KR102726510B1

KR102726510B1 - Ssu72 단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 간섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102726510B1
Application number: KR1020220012373A
Authority: KR
Inventors: 이창우; 이진관; 김현수; 최지현; 변세은; 이해인; 조현주
Original assignee: 주식회사 큐로젠; 성균관대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2024-11-06
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: AU2022214501A1; CN116744961A; WO2022162568A1; US20240075110A1; US20230025176A1; KR20220110116A; EP4247415A4; EP4247415A1; US11793862B2; AU2022214501B2

Abstract

본 발명은 지방 독성에 의한 간세포의 손상 억제, 염증세포의 침윤을 동반한 조직학적 결함 감소 및 간 섬유화 수준을 효과적으로 감소시켜 비알코올성 지방간염의 예방 및 치료에 탁월한 치료제로 활용될 수 있는 Ssu72 단백질 또는 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 간섬유증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

Ssu72 단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 간섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating non-alcoholic fatty liver, non-alcoholic steatohepatitis, or hepatic fibrosis using Ssu72 protein or a polynucleotide encoding the same}

본 발명은 지방간, 지방간염 및 간섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 Ssu72 단백질 또는 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 간섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비만(obesity)은 21세기에 들어오면서 전 세계적으로 과거의 전염병과 같은 수준으로 증가하고 있다. 현대인들의 과잉 영양 섭취나 좌식 생활 패턴들은 비만을 비롯한 다양한 대사성 증후군들의 원인이 되며 다양한 약물 및 스트레스 등은 만성 지방간 및 지방간염 등과 같은 만성 간질환으로 진단받는 경우가 급속하게 증가하고 있다. 만성 지방간 및 지방간염은 단순한 지방간(steatosis)에서부터 염증 및 섬유화를 동반한 비알코올성 지방간염 및 알코올성 지방간염 등의 범위까지 아우르며, 이러한 증상들은 간경화(cirrhosis) 및 간부전(liver failure)의 원인으로 사료되며, 더 나아가 간암으로 발병할 가능성도 존재한다. 상기 비알코올성 지방간염은 대부분 간의 손상에 의하여 유발되는 간세포괴사, 지방증, 지방독성, 간염증 등의 다양한 원인에 의해 악화되어 유발된다고 알려져 있다. 특히, 비알코올성 지방간염은 간세포의 지방독성으로 초래되는 세포사멸, 만성적 다양한 염증성 면역세포의 침습, 활성화된 간 성상세포의 증식 및 섬유화 등을 동반한 복합성 질병으로서 현재 세계적으로 승인 받은 치료약은 전무하며, 다양한 임상시험 중인 후보물질들가운데 효과가 우수하게 평가받는 물질도 별로 없는 실정이다. 따라서 앞으로 부작용이 없고, 비용에 있어서 경제적이며 치료 효과가 매우 우수한 새로운 치료제의 개발이 절실하게 요구된다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2020-0010853호는 비알코올성 지방간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대해 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 만성 간염, 간경변증 등의 부작용과 함께 치료 효율이 높지 않은 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 높은 민감도와 특이도로 부작용 없이 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 간섬유증을 효과적으로 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ssu72 단백질; ii) 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및iii) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 및 간섬유증 예방용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ssu72 단백질; ii) 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 iii) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 간섬유증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 간염 환자로부터 수득된 시료에서 Ssu72의 발현 수준 또는 활성을 확인하는 단계; 및 Ssu72의 발현 수준이 정상인 또는 간염환자의 정상조직에 비해서 낮게 발현되거나 Ssu72가 비활성 형태로 발현될 경우 비알코올성 간염으로 진단하는 단계를 포함하는 간염 환자의 비알코올성 지방간염 진단방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 간염 환자로부터 수득된 시료에서 Ssu72의 발현 수준 또는 활성을 분석하는 단계; 상기 Ssu72의 발현 수준이 정상인에 비해서 낮거나 Ssu72가 비활성 형태로 발현되는 것으로 판정된 환자를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 환자에게 하기의 i 내지 iii로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간염 치료방법이 제공된다:

i) Ssu72 단백질;

ii) 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및

iii) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ssu72 단백질; ii) 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 iii) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 간기능 개선용 건강기능식품이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 개체에 하기의 i 내지 iii로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 및 간섬유증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 간질환의 예방방법이 제공된다:

i) Ssu72 단백질;

ii) 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및

iii) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 Ssu72 단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 간 내에서 발현할 경우, 간세포의 지방생성(lipogenesis) 활성의 효과적인 억제가 가능하고, TGF-β 발현 및 분비를 저해함으로써 간 성상세포의 활성화 및 섬유화를 억제할 수 있어 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 및 간섬유증을 포함하는 간질환 치료제로 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 pCMV.HA-Ssu72 벡터의 구조를 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 2는 AAV8 Ssu72의 벡터 및 바이러스를 제조하는 과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다. TBG(Thyroxine-binding globulin) 프로모터는 간 세포 특이적으로 Ssu72 단백질을 발현시키기 위해 사용된 것이다. 상기 AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스는 편의상 도면과 발명의 상세한 설명에서 AAV8 Ssu72로 약칭되어 사용될 수 있다.
도 3a는 pCMV.HA-Ssu72의 치료용 벡터의 비알코올성 지방간염 유도에 따른 완화 및 치료 효과를 검증한 결과로, 실험동물에서 적출된 간조직 박편을 Oil Red O으로 염색한 한 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3b는 pCMV.HA-Ssu72의 치료용 벡터의 비알코올성 지방간염 유도에 따른 완화 및 치료 효과를 검증한 결과로, 간 수치(AST, ALT)를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 실험 마우스에 정상 식이요법 적용 시 AAV8 Ssu72 바이러스 주입에 따른 부작용 여부를 확인한 것으로서, 실험동물로부터 적출된 간의 전체적인 모습(하단) 및 간조직 박편을 H&E 염색한 후 현미경으로 촬영한 사진(상단)이다.
도 4b는 실험 마우스에 AAV8 Ssu72 바이러스 주입 후 비알코올성 지방간염 유도 식이요법(Methionine and choline-deficient diet, MCD) 에 따른 비알코올성 지방간염의 완화 효과를 확인한 것으로서, 실험동물로부터 적출된 간의 전체적인 모습(하단) 및 간조직 박편을 H&E 염색한 후 현미경으로 촬영한 사진(상단)이다.
도 5a는 실험 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 AAV8 Ssu72 바이러스 주입 후 비알코올성 지방간염 병변의 간의 형태학적 및 조직학적 분석을 수행한 결과로, 비알코올성 지방간염 유도 식이요법(MCD)을 시행 후 대조군(AAV8) 및 AAV8 Ssu72 바이러스 투여군로부터 적출된 간 조직 박편에서 Ssu72 단백질의 발현 정도를 면역조직화학 분석으로 분석한 사진(상단) 및 지방축적 정도를 Oil Red 염색으로 분석한 결과를 나타내는 측정한 결과를 나타내는 사진(하단)이다. HA-tagged Ssu72 발현 확인: HA 안티바디, 지방 염색: Oil Red O.
도 5b는 상기 도 5a와 동일한 상기 실험동물로부터 적출된 간의 전체적인 모습(하단) 및 간조직 박편을 항-SMA 항체를 이용하여 면역조직화학 분석한 결과를 나타내는 현미경 사진(하단)이다.
도 6은 간 특이적으로 Ssu72의 발현이 억제되어 있는 유전자 조작 마우스를 이용하여 비알코올성 지방간염 유도 식이요법에 의한 Ssu72 유전자의 역할을 검증하기 위해 수행한 분석 결과로서, 서양식 식단과 과량의 과당을 포함하는 또 다른 비알코올성 지방간염 유도 식이요법(western + fructose diet) 을 정상 마우스 그룹(대조군)과 간 특이적으로 Ssu72의 발현이 억제된 유전자 조작 마우스 그룹(실험군)에 시행하고 3개월 후 간을 적출한 후 조직박편에 대하여 H&E 염색 및 Sirius red 염색을 수행한 후 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 7a는 AAV8 Ssu72 바이러스의 비알코올성 지방간염의 염증성 질환 완화 및 치료 효과를 확인한 결과를 나타내는 것이다. 도 7a는 구체적으로 실험동물에 대하여 다른 비알코올성 지방간염 식이요법 중 하나인 Choline-deficient and high fat diet(CD+HFD)를 실행한 후 희생된 실험동물에서 적출된 간조직 박편에 대한 항-Ly6c 항체 및 항-CD11b 항체를 이용한 면역조직화학 분석 및 Sirus red 염색 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 7b는 AAV8 Ssu72 바이러스의 비알코올성 지방간염의 염증성 질환 완화 및 치료 효과를 확인한 것으로, 도 7a에서 측정된 간에 침습한 염증성 대식세포의 양을 foci 기준(foci 크기 10 μm 이상)으로 정량화하기 위하여 적어도 5개 이상의 대식세포가 모여 있는 foci 개수를 측정하고 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 AAV8 Ssu72 바이러스의 비알코올성 지방간염의 염증성 질환 완화 및 치료 효과를 CD+HFD 5주 급이한 마우스에서 확인한 것으로, AAV8 Ssu72를 투여하였을 때, 비알코올성 지방간염 상태에서 섬유화의 지표인 TGF-β와 Col1a1 유전자들의 발현을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 투여한 후 간 조직을 이용한 실시간 qRT-PCR 분석결과를 나타내는 그래프이다. 본 발명에서 제공하는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 투여한 후 정상 식이요법 및 비알코올성 지방간염 유도 식이요법(MCD diet)을 시행하고, 실험동물의 간에서 발현되는 지방 생성(Lipogenesis) 관련 유전자인 Fasn, Srebp1c 및 Acc1, 마우스 간에서 발현되는 지방 분해(Lipid metabolism) 관련 유전자인 PPARa 및 Pgc1a 유전자의 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 투여한 후 지방대사 관련 단백질들의 발현 변화를 웨스턴 블로팅 분석으로 분석한 결과를 나타낸다. 보다 구체적으로 도 8b는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 투여한 후 정상 식이요법 및 비알코올성 지방간염 유도 식이요법(MCD diet)을 시행하고, 마우스 간에서 발현하는 지방 생성(De novo lipogenesis) 관련 단백질인 ChREBP의 발현 및 지방 분해(Lipid metabolism) 관련 PPARα, PGC1α 단백질들의 발현 수준을 웨스턴 블로팅으로 비교 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8c는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 투여한 후 간 조직을 이용한 지방간 예방 및 치료효과를 확인하기 위한, 면역조직화학 분석 결과를 나타낸다. 보다 구체적으로 도 8c는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 투여한 후 정상 식이요법 및 비알코올성 지방간염 유도 식이요법(MCD diet)을 시행하고, 실험이 종료된 후 실험동물로부터 적출된 간에서 마우스 간에서 발현하는 신규 지방 생성(de novo lipogenesis) 관련 단백질인 ChREBP의 발현을 항-ChREBP 항체를 이용하여 면역조직화학 분석한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 9a는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 주입 후 비알코올성 지방간염 간 조직에서의 ROS 및 비정상 대사체인 4-HNE의 형성을 관찰한 것으로 다양한 대사성 스트레스로 유발되는 간 손상을 통해 생성되는 ROS 생성 정도를 관찰한 결과를 나타내는 면역염색 사진이다.
도 9b는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 주입 후 비알코올성 지방간염 간 조직에서의 ROS 및 비정상 대사산물(4-HNE)의 형성을 관찰한 것으로 다양한 대사성 스트레스로 유발되는 간 손상을 통해 생성되는 비정상 대사산물의 유발 정도를 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 10a는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 주입 후 비알코올성 지방간염 간 조직에서의 간 섬유화 기전 억제를 확인한 것으로 섬유화(Fibrosis) 관련 TGF-β, Col1a1, Col3a1, MMP12 유전자들의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10b는 AAV8 Ssu72 바이러스를 마우스에 주입 후 비알코올성 지방간염 간 조직에서의 간 섬유화 기전 억제를 확인한 것으로 섬유화(Fibrosis) 관련 TGF-β의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11a는 STAM모델을 이용한 비알코올성 지방간염 유발 후, AAV8 Ssu72 바이러스 투여 시 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과를 확인한 것으로 정상 식이요법 및 비알코올성 지방간염 유도 식이요법(STAM 모델)을 시행하여 비알코올성 지방간염을 유발시킨 후 AAV8 Ssu72 바이러스를 투여하여 치료효과를 확인하기 위한 동물시험 모델의 스케줄을 나타내는 개요도이다.
도 11b는 STAM모델을 이용한 비알코올성 지방간염 유발 후, AAV8 Ssu72 바이러스 투여 시 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과를 나타낸 H&E 염색 결과이다. 구체적으로 도 11b는 도 11a에서 서술한 실험 방법대로 진행 후 대조군 AAV8을 투여한 그룹과 AAV8 Ssu72 바이러스를 투여한 그룹에서 적출된 간조직 박편을 H&E 염색한 후 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 11c는 STAM모델을 이용한 비알코올성 지방간염 유발 후, AAV8 Ssu72 바이러스 투여 시 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과를 확인한 것으로 다양한 측정 지표 결과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 대조군 AAV8을 투여한 그룹과 AAV8 Ssu72 바이러스를 투여한 그룹에서의 지방증(steatosis), 염증정도(lobular inflammation), 간세포의 풍선화(ballooning), 비알코올성 지방간염 척도(NAFLD activity, NAS), 간 손상지표(AST, ALT) 및 간 섬유화 정도(Sirius red-positive area) 결과를 확인하였다. 상기 그래프에서 Y축 수치는 NAS score로 이는 반정량적 검증된 점수 시스템으로 널리 사용되는 NASH CRN 시스템을 의미한다. NASH CRN 시스템은 0~8점 범위의 벌룬(ballooning), 소엽 염증(lobular inflammation) 및 지방증 점수(steatosis)와 0~4점 범위의 별도의 섬유증 점수의 병합을 포함하는 NAFLD 활동 점수(NAS)를 포함한다(Arka De et al., J. Clin. Exp. Hepatol. 10(3): 255-262. 2020).
도 12a는 CDAHFD모델을 이용한 비알코올성 지방간염 유발 후, AAV8 Ssu72 바이러스 투여 시 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과를 확인하기 위한 동물시험 모델의 스케줄을 나타내는 개요도이다. 정상 식이요법 및 CDAHFD(choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet)와 HFD(high-fat diet)을 이용한 비알코올성 지방간염 유도 식이요법을 시행하여 비알코올성 지방간염을 유발시킨 후 본 발명에서 제공하는 AAV8 Ssu72 바이러스를 투여 시, 비알코올성 지방간염 및 간 섬유화의 치료 효과를 확인하였다.
도 12b는 CDAHFD모델을 이용한 비알코올성 지방간염 유발 후, 본 발명의 일 실시예에 따른 AAV8 Ssu72 바이러스 투여 시 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과를 분석한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 12b는 도 12a에서 설명한 방법으로 실험을 진행한 뒤 대조군(AAV8) 및 AAV8 Ssu72 바이러스를 투여군(AAV8 Ssu72)에서의 실험 종료 후 적출된 간의 상태(상단), 간조직 박편에 대한 H&E 염색(하단 좌측) 및 Sirius red 염색(하단 우측) 결과를 촬영한 일련의 사진이다.
도 12c는 CDAHFD모델을 이용한 비알코올성 지방간염 유발 후, AAV8 Ssu72 바이러스 투여 시 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과를 분석한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 12c는 대조군(AAV8) 및 AAV8 Ssu72 바이러스 투여 시 간 섬유화의 지표인 TGF-β, Col1a1, SMA, 및 Timp1과 섬유화 호전 지표인 MMP13 유전자의 발현을 qRT-PCT로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "비알코올성 지방간염(Non-alcoholic steatohepatitis, NASH) "은 단순 지방증과 달리 팽창성 변성(ballooning degeneration) 및 세포 사멸, 염증성 침윤 등의 병리학적 소견을 보이며, 경우에 따라 콜라겐 축적 등의 섬유화 소견을 보일 수도 있다. 단순 지방증이 느린 조직학적 진행을 보임에 반해 비알코올성 지방간염은 보다 빠른 조직학적 진행을 보이며 간경변으로 진행할 수 있음은 잘 알려져 있으며, 지방간으로 판명 받은 사람들 중 약 5-10%가 지방간염으로 판명된다.

본 문서에서 사용되는 용어 "Ssu72"는 효모 모델에서 RNA 중합효소 Ⅱ의 C 말단 도메인의 탈인산화를 촉매하는 탈인산화 효소로서 알려져 있으나, 고등동물에서는 생체 내 기능이 잘 알려지지 않았다. 상기 유전자 및 단백질은 효모에서부터 침팬지, 개, 돼지, 마우스, 랫트 등에서 모두 보존되어 있으며, 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(NCBI Reference Sequence: NM_026899.3, NM_200728.1 등).

발명의 상세한 설명:

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있고 상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터일 수 있고, 상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있으며, 상기 비바이러스성 벡터는 DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜일 수 있고, 상기 DNA 벡터는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터 또는 인공 인간 염색체일 수 있으며 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

상기 진단방법에 있어서, 상기 시료는 간 생검 조직 또는 체액일 수 있고 상기 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 땀, 눈물 또는 타액일 수 있다.

i) Ssu72 단백질;

ii) 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및

iii) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

상기 치료방법에 있어서, 상기 시료는 간 생검 조직 또는 체액일 수 있고 상기 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 땀, 눈물 또는 타액일 수 있으며 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

i) Ssu72 단백질;

ii) 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및

iii) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

상기 예방방법에 있어서, 상기 개체는 Ssu72의 발현 수준 또는 활성을 분석한 결과, 상기 Ssu72의 발현 수준이 정상인에 비해서 낮거나 Ssu72가 비활성 형태로 발현되는 것으로 판정된 개체일 수 있다.

본 발명에서 상기 Ssu72 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 이때, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ssu72 펩타이드에 HA tag가 포함이 되도록 유전자 컨스트럭트를 제조하였다. 그 이유는 유전자 형질도입에 의해 발현된 Ssu72 단백질이 인체 내의 내재성(inherent) Ssu72 단백질과 구분되지 않기 때문에, 외래도입에 의해 발현된 Ssu72 단백질을 웨스턴 블로팅 분석 등 분석을 통해 구분하기 위한 것이다. 따라서, 실제 치료 또는 예방용 유전자 컨스트럭트에는 HA 태그와 같은 구분용 태그가 포함될 수도 있고, 면역원성을 최소화하기 위해 제거된 채 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에서 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 상기 발현벡터는 일반적으로 제조되는 모든 재조합 벡터일 수 있으며, 비바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터를 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 재조합 바이러스 벡터일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Ssu72 단백질 N-말단에 단백질 분비를 위한 분비 신호서열을 포함할 수 있다. 상기 분비 신호서열은 공지된 그 어떠한 것이든 사용할 수 있는데 예컨대, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.

아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 개체 내에서 정상적인 발현 또는 시공간적인 발현 조절을 위해서 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트 형태로 발현 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다. 상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 프로모터 또는 SV40 프로모터와 같은 프로모터를 포함한다.

간에서의 발현을 위해서는 PBGD 프로모터, α-1 항트립신 프로모터(EhAlbAAT), 티록신 결합 글로불린(thyroxine-bidning glogulin, TBG) 프로모터, HCR(Hepatic Control Region)-ApoCII 하이브리드 프로모터, HCR-hAAT 하이브리드 프로모터, 아포리포단백질 E(ApoE) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제[PGK] 프로모터, 하이브리드 간 특이적 프로모터[HLP], 또는 선행 기술(WO2001098482A; WO2020104782A)에 개시된 간 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다.

원핵세포 내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pX(Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris Cell 75: 791-803, 1995) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham-Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합 단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더서열이다.

아울러, 상기 유전자 컨스트럭트는 제조 및 조작의 편의를 위해 플라스미드 벡터와 같은 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 건강기능식품 조성물의 형태인 경우, 특정보건용 식품, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학 및 의료효과가 높은 식품으로 제조 될 수 있으며, 상기 식품은 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품으로 혼용될 수 있으며, 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 식품 조성물에 통상적으로 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분, 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시 톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제, 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품에 있어서, Ssu72 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 식품의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양의 Ssu72 단백질 또는 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 재조합 벡터를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 일반적인 전신성 투여 또는 국소성 투여, 예컨대, 근육내 주사 또는 정맥 주사 방식으로 투여될 수 있으나, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로 제공되는 경우, 바이러스 벡터를 이용하여 투여되는 경우, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하투여, 수력학적 투여(hydrodynamic injection) 등을 사용할 수 있고, 비바이러스 벡터 특히 플라스미드 DNA와 같이 별도의 유전자 전달 담체를 사용하지 않는 경우에는 전기천공기(electroporator)를 이용하여 주입될 수 있다. 상기 전기천공기는 시판 중인 DNA 약물 체내 주입용 전기천공기, 예컨대, 이탈리아의 IGEA 사의 Glinporator^TM,한국의 JCBIO사의 CUY21EDIT, 스위스의 Supertech사의 SP-4a 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 투여경로는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 활막강 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 1 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

바람직한 실시태양에서 상기 벡터가 AAV 벡터인 경우, 벡터의 투여량은 1×10¹⁰gc/kg 내지 1×10¹⁵ gc/kg 또는 그 이상, 바람직하게는 1×10¹²gc/kg 내지 1×10¹⁴gc/kg, 더 바람직하게는 5×10¹² gc/kg 내지 5×10¹³ gc/kg일 수 있다.

일반적으로, 이를 필요로 하는 개체는 포유동물, 바람직하게는 영장류, 보다 바람직하게는 인간일 것이다. 전형적으로, 이를 필요로 하는 개체는 질병의 특징적인 증상을 나타낼 것이다. 상기 방법은 일반적으로 치료제의 유효 용량을 표현함으로써 이를 필요로 하는 개체에서 나타나는 증상을 개선하는 것을 포함한다.

시험관 내 및 생체 내 표적 세포에서 치료적 유전자 발현을 위한 유전자 요법 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있으며 여기에서 상세히 논의되지 않을 것이다. 이를 간단하게 언급하자면, (나출 또는 리포좀으로 제형화된) 플라스미드 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터의 근육 내 주사, 간질 주사(interstitial injection), 기도 점적, 내피로의 도포, 간장 내 주사, 실질 내 주사 또는 정맥 내 또는 동맥 내 투여(예: 간내 동맥, 간내 정맥)를 포함한다. 표적 세포에 대한 DNA의 가용성을 향상시키기 위한 다양한 장치가 개발되었다. 간단한 접근 방법은 표적 세포를 관련 벡터를 포함하는 카테터 또는 이식 가능한 소재와 물리적으로 접촉시키는 것이지만, 더 복잡한 접근 방식은 근육 내 유전자 전달을 위해 제트 주입 장치 또는 전기천공장치를 사용할 수 있다. 포유동물 간 세포로의 유전자 전달은 생체 외(ex vivo) 및 생체 내(in vivo) 절차를 모두 사용하여 수행될 수 있다. 생체 외 접근 방식은 일반적으로 간 세포의 수확, 적절한 발현 벡터를 사용한 시험관 내 형질도입, 형질도입된 간세포의 재도입을 필요로 한다. 생체 내 유전자 전달은 비-바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터를 간 실질, 간동맥 또는 문맥에 주입하여 달성될 수 있다.

비알코올성 지방간은 과도한 알콜 섭취 없이 간세포에 중성지방인 트리글리세라이드가 축적되는 것이 특징이다. 비알코올성 지방간은 현대인의 고지방 및 고탄수화물 섭취와 관련된 영양 과다에 따라 계속 증가하고 있다. 비만, 당뇨인 경우 비알코올성 지방간이 흔히 관찰되지만, 다앙한 인자가 비알코올성 지방간과 관련된 것으로 알려져 있고 비알코올성 지방간을 지닌 성인의 80%가 인슐린 저항성 당뇨병 및 심장질환 등 대사이상 질환으로 발전된다고 보고되고 있다. 병리학적으로, 비알코올성 지방간은 비알코올성 단순 지방간(non-alcoholic simple steatosis)과 염증을 동반한 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)으로 분류되는데, 장기간 방치 시, 간염, 간섬유, 간경변 등의 심각한 간 질환으로 이행될 수 있다. 비알코올성 지방간은 간세포(hepatocyte)에서 지방의 축적(지방 침윤)을 갖는 것을 특징으로 하고 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행될 수 있다. 비알코올성 지방간염에서 지방 축적은 다양한 정도의 간의 염증과 관련되고, 많은 경우에 인슐린 저항성, 이상지질혈증 및 고혈압과 연관되며 과체중, 높은 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치 또는 인슐린 저항성을 갖는 사람들에서 종종 발생한다.

또한, 비알코올성 지방간염의 발병은 투-히트 가설(2-hit hypothesis)에 의해 설명되고 있는데 처음에는 간 조직 내에 지방 축적이 일어난 후 간 조직 내의 지방 축적이 심해지면 염증반응이 일어나게 되고, 이에 따라 지방의 과산화 반응 및 염증의 악화가 초래된다. 비알코올성 지방간염은 대부분 간의 손상에 의하여 유발되는 간세포괴사, 지방증, 지방독성, 간염증 등의 다양한 원인에 의해 악화되어 유발된다고 알려져 있고, 중증 비알코올성 지방간염이 유발되기 전, 즉 간섬유화 및 간부전이 발병되기 이전에 비알코올성 지방간염을 조기에 치료하는 것이 중요할 것으로 판단된다. 이는, 섬유화가 상당히 진행된 비알코올성 지방간염, 간섬유화 단계 3 및 4(Fibrosis stage 3 & 4) 환자의 경우에는 치료가 매우 어렵기 때문이며, 이는 여러 임상시험에서도 증명된 바 있다. 이와 같이 간섬유화가 진행된 중증의 비알코올성 지방간염 환자들의 치료가 어려운 만큼 질병의 심각도도 크므로, 중증 비알코올성 지방간염 환자를 대상으로 하는 치료제 개발 연구가 필요한 실정이다. 이와 같이 비알코올성 지방간염 환자가 급속도로 증가하는 것에 비하여, 비알코올성 지방간염에 대한 탁월한 치료제는 아직 존재하지 않는다. 치료제의 부재로 인해 복부비만, 고지혈증, 당뇨 등 다른 대사증후군 치료제들, 예를 들어, 인슐린 저항성 개선 약제, 항산화제(예를 들어, 비타민C, E), 이상지질혈증 치료제, 간장보호제 등이 사용되고 있으나, 이들은 비알코올성 지방간염의 직접적인 치료제라고 보기는 어렵다. 또한 비만 인구의 증가와 더불어 비알코올성 지방간염 환자가 증가하면서, 비알코올성 지방간염 치료제 시장은 막대한 시장규모로 발전하였고, 비알코올성 지방간염의 발생원인 및 기작이 밝혀지면서 치료제 개발에 많은 관심이 집중되고 있으나 안전하고 장기 복용이 가능한 비알코올성 지방간염의 치료제의 개발은 아직 미미한 수준이다.

이러한 배경 하에서 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 비알코올성 지방간염의 예방 및 치료제 개발에 대해 연구한 결과, Ssu72 단백질 또는 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 비알코올성 지방간염을 비롯한 비알코올성 지방간, 간섬유화의 예방 또는 치료에 효과적임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. 이에, 본 발명은 Ssu72 단백질 또는 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간 및 비알코올성 지방간염, 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로 본 발명자들은 Ssu72를 발현하는 치료용 비바이러스 pCMV 벡터를 제작하기 위해 PCR을 통해 Ssu72 유전자를 클로닝하고, BamHI, XbaI 제한효소를 처리하여 pCMV.HA-Ssu72를 제작하였으며, Ssu72를 발현하는 바이러스 벡터, AAV8 벡터를 제작하기 위해 AAV8.TBG.PI.Cre.rBG 벡터(Addgene, USA)에서 Cre를 제거하고 ClaI, SalI 제한효소를 처리하여 AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV Ssu72)를 클로닝하였다. 그 후, 상기 제조된 바이러스를 이용하여 비알코올성 지방간염의 완화 및 치료 효과를 검증하였다. 구체적으로 Methionine and choline-deficient (MCD) 식이요법과 High-fat, High-cholesterol 및 High-sugar가 포함된 Western + Fructose 식이요법, 및 Choline-deficient에 High-fat이 추가된 CD + HF 식이요법, 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 투여한 마우스에 High Fat을 섭취시킨 식이요법(STAM), Choline-deficient, L-amino acid-defined High-fat 식이요법(CDAHF)으로 비알코올성 지방간염을 유도하였다. MCD 식이요법으로 pCMV.HA-Ssu72의 치료용 벡터의 비알코올성 지방간염 유도에 따른 완화 및 치료 효과를 검증하였고, AAV8 Ssu72의 비알코올성 지방간염 완화 효과를 확인하였으며 비알코올성 지방간염 병변을 형태학적 및 조직학적으로 분석하였다. 또한 CD + HF 식이요법으로 AAV8 Ssu72를 투여 후 비알코올성 지방간염의 염증성 질환 완화 및 치료효과 확인하였고, AAV8 Ssu72 투여 후 비알코올성 지방간염 마우스의 간 조직에서의 간 섬유화 기전 억제 및 STAM 모델을 통해 비알코올성 지방간염을 유도한 후 AAV8 Ssu72를 투여하여 비알코올성 지방간염 및 간섬유화 개선을 확인하였으며, CDAHFD 식이요법으로 비알코올성 지방간염을 유도한 후 AAV8 Ssu72 투여하여 간 조직에서의 간 섬유화 기전 억제를 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 실험 준비

본 발명에서 사용된 모든 동물 실험은 성균관대학교 의과대학(Sungkyunkwan University School of Medicine; SUSM)에 있는 동물실험윤리위원회(The Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에 의해 승인된, 국제 실험 동물 평가 관리인 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International; AAALAC International)와 실험동물센터(Institute of Laboratory Animal Resources; ILAR)의 가이드라인(guidelines)에 따라 수행하였다.

실시예 2: Ssu72 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 제작

2-1: pCMV.HA-Ssu72 플라스미드 벡터 제작

본 발명자들은 Ssu72를 발현하는 치료용 비바이러스 pCMV 벡터를 제작하기 위해 PCR을 통해 Ssu72를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2)를 클로닝하였고, Bam HI, Xba I 제한효소를 처리한 후, pCMV.HA 벡터(Clonetech, USA)에 삽입함으로써, pCMV.HA-Ssu72를 제작하였다(도 1).

2-2: AAV8.TBG.HA-Ssu72(AAV8 Ssu72) 벡터 제작

본 발명자들은 Ssu72를 발현하는 AAV8 벡터를 제작하기 위해 기 실시예 2-1에서 제조된 pCMV.HA-Ssu72 벡터에서 잘라낸 HA-Ssu72를 암호화하는 유전자를 pAAV.TBG.PI.Cre.rBG 벡터(Addgene, USA)에서 Cre를 제거하고 Cla I, Sal I 제한효소를 처리한 후 삽입함으로써, AAV8.TBG.HA-Ssu72(AAV8 Ssu72)를 클로닝하였다(도 2).

2-3: AAV8.TBG.HA-Ssu72 (AAV8 Ssu72) 바이러스 제작

본 발명자들은 상기 실시예 2-2로부터 수득한 플라스미드 DNA를 사용하여 AAV를 제작하였다. 구체적으로 AAV를 생산하기 위하여 293T 세포를 전날 준비하여 24시간 동안 안정화 시키고, 상기 세포에 실시예 2-2에서 제작한 플라스미드 DNA와 AAV 생산에 필요한 플라스미드인 pHelper 및 pAAV-RC8(Agilent, USA)를 형질감염(Transfection)시키고 3~4일 경과 후 AAV를 수득하였으며, 적정 키트(AAVpro Titration Kit, Takara, Japan)를 통해 생산된 AAV를 정량하였다.

실시예 3: pCMV.HA-Ssu72의 치료용 벡터 투여

본 발명자들은 치료용 벡터인 pCMV.HA-Ssu72의 비알코올성 지방간염 유도에 따른 완화 및 치료 효과를 검증하였다. 구체적으로 비알코올성 지방간염을 유도하기위해 MCD 식이요법을 사용하였다. 먼저 6주령 마우스에 컨트롤 벡터와 pCMV.HA-Ssu72 벡터를 5μL/g 농도로 꼬리정맥에 투여한 후 3주 동안 비알코올성 지방간염 식이요법을 실시하였다. 그 후 채취한 간을 포르말린과 파라핀을 처리하여 고정한 후 고정된 간을 6 μm 두께의 박편으로 세절하고, 헤마톡실린과 에오신(Hematoxylin and eosin; H&E) 및 Oil red O 염색을 수행하였다.

그 결과, 대조군에서는 지방 방울(lipid droplet)이 축적되어 비알코올성 지방간염을 확인하였으나 pCMV.HA-Ssu72 벡터를 투여한 마우스의 실험군은 비알코올성 지방간염의 완화 및 치료효과를 확인하였다(도 3a). 또한 간의 손상 상태를 간접적으로 확인할 수 있는 혈청(Serum)내의 Aspartate transaminase(AST)와 Alanine transferase(ALT) 수치를 비교해 본 결과 pCMV.HA-Ssu72 벡터 투여에 의해 약 60% 이상 수치가 감소한 것으로 나타났다(도 3b). 상기 결과는 본 발명의 pCMV.HA-Ssu72 벡터에 의해 발현된 Ssu72가 비알코올성 지방간염의 병변을 개선 또는 치료함을 시사하는 것이다.

실시예 4: AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72) 투여

본 발명자들은 AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72) 투여 후 상기 AAV8 Ssu72의 비알코올성 지방간염에 대한 완화 효과를 확인하였다. 구체적으로, 비알코올성 지방간염을 유도하기위해 MCD 식이요법을 사용하였다. 6주령 마우스에 AAV8.GFP 바이러스(이하, 'AAV8'로 약칭함)와 AAV8 Ssu72를 3 x 10¹⁰ GC/g 농도로 꼬리정맥에 단회(1회) 투여한 후 2주 동안 비알코올성 지방간염 식이요법(MCD diet)을 실시하였고 대조군은 정상 식이요법을 실시하였다. 그 후, 효능 평가를 위해 각각의 마우스 간을 채취하여 사진을 촬영하였고 채취한 간을 포르말린과 파라핀을 처리하여 고정한 후 H&E 염색을 수행하였다.

그 결과, 정상 식이요법에서는 AAV8과 AAV8 Ssu72 사이 간의 형태학적, 조직학적 차이가 전혀 없었으나(도 4a), 비알코올성 지방간염 식이요법을 실시한 경우에는 AAV8을 투여한 마우스 간에서는 간에 지방이 쌓이는 경우 관찰되는 사례인 간의 색깔이 황토빛으로 밝아짐을 확인하였다(도 4b). 실제로 H&E 염색 결과 대조군에서는 지질 방울이 축적되고, 인간 비알코올성 지방간염의 고유한 특징이라고 알려져 있는 간세포의 풍선화(ballooning)가 관찰되었다. 반면에 AAV8 Ssu72를 투여한 후 비알코올성 지방간염 식이요법을 실시한 경우에는 지방 축적 및 면역세포의 침윤이 현저하게 떨어져 있었고 간세포의 풍선화는 전혀 관찰할 수 없었다. 상기 결과는 본 발명의 AAV8 Ssu72 투여에 의해 발현된 Ssu72가 비알코올성 지방간염의 병변을 완화 또는 치료함을 시사하는 것이다.

실시예 5: 간의 형태학적 및 조직학적 분석

본 발명자들은 본 발명의 AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72) 투여 후 비알코올성 지방간염 병변을 갖는 간의 형태학적 및 조직학적 분석을 수행하였다. 구체적으로 상기 AAV8 Ssu72 투여(3 x 10¹⁰ GC/g)로 인한 간 내의 Ssu72 단백질 발현 증가에 의해 실제 비알코올성 지방간염의 형태학적, 조직학적 환경 변화가 야기되고, 그로 인해 지방증 및 지방독성 수준, 면역세포의 침윤성, 간내 섬유화 수준 등의 완화가 되는지 여부를 확인하기 위해 면역염색 및 Oil red O 염색을 수행하였다. 이때, 대조군은 AAV8을 투여한 그룹으로 분석을 진행하였다.

그 결과, 면역염색에서 HA 안티바디를 통해 간 세포내에서 발현되는 Ssu72를 확인하였으며, Oil red O 염색에서 AAV8 Ssu72 투여 후 마우스 간 조직에서 지질 방울의 축적이 감소한 것으로 나타났다(도 5a). 또한 간 섬유화 마커인 SMA가 거의 관찰되지 않을 정도로 비알코올성 지방간염이 개선되었음을 확인하였다(도 5b).

실시예 6: Ssu72 유전자의 역할 검증

본 발명자들은 간 특이적으로 Ssu72의 발현이 억제되어 있는 유전자 조작 마우스를 이용하여 비알코올성 지방간염 유도 식이요법에 의한 Ssu72 유전자의 역할을 검증하였다. 구체적으로 정상 마우스와 간 특이적으로 Ssu72가 억제되어 있는 유전자 조작 마우스를 이용하여 Western + Fructose 식이요법을 통하여 Ssu72 발현 저해가 비알코올성 지방간염의 생성 및 발달 정도에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다. 정상 마우스 그룹과 간 특이적으로 Ssu72의 발현이 억제된 마우스 그룹에 Western + Fructose 식이요법을 시행하였고 3개월 후 상기 마우스의 간을 적출하여 H&E 염색 및 Sirius red 염색을 수행하였다.

그 결과, H&E 염색을 통하여 간 조직의 지방증 수준 및 면역세포의 침윤성 증가가 관찰되어 비알코올성 지방간염이 간 특이적으로 Ssu72의 발현이 억제된 마우스 그룹에서 진행정도가 현저하게 빨라짐을 확인하였고 Sirius red 염색을 통하여 간 섬유화 진행정도가 중증이 되었음을 관찰하였다(도 6).

실시예 7: 비알코올성 지방간염 치료 효과 확인

7-1: Sirius red 염색 및 면역염색

본 발명자들은 Choline-deficient + High fat(CD+HFD)를 이용한 AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72) 투여에 의한 비알코올성 지방간염의 완화 및 치료 효과를 확인하였다. 구체적으로 본 발명의 Ssu72의 비알코올성 지방간염 치료 효과를 확인하기 위해, AAV8 Ssu72를 마우스에 투여(2 x 10¹⁰ GC/g)한 후 또 다른 비알코올성 지방간염 식이요법 중 하나인 Choline-deficient + High fat Diet(CD+HF Diet)를 마우스에 급이하여 AAV8 Ssu72의 치료 효과를 Sirius red 염색 및 면역염색을 통해 관찰하였다.

그 결과, AAV8 대조군과 비교하여 AAV8 Ssu72를 단회(1회) 투여한 경우 간 섬유화에 대해 현저한 저해 효과를 나타내었다. 이는 섬유화 stage 2 정도에서 한 단계 낮은 섬유화 stage 1 단계로 낮추는 효과라 판단된다. 이와 더불어, 침윤된 대식세포의 정도를 면밀히 측정하기 위하여 Ly6c와 CD11b 안티바디를 이용하여 비알코올성 지방간염을 유발시킨 동안 간에 침윤된 염증성 대식세포의 양을 측정한 결과, 본 발명의 AAV8 Ssu72 투여에 의해 염증반응이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(도 7a). 상기 마우스 간에 침습한 염증성 대식세포의 양은 foci 형성 양을 토대로 정량화하였다. Ly6c+, CD11b+ 대식세포의 정량화 과정은 Ly6c(초록), CD11b(빨강)로 면역 염색한 후 두 단백질이 함께 발현하여 노란색으로 보이는 세포의 군집 중, 10 mm 이상 크기이며 세포의 수가 5개 이상인 것을 foci로 정하였다. 특히 혈관이나 담관 주변의 군집은 제외하고 염색 강도가 기저 수준 이상이어야 한다. 대조군과 AAV8 Ssu72를 투여한 실험군에서 대식세포가 이룬 foci양을 측정 후, 비교한 결과, AAV8 Ssu72를 투여한 실험군에서 Foci의 양이 감소하였고 통계적으로 유의미한 차이를 나타냈다(도 7b).

7-1: RT-PCR

본 발명자들은 Choline-deficient + High fat Diet(CD+HF Diet)를 마우스에 급이한 후 간 조직을 적출하여 RNeasy Mini kit(Qiagen)의 매뉴얼에 의거하여 각각의 총 RNA를 수득하였다. 상기 수득한 총 RNA에 Oligo 프라이머를 첨가하고 70℃ 5분 동안 pre-incubation을 한 후, 역전사 효소, RNase 억제제, 25 mM MgCl₂ 및 dNTP의 혼합물을 첨가하고, 42℃ 60분, 85℃ 5분의 조건으로 RT-PCR을 수행하여 총 RNA에 대한 cDNA를 수득하였다. 상기 수득한 cDNA와 하기의 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였고, 비알코올성 지방간염 치료의 가장 중요한 지표인 간 섬유화(fibrosis) 관련 유전자들의 발현 수준을 비교하였다.

비알코올성 지방간염의 주요 증상 중 하나는 정상 간에서는 휴지기 상태로 존재하는 간 성상세포가 지방 독성 및 TGF-β를 포함한 여러 사이토카인 등에 의해 활성화되고 더 나아가 섬유 세포로의 변성에 의해서 간의 섬유화가 발생하게 되는 것으로 알려져 있다. 그런데, 본 발명의 AAV8 Ssu72의 투여를 통해 간으로의 Ssu72 도입은 비알코올성 지방간염 상태에서 섬유화의 지표인 TGF-β와 Col1a1 유전자들의 발현이 50% 정도 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(도 7c). 상기 간 섬유화(fibrosis) 관련 유전자 검출을 포함한 본 발명에서 사용한 프라이머의 염기서열 정보를 하기 표 1에 요약하였다.

프라이머 서열 정보

프라이머	염기서열(5'-->3')	서열번호
TGF F	CACCGGAGAGCCCTGGATA	5
TGF R	TGTACAGCTGCCGCACACA	6
Col1a1 F	GGGTCTAGACATGTTCAGCTTTGTG	7
Col1a1 R	ACCCTTAGGCCATTGTGTATGC	8
Fasn F	ATTGCATCAAGCAAGTGCAG	9
Fasn R	GAGCCGTCAAACAGGAAAG	10
Srebp1c F	GGCTTGTCCTTTGGGAAGC	11
Srebp1c R	CGCCTATGCTGGTGCACA	12
ACC1 F	CCAGGCCATGTTGAGACGCT	13
ACC1 R	CCAGCCAGCCTCTTGACTAT	14
PPARa F	GGATGTCACACAATGCAATTCG	15
PPARa R	TCACAGAACGGCTTCCTCAGGT	16
Pgcla F	CCCTGCCATTGTTAAGACC	17
Pgcla R	TGCTGCTGTTCCTGTTTTC	18
Col3a1 F	TACACCTGCTCCTGTGCTTC	19
Col3a1 R	CATTCCTCCCACTCCAGACT	20
MMP12 F	ACCAGAGCCACACTATCCC	21
MMP12 R	CTCCTGCCTCACATCATACC	22
MMP13 F	CTGGCACACGCTTTTCCTC	23
MMP13 R	ATGGGCAGCAACAATAAACAAG	24
SMA F	CTGACAGAGGCACCACTGAA	25
SMA R	CATCTCCAGAGTCCAGCACA	26
Timp F	CTCAAAGACCTATAGTGCTGGC	27
Timp R	CAAAGTGACGGCTCTGGTAG	28

실시예 8: 간 조직을 이용한 실시간 qRT-PCR 분석

본 발명자들은 본 발명의 AAV8.GFP 바이러스(AAV8)와 AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72)를 마우스에 투여하고, 2~3주 동안 정상 또는 비알코올성 지방간염 식이요법(MCD diet)을 수행한 후 마우스 간 조직을 적출하였다. 상기 수득한 간 조직을 RNeasy Mini kit(Qiagen)의 매뉴얼에 따라 각각의 총 RNA를 수득하였고 상기 수득한 총 RNA에 Oligo 프라이머를 첨가 후 70℃ 5분 동안 전 배양(pre-incubation)하였다. 이어서 역전사 효소, RNase 억제제, 25 mM MgCl₂ 및 dNTP의 혼합물을 가하고, 42℃ 60분, 85℃ 5분 RT-PCR을 수행하여 역전사 반응을 수행을 통해 총 RNA에 대한 cDNA를 수득하였다. 상기 수득한 cDNA와 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였고, 간에서 발현되는 지방생성(lipogenesis), 지방 분해(lipid metabolism) 및 섬유화(fibrosis) 관련 유전자들의 발현 수준을 비교하였다.

그 결과, 식이요법과 상관없이 간에서의 Ssu72 발현은 지방생성에 관여하는 Fasn, Srebp1c 및 ACC1의 발현을 감소시켰고 비알코올성 지방간염 식이요법에서 현저한 지방생성 억제 현상을 관찰하였다. 또한, 대조적으로 지방 대사 및 분해 관련 유전자들{PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor alpha), PGC1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)}의 발현은 Ssu72 발현에 의해 증가한 것으로 나타났다(도 8a). 상기 결과는 Ssu72의 발현이 간 세포내의 기능 및 미토콘드리아 활성을 증가시킴을 시사하는 것이다. 아울러, 상기 같은 결과를 바탕으로 동일 조건에서 간을 적출한 후 지방생성과 지방 대사에 관련된 단백질에 대한 웨스턴 블럿과 면역염색을 수행한 결과 지방 대사 관련 단백질인 PPARα와 PGC1α의 발현은 증가하였고 신규 지방생성(de novo lipogenesis)의 핵심 전사인자(transcription factor)인 ChREBP의 발현은 AAV8 Ssu72 투여 후 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(도 8b 및 8c). 간에서 포도당 유입에 따른 신규 지방생성의 핵심 인자인 ChREBP는 실제로 간 내의 인슐린 감수성(insulin sensitivity) 및 인슐린 저항성(insulin resistance)의 조절자이다(Mi-sung Kim et al., J. Clin. Invest. 126(11): 4372-4386. 2016). 또한 인슐린 저항성이 있는 마우스에서 간 특이적으로 ChREBP를 억제하였을 경우에 간(hepatic) 및 말초 인슐린 감수성(peripheral insulin sensitivity)이 회복됨이 확인되었다(Tara Jois et al., Mol. Metab. 6(11): 1381-1394. 2017). 따라서 비알코올성 지방간염 마우스에서 ChREBP 발현을 면역염색을 통하여 확인하였을 때, AAV8 Ssu72 투여 후 현저하게 ChREBP 발현이 억제되었는데, 이러한 결과는 간 내에서의 신규 지방생성 감소 및 인슐린 저항성 회복에 연관되어 있음을 시사하는 것이다.

실시예 9: ROS(Reactive oxygen species) 및 비정상 대사산물(4-HNE)의 형성 비교

본 발명자들은 AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72) 투여 후 비알코올성 지방간염 간 조직에서 ROS 및 비정상 대사산물(metabolites)인 4-HNE(4-hydroxynonenal)의 형성을 비교하였다. 비알코올성 지방간염은 지속적으로 간에 손상을 유도하는 질환으로 활성산소종(ROS)이 간으로 과도하게 유입되거나 생성된 지방산의 지질과산화(lipid peroxidation) 과정 중에 생기는 4-HNE와 같은 비정상적인 대사산물들에 의해 유발된다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 마우스에 AAV8.GFP 바이러스(AAV8)을 투여한 그룹을 대조군으로 하여 AAV8 Ssu72 투여 후(3 x 10¹⁰ GC/g) 비알코올성 지방간염 간 조직에서의 ROS 및 비정상 대사산물(4-HNE)의 형성 비교하였다.

그 결과, 간 특이적으로 Ssu72가 억제된 마우스 간에서 4-HNE가 과도하게 생성되는 것으로 나타났다(도 9a). 상기 4-HNE는 미토콘드리아 또는 퍼옥시좀에서 지방산의 산화(oxidation) 과정 중에 생성되며, DNA 및 단백질에 부산물(adduct)로 작용하면서 간세포의 비정상적 조절이나 세포사멸을 유도한다. 또한 비알코올성 지방간염 병변에서 간 성상세포의 활성화를 유도하여 섬유화를 일으키는 주요한 요인으로도 작용하는데 본 발명자들이 AAV8 Ssu72를 마우스에 투여하고, 2주 동안 정상 또는 비알코올성 지방간염 식이요법(MCD diet)을 수행한 후 마우스 간 조직을 적출하고 웨스턴 블롯을 수행한 결과 AAV8 Ssu72 투여한 그룹에서 4-HNE의 단백질 부가생성이 현저하게 감소한 것으로 나타났다(도 9b). 상기 결과는 발현된 Ssu72가 간세포의 비정상적 조절이나 세포사멸을 억제함으로서 비알코올성 지방간염의 완화 및 치료에 효과적임을 시사하는 것이다.

실시예 10: 간 섬유화 기전 억제 확인

본 발명자들은 본 발명의 AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72) 투여 후 비알코올성 지방간염 간 조직에서 간 섬유화 기전 억제를 확인하였다. 구체적으로 비알코올성 지방간염의 주요 증상 중 하나는 정상 간에서는 휴지기 상태로 존재하는 간 성상세포가 지방 독성 및 TGF-β를 포함한 여러 사이토카인 등에 의해 활성화되고 더 나아가 섬유 세포로의 변성이 일어나게 된다. 따라서 본 발명자들은 마우스에 AAV8.GFP 바이러스(AAV8)을 투여한 그룹을 대조군으로 하여 AAV8 Ssu72 투여(3 x 10¹⁰ GC/g) 후 비알코올성 지방간염 간 조직에서의 간 섬유화 기전 억제 여부를 실시간 PCR(표 1 참조) 및 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

그 결과, AAV8 Ssu72의 투여를 통해 간으로의 Ssu72 도입은 비알코올성 지방간염 상태에서의 섬유화의 지표인 TGF-β와 Col1a1, Col3a1 유전자들의 발현을 유의하게 감소시켰고 콜라겐을 분해시키는 MMP12 유전자의 발현은 크게 증가한 것으로 나타났다(도 10a). 또한, 실제 간 조직에서 TGF-β의 발현양을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과 AAV8 Ssu72의 투여에 의해 현저하게 억제되는 것으로 나타났다(도 10b). 따라서 상기 결과들을 종합하면, 간에서 AAV를 이용한 Ssu72 발현의 유도는 지방 독성에 의한 간세포의 손상 억제, 염증세포의 침윤을 동반한 조직학적 결함 감소 및 간 섬유화 수준이 현저하게 감소하였으므로 비알코올성 지방간염의 예방 및 치료에 탁월한 치료제로 활용될 수 있음을 시사한다.

실시예 11: 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과 확인

본 발명자들은 STAM 모델을 이용한 비알코올성 지방간염 유발 후, AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72) 투여 시 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과를 확인하였다. 구체적으로 생후 2일된 마우스에 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 투여하고 4주령부터 12주령까지 고지방식이(High Fat diet)를 급이하여 비알코올성 지방간염을 유발하였다. 상기 마우스는 6주령에 지방간, 8주령에 비알코올성 지방간염, 12주령에 간경변이 유발되었다. 8주령에 비알코올성 지방간염과 간섬유화가 유발되었음을 확인 후 AAV8 Ssu72를 투여하였고(3 x 10¹⁰ GC/g), 12주령에 마우스 간세포의 H&E 염색 및 비알코올성 지방간염과 간섬유화 정도를 확인할 수 있는 지표를 분석하였다(도 11a). 이때 대조군은 AAV8.GFP 바이러스(AAV8)를 투여하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여 AAV8 Ssu72를 투여한 군에서 지방 축적, 간세포의 풍선화 및 면역세포의 침윤성이 정상 간의 상태로 개선되었음을 관찰하였다(도 11b). 또한 AAV8 Ssu72의 투여를 통해 지방증(steatosis), 염증정도(lobular inflammation), 간세포의 풍선화(Ballooning)의 정도가 현저히 개선되어 NAFLD 활성이 AAV8 투여한 대조군에 비해 현저히 감소한 것으로 나타났다. 특히, AAV8 Ssu72를 투여한 군에서는 염증정도가 거의 나타나지 않을 정도로 개선되었고 간수치(AST, ALT)도 감소하였으며 Sirius red -양성 지역을 통해 확인한 간 섬유화 정도가 모두 대조군 대비 약 60% 이상 개선되었음을 관찰하였다(도 11c).

실시예 12: CDAHFD 모델을 이용한 비알코올성 지방간염 및 간섬유화의 치료 효과 확인

본 발명자들은 CDAHFD 모델을 이용한 비알코올성 지방간염 유발 후, AAV8.TBG.HA-Ssu72 바이러스(AAV8 Ssu72) 투여 시 비알코올성 지방간염 및 간 섬유화의 치료 효과를 확인하였다. 구체적으로 마우스에 CDAHFD 식이요법을 약 11주간 실시하여 비알코올성 지방간염 및 간 섬유화를 유발시키고, 이후 3주간 고지방식이로 변경하여 간의 지방축적을 지속화한 모델에서, AAV8 Ssu72를 투여 후 H&E 염색 및 Sirius red 염색을 수행하였다. 이때, AAV8 Ssu72는 CDAHF 식이 시작일로부터 11주가 되는 날에 단회 투여(3 x 10¹⁰ GC/g)하였고, AAV8 Ssu72 투여 3일 전 고지방식이로 변경하였으며(도 12a) 대조군은 AAV8.GFP 바이러스(AAV8)를 투여하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여 AAV8 Ssu72를 투여한 군에서 지방증 수준 및 면역세포의 침윤성과 간 섬유화 진행정도 모두 정상 간의 상태로 개선되었음을 관찰하였다(도 12b). 또한 AAV8 Ssu72의 투여를 통해 간 섬유화의 질환 표지 유전자의 발현 수준과 완화 정도를 확인할 수 있는 섬유화 마커와 상기 섬유화를 억제하는 효소의 레벨을 qRT-PCT(표 1 참조)로 확인한 결과 AAV8 Ssu72를 통해 간으로 도입된 Ssu72는 비알코올성 지방간염 상태에서의 섬유화의 억제 지표인 MMP13의 발현이 약 4배 증가 되었으나 간 섬유화 지표인 TGF-β, Col1a1, SMA, Timp1 유전자들은 발현이 약 50% 정도 감소한 것으로 나타났다(도 12c).

결론적으로, 본 발명의 Ssu72 단백질 또는 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 간세포의 지방 생성(lipogenesis) 활성의 효과적인 억제가 가능하고, 간세포 지방 생성 억제를 통해 대식세포를 포함한 다양한 면역세포의 활성화 및 침습을 저해시킬 수 있으며, TGF-β 발현 및 분비를 저해함으로써 간 성상세포의 활성화 및 섬유화를 억제할 수 있어 비알코올성 지방간 및 비알코올성 지방간염, 간 섬유화를 매우 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 치료제로 활용가능하다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> CUROGEN Technology Co., Ltd. Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Pharmaceutical composition for treating non-alcoholic fatty liver, non-alcoholic steatohepatitis, or hepatic fibrosis using Ssu72 protein or a polynucleotide encoding the same <130> PD21-6154 <150> KR 10-2021-0013620 <151> 2021-01-29 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 194 <212> PRT <213> Human Ssu72 protein sequence <400> 1 Met Pro Ser Ser Pro Leu Arg Val Ala Val Val Cys Ser Ser Asn Gln 1 5 10 15 Asn Arg Ser Met Glu Ala His Asn Ile Leu Ser Lys Arg Gly Phe Ser 20 25 30 Val Arg Ser Phe Gly Thr Gly Thr His Val Lys Leu Pro Gly Pro Ala 35 40 45 Pro Asp Lys Pro Asn Val Tyr Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Asp Gln Met 50 55 60 Tyr Asn Asp Leu Leu Arg Lys Asp Lys Glu Leu Tyr Thr Gln Asn Gly 65 70 75 80 Ile Leu His Met Leu Asp Arg Asn Lys Arg Ile Lys Pro Arg Pro Glu 85 90 95 Arg Phe Gln Asn Cys Lys Asp Leu Phe Asp Leu Ile Leu Thr Cys Glu 100 105 110 Glu Arg Val Tyr Asp Gln Val Val Glu Asp Leu Asn Ser Arg Glu Gln 115 120 125 Glu Thr Cys Gln Pro Val His Val Val Asn Val Asp Ile Gln Asp Asn 130 135 140 His Glu Glu Ala Thr Leu Gly Ala Phe Leu Ile Cys Glu Leu Cys Gln 145 150 155 160 Cys Ile Gln His Thr Glu Asp Met Glu Asn Glu Ile Asp Glu Leu Leu 165 170 175 Gln Glu Phe Glu Glu Lys Ser Gly Arg Thr Phe Leu His Thr Val Cys 180 185 190 Phe Tyr <210> 2 <211> 585 <212> DNA <213> Human Ssu72 gene sequence <400> 2 atgccgtcgt ccccgctgcg ggtggcggtg gtgtgctcga gcaaccagaa ccggagcatg 60 gaggcgcaca acatcctcag caaacgggga ttcagcgtcc gatcctttgg aacagggact 120 cacgtgaagc ttccaggacc agctcccgac aagcccaatg tttatgattt caaaaccaca 180 tatgaccaga tgtacaatga tcttcttagg aaagacaaag aactctatac acagaatggg 240 attttacata tgctggacag aaataagaga atcaagcccc ggccagaaag attccagaac 300 tgcaaagacc tgtttgatct gatcctcact tgcgaagaga gagtgtatga ccaggtggtg 360 gaagatctga attccagaga acaggagacc tgccagcctg tgcacgtggt caatgtggac 420 atccaggaca accacgagga ggccaccctg ggggcgtttc tcatctgtga gctctgccag 480 tgtatccagc acacggaaga catggagaac gagatcgacg agctgctgca ggagttcgag 540 gagaagagtg gccgcacctt tctgcacacc gtctgcttct actga 585 <210> 3 <211> 5989 <212> DNA <213> pCMV. HA-Ssu72 plasmid <400> 3 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 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TBG. 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caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5100 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5160 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5220 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5280 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5340 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5400 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 5460 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 5520 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 5580 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 5640 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 5700 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 5760 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 5820 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 5880 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 5940 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6000 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6060 ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 6120 ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 6180 tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga 6240 ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg 6300 caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg 6360 ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc 6420 atgattacgc cagatttaat taaggcctta attagg 6456 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta forward primer <400> 5 caccggagag ccctggata 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta reverse primer <400> 6 caccggagag ccctggata 19 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Colla1 forward primer <400> 7 gggtctagac atgttcagct ttgtg 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Colla1 reverse primer <400> 8 acccttaggc cattgtgtat gc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fasn forward primer <400> 9 attgcatcaa gcaagtgcag 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fasn reverse primer <400> 10 gagccgtcaa acaggaaag 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp1c forward primer <400> 11 ggcttgtcct ttgggaagc 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp1c reverse primer <400> 12 cgcctatgct ggtgcaca 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 forward primer <400> 13 ccaggccatg ttgagacgct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 reverse primer <400> 14 ccagccagcc tcttgactat 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARa forward primer <400> 15 ggatgtcaca caatgcaatt cg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARa reverse primer <400> 16 tcacagaacg gcttcctcag gt 22 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pgcla forward primer <400> 17 ccctgccatt gttaagacc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pgcla reverse primer <400> 18 tgctgctgtt cctgttttc 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col3a1 forward primer <400> 19 tacacctgct cctgtgcttc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col3a1 reverse primer <400> 20 cattcctccc actccagact 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP12 forward primer <400> 21 accagagcca cactatccc 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP12 reverse primer <400> 22 ctcctgcctc acatcatacc 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP13 forward primer <400> 23 ctggcacacg cttttcctc 19 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP13 reverse primer <400> 24 atgggcagca acaataaaca ag 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMA forward primer <400> 25 ctgacagagg caccactgaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMA reverse primer <400> 26 catctccaga gtccagcaca 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Timp forward primer <400> 27 ctcaaagacc tatagtgctg gc 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Timp reverse primer <400> 28 caaagtgacg gctctggtag 20

Claims

PBGD 프로모터, α-1 항트립신 프로모터(EhAlbAAT), 티록신 결합 글로불린(thyroxine-bidning glogulin, TBG) 프로모터, HCR(Hepatic Control Region)-ApoCII 하이브리드 프로모터, HCR-hAAT 하이브리드 프로모터, 아포리포단백질 E(ApoE) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제[PGK] 프로모터, 및 하이브리드 간 특이적 프로모터[HLP]로 구성되는 군으로부터 선택되는 간 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 간섬유증 치료용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 아데노부속바이러스 벡터는 AAV8 벡터이고, 상기 간 특이적 프로모터는 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터인, 약학적 조성물.
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바알코올성 지방간염에 걸린 인간을 제외한 포유동물 개체로부터 수득된 시료에서 Ssu72의 발현 수준 또는 활성을 분석하는 단계; 상기 Ssu72의 발현 수준이 정상인에 비해서 낮거나 Ssu72가 비활성 형태로 발현되는 것으로 판정된 개체를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 개체에게 제1항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함 하는, 상기 개체의 비알코올성 지방간염 치료방법
제7항에 있어서,
상기 시료는 간 생검 조직 또는 체액인, 치료방법.
제8항에 있어서,
상기 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 땀, 눈물 또는 타액인, 치료방법.
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