KR102725653B1

KR102725653B1 - L-라이신 생산능이 향상된 변이 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법

Info

Publication number: KR102725653B1
Application number: KR1020230189277A
Authority: KR
Inventors: 홍인표
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2023-03-20
Filing date: 2023-12-22
Publication date: 2024-11-05
Anticipated expiration: 2043-12-22
Also published as: KR20240142278A; KR20240142275A; KR102796959B1; KR102685485B1; KR20240142276A; KR20240142277A; KR102685486B9; KR102685485B9; CN118667796A; KR102685486B1

Abstract

본 발명은 Ncgl0251 유전자 변이체 및 이를 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 Ncgl0251 유전자 변이체는 Ncgl0251 유전자의 염기서열 중 하나 이상의 염기가 변이됨으로써 Ncgl0251 유전자로 암호화된 단백질 활성이 변화되어, 상기 유전자 변이체를 포함하는 재조합 미생물로부터 L-라이신을 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

L-라이신 생산능이 향상된 변이 미생물 및 이를 이용한 L-라이신의 생산 방법{Mutant microorganism having enhanced L-lysine productivity and method for producing L-lysine using the same}

본 발명은 L-라이신 생산능이 향상된 변이 미생물 및 이를 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 Ncgl0251 유전자 변이체 및 이를 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.

L-라이신은 사람이나 동물 체내에서 합성되지 않는 필수아미노산으로서 외부에서 공급되어야 하며, 일반적으로 세균이나 효모와 같은 미생물을 이용한 발효에 의해 생산된다. L-라이신 생산은 자연상태에서 수득된 야생형 균주나 이의 L-라이신 생산능이 향상되도록 변형된 변이주를 이용할 수 있다.

최근에는 L-라이신의 생산 효율을 개선시키기 위해 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되는 대장균, 코리네박테리움 등의 미생물을 대상으로 유전자 재조합 기술을 적용하여 우수한 L-라이신 생산능을 갖는 다양한 재조합 균주 또는 변이주 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법이 개발되고 있다. 특히 L-라이신의 생합성 경로에 관여하는 효소, 전사인자, 수송 단백질 등의 유전자를 대상으로 하거나, 또는 이들의 발현을 조절하는 프로모터에 변이를 유도하여 L-라이신의 생산량을 증대시키려는 시도가 있었다. 그러나 L-라이신 생산에 직간접적으로 연관된 효소, 전사인자, 수송 단백질 등 단백질의 종류가 수십 ~ 수백여 종에 이르기 때문에 이러한 단백질의 활성 변화에 따른 L-라이신 생산능 증가 여부에 관해 여전히 많은 연구가 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-0838038호 한국등록특허 제10-2139806호

본 발명은 Ncgl0251 유전자 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 변이체로 암호화된 단백질 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용한 L-라이신의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 염기서열에서 1030번째 염기가 c에서 t로 치환된, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 Ncgl0251 유전자 변이체를 제공한다.

본 발명의 다른 양상은 상기 유전자 변이체로 암호화된 단백질 변이체를 제공한다.

본 발명에 사용된 “Ncgl0251 유전자”는 과산화수소를 물과 산소로 분해하며 과산화수소의 독성 영향으로부터 세포를 보호하는 역할을 한는 과산화수소분해효소(catalase)를 암호화한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Ncgl0251 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Ncgl0251 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "변이"는 유전자의 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 변경(alteration)을 의미하며, 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 치환(substitution), 삽입(insertion), 결손(deletion) 등을 포함할 수 있다. 여기서 치환은 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 다른 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산으로 바뀌는 변경을 의미한다. 삽입은 다른 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 추가되는 변경을 의미한다. 결손은 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 제거되는 변경을 의미한다. 이러한 변이를 갖는 유전자를 변이 유전자 또는 유전자 변이체라고 한다.

상기 유전자의 염기서열 상 염기 변이는 하나 이상의 염기 또는 뉴클레오티드 (A, T, C 또는 G; 뉴클레오티드 A는 아데닌, 뉴클레오티드 T는 티민, 뉴클레오티드 C는 시토신, 뉴클레오티드 G는 구아닌을 의미함)의 차이를 보이는 서열의 변경 또는 변이를 의미하며, 하나의 염기 또는 뉴클레오티드가 변이된 것을 단일 염기서열 변이 또는 단일 뉴클레오티드 변이(single nucleotide variant)라고 한다. 이러한 염기 변이가 단백질을 암호화하고 있는 영역 (코딩 서열)에 존재할 경우에는 단백질의 구조에 영향을 미쳐 단백질 구조 또는 기능이 달라질 수 있으며, 프로모터(promoter)와 같이 단백질을 암호화하지 않는 비암호화 영역에 존재할 경우에는 단백질의 발현 수준에 차이를 가져와 그 단백질의 전체적인 활성이 증가 또는 감소할 수 있다.

본 발명에 따른 Ncgl0251 유전자 변이체는 서열번호 1의 염기서열에서 1030번째 염기가 c에서 t로 치환되어, 이로부터 암호화된 단백질의 아미노산 서열 내 변이를 유발할 수 있다.

상기 Ncgl0251 유전자 변이체는 서열번호 3의 염기서열을 포함하며, 서열번호 3의 염기서열과 비교하여 변이 위치 (1030번째 염기)를 제외하고 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성 또는 동일성을 가지는 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함할 수 있으며, 상기 변이체의 기능 또는 특성을 유지하는 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 여기서 “상동성” 또는 “동일성”이란 기준이 되는 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하여 분석하였을 때 두 서열 간의 일치율(%)을 의미한다.

본 발명에서 사용된 "단백질 변이체”는 단백질을 암호화하는 유전자의 염기서열 상 변이로 인해 아미노산 서열 중 N-말단, C-말단 및/또는 내부에서 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 변이 전 아미노산 서열과 상이하나, 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지된다. 여기서 "보존적 치환"이란 하나의 아미노산을 구조적 및/또는 화학적 성질이 유사한 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미하며, 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나, 또는 전혀 영향을 미치지 않을 수 있다. 상기 아미노산으로는 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 발린(Val, V), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 아스파트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K), 글리신(Gly, G) 및 프롤린(Pro, P)으로부터 선택된 것이다.

또한, 단백질 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거되거나, 또는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 것을 포함한다.

이러한 단백질 변이체는 그 능력이 변이 전 단백질에 비하여 증가 (강화)되거나, 변하지 않거나, 또는 감소 (약화)될 수 있다. 여기서 "증가 또는 강화"는 단백질 자체의 활성이 변이 전 단백질에 비하여 증가한 경우, 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 증가 또는 번역 증가 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도가 야생형 균주 또는 변이 전 단백질을 발현하는 균주에 비하여 높은 경우, 및 이들의 조합을 포함한다. 또한 "감소 또는 약화"는 단백질 자체의 활성이 변이 전 단백질에 비해 감소한 경우, 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도가 야생형 균주 또는 변이 전 단백질을 발현하는 균주에 비하여 낮은 경우, 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명에서는 변이체가 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 등과 혼용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단백질 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 344번째 아미노산이 아르기닌에서 시스테인으로 치환된 것일 수 있다.

상기 단백질 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열과 비교하여 변이 위치 (344번째 아미노산)를 제외하고 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성 또는 동일성을 가지는 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함할 수 있으며, 상기 변이체의 기능 또는 특성을 유지하는 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 사용된 "벡터(vector)"는 변이 대상 (숙주세포)에 목적 유전자를 전달하여 발현시키기 위한 수단으로 사용되는 모든 유형의 핵산 서열 운반 구조체를 의미한다. 상기 벡터는 특별한 언급이 없는 한, 담지된 핵산 서열이 숙주세포 유전체 내 삽입되어 발현되도록 하는 것 및/또는 독자적으로 발현되도록 하는 것을 의미할 수 있다. 이러한 벡터는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하며, “작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 목적 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결된 것을 의미하고, "조절요소"는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 벡터의 일례로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들면, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로는 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, Charon21A 등이 있으며, 플라스미드 벡터로는 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 발현을 위한 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 유전자 또는 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

본 발명에서 사용된 “재조합 벡터”는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있으며, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제 가능하거나 게놈 그 자체에 봉합될 수 있다. 상기 숙주세포는 벡터가 복제 가능한 것으로, 복제가 개시되는 특정 염기서열인 복제 원점을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예컨대, 메탈로 티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예컨대, 아데노 바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토 메갈로 바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 가진다.

상기 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체 (숙주세포)를 선별하기 위한 것으로 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환된 세포의 선별이 가능하다. 상기 선택 마커는 대표적인 예로 암피실린, 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 Ncgl0251 유전자 변이체로서 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

재조합 벡터를 숙주세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 재조합 벡터를 적절한 숙주세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다.

재조합 미생물을 제작하기 위하여 원핵세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, E. coli XL1-Blue와 같은 대장균, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 투링겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속과 같은 다양한 장내균과 균주 등이 이용되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

재조합 미생물을 제작하기 위하여 진핵세포에 형질전환을 하는 경우에는 숙주세포로서 효모 (예컨대, 사카로마이세스 세레비지에), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 "형질전환(transformation)"은 외부 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미하며, "형질전환체(transformant)"는 외부 DNA가 도입되어 목적 유전자의 발현을 안정적으로 유지하는 숙주세포를 의미한다.

상기 형질전환은 숙주세포에 따라 적합한 벡터 도입 기술이 선택되어 목적 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 벡터 도입은 전기천공법(electroporation), 열 충격(heat-shock), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 초산 리튬-DMSO법, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다.

상기 형질전환체는 생체내 또는 시험관내에서 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질감염, 형질전환, 또는 감염된 세포를 포함하며, 재조합 숙주세포, 재조합 세포 또는 재조합 미생물과 동일한 용어로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주인 것일 수 있다.

상기 코리네박테리움 속 균주로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데저티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 수라나래에(Corynebacterium suranareeae), 코리네박테리움 루브리칸티스(Corynebacterium lubricantis), 코리네박테리움 두사넨세(Corynebacterium doosanense), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 우테레키(Corynebacterium uterequi), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 파캔세(Corynebacterium pacaense), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 휴미레듀센스(Corynebacterium humireducens), 코리네박테리움 마리눔(Corynebacterium marinum), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스페니스코룸(Corynebacterium spheniscorum), 코리네박테리움 프레이부르겐세(Corynebacterium freiburgense), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 카니스(Corynebacterium canis), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 레날레(Corynebacterium renale), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 카스피움(Corynebacterium caspium), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris), 코리네박테리움 슈도펠라지(Corynebacaterium pseudopelargi), 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens) 등일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 형질전환체는 전술한 Ncgl0251 유전자 변이체 또는 이로부터 암호화된 단백질 변이체를 포함하거나, 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 균주, 상기 Ncgl0251 유전자 변이체 또는 이로부터 암호화된 단백질 변이체를 발현하는 균주, 또는 상기 단백질 변이체에 대한 활성을 가지는 균주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서의 형질전환체는 상기 Ncgl0251 유전자 변이체 외에도 다른 유전자 변이체 또는 이로 암호화된 단백질 변이체를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 L-라이신 생산능을 가지는 것일 수 있다.

상기 형질전환체는 자연적으로 L-라이신 생산능을 가지고 있거나, 또는 인위적으로 L-라이신 생산능이 부여된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 Ncgl0251 유전자 변이체로 암호화된 단백질의 활성이 변화되어 L-라이신 생산능이 향상된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "L-라이신 생산능이 향상된"은 모균주에 비해 L-라이신의 생산성이 증가된 것을 의미한다. 상기 모균주는 변이의 대상이 되는 야생형 또는 변이주를 의미하며, 직접 변이의 대상이 되거나 재조합된 벡터 등으로 형질전환되는 대상을 포함한다. 본 발명에 있어서, 모균주는 L-라이신 생산능이 없거나 L-라이신 생산능을 가지며, 야생형 코리네박테리움 속 균주이거나 이로부터 변이된 코리네박테리움 속 균주일 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환체는 Ncgl0251 유전자 변이체가 도입됨으로써 Ncgl0251 유전자로 암호화된 단백질의 활성이 변화하여 변이 전 단백질을 포함하는 균주 (모균주)에 비해 증가된 L-라이신 생산능을 나타낸다. 구체적으로, 상기 형질전환체는 모균주에 비해 L-라이신 생산량이 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 증가하거나, 또는 1.1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 또는 10배 증가된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일례로, 상기 Ncgl0251 유전자 변이체가 도입된 형질전환체는 모균주에 비해 L-라이신 생산량이 5% 이상, 구체적으로는 5 내지 50% (바람직하게는 10 내지 40%) 증가된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환체를 포함하는 조성물은 L-라이신 생산용 조성물로서 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 형질전환체를 배지에 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산 방법을 제공한다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 공지된 문헌 (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20 내지 45℃, 예를 들면 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160시간일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지에서 L-라이신을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 L-라이신을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-라이신을 회수하는 단계는 배양 배지를 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-라이신을 회수하는 단계는 L-라이신을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 Ncgl0251 유전자 변이체는 Ncgl0251 유전자의 염기서열 중 하나 이상의 염기가 변이됨으로써 Ncgl0251 유전자로 암호화된 단백질 활성이 변화되어, 상기 유전자 변이체를 포함하는 재조합 미생물로부터 L-라이신을 효율적으로 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 라이신 생산능 향상 균주 선별을 위한 ALE

모균주로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) DS1 (수탁번호 KCCM12969P)을 사용하여 고농도 라이신 조건에서의 라이신 생산능이 향상된 균주를 선별하기 위한 적응 진화(adaptive laboratory evolution, ALE)를 수행하였다.

DS1의 균주 vial에서 순수 분리를 통해 12주의 DS1 (1세대, 1G)을 선별하였고, 종배양을 위해 각 colony를 CM 배지 (증류수 1 L에 글루코오스 5 g, NaCl 2.5 g, 효모 추출물 5.0 g, 유레아(urea) 1.0 g, 폴리펩톤 10.0 g 및 비프(beef) 추출물 5.0 g 함유, pH 6.8) 10 ml에 접종한 후 100 ml baffled flask에서 30℃, 200rpm으로 밤새 배양하였다. 이후 균주를 라이신 5%가 첨가된 ALE 배지 (하기 표 1 참조) 2 ml에 최종 OD₆₀₀ = 0.5가 되도록 접종하였고, polypropylene square 24-deepwell microplates (ENZYSCREEN BV)에서 30℃, 180rpm으로 20시간 배양한 후, 흡광도 (OD₆₀₀)를 측정하고서 새로운 plate에 다시 접종하였다. 이와 같이 20세대를 배양한 후 21세대에서 40세대까지는 라이신 6%가 첨가된 배지에서, 그리고 41세대에서 60세대까지 라이신 7%가 첨가된 배지에서 배양하여 적응 진화를 유도하였다. 적응 진화된 균주들에 대해 HPLC (Agilent)를 사용하여 배지 내 라이신 농도를 측정하였고, 라이신 7% 조건 배지에서 성장하는 균주, 즉 적응 진화된 균주 5주를 선별하였다. 라이신 생산능이 우수한 균주 1주의 세대별 3반복 측정 값의 평균치를 하기 표 2에 나타내었다.

성분	함량
Glucose	10 %
(NH₄)₂SO₄	55 g/L
Yeast extract	10 g/L
MgSO₄	1.2 g/L
KH₂PO₄	1.1g/L
ZnSO₄	0.9 mg/L
FeSO₄	180 mg/L
MnSO₄	180 mg/L
CuSO₄	0.9 mg/L
beta-alanine	9 mg/L
Nicotinamide	60 mg/L
Thiamine-HCl	9 mg/L
Biotin	1.8 mg/L
Urea	5 g/L

세대	라이신 5%		라이신 6%		라이신 7%
세대	OD	L-라이신 농도 (%)	OD	L-라이신 농도 (%)	OD	L-라이신 농도 (%)
1G (대조구)	8.5	0.83	7.4	0.71	6.8	0.64
30G	13	1.22	10.1	0.80	8.3	0.73
60G	14.8	1.50	13.5	1.12	12.7	1.01

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 선별주는 모균주 대비 고농도 라이신 존재 하에서 생육 및 라이신 생산성이 증가한 것으로 확인되었다.

이후, 라이신 무첨가 조건에서 선별주 5주의 라이신 생산성을 확인하였다. 100 ml baffled flask에 ALE 배지 10 ml를 분주하고, CM 배지에서 종배양된 각 균주를 부피를 기준으로 1%씩 접종하여 30℃, 200 rpm, 48시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC (Agilent)를 사용하여 배지 내 라이신 농도를 측정하였다. 라이신 생산능이 우수한 균주 1주의 세대별 3반복 측정 값의 평균치를 하기 표 3에 나타내었다.

세대	라이신 0%
세대	OD	L-라이신 농도 (%)
1G (대조구)	15.2	1.63
30G	15.8	1.83
60G	16.5	2.35

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 최종 60세대까지 적응 진화된 균주는 모균주 대비 라이신 농도가 약 44.2% 증가한 것으로 확인되었으며, 이를 DS1_ALE(60G)라 명명하였다.

라이신 생산성이 증가한 적응 진화된 균주 5주에 대해 전장유전체분석(WGS)과 비교게놈분석 (제노텍㈜, 대전)을 실시하였고, 모균주 대비 유전자 변이를 확인하였다. 그 결과, Ncgl0251 유전자 상의 1030번째 염기가 c에서 t로 치환됨으로써 Ncgl0251 유전자로 암호화된 아미노산 서열에서 344번째 아미노산 위치의 아르기닌이 시스테인으로 치환된 것으로 확인되었다.

실시예 2. Ncgl0251 유전자 변이 균주 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 genomic DNA를 주형(template)으로 하고, 프라이머 1 및 2와, 프라이머 3 및 4를 각각 이용하여 PCR로 증폭하였다. 각각의 PCR 산물을 정제하고 혼합한 후 프라이머 1 및 4를 이용하여 PCR로 증폭하여, 최종적으로 변이가 도입된 insert DNA를 얻었다. 이후 pCGI vector [Kim et al., Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130]를 프라이머 5 및 6으로 PCR 증폭하였고, insert DNA를 T4 Polynucleotide Kinase (New England Biolabs. Cat# M0201)로 5'-인산화시켜 ligation 후 E. coli DH5a (HIT Competent cells™, Cat No. RH618)에 형질전환 시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 도말하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 최종 형성되는 콜로니를 분리하여 삽입물(insert)이 정확히 벡터에 존재하는지 확인한 후, 이 벡터를 분리하여 코리네박테리움 글루타미쿰 DS1 균주의 재조합에 사용하였다.

PCR은 Thermocycler (TP600, TAKARA BIO Inc.)를 이용하여 각각의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100 μM가 첨가된 반응액에 올리고뉴클레오티드 1 pM, DS1_ALE(60G)의 염색체 DNA 또는 pCGI 벡터 10 ng을 주형(template)으로 이용하여, pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물 (Solgent) 1 유닛의 존재 하에서 25 ~ 30 주기(cycle)를 수행하였다. PCR 수행 조건은 (i) 변성(denaturation) 단계: 94℃에서 30초, (ii) 결합(annealing) 단계: 58℃에서 30초, 및 (iii) 확장(extension) 단계: 72℃에서 1 ~ 3분 (1 kb 당 1분의 중합시간 부여)의 조건에서 실시하였다.

형질전환으로 얻어진 colony에 대해 염기서열분석을 하여 insert DNA가 삽입된 colony를 선별하고, 컴피턴트 세포(competent cell)로 준비된 DS1에 전기천공(electroporation)을 한 후 상동 재조합(homologous recombination)을 유도하여 변이를 도입하였다. 여기서 제작된 변이 균주를 DS1/Ncgl0251(R344C)라 명명하였다.

여기서 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나타내었다.

프라이머		서열 (5'-3')	서열번호
1	Ncgl0251 F1	ctgttcgcttctctactgttgc	5
2	Ncgl0251 R1	tacgtgcctggagcatgcagtctggggacaggccgac	6
3	Ncgl0251 F2	gtcggcctgtccccagactgcatgctccaggcacgta	7
4	Ncgl0251 R2	gacttaagccttcttctggaggt	8
5	pCGI F	aggatccccgggtaccga	9
6	pCGI R	tggcgtaatcatggtcatag	10

실시예 3. Ncgl0251 유전자 변이 균주의 L-라이신 생산능 평가

실시예 1에서 적응 진화된 균주와 실시예 2에서 제작된 Ncgl0251 유전자 변이 균주의 L-라이신 생산능을 비교하였다.

ALE 배지 10 ml이 담긴 100 mL 플라스크에 CM 배지에서 종배양된 각 균주를 부피를 기준으로 1%씩 접종하여 30℃, 200 rpm, 48시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC (Agilent)를 사용하여 배지 내 라이신 농도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

균주	OD	L-라이신 농도 (%)
DS1	15.3	1.61
DS1_ALE(60G)	16.4	3.59
DS1/Ncgl0251(R344C)	15.4	2.03

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, Ncgl0251 유전자의 1030번째 염기를 c에서 t로 치환시켜 아미노산 서열에서 344번째 아미노산이 아르기닌에서 시스테인으로 변이된 균주 DS1/Ncgl0251(R344C)는 모균주 DS1에 비해 라이신 농도가 약 26.1% 향상된 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 Ncgl0251 유전자의 염기 변이가 적응 진화된 균주 DS1_ALE(60G)의 라이신 생산성 향상에 기여하는 유효 변이임을 시사한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국미생물보존센터(KCCM)

KCCM12969P

20210402

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열에서 1030번째 염기가 c에서 t로 치환된, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 Ncgl0251 유전자 변이체.
청구항 1의 유전자 변이체로 암호화된 단백질 변이체.
청구항 1의 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터.
청구항 3의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
청구항 4에 있어서,
상기 형질전환체는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주인 것인 형질전환체.
청구항 4에 있어서,
상기 형질전환체는 L-라이신 생산능을 가지는 것인 형질전환체.
청구항 4의 형질전환체를 배지에 배양하는 단계; 및
상기 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산 방법.