 동물은 생존을 위해 자궁내 환경을 요구하지 않을 수 있다.

용어 "출생전"은 출생 전에 존재하거나 일어나는 것을 지칭한다. 유사하게, 용어 "출생후"는 출생 후에 존재하거나 일어나는 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스제닉 유기체"는 또다른 유기체로부터의 유전 물질이 실험적으로 전달되어, 숙주가 그의 염색체 조성에서 전달된 유전자의 유전적 소질을 획득하는 유기체를 지칭한다.

본원에 개시된 바와 같은 SCNT 배아와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "착상"은 본원에 기재된 SCNT 배아를 갖는 대리 암컷 동물을 수태시키는 것을 지칭한다. 이 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Seidel and Elsden, 1997, Embryo Transfer in Dairy Cattle, W. D. Hoard & Sons, Co., Hoards Dairyman]을 참조한다. 배아는 자궁내에서 발달하도록 허용될 수 있거나, 대안적으로, 태아는 분만 전에 자궁 환경으로부터 제거될 수 있다.

"대상체"란 인간 또는 비-인간 포유동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물, 예컨대 농업적으로 중요한 포유동물 (예를 들어, 소, 말, 양, 돼지), 애완동물 (예를 들어, 개, 고양이), 또는 희귀하거나 멸종위기 포유동물 (예를 들어, 팬더)을 의미한다.

"실질적으로 동일한"이란 참조 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나)과 적어도 50％ 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 비교에 사용되는 서열과 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60％, 보다 바람직하게는 80％ 또는 85％, 및 보다 바람직하게는 90％, 95％ 또는 심지어 99％ 동일하다.

서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애브뉴 1710에 소재하는 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터 (University of Wisconsin Biotechnology Center), 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지 (Sequence Analysis Software Package), BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 상동성의 정도를 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 할당함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매칭시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 군 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 측정하는 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램이 사용될 수 있으며, e^-3 내지 e^-100의 확률 점수는 가깝게 관련된 서열을 지시한다.

"체세포 핵 전달" 또는 "SCNT"란 제핵된 난모세포 내로의 체세포로부터의 공여자 핵의 전달을 의미한다. 상기 프로세스는 생식적 또는 치료적 클로닝 중 어느 하나에 사용될 수 있으며, 체세포와 제핵된 난모세포의 융합, 제핵된 난모세포 내로의 핵의 주사에 의해, 또는 임의의 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.

체세포의 핵은 유전 정보를 제공하는 반면, 난모세포는 배아의 발생에 필요한 영양분 및 다른 에너지-생성 물질을 제공한다. 융합이 일어나면, 세포는 전능성이고, 결국 배반포로 발달하며, 이 시점에서 내부 세포 덩이가 단리된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵 전달"은 제핵된 난모세포를 체세포의 세포 핵 유전 물질 또는 핵과 인공적으로 조합함으로써 획득된 동일한 특징 및 품질을 허용하는 유전자 조작 기법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 핵 전달 절차는 공여자 체세포로부터의 핵 또는 핵 유전 물질이 제핵된 난 또는 난모세포 (핵/전핵이 제거된 난 또는 난모세포) 내로 전달되는 경우이다. 공여자 핵은 체세포로부터 올 수 있다.

용어 "핵 유전 물질"은 개체에 관한 정보를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)를 포함하는 핵에서 발견되는 구조 및/또는 분자를 지칭한다. 핵 유전 물질은 염색체 및 염색질을 포함한다. 상기 용어는 또한 세포 분열, 예컨대 모 세포의 딸 세포로의 분열에 의해 생산된 핵 유전 물질 (예를 들어, 염색체)을 지칭한다. 핵 유전 물질은 미토콘드리아 DNA를 포함하지 않는다.

용어 "SCNT 배아"는 체세포의 핵 또는 핵 유전 물질과 융합된 제핵된 난모세포의 세포, 또는 그의 전능성 자손을 지칭한다. SCNT 배아는 배반포로 발달하고, 착상후에 살아 있는 후손으로 발달할 수 있다. SCNT 배아는 1-세포 배아, 2-세포 배아, 4-세포 배아, 또는 배반포가 되기 전의 임의의 단계의 배아일 수 있다.

용어 "공여자 인간 세포" 또는 "공여자 인간 체세포"는 핵 수용체 또는 수용자로서 수용자 난모세포 내로 전달된 인간 세포의 체세포 또는 핵을 지칭한다.

용어 "체세포"는 생식 세포 또는 생식 세포 전구체가 아닌 동물 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 분화된 세포는 배 세포가 아니다. 체세포는 다능성 또는 전능성 세포와 관련되지 않는다. 일부 실시양태에서, 체세포는 "비-배아 체세포"이며, 이는 배아에 존재하거나 그로부터 얻어지지 않으며, 시험관내에서 이러한 세포의 증식으로부터 발생되지 않는 체세포를 의미한다. 일부 실시양태에서, 체세포는 "성체 체세포"이며, 이는 배아 또는 태아 이외의 유기체에 존재하거나 그로부터 얻어지거나, 시험관내에서 이러한 세포의 증식으로부터 발생되는 세포를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "난모세포"는 감수분열의 중기 II에 도달한 성숙한 난모세포를 지칭한다. 난모세포는 또한 생식에 관여하는 자성 배우자 또는 배 세포를 기재하는 데 사용되며, 통상적으로 또한 난으로 지칭된다. 성숙한 난은 모계 염색체의 단일 세트 (23개, 인간 영장류에서 X)를 가지며, 중기 II에서 중단된다.

"하이브리드 난모세포"는 제1 인간 난모세포 ("수용자"로 용어화됨)로부터의 세포질을 갖지만, 수용자 난모세포의 핵 유전 물질을 갖지 않는 제핵된 난모세포를 지칭하며; 이는 "공여자"로 용어화되는 또다른 인간 세포로부터의 핵 유전 물질을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하이브리드 난모세포는 또한 수용자 난모세포로부터의 것이 아니지만, 공여자 세포로부터의 것인 (이는 핵 유전 물질과 동일한 공여자 세포, 또는 상이한 공여자로부터의, 예를 들어 공여자 난모세포로부터의 것일 수 있음) 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제핵된 난모세포"는 그의 핵이 제거된 인간 난모세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제핵"은 세포의 핵 물질이 제거되어, 세포질만 남기는 프로세스를 지칭한다. 난에 적용되는 경우, 제핵은 핵막에 의해 둘러싸이지 않은 모계 염색체의 제거를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "수용자 인간 난모세포"는 그의 원래 핵을 제거한 후에 인간 핵 공여자 세포로부터 핵을 받는 인간 난모세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합"은 핵 공여자 세포 및 수용자 난모세포의 지질 막의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 지질 막은 세포의 형질막 또는 핵막일 수 있다. 융합은 핵 공여자 세포 및 수용자 난모세포 사이의 전기적 자극의 인가 시 일어날 수 있는데, 이 때 이들은 서로 인접하게 위치하거나, 핵 공여자 세포는 수용자 난모세포의 난황주위 공간에 위치한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "살아 있는 후손"은 자궁 외에서 생존할 수 있는 동물을 의미한다. 바람직하게는, 이는 1시간 이상, 1일, 1주, 1개월, 6개월 또는 1년 초과 동안 생존할 수 있는 동물이다. 동물은 생존을 위해 자궁내 환경을 요구하지 않을 수 있다.

용어 "출생전"은 출생 전에 존재하거나 일어나는 것을 지칭한다. 유사하게, 용어 "출생후"는 출생 후에 존재하거나 일어나는 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "배반포"는 약 30 내지 150개의 세포의 태반 포유동물에서의 착상전 배아 (마우스에서 수정 후 약 3일, 인간에서 수정 후 약 5일)를 지칭한다. 배반포 단계는 상실배 단계에 이어지며, 그의 고유한 형태에 의해 구별될 수 있다. 배반포는 세포의 층 (영양외배엽), 유체-충전된 강 (포배공간 또는 배반포강), 및 내부 상의 세포의 클러스터 (내부 세포 덩이, 또는 ICM)로 구성된 구체로 이루어진다. 비분화된 세포로 이루어진 ICM은 배반포가 자궁에 착상되는 경우 태아가 될 것을 발생시킨다. 이들 동일한 ICM 세포는, 배양에서 성장되는 경우, 배아 줄기 세포주를 발생시킬 수 있다. 착상 시, 마우스 배반포는 약 70개의 영양막 세포 및 30개의 ICM 세포로 구성된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스제닉 유기체"는 또다른 유기체로부터의 유전 물질이 실험적으로 전달되어, 숙주가 그의 염색체 조성에서 전달된 유전자의 유전적 소질을 획득하는 유기체를 지칭한다.

본원에 개시된 바와 같은 SCNT 배아와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "착상"은 본원에 기재된 SCNT 배아를 갖는 대리 암컷 동물을 수태시키는 것을 지칭한다. 이 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Seidel and Elsden, 1997, Embryo Transfer in Dairy Cattle, W. D. Hoard & Sons, Co., Hoards Dairyman]을 참조한다. 배아는 자궁내에서 발달하도록 허용될 수 있거나, 대안적으로, 태아는 분만 전에 자궁 환경으로부터 제거될 수 있다.

"대상체"란 인간 또는 비-인간 포유동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물, 예컨대 농업적으로 중요한 포유동물 (예를 들어, 소, 말, 양, 돼지), 애완동물 (예를 들어, 개, 고양이), 또는 희귀하거나 멸종위기 포유동물 (예를 들어, 팬더)을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 그와 연관된 장애 및/또는 증상을 감소시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 불가능하지는 않지만, 장애 또는 상태를 치료하는 것은 장애, 상태 또는 그와 연관된 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지는 않음이 인정될 것이다. 한 실시양태에서, 용어 "치료하는"은 SCNT 배아에서의 각인 결함의 치료를 지칭한다.

구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 명백하지 않다면, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 포함적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 명백하지 않다면, 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.

구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 명백하지 않다면, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 포함적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 명백하지 않다면, 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태 용어는 단수 또는 복수 (즉, 적어도 하나)인 것으로 이해된다. 예로서, "요소"는 1개의 요소 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.

구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 명백하지 않다면, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 관련 기술분야에서 정상적인 내성의 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로서 이해된다. 약은 언급된 값의 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.5％, 0.1％, 0.05％, 또는 0.01％ 내로서 이해될 수 있다. 맥락으로부터 달리 명백하지 않다면, 본원에서 제공된 모든 수치 값은 용어 약에 의해 변형된다.

본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학기의 목록의 나열은 열거된 기의 임의의 단일 기 또는 조합으로서의 그 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 변수 또는 측면에 대한 실시양태의 나열은 임의의 단일 실시양태로서 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과의 조합으로의 그 실시양태를 포함한다.

본원에서 제공된 임의의 조성물 및 방법은 본원에서 제공된 다른 조성물 및 방법 중 임의의 것 중 1종 이상과 조합될 수 있다.

도 1a 내지 1d는 H3K9me3의 이소적 제거가 모계 Xist 발현을 유도하지 않았음을 나타낸다. 도 1a는 항-H3K9me3 항체로 염색된 접합자의 대표적인 화상을 나타낸다. (M) 모계 전핵; (P) 부계 전핵. 막대 그래프는 모계 전핵의 상대 H3K9me3 신호 강도를 나타낸다. 비주사된 접합자의 평균 신호 강도는 1.0으로서 설정되었다. 조사된 배아의 총 수는 8개 (주사 없음), 9개 (1000 ng/μL Kdm4b), 및 9개 (2600 ng/μL Kdm4b)였다. 오차 막대는 표준 오차 (SE)를 지시한다. (***) P < 0.001; (*) P < 0.05, 양측 스튜던트 (Student) t-검정. 도 1b는 Kdm4b-주사된 4-세포 배아에서의 Xist RNA FISH (마젠타)의 대표적인 화상을 나타낸다. 각각의 배아의 성별을 Rnf12 유전자좌 (회색)에 대한 동시 DNA FISH에 의해 평가하였다. 화살표는 할구를 지시하며, 이는 하부 패널에서 확대되어 나타내어진다. 도 1c는 웅성 배아에서의 지시된 수의 Xist RNA 클라우드 및 스폿을 갖는 할구의 비를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 막대는 개별적 배아를 나타낸다. 조사된 웅성 배아의 수는 6개 (주사 없음), 5개 (1000 ng/μL Kdm4b), 및 12개 (2600 ng/μL Kdm4b)였다. 도 1d는 자성 배아에서의 지시된 수의 Xist RNA 클라우드 및 스폿을 갖는 할구의 비를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 막대는 개별적 배아를 나타낸다. 조사된 자성 배아의 수는 6개 (주사 없음), 6개 (1000 ng/μL Kdm4b), 및 8개 (2600 ng/μL Kdm4b)였다.
도 2a 내지 2c는 모계 H3K27me3이 난모세포 및 착상전 배아에서 Xist를 코팅하였음을 나타낸다. 도 2a는 Xist 유전자좌에서의 H3K27me3 ChIP-seq (Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079), DN아제 I-seq (Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424), 및 DNA 메틸화 수준 (Kobayashi et al. 2012. PLoS Genet 8: e1002440)의 게놈 브라우저 뷰를 나타낸다. (Oo) MII 난모세포; (Sp) 정자; (7d) 7일령 암컷으로부터 수집된 성장하는 난모세포; (14d) 14일령 암컷으로부터 수집된 성장하는 난모세포; (GV) 완전히 성장된 GV 단계 난모세포. 도 2b는 Xist 유전자좌에서의 1-세포, 2-세포, 및 배반포 배아 및 E6.5 외배판에서의 대립유전자 H3K27me3의 게놈 브라우저 뷰를 나타낸다. 강조된 정사각형은 H3K27me3 풍부화의 모계 대립유전자 편향이 배반포 배아에서 보유된 컴퓨터 결정된 영역을 지시한다. (Mat) 모계 대립유전자; (Pat) 부계 대립유전자. H3K27me3 ChIP-seq 데이터 세트는 문헌 [Zheng et al. (2016; Mol Cell 63: 1066-1079)]에 기재되었다. 도 2c는 배반포 배아에서의 Xist 유전자좌의 보다 고-해상도 뷰를 나타낸다. 모계 대립유전자-편향된 H3K27me3 도메인은 음영화된다.
도 3a 내지 3e는 H3K27me3의 소실이 모계 Xist 발현을 유도하였음을 나타낸다. 도 3a는 항-H3K27me3 항체로 염색된 접합자의 대표적인 화상을 나타낸다. (M) 모계 전핵, (P) 부계 전핵. 막대 그래프는 모계 전핵의 상대 H3K27me3 신호 강도를 지시한다. Kdm6b ^MUT -주사된 접합자의 평균 신호는 1.0으로서 설정되었다. 조사된 배아의 총 수는 15개 (Kdm6b ^MUT ) 및 13개 (Kdm6b ^WT )였다. 오차 막대는 표준 오차 (SE)를 지시한다. (***) P < 0.001, 양측 스튜던트 t-검정. 도 3b는 Kdm6b ^WT -주사된 상실배 배아에서 모계 H3K27me3 ChIP-seq 신호의 소실을 나타내는 Xist 유전자좌의 게놈 브라우저 뷰이다. (Mat) 모계 대립유전자; (Pat) 부계 대립유전자. 도 3c는 Kdm6b-주사된 4-세포 배아에서의 Xist RNA FISH (밝은 회색)의 대표적인 화상을 나타낸다. 각각의 배아의 성별을 Rnf12 유전자좌 (회색)에 대한 동시 DNA FISH에 의해 평가하였다. 도 3d는 웅성 4-세포 배아에서의 지시된 수의 Xist RNA 클라우드 및 스폿을 갖는 할구의 비를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 막대는 개별적 배아를 나타낸다. 조사된 웅성 배아의 수는 8개 (Kdm6bMUT) 및 15개 (Kdm6bWT)였다. 도 3e는 자성 4-세포 배아에서의 지시된 수의 Xist RNA 클라우드 및 스폿을 갖는 할구의 비를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 막대는 개별적 배아를 나타낸다. 조사된 자성 배아의 수는 8개 (Kdm6b ^MUT ) 및 12개 (Kdm6 ^WT )였다.
도 4a 내지 4e는 H3K27me3의 소실이 모계 X-염색체 불활성화 (XCI)를 유도하였음을 나타낸다. 도 4a는 Kdm6 ^WT -매개된 모계 Xist 발현에 의해 유발된 모계 XCI를 나타내는 도시이다. 도 4b는 Kdm6b-주사된 상실배 배아에서의 Xist RNA FISH (밝은 회색)의 대표적인 화상을 나타낸다. 각각의 배아의 성별을 Rnf12 유전자좌 (회색)에 대한 동시 DNA FISH에 의해 평가하였다. 도 4c는 웅성 상실배 배아에서의 지시된 수의 Xist RNA 클라우드를 갖는 할구의 비를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 막대는 개별적 배아를 나타낸다. 조사된 웅성 배아의 수는 19개 (Kdm6bMUT) 및 35개 (Kdm6bWT)였다. 도 4d는 자성 상실배 배아에서의 지시된 수의 Xist RNA 클라우드를 갖는 할구의 비를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 막대는 개별적 배아를 나타낸다. 조사된 자성 배아의 수는 34개 (Kdm6bMUT) 및 35개 (Kdm6bWT)였다. 도 4e는 Kdm6b ^MUT - 및 Kdm6b ^WT -주사된 배반포 사이의 개별적 모계 염색체 상의 유전자의 상대 발현을 나타내는 박스 플롯을 나타낸다. 충분한 SNP 리드 (SNP 리드 > 10, RPM [백만개 당 리드] > 0.5)를 갖는 유전자를 분석하였다. 박스에서 중간 선은 중위값을 나타낸다. 박스 모서리 및 수염모양은 각각 제25/제75 및 제2.5/제97.5 백분위수를 지시한다. (***) P < 0.001, 만-휘트니-윌콕슨 (Mann-Whitney-Wilcoxon) 검정.
도 5a 및 5b는 이소적 Kdm6b ^WT mRNA 주사가 착상전 배아에서 H3K27me3의 감소를 초래하였음을 나타낸다. 이들 결과는 도 3a 내지 3e에 나타내어진 것들과 관련된다. 도 5a는 H3K27me3 항체로 면역염색된 Kdm6b-주사된 4-세포 및 상실배 배아의 대표적인 화상을 나타낸다. Kdm6b mRNA를 접합자 내로 주사하였다. 배아를 수정 후 46시간 (4-세포) 및 78시간 (상실배)에 고정시켰다. 도 5b는 상대 H3K27me3 신호 강도를 나타내는 그래프이다. 다수의 할구의 신호 강도를 측정하고, 평균하여 단일 배아의 값을 얻었다. Kdm6b ^MUT 배아의 평균 신호는 1.0으로서 설정되었다. 조사된 배아의 총 수는 4-세포에 대해 9개 (Kdm6b ^MUT ) 및 9개 (Kdm6b ^WT ) 및 상실배에 대해 19개 (Kdm6b ^MUT ) 및 22개 (Kdm6b ^WT )였다. 오차 막대는 표준 오차 (SE)를 지시한다. ***, p<0.001, * p<0.05 (양측 스튜던트 t-검정).
도 6a 내지 6f는 배아 줄기 세포 (ESC) 및 Kdm6b-주사된 상실배 배아에서의 H3K27me3 ULI-NChIP의 확인을 나타낸다. 이들 결과는 도 3a 내지 3e에 나타내어진 것들과 관련된다. 도 6a는 ENCODE 프로젝트에서의 마우스 ESC에서 및 500 또는 2,000개의 ESC를 사용한 본 발명자들의 것에서 검출된 H3K27me3 피크 사이의 상관을 나타내는 산포도이다. 도 6b는 공개된 데이터세트 (Liu et al. 2016. Nature 537: 558-562) 및 Kdm6b ^MUT -주사된 상실배 배아의 H3K27me3 피크 사이의 상관을 나타내는 산포도를 나타낸다. 도 6c는 공개된 데이터세트 (Liu et al. 2016. Nature 537: 558-562) 및 Kdm6b ^MUT -주사된 상실배 배아의 H3K27me3 피크 사이의 상관을 나타내는 벤 다이아그램을 나타낸다. 도 6d는 공개적 데이터세트 및 Kdm6b ^MUT -주사된 상실배 배아에서의 거의 동일한 H3K27me3 풍부화를 나타내는 대표적인 유전자좌의 게놈 브라우저 뷰를 나타낸다. 도 6e는 Kdm6b ^MUT - 및 Kdm6b ^WT -주사된 상실배 배아에서 검출된 H3K27me3 피크의 수를 나타내는 그래프이다. 도 6f는 Kdm6b ^WT -주사된 배아에서의 H3K27me3 도메인의 소실을 나타내는 Xist 유전자좌의 게놈 브라우저 뷰를 나타낸다. 모 대립유전자는 이들 트랙에서 구별되지 않았다.
도 7은 Kdm6b-주사된 배아에서의 Rnf12의 RT-qPCR 분석을 나타내는 그래프이다. 데이터를 18S에 대해 정규화한 후, Kdm6b ^MUT 배아의 값을 1.0으로서 설정하였다. 오차 막대는 3회의 생물학적 반복실험의 표준 오차 (SE)를 지시한다. 각각의 실험은 군 당 18 내지 24개의 배아의 풀을 사용하였다. Rnf12는 Kdm6b ^WT -주사된 배아에서 상향조절되기 보다는 하향조절됨을 주목한다. 이론에 구애되지는 않지만, 이는 Rnf12가 비-모면자 X-연관된 유전자임을 고려하여 (Borensztein et al. 2017. Nat Struct Mol Biol 24: 226-233), Kdm6b ^WT -주사된 배아에서 4-세포 단계만큼 초기에 발생하는 모계 XCI에 기인할 가능성이 있다.
도 8a 내지 8d는 Kdm6bWT-주사된 배반포 배아에서의 모계 X 염색체 불활성화를 나타낸다. 이들 결과는 도 4a 내지 4e에 나타내어진 것들과 관련된다. 도 8a는 RNA-seq 샘플의 생물학적 이중실험 사이의 상관을 나타내는 산포도이다. 도 8b는 Kdm6b-주사된 배반포에서의 개별적 염색체의 모계 대립유전자 발현 비 [Mat/(Mat+Pat)]를 나타내는 박스 플롯이다. 박스에서 중간 선은 중위값을 나타낸다. 박스 모서리 및 수염모양은 각각 제25/제75 및 제2.5/제97.5 백분위수를 지시한다. Kdm6bMUT: 밝은 회색, 좌측 막대; Kdm6b ^WT : 어두운 회색, 우측 막대; p-값 < 2.2e-16. 도 8c는 Kdm6bWT- 및 Kdm6bMUT- 주사된 배반포 배아 사이의 X-연관된 유전자의 상대 발현 수준을 나타내는 그래프이다. 모계 대립유전자의 발현 수준을 분석하였다. 각각의 점은 충분한 SNP 리드 (RPM>0.5)를 나타내는 개별적 유전자를 나타낸다. 도 8c는 도 8d에 나타내어진 공지된 모면자를 제외한 유전자를 나타낸다. 도 8d는 Kdm6bWT- 및 Kdm6bMUT-주사된 배반포 배아 사이의 X-연관된 유전자의 상대 발현 수준을 나타내는 그래프이다. 모계 대립유전자의 발현 수준을 분석하였다. 각각의 점은 충분한 SNP 리드 (RPM>0.5)를 나타내는 개별적 유전자를 나타낸다. 도 8d는 공지된 모면자인 유전자를 나타낸다. 좌측에서 우측으로: Rbm3, Suv39h1, Tbc1d25, Atp6ap2, Araf, Ndufb11, Nkap, Lamp2, Utp14a, Idh3g, Eif2s3x, Xist, Kdm5c, Sms, Pdha1, Syap1, 및 Msl3.

본 발명은 체세포 핵 전달 (SCNT)에 의해 생성된 임의의 배아의 세포를 비롯한 세포에서 생리학적 X 염색체 불활성화를 재현하기 위한 조성물 및 방법을 특색으로 한다.

Kdm6b는 H3K27me3-특이적 데메틸라제이다. 본 발명은 적어도 부분적으로 Kdm6b-매개된 모계 X-염색체 불활성화가 생리학적-염색체 불활성화를 재현한다는 발견에 기초한다.

X-염색체 불활성화

발생 동안, X-염색체 불활성화 (XCI)는 각인된 또는 무작위 방식으로 일어난다. 각인된 XCI에 대해, 부계 X 염색체 (Xp)는 착상전 발생 동안 선택적으로 불활성화된다. 무작위 XCI는 그것이 Xp 또는 모계 X 염색체 (Xm) 중 어느 하나의 침묵화를 초래하는 외배판에서 일어난다. Xist는 각인된 및 무작위 XCI 둘 다에서 기능하는 X-연관된 긴 비코딩 RNA이다. Xist는 난자형성 동안 Xm에서 각인된다. Xist RNA는 X 염색체를 시스에서 코팅하고 불활성화시킴으로써 XCI에 참여한다.

H3K27me3-특이적 데메틸라제

한 측면에서, 본 발명은 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 융합 또는 활성화 전에 공여자 유전 물질을 포함하는 인간 제핵된 난모세포) 또는 인간 SCNT 배아 (즉, 공여자 핵과 제핵된 난모세포의 융합 후)의 핵 또는 세포질을 생리학적 X-염색체 불활성화를 재현할 수 있는 H3K27me3-특이적 데메틸라제 (Kdm6a, Kdm6b, Kdm6c 등)와 접촉시키는 것을 포함하는, 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 본원에 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 H3K27me3-특이적 데메틸라제가 부계 X 염색체 불활성화에 비해 모계 X 염색체 불활성화를 정상화함으로써 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 데 사용될 수 있음을 발견하였다.

H3K27me3-특이적 데메틸라제 활성화제

한 측면에서, 본 발명은 공여자 인간 체세포, 수용자 인간 난모세포, 하이브리드 난모세포 (예를 들어, 융합 또는 활성화 전에 공여자 유전 물질을 포함하는 인간 제핵된 난모세포) 또는 인간 SCNT 배아 (즉, 공여자 핵과 제핵된 난모세포의 융합 후)의 핵 또는 세포질을 H3K27me3-특이적 데메틸라제 (Kdm6a, Kdm6b, Kdm6c 등)를 활성화시키는 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는, 인간 SCNT의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법, 조성물 및 키트에 유용한 H3K27me3-특이적 데메틸라제 활성화제는 H3K27me3-특이적 데메틸라제를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나, 인간 H3K27me3-특이적 데메틸라제, 예를 들어, 인간 Kdm6a, Kdm6b, Kdm6c 등의 활성을 증가시키는 작용제이다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법, 조성물 및 키트에 유용한 H3K27me3-특이적 데메틸라제 활성화제는 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작용제이다.

일부 실시양태에서, 작용제는 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c, 또는 인간 SCNT의 효율을 인간 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c를 코딩하는 상응하는 야생형 서열에 비해 유사하거나 더 큰 정도로 증가시키는 그와 적어도 80％ 서열 동일성 (또는 적어도 약 85％, 또는 적어도 약 90％, 또는 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 98％, 또는 적어도 약 99％ 서열 동일성)을 갖는 그의 생물학적 활성 단편 또는 동족체 또는 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 인간 H3K27me3-특이적 데메틸라제 활성화제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 사용하기 위한 H3K27me3-특이적 데메틸라제 활성화제는 임의의 인간 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c 폴리펩티드, 또는 이러한 인간 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 단편으로부터 선택된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용하기 위한 인간 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c 폴리펩티드의 적절한 인간 동족체, 및 이러한 인간 동족체를 코딩하는 핵산을 확인할 수 있음이 본 발명에 포함된다. 일부 실시양태에서, H3K27me3-특이적 데메틸라제 활성화제는 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터로부터 발현된 H3K27me3-특이적 데메틸라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작용제이다.

대안적인 실시양태에서, 본원에 사용하기 위해 포함되는 H3K27me3-특이적 데메틸라제 활성화제는 Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c, 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 합성 변형된 RNA (modRNA)이다. 합성 변형된 RNA (modRNA)는 미국 출원 US2012/03228640; US2009/0286852 및 US2013/0111615 및 미국 특허 8,278,036; 8,691,966; 8,748,089; 8,835,108호에 기재되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 합성 변형된 RNA 분자는 벡터에서 발현되지 않으며, 합성 변형된 RNA 분자는 네이키드 합성 변형된 RNA 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 지질 복합체에 존재하는 적어도 1종의 합성 변형된 RNA 분자를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 합성 변형된 RNA 분자는 적어도 2개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하며, 예를 들어, 적어도 2개의 변형된 뉴클레오시드는 5-메틸시티딘 (5mC), N6-메틸아데노신 (m6A), 3,2'-O-디메틸우리딘 (m4U), 2-티오우리딘 (s2U), 2' 플루오로우리딘, 슈도우리딘, 2'-O-메틸우리딘 (Um), 2'데옥시 우리딘 (2' dU), 4-티오우리딘 (s4U), 5-메틸우리딘 (m5U), 2'-O-메틸아데노신 (m6A), N6,2'-O-디메틸아데노신 (m6Am), N6,N6,2'-O-트리메틸아데노신 (m62Am), 2'-O-메틸시티딘 (Cm), 7-메틸구아노신 (m7G), 2'-O-메틸구아노신 (Gm), N2,7-디메틸구아노신 (m2,7G), N2, N2, 7-트리메틸구아노신 (m2,2,7G), 및 이노신 (I)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 합성 변형된 RNA 분자는 5' 캡, 예컨대 5' 캡 유사체, 예를 들어, 5' 디구아노신 캡을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용하기 위한 합성 변형된 RNA 분자는 5' 트리포스페이트를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용하기 위한 합성 변형된 RNA 분자는 폴리(A) 꼬리, 코작 (Kozak) 서열, 3' 비번역된 영역, 5' 비번역된 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하며, 일부 실시양태에서, 합성 변형된 RNA 분자는 임의로 알칼리성 포스파타제로 처리될 수 있다.

본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 도입하는 데 있어서, 핵산 구축물을 세포 내로 도입하기 위한 본질적으로 임의의 방법이 채용될 수 있다. 핵산을 도입하는 물리적 방법은 구축물을 함유하는 용액의 주사, 구축물에 의해 덮힌 입자에 의한 포격, 핵산의 용액 중에서 세포, 조직 샘플 또는 유기체를 흡인하는 것, 또는 구축물의 존재 하에서의 세포막의 전기천공을 포함한다. 바이러스 입자 내로 패키징된 바이러스 구축물은 세포 내로의 발현 구축물의 효율적인 도입 및 코딩된 단백질의 번역 둘 다를 달성하는 데 사용될 수 있다. 핵산을 세포에 도입하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다른 방법, 예컨대 지질-매개된 운반체 수송, 화학적 매개된 수송, 예컨대 인산칼슘 등이 사용될 수 있다.

세포 내의 발현을 위해, H3K27me3-특이적 데메틸라제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터를 포함하는 DNA 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터가 채용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩된 단백질의 발현은 유도성 프로모터 또는 조건적 발현 시스템에 의해 제어된다. 본 발명의 맥락에서 유용한 프로모터의 예는 테트라시클린-유도성 프로모터 (TRE-타이트를 포함함), IPTG-유도성 프로모터, 테트라시클린 트랜스활성화제 시스템, 및 리버스 테트라시클린 트랜스활성화제 (rtTA) 시스템이다. 구성적 프로모터는 또한 사용될 수 있으며, 세포- 또는 조직-특이적 프로모터도 사용될 수 있다. 많은 프로모터는 이들이 모든 세포 및 조직 유형에서 발현되도록 편재적일 것이다. 특정 실시양태는 시험관내 및 생체내 연구에서 가장 효과적인 조건적 유전자 발현 시스템 중 하나인 테트라시클린-반응성 프로모터를 사용한다.

체세포 핵 전달

체세포 핵 전달 (SCNT)은 예를 들어, 가축 (예를 들어, 소, 말, 양, 염소, 돼지)의 생식적 클로닝에, 또는 바람직한 조직이 세포 대체 요법을 위해 생성되는 치료적 클로닝에 사용될 수 있는 기법이다. 불행하게도, 클로닝된 동물은 부적절한 X-염색체 불활성화로부터 발생되는 특정 결함을 겪는다. 본 발명은 시험관내 수정으로부터 생성된 배아에 대한 생리학적 X 염색체 불활성화를 복원함, 즉, SCNT를 사용하여 생성함으로써 이들 결함을 다룬다.

체세포 핵 전달은 핵 공여자 세포를 얻고, 그 후 이 핵 공여자 세포를 제핵된 수용자 세포, 가장 바람직하게는 제핵된 난모세포 내로 융합시켜 핵 전달 배아를 형성하고, 이 배아를 활성화시키고, 마지막으로 배아를 배양하거나, 이 배아를 모계 숙주 내로 전달하는 것을 포함한다. 핵 전달 동안, 한 세포로부터의 핵 DNA의 완전한 상보체는 제핵된 세포에 도입된다. 핵 전달 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 1991년 2월 19일에 허여된 발명의 명칭이 "소 배아의 증식"인 프라더 (Prather) 등의 미국 특허 제4,994,384호; 1991년 10월 15일에 허여된 발명의 명칭이 "소 핵 이식"인 매시 (Massey)의 미국 특허 제5,057,420호; 1999년 11월 30일에 스티스 (Stice) 등에게 허여된 발명의 명칭이 "배양된 내부 세포 덩이 세포를 사용한 키메라 소 또는 돼지 동물의 생산"인 미국 특허 제5,994,619호; 2000년 1월 19일에 캠벨 (Campbell) 등 및 윌무트 (Wilmut) 등에게 각각 허여된 발명의 명칭이 "핵 전달을 위한 정지 세포 집단"인 영국 특허 제GB 2,318,578호, 제GB 2,331,751호; 2000년 1월 4일에 허여된 발명의 명칭이 "재프로그래밍된 비-배아 소 세포를 사용하여 소를 클로닝하는 방법"인 스트렐켄코 (Strelchenko) 등의 미국 특허 제6,011,197호; 및 발명의 명칭이 "돼지 동물을 클로닝하는 방법"인 미국 특허 출원 일련 번호 09/753,323 (대리인 정리 번호 030653.0026.CIP1, 2000년 12월 28일에 출원됨)을 참조하며, 이들의 각각은 모든 도면, 표 및 도면을 비롯하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 핵 전달은 투명대에 의해 둘러싸이지 않은 난모세포를 사용함으로써 달성될 수 있다.

핵 전달 절차에서, 핵 공여자 세포, 또는 그의 핵은 수용자 세포 내로 도입된다. 수용자 세포는 바람직하게는 난모세포이고, 바람직하게는 제핵된다. 그러나, 본 발명은 부분적으로 난모세포의 핵이 난모세포로부터 물리적으로 추출되지 않는 핵 전달에 관한 것이다. 공여자 세포로부터의 핵 DNA가 세포 분열 동안 복제되는 핵 전달 배아를 확립하는 것이 가능하다. 예를 들어, 문헌 [Wagoner et al., 1996, "Functional enucleation of bovine oocytes: effects of centrifugation and ultraviolet light," Theriogenology 46: 279-284]을 참조한다. 또한, 핵 전달은 1개의 핵 공여자 및 1개 초과의 제핵된 난모세포를 조합함으로써 달성될 수 있다. 또한, 핵 전달은 1개의 핵 공여자, 1개 이상의 제핵된 난모세포, 및 1개 이상의 제핵된 난모세포의 세포질을 조합함으로써 달성될 수 있다. 핵 공여자 세포 및 수용자 세포의 생성된 조합은 "하이브리드 세포"로 지칭될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵 공여자"는 난모세포 내로 전위될 수 있는 핵 DNA를 갖는 임의의 세포, 또는 그의 핵을 지칭한다. 핵 공여자는 세포로부터 단리된 핵일 수 있다. 세포로부터 핵을 단리한 후, 핵을 핵 공여자로서 이용하기 위한 다수의 기법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제4,664,097호, 제6,011,197호, 및 제6,107,543호를 참조하며, 이들의 각각은 모든 도면, 표, 및 도면을 비롯하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 임의의 유형의 세포는 핵 공여자로서 기능할 수 있다. 핵 공여자 세포의 예로는 시험관내에서 또는 생체내에서 2개의 배우자의 결합으로부터 발생한 배아로부터 단리된 배양된 및 비-배양된 세포; 배양된 배아 세포 (예를 들어, 사전-배반포 세포 및 내부 세포 덩이 세포)로부터 발생한 배아 줄기 세포 (ES 세포); 배아로부터 단리된 내부 세포 덩이 세포로부터 발생한 배양된 및 비-배양된 세포; 배양된 및 비-배양된 사전-배반포 세포; 배양된 및 비-배양된 태아 세포; 배양된 및 비-배양된 성체 세포; 배양된 및 비-배양된 원시 배 세포; 배양된 및 비-배양된 배 세포 (예를 들어, 배아 배 세포); 동물로부터 단리된 배양된 및 비-배양된 체세포; 배양된 및 비-배양된 난구 세포; 배양된 및 비-배양된 양막 세포; 배양된 및 비-배양된 태아 섬유모세포 세포; 배양된 및 비-배양된 생식 융기 세포; 배양된 및 비-배양된 분화된 세포; 동기 집단에서의 배양된 및 비-배양된 세포; 비동기 집단에서의 배양된 및 비-배양된 세포; 배양된 및 비-배양된 혈청-기아 세포; 배양된 및 비-배양된 영구 세포; 및 배양된 및 비-배양된 전능성 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321-1329]; [Shim et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 1089-1095]; [Tsung et al., 1995, Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao 28: 173-189]; 및 [Wheeler, 1994, Reprod. Fertil. Dev. 6: 563-568]을 참조하며, 이들의 각각은 모든 도면, 도면, 및 표를 비롯하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 핵 공여자는 이전에 동결되거나 동결보존된 세포일 수 있다.

핵 전달의 프로세스에 의해 제조된 하이브리드 세포는 예를 들어, 생식적 클로닝에 또는 재생적 클로닝에 사용될 수 있다.

SCNT 실험은 성체 분화된 체세포로부터의 핵이 전능한 상태로 재프로그래밍될 수 있음을 나타내었다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 생성된 SCNT 배아는 전능성 또는 배아 줄기 세포 또는 줄기-유사 세포 및 세포 콜로니의 생성을 위해 적합한 시험관내 배양 배지에서 배양될 수 있다. 배아의 배양 및 성숙에 적합한 배양 배지는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 소 배아 배양 및 유지에 사용될 수 있는 공지된 배지의 예로는 햄 (Ham) F-10+10％ 소 태아 혈청 (FCS), 조직 배양 배지 (Tissue Culture Medium)-199 (TCM-199)+10％ 소 태아 혈청, 티로드-알부민-락테이트-피루베이트 (Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate) (TALP), 둘베코 포스페이트 완충 염수 (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) (PBS), 이글 (Eagle) 및 위튼 (Whitten) 배지를 들 수 있다. 난모세포의 수집 및 성숙에 사용되는 가장 통상적인 배지 중 하나는 TCM-199, 및 소 태아 혈청, 신생아 혈청, 발정기 소 혈청, 양 혈청 또는 거세수소 혈청을 비롯한 1 내지 20％ 혈청 보충물이다. 바람직한 유지 배지는 얼 (Earl) 염, 10％ 소 태아 혈청, 0.2 Ma 피루베이트 및 50 ug/ml 겐타미신 술페이트를 갖는 TCM-199를 포함한다. 상기 중 임의의 것은 또한 다양한 세포 유형, 예컨대 과립막 세포, 난관 세포, BRL 세포 및 자궁 세포 및 STO 세포와의 공동-배양을 포함할 수 있다.

특히, 자궁내막의 상피 세포는 착상전 및 착상 기간 동안 백혈병 억제성 인자 (LIF)를 분비한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 배양 배지에의 LIF의 첨가는 SCNT-유래된 배아의 시험관내 발생을 향상시키기 위해 포함된다. 배아 또는 줄기-유사 세포 배양을 위한 LIF의 사용은 미국 특허 제5,712,156호에 기재되었으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

또다른 유지 배지는 본원에 참조로 포함되는 로센크란스, 주니어 (Rosenkrans, Jr.) 등의 미국 특허 제5,096,822호에 기재되어 있다. CR1로 명명된 이 배아 배지는 배아를 지지하는 데 필요한 영양 물질을 함유한다. CR1은 1.0 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 1.0 mM 내지 5.0 mM 범위의 양으로 헤미칼슘 L-락테이트를 함유한다. 헤미칼슘 L-락테이트는 그 상에 혼입된 헤미칼슘 염을 갖는 L-락테이트이다. 또한, 문헌 [Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)] 및 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7844-7848 (1995)]에 논의된 바와 같은 인간 배아 줄기 세포를 배양에서 유지하기 위한 적합한 배양 배지.

일부 실시양태에서, 공급자 세포는 마우스 배아 섬유모세포를 포함할 것이다. 적합한 섬유모세포 공급자 층의 제조를 위한 수단은 이어지는 실시예에 기재되어 있으며, 통상의 기술자의 기술 내에 있다.

배반포-단계 SCNT 배아 (또는 그의 등가물)로부터 ES 세포 (예를 들어, NT-ESC 또는 hNT-ESC)를 유도하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 기법은 SCNT 배아로부터 ES 세포 (예를 들어, hNT-ESC)를 유도하는 데 사용될 수 있으며, 여기서, hNT-ESC를 생성하는 데 사용되는 SCNT 배아는 KDM4 데메틸라제 족의 구성원 및/또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 SUV39h1/SUV39h2의 억제제로 처리되지 않은 SCNT에 비해, 체세포 공여자 세포로부터 공여된 핵 유전 물질에서 감소된 수준의 H3K9me3을 갖는다. hNT-ESC는 발생의 보다 초기 단계 동안 클로닝된 SCNT 배아로부터 유래될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법, 조성물 및 키트를 사용하여 생성된 SCNT 배아로부터 생성된 할구는 유리 피펫을 사용하여 분리되어 전능성 세포를 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 분리는 0.25％ 트립신의 존재 하에서 일어날 수 있다 (Collas and Robl, 43 BIOL. REPROD. 877-84, 1992; Stice and Robl, 39 BIOL. REPROD. 657-664, 1988; Kanka et al., 43 MOL. REPROD. DEV. 135-44, 1996).

특정 실시양태에서, SCNT 배아로부터의 생성된 배반포, 또는 배반포-유사 클러스터는 배아 줄기 세포주, 예를 들어, 핵 전달 ESC (ntESC) 세포주를 얻는 데 사용될 수 있다. 이러한 주는 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)] 및 [Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7544-7848 (1995)]에 의해 보고된 배양 방법에 따라 얻어질 수 있다.

다능성 배아 줄기 세포는 또한 배아의 정상적인 발생에서 출생까지를 방해하지 않고 SCNT 배아로부터 제거된 단일 할구로부터 생성될 수 있다. 2004년 11월 4일에 출원된 미국 출원 제60/624,827호; 2005년 3월 14일에 출원된 제60/662,489호; 2005년 6월 3일에 출원된 제60/687,158호; 2005년 10월 3일에 출원된 제60/723,066호; 2005년 10월 14일에 출원된 제60/726,775호; 2005년 11월 4일에 출원된 제11/267,555호; 2005년 11월 4일에 출원된 PCT 출원 제PCT/US05/39776호를 참조하며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다; 또한 문헌 [Chung et al., Nature, Oct. 16, 2005 (인쇄물에 앞서 전자적으로 공개됨) 및 [Chung et al., Nature V. 439, pp. 216-219 (2006)]을 참조하며, 이들의 각각의 전체 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다). 이러한 경우, SCNT 배아는 다능성 줄기 세포의 생성을 위해 파괴되지 않는다.

본 발명의 한 측면에서, 방법은 연구에서의 및 요법에서의 SCNT 배아로부터 유래된 세포의 이용을 포함한다. 이러한 다능성 줄기 세포 (PSC) 또는 전능성 줄기 세포 (TSC)는 제한 없이, 피부, 연골, 골, 골격근, 심장근, 신장, 간, 혈액 및 혈액 형성, 혈관 전구체 및 혈관 내피, 췌장 베타, 뉴런, 교질, 망막, 내이 모낭, 장, 폐 세포를 비롯한 신체 내의 임의의 세포로 분화될 수 있다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, SCNT 배아, 또는 배반포, 또는 SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, NT-ESC)는 1종 이상의 분화의 유도제에 노출되어 다른 치료적으로 유용한 세포, 예컨대 망막 색소 상피, 조혈 전구체 및 혈관모세포 전구체 뿐만 아니라 외배엽, 중배엽, 및 내배엽의 많은 다른 유용한 세포 유형을 수득할 수 있다. 이러한 유도제는 시토카인, 예컨대 인터류킨-알파 A, 인터페론-알파 A/D, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 인터페론-감마-유도성 단백질-10, 인터류킨-1 내지 17, 각질세포 성장 인자, 렙틴, 백혈병 억제성 인자, 대식세포 콜로니-자극 인자, 및 대식세포 염증성 단백질-1 알파, 1-베타, 2, 3 알파, 3 베타, 및 단핵구 화학주성 단백질 1 내지 3, 6카인, 액티빈 A, 암피레귤린, 안지오게닌, B-내피 세포 성장 인자, 베타 셀룰린, 뇌-유래된 신경영양 인자, C10, 카디오트로핀-1, 섬모 신경영양 인자, 시토카인-유도된 호중구 화학유인물질-1, 에오탁신, 표피 성장 인자, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, 에리트로포이에틴, 에스트로겐 수용체-알파, 에스트로겐 수용체-베타, 섬유모세포 성장 인자 (산성 및 염기성), 헤파린, FLT-3/FLK-2 리간드, 아교 세포주-유래된 신경영양 인자, Gly-His-Lys, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구대식세포 콜로니 자극 인자, GRO-알파/MGSA, GRO-베타, GRO-감마, HCC-1, 헤파린-결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 헤레귤린-알파, 인슐린, 인슐린 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 II, 신경 성장 인자, 뉴로토핀-3,4, 온코스타틴 M, 태반 성장 인자, 플레이오트로핀, 란테스, 줄기 세포 인자, 기질 세포-유래된 인자 1B, 트로모포이에틴, 전환 성장 인자--(알파, 베타 1,2,3,4,5), 종양 괴사 인자 (알파 및 베타), 혈관 내피 성장 인자, 및 골 형태형성 단백질, 호르몬 및 호르몬 길항제, 예컨대 17B-에스트라디올, 부신피질자극 호르몬, 아드레노메둘린, 알파-멜라닌세포 자극 호르몬, 융모막성 고나도트로핀, 코르티코스테로이드-결합 글로불린, 코르티코스테론, 덱사메타손, 에스트리올, 난포 자극 호르몬, 가스트린 1, 글루카곤, 고나도트로핀, L-3,3',5'-트리아이오도티로닌, 황체형성 호르몬, L-티록신, 멜라토닌, MZ-4, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, PEC-60, 뇌하수체 성장 호르몬, 프로게스테론, 프로락틴, 세크레틴, 성 호르몬 결합 글로불린, 갑상선 자극 호르몬, 티로트로핀 방출 인자, 티록신-결합 글로불린, 및 바소프레신의 발현을 변경시키는 효소, 세포외 매트릭스 성분, 예컨대 피브로넥틴, 피브로넥틴의 단백질분해적 단편, 라미닌, 테나신, 트롬보스폰딘, 및 프로테오글리칸, 예컨대 아그레칸, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸, 콘트로이틴 술페이트 프로테오글리칸, 및 신데칸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 유도제는 본 발명의 재프로그래밍된 세포로부터 유래된 분화 세포에 대한 유도성 신호를 제공하는 데 사용되는 한정된 조직으로부터의 세포로부터 유래된 세포 또는 성분을 포함한다. 이러한 유도제 세포는 인간, 비-인간 포유동물, 또는 조류, 예컨대 특이적 병원체-무함유 (SPF) 배아 또는 성체 세포로부터 유래될 수 있다.

할구 배양. 한 실시양태에서, SCNT 배아는 할구를 생성하고, SCNT 배아를 파괴하거나, 다르게는 그들의 생존성을 유의하게 변경시키지 않고, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생성된 SCNT 배아로부터 단일 할구를 단리하기 위해 착상전 유전적 진단 (PGD)에 현재 사용되는 것들과 관련된 시험관내 기법을 이용하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 입증된 바와 같이, 다능성 배아 줄기 (hES) 세포 및 세포주는 배아의 정상적인 발생에서 출생까지를 방해하지 않고 본원에 개시된 바와 같은 SCNT 배아로부터 제거된 단일 할구로부터 생성될 수 있다.

hESC를 유도하는 데 있어서 톰슨 (Thomson) 등 (Thomson et al., Science 282, 1145 (1998))과 함께 "돌리 (Dolly)"의 양 클로닝에서 윌무트 (Wilmut) 등 (Wilmut, et al., Nature 385, 810 (1997)의 발견은 SCNT-배아 또는 환자 자신의 핵으로부터 생성된 SCNT-조작된 세포 덩이로부터 유래된 환자-특이적 hESC의 확립에 기초한 재생적 세포 이식을 위한 상당한 열광을 발생시켰다. 자가 이식을 통해 면역 거부를 회피하는 데 목표를 둔 이 전략은 아마 SCNT에 대한 가장 강한 임상적 근거이다. 마찬가지로, 복잡한 질환-특이적 SCNT-hESC의 유도는 질환 메커니즘의 발견을 가속화할 수 있다. 세포 이식을 위해, 개별적 마우스 자신의 SCNT-유래된 mESC로의 뮤린 SCID 및 PD 모델의 혁신적인 치료는 고무적이다 (Rideout et al., Cell 109, 17 (2002); Barberi, Nat. Biotechnol. 21, 1200 (2003)). 궁극적으로, 폭넓은 조직 적합성을 갖는 SCNT-유래된 줄기 세포의 뱅크를 생성하는 능력은 새로운 난모세포의 계속되는 공급에 대한 필요를 감소시킬 것이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, hNT-ESC)는 치료적 유용성을 나타내기 위해 임의로 분화되고, 이들이 정상적으로 거주하는 조직 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포는 조직 내로 도입될 수 있다. 특정 다른 실시양태에서, SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포는 전신적으로 또는 치료적 유용성이 바람직한 부위로부터 거리를 두고 도입될 수 있다. 이러한 실시양태에서, SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포는 거리를 두고 작용할 수 있거나, 바람직한 부위로 향할 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, SCNT 배아로부터 얻어진 클로닝된 세포, 다능성 또는 전능성 세포는 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 데 이용될 수 있다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하면서 시험관내에서 번식할 수 있는 세포의 단일 세포-유래된 집단의 생성은 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 데 유용하다. 세포-세포 유도는 초기 배아에서의 분화를 지시하는 통상적인 수단이다. 많은 잠재적으로 의학적으로 유용한 세포 유형은 척수 뉴런, 심장 세포, 췌장 베타 세포, 및 최종적인 조혈 세포를 비롯한 정상적인 배아 발생 동안 유도적 신호에 의해 영향을 받는다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하면서 시험관내에서 번식될 수 있는 세포의 단일 세포-유래된 집단은 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 다양한 시험관내, 난자내, 또는 생체내 배양 조건에서 배양되어 바람직한 세포 또는 조직 유형이 될 수 있다.

SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, ntESC)는 임의의 바람직한 분화된 세포 유형을 얻는 데 사용될 수 있다. 이러한 분화된 세포의 치료적 용법은 독보적이다. 본원에서 논의된 바와 같이, 공여자 세포, 또는 수용자 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 SCNT 배아는 본원에서 개시된 바와 같은 방법에 따라 H3K27me3-특이적 데메틸라제로 처리될 수 있다.

대안적으로, 공여자 세포는 장애를 갖는 대상체로부터의 성체 체세포일 수 있으며, 생성된 SCNT 배아는 질환의 동물 모델 또는 질환의 세포 모델을 생성하는 분화 조건 하에서 배양될 수 있는 질환-특이적 다능성 또는 전능성 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 큰 이점은 SCNT의 효율을 증가시킴으로써, 그것이 특히 유도된 다능성 줄기 세포가 아닌 (예를 들어, iPSC가 아닌) 다능성인 동종 또는 동계 ES 세포의 본질적으로 제한없는 공급을 제공한다는 것이다. 이러한 NT-ESC는, 이들이 부분적으로 다능성이 아니며, 그들의 재프로그래밍을 지시하기 위해 바이러스 트랜스진 또는 재프로그래밍 인자의 강제된 발현을 갖지 않기 때문에, iPSC에 비해 이점을 가지며, 이식에 적합하다.

일부 실시양태에서, SCNT로부터 생성된 NT-ESC는 SCNT 배아로부터 얻어진 환자-특이적 다능성이며, 여기서, 공여자 세포는 다능성 줄기 세포 또는 그의 분화된 자손으로 처리되는 대상체로부터 얻어졌다. 따라서, 이는 현재의 이식 방법과 연관된 상당한 문제, 즉, 숙주-대-이식편 또는 이식편-대-숙주 거부 때문에 일어날 수 있는 이식된 조직의 거부를 제거할 것이다. 통상적으로, 거부는 항-거부 약물, 예컨대 시클로스포린의 투여에 의해 방지되거나 감소된다. 그러나, 이러한 약물은 상당한 유해한 부작용, 예를 들어, 면역억제, 발암 특성을 가질 뿐만 아니라 매우 고비용이다. 본 발명은 항-거부 약물, 예컨대 시클로스포린, 이뮬란, FK-506, 글루코코르티코이드, 및 라파마이신, 및 그의 유도체에 대한 필요를 제거하거나, 적어도 크게 감소시킬 것이다.

키트

본 발명은 H3K27me3-특이적 데메틸라제 활성화제 (예를 들어, Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Kdm6a, Kdm6b, 또는 Kdm6c 폴리펩티드, 또는 그의 효소 활성 단편)를 포함하는 키트를 제공한다.

일부 실시양태에서, 키트는 치료 또는 예방 세포 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함하며; 이러한 용기는 박스, 앰풀, 보틀, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층 종이, 금속 호일, 또는 의약을 보유하기에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다.

바람직한 경우, 본 발명의 작용제는 SCNT의 효율을 향상시키는 작용제를 투여하기 위한 지시서와 함께 제공된다. 지시서는 일반적으로 생리학적 X 염색체 불활성화를 향상시키는 조성물의 사용에 관한 정보를 포함할 것이다. 다른 실시양태에서, 지시서는 하기 중 적어도 1종을 포함한다: 치료제의 설명; 신경학적 질환 또는 그의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여량 스케줄 및 투여; 예방책; 경고; 적응증; 반대-적응증; 과량투여 정보; 유해 반응; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참조물. 지시서는 용기 상에 직접적으로 인쇄되거나 (존재하는 경우), 용기에 적용된 표지로서, 또는 용기에 또는 그와 함께 공급되는 별개의 쉬트, 팸플릿, 카드, 또는 폴더로서일 수 있다.

본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면 분자 생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기법을 채용하며, 이는 널리 통상의 기술자의 범위 내에 있다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)]; ["Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)]; ["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)]; ["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)]; ["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에 충분히 설명되어 있다. 이들 기법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 적용가능하며, 따라서, 본 발명을 수행하고 실시하는 데 있어서 고려될 수 있다. 특정 실시양태에 특히 유용한 기법은 이어지는 섹션에서 논의될 것이다.

하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 검정, 스크리닝, 및 치료 방법을 수행하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1: H3K9me3은 양친성 배아에서 Xist 침묵화에 불필요하다

H3K9me3의 Kdm4b-매개된 소실이 양친성 배아에서 Xist 탈억제를 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, Kdm4b mRNA를 시험관내 수정-유래된 배아 내로 주사하였다. 면역염색 분석은 Kdm4b mRNA 주사가 농도-의존적 방식으로 접합자에서 H3K9me3을 효과적으로 고갈시켰음을 확인시켜 주었다 (도 1a). Xist RNA 발현을 평가하기 위해, RNA 형광 계내 혼성화 (FISH) 분석을 4-세포 배아에서 수행하였다. 웅성 및 자성 배아 사이를 구별하기 위해, X 염색체를 Rnf12 유전자좌에 대해 특이적인 프로브를 사용하여 DNA FISH에 의해 동시에 표지하였다. 따라서, 웅성 및 자성 배아의 각각의 할구는 각각 1개 또는 2개의 DNA FISH 신호를 가질 것이다. "주사 없음" 대조군 웅성 배아는 Xist RNA 신호를 나타내지 않았으며, 자성 배아의 대다수는 1개의 RNA 클라우드 또는 스폿 신호를 나타내었다 (도 1b 내지 1d). 유사하게, Kdm4b-주사된 배아는 웅성 또는 자성 배아에서 모계 Xist 발현을 유도하지 않았다 (도 1b 내지 1d). 이론에 구애되지는 않지만, 이는 H3K9me3이 생리학적 양친성 조건 하에서 모계 Xist 침묵화에서 주요한 역할을 하지 않음을 지시한다.

실시예 2: 모계 H3K27me3은 난모세포 및 착상전 배아에서 Xist 를 코팅한다

모계 H3K27me3은 각인 마크로서 기능할 수 있기 때문에 (Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424), Xist 각인에서의 그의 잠재적 관여를 조사하였다. H3K27me3 ChIP-seq (고-처리량 시퀀싱과 조합된 염색질 면역침전 [ChIP]) 데이터 세트의 분석 (Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079)은 Xist가 폭넓은 H3K27me3 도메인으로 코팅되며, 이는 성숙한 난모세포에서 ~450 kb에 걸치고, 난모세포 성장 동안 확립됨을 밝혀내었다 (도 2a). 난모세포 DN아제 I 시퀀싱 (DN아제 I seq) (Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424) 및 DNA 메틸롬 (Kobayashi et al. 2012. PLoS Genet 8: e1002440) 데이터 세트의 분석은 이 전체 H3K27me3 도메인이 낮은 염색질 접근성 및 낮은 DNA 메틸화를 나타냄을 밝혀내었다 (도 2a). 이론에 구애되지는 않지만, 이는 DNA 메틸화에 독립적인 헤테로염색질 도메인의 형성을 시사한다. 수정후 배아의 ChIP-seq 데이터 세트의 분석 (Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079)은 모계 H3K27me3 도메인이 착상전 발생 전반에 걸쳐 유지되지만, 배아 일 6.5 (E6.5) 외배판에서 소실됨을 밝혀내었다 (도 2b). 특히, Xist 내지 Zcchc13에 걸치지만, Tsix 프로모터를 포함하지 않는 상류 ~200-kb 영역은 배반포 배아에서 H3K27me3 풍부화의 모계 대립유전자 편향을 유지한다 (도 2c). 이들 데이터는 모계 Xist 침묵화에서 모계 H3K27me3에 대한 잠재적 역할을 뒷받침한다.

실시예 3. 모계 H3K27me3은 모계 Xist 침묵화의 원인이다

H3K27me3이 모계 Xist 침묵화의 원인인지 여부를 조사하기 위해, H3K27me3을 H3K27me3-특이적 데메틸라제, Kdm6b를 코딩하는 mRNA를 주사함으로써 접합자에서 고갈시켰다 (도 3a). 음성 대조군으로서, 접합자를 촉매 도메인에 점 돌연변이를 갖는 촉매 돌연변이체, Kdm6bMUT로의 주사에 의해 제조하였다 (도 3a; Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424). 외인성 Kdm6b의 일시적 발현에도 불구하고, Kdm6bWT 배아에서의 H3K27me3 수준은 4-세포 및 상실배 단계에서의 Kdm6bMUT 배아의 그것보다 유의하게 더 낮았다 (도 5a 내지 5b).

H3K27me3이 Kdm6bWT-주사된 배아에서 Xist 유전자좌에서 소실되는 지를 확인하기 위해, 초저 투입 천연 ChIP-seq (ULI-NChIP) 분석을 수행하였으며 (Brind'Amour et al. 2015. Nat Commun 6: 6033), 이는 500 내지 2000개의 마우스 배아 줄기 세포를 사용하여 효율적으로 작동하였다 (도 6a). H3K27me3 ULI-NChIP를 Kdm6bWT- 또는 Kdm6bMUT-주사된 상실배 배아로부터의 ~2000개의 할구를 사용하여 수행하였다. 데이터 품질을 Kdm6bMUT-주사된 배아를 공개적 상실배 배아 데이터 세트와 비교함으로써 확인하였다 (도 6b 내지 6d; Liu et al. 2016. Nature 537: 558-562). Kdm6bWT-주사된 배아에서의 H3K27me3 피크의 수는 Kdm6bMUT-주사된 배아의 그것보다 훨씬 더 작았다 (도 6e). 중요하게는, Xist 유전자좌는 Kdm6bWT 배아에서 전체 도메인 전반에 걸쳐 H3K27me3 풍부화의 현저한 감소를 나타낸다 (도 6f). 더욱이, 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP) 정보의 분석은 모계 H3K27me3 도메인이 Kdm6bWT 배아에서 소실되었음을 밝혀내었다 (도 3b).

모계 Xist가 Kdm6bWT-주사된 4-세포 배아에서 탈억제되는지 여부를 조사하기 위해, RNA/DNA FISH 분석을 수행하였다. RNA/DNA FISH 분석은 Kdm6bWT-주사된 웅성의 대다수가 1개의 Xist RNA 클라우드 및 스폿을 나타낸 반면, 모든 Kdm6bMUT-주사된 웅성은 신호를 나타내지 않았음을 밝혀내었다 (도 3c 내지 3d). 더욱이, Kdm6bWT-주사된 자성의 대다수는 2개의 Xist RNA 클라우드 또는/및 스폿을 나타낸 반면, 대부분의 Kdm6bMUT-주사된 자성은 1개의 클라우드를 나타내었다 (도 3c, 3e). 이들 결과는 Xist 유전자좌에서의 모계 H3K27me3의 소실이 4-세포 단계에서 모계 Xist 탈억제를 유도하였음을 입증한다.

실시예 4. H3K27me3의 소실은 모계 X-염색체 불활성화 (XCI)를 유도한다

모계 Xist 발현이 상실배 단계까지 계속되는지 여부를 조사하기 위해 (도 4a), RNA/ DNA FISH 분석을 수행하였다. 현저하게, Kdm6bWT-주사된 웅성 및 자성 배아의 대다수는 각각 1개 및 2개의 RNA 클라우드를 나타낸 반면, 대부분의 Kdm6bMUT-주사된 웅성 및 자성 배아는 각각 없는 및 1개의 RNA 클라우드를 나타내었으며 (도 4b 내지 4d), 이는 재활성화된 Xist가 지속함을 지시한다. Xist는 Rnf12 과발현에 의해 상향-조절될 수 있지만 (Tan et al. 2016. Proc Natl Acad Sci 113: 3197-3202), RT-qPCR 분석은 Kdm6bWT-매개된 Xist 탈억제가 Rnf12 과발현에 기인할 가능성을 제외하고, Kdm6bWT-주사된 배아에서 Rnf12 상향-조절의 증거를 발견하지 않았다 (도 7).

모계 Xist 발현이 모계 XCI를 초래하는지 여부를 결정하기 위해 (도 4a), RNA 시퀀싱 (RNA-seq) 분석을 초기 배반포 단계 하이브리드 마우스 배아에 대해 생물학적 중복실험으로 수행하였다 (도 8a). SNP 정보의 분석은 Xm-연관된 유전자의 조사를 허용하였으며, 이는 Xm-연관된 유전자의 발현 수준 (그러나 상염색체 유전자의 그것은 아님)이 Kdm6bWT-주사된 배아에서 유의하게 하향-조절되었음을 밝혀내었다 (도 4e). 일치하게, X-연관된 유전자의 모계 대립유전자 발현 편향 [Mat/ (Mat + Pat)]은 Kdm6bWT-주사된 배아에서 유의하게 손상되었지만, 이는 여전히 >50％였다 (도 8b). 이들 데이터는 모계 XCI가 Kdm6bWT-주사된 배아에서 부계 XCI보다 더 온건한 수준에서 일어남을 입증한다. 개별적 X-연관된 유전자의 보다 면밀한 조사는 대부분의 유전자가 Kdm6bWT-주사된 배아에서 하향-조절된 반면 (도 8c), 각인된 XCI를 모면하는 것으로 공지된 유전자 (Borensztein et al. 2017. Nat Struct Mol Biol 24: 226-233)는 변화되지 않았음 (도 8d)을 확인시켜 주었다. 이론에 구애되지는 않지만, 이는 Kdm6b-매개된 모계 XCI가 생리학적 XCI를 재현할 수 있음을 시사한다.

함께, 본원에 기재된 결과는 H3K27me3이 Xist의 각인 마크로서 기능한다는 증거를 제공한다. Xist 유전자좌에서의 모계 H3K27me3의 도메인-기재 조절은 매력적인 관찰이며, 중요한 질문을 제기한다. 예를 들어, H3K27me3 도메인의 경계는 난자형성 동안 어떻게 한정되는가? Xist 및 Zcchc13에 걸치는 도메인의 첫번째 절반 (~200 kb)은 어떻게 배반포 배아에서 모계 대립유전자-특이적 H3K27me3 풍부화를 유지하는가? 특히, 이 ~200-kb 영역은 위상 연관 도메인을 형성하는 것으로 보이며 (Giorgetti et al. 2014. Cell 157: 950-963), 이는 염색질 경계를 조절하는 데 있어서 단백질, 예컨대 CTCF의 잠재적 관여를 암시한다. 흥미롭게도, 이 도메인은 상염색체 내로의 그의 삽입이 각인된 XCI를 재현하는 트랜스진과 매우 중첩된다 (Okamoto et al. 2005. Nature 438: 369-373). 이론에 구애되지는 않지만, 이는 폴리콤 (Polycomb) 군 복합체를 유인하는 코어 요소가 영역에 존재하고, 난자형성 동안 각인 확립에 기여할 수 있다는 가능성을 제기한다.

결론적으로, 본 연구는 따라서 H3K27me3-의존성 각인된 유전자의 새로운 구성원으로서 Xist를 확인할 뿐만 아니라 (Inoue et al. 2017), XCI로부터 Xm을 보호하는 데 있어서 H3K27me3-의존성 게놈 각인의 생물학적 중요성을 입증한다.

상기 기재된 결과는 하기 물질 및 방법으로 얻어졌다.

마우스 난모세포의 수집

모든 동물 연구는 하바드 메디칼 스쿨 (Harvard Medical School)에서의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 수행되었다. 난모세포 수집 및 시험관내 수정의 절차는 이전에 기재되었다 (Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424). 이 연구에서 SNP 분석에 사용된 하이브리드 배아는 B6D2F1/J((BDF1) 난모세포 및 PWK 정자 (잭슨 래버러토리 (Jackson Laboratory), 003715)의 시험관내 수정에 의해 얻었다.

mRNA 제조 및 주사

Kdm6b mRNA의 구축 및 제조 및 수정된 난모세포 내로의 미세주사는 이전에 기재되었다 (Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424). Kdm4b 구축물을 그의 cDNA 앰플리콘을 pcDNA3.1-Flag-폴리(A)83 플라스미드 내로 클로닝함으로써 생성하였다. mRNA를 mMES- SAGE mMACHINE T7 울트라 (Ultra) 키트 (라이프 테크놀로지스 (Life technologies))로 합성하고, 염화리튬 침전에 의해 정제하고, 뉴클레아제-무함유수로 용해시켰다. Kdm6b ^WT 및 Kdm6b ^MUT 의 주사된 mRNA의 농도는 1800 ng/μL이고, Kdm4b의 그것은 1000 또는 2600 ng/μL였다.

FISH를 위한 프로브

Xist RNA를 위한 프로브를 Cy3-dCTP (지이 헬스케어 (GE Healthcare), PA53021)를 갖는 닉 (Nick) 번역 시약 키트 (애보트 몰리큘라 (Abbott Molecular), 07J00-001)를 사용함으로써 제조하였다. 주형 DNA는 전장 마우스 Xist 유전자를 코딩하는 플라스미드 (애드진 (Addgene), 26760)였다 (Wutz and Jaenisch. 2000. Mol Cell 5: 695-705). DNA FISH를 위한 프로브를 그린 (Green)-dUTP를 갖는 동일한 키트 (애보트 몰리큘라, 02N32-050)를 사용하여 제조하였다. 주형 DNA는 Rnf12 유전자좌를 함유하는 BAC 클론 (RP23-36C20)이었다 (Fukuda et al. 2015. Development 142: 4049-4055). 형광 프로브를 5 μg의 Cot-1 DNA (라이프 테크놀로지스), 5 μg의 청어 정자 DNA (써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific)), 및 2.5 μg의 효모 tRNA (써모 피셔 사이언티픽, AM7119)로 에탄올-침전시킨 후, 20 μL의 포름아미드 (써모 피셔 사이언티픽, 17899)로 용해시켰다. 프로브를 4℃에서 저장하였다. 사용하기 전에, 프로브 (각각 0.75 μL)를 0.75 μL의 Cot-1 DNA/포름아미드 및 2.25 μL의 4× SSC/20％ 덱스트란 (밀리포어 (Millipore) S4030)과 혼합하였다. 프로브 혼합물을 80℃에서 30분 동안 가열한 후, 37℃ 인큐베이터에 옮겼다 ("사전어닐링된 프로브").

전조직 RNA/DNA FISH

4-세포 또는 상실배 배아를 수정후 46시간 또는 78시간 (hpf)에서 0.5％ 트리톤 (Triton) X-100을 함유하는 PBS 중 2％ 파라포름알데히드 (PFA)에서 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 0.1％ BSA/PBS로 3회 세척 후, 배아를 0.02％ 트리톤 X-100을 함유하는 0.1 N HCl로 4℃에서 15분 동안 처리하였다. 0.1％ BSA/2× SSC로 3회 세척 후, 배아를 유리 디쉬 (일렉트론 마이크로스코피 사이언스 (Electron Microscopy Science), 705430-30)에서 일련의 10％, 20％, 및 50％ 포름아미드/2× SSC에서 인큐베이션하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 미네랄 오일로 덮고, 80℃에서 30분 동안 가열한 후, 37℃에서 >30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 배아를 4.5 μL의 "사전어닐링된 프로브" 내로 옮기고, 또다른 유리 디쉬 상의 미네랄 오일로 덮고, 37℃에서 >24시간 동안 인큐베이션하였다. 배아를 42℃ 사전가온된 0.1％ BSA/2× SSC로 세척하고, 마지막 액적에서 30분 동안 방치하고, DAPI를 갖는 벡타쉴드 (VectaShield) (벡터 래버러토리스 (Vector Laboratories))에서 유리 슬라이드 상에 실장하였다. 형광을 레이저-주사 공초점 현미경 (자이스 (Zeiss), LSM800) 하에서 검출하였다.

전조직 면역염색

면역염색 및 정량화의 절차는 이전에 기재되었다 (Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424).

모계 대립유전자-편향된 H3K27me3 도메인의 확인

내부 세포 덩이 (ICM)에서 H3K27me3 ChIP-seq에 대한 100-염기-쌍 (bp) 빈에서의 RPKM (백만개 맵핑된 리드 당 킬로베이스 당 리드) 값을 포함하는 BED 파일은 GSE76687로부터의 것이었다 (Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079). BED 파일은 2개의 모 대립유전자에 대한 모계- 또는 부계-함유 RPKM 값을 표지하였으며, 대립유전자 리드를 총 리드 수에 대해 정규화하였다. "베드툴스 메이크윈도우스 (bedtools makewindows)"를 사용하여 전체 mm9 게놈에 대한 1-kb 빈을 생성하고, 각각의 빈에 대한 RPKM 값을 "베드툴스 맵 (bedtools map)"에 의해 계산하였다. 모든 빈을 1의 신호 컷오프 및 4의 배수 변화 컷오프를 사용하여 "신호 없음", "이중대립유전자성", 및 "모계-편향된"의 3개의 범주로 분류하였다. 슬라이딩 창 접근법을 사용하여 "모계-편향된" H3K27me3 빈에 대해 풍부화된 도메인을 확인하였다. 사용된 기준은 하기와 같았다: 20 kb의 창 내에서, "모계-편향된" 빈의 최소 수는 3이고, "모계-편향된" 빈의 백분율은 "이중대립유전자성" 빈보다 더 컸다. 중첩된 창을 "베드툴스 머지 (bedtools merge)"에 의해 합쳤다. 총 5986개의 도메인을 게놈에서 확인하였다.

ULI-NChIP

78 hpf에서, 군 당 ~110개의 상실배 배아를 산 티로드 (Tyrode) 용액 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich))으로 간단히 처리하여 투명대를 제거하고, 0.2％ BSA/PBS로 세척하고, 1.5-mL 튜브에 옮겼다. ULI-NChIP를 H3K27me3 항체 (디아게노드 (Diagenode), C15410069)를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 (Brind'Amour et al. 2015. Nat Commun 6: 6033) 하기 변형으로 수행하였다. 첫째, 본 발명자들은 아젠코트 앰퓨어 (Agencourt Ampure) XP 비드 대신 베크만 (Beckman) SPRI셀렉트 비드 (베크만 쿨터 (Beckman Coulter))를 사용하였다. 둘째, 시퀀싱 라이브러리를 일루미나 (Illumina)를 위한 NEB넥스트 울트라 (NEBNext Ultra) II DNA 라이브러리 제조 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs))를 사용하여 제조하였다. 셋째, PCR 증폭을 카파 하이파이 (Kapa Hifi) 핫 스타트 레디 믹스 (카파 바이오시스템스 (Kapa Biosystems))를 사용하여 수행하였다. 마지막으로, 크기 선택을 수행하지 않았다. 투입 샘플에 대해, 10％ 부피의 염색질 용해물을 취하고, 라이브러리 구축 및 시퀀싱에 사용하였다. 라이브러리의 정량화 및 시퀀싱은 이전에 기재되었다 (Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424).

ULI-NChIP의 데이터 분석

Kdm6bMUT 및 Kdm6bWT 샘플 사이의 정규화를 위해, MAnorm (Shao et al. 2012. Genome Biol 13: R16)과 유사한 전략을 사용하였다. 먼저, Kdm6bMUT 및 Kdm6bWT 샘플 사이에 공통 피크를 확인하였다. 다음으로, 모든 샘플을 공통 피크 내의 각각의 샘플에 대한 RPKM 값에 기초하여 최고 커버리지 샘플에 대해 정규화하였다. SNP-특이적 리드를 라이브러리 당 총 고유하게 맵핑된 리드에 대해 정규화하고, 대립유전자 당 SNP-특이적 리드의 합계에 기초하여 최고-커버리지 대립유전자에 대해 추가로 정규화하였다.

역전사 및 실시간 PCR 분석

Kdm6b-주사된 배아를 46 hpf (4-세포), 60 hpf (8-세포), 및 78 hpf (상실배)에서 수집하였다. 역전사 및 실시간 PCR 분석의 절차는 이 연구에서 역전사에 대해 무작위 프라이머의 사용을 제외하고는, 이전에 기재되었다 (Inoue and Zhang. 2014. Nat Struct Mol Biol 21: 609-616). 실시간 PCR에 사용된 프라이머 서열은 하기와 같았다: 18S-F (5'-TTG ACGGAAGGGCACCACCAG-3'), 18S-R (5'-GCACCACCACCCACGGA ATCG-3'), Rnf12-F (5'-TTTGTCGCAGGGCAGTCTTA-3') 및 Rnf12-R (5'-GTTTGCCCATCACTATTCCAGC-3

RNA-seq 및 데이터 분석

96 hpf에서의 배반포 배아를 산 티로드 용액으로 간단히 처리하고, 0.2％ BSA/PBS에 의해 세척하고, PCR 튜브에서 -80℃에서 저장하였다. 군 당 40 내지 46개의 배아를 풀링하고, RNA-seq에 사용하였다. RNA-seq 라이브러리를 cDNA 증폭 후 넥스테라 (Nextera) XT DNA 라이브러리 제조 키트 (일루미나)를 사용한 것을 제외하고는 이전에 기재된 바와 같이 [(Inoue et al. 2017) 제조하였다.

통계적 분석

통계적 분석을 R (http://www.r-project.org)로 실행하였다. 피어슨 (Pearson) R 계수를 디폴트 파라미터를 갖는 "cor" 기능을 사용하여 계산하였다. 도 8b에 대해, 만-휘트니 U-검정을 R 기능 "wilcox.test"로 수행하였다.

코드 가용성

주문제작된 파이프라인을 사용하여 하이브리드 배아로부터의 시퀀싱 데이터의 정렬을 SNP 정보에 기초하여 그들의 모 기원으로 분할하였다. 코드는 https://github.com/lanjiangboston/UniversalSNPsplit에서 이용가능하다.

데이터 가용성

본원에서 생성된 ChIP-seq 및 RNA-seq 데이터 세트는 유전자 발현 옴니버스 (Gene Expression Omnibus) 데이터베이스에 수탁 번호 GSE103714 하에 기탁되어 있다. GV 난모세포에 대한 WGBS 데이터 세트는 http://www.nodai-genome.org/mouse.html?lang=en으로부터 다운로드하였다 (Kobayashi et al. 2012. PLoS Genet 8: e1002440). H3K27me3 ChIP-seq 데이터 세트는 GSE76687로부터 다운로드하였다 (Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079). 난모세포 DN아제 I-seq 데이터 세트는 GSE92605로부터의 것이었다 (Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424). BAM 파일 및 ENCODE 데이터의 피크 파일은 https://www. encodeproject.org/files/ENCFF001KDT로부터 다운로드하였다. 상실배 배아 H3K27me3 ChIP-seq 데이터 세트는 GSE73952로부터의 것이었다 (Liu et al. 2016. Nature 537: 558-562).

다른 실시양태

상기 설명으로부터, 변화 및 변형이 이를 다양한 용법 및 조건에 채택하기 위해 본원에 기재된 본 발명에 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 실시양태는 또한 하기 청구범위의 범위 내에 있다.

본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소의 목록의 나열은 열거된 요소의 임의의 단일 요소 또는 조합 (또는 하위조합)으로서 그 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 실시양태의 나열은 임의의 단일 실시양태로서 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과 조합으로 그 실시양태를 포함한다.

이 명세서에 언급된 모든 특허, 간행물 및 수탁 번호는 각각의 독립적인 특허, 간행물 및 수탁 번호가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENERATING PHYSIOLOGICAL X CHROMOSOME INACTIVATION <130> 167705.015900/PCT <140> PCT/US2018/042890 <141> 2018-07-19 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1401 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Ser Cys Gly Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Phe Gly Asp Glu Glu Lys Lys Met Ala Ala Gly Lys Ala Ser Gly 20 25 30 Glu Ser Glu Glu Ala Ser Pro Ser Leu Thr Ala Glu Glu Arg Glu Ala 35 40 45 Leu Gly Gly Leu Asp Ser Arg Leu Phe Gly Phe Val Arg Phe His Glu 50 55 60 Asp Gly Ala Arg Thr Lys Ala Leu Leu Gly Lys Ala Val Arg Cys Tyr 65 70 75 80 Glu Ser Leu Ile Leu Lys Ala Glu Gly Lys Val Glu Ser Asp Phe Phe 85 90 95 Cys Gln Leu Gly His Phe Asn Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Pro Lys Ala 100 105 110 Leu Ser Ala Tyr Gln Arg Tyr Tyr Ser Leu Gln Ser Asp Tyr Trp Lys 115 120 125 Asn Ala Ala Phe Leu Tyr Gly Leu Gly Leu Val Tyr Phe His Tyr Asn 130 135 140 Ala Phe Gln Trp Ala Ile Lys 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gggagccagc ccagccaggg ctttgggaac agcttgggca 720 actgtacgag tcagagcacg atagtgagga ggccacacgc tgctaccaca gcgcccttcg 780 atacggagga agcttcgctg agctggggcc ccgcattggc cgactgcagc aggcccagct 840 ctggaacttt catactggct cctgccagca ccgagccaag gtcctgcccc cactggagca 900 agtgtggaac ttgctacacc ttgagcacaa acggaactat ggagccaagc ggggaggtcc 960 cccggtgaag cgagctgctg aacccccagt ggtgcagcct gtgcctcctg cagcactctc 1020 aggcccctca ggggaggagg gcctcagccc tggaggcaag cgaaggagag gctgcaactc 1080 tgaacagact ggccttcccc cagggctgcc actgcctcca ccaccattac caccaccacc 1140 accaccacca ccaccaccac caccacccct gcctggcctg gctaccagcc ccccatttca 1200 gctaaccaag ccagggctgt ggagtaccct gcatggagat gcctggggcc cagagcgcaa 1260 gggttcagca cccccagagc gccaggagca gcggcactcg ctgcctcacc catatccata 1320 cccagctcca gcgtacaccg cgcacccccc tggccaccgg ctggtcccgg ctgctccccc 1380 aggcccaggc ccccgccccc caggagcaga gagccatggc tgcctgcctg ccacccgtcc 1440 ccccggaagt gaccttagag agagcagagt tcagaggtcg cggatggact ccagcgtttc 1500 accagcagca accaccgcct gcgtgcctta cgccccttcc cggccccctg gcctccccgg 1560 caccaccacc agcagcagca gtagcagcag cagcaacact ggtctccggg gcgtggagcc 1620 gaacccaggc attcccggcg ctgaccatta ccaaactccc gcgctggagg tctctcacca 1680 tggccgcctg gggccctcgg cacacagcag tcggaaaccg ttcttggggg ctcccgctgc 1740 cactccccac ctatccctgc cacctggacc ttcctcaccc cctccacccc cctgtccccg 1800 cctcttacgc cccccaccac cccctgcctg gttgaagggt ccggcctgcc gggcagcccg 1860 agaggatgga gagatcttag aagagctctt ctttgggact gagggacccc cccgccctgc 1920 cccaccaccc ctcccccatc gcgagggctt cttggggcct ccggcctccc gcttttctgt 1980 gggcactcag gattctcaca cccctcccac tcccccaacc ccaaccacca gcagtagcaa 2040 cagcaacagt ggcagccaca gcagcagccc tgctgggcct gtgtcctttc ccccaccacc 2100 ctatctggcc agaagtatag acccccttcc ccggcctccc agcccagcac agaaccccca 2160 ggacccacct cttgtacccc tgactcttgc cctgcctcca gcccctcctt cctcctgcca 2220 ccaaaatacc tcaggaagct tcaggcgccc ggagagcccc cggcccaggg tctccttccc 2280 aaagaccccc gaggtggggc cggggccacc cccaggcccc ctgagtaaag ccccccagcc 2340 tgtgccgccc ggggttgggg agctgcctgc 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ggacagtggg actgagcgac tgctgccccc 3240 cgcacaggcc aaggaggagg ctggcggggt ggcggcagtg tcaggcagct gtaagcggcg 3300 acagaaggag catcagaagg agcatcggcg gcacaggcgg gcctgtaagg acagtgtggg 3360 tcgtcggccc cgtgagggca gggcaaaggc caaggccaag gtccccaaag aaaagagccg 3420 ccgggtgctg gggaacctgg acctgcagag cgaggagatc cagggtcgtg agaagtcccg 3480 gcccgatctt ggcggggcct ccaaggccaa gccacccaca gctccagccc ctccatcagc 3540 tcctgcacct tctgcccagc ccacaccccc gtcagcctct gtccctggaa agaaggctcg 3600 ggaggaagcc ccagggccac cgggtgtcag ccgggccgac atgctgaagc tgcgctcact 3660 tagtgagggg ccccccaagg agctgaagat ccggctcatc aaggtagaga gtggtgacaa 3720 ggagaccttt atcgcctctg aggtggaaga gcggcggctg cgcatggcag acctcaccat 3780 cagccactgt gctgctgacg tcgtgcgcgc cagcaggaat gccaaggtga aagggaagtt 3840 tcgagagtcc tacctttccc ctgcccagtc tgtgaaaccg aagatcaaca ctgaggagaa 3900 gctgccccgg gaaaaactca acccccctac acccagcatc tatctggaga gcaaacggga 3960 tgccttctca cctgtcctgc tgcagttctg tacagaccct cgaaatccca tcacagtgat 4020 ccggggcctg gcgggctccc tgcggctcaa 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 ttgacggaag ggcaccacca g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 gcaccaccac ccacggaatc g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 tttgtcgcag ggcagtctta 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 gtttgcccat cactattcca gc 22

Claims (23)

1. 체세포 핵 전달(SCNT)에 의해 생성된 비-인간 포유동물 배아에서 모계 X 염색체의 각인된 X-불활성화-특이적 전사(Xist) 유전자좌에서의 모계 H3K27me3을 고갈시키고, 모계 Xist 탈억제 및 모계 X 염색체 불활성화(XCI)를 유도하는 방법으로서,
   상기 방법은, SCNT를 통해 생성된 비-인간 포유동물 배아에 H3K27me3-특이적 데메틸라제 Kdm6b 폴리펩티드 또는 Kdm6b 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 주사하는 것;
   비-인간 포유동물 배아에서 (i) 모계 H3K27me3의 소실 및 (ii) Kdm6b 폴리펩티드 또는 Kdm6b 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 주사되지 않은 배아에 비해 주사된 비-인간 포유동물 배아에서 35-60 % 초과의 X-연관된 유전자의 모계 대립유전자 발현 편향을 유도함으로써 모계 XCI를 통한 생리학적 XCI를 재현하는 것; 및
   부계 X 염색체 불활성화에 비해 모계 X 염색체 불활성화를 정상화시키는 것
   을 포함하는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 비-인간 포유동물 배아에 H3K27me3-특이적 데메틸라제 Kdm6b 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 주사하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 비-인간 포유동물 배아에 약 1000 내지 2000 ng/μL의 mRNA를 주사하는 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 비-인간 포유동물 배아에 1800 ng/μL의 mRNA를 주사하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, X 염색체가 체세포로부터 유래된 비-인간 포유동물 공여자 핵에 존재하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 공여자 핵이 비-인간 포유동물의 난모세포 또는 배아 줄기 세포 내로 전달되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 H3K27me3-특이적 데메틸라제의 효소 활성 단편을 코딩하는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 포유동물 발현 벡터에 존재하는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 포유동물 발현 벡터가 H3K27me3-특이적 데메틸라제의 구성적 또는 유도성 발현을 지시하는 프로모터를 포함하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, X-염색체 각인을 모면하는 유전자의 발현을 유의하게 변화시키지 않는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상염색체 유전자 발현을 유의하게 변화시키지 않는 방법.
12. 제1항에 있어서, X-연관된 유전자의 모계 대립유전자 발현 편향이 약 50％ 초과인 방법.
13. 제1항에 있어서, 비-인간 포유동물 배아가 초기 비-인간 포유동물 배반포 단계 배아인 방법.
14. 제1항에 있어서, 비-인간 포유동물 배아가 성체 비-인간 포유동물 체세포로부터 유래되는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 체세포가 비-인간 포유동물 대상체로부터 얻어지는 것인 방법.
16. 제14항에 있어서, 비-인간 포유동물 배아로부터의 세포를 배양하여 비-인간 포유동물 대상체 내로의 이식에 적합한 조직을 얻는 것을 더 포함하는 방법.
17. 제1항의 방법에 따라 생성된 비-인간 포유동물 배반포.
18. 제16항의 방법에 따라 생성된 세포.
19. 제16항의 방법에 따라 얻어진 조직.
20. 제17항의 비-인간 포유동물 배반포를 비-인간 포유동물 숙주 자궁 내로 착상시킴으로써 생성된 클로닝된 비-인간 포유동물 유기체.
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