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KR102728275B1 - 가지 친 구조의 이온화 지질을 포함한 지질 나노입자 제형 및 이의 용도 - Google Patents

가지 친 구조의 이온화 지질을 포함한 지질 나노입자 제형 및 이의 용도 Download PDF

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KR102728275B1
KR102728275B1 KR1020230156562A KR20230156562A KR102728275B1 KR 102728275 B1 KR102728275 B1 KR 102728275B1 KR 1020230156562 A KR1020230156562 A KR 1020230156562A KR 20230156562 A KR20230156562 A KR 20230156562A KR 102728275 B1 KR102728275 B1 KR 102728275B1
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lipid
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임성은
정혜인
김도근
김시현
김유진
여진아
전지향
황윤호
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이화여자대학교 산학협력단
대한민국(질병관리청 국립보건연구원장)
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Abstract

본 발명은 가지 구조의 지질을 포함하고 있는 이온화 지질 및 이를 활용한 지질 나노입자 제형 그리고 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 이온화 지질은 헤테로 아민 구조에 가지 친 지질 구조를 포함한 생분해성 지질 물질이며, 이를 활용한 지질나노입자는 고효율로 핵산 약물 등을 전달할 수 있어 mRNA 백신 및 치료제 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

가지 친 구조의 이온화 지질을 포함한 지질 나노입자 제형 및 이의 용도 {Lipid nanoparticle formulation comprising of ionizable lipid having branched structure and their use of}
본 발명은 가지 친 구조의 이온화 지질을 포함한 지질 나노입자 제형 및 이의 용도에 관한 것이다.
의약 제제 산업에 있어 약물의 부작용을 줄이고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 약물전달시스템 (DDS; Drug Delivery System)은 신약개발과 맞먹는 경제적 이익을 창출할 수 있는 성공 가능성이 큰 고부가가치 핵심기술로서 효율적인 약물투여로 환자 치료의 질을 높이는데 그 목적이 있다.
siRNA, mRNA 등의 핵산은 생체 내에서 특정 단백질의 발현을 조절할 수 있는 물질로, 암, 유전병, 감염병, 자가면역 질환 등의 치료에 중요한 도구로 각광받고 있다. 핵산은 음이온을 띠는 분자량이 큰 물질로, 세포 내로 직접 전달이 어렵고, 혈액 내에서 효소에 의해 쉽게 분해되므로 이를 극복하기 위한 연구들이 많이 진행되고 있다.
현재까지 핵산을 세포 내로 운반하는 방법으로 양전하 지질 또는 중합체와 섞어 운반하는 방법 (각각 지질-DNA 접합체 (lipoplex) 및 폴리머-DNA 접합체 (polyplex)라 명명함)이 주로 사용되고 있다. 지질-DNA 접합체는 핵산과 결합하여 세포 내로 핵산을 잘 전달시켜 세포수준에서 많이 사용되고 있으나, 생체 내에서는 국부적으로 주사 시 많은 경우 체내에서 염증을 유발시키며, 혈관 내 주사 시 주로 1차 통과 기관들인 폐, 간, 비장 등과 같은 조직에 축적되는 단점이 있다.
초기에 개발된 이온화 지질 1,2- dilinoleoyl-3-dimethylaminopropane (DLinDAP)은 낮은 유전자 전달 효율로 치료효과를 보기 위해선 다량의 siRNA를 필요로 하였다. 이후 아민 헤드 그룹과 링커의 구조 변화를 통해 약 300종의 이온화 지질을 마우스 혈액응고인자 FVII모델을 통해 스크리닝 한 결과 0.005mg/kg의 매우 낮은 ED50값을 갖는 최적화된 이온화 지질(Dlin-MC3-DMA)을 선별하게 되었다[Acc. Chem. Res. 2019]. 이는 기존 이온화지질 대비 약 1000배 이상의 효과를 보이는 수치이며 2018년 FDA에 세계 최초로 승인을 받은 유전성 아밀로이드증(hATTR)의 siRNA 치료제인 Onpattro®의 전달체로 사용되었다.
전세계적으로 팬데믹 상태인 코로나 19를 극복하기 위해 모더나와 화이자에서 최초로 mRNA 지질나노입자(Lipid nanoparticle) 백신이 개발되었다. 현재 미국, 이스라엘 등 여러 국가에서 성공적으로 백신 접종이 진행되었다. 모더나와 화이자의 코로나 백신엔 mRNA 지질나노입자가 사용된다. 모더나 백신의 이온화 지질은 SM-102 (Arbutus) {{9-Heptadecanyl 8-{(2-hydroxyethyl)[6-oxo-6-(undecyloxy)hexyl]amino}octanoate}} 이고, 화이자 백신의 이온화지질은 ALC-0315 (Genevant) {[(4-hydroxybutyl)azanediyl]di(hexane-6,1-diyl) bis(2-hexyldecanoate)} 이다.
이온화지질은 체내의 pH에 따라 이온화 정도가 달라지는 삼차 아민 헤드 그룹과 긴 탄화수소 꼬리가 링커로 연결된 구조로 pH에 따라 달라지는 이온화 정도로 인해 핵산 약물을 둘러쌀 수 있다. 이렇게 구성된 이온화지질은 다른 구성요소들과 함께 제형화 과정을 거쳐 핵산 약물을 내부에 봉입한 고체 지질 나노입자 (Solid lipid nanoparticle) 구조를 형성하게 된다. 이온화지질은 pH가 낮은 제형화 과정에서 양이온을 띠며 핵산 약물 주위를 둘러싸게 되고 생리적인 pH에서는 중성 표면전하를 띠며 소수성 상호작용에 의해 지질 나노입자를 형성하게 된다. 내포작용을 통해 엔도솜 내로 도입된 지질 나노입자는 엔도솜 pH가 낮아지며 다시 양이온을 띠게 되고 엔도솜 막의 음이온성 지질과 상호작용하며 엔도솜 탈출을 통해 둘러싼 핵산 약물을 세포 속으로 방출할 수 있게 된다.
종래의 선행기술로서 대한민국 공개특허 제10-2020-0040586호에는 6원의 헤테로고리 아민 및 1,2-에폭시도데칸(1,2-epoxydodecane)이 결합된 이온화 가능한 지질을 제조하여 생체 내 약물 전달을 위한 지질 나노입자로 제조함이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 공개특허 제10-2022-0103968호, 제10-2022-0103968호 등에는 다양한 이온화 가능한 지질 및 지질 나노입자 조성물이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 약물의 봉입률이 우수하며 목적하는 기관 또는 세포에 음이온성 약물, 핵산 등을 효율적으로 전달할 수 있는 신규 입자를 개발하고자 예의 노력한 결과, 가지 친 구조의 이온화 지질을 포함한 지질나노입자를 제조하고, 상기 지질 나노입자가 핵산 약물을 높은 효율로 봉입할 수 있고, 봉입된 핵산에 의해 면역능을 유도할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 가지 친 구조의 이온화 가능한 지질 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이온화 가능한 지질 화합물을 포함하는 지질 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물의 약물 전달 시스템으로서의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 약물 전달 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 이온화 가능한 지질 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이온화 가능한 지질 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-10알킬, -Y 또는 -C1-10알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-10알킬, -Y 또는 -C1-10알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이거나, 서로 연결되어 2 개의 N 원소를 갖는 4 내지 8원 헤테로사이클로알킬을 형성하고,
다만, R1 내지 R4 중 적어도 하나 이상은 -C1-10알킬-NRARB이고,
RA 및 RB는 각각 독립적으로 -H, -C1-10알킬 또는 -Y이고,
n은 0 내지 6 중 어느 하나의 정수이며,
최소한 하나의 -Y 치환기가 존재하고,
Y는 하기 [화학식 2]으로 표시되고,
복수의 Y가 존재하는 경우 Y는 서로 다를 수 있으며,
[화학식 2]
o, p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 12 중 어느 하나의 정수이다.
또한, 본 발명은 이온화 가능한 지질 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산 또는 이의 조합을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물의 약물 전달 시스템으로서의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 약물 전달 방법을 제공한다.
본 발명은 가지 구조의 지질을 포함하고 있는 이온화 지질 및 이를 활용한 지질 나노입자 제형 그리고 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 이온화 지질은 헤테로 아민 구조에 가지 친 지질 구조를 포함한 생분해성 지질 물질이며, 이를 활용한 지질나노입자는 고효율로 핵산 약물 등을 전달할 수 있어 mRNA 백신 및 치료제 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 가지 친 구조 포함하는 신규한 이온화 가능한 지질의 합성과정을 나타낸 도이다.
도 2는 이온화 가능한 지질의 합성을 확인하기 위한 MS 스펙트럼 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 Hela 세포에서 이온화 가능한 지질 나노입자의 발광 유전자 발현 수준 및 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 HEK 293 세포에서 이온화 가능한 지질 나노입자의 발광 유전자 발현 수준 및 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 EW244-E-7 지질 나노입자 투여 후 마우스 혈중 AST 수준을 확인한 그래프이다.
도 6은 EW244-E-7 지질 나노입자 투여 후 마우스 혈중 AST 수준을 확인한 그래프이다.
도 7은 마우스에 정맥주사한 mFluc이 봉입된 EW221-E-7 지질 나노입자의 생체 발광을 확인하는 도이다.
도 8은 마우스에 정맥주사한 mFluc이 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자의 생체 발광을 확인하는 도이다.
도 9는 마우스에 근육주사한 mFluc이 봉입된 EW221-E-7 지질 나노입자의 생체 발광을 확인하는 도이다.
도 10은 마우스에 근육주사한 mFluc이 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자의 생체 발광을 확인하는 도이다.
도 11은 마우스에 hEPO mRNA가 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자를 주사한 후, EPO 및 MCP-1의 발현 수준을 확인한 그래프이다.
도 12는 마우스에 hEPO mRNA가 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자를 주사한 후, MCP-1의 발현 수준을 확인한 그래프이다.
도 13는 마우스에 COVID-19 spike mRNA가 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자를 주사한 후, 중화항체 역가를 확인한 그래프이다.
도 14은 마우스에 COVID-19 spike mRNA가 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자를 주사한 후, IFN-gamma 유도능을 확인한 그래프이다.
도 15는 마우스에 in-silico spike mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 주사한 후, 우한주(S)에 대한 중화항체 역가를 확인한 그래프이다.
도 16는 마우스에 in-silico spike mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 주사한 후, 인도주(Delta)에 대한 중화항체 역가를 확인한 그래프이다.
도 17는 마우스에 in-silico spike mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 주사한 후, 오미크론(BA.5)에 대한 중화항체 역가를 확인한 그래프이다.
도 18는 마우스에 in-silico spike mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 주사한 후, IFN-gamma 유도능을 확인한 그래프이다.
도 19은 마우스에 RSV를 암호화하는 mRNA가 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자를 주사한 후, IgG　항체가를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 이온화 가능한 지질 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-10알킬, -Y 또는 -C1-10알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-10알킬, -Y 또는 -C1-10알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이거나, 서로 연결되어 2 개의 N 원소를 갖는 4 내지 8원 헤테로사이클로알킬을 형성하고,
다만, R1 내지 R4 중 적어도 하나 이상은 -C1-10알킬-NRARB이고,
RA 및 RB는 각각 독립적으로 -H, -C1-10알킬 또는 -Y이고,
n은 0 내지 6 중 어느 하나의 정수이며,
최소한 하나의 -Y 치환기가 존재하고,
Y는 하기 [화학식 2]으로 표시되고,
복수의 Y가 존재하는 경우 Y는 서로 다를 수 있으며,
[화학식 2]
o, p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 12 중 어느 하나의 정수이다.
본 발명의 다른 구체예로서,
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-6알킬, -Y 또는 -C1-6알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-6알킬, -Y 또는 -C1-6알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이거나, 서로 연결되어 2 개의 N 원소를 갖는 4 내지 8원 헤테로사이클로 알킬고리를 형성하고,
다만, R1 내지 R4 중 적어도 하나 이상은 -C1-6알킬-NRARB이고,
RA 및 RB는 각각 독립적으로 -H, -C1-6알킬 또는 -Y이고,
n은 0 내지 4 중 어느 하나의 정수이며,
2 내지 6개의 -Y 치환기가 존재하고,
Y는 하기 [화학식 2]으로 표시되고,
각각의 Y는 서로 다를 수 있으며,
[화학식 2]
o 및 p 각각 독립적으로 1 내지 9 중 어느 하나의 정수이고,
q는 1 내지 5 중 어느 하나의 정수이다.
본 발명의 다른 구체예로서,
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬, -Y 또는 -C1-4알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬, -Y 또는 -C1-4알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이거나, 서로 연결되어 2 개의 N 원소를 갖는 5 내지 6원 헤테로사이클로 알킬고리를 형성하고,
다만, R1 내지 R4 중 적어도 하나 이상은 -C1-4알킬-NRARB이고,
RA 및 RB는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬 또는 -Y이고,
n은 1 내지 2 중 어느 하나의 정수이며,
3 내지 6개의 -Y 치환기가 존재하고,
Y는 하기 [화학식 2]으로 표시되고,
각각의 Y는 서로 다를 수 있으며,
[화학식 2]
o 및 p 각각 독립적으로 1 내지 9 중 어느 하나의 정수이고,
q는 1 내지 5 중 어느 하나의 정수이다.
본 발명의 다른 구체예로서,
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬, -Y 또는 -C1-4알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬, -Y 또는 -C1-4알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이거나, 서로 연결되어 2 개의 N 원소를 갖는 5 내지 6원 헤테로사이클로 알킬고리를 형성하고,
다만, R1 내지 R4 중 적어도 하나 이상은 -C1-4알킬-NRARB이고,
RA 및 RB는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬 또는 -Y이고,
n은 1 내지 2 중 어느 하나의 정수이며,
3 내지 6개의 -Y 치환기가 존재하고,
Y는 하기 [화학식 2]으로 표시되고,
각각의 Y는 서로 다를 수 있으며,
[화학식 2]
o 및 p 각각 독립적으로 3 내지 9 중 어느 하나의 정수이고,
q는 1 내지 3 중 어느 하나의 정수이다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 화합물은 하기에서 선택될 수 있다:
;
;
.
상기 이온화 가능한 지질은 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질을 의미하고, 예를 들면, 주변 pH에 따라 전하상태가 변하는 지질이다.
상기 이온화 지질은 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(양으로 하전) 될 수 있고, pKa 초과의 pH에서는 실질적으로 중성일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이온화 지질은 지질과 유사한 특성을 갖는 이온화 가능한 화합물로서 약물(예를 들면, 음이온성 약물 및/또는 핵산)과의 정전기적 상호작용을 통하여 상기 약물이 지질 나노입자 내에 높은 효율로 봉입되도록 하는 역할을 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 이온화 지질은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 이온화 지질은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 포함한다.
본 발명의 가지 친 구조의 이온화 가능한 지질 화합물은 세포막으로 이동하여 세포막의 구조를 무너뜨려 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 촉진시킬 수 있고, 또는 가지 구조로 인해 에스터의 가수분해 혹은 효소 분해 속도를 늦출 수 있어, 약물 전달 효율이 우수하다.
또한, 본 발명은 이온화 가능한 지질 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다.
상기 지질 나노입자는 인지질, 콜레스테롤, 및 지질-PEG (polyethyleneglycol) 접합체를 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 인지질은 지질 나노입자 내에서 이온화 가능한 지질 및 약물이 상호작용하여 형성된 코어를 감싸서 보호하는 역할을 수행하며, 타겟 세포의 인지질 이중층과 결합하여 약물의 세포 내 전달시 세포막 통과 및 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 용이하게 한다.
상기 인지질은 인지질은 일 예에 따른 지질 나노입자의 융합을 촉진할 수 있 는 인지질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면, 디올레일포스파티딜 에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디올레오일포스파티 딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(POPE), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine](DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine] 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 구체적으로 상기 인지질은 DOPE이고, 이를 포함하는 지질 나노입자는 mRNA 전달에 효과적(mRNA에 대한 약물 전달 효율이 우수)일 수 있다.
상기 콜레스테롤은 지질 나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 한다.
상기 지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체, 지질-PEG, PEG-lipid, 또는 lipid-PEG는 지질과 PEG가 컨쥬게이트된 형태를 지칭하는 것으로, 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 중합체가 결합된 지질을 의미한다. 상기 지질-PEG 접합체는 지질 나노입자 내에서 나노입자의 혈청 내 입자 안정성에 기여하며, 나노입자 간 응집을 막는 역할을 수행한다. 또한, 지질-PEG 접합체는 핵산의 생체 내 전달시 분해효소로부터 핵산을 보호하여 핵산의 체내 안정성을 강화시키며, 나노 입자 내 봉입된 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다.
상기 지질-PEG 접합체에서 PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 예를 들면, 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 상기 에스테르-비함유 링커 모이어티는 아미도 (-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카르보닐(-C(O)-), 카르바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 다이설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH2CH2C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 다이설파이드뿐만 아니라 이들의 조합(예컨대, 카르바메이트 링커 모이어티 및아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 에스테르-함유 링커 모이어티는, 예를 들면 카르보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트에스테르, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 지질-PEG 접합체 내 지질은 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있는 지질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 상기 지질 나노입자의 다른 구성요소인 인지질 및/또는 콜레스테롤 또한 사용할 수 있다. 구체적으로, 지질-PEG 접합체 내 지질은 세라미드(세라마이드)(ceramide), 디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol, DMG), 석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol, s-DAG), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 또는 콜레스테롤일 수 있고, 보다 구체적으로 C16-PEG2000 세라마이드이다.
상기 지질-PEG 접합체 내 PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억
제하는 능력을 가지고 있어서 지질 나노입자의 체내 순환시간을 증가시키며, 나노입자 간의 응집현상을 막는 역할을 한다. 또한, 지질-PEG 접합체는 생체 내에서 스텔스 (stealth) 기능을 나타내어 나노입자의 분해를 방지할 수 있다
상기 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 : 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PEG 접합체를 15 내지 35 : 15 내지 35 : 40 내지 60 : 0.1 내지 5 의 몰비, 바람직하게는 25 내지 40 : 10 내지 25 : 40 내지 60 : 0.5 내지 3의 몰비, 더 바람직하게는 25 내지 30: 17 내지 22: 50 내지 55 : 1 내지 2의 몰비로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
상기 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 핵산은 메신저 리보핵산(mRNA), 소간섭리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), 앱타머(aptamer), 운반 리보핵산(tRNA), 가이드 리보핵산(gRNA), 단일 가이드 리보핵산(sgRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA, 및 DNAzyme로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 일 수 있다.
상기 약물 전달용 조성물은 상기 지질 나노입자 내부에 음이온성 약물 및/또는 치료용 핵산 등의 생리활성물질이 봉입되어 있는 것일 수 있으며, 음이온성 약물 및/또는 핵산 등의 생리활성물질이 안정적이고 높은 효율로 봉입되어 상기 전달용 조성물에 의해 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 상기 지질 나노입자 내부에 봉입되는 약물의 종류를 치료 목적에 따라 다양하게 조절할 수 있는 장점이 있다.
상기 지질 나노입자는 음이온성 약물 및/또는 핵산이 (지질 나노입자의) 내부에 봉입된 것일 수 있다. 음이온성 약물 및/또는 핵산이 (지질 나노입자의 내부에) 봉입된 지질 나노입자에 대한 것은 전술한 지질 나노입자에 대한 것과 동일하다.
상기 지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질 및 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)의 중량비는 1 내지 20 : 1, 바람직하게는 1 내지 15 : 1, 1 내지 10 : 1, 더욱 바람직하게 7.5 내지 10 : 1 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물 전달용 조성물은 질병의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로서 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 구체적으로 피내, 피하, 근육내, 안구내, 관절내, 심실내, 척수강내, 구강 전달, 정맥내, 기관내, 복강내, 비강내, 자궁내 전달, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 전달 경로에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 예에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물의 약물 전달 시스템으로서의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질 나노입자 및 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 약물 전달 방법을 제공하는 것이다.
상기 대상체는 제한없이 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지, 래트 및 마우스를 포함하는 모든 포유동물을 포함한다. 상기 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있으며, 구체적으로 피내, 피하, 근육내, 안구내, 관절내, 심실내, 척수강내, 구강 전달, 정맥내, 기관내, 복강내, 비강내, 자궁내 전달, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예 및 실험예에서 헤테로 아민 구조에 생분해성 작용기를 도입한 이온화 가능한 지질을 합성하고 (도 1 참조), 이온화 가능한 지질이 잘 합성되었음을 확인하였다 (도 2 참조). 또한, 합성한 이온화 가능한 지질에 콜레스테롤, 인지질, 및 지질-PEG 접합체를 용해시키고, 지질과 mRNA를 10:1 부피비로 혼합하여 핵산이 봉입된 지질 나노입자를 제조하였다. 제조된 핵산이 봉입된 지질 나노입자는 약물 방출이 우수한 입자 크기를 나타내었고, 입자가 균일하였으며, 약물 봉입률도 우수함을 확인하였다.
다음으로, mFluc이 봉입된 지질 나노입자의 발광을 측정하여 세포 내 핵산 전달 효율이 우수함과 세포 독성이 없음을 확인하였다 (도 3 및 도 4 참조). 이와 더불어 지질 나노입자를 마우스에게 투여하여 동물에게 간 독성을 유발하지 않음을 확인하였다 (도 5 및 도 6 참조). 또한, 마우스에 mFluc이 봉입된 지질 나노입자를 정맥 주사하여 지질 나노입자가 간으로 전달됨을 확인(도 7 및 도 8 참조)하였고, 근육 주사하여 지질 나노입자가 주사부위에 전달됨을 확인함 (도 9 및 도 10 참조)으로써 생체 내 약물 전달에 적합함을 알 수 있었다. 또한, 마우스에 hEPO mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 전달하여 생체 내에서의 단백질 발현에 적합하고 초기 면역 생성능이 우수함을 확인하였다 (도 11 및 도 12 참조). 이와 더불어, 마우스에 COVID-19 mRNA 또는 세포호흡기융합 바이러스를 암호화하는 mRNA 가 봉입된 지질 나노입자를 전달하여, 중화항체 역가, IFN-gamma 분비, IgG 역가 수준을 증가시킴을 확인함으로써 (도 13 내지 도 19 참조), 지질 나노입자가 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도함을 확인하였다.
상기의 결과들로부터 본 발명의 가지 친 구조의 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자는 고효율로 핵산 유전자 치료제와 백신 등을 전달할 수 있어 지질 나노입자 매개 mRNA 백신, 유전자 치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 1> 이온화 가능한 지질의 합성
1-1. 이온화 가능한 지질의 합성
헤테로 아민 구조에 생분해성 작용기를 도입하여 가지 친 구조의 이온화 가능한 지질을 합성하였다.
구체적으로, DCM 용매에 3-octanol당 9-Bromononanoic acid, DIC (1.5 당량), DMAP (0.2 당량)을 첨가하고, 25 ℃에서 밤새 반응시켰다(도 1). 이후 CombiFlash column을 이용하여 Hexane/Ethyl Acetate (5:1 v/v 비율)에서 정제하였다. 용매를 증발시키고, 생성물을 에탄올 (ethanol)에 녹인 후, DIPEA (1 당량), 하기 표 1의 화학식을 가진 아민 (0.3당량)을 넣고 25 ℃에서 3일 동안 반응시켰다. 이후 CombiFlash column을 이용하여 DCM/MeOH (9:1 v/v 비율)에서 정제하였다. 이에 따라, 다양한 아민 헤드 그룹과 에스터 결합을 포함한 새로운 이온화 가능한 지질을 수득하였다. 수득한 이온화 가능한 지질은 아민의 종류에 따라 EW221-E-7, EW244-E-7, EW246-E-7로 명명하였다.
명칭 아민 이온화 가능한 지질
221
244
246
1-2. 합성된 이온화 가능한 지질의 확인
상기 실시예 1-1에서 합성한 이온화 가능한 지질을 확인하기 위하여, 핵자기공명 분석 (NMR　spectroscopy)을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1-1에서 합성된 이온화 가능한 지질(EW244-E-7) 5 ㎍을 CDCl3(sigma, USA) 0.5㎖에 희석하여 100mmole 농도가 되도록 준비하였다. 이후 400MHz NMR 전용 튜브에 0.5㎖씩 넣고 상부를 막은 후 파라필름으로 실링하여 Agilent 400MHZ FT-NMR(Agilent, USA)을 이용하여 NMR spectra을 얻었다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, EW244-E-7의 각 작용기를 나타내는 신호가 포화된 것을 알 수 있었다.
또한, 합성한 이온화 가능한 지질(EW244-E-7)을 식별하기 위해 질량분석법(mass spectrometry,　MS)을 수행하였다.
구체적으로, 이온화 가능한 지질은 0.5ppm 이하 농도로 에탄올에 희석하여 Agilent Technologies사 (Palo Alto,USA)의 6230 LC/MS로 분리관은 Agilent Technologies사 Zorbax SB-C18(100 mmХ2.1 mm i.d., 3.5 μm)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, EW244-E-7 이온화 가능한 지질의 측정된 질량 대 전하 비율(m/z)과 계산된 질량 대 전하 비율가 거의 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
화학식 계산된 m/z 측정된 m/z
C57H111N3O6 933.8476 933.8550
상기 결과로부터 이온화 가능한 지질이 잘 합성된 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> 지질 나노입자의 제조
2-1. 핵산이 봉입된 지질 나노입자의 제조
상기 실시예 1-1에서 합성한 이온화 가능한 지질 (EW244-E-7), 인지질 (DOPE) (Avanti, 미국), 콜레스테롤 (Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≥99%, sigma, 한국), 및 지질-PEG 접합체 (C16-PEG2000 세라마이드 (Avanti, 미국)를 에탄올에 26.5:20:52:1.5의 몰비로 용해시켰다 (표 3). mRNA는 10mM 시트르산나트륨 (Sodium citrate, sigma, 한국) 버퍼에 용해시켰다. 이온화 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및 지질-PEG가 용해된 에탄올 및 시트르산 버퍼를 각각 1:3의 부피비로 혼합하여, 12㎖/min의 유속으로 미세 유체 혼합 장치 (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada)를 통해 혼합하여, 핵산이 봉입된 지질 나노입자 (LNP)를 제조하였다.
몰비 (%) EW244-E-7 지질 나노입자
이온화 지질 (EW244-E-7) 26.5
인지질 (DOPE) 20
콜레스테롤 52
지질-PEG (ceramide C16 PEG) 1.5
중량비 EW244-E-7 지질 나노입자
지질/mRNA 10
2-2. 핵산이 봉입된 지질 나노입자의 물리화학적 특성 확인
2-2-1. 입자의 크기 측정
상기 실시예 2-1에서 합성한 mRNA가 봉입된 지질 나노입자의 크기를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 합성한 EW244-E-7 지질 나노입자에 포함된 Firefly luciferase mRNA(mFluc, 서열번호 1)의 농도가 1㎍/㎖가 되도록 PBS를 사용하여 희석하고, Malvern Zetasizer Nano(Malvern Instruments, UK)에서 동적 광산란 (Dynamic　Light Scattering, DLS)을 사용하여 지질 나노입자의 지름, 다분산도 (PDI; polydispersity index), 및 표면 전하 (zeta potential)를 측정하였다.
그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, EW244-E-7 지질 나노입자는 약물 방출이 우수한 입자 크기를 나타내었고, 입자가 균일한 것을 알 수 있었다.
2-2-2. 약물 봉입률 측정
핵산 약물 봉입률(encapsulation efficacy) 측정하기 위해 Ribogreen assay를 수행하였다.
구체적으로, Ribogreen 분석 (Quant-iT™ RiboGreen® RNA, Invitrogen)을 위해, 핵산 약물을 봉입한 지질 나노입자를 96 웰 플레이트에서 RNA의 최종 농도가 4 ~ 7 ㎍/㎖이 되도록 1xTE 완충액 50㎕로 희석하였다. Triton-X를 처리하지 않은 그룹(Triton-x LNP(-))은 1xTE 버퍼 50㎕를 첨가하고, Triton-X를 처리한 그룹(Triton-X LNP(+))은 2% Triton-X 버퍼 50 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 10분간 인큐베이션하여, Triton-X로 지질 나노입자를 분해하여 캡슐화된 핵산을 방출시켰다. Ribogreen 시약 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. Triton LNP(-)와 Triton LNP(+)의 형광 강도(FL)는 Infinite® 200 PRO NanoQuant(Tecan)에서 파장 대역폭(exitation : 485nm, emission : 528nm)으로 측정하였다. 약물 봉입률 (캡슐화 효율, %)은 다음과 같이 계산하였다.
약물 봉입률(%)=(Triton LNP(+)의 형광도 - Triton LNP(-)의 형광도)/(Triton LNP(+)의 형광도) X 100
그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, EW244-E-7 지질 나노 입자가 높은 효율로 약물을 봉입할 수 있음을 확인하였다.
EW244-E-7 지질 나노입자
지름 (nm) 92.17
PDI 0.131±0.06
표면 전하 (mV) -3.14~-3.92
약물 봉입률 (%) 91.4
<실험예 1> 지질 나노입자의 세포 내 핵산 전달 및 세포 독성 확인
실시예 2-1에서 제조한 mFluc이 봉입된 지질 나노입자를 이용하여 세포 내 핵산 전달 효율 및 세포 독성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, mFluc이 봉입된 지질 나노입자를 Hela 세포 또는 HEK293 세포에 20ng 처리 후, 24시간 째에 발광(luminescence)을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, Hela 세포에서 EW244-E-7 지질 나노입자가 다른 지질 나노입자와 비교하여 높은 발현 효과를 나타내었다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, HEK293 세포에서는 EW221-E-7 및 EW244-E-7 지질 나노입자의 높은 발현 효과를 확인하였다. 또한, EW221-E-7 및 EW244-E-7 지질 나노입자의 독성이 거의 없음을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 지질 나노입자의 간 독성 확인
실시예 2-1에서 제조한 mFluc이 봉입된 지질 나노입자를 마우스에 투여하여 동물 내 독성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
AST (aspartate aminotransferase, 아스파테이트 아미노기 전이효소) 및 ALT (alanine aminotransferase, 알라닌 아미노기 전달효소)은 간 세포성 질환이나 간염과 같은 질환의 유무를 측정할 수 있는 수치로서, 보통은 혈액 중에 낮은 농도로 존재하지만 간 세포가 손상받으면 방출되어 혈액 내 농도가 상승할 수 있다. 따라서 간에 대한 독성 확인을 위한 지표로 이용될 수 있다.
구체적으로, mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 7주령 C57BL/6 마우스에 mRNA 기준 2 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하였다. 투여로부터 24시간 후, 채혈하여 혈액 내 AST 및 ALT 수준을 측정하였다. 대조군으로서, 모더나 백신의 이온화 지질인 SM-102 및 화이자 백신의 이온화지질인 ALC-0315을 사용하였다.
Injection (2 mg/kg) AST (mean ± SD, U/L) ALT (mean ± SD, U/L)
PBS 51.75 ± 18.63 21.25 ± 1.89
SM-102 287.75 ± 121.81 223.25 ± 142.59
ALC-0315 144.75 ± 82.25 109.50 ± 100.06
244-BC 136.00 ± 19.00 50.67 ± 6.66
그 결과, 표6, 도 5, 및 도 6에 나타난 바와 같이, EW244-E-7 지질 나노입자를 투여한 마우스의 경우, 모더나의 SM-102 또는 화이자의 ALC-0315와 비교하여 낮은 수준의 간 독성이 나타났다. 이는 EW244-E-7 지질 나노입자는 높은 안전성을 지님을 시사한다.
<실험예 3> 지질 나노입자의 생체 내 발현 확인
3-1. 정맥 주사를 통한 지질 나노입자 전달
먼저, mFluc이 봉입된 지질 나노입자를 제조하여, 물리화학적 특성을 확인하였다.
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, mFluc이 봉입된 EW221-E-7 및 EW244-E-7 지질 나노입자의 크기가 약물 전달에 효율적이며, 입자가 균일하고, 약물 봉입률이 우수함을 확인하였다.
EW221-E-7 지질 나노입자 EW244-E-7 지질 나노입자
Hit 7.60 ×107 5.72 ×107
크기 88.29nm 99.47nm
PDI 0.227 0.177
약물 봉입률 60.6% 87.1%
다음으로, 마우스에 mFluc이 봉입된 지질 나노입자를 정맥주사를 통해 전달 후, 생체발광(bioluminescence)을 확인하여 생체 내 약물 전달 효율을 확인하였다.
구체적으로, mFluc이 봉입된 EW221-E-7 및 EW244-E-7 지질 나노입자 2ug을 7주령 C57BL/6 마우스에 정맥 주사한 후, 3시간 뒤에 루시페린(luciferin) 0.25 mg/kg을 복강 투여하여 IVIS(PerkinElmer, USA) 장비를 통해 생체발광을 확인하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 대부분의 EW221-E-7 및 EW244-E-7 지질 나노입자가 간으로 전달되는 것을 확인하였다.
상기의 결과는 지질 나노입자를 정맥으로 투여하여 생체 내 약물 전달이 가능함을 시사한다.
3-2. 근육 주사를 통한 지질 나노입자 전달
먼저, mFluc이 봉입된 지질 나노입자를 제조하여, 물리화학적 특성을 확인하였다.
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, mFluc이 봉입된 EW221-E-7 및 EW244-E-7 지질 나노입자의 크기가 약물 전달에 효율적이며, 입자가 균일하고, 약물 봉입률이 우수함을 확인하였다.
EW221-E-7 지질 나노입자 EW244-E-7 지질 나노입자
Hit 7.60 ×107 5.72 ×107
크기 88.29nm 99.47nm
PDI 0.227 0.177
약물 봉입률 60.6% 87.1%
다음으로, 마우스에 mFluc이 봉입된 지질 나노입자를 근육주사를 통해 전달 후, 생체발광을 확인하여 생체 내 약물 전달 효율을 확인하였다.
구체적으로, mFluc이 봉입된 EW221-E-7 및 EW244-E-7 지질 나노입자 2ug을 7주령 C57BL/6 마우스에 근육 주사한 후, 3시간 뒤에 루시페린(luciferin) 0.25 mg/kg을 복강 투여하여 IVIS(PerkinElmer, USA) 장비를 통해 생체발광을 확인하였다.
그 결과, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 대부분의 EW221-E-7 및 EW244-E-7 지질 나노입자가 주사 부위에 전달되는 것을 확인하였다.
상기의 결과는 지질 나노입자를 근육으로 투여하여 생체 내 약물 전달이 가능함을 시사한다.
<실험예 4> 지질 나노입자의 초기 면역 생성능 확인
먼저 hEPO (Human EPO) mRNA (서열번호 2)가 봉입된 지질 나노입자를 제조하였고 대조군으로서 모더나 백신의 이온화지질인 SM-102에도 동일한 mRNA를 봉입한 후, 물리화학적 특성을 비교하였다(표 9).
EW244-E-7 SM-102
약물 봉입률 95.9 95.8
크기 (nm) 77.88 52.18
PDI 0.072 0.088
hEPO mRNA가 봉입된 나노 지질입자를 마우스에 전달한 후, 혈중 인간 EPO 및 MCP-1의 농도를 측정하여 초기 단백질 발현 및 초기 면역 생성능을 확인하였다.
구체적으로는, hEPO mRNA가 봉입된 지질 나노입자 0.5 mg/kg를 7주령 Balb/c 마우스에 정맥 주사하였다. 6시간 후 채혈하여 혈청을 확보하였고 hEPO ELISA 키트 및 MCP-1 ELISA 키트를 이용하여 hEPO 및 MCP-1을 정량분석하였다. 대조군으로서 모더나 백신의 이온화지질인 SM-102를 이용하였다.
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 혈청 내 hEPO 농도는 EW244-E-7과 SM-102를 투여하였을 때 모두 유사한 수준으로 높게 관찰되었고, EPO에 의해 발현 유도되는 MCP-1은 SM-102에 비해 EW244-E-7을 투여하였을 때 더 높게 관찰되었다.
상기의 결과는 EW244-E-7 지질 나노입자가 단백질 발현 능력이 높고 초기 면역 생성능이 뛰어나다는 것을 시사한다.
<실험예 5> 지질 나노입자를 이용한 면역생성능 확인
5-1. 코로나 바이러스에 대한 면역 유도능 확인
먼저, COVID-19 spike mRNA (서열번호 3)가 봉입된 지질 나노입자를 제조하여, 물리화학적 특성을 확인하였다. COVID-19 spike mRNA는 서울대학교로부터 제공받았으며, 양성 대조군으로 ALC-0315을 사용하였다.
그 결과, 표 10에 나타난 바와 같이, COVID-19 spike mRNA가 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자의 크기가 약물 전달에 효율적이며, 입자가 균일하고, 약물 봉입률이 우수함을 확인하였다.
ALC-0315 지질 나노입자 EW244-E-7 지질 나노입자
1차 투여 크기 88.29nm 99.47nm
PDI 0.227 0.177
약물 봉입률 60.6% 87.1%
2차 투여 크기 47.83nm 59.65nm
PDI 0.157 0.108
약물 봉입률 52.1% 96.3%
다음으로, COVID-19 spike mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 마우스에 전달 후, 중화항체 역가와 IFN-gamma 수준을 측정하였다.
구체적으로, mRNA 0.25mg/kg을 7주령 Balb/c 마우스에 1차 근육 주사하였다. 1차 접종 3주 후 2차 접종 동일하게 실시하였다. 2차 접종 3주 후 채혈하여 확보한 혈청과 추출한 비장을 이용하여 각각 SARS-CoV-2에 대한 중화항체 역가와 IFN-gamma 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, EW244-E-7 지질 나노입자가 양성대조군인 ALC-0315와 비교하여 비슷한 중화항체 역가를 나타냄을 확인하였다. 또한 도 14에 나타난 바와 같이, EW244-E-7 지질 나노입자에서 펩타이드 농도가 증가함에 따라 IFN-gamma 분비가 증가함을 확인하였다.
상기의 결과는 EW244-E-7 지질 나노입자가 체액성 및 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있음을 시사한다.
5-2. COVID 19 범용 백신의 면역 유도능 확인
먼저, in-silico spike (서열번호 4) mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 제조하였다. 그리고 상기 COVID-19 mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 마우스에 전달한 후, 중화항체 역가 및 IFN-gamma 수준을 측정하였다.
구체적으로, mRNA 0.25mg/kg을 7주령 Balb/c 마우스에 1차 근육 주사하였다. 1차 접종 3주 후 2차 접종 동일하게 실시하였다. 2차 접종 3주 후 채혈하여 확보한 혈청과 추출한 비장을 이용하여 각각 SARS-CoV-2에 대한 중화항체 역가와 IFN-gamma 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 15 내지 도 17에 나타난 바와 같이, EW244-E-7 지질 나노입자를 이용하여 접종한 마우스는 우한주(S), 인도주(Delta), 및 오미크론(BA.5)에 대해, 즉 모든 COVID-19주에 대해 비슷한 수준의 중화항체가를 형성하는 것을 확인하였다. 또한, 도 18에 나타난 바와 같이, IFN-gamma 분비가 높게 확인되어 T 세포 반응이 활발히 일어남을 확인하였다.
상기의 결과는 EW244-E-7 지질 나노입자가 체액성 및 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있음을 시사하고 다양한 COVID-19 주에 대해 범용성을 갖을 수 있음을 시사한다.
5-3. 세포호흡기융합 바이러스에 대한 면역 유도능 확인
먼저, 세포호흡기융합 바이러스(RSV)를 암호화하는 mRNA(서열번호 5)가 봉입된 지질 나노입자를 제조하여, 물리화학적 특성을 확인하였다.
그 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, RSV를 암호화하는 mRNA가 봉입된 EW244-E-7 지질 나노입자의 크기가 약물 전달에 효율적이며, 입자가 균일하고, 약물 봉입률이 우수함을 확인하였다.
EW244-E-7 지질 나노입자
1차 투여 크기 55.49nm
PDI 0.136
약물 봉입률 90.0%
2차 투여 크기 97.90nm
PDI 0.010
약물 봉입률 93.8%
다음으로, RSV를 암호화하는 mRNA가 봉입된 지질 나노입자를 마우스에 전달 후, IgG 역가를 측정하였다.
구체적으로, mRNA 0.5mg/kg을 7주령 Balb/c 마우스에 1차 근육 주사하였다. 1차 접종 2주 후 2차 접종 동일하게 실시하였다. 2차 접종 1주 후 채혈하여 확보한 혈청을 이용하여 RSV에 대한 중화항체가를 측정하였다. 양성대조군[(+) ctrl.]은 rAd/3xGmFcm이라는 아데노 바이러스 벡터 기반의 백신을 사용하였고, 음성대조군[(-) ctrl.]은 백신을 접종하지 않았다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 2차 접종 이후, EW244-E-7 지질 나노입자는 양성 대조군에 비해 IgG 역가가 높게 나타남을 확인하였다.
상기의 결과는 EW244-E-7 지질 나노입자의 세포호흡기융합 바이러스에 대한 면역유도능이 우수함을 시사한다.
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Claims (15)

  1. 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이온화 가능한 지질 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]

    R1 은 -Y 또는 -C1-10알킬-NRARB로부터 선택된 어느 하나이고,
    R2 는 -C1-10알킬 또는 -C1-10알킬-NRARB이고,
    R3 는 -Y이고,
    R4 는 -C1-10알킬이거나,
    R3 및 R4는 서로 연결되어 2 개의 N 원소를 갖는 4 내지 8원 헤테로사이클로알킬을 형성하고,
    RA 및 RB는 둘다 -Y이고,
    n은 1 내지 2 중 어느 하나의 정수이며,
    Y는 하기 [화학식 2]으로 표시되고,
    복수의 Y가 존재하는 경우 Y는 서로 다를 수 있으며,
    [화학식 2]

    o 및 p는 각각 독립적으로 3 내지 12 중 어느 하나의 정수이고,
    q는 2 내지 5 중 어느 하나의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 2에서 o 및 p는 각각 독립적으로 4 내지 7 중 어느 하나의 정수이고,
    q는 2 내지 5 중 어느 하나의 정수인 것을 특징으로 하는 이온화 가능한 지질 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 이온화 가능한 지질 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염:
    ;
    ;
    .
  6. 제1항, 제2항, 또는 제5항의 이온화 가능한 지질 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 인지질, 콜레스테롤 또는 지질-PEG (polyethyleneglycol)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 화합물 : 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PEG 접합체를 15 내지 35 : 15 내지 35 : 40 내지 60 : 0.1 내지 5 의 몰비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 인지질은 DOPE, DSPC, POPC, EPC, DOPC, DPPC, DOPG, DPPG, DSPE, Phosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE, POPC, DOPS, 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 지질-PEG 접합체 내 지질은 세라미드(ceramide), 디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol, DMG), 석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol, s-DAG), 디스테아로일포스파티딜콜린 (distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부 터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 지질 나노입자.
  11. (1) 제6항의 지질 나노입자; 및
    (2) 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질, 단백질-핵산 구조체 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 핵산은 메신저 리보핵산(mRNA), 소간섭리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), 앱타머(aptamer), 운반 리보핵산(tRNA), 가이드 리보핵산(gRNA), 단일 가이드 리보핵산(sgRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA, 및 DNAzyme로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 음이온성 약물, 핵산 또는 이의 조합은 상기 지질 나노입자 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 약물 전달용 조성물은 전신 또는 국소 투여되는 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
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