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KR102724939B1 - 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머 아쥬반트를 포함하는 신규한 면역원성 제형 - Google Patents

선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머 아쥬반트를 포함하는 신규한 면역원성 제형 Download PDF

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KR102724939B1
KR102724939B1 KR1020197001525A KR20197001525A KR102724939B1 KR 102724939 B1 KR102724939 B1 KR 102724939B1 KR 1020197001525 A KR1020197001525 A KR 1020197001525A KR 20197001525 A KR20197001525 A KR 20197001525A KR 102724939 B1 KR102724939 B1 KR 102724939B1
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기욤 리고
알렉시 기 앙드레 뤼시앙 파리소
뤼카 까렐 드
크리스땡 미셸 피에레뜨 앙드레오니
리디 레몰뤼
마리 가리노
장-프랑수아 꼬뜨
파트리시아 프로벡-뀌엘렉
장 헨슬러
베로니끄 샹봉
필리쁘 탈라가
Original Assignee
뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드
사노피 파스퇴르
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Abstract

본 발명은 새로이 적용되는 비 가교 폴리아크릴산 폴리머 아쥬반트를 포함하는 신규 면역학적 및 백신 조성물을 제공한다. 본 아쥬반트는 매우 다양한 표적 동물에 투여될 때 안전하고 유효한 백신을 제조하기 위해, 매우 다양한 면역원과 합하여질 수 있다. 면역원은 비활성화 병원체, 약독화 병원체, 서브유닛, 재조합 발현 벡터, 플라스미드 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 동물은 인간, 쥣과 동물, 개과 동물, 고양이과 동물, 말과 동물, 돼지과 동물, 양과 동물, 염소과 동물 및 소과 동물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

Description

선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머 아쥬반트를 포함하는 신규한 면역원성 제형
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 본원에 전체로서 참조로 인용되어 있는 미국 가출원 제62/351,492호(2016년 6월 17일 출원)의 우선권을 주장한다.
참조에 의한 인용
임의의 이전 출원들과 그에 인용된 모든 문헌들, 또는 소송중인 출원의 문헌들("타출원 인용 문헌") 및 이 타출원 인용 문헌에 인용 또는 참조되는 문헌들 모두, 그리고 본원에 인용 또는 참조되는 문헌들 모두("본원 인용 문헌"), 그리고 본원 인용 문헌에 인용 또는 참조되는 모든 문헌들은, 본원에 예시되거나 본원에 참조로서 인용된 임의의 문헌에 예시된 임의의 제품에 대한 임의의 제품 설명서, 제품 사양서, 설명서 및 제조자의 지침과 함께, 본원에 참조로서 인용되어 있고, 본 발명을 실시함에 있어 이용될 수 있다. 본 출원에서 이러한 임의의 문헌을 인용 또는 인지함은, 이 문헌들이 본 발명에 대한 선행 기술로서 유용함을 자인하는 것은 아니며, 또한 이처럼 인용된 특허 문헌들의 효력, 특허성 및/또는 강제 가능성에 대한 임의의 견해를 반영하는 것도 아니다. 본원에 GenBank 수탁 번호로써 인용된 모든 서열은 본원에 그 자체로서 참조로 인용되어 있으며, 이 서열들은 본 출원의 출원일 부로 GenBank에 제출된 것들이다.
본 발명의 분야
본 출원은 백신 분야에 속한다. 구체적으로 본 발명은 특정의 아쥬반트(adjuvant) 및 보강된 조성물(adjuvated composition), 그리고 이러한 아쥬반트 및 보강된 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
백신 조성물에서 아쥬반트로서 아크릴산 단위를 포함하는 폴리머를 사용하는 것은 이미 제안된 바 있다. 대부분의 경우, 아쥬반트로서 권장되는 폴리아크릴산 폴리머는 가교 폴리머이다. 예를 들어 미국 특허 제3,790,665호 및 미국 특허 제3,919,411호에는 폴리알릴 당체와 가교된 아크릴산 폴리머를 아쥬반트로서 사용하는 것이 기술되어 있다. 특히 폴리알코올 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된, 아크릴산 또는 메타크릴산의 폴리머에 대응하는 아쥬반트는 또한 미국 특허 제7,163,926호에 기술되어 있다. 이러한 종류의 폴리머는 상표명 CARBOPOL®로서 시판되고 있다. 고 Mw(즉 제조자에 의해 제공된 데이터에 따르면 974P의 경우에는 약 3백만) CARBOPOL 974P, 934P 및 971P를 사용하는 것은 미국 특허 제7,163,926호, 유럽 특허 제1 058 558호 및 WO 2009/118523에 기술되어 있다.
몇몇 연구 활동들은 중량이 작은 선형의 폴리아크릴산 폴리머를 사용하는 것, 또는 아크릴산/아크릴산 에스테르 코폴리머를 사용하는 것에 집중하였다.
WO 2005/065712에는, 아크릴산 또는 이의 염으로부터 유래하는 단위들을 포함하는 협소한 분자량 분포 폴리머와, 병원성 유기체 또는 암, 또는 하나 이상의 항원 또는 면역원에 대해 약리 활성을 보이는 성분을 포함하는 복합체가 제안되어 있다. 이 폴리머는 아크릴산 또는 메타크릴산 또는 이것들의 염의 호모폴리머 또는 코폴리머일 수 있다. 분자량 100,000 이하가 지지되고 있다.
미국 특허 제6,610,310호 및 유럽 특허 제0 804 234호에는, 음이온성 구성적 반복 모노머 단위와 소수성 구성적 반복 모노머 단위를 가지는 폴리머를 사용하는 것이 기술되어 있다. 특히 유럽 특허 제0 804 234호에는, 수용액 중 백신 아쥬반트로서 부분적으로 아크릴산 단위(음이온성 구성적 반복 단위)와 아크릴산 에스테르 단위(구성적 소수성 반복 단위)로 이루어진 폴리머를 사용하는 것이 개시되어 있다. 이들 문헌에서 폴리아크릴산 폴리머인 CARBOPOL® 907은 지지되고 있는 자체의 상동성 부분 에스테르화 폴리아크릴산 폴리머와 비교되고 있으며, 형편없는 면역 반응을 제공한다고 한다. 이와 유사하게 L.Hilgers외 다수의 저서[Vaccine, 2000, 18, 3319-3325 및 Vaccine 1998 Vol. 16, No. 16, 1575-1581]에는 또한 이처럼 에스테르화된 폴리머를 사용하는 것이 개시되어 있으며, 폴리아크릴산의 알킬 에스테르가 사용되면 대다수의 경우에 우수한 면역 반응이 제공된다고 교시되어 있다. CARBOPOL® 907은 오늘날에는 더 이상 사용 불가한 폴리아크릴산 폴리머이며, 이의 특징은 신뢰할 수 있을 정도로 확인되지는 못하고 있다. 이는 가교 폴리머로서 공지된 CARBOPOL 계열에 속한다. 이 폴리머는 또 다른 것에 대한 문헌에 개시된 폴리머의 중량 평균 분자량(Mw)과 상이한 중량 평균 분자량을 가지는데; 한 저서[Vaccine, 1998 Vol. 16, No. 16, page 1575 - 1581]에는 분자량 측정에 사용되는 방법에 따르면 대략적으로 중량 평균 분자량 Mw가 450 kDa이라고 개시되어 있다. 이 저서에는 폴리머의 다분산 지수는 언급되어 있지 않다. 이와는 반대로, 저서["Liquid Detergents", surfactant series Science, Vol. 67, page 147 (1996, CRC Press, Publisher: Kuo-Yann Lai]에는 겔 투과(GPC)에 의한 크로마토그래피 기술로 측정된 중량 평균 분자량 Mw가 603.3kDa이고, 다분산 지수 IP가 4.124인 동일 폴리머가 개시되어 있다. CARBOPOL® 907의 특징에 관하여는 의심스러운 부분이 있다. 뿐만 아니라, 본 특허 출원의 실시예들에 보인 바와 같이, 대체로 제조자에 의해 제공된 Mw 데이터는 표준화된 방법에 의해 측정될 수 있는 Mw와 상이하다.
현존하는 폴리머 아쥬반트의 정확한 특징에 대한 불확실성에 더하여, 개선된 안전성과 효능 특성을 가지는 신규 아쥬반트를 개발할 필요가 대두되고 있는 실정이다. 본 개시내용은 비(非)가교 아크릴산 폴리머 아쥬반트를 포함하는, 안전하고 유효한 면역학적 및 백신 제형을 제공함으로써 이러한 필요를 충족시켜준다.
제1 양태에서, 본 발명은 백신 아쥬반트로서 신규 폴리머 군을 포함하는 제형을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 폴리머 군은 매우 다양한 동물 종에의 투여에 사용되기 위한 제형을 매우 다양한 항원에 대해 보강(adjuvanting)함에 있어서 그 안전성과 효능이 입증되었다. 이 폴리머 군은, 종래 기술에서 사용되었던 폴리아크릴산 폴리머의 다른 군에 비하여 유리한 아쥬반트 특성을 나타낸다.
제1 양태의 구현예에서, 본 발명은 아쥬반트로서 특히 유효한 폴리머 군을 제공한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명은 예상외로 Th-2 반응에 더하여 강력한 Th-1 반응을 촉진하는 폴리머 군을 제공한다.
추가로, 본 발명에 따라 선택된 일부 폴리머는 아쥬반트 조성물을 구성하고, 결과적으로는 백신 조성물을 이룬다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은, 특히 백신 보관 안정성과 종종 양립할 수 없는 오염물질의 감소 및 이의 재현 가능성에 있어서 더욱 안전하다. 더욱 구체적인 구현예에서, 선택된 폴리머는 안정적이며 또한 고압증기멸균에 의해 멸균될 수 있다.
이러한 맥락에서, 본 발명은 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw가 350 kDa 내지 650 kDa의 범위인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용될 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
구체적으로 상기 폴리아크릴산 폴리머 염은 배타적으로 아크릴산 염에 대응하는 단위로 이루어지거나, 또는 배타적으로 아크릴산의 유리 산 형태에 대응하는 단위 또는 아크릴산 염에 대응하는 단위로 이루어진다.
유리하게, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염은 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 산화제를 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만 포함하고/포함하거나 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 과황산염을 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만 포함한다.
더욱 구체적인 구현예에서, 상기 폴리아크릴산 폴리머는 Na+와의 염이다.
구체적인 구현예들에서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 다분산 지수는 약 4 이하, 바람직하게는 약 2.5 이하이다.
구체적인 구현예들에서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw는 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 4 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw는 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 4 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw는 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 2.5 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw는 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 2 이하이다.
유리하게 상기 폴리아크릴산 폴리머 염은 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 유리 산 형태 또는 염 형태의 아크릴산 모노머를 0.005 %w/w 미만 포함한다.
유리한 구현예들에 따르면, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염은 정용여과 및 멸균된다.
유리하게, 본 발명에 기술된 폴리아크릴산 폴리머 염은 백신 조성물로 수득되는 Th1 면역 반응을 향상시키는데 사용된다. Th1 면역 반응은, 저 분자량 Mw의 폴리아크릴산 폴리머 염이 아쥬반트로서 사용될 때 수득되는 Th1 면역 반응보다 더 크다.
본 발명의 또다른 양태는 또한 하기 연속 단계들, 즉
a) 폴리아크릴산 폴리머 용액을 제공하는 단계,
b) 불순물을 제거하기 위하여 이 폴리아크릴산 폴리머 용액을 정제하는 단계, 및
c) 폴리아크릴산 폴리머의 정제된 용액을 멸균하는 단계
를 포함하는, 본 발명에 기술된 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위한 방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 또한 상기 제조 방법을 포함하는 본 발명에 기술된 폴리아크릴산 폴리머 염 용액을 보관하기 위한 방법으로서, 제조 방법을 완료한 후, 이로부터 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 용액에 보관하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이기도 하다.
제3의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 기술된 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염과 백신 제제(예컨대 면역원 또는 면역원을 암호화하는 핵산) 적어도 하나를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이기도 하다. 구체적인 구현예에서, 면역원은 비활성화된 병원체, 약독화된 병원체, 서브유닛 항원, 정제 항원, 미정제 항원, 또는 세균, 효모, 식물, 곤충 또는 동물 세포를 사용하여 재조합 제조된 항원, 그리고 플라스미드를 포함하는 발현 벡터 등으로부터 선택될 수 있다. 항원은 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 한외여과, 초원심분리, 크기별 배제 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 PEG-정제(이에 한정되는 것은 아님)에 의해 정제될 수 있다. 병원체는 그 기원이 세균, 바이러스, 원생동물 또는 진균일 수 있거나, 또는 면역원은 항독소를 구성할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 백신화 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 백신화 대상체 내에서 병원체에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 개시내용, 구체적으로 특허청구범위에 있어서, "~를 포함하다(comprise)", "~에 포함된(comprised)", "~를 포함하는(comprising)"등의 용어들은 이러한 용어들이 미국 특허법 하에 인정되는 의미를 가질 수 있는데; 예컨대 상기 용어들은 "~를 포함하다(include)", "~에 포함된(included)", "~를 포함하는(including)"등을 의미할 수 있음과, "본질적으로 ~로 이루어진" 및 "본질적으로 ~로 이루어지다"와 같은 용어들은 이러한 용어들이 미국 특허법에 의해 인정되는 의미를 가지는데; 예컨대 상기 용어들은 분명치 않게 나열된 요소들을 허용하되, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적이거나 신규한 특징에 영향을 미치는 요소들은 배제함을 주목한다.
본원에 사용된 바와 같은 "약"이란 용어는, "대략적으로", "~의 범위 내", "대게" 또는 "~ 언저리"를 의미한다. "약"이란 용어가 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 제시된 수치 값보다 큰 값과 작은 값의 경계를 확장함으로써 해당 범위를 수정한다. 일반적으로 "약"이란 용어는 본원에서 진술된 값보다 크고 작은 수치 값을 10%의 변차만큼 수정하기 위해 사용된다. 일 양태에서, "약"이란 용어는 이 용어가 사용된 수의 수치 값의 ±20%를 의미한다. 그러므로 "약 50%"라 함은 "45% ~ 55%"의 범위에 있음을 의미한다. 본원에서 한계치들에 의해 나열된 수치 범위들은 해당 범위 내에 포함되는 모든 수와 분수를 포함한다(예컨대 "1 내지 5"는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4 및 5를 포함함). 모든 수와 이의 분수는 "약"이란 용어에 의해 수정될 것으로 추정됨도 또한 이해될 것이다.
이러한 구현예들과 기타 구현예들이 하기 상세한 설명에 개시되어 있거나, 또는 여기로부터 자명하며, 또한 여기에 포함되어 있다.
본 발명의 최선의 양태를 비롯하여 당 업자에게 개시된 본 발명의 전체 및 실시 가능한 개시내용은, 첨부된 도면들에 대한 참조를 비롯하여 본 명세서의 나머지 부분에 더욱 구체적으로 제시되어 있는데, 이때
도 1은 당일, 21일 및 35일에 마우스 당 1회 주입시 2.5μg PS5-rEPA 단독 주입, 또는 200μg의 CARBOPOL, PAA20 또는 PAA225000 중 어느 하나와의 공동 주입으로 면역화된 OF1 마우스에 대한 항체(IgG1 및 IgG2a) 역가를 보여주는 그래프이고;
도 2는 MRC5 섬유아세포에 대해 측정된 바와 같은, 2μg의 hCMV-gB 및 스쿠알렌 에멀전, PAA3000, PAA6000, PAA50000, PAA60000, PAA20 또는 PAA225000으로 면역화된 C57BL/6 마우스 군의 혈청에 대한 기하학적 평균 중화 항체 역가(GMT)를 보여주는 그래프이며;
도 3은 ARPE-19 세포(인간 상피 세포)를 대상으로 한 혈청중화(seroneutralization)에 의해 측정된 바와 같은, 도 2의 군들에 대한 GMT를 보여주는 그래프이고;
도 4는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 도 2의 군들에 있어서 hCMV-gB 항원에 대해 생성된 혈청 IgG1 항체를 보여주는 그래프이며;
도 5는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 도 2의 군들에 있어서 hCMV-gB 항원에 대해 생성된 혈청 IgG2c 항체를 보여주는 그래프이고;
도 6은 CBA Flex 세트 키트를 사용하여 측정된 바와 같은, 도 2의 군들에 있어서 IL5 시토카인 수준을 보여주는 그래프이며;
도 7은 CBA Flex 세트 키트를 사용하여 측정된 바와 같은, 도 2의 군들에 있어서 IFNγ 시토카인 수준을 보여주는 그래프이고;
도 8은 비활성화된 광견병 바이러스 + PAA225000; AF03; PAA60000; 또는 스쿠알렌 에멀전으로 백신화된 개과 동물의 군에 대한 광견병 혈청시험 결과를 제시하는 그래프이며;
도 9는 카나리아 두창 매개 재조합 인플루엔자와 함께, (1) PBS; (2) 카보머(4 mg/ml); (3) PAA60000(4 mg/ml); 또는 (4) PAA225000(4 mg/ml)으로 백신화된 개과 동물 군들에 대한 CIV 혈청시험 결과를 제시하는 그래프로서, 5 군은 PBS만을 투여받았을 때(즉 재조합 플루 항원도 아쥬반트도 투여받지 않았을 때)의 그래프이고;
도 10은 도 9에 보인 바와 같은 혈청시험 데이터 중 41일의 데이터를 확대하여 제시하는 그래프이며;
도 11은 vCP1533+vCP2242(각각은 인플루엔자 바이러스 유래 HA 유전자를 보유함) 및 파상풍 독소와, 하기, 즉 (A) 카보머(4 mg/mL); (B) PAA60000(4 mg/mL); (C) PAA225000(4 mg/mL); (D) ADVAX1(20 mg/mL); (E) ADVAX2(20 mg/mL) 중 하나로 백신화된 말과 동물 군에 대한 평균 SRH-측정 인플루엔자 항체 역가를 보여주는 그래프로서, F군은 PBS만을 투여받았을 때(즉 항원도 아쥬반트도 투여받지 않았을 때)의 그래프이고;
도 12는 35일까지의, 말과 동물 군들 각각에 대한 파상풍 혈청시험 결과를 보여주는 그래프임. 군들은 도 11에 표시된 군들과 동일함;
도 13은 63일까지의, 말과 동물 파상풍 혈청시험 결과를 보여주는 그래프이고;
도 14는 (59일까지의) 돼지 군들 각각에 대한 평균 SpaA 혈청시험 결과를 보여주는 그래프임. 군: (G1) SpaA + TS6; (G2) SpaA + PAA60000; (G3) SpaA + PAA225000; SpaA-FlaB-His + PBS; (G5) SpaA-FlaB-His + PAA225000; (G6) PBS.
본 발명의 또다른 목적, 특징 및 양태들은 이하 상세한 설명에 개시되어 있거나, 이로부터 자명하다. 본 발명에 논의된 내용은 단지 예시적 구현예들에 대한 기술이지, 예시적 구성으로 구현된 본 발명의 더 넓은 양태들을 제한하고자 하는 것이 아님은 당 업자에 의해 이해될 것이다. 실상, 본 발명의 범위와 사상으로부터 벗어나지 않고 본 발명에 다양한 변형과 수정이 이루어질 수 있음은 당 업자들에게 분명할 것이다. 예를 들어 일 구현예의 일부로서 예시 또는 기술된 특징은 또 다른 구현예에서 또 다른 추가의 구현예를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 본원에 첨부된 특허청구범위와 이의 균등범위 내에 있는 것으로서 이러한 변형과 수정을 포함하도록 의도된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허들, 공개된 특허들 및 참고문헌들의 내용은 전체로서 본원에 참조로 인용되어 있다.
폴리아크릴산 폴리머의 특징
본 발명에 사용된 폴리머는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머이지, 가교 폴리머가 아니다. "폴리아크릴산 폴리머"란, 아크릴산 단위들로 배타적으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 그러므로 염의 형태일 때 상기 폴리아크릴산 폴리머 염은 아크릴산의 염에 대응하는 단위들로 배타적으로 이루어지거나, 또는 아크릴산의 유리 산 형태에 대응하는 단위와, 아크릴산의 염에 대응하는 단위로 배타적으로 이루어진다.
선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머는 오로지 아크릴산만을 모노머로 하여 중합함으로써 수득된다. 보통 중합은 개시제 또는 촉매로서 산화제를 사용하는 라디칼 중합에 의해 수행된다. 가장 흔히 사용되는 산화제는 과황산염(과산화중황산염), 예를 들어 나트륨 또는 칼륨 과황산염이다. 분지형 폴리아크릴산 폴리머는, 예를 들어 문헌[Macromolecules 2011, 44, 5928-5936]에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 폴리머가 선형일 때, 이의 마크-하우윙크(Mark-Houwink) 기울기는 0.7 이상이다[Yan J.K., Pei J.J., Ma H.L., Wang Z.B. 2015. Effects of ultrasound on molecular properties, structure, chain conformation and degradation kinetics of carboxylic curdlan. Carb. Polymers. 121, 64-70].
폴리아크릴산 폴리머의 "약학적으로 허용 가능한 염"이란, 약학적으로 허용 가능한 양이온(들), 구체적으로 1가 양이온(들)과, 폴리머의 음이온 형태의 염을 의미한다. 1가 양이온의 예들로서는 알칼리 금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+, 또는 암모늄 양이온, 예컨대 NH4 +가 있다. pH 5.5 내지 8인 수용액, 예컨대 pH가 7에 가까운 수용액에 있어서, 폴리아크릴산 폴리머의 산성 기는 음이온 형태를 취하여, 수용액 중에 또한 존재할 양이온과 염을 형성할 것이다. 본 발명자는 폴리머에 산기를 가지는 유리 산 형태의 아크릴산 단위와, 산기를 가지는 음이온 형태의 또다른 단위가 존재함으로 말미암아 염을 형성하도록 만들 수 있다. pH에 따라서, 폴리머의 산기는 배타적으로 유리 산 형태로 존재할 수 있거나, 또는 염의 경우 폴리머의 산기는 배타적으로 염 형태로 존재할 수 있거나, 또는 몇몇 산기는 산성 형태로, 다른 것들은 염 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리아크릴산 폴리머의 바람직한 염은 Na+와의 염이다. 그러므로 본 발명에 기술된 구현예 어느 것의 것이든, 폴리아크릴산 폴리머는, 바람직하게 나트륨 염의 형태를 가질 것이고, 그러한 경우 모든 특징(Mw, IP, 모노머 및 과황산염 함량 등)은 폴리아크릴산 폴리머의 염(즉 나트륨 염)에 관한 것일 것이다.
본 특허출원의 명세서에 있어서, 이 "폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염"은 간단히 "폴리아크릴산 폴리머 염"으로 칭하여질 것이고, 바람직하게는 폴리아크릴산 폴리머 나트륨 염이다.
폴리아크릴산 폴리머 염은 고체 형태(침전물 또는 분말)로 존재할 수 있거나, 바람직하게는 액체 제형 중에 있을 수 있다. 액체 제형은 폴리아크릴산 폴리머 염과 수용액을 포함할 것이다. 바람직하게 이러한 제형의 pH는 5.5 내지 8.0의 범위이다. 이 pH는 수용액 중에 NaOH와 같은 염기를 혼입시킴으로써 수득될 수 있다. 수용액은 완충제, 예컨대 인산염 완충제, TRIS(2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올), HEPES(2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄-1-설폰산), 히스티딘 또는 시트르산염 완충제로 수득된 완충 수용액일 수 있다. 액체 제형은 또한 하나 또는 수 개의 추가 염, 예컨대 NaCl을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 하기 특징들, 즉
- 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw가 350 kDa 내지 650 kDa 범위라는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형이 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만의 산화제, 및/또는 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만의 과황산염을 포함하는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염이 4 이하, 바람직하게는 2.5 이하인 다분산 지수를 가진다는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa 범위이고, 다분산 지수는 4 이하이거나, 또는 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa 범위이고, 다분산 지수는 4 이하라는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa 범위이고, 다분산 지수는 2.5 이하이거나, 또는 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa 범위이고, 다분산 지수는 2 이하라는 점
- 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이라는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형이 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 아크릴산 모노머(유리 산 형태 또는 염 형태)를 포함하는 점
중 하나를 가지거나, 이러한 특징들을 임의로 조합하여 가지거나, 또는 이러한 특징들이 서로를 배척하지 않는다면 심지어 상기 특징들을 모두 가지는, 폴리아크릴산 폴리머 염, 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형을 아쥬반트로서 사용할 것이 제안된다.
구체적으로
- 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 4 이하이며, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 과황산염의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만이고, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 유리 산 형태 또는 염 형태인 아크릴산 모노머의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만이며; 유리하게 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이라는 점, 또는
- 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2.5 이하이며, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 과황산염의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만이고, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 유리 산 형태 또는 염 형태인 아크릴산 모노머의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만이며; 유리하게 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이라는 점, 또는
- 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 4 이하이며, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 과황산염의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만이고, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 유리 산 형태 또는 염 형태인 아크릴산 모노머의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만이며; 유리하게 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이라는 점, 또는
- 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2 이하이며, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 과황산염의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만이고, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 유리 산 형태 또는 염 형태인 아크릴산 모노머의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만이며; 유리하게 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이라는 점
에 의해 특징지어지는, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형을 아쥬반트로서 사용할 것이 제안된다.
유리하게 액체 제형 하에 폴리아크릴산 폴리머 염은 정용여과된다.
유리하게 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형은 멸균된다. 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형이 정용여과될 때, 정용여과 이후에 멸균이 이루어진다.
본 발명에 따르면, 중량 평균 분자량 Mw는 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 구하여진다. 유리하게 크기별 배제 크로마토그래피 컬럼에 의한 크로마토그래피 이후 3개의 검출기, 즉 직각 광 산란 검출기, 굴절률 검출기 및 4-모세관 미분 점도계(four-capillary differential viscometer)가 사용될 것이다. 실시예들에 제공된 상세한 절차들은, 바람직하게 본 발명에 따라서 Mw, IP(다분산 지수), 폴리머 농도 및 마크-하우윙크 기울기를 측정하기 위해 사용된다. Mw 측정을 위하여 사용되는 dn/dc는, 바람직하게 공지된 농도의 폴리아크릴산 폴리머 패널을 가지는 굴절률 검출기를 사용하여 결정된다.
과황산염의 함량과, 유리 산 형태 또는 염 형태의 아크릴산 모노머의 함량은, 전도도 검출이 수반되는 고 성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게 실시예, 구체적으로 "I.2 과황산염 및 아크릴산염 모노머의 측정"이라는 표제의 문단 B에 상세히 기술된 프로토콜이 적용될 수 있다.
폴리아크릴산 폴리머의 제조 및 보관
폴리아크릴산 폴리머 원료 중에는 중합되지 않은 함유물인 아크릴산 또는 아크릴산염 염에 대응하는 함유물인 잔류 모노머가 존재한다. 폴리아크릴산 폴리머 중합시 중합 개시제, 보통은 산화제, 예컨대 과황산염이 중합을 개시하는 촉매로서 사용된다. 폴리아크릴산 폴리머 원료 중에는 중합 공정에 의해 소비되지 않은 중합 개시제(대게는 과황산염과 같은 산화제) 잔류 함량만큼이 남아 있을 수 있다.
시판중인 폴리아크릴산 폴리머에는 종종 잔류 모노머, 산화제(들) 함량 및 이것들의 정확한 Mw 및 이것들의 올리고머 함량에 대한 사양이 제공되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 아쥬반트 조성물 및 아쥬반트를 함유하는 백신 조성물의 안정성 및/또는 백신 조성물의 독성을 고려하였을 때, 유해할 수 있는 화합물 잔류 함량만큼이 존재하게 될 위험을 피하기 위해 아쥬반트 조성물 제조에 사용되도록 구입된 폴리아크릴산 폴리머 원료를 체계적으로 정제할 것이 제안된다. 추가로 본 발명에 따르면, 중요한 함유물인 산화제(들), 예컨대 과황산염은 열 처리시 폴리머의 안정성에 유해하고, 고압증기멸균에 의한 멸균을 방해함이 인지되었다.
본 발명은 하기 연속 단계들, 즉
a) 폴리아크릴산 폴리머 용액을 제공하는 단계,
b) 불순물을 제거하기 위하여 이 폴리아크릴산 폴리머 용액을 정제하는 단계, 및
c) 폴리아크릴산 폴리머의 정제된 용액을 멸균하는 단계
를 포함하는, 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염, 구체적으로 "폴리아크릴산 폴리머의 특징" 이라는 표제의 문단에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
단계 a), b) 및 c)에 있어서, 용액은, 약학적으로 허용 가능한 염으로서 원하는 염의 형태를 바로 가지거나, 또는 최소한 부분적으로 자체의 유리 산 형태를 가지는 폴리아크릴산 폴리머의 용액일 수 있다. 만일 단계 a)에서 용액이 유리 산 형태의 폴리아크릴산 폴리머 용액이면, 약학적으로 허용 가능한 염으로서 원하던 염의 용액을 대상으로 수행되는 단계 b)의 정제 및 단계 c)의 멸균 이후에 염화가 수행될 수 있다. 유리 산 형태의 폴리아크릴산 폴리머 용액을 대상으로 단계 c)의 멸균 단계를 수행하는 것과, 멸균 이후에 염화를 수행하는 것도 또한 가능하다.
만일 염화가 필요하면, 염화는 임의의 단계에서 원하는 염에 따라 NaOH 또는 KOH와 같은 염기를 용액에 혼입함으로써 이루어질 수 있다.
예를 들어 정제 및/또는 멸균은 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염의 용액을 대상으로 수행된다. 이 용액은, 예를 들어 완충된 수용액, 구체적으로는 인산염 완충제 또는 TRIS, HEPES, 히스티딘 또는 시트르산염 완충제로 완충된 수용액이다. 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염의 수용액은 또한 하나 또는 수 개의 부가 염, 예컨대 NaCl을 포함할 수 있다. 이러한 경우들에서, 본 발명에 따른 방법으로서, 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염, 구체적으로는 "폴리아크릴산 폴리머의 특징"이라는 표제의 문단에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위한 방법은 하기 연속 단계들, 즉
a) 폴리아크릴산 폴리머의 선택된 약학적으로 허용 가능한 염의 용액을 제공하는 단계,
b) 불순물을 제거하기 위하여 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 용액을 정제하는 단계, 및
c) 폴리아크릴산 폴리머 염의 정제되어 수득된 용액을 멸균하는 단계
를 포함한다.
유리하게, 단계 a)의 폴리아크릴산 폴리머 용액의 마크-하우윙크 기울기는 0.7 이상이다. 용액 중 폴리아크릴산 폴리머가 염의 형태를 가질 때, 이 마크-하우윙크 기울기는 폴리아크릴산 폴리머 염에 관한 것이다.
정제는 소분자들을 제거할 것이다. 정제는 투석, 정용여과, 한외여과 또는 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 정용여과 및 한외여과는 다공성 막 위에서의 직교류 여과(접선 유동 여과라고도 칭하여짐)를 이용한다. 폴리아크릴산 폴리머를 함유하는 용액이 막 위를 순환하다가, 막을 통과할 투과물(permeate) 중 소분자를 포함하는 용액 일부가 제거된다. 정제된 폴리아크릴 폴리머를 포함하는 용액의 또 다른 일부(농축물(retentate)이라고도 칭하여짐)는 막의 표면 위를 순환할 것이다. 농축물은 순환 루프를 따라서 순환하다가 수 회에 걸쳐 정용여과 또는 한외여과될 수 있다. 투과물의 유속과 동일한 속도로 순환하는 농축물에 용매(통상 수성 완충제 또는 염 수용액)가 첨가되어 투과물 용적만큼이 이 용매에 의해 대체되는 결과, 농축물 용적은 일정하게 유지된다. 제거된 분자의 크기는 상기 막의 컷-오프(cut-off) 에 의해 측정된다. 유리하게 컷-오프 범위가 1 kDa 내지 80 kDa, 바람직하게는 2 kDa 내지 50 kDa인 막이 사용될 수 있다. 이러한 막은, 예를 들어 Merck Millipore로부터 입수 가능하다. 막의 컷-오프는 공칭 분자량 한계(Nominal Molecular Weight Limit; NMWL) 또는 이의 분자량 컷-오프(Molecular Weight Cut Off; MWCO)에 따라서 등급이 메겨진다. 예를 들어 30 kDa 등급 UF 막은 분자량이 30 킬로달톤인 시험 단백질은 배제할 것이다. 이 시험 단백질의 90%는 농축물 중에 남을 것이고, 10%는 막을 통과하여 투과물에 들어갈 것인데, 그 결과 만일 본 공정 진행 중에 완충제 또는 염수 용액이 농축물에 첨가되지 않는다면, 단백질 농축이 달성될 것이다.
일반적으로 농축물 순환의 유속은 50 L/H/m2 내지 80 L/H/m2이다. 경막압(Transmembrane Pressure; TMP)은, 예를 들어 0.9 +/- 0.1 bar이다.
그러므로 단계 b)의 정제는 투석, 정용여과, 한외여과 또는 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 정제는 폴리아크릴산 폴리머를 2 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게 10 mg/ml 내지 30 mg/ml 함유하는 용액을 대상으로 수행될 수 있다. 용액 중 폴리머가 염의 형태로 존재하면, 이 농도는 폴리머 염에 관한 것이다.
유리하게 정제는 컷-오프가 1 kDa 내지 80 kDa, 바람직하게는 2 kDa 내지 50 kDa인 막이 사용되는 정용여과에 의해 수행된다.
바람직하게 정제는
- 정제(구체적으로 정용여과에 의한 정제) 후 수득된 용액의 총 건물량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만의 과황산염, 더욱 일반적으로는 정제(구체적으로 정용여과에 의한 정제) 후 수득된 용액의 총 건물량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만의 산화제, 및/또는
- 정제(구체적으로 정용여과에 의한 정제) 후 수득된 용액의 총 건물량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 아크릴산 모노머(유리 산 형태 또는 염 형태)
를 가지는 용액 중의, 폴리아크릴산 폴리머의 회수가 허용되는 조건에서 수행된다.
회수된 폴리아크릴산 폴리머의 중량 평균 분자량 Mw는 350 kDa 내지 650 kDa의 범위일 수 있고, 이의 다분산 지수는 4 이하일 수 있다.
정제 디바이스는 원하는 불순물을 제거하기 위한 것으로서 선택될 것이다. 예를 들어 정제에 한외여과 또는 정용여과가 사용되면, 막의 컷-오프는 제거될 불순물에 따라서 선택될 것이다. 컷-오프가 적어도 20 kDa이면, 본질적으로 과황산염 및 모노머와 같은 소분자들은 교차 여과(cross-filtration)에 의해 제거된다. 컷-오프가 20 kDa보다 더 크면, 올리고머와 같이 더 큰 분자들도 또한 제거되며, 결과적으로 정제를 통해 IP는 감소하고, Mw는 증가하게 된다.
- 바람직하게 정용여과 또는 한외여과는 사용된 막의 컷-오프에 의해 수행되거나, 또는 더욱 일반적으로 정제는 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2.5 이하; 또는 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2 이하이고,
- 정제(구체적으로 정용여과에 의한 정제) 후 수득된 용액의 총 건물량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만의 과황산염, 또는 더욱 일반적으로는 정제(구체적으로 정용여과에 의한 정제) 후 수득된 용액의 총 건물량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만의 산화제, 및/또는
- 정제(구체적으로 정용여과에 의한 정제) 후 수득된 용액의 총 건물량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 아크릴산 모노머(유리 산 형태 또는 염 형태)를 가지는 용액 중의 폴리아크릴 산 폴리머의 회수를 허용하는 조건 하에서 수행된다.
유리하게 정제 단계 이후에 수득된 용액은 2 mg/mL 내지 50 mg/mL의 폴리아크릴산 폴리머 염, 구체적으로는 적어도 10 mg/ml의 폴리아크릴산 폴리머 염을 함유한다.
정제 공정의 주요 결과는, 소분자, 예컨대 산화제(즉 과황산염) 및 아크릴산염 모노머를 제거하는 것이다.
이러한 정제 단계를 체계적으로 수행함으로써 아쥬반트로서 사용되는 중합체 조성물의 특징들은 더 잘 정의될 수 있으며, 조성물은 더 안전하고 더 안정적이다. 배아 독성이고 기형 발생원인 것으로 의심되는 아크릴산 모노머의 함량은 상당히 감소된다.
상기에서 설명된 바와 같이, 디바이스(구체적으로 막의 컷-오프) 사용에 따른 정용여과, 투석, 한외여과 또는 크기별 배제 크로마토그래피는 또한, 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 중량 평균 분자량 증가 및 이의 다분산 지수(IP) 감소를 초래한다. 실상 사용된 기술에 따라서, 그리고 구체적으로 정용여과, 투석 및 한외여과에서 사용된 막의 컷-오프에 따라서, 또는 크기별 배제 크로머토그래피에서 사용된 겔의 투과 특징에 따라서, 올리고머도 또한 제거되며, 그 결과 Mw는 증가할 것이고, IP는 감소할 것이다. 이러한 경우들에 있어서, 폴리머 염의 조성은 더 엄격하게 제어된다.
멸균은 멸균 여과(들) 또는, 바람직하게 고압증기멸균에 의해 수행될 수 있다. 멸균 여과는 0.2 μm의 공극을 가지는 막에서 수행된다. 산화제의 제거는, 약전에 의해 권장되는 고압증기멸균에 의한 멸균 수행을 허용한다. 고압증기멸균은 100℃ 내지 150℃의 온도에서, 5 분 내지 1 시간의 시간 동안 수행될 수 있다. 정제 단계에 의해 수득된 폴리머는 시간이 경과함에 따라 더 안정적이며, 열 처리에 더 잘 견딘다.
본 발명은 또한 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염, 구체적으로 "폴리아크릴산 폴리머의 특징" 이라는 표제의 문단에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염 용액을 보관하기 위한 방법으로서, 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 제조 방법 이후, 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 용액 중에 보관하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이기도 하다. 보관 단계는 1 일 내지 2 년 동안 지속될 수 있다. 보관 온도는, 대게 0℃ 내지 30℃의 범위, 구체적으로는 2℃ 내지 8℃의 범위, 또는 실온, 일반적으로 약 22℃일 것이다. 보관은 단계 c), 즉 멸균 단계 직후에 수행될 수 있다.
이러한 아쥬반트의 액체 형태로의 보관은, 백신 조성물 제조를 위해 폴리머 재현탁/희석을 필요로 하는 건조 형태로의 보관에 비하여 매우 유리하며, 추가 조작이 필요없다.
구체적으로 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 용액이 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 산화제를 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만 포함하고/포함하거나, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 과황산염을 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만 포함할 때, 이 용액은 특히 안정적이다.
보관 단계는 폴리아크릴산 폴리머 염의 용액을 용기 내에 담아서 이를 보관함으로써 수행된다. 보관 중 보관된 용액은, 예를 들어 폴리아크릴산 폴리머 염을 2 mg/ml 내지 50 mg/ml 함유한다. 희석 단계 또는 농축 단계는, 예를 들어 제조 공정인 단계 b) 이후에 원하는 농도를 달성하기 위하여 수행될 수 있다. 보관 중 폴리아크릴산 폴리머 염은, 예를 들어 수용액 중에 있을 수 있거나, 또는 완충된 수용액 중에 있을 수 있다. 보관된 용액의 pH는, 일반적으로 5.5 내지 8이고, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7.5(예컨대 약 7)이다. 안정한 pH는 완충제, 예컨대 Tris 완충제, 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, HEPES 완충제 또는 히스티딘 완충제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
수용액은 또한 하나 또는 수 개의 추가 염, 예컨대 NaCl을 포함할 수 있다.
보관은 폴리아크릴산 폴리머 염 용액을 광선이 닿지 않도록 유지시킴으로써 수행될 수 있다. 이를 위해 어두운 색 또는 불투명한 용기가 사용될 수 있다.
폴리아크릴산 폴리머의 아쥬반트로서의 사용
본 발명은 또한 상기 "폴리아크릴산 폴리머의 특징" 이라는 표제의 문단과 관련하여 기술된 구현예가 무엇이든, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되거나 개체, 구체적으로 인간에 있어서 면역 반응을 증강시키는데 있어 백신 제제에 대한 아쥬반트로서 사용하기 위한, 본 발명에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머 염에 관한 것이기도 하다.
상기 "폴리아크릴산 폴리머의 특징" 이라는 표제의 문단과 관련하여 기술된 구현예가 무엇이든, 본 발명에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염의 수용액을 포함하는 백신용 아쥬반트 조성물도 또한 본 발명의 목적이다.
본원에 사용된 바와 같은 "아쥬반트"란 백신 조성물의 면역원성을 조정하는 화합물을 지칭한다. 백신 조성물은 관행에 따라 항원 또는 항원을 암호화하는 벡터(재조합 생 바이러스 벡터 또는 핵산)일 수 있는 백신 제제를 포함한다. 더욱 정확하게 아쥬반트는 조성물 중에 존재하거나 조성물 중에 존재하는 핵산에 의해 암호화되는 항원의 면역원성을 조정한다. "면역원성을 조정하는 것"은 항원에 의해 유도되는 면역 반응의 세기 및/또는 지속기간을 향상시키는 것을 포함하고, 구체적으로 항체(특히 바이러스 중화 항체 또는 세균 항체) 반응의 향상 및/또는 세포 면역 반응의 향상(CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응의 향상)을 포함한다.
본 발명에 따라 선택된 폴리머는 실시예들에 의해 보이는 바와 같이 상이한 이점들을 가진다. 예를 들어 저 Mw인 유사 선형 또는 분지형 폴리머와 비교되게, 본 발명에 따라 선택된 폴리머는 면역 반응의 증가를 초래한다.
"조력자 T 세포(helper T cell)"라고도 칭하여지는 CD4+ 림프구는 면역 반응 매개체이다. 관행에 따라, 2가지 유형의 효과기 CD4+ T 조력자 세포(Th1 및 Th2라 명명됨) 반응은 시토카인 프로파일링(profiling) 및 항체 유형세분화(subtyping)에 의해 특징지어진다. 본 발명에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머의 사용은, 선행 기술의 인간 아쥬반트(알루미늄 염, 수중유 에멀전)에 의해 통상적으로 유도되는 Th-2 반응(마우스 내 Il-4, Il-5 및 IgG1 항체에 대한 결과가 얻어짐) 이외에도, 강력한 Th-1 반응(마우스 내 IFN-γ, TNF-α 및 IgG2a 항체에 대한 결과가 얻어짐)을 촉진하는데 이점을 가진다. Th-1 면역 반응은 세포내 병원체, 감염된 세포 및 종양 세포를 사멸하기 위한 대식세포의 활성화 및 기타 사멸 세포(예컨대 CD8+ T 림프구 또는 세포독성 T 림프구)의 활성화를 지원하므로, 강력한 Th-1 면역성의 유도는 바이러스 감염 및 세포내 세균 감염뿐만 아니라, 암과 싸우는데 중요하다.
본 발명의 폴리아크릴산 폴리머 염과 백신 제제는 동일한 조성물, 구체적으로 수성 조성물 중에 제형될 수 있거나, 또는 상이한 조성물 2가지 중에 제형되어 투여 직전에 혼합될 수 있다.
백신 조성물을 여러 부품들로 이루어진 키트의 형태로 만드는 것 또한 가능하다. 백신 조성물은 2개의 바이알에 담길 수 있는데; 이 중 하나는 백신 제제를 담고, 또 다른 하나는 폴리아크릴산 폴리머 염을 담는다. 구체적으로 액체 제형 중 폴리아크릴산 폴리머 염은 제1 바이알에 담기고, 동결 건조 형태 또는 동결건조된 형태의 백신 제제, 구체적으로 동결 건조 또는 동결건조된 형태의 선택된 항원은 제2 바이알에 담긴다. 폴리아크릴산 폴리머 염의 제형은 백신 제제, 구체적으로 선택된 항원의 재수화에 사용될 것이다.
본 발명은 또한 상기 "폴리아크릴산 폴리머의 특징" 이라는 표제의 문단과 관련하여 기술된 구현예가 무엇이든, 수득된 Th1 면역 반응을 향상시키고/향상시키거나 수득된 Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응간 균형을 맞추는 아쥬반트로서 백신 조성물에 사용되기 위한, 본 발명에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머 염에 관한 것이기도 하다. 구체적으로 본 발명에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머 염은 개체, 구체적으로 인간에 있어 면역 반응을 증강시키고, 수득된 Th1 면역 반응을 향상시키며/향상시키거나 수득된 Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 간 균형을 맞추기 위한 아쥬반트로서 백신 제제에 사용된다.
백신 조성물 및 백신 제제
본 발명에 따른 백신 조성물은 백신에 사용될 수 있는 임의의 백신 제제, 예컨대 항원 또는 항원을 암호화하는 벡터(생 바이러스 벡터 또는 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA)를 포함할 수 있다.
본 발명을 위하여 "항원"이란 용어는 하나 이상의 에피토프를 가져서, 면역 반응을 유도하는 임의의 (선형 또는 입체형, 아니면 이 둘 다의) 분자를 의미하도록 의도된다. 본 발명에 따른 백신 조성물에 사용될 수 있는 항원(들)은 생, 약독화, 사멸, 비활성화 또는 비감염성 미생물 전체, 미생물 추출물 또는 분편(split), 자연발생 항원의 서브유닛 형태, 재조합체 형태 또는 하이브리드 형태일 수 있다. 항원이 서브유닛 형태일 때, 항원의 성질은 조금 중요하다. 항원은 펩티드, 단백질, 당단백, 다당체, 당지질, 지단백, 리포펩티드, VLP(바이러스 유사 입자) 등일 수 있다.
조성물 중에 존재하는 백신 제제는, 인간이나 인간 이외의 동물에 발병할 수 있는 다양한 질환, 특히 예를 들어 디프테리아, 파상풍, 소아마비, 광견병, 백일해, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 황열병, 장티푸스, 수두, 홍역, 유행성 이하선염, 풍진, 일본 뇌염, 인플루엔자, 뇌막염, 콜레라, 로타바이러스(Rotavirus), 노로바이러스(Norovirus), 리노바이러스(Rhinovirus), 호흡기융합바이러스(Respiratory Syncytial Virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus), 파필로마 바이러스(Papilloma Virus), 거대세포바이러스(cytomegalovirus virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus), 뎅기 바이러스(Dengue Virus), 치쿤구니아 바이러스(Chykungunya Virus), HIV(AIDS)에 의해 유발되는 감염, 연쇄구균, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) 및 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 해모필러스 인플루엔자 B형(Haemophilus influenza type B)에 의해 유발되는 세균성 질환, 리스테리아증, 시겔라증, 살모넬라증, 결핵, 라임병(Lyme disease), 암, 기생체에 의한 질환, 예컨대 말라리아, 리슈마니아증, 샤가스병(Chagas disease), 주혈흡충병 등의 치료 또는 예방을 위해 사용되거나 사용되기 적합한 항원 또는 항원을 암호화하는 벡터(재조합 바이러스 또는 핵산)이다.
항원은 세균, 바이러스 또는 기생체의 성질을 보이는 것일 수 있다. 본 발명의 주제에 적합한 항원으로서는, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디프테리아에(Clostridium diphtheriae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 해모필러스 인플루엔자 B형, 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 네이세리아 메닝기티디스, 쉬겔라(Shigella) 종, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 스타필로코커스 아우레우스 또는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 클라미디아 트라코마티스 및 뉴모니아에 또는 스트렙토코커스(Streptococcus) 종으로부터 기원하는 세균 항원, A형, B형 또는 C형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노 바이러스, 호흡기융합 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 광견병 바이러스, 소아마비 바이러스, HIV 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 거대세포바이러스 또는 헤르페스 바이러스로부터 기원하는 바이러스 항원, 구체적으로 플라스모듐(Plasmodium) 종, 리슈마니아(leishmania) 종, 쉬스토소마(schistosoma) 종으로부터 기원하는 기생체 항원, 그리고 종양 항원이 예시된다. 이와 같은 항원은 유전자 재조합 방법을 사용하거나 또는 당 업자에게 널리 공지된 추출 방법을 사용하여 수득될 수 있다.
구체적으로 조성물 중에 존재하는 백신 제제는 스타필로코커스 아우레우스 또는 거대세포바이러스로부터 기원하는 항원 또는 이러한 항원을 암호화하는 벡터(재조합 벡터 또는 핵산)이다.
본 발명의 백신 조성물은 단일 병원체 또는 암에 대해 면역화하기 위한 것으로 의도된 조성물(다시 말해서 하나 이상의 백신 제제, 구체적으로 하나 이상의 단일 병원체 또는 암의 항원을 포함하는 조성물)일 수 있거나, 또는 몇몇 병원체 또는 암에 대해 면역화하기 위한 것으로 의도된 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 또한 하나 또는 수 개의 특이 백신 제제, 구체적으로 하나의 질환의 항원이되, 이 질환의 상이한 카테고리에 속하는 질환의 항원 하나 또는 수 개(백신 제제의 성질에 따라 다수의 혈청형 또는 균주, 또는 계통분기군)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리아크릴산 폴리머 염과 백신 제제는 약학적으로 허용 가능한 임의의 비이클(vehicle)과 함께 조성물 중에 제형될 수 있다. 본 발명의 내용 중 "약학적으로 허용 가능한 비이클"이란 표현은, 본 발명에 따른 조성물의 생리 활성, 즉 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하면서, 포유동물, 구체적으로 인간에의 투여를 위한 것으로 생리적으로 허용 가능한 비이클을 지칭한다. 하나의 예시적인 약학적으로 허용 가능한 비이클은 생리 염수 완충제이다. 또다른 생리적으로 허용 가능한 비이클은 당 업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa]에 기술되어 있다.
본 조성물의 pH는, 일반적으로 5.5 내지 8, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7.5(예컨대 약 7)이다. 안정적인 pH는 완충제, 예컨대 Tris 완충제, 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, HEPES 완충제, 또는 히스티딘 완충제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 따라서 본 조성물은, 일반적으로 완충제를 포함한다. 본 조성물은 멸균된 것 및/또는 무 발열원인 것일 수 있다. 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다.
본 조성물은 또한 하나 또는 수 개의 추가 염, 예컨대 NaCl을 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물은 백신 제제 면역학적 유효량만큼을 포함한다. "면역학적 유효량"은, 대상체에 투여될 때 벡터 및/또는 핵산 발현시 사용 또는 생성되는 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 유효한 양이다. 이 양은 치료될 대상체의 건강 및 신체 조건, 대상체의 나이, 대상체의 면역계가 항체를 생산하는 능력, 원하는 방어의 정도, 백신 제형, 치료를 담당하는 의사에 의한 의학적 상태 평가에 따라서 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 또한 알레르기원(들), 구체적으로 알레르기 치료에 있어서 탈감작을 위한 알레르기원(들)을 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 백신 투여를 위해 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 예상 면역 반응의 유도를 초래하는 투여계획이 사용될 것이다. 일반적으로 면역화 스케쥴은 수 회의 투여를 포함한다. 투여된 조성물의 양은 원하는 면역 반응을 나타내기에 충분한 양이다.
바람직하게 백신 조성물은, 생산 비용이 덜 드는 액체 형태의 사용을 허용하는 폴리아크릴산 폴리머의 우수한 안정성이 고려된 액체 형태를 가진다.
비경구 주입(근육내, 피하, 피내 및 정맥내 주입)도 또한 바람직하다. 폴리아크릴산 폴리머는 피내 주입 이후 눈에 띄는 부작용을 유발하지 않는다. 이 점은, 종종 피내 경로를 통해 면역 반응을 일으키는 대부분의 또다른 아쥬반트(예컨대 알루미늄 염)에 비해 유리할 수 있다.
본 발명에 따라 바람직한 백신 조성물이 이하에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 적어도 하나의 백신 제제와 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는데, 이 경우 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 평균 분자량 Mw는 350 kDa 내지 650 kDa의 범위이다.
유리하게 본 발명에 따른 백신 조성물은 용량당 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 0.1 mg 내지 8 mg, 바람직하게 0.1 mg 내지 4 mg, 더욱 바람직하게 0.1 mg 내지 2 mg 포함한다.
바람직하게 적어도 하나의 백신 제제는 항원 또는 항원을 암호화하는 벡터(바이러스 벡터 또는 핵산)인데, 상기 항원은 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 디프테리아에, 보르데텔라 페르투시스, 해모필러스 인플루엔자 B형, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 네이세리아 메닝기티디스, 쉬겔라 종, 살모넬라 타이피, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스타필로코커스 에피더미디스, 마이코박테리움 튜베르큘로시스, 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니아에, 또는 스트렙토코커스 종으로부터 기원하는 세균 항원; A형, B형 또는 C형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노 바이러스, 호흡기융합 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 광견병 바이러스, 소아마비 바이러스, HIV 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 거대세포바이러스 또는 헤르페스 바이러스로부터 기원하는 바이러스 항원; 구체적으로 플라스모듐 종, 리슈마니아 종, 쉬스토소마 종으로부터 기원하는 기생체 항원; 또는 종양 항원이다. 구체적으로 본 조성물 중에 존재하는 백신 제제는 스타필로코커스 아우레우스 또는 거대세포 바이러스로부터 기원하는 항원 또는 이러한 항원을 암호화하는 벡터(재조합 바이러스 또는 핵산)이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 pH가 5.5 내지 8.0 범위인 액체 형태를 가진다. 예를 들어 본 발명에 따른 백신 조성물은 인산염 완충제 또는 Tris, HEPES, 히스티딘 또는 시트르산염 완충제를 포함한다.
백신 조성물 중에 존재하는 폴리아크릴산 폴리머 염은 하기 특징들, 즉
- 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형이 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만의 산화제, 및/또는 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게는 0.001 %w/w 미만의 과황산염을 포함하는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염이 4 이하, 바람직하게는 2.5 이하인 다분산 지수를 가진다는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa 범위이고, 다분산 지수는 4 이하이거나, 또는 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa 범위이고, 다분산 지수는 4 이하라는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa 범위이고, 다분산 지수는 2.5 이하이거나, 또는 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa 범위이고, 다분산 지수는 2 이하라는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이라는 점;
- 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형이 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 아크릴산 모노머(유리 산 형태 또는 염 형태)를 포함하는 점;
- 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용가능한 염이 정용여과 및/또는 멸균되는 점
중 하나를 가지거나, 이러한 특징들을 임의로 조합하여 가지거나, 또는 이러한 특징들이 서로를 배척하지 않는다면 심지어 상기 특징들을 모두 가진다.
구체적으로 백신 조성물 중에 존재하는 폴리아크릴산 폴리머 염은
- 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 4 이하인 것을 특징으로 하되, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 과황산염의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만이고, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 유리 산 형태 또는 염 형태인 아크릴산 모노머의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만이며; 유리하게 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이거나, 또는
- 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2.5 이하인 것을 특징으로 하되, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 과황산염의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만이고, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 유리 산 형태 또는 염 형태인 아크릴산 모노머의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만이며; 유리하게 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이거나, 또는
- 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 4 이하인 것을 특징으로 하되, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 과황산염의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만이고, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 유리 산 형태 또는 염 형태인 아크릴산 모노머의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만이며; 유리하게 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이거나, 또는
- 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2 이하인 것을 특징으로 하되, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 과황산염의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만이고, 폴리아크릴산 폴리머 염 또는 폴리아크릴산 폴리머 염의 액체 제형 중 유리 산 형태 또는 염 형태인 아크릴산 모노머의 함량이, 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만이며; 유리하게 이 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기가 0.7 이상이다.
본 발명은 또한 개체, 구체적으로 인간에서 면역 반응을 증강시키는데 사용되기 위한, 본 발명의 백신 조성물에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 특허 대상은 또한 개체, 구체적으로 인간에서 면역 반응을 증강시키는 방법으로서, 본 발명에 따른 조성물 면역학적 유효량만큼을, 이 조성물의 투여를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 개체는 인간이거나, 또는 개과 동물, 고양이과 동물, 소과 동물, 돼지과 동물, 말과 동물 또는 양과 동물의 종뿐만 아니라 족재빗과 및 조류의 종일 수 있다.
본 발명은 또한 수득된 Th1 면역 반응의 향상과 더불어 개체, 구체적으로 인간에 있어서 면역 반응을 증강시키는데 사용되기 위한 본 발명의 백신 조성물에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 특허 대상은 또한 수득된 Th1 면역 반응의 향상과 더불어 개체, 구체적으로 인간에 있어서 면역 반응을 증강시키는 방법으로서, 본 발명에 따른 조성물 면역학적 유효량만큼을, 이 조성물의 투여를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
백신 조성물의 제조
유리하게 폴리아크릴산 폴리머 또는 폴리아크릴산 폴리머 염은 백신 조성물에 첨가되기 전 정제, 예컨대 정용여과의 대상이 된다. 더욱 정확하게 폴리아크릴산 폴리머 또는 폴리아크릴산 폴리머 염은 정제, 예컨대 정용여과의 대상이 된 이후, 멸균이 수행된 다음, 백신 조성물에 도입된다. 멸균은 멸균 여과(들), 또는 바람직하게 고압증기멸균에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 백신 조성물은 이 조성물 중에 존재할 수 있는 백신 제제(들) 및 기타 성분(들)의 현탁액, 그리고 완충된 수용액 또는 수용액 중에서 폴리아크릴산 폴리머 염, 구체적으로 액체 형태의 폴리아크릴산 폴리머 염을 간단히 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이 과정은, 폴리아크릴산 폴리머 염, 구체적으로 수용액 또는 완충된 수용액 중의 액체 제형 중 폴리아크릴산 폴리머 염에 하나 이상의 선택된 백신 제제를 부가하거나, 또는 폴리아크릴산 폴리머, 구체적으로 수용액 또는 완충된 수용액 중의 액체 제형 중 폴리아크릴산 폴리머를, 선택된 백신 제제(들)를 이미 포함하고 있는 현탁액에 부가함으로써 수행될 수 있다. 다른 한편, 다수의 백신 제제를 포함하는 백신 조성물을 제형하는 것이 요망되는 경우에는 처음에 폴리아크릴산 폴리머 염과 하나 이상의 백신 제제(들)의 혼합을 수행하하고, 이후 또다른 성분(들)을 혼입하는 것이 바람직할 수 있다.
대안적으로, 만일 백신 제제가 동결 건조되었거나 동결건조된 제품으로 제형되면, 백신 조성물은, 동결건조된 제제(들)를 폴리아크릴산 폴리머 염을 함유하는 제형(수용액 또는 완충된 수용액)으로 직접 재수화함으로써 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 "폴리아크릴산 폴리머의 특징" 이라는 표제의 문단과 관련하여 기술된 구현예가 무엇이든, 본 발명에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머 염을, 적어도 하나의 백신 제제를 포함하는 백신 조성물의 제조에 있어서 사용하는 것에 관한 것이기도 하다.
상기 "폴리아크릴산 폴리머의 특징" 이라는 표제의 문단과 관련하여 기술된 구현예가 무엇이든, 본 발명에 정의된 바와 같은 폴리아크릴산 폴리머 염과 적어도 하나의 백신 제제의 혼합을 수행하는, 백신 조성물에 관한 방법도 또한 본 발명의 목적이다.
편의상 발명의 설명, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 임의의 용어들을 하기에 모아두었다.
본원에 사용된 바와 같은 "동물"이란 용어는 모든 척추동물, 예컨대 인간을 포함한다. 동물은 또한 모든 발달 단계의 동물 개체, 예컨대 배아 단계 및 태아 단계의 동물 개체를 포함한다. 구체적으로 "척추 동물"이란 용어는 인간, 개과 동물(예컨대 개), 고양이과 동물(예컨대 고양이), 말과 동물(예컨대 말), 소과 동물(예컨대 암소, 축우), 돼지과 동물(예컨대 돼지)뿐만 아니라, 조류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같이 "암소" 또는 "축우"란 용어는 일반적으로 임의의 나이의 소과 동물 기원의 동물을 지칭하는데 사용된다. 호환 가능한 용어로서는 "소과 동물", "송아지", "수송아지", "숫소", "어린 암소" 및 "암소" 등을 포함한다. 호환 가능한 용어로서는 "새끼 돼지" 및 "암퇘지" 등을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "조류"란 용어는 분류학상 "아바(ava)" 군에 속하는 임의의 종 또는 아종, 예컨대 닭(종계, 육계 및 산란계), 칠면조, 오리, 거위, 메추리, 공작, 앵무새, 되새류, 매, 까마귀 및 주금류, 예컨대 타조, 에뮤 및 화식조(이에 한정되는 것은 아님)를 지칭한다. "돼지" 또는 "새끼 돼지"란 용어는 돼지과 동물 기원의 동물을 의미하는 한편, "암퇘지"는 생식이 가능한 나이의 개체로서, 생식력을 가지는 암컷을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "독성(virulent)"이란, 분리주가 동물 숙주를 감염시킬 능력을 보유하는 경우를 의미한다.
본원에 시용된 바와 같은 "비활성화 백신"이란 용어는, 더 이상 증식이나 성장이 불가능한 감염성 유기체 또는 병원체를 함유하는 백신 조성물을 의미한다. 병원체는 세균, 바이러스, 원생동물 또는 진균 기원의 병원체일 수 있다. 비활성화는 다양한 방법, 예컨대 동결-해동, 화학 처리(예컨대 포르말린 처리), 초음파처리, 방사선처리, 열 또는 기타 종래의 임의의 수단으로서 유기체 자체가 가지고 있는 면역원성은 유지한 채 이 유기체의 증식이나 성장을 막기에 충분한 수단에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역원성"이란 용어는, 항원 또는 항원들에 대해 숙주 동물 내 면역 반응이 일어날 수 있는 특성을 의미한다. 이 면역 반응은 특이한 감염성 유기체에 대한 백신에 의해 유도되는 방어 면역성의 근간을 이룬다.
본원에 사용된 바와 같이 "면역 반응"이란 용어는, 동물에서 유도되는 반응을 지칭한다. 면역 반응은 세포성 면역(CMI), 체액성 면역을 지칭할 수 있거나, 또는 이 둘 다를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 면역계의 일부에 제한된 반응도 고려한다. 예를 들어 본 발명의 백신 조성물은 감마 인터페론 반응의 증가를 특이적으로 유도할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "항원" 또는 "면역원"이란 용어는 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 성분을 의미한다. 항원은 사멸, 약독화 또는 생 유기체 전체; 유기체의 서브유닛 또는 일부분; 면역원 특성을 보이는 삽입체를 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 조각 또는 단편; 단백질; 폴리펩티드; 펩티드; 에피토프; 합텐(hapten); 독소; 항독소; 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "다가성(multivalent)"이란 용어는, 항원이 동일한 종으로부터 유래하건(즉 FMD 바이러스 혈청형의 상이한 분리주), 상이한 종으로부터 유래하건(즉 파스퇴렐라 해몰리티카(Pasteurella haemolytica) 및 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 둘 다로부터 선택되는 분리주) 간에, 하나를 초과하는 항원을 함유하는 백신, 또는 상이한 속으로부터 유래하는 항원들의 조합을 함유하는 백신(예를 들어 파스퇴렐라 멀토시다, 살모넬라, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 해모필러스 솜너스(Haemophilus somnus) 및 클로스트리듐으로부터 유래하는 항원을 포함하는 백신)을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용 가능한 담체" 및 "약학적으로 허용 가능한 비이클"이란 용어는, 호환 가능한 용어로서, 부작용 없이 숙주에 주입될 수 있는, 백신 항원을 함유하는 유체 비이클을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 적합한 것으로, 당 분야에 공지되어 있는 담체는 멸균수, 염수, 글루코스, 덱스트로스 또는 완충된 용액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 담체는 보조제, 예컨대 희석제, 안정화제(즉 당 및 아미노산), 보존제, 습윤제, 유화제, pH 완충제, 증점 첨가제 및 착색제 등(이에 한정되는 것은 아님)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "백신 조성물"이란 용어는, 숙주 내에서 면역 반응을 유도하는데 유용한, 약학적으로 허용 가능한 비이클 중 적어도 하나의 항원 또는 면역원을 포함한다. 백신 조성물은 나이, 성별, 체중, 종 및 수용 동물의 상태, 그리고 투여 경로와 같은 요인들을 고려하여 의학 분야 또는 수의학 분야의 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 투여량만큼 투여될 수 있다. 투여 경로는 경피 투여 경로, 점막을 통한 투여 경로(예컨대 구강, 비내, 항문, 질내 투여 경로) 또는 비경구 경로(피내, 근육내, 피하, 정맥내 또는 복막내)일 수 있다. 백신 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 치료법이나 요법이 수행될 때 공동 투여될 수 있거나, 이것들이 수행될 때 순차적으로 투여될 수 있다. 투여형은 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르, 그리고 비경구, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여(예컨대 주입 투여)용 제제, 예컨대 멸균 현탁액 또는 에멀전을 포함할 수 있다. 백신 조성물은 스프레이로서 투여될 수 있거나, 음식 및/또는 물에 섞여 투여될 수 있거나, 아니면 적합한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리 염수 또는 글루코스 등과 혼합되어 전달될 수 있다. 본 조성물은 투여 경로 및 요망되는 제제에 따라서, 보조 성분, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 아쥬반트, 겔화 첨가제 또는 증점 첨가제, 보존제, 풍미제 및 착색제 등을 함유할 수 있다. 표준 약학 교재, 예컨대 "Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)"는 과도한 실험을 실시하지 않고서도 적합한 제제를 제조하기 위해 참조될 수 있다.
본 발명에 사용하기 적합한 면역원 또는 항원은 비활성화된 병원체, 약독화된 병원체, 면역원성 서브유닛(예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐) 또는 재조합 발현 벡터, 예를 들어 면역원성 삽입물을 가지는 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 면역원은 비활성화되거나 사멸된 미생물이다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 백신 조성물은 조류 병원체, 예컨대 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 감염성 기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis virus; IBV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease virus; NDV), 산란저하증후군 바이러스(Egg Drop Syndrome virus; EDS) 또는 감염성 패브리셔스낭병 바이러스(Infectious Bursal Disease virus; IBDV), 조류 인플루엔자 바이러스 및 이것들의 조합(이에 한정되는 것은 아님)의 군으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.
대안적으로 백신 조성물은 고양이과 동물의 병원체, 예컨대 고양이 헤르페스바이러스(Feline HerpesVirus; FHV), 고양이 칼리시바이러스(Feline CaliciVirus; FCV), 고양이 백혈병 바이러스(Feline Leukemia Virus; FeLV), 고양이 면역결핍증바이러스(Feline Immunodeficiency Virus; FIV), 광견병 바이러스 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은 개과 동물의 병원체, 예컨대 광견병 바이러스, 개 헤르페스바이러스(Canine HerpesVirus; CHV), 개 파보바이러스(Canine ParvoVirus; CPV), 개 코로나바이러스(canine coronavirus), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 익테로해모라기아에(Leptospira icterohaemorragiae), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보르데텔라 브론티셉티카(Bordetella bronchiseptica) 등, 그리고 이것들의 조합(이에 한정되는 것은 아님)으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 조성물은 말과 동물의 병원체, 예컨대 말 헤르페스 바이러스(제1형 및 제4형), 말 인플루엔자 바이러스, 파상풍균 및 웨스트 나일 바이러스 등, 또는 이것들의 조합으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 조성물은 소과 동물의 병원체, 예컨대 수족구병 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV), 광견병 바이러스, 소 로타바이러스(bovine rotavirus), 소 파라인플루엔자 바이러스(제3형)(bovine ParaInfluenza Virus type 3; bPIV-3), 소 코로나바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV), 소 호흡기융합바이러스(Bovine Respiratory Syncytial Virus; BRSV), 소 감염성 비기관염 바이러스(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus; IBR), 이. 콜라이, 피.멀토시다, 피.해몰리티카 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 조성물은 돼지과 동물의 병원체, 예컨대 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine Influenza Virus; SIV), 돼지 써코바이러스(제2형)(Porcine CircoVirus type 2; PCV-2), 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스(Porcine Reproductive Respiratory Syndrome virus; PRRS), 유사광견병 바이러스(PseudoRabies Virus; PRV), 돼지 파보바이러스(PPV), FMDV, 엠. 하이오뉴모니아에(M. hyopneumoniae), 에리시펠로트릭스 루시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 파스퇴렐라 멀토시다, 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica) 및 이. 콜라이 등과, 이것들의 조합(이에 한정되는 것은 아님)으로부터 선택되는 면역원 및 이러한 면역원을 암호화하는 핵산을 비롯한 백신 제제를 포함한다.
바이러스, 세균 및 진균등을 포함하는 백신 제제는, 당 업자에게 널리 공지된 종래의 방법들과, 적당한 배양 배지 또는 숙주 세포주를 사용하는 시험관 내 배양 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 PRRS는 적당한 세포주, 예컨대 MA-104 세포주 중에서 배양될 수 있다(미국 특허 제5,587,164호; 동 제5,866,401호; 동 제5,840,563호; 동 제6,251,404호 참조). 유사한 방식으로 PCV-2는 PK-15 세포주를 사용하여 배양될 수 있고(미국 특허 제6,391,314호); SIV는 달걀에서 배양될 수 있으며(미국 특허 제6,048,537호); 엠. 하이오뉴모니아에는 적당한 배양 배지 중에서 배양될 수 있다(미국 특허 제5,968,525호; 동 제5,338,543호).
비활성화된 면역학적 조성물 또는 백신 조성물을 수득하기 위하여 병원체는, 바람직하게 수집 이후에 비활성화되고, 선택적으로는, 예를 들어 포르말린이나 포름알데히드, 베타-프로피오락톤, 에틸렌이민, 2급 에틸렌이민(BEI)을 사용하는 화학 처리, 및/또는 물리적 처리(예컨대 열 처리 또는 초음파처리)에 의한 청징화(clarification)가 수행된다. 비활성화를 위한 방법은 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 FMD 바이러스는 에틸렌이민(Cunliffe, HR, Applied Microbiology, 1973, p. 747-750) 또는 고압(Ishimaru et al., Vaccine 22 (2004) 2334-2339)에 의해 비활성화될 수 있고; PRRS 바이러스는 베타-프로피오락톤 처리(Plana-Duran et al., Vet. Microbiol., 1997, 55: 361-370) 또는 BEI 처리(미국 특허 제5,587,164호)에 의해 비활성화될 수 있으며; PCV-2 바이러스의 비활성화는 에틸렌이민 처리 또는 베타-프로피오락톤 처리를 사용하여 달성될 수 있고(미국 특허 제6,391,314호); 돼지 인플루엔자 바이러스는 Triton과 같은 세제를 사용하거나, 또는 포름알데히드 처리에 의해 비활성화될 수 있으며(미국 특허 제6,048,537호); 엠. 하이오뉴모니아에 세균은 포름알데히드 처리(Ross R. F. 상동), 에틸렌이민 또는 BEI 처리에 의해 비활성화될 수 있다.
비활성화된 병원체는 종래의 농축 기술, 구체적으로 한외여과에 의해 농축될 수 있으며/있거나 종래의 정제 수단, 구체적으로 크로마토그래피 기술을 이용하는 정제 수단, 예컨대 겔 여과, 수크로스 구배 하의 초원심분리, 또는 선택적 침전법, 구체적으로 PEG의 존재 하에서의 선택적 침전법(이에 한정되는 것은 아님)에 의해 정제될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물에 유용한 면역원은 또한 발현 벡터를 포함한다. 이러한 벡터로서는 생체내 재조합 발현 벡터, 예컨대 폴리뉴클레오티드 벡터 또는 플라스미드(EP-A2-1001025; Chaudhuri P, Res. Vet. Sci. 2001, 70: 255-6), 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터, 수두바이러스 벡터, 예컨대 계두 바이러스 벡터(미국 특허 제5,174,993호; 동 제5,505,941호; 및 동 제5,766,599호) 또는 카나리아 두창 벡터(미국 특허 제5,756,103호)(이에 한정되는 것은 아님), 또는 세균 벡터(이.콜라이 또는 살모넬라 종)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 다가성 면역학적 조성물 또는 조합 백신 조성물의 제형을 포함한다. 예를 들어 본 발명에 따라 제조된 조합 소과 동물 박테린에 유용한 항원은 마이코플라스마 보비스(Mycoplasma bovis), 파스퇴렐라종, 구체적으로 피. 멀토시다 및 피. 해몰리티카, 해모필러스종, 구체적으로 에이치. 솜너스, 클로스트리듐종, 살모넬라, 코린박테리움, 스트렙토코커스, 스파필로코커스, 모락셀라 및 이. 콜라이 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 숙주, 예컨대 동물에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 본 발명에 따른 면역학적 조성물 또는 백신 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방식으로 유도된 면역 반응으로서는, 특히 항체 및/또는 세포성 면역 반응, 구체적으로 γ-인터페론 반응이 있다.
구체적으로 본 발명은 병원성 유기체에 의한 동물 감염(예를 들어 바이러스, 세균, 진균 또는 원생동물 기생체에 의한 감염)에 의해 유발되는 증상에 대해 면역화하거나, 이러한 증상을 예방하거나 완화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 척추동물, 예컨대 인간, 개과 동물(예컨대 개), 고양이과 동물(예컨대 고양이), 말과 동물(예컨대 말), 소과 동물(예컨대 축우) 및 돼지과 동물(예컨대 돼지)(이에 한정되는 것은 아님), 그리고 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추리, 공작, 앵무새, 되새류, 매, 까마귀 및 주금류(타조, 에뮤 및 화식조 등)(이에 한정되는 것은 아님)에서 유용하다.
본 발명의 구체적 양태에서, 이러한 방법은 출산 전에 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물을 투여함으로써 임신한 암컷을 백신화하는 단계로 이루어져 있다. 이러한 방법은 백신화 프로토콜에 의해 유도되는 방어적 항체를 유도하는 단계 및 백신화된 임신한 암컷으로부터 유래하는 이러한 방어적 항체를 이의 자손에 운반하여 자손을 감염 및 질환으로부터 방어하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에 따라서 제조된 백신 조성물의 투여량은 백신화될 동물의 종, 사육방법, 나이, 크기, 백신화 이력 및 건강 상태에 따라 달라질 것이다. 기타 요인들, 예컨대 항원 농도, 추가 백신 성분 및 투여 경로(즉 피하, 피내, 경구, 근육내 또는 정맥내 투여)도 또한 유효 투여량에 영향을 미칠 것이다. 투여될 백신의 투여량은 백신 중 항원 농도, 투여 경로 및 백신화될 동물의 나이와 상태를 바탕으로 용이하게 결정될 수 있다. 각각의 항원 회분은 개별적으로 검정될 수 있다. 대안적으로 상이한 투여량의 방법론적 면역원성 시험뿐만 아니라, LD50 연구 및 기타 스크리닝 절차는 과도한 실험이 수행되지 않고서도 본 발명에 따른 백신 조성물의 유효 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다. 이하 제시된 실시예들로부터, 구하여진 투여량 근사치와 구하여진 용적 근사치는 본원에 기술된 백신 조성물을 이용하는데 있어서 적당할 것임이 용이하게 파악될 것이다. 중요한 요인은, 자연 감염과 연관된 사망률과 유병률의 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 투여량은 자연 감염에 대해 적어도 부분적으로나마 방어 효과를 제공한다는 것이다. 유사하게, 적당한 용적도 당 업자에 의해 용이하게 확인된다. 예를 들어 조류 종의 경우 용량의 용적은 약 0.1 ml 내지 약 0.5 ml, 유리하게는 약 0.3 ml 내지 약 0.5 ml일 수 있다. 고양이과 동물, 개과 동물 및 말과 동물 종의 경우, 용량의 용적은 약 0.2 ml 내지 약 3.0 ml, 유리하게는 약 0.3 ml 내지 약 2.0 ml, 그리고 더욱 유리하게는 약 0.5 ml 내지 약 1.0 ml일 수 있다. 소과 동물 및 돼지과 동물 종의 경우, 용량의 용적은 약 0.2 ml 내지 약 5.0 ml, 유리하게는 약 0.3 ml 내지 약 3.0 ml, 그리고 더욱 유리하게는 약 0.5 ml 내지 약 2.0 ml일 수 있다.
처음에, 그리고 마지막 투여 이래로 오랜 시간이 흘렀을 때 면역 반응을 향상시키기 위하여 주기적인 시간 간격으로 반복되는 백신화가 바람직할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 백신 조성물은 비경구 주입(즉 피하, 피내 또는 근육내 주입)로서 투여된다. 본 조성물은 1회 용량으로서 투여될 수 있거나, 또는 대안적 구현예들에서 약 2주 내지 약 6주, 바람직하게는 약 2주 내지 약 5주의 간격으로 투여하여 약 2회분 내지 약 5회분의 용량으로 반복 투여함으로써 투여될 수 있다. 그러나 당업자는 용량의 투여 횟수 및 백신화들 간 시간 간격은 다수의 요인들, 예컨대 백신화된 동물의 나이; 동물의 상태; 면역화 경로; 용량당 이용 가능한 항원의 양 등(이에 한정되는 것은 아님)에 따라 달라짐을 인지할 것이다. 초회 백신화를 위한 기간은, 일반적으로 1주보다 더 길 것이고, 바람직하게는 약 2주 내지 약 5주일 것이다. 앞서 백신화된 동물에 대해서는, 임신 전 또는 임신 중 약 1년의 간격으로 추가 백신화(booster vaccination)가 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 숙주, 예컨대 동물을 치료하는 방법으로서, 단백질 또는 펩티드, 비활성화 또는 약독화된 바이러스, 항체, 알레르기원, CpG ODN, 성장 인자, 시토카인 또는 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원, 구체적으로는 CpG ODN 또는 시토카인으로부터 선택되는 면역원 적어도 하나를 포함하는, 본 발명에 따라 제조된 약학 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이기도 하다. 이러한 약학 조성물은 동물, 예컨대 닭, 돼지, 암소 또는 축우에 있어서 성장 능을 개선하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 아쥬반트 제형, 치료적 유효량만큼의 항원 성분 및 약학적으로나 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역학적 조성물 또는 백신 조성물을 제공하는데, 다만 이 아쥬반트 제형은 중량 평균 분자량(AMw) 약 350 kDa 내지 약 650 kDa인 비 가교 폴리아크릴산(PAA) 폴리머를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 항원 성분은 약독화된 재조합 바이러스 벡터, 자연 발생 또는 유전자 조작된 약독화 생 바이러스 또는 미생물, 비활성화된 바이러스 또는 미생물, 콕시디안(coccidian) 미생물, 조숙 콕시디안 미생물, 단백질 서브유닛, 단세포 기생체, 다세포 기생체 또는 앞서 열거된 것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
구체적인 구현예에서, 항원 성분은 개 코로나바이러스(CCV) 항원, 개 홍역 바이러스(Canine Distemper Virus; CDV) 항원, 개 파보바이러스 항원(CPV), 개 파라인플루엔자(CPI) 항원, 고양이 칼리시바이러스(FCV) 항원, 고양이 면역결핍증 바이러스(FIV) 항원, 고양이 헤르페스바이러스(FHV) 항원, 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 항원, 암 항원(예컨대 Her2-neu, 티로시나아제 및 Il-2 등), 에이메리아(Eimeria) 종 또는 이의 항원, 에스케리치아 콜라이(이. 콜라이)(E. coli) 또는 이의 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에(엠. 하이오)(M. hyo)소 설사 바이러스(BDV) 항원, 적어도 하나의 방어적 면역원을 함유하고, 이를 생체내 발현시킬 수 있는 재조합 카나리아 두창 벡터, 비활성화된 전장 광견병 당단백, 에리시펠로트릭스 종, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에, 이. 루시오파티아에로부터 유래하는 방어적 표면 항원(SpaA), 추가의 면역원 적어도 하나의 적어도 일부분을 포함하는 SpaA 융합 단백질, SpaA-FlaB 융합 단백질, SpaA-FlaB-His 융합 단백질, 클로스트리듐(씨.)(C.) 퍼프린젠스(perfringens) B/C 독소, 씨. 퍼프린젠스 D 독소, 씨. 셉티큠(C. septicum) 독소, 씨. 노비이(C. novyi) 독소, 씨. 테타니 독소 또는 앞서 열거된 것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항원 성분은 비활성화된 전장 광견병 당단백을 포함하거나 이것으로 이루어져 있다. 항원 성분은 또한 씨. 퍼프린젠스 B/C 독소, 씨. 퍼프린젠스 D 독소, 씨. 셉티큠 독소, 씨. 노비이 독소, 씨. 테타니 독소 또는 이것들의 조합을 포함하거나 이것으로 이루어져 있을 수 있다. 구체적인 구현예에서, 면역학적 조성물 또는 백신 조성물은 씨. 퍼프린젠스 B/C 독소, 씨. 퍼프린젠스 D 독소, 씨. 셉티큠 독소, 씨. 노비이 독소 및 씨. 테타니 독소를 포함하는 항원 성분을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 PAA 아쥬반트는 "용량 절감(dose sparing)"을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 항원 성분은 SpaA 항원 또는 이 SpaA 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
다른 구현예에서, 항원 성분은 인플루엔자 유전자를 함유하고 이 유전자의 생체내 발현이 가능한 DNA 플라스미드 또는 약독화된 조류 두창 바이러스를 포함한다. 항원 성분은 또한 광견병 당단백 유전자를 함유하고 이 유전자의 생체내 발현이 가능한 DNA 플라스미드 또는 약독화된 조류 두창 바이러스를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 다양한 치료 방법이 제공된다. 예를 들어 본 발명은 세균에 의해 유발되는 소과 동물의 감염을 치료하는 방법으로서, Mw 범위 약 350 kDa 내지 약 650 kDa인 PAA 폴리머를 포함하는 동물 백신 조성물을 소과 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 구체적인 구현예들에서, Mw 약 450 kDa인 PAA는 동물, 예컨대 소과 동물에서 방어적 면역 반응을 유도하는데 있어 특히 유용하다.
어떤 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자에 의해 유발되는, 개과 동물이나 말과 동물의 감염을 치료하는 방법으로서, 인플루엔자 항원을 함유하고 이 항원의 생체내 발현이 가능한 DNA 플라스미드 또는 조류 두창 바이러스를 포함하는 백신을 개과 동물 또는 말과 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 구체적인 구현예들에서, 인플루엔자 항원은 HA 유전자이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 광견병 바이러스에 의해 유발되는 개과 동물의 감염을 치료하기 위한 방법으로서, 비활성화된 광견병 당단백과, Mw 약 350 kDa 내지 약 650 kDa인 PAA를 포함하는 백신 조성물을 개과 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 성분들, 즉
평균 Mw 약 350 kDa 내지 약 650 kDa인 비 가교 PAA를 포함하는 아쥬반트; 및
(1) 하나 이상의 재조합 발현 단백질; (2) 종래 방법으로 원생동물로부터 분리된 하나 이상의 단백질 또는 기타 거대분자; (3) 원생동물로부터 유래하는 전세포 추출물 또는 제제; 및 (4) 에이메리아(이.) 아세르불리나(Eimeria (E.) acervulina), 이. 아데노에이데스(E. adenoeides), 이. 브루네티(E. brunetti), 이. 콜히치(E. colchici), 이. 커바타(E. curvata), 이. 디스페르사(E. dispersa), 이. 듀오데날리스(E. duodenalis), 이. 프라테르큘라에(E. fraterculae), 이, 갈로파보니스(E. gallopavonis), 이. 이노쿠아(E. innocua), 이. 프라에콕스(E. praecox), 이. 막시마(E. maxima), 이. 멜레아그리디스(E. meleagridis), 이. 멜레아그리미티스(E. meleagrimitis), 이. 미티스(E. mitis), 이. 네카트릭스(E. necatrix), 이. 파시아니(E. phasiani), 이. 프로세라(E. procera), 이. 테넬라(E. tenella) 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 비활성화, 생 또는 조숙 생 콕시디안으로부터 선택되는 원생동물 항원
을 포함할 수 있는, 난자내(in ovo) 투여용 조류 백신, 예컨대 조류 콕시디아증 백신을 제공한다.
구체적인 구현예들에서, PAA의 평균 Mw는 약 450 kDa이다.
본 발명은 또한 이. 콜라이 또는 엠. 하이오에 의해 유발되는, 소과 동물 감염을 치료하는 방법으로서, PAA 및 이. 콜라이 또는 엠. 하이오를 포함하는 백신 조성물을 소과 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 엠. 하이오를 포함하는 백신을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는, 엠. 하이오에 의해 유발되는 돼지의 감염을 치료하는 방법을 필연적으로 포함한다.
다른 구현예에서, 면역학적 조성물 또는 백신 조성물은 고양이과 동물 감염 및/또는 병상에 관여하는 제제에 대응하는 항원을 포함한다. 이 항원은 고양이 면역결핍증 바이러스(FIV)를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 FIV 항원 및 PAA를 포함하는 백신을 고양이과 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, FIV에 의한 고양이과 동물의 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 암 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 암 항원 및 PAA를 포함하는 백신 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 발병 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
이하 실시예들은 도면들을 참조하여 본 발명에 사용된 폴리머의 특성들과 이점들을 부각시켜준다. 이들 실시예에서, NaPAA는 본 발명에 따른 것이건 아니건 간에 폴리머 나트륨 염을 지칭한다.
특정되지 않았을 때 "분자량"은 "중량 평균 분자량"을 의미한다.
실시예 1 - 폴리머의 특성규명을 위한 재료 및 방법
Mw, 마크-하우윙크 기울기, IP, 모노머 및 과황산염 함량의 측정은 모두 이하의 절차에 따라 수행되었다.
I.1 - Mw, 마크-하우윙크 기울기 및 IP의 측정
1. 화학물질 및 시약
물은 Milli-Q-UF 시스템(Millipore, Milford, MA, USA)에서 정제하였다. 인산염 완충 염수(PBS 1C; 6.5 mMol.L-1 Na2HPO4 , 2H2O; 1.5 mMol.L-1 KH2PO4; 2.7 mMol.L-1 KCl; 137 mMol.L-1 NaCl; pH 6.8)는 자체 제작하였다. 겔 투과 특징의 측정은 Sigma Aldrich사(Saint Quentin Fallavier, France)의 DNA(CAS 번호 73049-39-5)와, VWR사(Darmstadt, Germany)의 수크로스(CAS 번호 57-50-1)로 이루어졌다. 시스템 검정에 이용된 표준은, 풀루란(Pullulan) 100 KDa의 경우에는 Malvern(Malvern, UK)으로부터, 그리고 풀루란 400 KDa의 경우에는 Agilent(Santa Clara, CA)로부터 구하였다.
2. 3중 검출이 수반되는 크기별 배제 크로마토그래피(SEC)
빌트인 탈기기와 오토샘플러(100 μL 주입 루프 포함)와 함께 HPLC 펌프를 포함하는 Viscotek GPCmax VE2501 시스템(Malvern Instrument, Malvern, UK)을 사용하여 HP-SEC 분석을 수행하였다. 굴절률 측정기, 직각 광산란기 및 4-모세관 미분 점도계 검출기를 가지는 Viscotek TDA 302 검출기 시스템을 사용하여 온-라인 SEC 신호 검출을 실시하였다. 검출기는 하기의 순서대로 배열하였다: LS(직각 광산란기)-RI(굴절률 측정기)-VIS(4-모세관 미분 점도계). 0.22 μm의 나일론 예비필터를 컬럼과 검출기 사이에 배치하였다. SEC 데이터 획득 및 분석을 위해 OmniSEC 4.7 소프트웨어 프로그램을 사용하였다. 모든 검출기는 PBS 1C의 이동상 중 100 KDa 풀루란 표준으로 검정하였다. PBS 1C 이동상은 0.22 μm Millipore 셀룰로스 질산염 필터를 통해 여과한 다음, 탈기하고 나서 사용하였다. NaPAA 샘플들의 분리는 일렬로 연결된 2개의 A6000M(8mm ID x 30 cm L) 컬럼(Malvern)을 통해 달성하였다. 용리는 유속 0.6 mL.min- 1으로 등용매용리로서 진행하였다. Mw, IP 및 마크-하우윙크 기울기 측정을 위해 샘플 100 μL를 목표 NaPAA 농축물과 함께 대략 0.4 mg.mL-1으로 주입하였다. 모든 분석에 있어서 풀루란 400 kDa 표준을 "대조군" 샘플로 사용하였다. 고분자량 DNA 및 수크로스를 각각 주입함으로써 컬럼의 공극 용적(void volume; V0)과 총 투과 용적(total permeation volume; Vt)을 측정하였다.
3. 표준 및 샘플의 제조
원료를 최종 농도 각각 1, 0.1 및 2 mg.mL-1 이 되도록 PBS 1C 중에 용해하여 풀루란, DNA 및 수크로스 표준을 제조하였다. NaPAA를 제조한 다음, 이를 목표 농도에 도달하도록 PBS 1C 중에 희석하였다.
4. NaPAA dn/dc 값의 결정 및 Mw, 마크-하우윙크 기울기 및 IP 측정
dn/dc 계수는 하기 관계식에 따른 몰 질량과 관련되어 있다(Zimm, 1948, J. chem. Phys., 16, 1099-1116):
상기 식 중, K는 하기 방정식에 기술된, 특정 산란 시스템에 대한 dn/dc를 포함하는 광학 상수이고, C는 샘플 중 NaPAA의 농도이며, Rθ는 각도 θ에서 산란된 광선의 초과 세기(excess intensity)이며, Mw는 중량 평균 분자량이고, A2는 제2 비리얼 계수(이는 각 샘플 분획의 농도가 극도로 낮은 관계로 "0"으로 취하여질 수 있음)이며, P(θ)는 광 산란 세기의 각도 의존성을 보여주는 입자 산란 함수(particle scattering function)로서, 폴리머 분자의 선회 반경(Rg)과 관련되어 있다.
상기 식 중, n0는 샘플중 용매의 굴절률이고; NA 는 아보가드로(Avogadro) 수이며; λ0는 진공에서의 레이저빔 파장이다.
크기가 λ0/20보다 작은 소분자에 있어서, 산란 광의 세기는 산란 각도에 독립적인 것으로 가정되므로, 모든 각도에 대해 P(θ)는 1이다.
이로써 얻어진 결과는 하기, 즉
와 같이 표현된다.
NaPAA의 dn/dc는 SEC-삼중 검출 시스템과 함께, 0.4 mg.mL-1에서 1　mg.mL-1로의 공지된 NaPAA 농도 증가를 이용하는 OmniSEC 소프트웨어에 의해 자동으로 계산하였다. 각각의 농도만큼을 2회씩 주입하였다. 이 실험은 공지된 농도의 상이한 NaPAA 회분들 각각을 사용하여 동일한 조건 하에 반복 수행하였다. 최종 dn/dc 계수는 이러한 측정치들의 평균에 대응하였으며, 0.172 mL.g-1인 것으로 결정되었다. 이 dn/dc 값을 후속 분자량 측정에 이용하였다.
PBS 1C 중 폴리아크릴산 폴리머 염 용액으로써 Mw, IP 및 마크-하우윙크 기울기의 측정 및 결정을 수행하였는데, 이때 폴리아크릴산 폴리머 염의 공지된 농도는, 예를 들어 0.4 mg.mL-1였다. 폴리아크릴산 염이 폴리아크릴산 폴리머 염 건조 중량의 95%를 초과하여 건조 중량을 보일 때, 건물 중량은 폴리아크릴산 폴리머 염의 건조 중량인 것으로 간주하였다.
NaPAA의 고유 점도(IV)는 NaPAA 자체의 분자량 및 형태와 관련되어 있으며; 이는 마크-하우윙크 도해로 표시된다:
IV = K ㆍ MWa
상기 식 중, "a" 및 "K"는 주어진 용질-용매계에 대한 상수이고, 지수 "a"는 0(고체 형상)에서 2(막대 형상)로 가변적이다.
마크-하우윙크 기울기 "a"는 상기 식, 즉 IV = KㆍMWa로부터 결정되었다.
기울기 "a"는 0.7보다 크거나 같은데, 이 점은 NaPAA가 선형인 것으로 간주될 수 있음을 의미한다.
다분산 지수(IP)는, Mw/Mn(여기서 Mn은 중량 평균 분자량임)으로 정의된다. PAA의 Mn은 OmniSEC 소프트웨어에 의해 자동으로 산정되었다.
I.2 과황산염 및 아크릴산염 모노머 분석
A. 원료
1. 화학 물질 및 시약
물은 Milli-Q-UF 시스템(Millipore, Milford, MA)으로 정제하였다. 25 mM(A상) 및 200 mM(B상) 수산화나트륨 용액을, Fisher Scientific사(Illkirch, France)의 46% ~ 51% 농축 수산화나트륨으로 제조하였다. 0.1N 수산화나트륨은 VWR사(Darmstadt, Germany)에서 입수하였다. 검정에 사용된 표준은, 과황산나트륨에 대해서는 Fisher Scientific사(Illkirch, France)로부터, 그리고 아크릴산나트륨에 대해서는 Sigma Aldrich사(Saint Quentin Fallavier, France)로부터 구하였다. 샘플 제조시의 편차를 교정하기 위하여 사용되는 내부 표준은 Sigma Aldrich사(Saint Quentin Fallavier, France)의 옥살산나트륨이었다.
2. 전도도 검출이 수반되는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피
NaPAA 샘플 중 아크릴산염 및 과황산염 불순물을, 전도도 검출이 수반되는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)로 동시에 분석하였다. 이 때, ICS-3000(Dionex, Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 이온 크로마토그래피 시스템을 사용하였다. 이 시스템에는 SP-1 펌프, 온도조절 오토샘플러(5℃), 온도조절 컬럼(40℃) 및 전도도 검출기 구획(30℃)이 장착되어 있다. ATC3 RFIC(9x24mm) 탄산염 트랩 컬럼(Thermo Fisher Scientific)을 상기 컬럼 앞에 배치하여, 수중 탄산염 음이온을 포착함으로써 전체적인 분석 감도를 개선하였다. Dionex사(Thermo Fisher Scientific)의 음이온 교환 AS-11HC 컬럼(250 x 4mm)에서 분석을 위한 분리를 실시하였는데, 이 때 용리 구배는 25 mM(A상) → 200 mM(B상) 수산화나트륨 용액이었다. 구배 프로그램은 다음과 같았다: 0% B(12 분), 0% - 40% B(5 분), 40% - 100% B(8 분), 100% B(25 분), 100% - 0% B(1 분), 0% B(9 분). 이동상의 유속은 1 mL/분이었으며, 주입 용적은 50 μL였다. Dionex사(Thermo Fisher Scientific)의 AG-11HC 예비컬럼(50 x 4 mm)을 사용하여, 분석용 컬럼을 보호하였다. Dionex 전도도 서프레서(conductivity suppressor)(AERS 082540, Thermo Fisher Scientific)를 검출기 구획의 앞에 배치하여 신호의 품질을 개선하였다. 이러한 크로마토그래피 조건에서, 아크릴산염, 옥살산염 및 과황산염의 체류 시간은 각각 약 4분, 약 11분 및 약 45분이었다.
3.샘플 제조
크로마토그래피 분석에 들어가기 앞서, 고분자량 종을 샘플로부터 제거하였다. 요약하면, NaPAA 샘플을 물로 10배 희석하고(이로써 NaPAA 중 농도는 10 mg/mL이 됨), 옥살산나트륨 내부 표준을 첨가하여 농도가 50 μg/mL에 도달하도록 만들었다. 그 다음, Merck Millipore사(Darmstadt, Germany)로부터 구한 Amicon Ultracel 0.5 ml-100k 및 Amicon Ultracel 0.5 ml-3k 원심분리기 필터를 순차적으로 사용하여 샘플 500 μl를 30분 동안 14000 g에서 원심분리하였다. 사용 전, Amicon 원심분리 필터를 물과 0.1N NaOH으로 순차적으로 세정하여 글리세롤을 제거하였다.
4. 검정 및 결과
상업용 표준으로 마련한 외부 검정 곡선에 의해 과황산염 및 아크릴산염 불순물의 정량을 수행하였다. 1 μg/mL ~ 100 μg/mL 범위의 아크릴산나트륨 및 과황산나트륨 농축물 6개를 물 중에서 혼합한 다음, 각각의 농축물에 500 μg/mL 옥살산나트륨 내부 기준 200 μL를 첨가하였다. 검정 곡선은 과황산염에 대해서는 1차 방정식 모델을 따랐고, 아크릴산염에 대해서는 2차 방정식 모델을 따랐다. 불순물 함량은 %w/w(NaPAA 건조 중량에 대한 아크릴산염 또는 과황산염 불순물의 중량%) 또는 원료 NaPAA 1 그램당 과황산염 또는 아크릴산염 불순물 μg으로 표현하였다.
B. 정제후 수득된 NaPAA 폴리머
(투석, 한외여과 또는 겔 여과에 의한) 정제 단계 이후 NaPAA 샘플 중 과황산염과 잔류 아크릴산 불순도를, NaPAA 원료 샘플 중 이 것들의 측정에 대해 전술한 바와 같이 측정하였다. 그러나, 샘플 제조 과정에서 정제된 샘플 중 10배 희석 단계는 생략하였다. 과황산염에 대한 크로마토그래피 조건은 원료 NaPAA에 대한 크로마토그래피 조건과 동일하였으며, 분석은 100 ng/mL을 검출 한계로 한 한계 시험으로서 관리하였다. 아크릴산염에 대해서는 동일한 HPAEC 시스템을 사용하였으나, 분석을 위한 분리는 용리 구배 30 mM(A상) → 200 mM(B상) 수산화나트륨 용액인, Dionex사(Thermo Fisher Scientific)의 CarboPacTM SA10 컬럼(250 x 4mm)으로 실시하였다. 구배 프로그램은 다음과 같았다: 0% B(14 분), 0% - 100% B(6 분), 100% B(15 분), 100% - 0% B(1 분), 0% B(9 분). 이동상의 유속은 1mL/분이었고, 주입 용적은 50 μL였다. Dionex사(Thermo Fisher Scientific)의 음이온 교환 CarboPacTM SA10 컬럼(50 x 4mm)를 사용하여 분석용 컬럼을 보호하였다. Dionex 전도도 서프레서(AERS 082540, Thermo Fisher Scientific)를 검출기 구획의 앞에 배치하여 신호의 품질을 개선하였다. 이러한 크로마토그래피 조건에서, 아크릴산염의 체류 시간은 약 11분이었다. 잔류 아크릴산의 불순도를, PBS 1C 중 20 ng/ml ~ 500 ng/ml인 외부 아크릴산 표준을 이용하여 구성된 1차 방정식 검정 곡선으로 측정하였다. 결과를 상기와 같이 %w/w(NaPAA 건조 중량에 대한 아크릴산염 또는 과황산염 불순물의 중량%) 또는 NaPAA 아쥬반트 용액 1 mL당 과황산염 또는 아크릴산염 불순물 μg으로 표현하였다.
실시예 2 - 아쥬반트 활성에 대한 시험
1) 스타필로코커스 아우레우스 항원과 관련하여, 선행 기술의 PAA 2개의 아쥬반트 효과와 비교함에 의한, 본 발명에 따른 PAA의 아쥬반트 효과의 평가
슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래 재조합 외독소 A(rEPA)(모형 항원)에 접합된 에스. 아우레우스 유래 제5형 다당체(PS5)를 사용하여 폴리머 기반 제형의 아쥬반트 활성을 이계교배 OF1 마우스를 대상으로 시험하였다.
항원을 하기 방법으로 제조하였다:
스타필로코커스 아우레우스(레이놀즈(Reynolds) 균주)를 SATA-1 배양 배지에서 교반(100 rpm) 하에 72시간 동안 생육한 다음, 1/1(v/v) 페놀/에탄올 용액을 첨가하여 최종 농도 2% w/v로 만듦으로써 비활성화하였다. 세균 세포를 16,000 g에서 75 분 동안 침강시켰다. 세포 페이스트를 50 mM Tris-2 mM MgSO4(pH 7.5) 중에 0.5 g(습윤 중량)/ml로 현탁하였다. 리소스타핀(100 μg/ml)을 첨가하고, 현탁액을 교반 하에 37℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 벤조나아제를 5 U/ml 농도로 첨가한 다음, 2 시간 더 계속해서 항온처리하였다. 반응 혼합물을 접선 유동 여과(30,000 Da 분자량 컷-오프)에 의해 농축하였다. 이로부터 얻어진 농축 재료를 적당한 완충제(1 mM MgCl2 및 1 mM CaCl2 함유 Tris 50 mM(pH 8.0)) 중에서 벤조나아제(5　U/ml)로 37℃에서 6 시간 동안 분해한 후, 다시 프로나아제(4 U/ml)로 37℃에서 15 시간 동안 분해하였다. 5,000 g에서 30 분 동안 원심분리를 수행한 후, 접선 유동 여과(30,000 Da MWCO)에 의해 상청액을 농축하였다. 그 다음, 이 용액을 50 mM Tris HCl(pH 7.5)로 조정하여 최종 농도에 이르게 하였다. 분취액을 50 mM Tris HCl(pH 7.5)로 평형화한 Q 세파로스(20 mL) 컬럼에 로딩(loading)하였다. 컬럼에서 유속 2 ml/분으로 용리를 진행시킨 다음, 분획(5 ml)들을 수집하였다. 이 컬럼을 5 용적만큼의 출발 완충제(starting buffer)로 세정하였다. 그 다음, 50 mM Tris HCl(pH 7.5) 중 0 M → 0.5 M NaCl의 선형 구배(250 ml)를 걸어주어 다당체를 용리하였다. 210 nm에서의 흡광도 및 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD)에 의해 다당체를 함유하되 테이코산을 함유하지 않는 것으로 확인된 분획들을 투석한 다음, 동결 건조하였다.
이후, 정제한 다당체를 NaCl 중에서 아디프산 디하이드라지드(ADH)로 활성화하였다. pH를 4.9로 조정한 후, 에틸디메틸아미노프로필카보디이미드(EDAC)를 첨가하였다. 활성화가 상온에서 90분 동안 지속되며 진행됨에 따라서, 0.1 N HCl로 pH값 조정하여 항상 4.9이 되도록 하였다. 여기에 NaOH를 첨가하여 중화 상태(pH 7.0)까지 이르게 함으로써 반응을 중단하였다. 그 다음, 활성화한 다당체를 500 mM NaCl 수용액에 대해 투석한 다음, 물에 대해 투석하였다. 이후 활성화 및 투석한 다당체를 동결건조하였다. 기능화 백분율(percentage functionalization)은 약 5.9%(w/w)인 것으로 추산되었다.
활성화한 다당체 용액을 NaCl 및 EDAC 중에서 담체 단백질(rEPA)과 혼합하였다. 4℃에서 접합이 일어났는데, 이 경우 pH는 0.1 N HCl을 첨가함으로써 5.7로 유지시켰다. 90분 후, 0.2 N NaOH를 첨가하여 pH 7 이하로 만듦으로써 반응을 중단하였다. 그 다음, 접합된 항원을 NaCl 수용액에 대해 투석한 다음, 10 mM 인산염 완충제(pH 7.2) 중 200 mM NaCl로 평형화된 세파로스 Cl-4B 컬럼상 크기별 배제 크로마토그래피로 정제하였다. (206 nm 및 278 nm에서의 흡광도로써 확인되는 바에 따르면) 접합체를 함유하였고, 주로 컬럼의 무용 부피 (dead volume) 만큼이 용리되었던 분획들을 합하였다.
폴리머 제형을 하기 방법으로 제조하였다:
제품(제품명: PAA225000)(Ref. 18613, 나트륨염)을 농축 용액 형태로 Polysciences Europe사(Eppelheim, Germany)로부터 구하였다. 이를 물로 희석하여 농도를 20 mg/ml로 만든 다음, 실온에서 12 시간 동안 교반 상태를 유지하였다. HCl로 pH를 7.55로 만들고 나서, 2kDa 컷-오프 투석 카세트(Thermo Fischer Scientific, Courtaboeuf, France)를 사용하여 용액을 실온에서 150 mM NaCl 수용액에 대해 투석하였다(3개의 연속 조). 그 다음, 용액을 0.22 μm PVDF 막을 통하여 여과함으로써 멸균을 실시하였다. 그 다음, 폴리머 염의 분자량을 측정하였더니 488,550 Da이었다. 이 폴리머의 Mn은 129,070 Da였고, IP는 3.8이었다.
그 다음, 폴리머를 150 mM NaCl 수용액 중 폴리머 20mg/ml를 포함하는 용액으로서 +4℃에 보관하였다. 이후, 폴리머 염 2mg/ml를 포함하는 염수 용액을 얻기 위해, 이 용액을 멸균수로 10배 농축한 PBS 1C와 혼합하였다.
Polymer Expert사(Pessac, France)로부터 시판되는 제품(제품명: PAA20)을 건조 분말 형태의 나트륨 염으로서 수득하였다. 이를 물로 재수화하여 농도 20 mg/ml로 만든 후 12 시간 동안 실온에서 교반 상태를 유지시켰다. 그 다음, 이 용액을 0.22 μm PVDF 막을 통해 여과하여 멸균을 실시하였다. 폴리머 염의 분자량은 100,700 Da인 것으로 측정되었다. 이 폴리머 염의 Mn은 46,700 Da였고, IP는 2.2였다. 그 다음, 폴리머를 150 mM NaCl 수용액 중 폴리머 염 20mg/ml를 포함하는 용액으로서 +4℃에 보관하였다. 이후, 폴리머 염 2mg/ml를 포함하는 염수 용액을 얻기 위해, 이 용액을 PBS 10C 및 멸균수와 혼합하였다.
분자량이 수백만 Da인 망상 조직 PAA 폴리머인 CARBOPOL® 974 P(상표명: CARBOPOL®)를 PBS로 희석하여, 폴리머 2mg/ml를 포함하는 용액을 만들었다.
동물에 주입될 보강 제형을 항원 용액과 폴리머 용액의 vol/vol 혼합에 의해 제조하였다. 각 주입 용량은, PBS 1C 용액 중 다당체의 경우 2.5 μg, 그리고 폴리머의 경우 200 μg이었다.
면역화:
5 마리 내지 10 마리의 OF1 마우스(7 주령 ~ 9 주령)로 이루어진 군들을 PAA20, PAA225000 또는 CARBOPOL® 단독으로 (이는 음성 대조군으로 사용), 또는 항원과 아쥬반트 둘 다를 포함하는 제형으로 면역화하였다. 마우스 군 하나에는 PS5-rEPA만을 단독 주사하였다. 당일, 21일 및 35일에, 피하(SC) 경로를 통해 견갑부에 용량만큼을 투여하였다. 42일에 혈액 샘플을 수집하여 면역 반응 분석을 수행하였다.
혈액 샘플을, 응고 활성화제와 혈청 분리용 겔이 담긴 진공 채혈 튜브(Becton Dickinson, Meylan, France)에 수집하였다. 이 채혈 튜브를 2600 g에서 20분 동안 원심분리하여, 세포로부터 혈청을 분리하였다. 혈청을 딥-웰(deep-well) 평판에 옮겨담은 후, 56℃에서 30분 동안 열로 비활성화한 다음, 추후 검정에 사용될 때까지 -20℃에 보관하여 두었다.
시험은 하기와 같은 상이한 투여 군들을 포함하였다:
PBS
Carbopol®
PAA20
PAA225000
PS5-rEPA
PS5-rEPA + Carbopol®
PS5-rEPA + PAA20
PS5-rEPA + PAA225000
면역화된 마우스에 의해 생산된 특이적 IgG1 및 IgG2a 항체를 시험하기 위해, 혈액 샘플을 사용하였다.
ELISA 시험에서는 코팅용 항원으로서, 활성화된 다당체 PS5(ADH에 접합된 PS5: PS5-AH)를 사용하였다. 요약하면, ELISA 평판의 웰들을 PBS 1C 중 활성화된 다당체 용액(1 μg/mL) 100 μL로 코팅하였다. 평판을 4℃에서 12 시간 동안 항온처리한 다음, 평판을 뒤집어서 내용물을 비워냈다. 포화 완충제 1(PBS 1C / Tween 0.05 % w/v/ 소 알부민 1 % w/v) 150 μL를 첨가하고 나서, 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하여 웰을 차단(blocking)하였다. ELISA 평판을 뒤집어 내용물을 비워냈다. 희석 완충제로서 완충제 1을 사용하여 각 혈청의 2배 연속 희석(12회)을 ELISA 평판 안에서 바로 수행하여, 웰당 최종 용적을 100 μL로 만들었다. 평판을 37℃에서 90분 동안 항온처리한 다음, 이를 완충제 2(PBS 1C /Tween 0.05% w/v)로 3회 세정하였다(웰당 250 μL). 항마우스 IgG1 또는 항마우스 IgG2a 퍼옥시다아제 접합체를 완충제 1 중에 희석(1/8000)하여 2차 항체로서 사용하였다(웰당 100 μL). 37℃에서 90분 동안 항온처리한 다음, ELISA 평판을 완충제 2로 3회 세정하였다(웰당 250 μL). 각각의 웰에 테트라메틸벤지딘 기질 용액 100 μL를 첨가하여 반응을 진행시킨 다음, 이로부터 30분 후 실온에서 웰당 1 N HCl 100 μL를 사용하여 반응을 중단시켰다. 450 nm ~ 650 nm에서 흡광도를 측정하였다. SoftmaxPro 소프트웨어를 사용하여 항체 역가를, OD450nm 1일 때의 혈청 희석률 역수에 대응하는 임의의 단위로 표현하였다.
결과를 도 1에 요약하였으며, 하기 사항들을 보여주었다:
1) PBS 1C 또는 폴리머 기반 제형이 단독 주입되어 면역화된 마우스로부터 유래하는 음성 대조군 혈청에서는 백그라운드(background)가 측정되지 않았다(<1.3Log)(데이터는 보이지 않음).
2) PS5-rEPA 접합체 단독으로 이루어진 3차 면역 이후에는 PS5 다당체에 대해 특이적 면역 반응, 주로 항PS5 IgG1이 수득되었다(4.8Log). PS5-rEPA 접합체 단독 주입에 의해 유도된 항PS5 항체 반응은 주로 Th2 주도적으로서, IgG1/IgG2a 비는 126에 가까웠다.
3) PS5-rEPA 접합체가 Carbopol®, PAA20 또는 PAA225000 중 어느 하나와 함께 제형되었을 때, 항PS5 IgG1 역가는 증가하지 않았으며, 이 경우 항PS5 역가 평균은 4.8Log에 가까웠다. Carbopol® 또는 PAA20과의 공동 주입이 이루어졌을 때에는 항 PS5 IgG2a 역가의 증가가 유도되었지만, 이러한 항PS5 항체 반응은 여전히 Th2 주도적이었고, IgG1/IgG2a 비는 각각 50 및 63에 가까웠다. PS5-rEPA 접합체가 PAA225000와 공동 주입되었을 때, 항PS5 IgG2a 역가의 상당한 증가(4.5Log)가 관찰되었다. PAA225000와의 공동 주입은 Th1 편향적 항PS5 항체 반응을 유도하였고, IgG1/IgG2a 비는 2에 가까웠다.
결론적으로, 본 시험은 항원은 주로 Th2 반응만을 유도하였던 반면, 본 발명에 따른 아쥬반트는 기타 시험된 폴리머와 비교되게, Th-2 반응에 영향을 미치지 않고, 훨씬 더 증진된 Th-1 면역 반응을 유도할 수 있었음을 입증하였다.
또한 혈액 샘플을, 인간 말초 단핵구 세포(hPMN) 내 옵소닌 작용을 유도하는 능력에 대해서도 시험하였다. 이 시험을 위해, 각 군으로부터 풀링(pooling)한 혈청을 10배 연속 희석한 희석액 중 TSB 배지만에서 또는 보충된 TSB 배지 (정지상 (stationary phase)) 에서, 20 시간 동안 생육된(37℃) 로벤슈타인(Lowenstein) 균주(ATCC 49521)를 사용하여 시험하였다.
건강한 지원자(인간)로부터 인간 말초 혈액을 수집하여 나트륨 헤파린이 담긴 진공채혈 튜브에 넣었다. 공여자당 10 ml가 필요하였다. 염화암모늄 용해 완충제 중에서 적혈구 세포를 용해하여 백혈구를 분리하였다. 세포를 PBS 1C 중에서 2회 세정한 다음, 마지막으로 OPA 배지(0.5% BSA 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI-HEPES) 5 mL 중에 현탁하였다. 그 다음, Multisizer Coulter 카운터 상에서 대 백혈구(주로 hPMN(95%))를 계수하였으며, 이의 농도를 OPA 배지중 0.25 x 106/mL가 되도록 조정하였다. 생육 20 시간 후, 세균을 PBS 1C 중에서 2회 세정한 다음, 5 mL PBS 1C 중에 재현탁하였다. 세균 농도를 OPA 배지중 108 CFU/mL가 되도록 조정하였다.
96웰 폴리프로필렌 딥-웰 평판에서 산화적 분출 검정법(oxidative burst assay)을 수행하였다. 평판을 얼음 위에 계속해서 놓아두고, 시약들을 순차적으로 첨가하였다. 시약을 하기와 같은 순서, 즉 결정된 희석률 1/10 내지 1/640일 때의 열 비활성화 특이 혈청 50 μL, 세균 250 μL, 희석률 1/10일 때의 새끼 토끼의 보체 50 μL, 백혈구 100 μL, 및 1 mg/mL에서 DHR(Molecular Probe, D632) 50 μL의 순서로 웰에 첨가하였다. 최종 반응 용적은 500 μL였다. 그 다음, 평판을 가볍게 진탕해 주며 어두운 환경에서 25분 동안 항온처리(+37℃)하였다. 최종 세균/대 백혈구 비는 100:1이었고, 혈청과 보체의 최종 희석률은 1/100 내지 1/6400이었으며, DHR의 최종 농도는 0.1 mg/mL였다. 항온처리 기간의 막바지에 평판을 얼음 위에 놓아두어 반응을 중단시켰다. Cytomics FC500상에서 분석을 수행하였다. DHR의 산화된 형태인 로다민 123은 488 nm에서 여기되었을 때 밝은 형광을 발산하였다. (FSC/SSC) 점 도표에 있어서 게이트(gate)는, PMN 집단을 구별하기 위해 과립형 대 백혈구 집단에 대해 정의하였다. 이 게이트에서 각 웰로부터는 3천개의 이벤트(event)가 획득되었다. 그 결과를, 전체 PMN 집단 중 형광 활성화된 PMN(로다민 123 양성 PMN)의 백분율로서 표현하였다.
결과들을 이하 표 1에 제시하였다:
[표 1]
표 1의 결과들은 하기 사항들을 나타낸다:
1) PBS 또는 폴리머 기반 제형 중 어느 하나만이 단독으로 주입되어 면역화된 마우스로부터 유래한 음성 대조군 혈청이 사용될 때에는 활성화된 PMN이 검출되지 않았다(데이터는 보이지 않음)
2) PS5-rEPA 접합체는 세균 존재하에 hPMN을 미약하게 활성화할 수 있는 항-PS5 혈청 항체를 유도하였다. 산화적 분출을 일으키는 활성화 hPMN의 백분율은 혈청 희석률 1/100에 대해 30% 내지 70%인 것으로 추산되었다.
3) PS5-rEPA와, Carbopol 또는 PAA20 중 어느 하나가 공동 주입되었을 때에는, 항PS5 혈청 항체가 에스. 아우레우스 로벤슈타인 균주 표면을 인지하는 능력이 약간 증가하였다. 산화적 분출을 일으키는 활성화 hPMN의 백분율은 혈청 희석률 1/100에 대해 80% 내지 100%인 것으로 추산되었다.
4) PS5-rEPA와 PAA225000이 공동 주입되었을 때에는, 항PS5 혈청 항체가 에스. 아우레우스 로벤슈타인 균주 표면을 인지하는 능력이 확실히 개선되었다(10배 증가하였다). 산화적 분출을 일으키는 활성화 hPMN의 백분율은 혈청 희석률 1/1000에 대해 80% 내지 100%인 것으로 추산되었다.
PAA225000 및 PAA20으로 수득된 혈청, 또는 항원 단독으로 면역화된 마우스로 수득된 혈청 또한, 이 혈청이 인간 PMN 존재 하에서 스타필로코커스 아우레우스 로벤슈타인 세균을 사멸하는 능력에 대해 시험하였다.
이 시험을 위하여, 건강한 인간 공여자로부터 유래하는 전혈(EFS(Etablissement Francais du Sang)에서 입수)을 시트르산나트륨 백(bag)에 수집하였으며, 하기 절차에 따라서 신선한 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 분리하였다. 혈액 5　mL와 용해 완충제 45　mL를 +20℃에서 10분 동안 항온처리함으로써 적혈구를 분해하였다. PMN을 HEPES 염수 완충제(CaMg 불포함 HBSS, 기준 pH 7.4) 중에서 2회 세정하였다. 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 보인 바와 같이, PMN의 생존능은 90%를 초과하였다. PMN 현탁액을 1 mL당 107개 세포가 되도록 희석하였다.
로벤슈타인 에스. 아우레우스 균주를 TSB 배지 중에서 12 시간 동안 배양하였다. 세균 세포를 펠릿화한 다음, OPA 배지(RPMI+5 % SVF+0.05% Tween 20)로 세정하고 나서, 생리식염수 중에 1 mL당 5　x　107개 세포가 되도록 현탁하였다. 하기 성분들, 즉 PMN 0.25　mL, 희석된 시험 혈청 50　μL, 상동성 에스. 아우레우스 세포 50　μL(1 세포/1 세균 비), 0.5% w/v 토끼 보체 50　μL 및 OPA 배지를 각각의 튜브에 넣어, 전체 용적을 웰당 500 μL가 되도록 만들었다. 오로지 PMN, 시험 혈청 또는 보체 중 어느 하나만이 에스. 아우레우스와 함께 담긴 대조군 튜브들을 검정에 포함시켰다. 검정 튜브들을 진탕하며 +37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 희석을 3 단계로 수행하였으며(1/15 희석 3회), 상이한 희석액 50　μL씩을 TSA 겔로스에 6회 적하한 다음, 12 시간 동안 항온처리하였다. 매 희석 시점마다, 가능하다면 식, 즉 "(생존 세균수/원 접종균수) x 100"을 이용하여 세균의 생존 백분율을 확정하였다.
2회의 독립된 분석에서 수득한 데이터를 이하 표 2에 제시하였다(ONS = 비특이적 옵소닌 식세포작용(opsonophagocytosis)).
[표 2]
Figure 112019015211813-pct00005
표 2에 제시된 결과들은 하기 사항들을 보여준다:
1) PBS 또는 폴리머 기반 제형 중 어느 하나만이 단독으로 주입됨으로써 면역화된 마우스로부터 유래한 음성 대조군 혈청으로는 세균 사멸이 관찰되지 않았다(데이터는 보이지 않음).
2) PS5-rEPA 접합체는 hPMN 존재 하에 약한 사멸 활성을 보이는 항PS5 혈청 항체를 유도하였으며, 이 경우 1/100 혈청 희석시 세균 사멸 백분율은 39%였다. 혈청 풀이 1/500으로 희석되었을 때 세균 사멸 활성은 더 이상 측정되지 않았다.
3) PS5-rEPA를 PAA20과 공동 주입하였을 때, 항PS5 혈청 항체가 에스. 아우레우스 로벤슈타인 균주를 사멸하는 능력은 개선되지 않았다.
4) 시험 1에서 세균 사멸에 대한 PAA225000의 아쥬반트 효과가 관찰되었는데, 이때 1/100 혈청 희석시 보강되지 않은(non-adjuvanted) PS5-rEPA에 대한 39%에 비하여, 50%의 세균 사멸 백분율을 갖고, 1/500 혈청 희석시 보강되지 않은 PS5-rEPA에 대한 9%에 비하여 23%의 세균 사멸 백분율을 가졌다.
본 시험에 있어서 스타필로코커스 항원과 관련하여 내린 일반적 결론은, 본 발명의 아쥬반트가 저분자량 아쥬반트에 비하여 월등한 효능을 보였다는 것이다.
2) hCMV -gB에 의해 유도된 면역 반응에 대한, 상이한 폴리머들의 아쥬반트 효과 시험
본 연구의 목적은, 아쥬반트 효과에 대한 폴리아크릴산(PAA) 폴리머 분자량의 영향력을 평가하는 것이다. 본 연구는, 모형 항원으로서 인간 거대세포바이러스의 gB 당단백(hCMV-gB)으로부터 유래하는 재조합 단백질을 사용하여 수행하였다.
이 재조합 단백질을, 변형 gB 유전자를 함유하는 플라스미드(0708985pEE14.4라 칭하여짐)로 형질감염된 재조합 CHO 세포주에 의해 생산하였다. 677번 발린과 752번 아르기닌 사이의 아미노산 서열에 대응하는 gB 단백질의 경막 영역을 암호화하는 유전자의 일부를 결실시키고, 절단 부위에 3점 돌연변이를 도입함으로써, gB 유전자, 즉 미국 특허 제5,834,307호에 기술된 서열을 미리 변형시켜, 이 재조합 단백질의 CHO 세포주에 의한 생산을 촉진하였다. gBdTM라 칭하여지는, CHO 세포주에 의해 생산된 단백질은 절단 부위와 경막 영역이 결실된 절단형 gB 단백질에 대응한다.
이후 배양 배지 중에서 생산된 gBdTM 단백질을 크로마토그래피로 정제한 다음, 이 단백질을 인산염 완충액 중 gBdTM을 >0.2 mg/ml 함유하는 저장 용액(stock solution)의 형태로 보관하여 두었다.
상이한 분자량을 가지는 PAA는 하기와 같았다:
PAA20 및 PAA225000을, 상기 "1) 스타필로코커스 아우레우스 항원과 관련하여, 선행 기술의 PAA 2개의 아쥬반트 효과와 비교함에 의한, 본 발명에 의한 PAA의 아쥬반트 효과의 평가" 라는 표제의 문단에 기술된 바와 같이 제조하였다.
PAA3000(Ref. 06568), PAA6000(Ref. 06567), PAA50000(Ref. 00627) 및 PAA60000(Ref. 18611)은 NaPAA로서, Polysciences사에 의해 건조 분말(PAA6000) 또는 농축 용액(PAA6000 제외한 나머지)의 형태로 제공되었다.
PAA20을 물과 혼합하여 농도를 20 mg/ml으로 만들고 나서, 실온에서 12 시간 동안 계속 교반되도록 유지시켰다. 그 다음, 이 용액을 0.22 μm PVDF 막을 통해 여과한 후, 150 mM NaCl 수용액중 20 mg/ml 폴리머를 포함하는 용액으로서 +4℃에 계속 보관하여 두었다. 이후, 이 용액을 PBS 10C 및 멸균수와 혼합하여, 폴리머 2 mg/ml를 포함하는 염수 용액을 제조하였다.
Polysciences사의 PAA들을 멸균수로 희석하여 농도를 20 mg/ml으로 만들고 나서, NaOH 또는 HCl로 pH를 약 7.4로 조정한 후, (pH 조정하지 않았던 PAA60000 제외하고) 2kDa 컷-오프 투석 카세트(Thermo Fischer Scientific, Courtaboeuf, France)를 사용하여 (3개의 연속 조에서) 150 mM NaCl에 대해 투석하였다. 그 다음, 용액을 0.22 μm PVDF 막을 통해 여과하여 멸균을 실시하였다. Mw, Mn 및 IP를 측정 및 결정하고 나서, 폴리머를 150 mM NaCl 수용액중 20 mg/ml 폴리머 염을 포함하는 용액으로서 +4℃에 계속 보관하여 두었다.
폴리머의 분자량(Mw 및 Mn)과 PI를 이하 표 3에 나타내었다:
[표 3]
Figure 112019015211813-pct00006
상이한 폴리머들의 아쥬반트 활성을, 기준으로서 사용된 선행 기술의 아쥬반트의 아쥬반트 활성과 비교하기 위해서, Novartis사의 MF59® 스쿠알렌 에멀전 성분과 동일한 성분을 함유하는 스쿠알렌 에멀전을 미세유동화(microfluidisation)에 의해 제조하였다.
항원 용액과 아쥬반트 용액의 vol/vol 혼합에 의해 보강된 제형을 제조하였다.
아쥬반트의 양은 주입 용량당 폴리머 200 μg이었고, 에멀전의 경우 최종 백신 용량에는 스쿠알렌 2.5% v/v이 포함되었다.
시험된 상이한 제형들은 다음과 같았다(gB는 hCMV-gB에 대응하고: 각각의 제형 중 2μg씩 포함됨)):
- gB 단독,
- gB + 스쿠알렌 에멀전,
- gB + PAA3000,
- gB + PAA6000,
- gB + PAA50000,
- gB + PAA60000,
- gB + PAA20(PBS),
- gB + PAA225000
C57BL/6 마우스(군당 8 마리 내지 10 마리)를, 아쥬반트와 함께, 또는 아쥬반트 없이 재조합 hCMV-gB 항원(2 μg/주입)을 IM 경로(좌측 사두근, 최종 용적 50 μl)로 주입하여 2회(당일 및 28일) 면역화하였다. 대조군으로 포함된 시험 군은 hCMV-gB 항원만으로 면역화하였다.
모든 동물을 마취시켜 동물들의 악하 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하였다(28일 = 중간 채혈; 41일 = 경동맥 절개에 의한 방혈). 용적 150 μL만큼의 Imalgene(케타민 1.6 mg)과 Rompun(자일라진 0.32 mg)을 복막 내 경로(IP)로 투여하여 마취를 수행하였다.
체액 반응 검정을 위해, 28일에 혈액 200 μL를 혈청 분리관이 장착된 바이알(혈액응고촉진제 함유)(Becton Dickinson Microtainer SST, ref 365951)에 수집하였다. +4℃에서 하룻 밤 방치한 후, 혈액을 10,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 혈청을 수집하여 분석이 실시될 때까지 -20℃에 보관하여 두었다. 41일에 혈액 1 mL를 혈청 분리관이 장착된 바이알(혈액응고촉진제 함유)(BD Vacutainer SST ref 367783)에 수집하였다. +4℃에서 12 시간 방치한 후, 혈액을 3000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 혈청을 수집하여 분석이 실시될 때까지 -20℃에 보관하여 두었다.
세포내 반응 검정을 위해, 41일에 멸균 조건에서 군당 5 마리 마우스로부터 비장을 채취하였다. 비장세포를 다음과 같이 분리하였다: 새로 수집한 비장을 Gentlemax 해체기(Miltenyi Biotec)로 해체한 후, 세포 현탁액을 세포 여과기에 통과시킨 다음, RPMI 배지로 세정하였다. 적혈구 세포를 적혈구 세포 용해 완충제(Red Blood Cell Lysing Buffer, Sigma)를 사용하여 용해하였다. 세정 후, 비장세포를 계수하고 나서 즉시 세포 검정을 위해 사용하였다.
혈청중화 검정:
이 기술을 사용하여 hCMV-gB 면역화 동물의 혈청 중에 존재하는 기능성 중화 항체를 적정하였다. 거대세포바이러스가 MRC5 섬유아세포와 ARPE-19 세포(인간 상피세포)를 감염시키는 능력을 기반으로, HCMV-gB에 대한 특이 기능성 항체를 함유하는 혈청은 세포의 바이러스 감염을 억제할 수 있었다.
a. MRC5에 대한 SN50
요약하면, 1 x 104개 MRC-5 섬유아세포를 5% CO2 세포 배양 항온처리기(37℃) 내 96웰 편평 바닥 평판에서 DMEM 중 1% FBS에서 1일 동안 배양하였다. 면역화된 동물로부터 유래한, 열 비활성화된 혈청을, 토끼 새끼 보체(10%)가 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 중 1% FBS(소 태아 혈청)으로 연속 희석하고 나서, hCMV Towne 균주 3.3 log CCID50(50% 세포 배양액 감염 용량: Cell Culture Infective Dose 50%)/ml(vol/vol)만큼과 함께 세포 배양 항온처리기 내에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 혈청/바이러스 혼합물을 MRC-5 세포 단일층으로 옮겼다. 항온처리한 지 7일 경과시, 배양 상청액을 제거하고, 세포를 PBS 1C로 4회 세정한 다음, 물중 85% 아세톤 100μl로 15분 동안 고정하였다(-20℃). 평판을 PBS 1C로 3회 세정한 후 공기 건조하였다. 감염된 세포를 비색 반응을 통해 검출하였다. 2개의 특이적 hCMV 바이오틴화 항체(항IE1 CH160 및 항gB CH177 HCMV 단백질) 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 웰에 0.5 μg/ml로 첨가하였다. 평판을 PBS 1C/0.05% Tween 20(PBST) 중에서 세정한 다음, 실온(22℃)에서 1 시간 동안 인산가수분해효소 알칼리 스트렙타비딘을 첨가하였다. 평판을 PBST 중에서 세정한 후, 발색소 NBT/BCIP 100 μl로 30분 동안 실온의 어두운 환경에서 염색하였다. 세정 후, 평판을 공기 건조한 다음, 비색 ELISPOT 평판 판독기(Microvision Instruments, Evry, France)를 사용하여 스캐닝하였다. 세포 변성 효과의 증거인, 진하게 염색된 핵이 각 웰에서 관찰되었다. 만일 대응하는 웰에 진한 점이 관찰되지 않으면, 해당 혈청 희석액은 중화 혈청인 것으로 간주하였다. 혈청의 각 희석액을 4회 반복하여 시험하였다. 최소 제곱 회귀분석(least square regression)에 의해 매 희석에 대한 50% 중화도(SN50)를 산정하였다. SN50 값(log 10 값)은, 감염이 일어난 웰 수를 50% 줄이는, 최고 혈청 희석률 역수로서 정의된다. 평균 중화 항체 역가는 각각의 마우스 군에 대해 산정하였다.
b. ARPE-19에 대한 μPRNT50
요약하면, 미세유동화(MN) 검정 전날에 2,5 x 104개의 ARPE-19 세포를 어두운 환경의 96웰 평판에 분배하였다. 당일, 혈청을 56℃에서 30 분 동안 열 비활성화하였다. 혈청 샘플을 DMEM/F12 1% FBS 중 2배 연속 희석하고 나서(96 딥웰 평판 내 1/10으로부터 시작하여 1/10240까지), BADrUL131-Y4 HCMV 바이러스 균주 4.2log FFU/ml와 함께 5% CO2 세포 배양 항온처리기 내에서 60 분 동안 항온처리(37℃)하였다. 그 다음, 혈청/바이러스 혼합물을 ARPE-19 세포에 옮긴 후, 5% CO2 세포 배양 항온처리기 내에서 4일 동안 항온처리(37℃)하였다.
4일에, 배양 상청액을 제거하고 나서 세포를 PBS 1C 중 1% 포르몰 100μl으로 1 시간 동안 실온에서 고정하였다. 그 다음, 평판을 PBS 1C로 3회 세정한 다음, 실온에서 공기 건조한 후, Microvision 형광 평판 판독기상에서 분석을 실시하여, 각 웰에 있는 감염 세포를 계수하였다.
각 평판에는 대조군으로서, 세포 대조군 웰 2개(바이러스 부재)와 바이러스 희석액 절반(4,2log FFU/mL 함유)만큼으로 감염된 세포가 담긴 웰 6개가 존재하였다. 상기 6개 웰의 평균을, 특이 신호 값의 50%로 측정되는 혈청중화 역치로서 규정하였다.
중화 종점 역가는, 특이 신호 값 50%의 산정치 이하에 해당하는 최후 희석률의 역수로 규정하였다. 중화 역가(μPRNT50)를 각각의 개별 혈청에 대해, 감염된 세포의 50% 감소를 유도하였던 최후 희석률, 즉 세포 감염을 특이 신호 값 50% 산정치보다 낮게 유도하였던 최후 희석률로서 규정하였다. 중화 항체 역가의 기하학적 평균을 각각의 군에 대해 산정하였다.
면역화된 마우스 각 군에 대해 수득한 GMT(기하학적 평균 중화 항체 역가; Geometric Mean neutralizing antibody Titer) 결과들을 도 2와 도 3에 제시하였다.
분석 대상 군이 어떤 군이었던 간에, MRC5 섬유아세포 및 ARPE 상피세포 둘 다에 대한 혈청중화 검정에 있어 유사한 프로필이 관찰되었다. 보강되지 않은 hCMV-gB로 면역화된 마우스에서는 중화 항체 역가가 아예 관찰되지 않았거나 낮게 관찰되었다(GMT = 6).
본 발명의 폴리아크릴산 폴리머는 훨씬 우수한 반응을 제공하였다.
IgG1 및 IgG2c 항체 반응
하기 절차에 따라 로봇 ELISA 검정법에 의해 hCMV-gB 항원에 대해 유도된 혈청 IgG1 및 IgG2c 항체를 적정하였다.
Dynex 96웰 마이크로평판을 4℃에서 12 시간 동안 웰당 0.05 M 탄산염/중탄산염 완충제(pH 9.6)(Sigma) 중 hCMV-gB 1μg으로 코팅하였다. 그 다음, 평판을 37℃에서 1 시간 동안 웰당 PBS Tween-밀크(PBS pH7.1, 0.05 % Tween 20, 1% (w/v) 탈지 분유(DIFCO)) 150μL로 차단하였다. 다음 항온처리는 모두 최종 용적 100μL으로 수행한 다음, PBS(pH 7.1), 0.05 % Tween 20에 의한 세정을 3회 실시하였다. PBS-Tween-밀크 중 혈청 샘플의 연속 2배 희석을 수행한 후(1/100 또는 1/1000에서 출발), 이 희석액을 웰에 넣었다. 평판을 37℃에서 90 분 동안 항온처리하였다. 세정 후 항 마우스 IgG1 또는 IgG2c 퍼옥시다아제 접합체(Southern Biotech)(PBS-Tween-밀크 중 1/2000로 희석)를 각 웰에 넣은 후, 평판을 37℃에서 90 분 동안 항온처리하였다. 평판을 또 다시 세정한 다음, 20℃의 어두운 환경에서 사용할 준비가 된 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액(TEBU) 웰당 100 μL와 함께 30분 동안 항온처리하였다. 웰당 1M HCl(Prolabo) 100μL로 반응을 중단시켰다. 450 nm ~ 650 nm에서 평판 판독기(Spectra Max - Molecular Devices)로 광학 밀도(OD)를 측정하였다. CodUnit 소프트웨어를 이용하여 적정 곡선(기준 마우스 과면역 혈청을 각 평판에 넣었을 때의 곡선) 중 OD 값 범위 0.2 내지 3.0에 대한 IgG 항체 역가를 산정하였다. 이 기준 혈청의 IgG 역가(임의의 ELISA 단위(EU)로 표현)는 OD 1.0을 보이며 희석률 역수의 log10에 대응하였다. 항체 검출 역치값은 10 ELISA 단위(1.0 log10)였다. 최종 역가는 모두 log10(Log) 값으로 표현하였다. 그 결과들을 도 4 및 도 5에 도시하였다.
이 결과들은, 보강된 hCMV-gB 항원이, 보강되지 않은 항원에 비하여 증가한 면역 반응을 유도하였음을 보여주었는데(이 때 상기 두 경우 모두 면역 반응은 IgG1 및 IgG2c 역가에 대한 것임), 다만 최저 분자량을 가지는 PAA3000 및 PAA6000은 예외였다. 본 발명의 PAA와 함께 hCMV-gB를 주입하여 면역화한 마우스에서 IgG2c 역가는 특히 강하였으므로, 본 발명의 PAA는 특히 제1형 T 조력자(Th1)에 의한 면역 반응을 증진시키는데 효율적이었음을 알아낸 것은 흥미롭다.
시토카인 측정:
41일에 면역화된 마우스를 안락사한 직후에 비장세포를 분리하여, 96웰 평판의 웰당 2.5 x 105 개 세포로 도말한 다음, hCMV-gB(5 μg/웰), 콘카나발린 A(0.25 μg/웰; 양성 대조군), 또는 배지(RPMI-GSPβ-10% FCS; 백그라운드) 중 어느 하나와만 항온처리하였다. 항온처리한 지 6일 경과시, CBA Flex 세트 키트를 이용하여 IL5 및 IFNγ 시토카인 분비를 확인하였다. 결과를 시토카인 농도(pg/ml)로 나타내었다(군당 기하학적 평균). 양성 시토카인 검출에 대한 역치값은 IL-5의 경우 5 pg/ml, 그리고 IFNγ의 경우 2.5 pg/ml였다. 결과들을 도 6과 도 7에 제시하였다.
이 결과들은, 에멀전 아쥬반트가 사용되었을 때, IL5 수준은 높았던 반면에 IFNγ 수준은 낮았음을 보여주었다. 흥미롭게도, 본 발명에 따른 폴리아크릴산 아쥬반트는 IL5를 낮은 수준으로 유도하였지만, IFNγ는 높은 수준으로 유도하였는데, 이 점은 면역 반응이 Th1 유형으로 치우쳤음을 나타낸다. 이러한 결과는 면역학적 유형세분화 결과에 따른 것이다.
3) 정용여과된, 본 발명에 따른 PAA와, 정용여과전 이의 원료의 비교
본 시험에서는 정용여과가 폴리머의 아쥬반트 특성에 영향을 주지 않았음이 확인되었다.
상기 "2) hCMV-gB에 의해 유도된 면역 반응에 대한, 상이한 폴리머들의 아쥬반트 효과 시험"을 표제로 하는 문단에 기술된 바와 같이 수득한 hCMV-gB 항원 0.08 mg/mL를 포함하는 상이한 제형들을 시험하였다.
Polysciences사에 의해 제공된 폴리아크릴산 폴리머 나트륨 염을 대상으로 2 가지 상이한 방법(즉 정용여과가 수행되지 않는 제조법 및 정용여과가 수행되는 제조법)을 실시하였다.
정용여과가 수행되지 않는 제조법을 위해서, Polysciences사로부터 입수한 제품을 PBS로 간단히 희석한 다음, 0.2 μm 컷-오프 막을 통해 멸균 여과하였다. PAA 염의 농도는 17.4 mg/mL였다. Mw, IP 및 마크-하우윙크 기울기를 측정 및 결정하였다.
정용여과가 수행되는 제조법을 위해, Polysciences사로부터 입수한 제품을 하기 프로토콜에 따라 처리하였다:
a) 폴리머 14 mg/ml를 포함하는 PBS 용액을 수득하기 위해 Polysciences사에 의해 제공된 수용액을 PBS 1C(pH 7.4)와 15분 동안 교반하며 혼합하였다.
b) 단계 a)에서 수득한 용액을, 5 용적만큼의 PBS에 대해 정용여과하였다(이 때 컷-오프 50kDa인 막 사용).
c) 단계 b)에서 수득한 제품을 0.2 μm 멸균 필터로 여과하였다.
수득된 용액은 PAA 염을 15.9 mg/mL 함유하였으며, pH는 7.3이었다. Mw, IP 및 마크-하우윙크 기울기를 측정 및 결정하였다.
정용여과 전과 후에 구하여진 Mw, IP 및 마크-하우윙크 기울기를 표 4에 제시하였다.
[표 4]
Figure 112019015211813-pct00007
정용여과 전과 후의 폴리머 분자량 Mw와 IP는, 모노머 및 소형 올리고머, 구체적으로는 2000 달톤 이하의 것들은 정용여과 단계에 의해 제거되었던 사실과 부합하였다.
Polysciences사에 의해 공표된 Mw(GPC(겔 투과 크로마토그래피)에 의해 측정)는 887,000 Da이었고, 이 값은 정용여과 전에 측정된 Mw와 차이가 매우 많이 난다는 사실에 주목하게 된 것도 또한 중요하다.
이러한 폴리머 제제들 중 어느 하나와 gB 용액을 적당한 비율로 혼합하여 상기 2가지 상이한 제조법으로부터 면역화 제형을 제조함으로써, 각각 gB 2μg와 하기의 것들, 즉
- 정용여과된 제형으로부터 유래하는 폴리머 염 25 μg, 50 μg, 100 μg 또는 200 μg, 또는
- 정용여과되지 않은 제형으로부터 유래하는 폴리머 염 25 μg, 50 μg, 100 μg 또는 200 μg
을 함유하였던 용량을 50 μl만큼씩 획득하였다.
당일 및 21일에, 제조된 제형들 중 어느 하나를 근육내 경로에 의해 투여하여 7 주령 C57BL/6J 마우스를 2회 면역화하였다. 5 마리 마우스로 이루어진 군을 대상으로 각각의 제제를 시험하였다. 대조군으로서, 5 마리 마우스로 이루어진 하나의 군에는 항원만을 투여하였다.
면역화된 마우스에서의 세포성 반응(IFNγ 및 IL5) 및 체액성 반응(IgG 항체 하위군, 혈청중화 항체)을, 마지막 면역화(35일)로부터 2주 후에 상기 "2) hCMV-gB에 의해 유도된 면역 반응에 대한, 상이한 폴리머들의 아쥬반트 효과 시험"을 표제로 하는 문단에 기술된 바와 동일한 방법으로 모니터링하였다.
결과들은, 선행된 시험에서와 같이, 본 발명에 따른 아쥬반트가 강력한 바이러스 중화 항체 역가 달성과 함께, 강력한 Th-1 면역 반응을 유도하였고, 정용여과된 제형으로 면역화한 마우스와 정용여과되지 않은 제형으로 면역화한 마우스 사이에는 유의미한 차이가 없었음을 보여주었다.
4) PAA 원료의 안정성과 비교함에 의한, 정용여과된 PAA의 안정성 연구
본 발명에 따른 PAA 아쥬반트의 안정성을 검사하기 위하여, 가속 노화 시험에 있어 폴리머 염 분자량의 가변성을 분석하는 연구를 수행하였다.
이 시험을 위해, 정용여과되지 않은 제제와 정용여과된 제제를 사용하였다. 50 kDa 컷-오프를 가지는 막을 사용하여 정용여과함으로써 정제를 수행하였는데, 이로부터 얻어진 정용여과 제제는 분자량 443553 Da인 PAA 폴리머 염을 PBS 1C 중 8 mg/mL만큼 함유하였다.
과황산나트륨 중 이의 함량은 건조 폴리머로서 0.0007%(w/w) 미만이었으며; 아크릴산나트륨의 함량은 건조 폴리머로서 0.0011%인 것으로 측정되었다.
이 제제를 유리 바이알에 채운 다음, 이의 온도를 +5℃, +25℃ 또는 +37℃로 유지시켰다. 5℃에서는 24 개월에 걸쳐, 25℃에서는 9 개월에 걸쳐, 그리고 37℃에서는 3 개월에 걸쳐 분석을 수행하였다. 이와 같은 안정성 연구로부터 획득된 결과들을 이하 표 5에 제시하였다.
[표 5]
Figure 112019015211813-pct00008
Figure 112019015211813-pct00009
이 결과들은, 24 개월 동안 5℃에 보관한 후, 9 개월 동안 25℃에 보관한 후, 그리고 3 개월 동안 37℃에 보관한 후 Mw에는 유의미한 감소가 없었으며, 이 폴리머의 다분산 지수는 동일하게 유지되었음을 보여준다.
이 점은, 투석되지 않았고, 과황산나트륨을 조성물 건조 중량을 기준으로 0.42% w/w의 농도로 함유하였던, 거의 동일한 PAA 염 10% w/w를 포함하는 수용액에 대응하는 조성물로 수득되었던 결과들과 대조적이었다. 폴리머 염의 초기 Mw는 470,269 Da인 것으로 측정되었던 반면에, 공급자에 의해 공표된 Mw는 GPC에 의해 측정하였을 때 351,100 Da이었다.
이처럼 투석되지 않은 폴리머 용액을 대상으로 안정성 연구가 행하여지는 동안에 수득된 결과들을 이하 표 6에 제시하였는데, 이 표는 시간이 지남에 따라, 구체적으로 25℃ 및 37℃에 보관한 후에 분자량이 감소하였음을 보여준다.
[표 6]
Figure 112019015211813-pct00010
Figure 112019015211813-pct00011
5) 과황산염 함유물의 유해한 효과를 보여주는 시험
(Polysciences사에 의해 제공된) 폴리아크릴산 폴리머의 나트륨 염을 고압증기멸균(온도 121℃, 15분)으로 멸균하였다. 용액 중 PAA 염의 농도는 101.8 mg/g였다. 이하 표 7은, 고압증기멸균 전과 후에 있어서 PAA 염의 Mw, IV(고유 점도) 및 마크-하우윙크 기울기를 보여준다.
[표 7]
Figure 112019015211813-pct00012
고압증기멸균 처리는 Mw와 IV의 급격한 감소를 초래하는 것으로 보인다. 이처럼 가열시 폴리머 열화에 관여하는 매개변수를 연구하는, 후속 연구를 수행하였다. 이 연구는, 폴리머 염의 정제, 구체적으로 정용여과에 의한 정제는 고압증기멸균에 의한 멸균시 폴리머를 안정화할 수 있었음을 보여주었다.
NaPAA 폴리머와 과황산염의 혼합물을 열에 노출시켜 고압증기멸균 조건을 재현하였는데; 이때, 120℃에서 15분 동안의 항온처리 전과 후에, 조성물을 NaPAA Mw 및 과황산염 함량에 대하여 특성규명하였다. 표 8에는, NaPAA Mw와 과황산염 함량의 관점에서 본 조성물의 특징들이 상세히 기술되어 있다.
[표 8]
이 결과들은 과황산염의 존재가, 열 처리 후 Mw 감소를 초래함을 보여준다. 이와는 대조적으로, 과황산염 함량이 매우 낮을 때 PAA의 Mw는 매우 안정적이었다. 결론적으로, PAA 용액의 열 안정성은 이 PAA 용액 중 과황산염 함량과 직접적으로 연계될 수 있었다. 본 발명의 방법에 도입된 정용여과 단계는 PAA 용액으로부터 과황산염 불순물을 제거하였고, 그 결과 고압증기멸균에 의한 멸균과 양립 가능한 열 안정 PAA 용액이 수득되었다.
실시예 3 - PAA는 강력한 반응을 지원하고, 항원 유효부하량(antigen payload)을 줄여준다
가축 병원체에 대한 보다 넓은 방어력을 도모하기 위해서는, 기존의 백신 제형(예컨대 일반적으로 비활성화된 독소 및/또는 박테린과 수산화알루미늄 아쥬반트를 포함하는 SINTOXAN® 제품) 또는 별도 단일 항원 백신들의 제형에 항원을 첨가할 것을 필요로 한다. 조합 백신을 제공하는 것이 상업적으로 더 많이 요망되므로, 출원인들은 기존의 용량 용적을 여전히 유지하는 신규 항원을 제공할 수 있되, 우수한 안정성 프로필을 보이는, 더 강력한 아쥬반트를 동정할 수 있을 것이라고 추론하였다.
중요한 점은, 백신업계 및 면역학계의 당 업자라면 잘 알고 있다시피, 당 업자는 어떤 분자 종이 안전하고 유효한 면역원성 아쥬반트로서 기능을 발휘할 것인지 아닌지 여부를 미리 예측할 수 없다는 점이다. 더군다나, 심지어 아쥬반트 특성이 신규 분자를 확립한 이후에 조차도, 당 분야에서는 예측불가능한 성질로 말미암아 당 업자는 상이한 상황에 신규 아쥬반트를 적용하였을 때 결과의 성공여부를 합리적으로 예측할 수 없다. 신규 제형이 안전하고 방어적인 백신으로서 기능을 발휘할지 안할지 여부에 영향을 미치는 변수로서는 1) 아쥬반트 유형/존재여부; 2) 항원 유형/성질(펩티드인지, 핵산인지, 사멸된 바이러스인지, 아니면 박테린인지 등); 3) 투여 경로; 4) 표적 병원체 유형/균주; 그리고 5) 백신화될 표적 종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서 신규 백신 아쥬반트의 안전성과 효능은, 자체의 일반적 적용가능성에 대해 임의의 의미있는 결론이 도출될 수 있게 되기 전에 이러한 변수들 중 적어도 몇 가지의 조합에 대해 입증되어야 한다.
이 경우, 즉 항원 유형으로서 비활성화된 세균이 대체로 포함될 때, 출원인들은 궁극적으로 신규하고, 효능이 더 세며, 용량 절감을 달성하는 아쥬반트는 리파아제 내성이어야 할 것임을 추론하였다. 불행하게도, 제형을 리파아제 내성이 되도록 만들 수 있는 화합물은 종종 원치않는 투여 부위 반응을 유발할 수 있다. 그러므로 백신 안전성, 효능 및 안정성 간 균형을 잘 맞추는 것이 절실히 요구되는 바이다.
실험적 SINTOXAN® 백신(Merial Brazil - 씨. 퍼프린젠스 B/C; 씨. 퍼프린젠스 D; 씨. 셉티큠; 씨. 노비이; 씨. 테타니)을 제조하고, 마우스, 기니아 피그 및 토끼를 대상을 시험을 실시하였다. 일례로서, 기니아 피그를 대상으로 하는 연구 디자인과 그 결과들을 각각 하기 표 9와 표 10에 제시하였다.
[표 9]
[표 10]
Figure 112019015211813-pct00015
기니아 피그, 마우스 및 토끼에 대한 안전성은 우수하였으며, 표 10에 보인 바와 같이 효능도 우수하였는데, 특히 수산화알루미늄을 포함하지 않는 제형을 사용하였을 경우 그러하였다(예컨대 노비이, 셉티큠 및 소르델리이 컬럼 참조; E 및 D 비교). 본 출원인들은 수산화알루미늄과 신규 폴리머 아쥬반트의 조합(E군)은 신규 폴리머만 포함하는 제형(D군)을 능가할 것이라 합리적으로 예상하였기 때문에, 이러한 결과들은 꽤 놀라운 것이었다.
실시예 4 - PAA가 관행적 비활성화 또는 재조합된 백신과 함께 제형될 때, 이는 개과 동물에서의 방어적 반응을 지지한다.
비활성화 광견병 바이러스 연구: 표 11에 따라서 백신을 제조하였으며, 그 결과들을 도 8에 제시하였다. 시험된 아쥬반트 모두는 개에 사용하기 안전한 것으로 보이며, 7일에 이르기까지 모든 아쥬반트는 혈청변환을 유도하였는데, 이 때 백신화 이후 양(+)의 역가는 70일까지 유지되었다. PAA 225000가 비활성화 광견병 바이러스의 단기 면역원성을 개선하는데 가장 유효한 아쥬반트였다.
[표 11]
Figure 112019015211813-pct00016
카나리아 두창 매개 인플루엔자 연구: 카나리아 두창 매개 인플루엔자 백신 제형을 제조한 다음, 5개의 군에 대해 시험하였으며(각 군은 7 마리의 개로 이루어짐)(표 12), 그 결과들을 도 10에 제시하였다. 14일, 27일 및 41일에 모든 군에서 IFNγ 생산 세포가 높은 수준으로 검출되었다. 상기 관행적 비활성화 백신 제형에서 관찰되는 경향과 유사하게, 카나리아 두창 매개 인플루엔자 항원은 MW가 더 큰 PAA(즉 PAA225000)에 의해 보강이 더 잘 이루어지는 것으로 보였다. vCP2242는 본원에 전체가 참조로 인용된 미국 특허 제7,425,336호(Merial)에 상세히 기술되어 있다. 하지만 여기서 요약하자면, vCP2242는 H3N8 말 인플루엔자 바이러스(EIV)로부터 유래한 코돈 최적화 HA 유전자를 함유하는 재조합 ALVAC이다(다만, 이 HA 유전자는 ALVAC C5 자리에 삽입됨). 본 출원인들은, 본원에 개시된 결과들이 재조합 카나리아 두창 벡터가 본 발명의 비가교 PAA와 양립 가능하며, 이에 의해 보강이 잘 이루어진다는 일반적인 결론을 지지해 줌을 주장하는 바이다(예컨대 도 9 참조).
[표 12]
실시예 5 - 비 가교 PAA는 말과 동물 백신용으로 유효한 아쥬반트이다.
카나리아 두창 매개 말 인플루엔자 + 파상풍 독소 연구: 말과 동물에 표 13에 따른 제형들을 투여하였다. 이하와 도 11 ~ 도 13에 보인 바와 같이, PAA는 2개의 무관한 항원들을 강력하게 보강하여, 말과 동물에서 방어적 면역 반응을 이끌어냈다.
[표 13]
결과: 14일에 이르기까지, PAA225000이 투여된 모든 동물은 방어 역가가 0.05 IU/ml 이상이었다. 14일, 카보머 보강 백신 투여 군의 8 마리 동물 중 6 마리의 방어 역가는 여전히 0.05 IU/ml 미만이었다. 그러므로 PAA225000 보강 백신 제형은 카보머 보강 면역학적 제형이 보이는 혈청변환보다 유의미하게 더 우수한 혈청변환을 보였다. 49일(2차 백신화 이후)까지 PAA225000 투여 군에서 보이는 역가는 모든 동물에서 유의미하고 효과적으로 높았다.
실시예 6 - PAA는 돼지과 동물 백신용으로서 유효한 아쥬반트이다
" SpaA " 항원 돼지 연구: "SpaA"는 돼지과 동물과, 개과 동물을 포함한 기타 동물들을 감염시키는 병원체인 에리시펠로트릭스 루시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae)의 "방어적 표면 항원"을 의미하도록 의도된다. 에리시펠로트릭스 루시오파티아에는 그램 양성, 카탈라아제 음성, 막대형, 포자 비형성, 내산성 및 비 이동성 세균이다. 돼지에서, 이. 루시오파티아에는 "다이아몬드 피부병"을 일으킨다. "TS6"은, 예를 들어 미국 특허 제7,371,395호(Merial)에 기술된 수중유 에멀전을 의미한다. TS6은, 항원 함유 수성 성분 약 1(1)부를 유질 성분 약 2(2)부에 첨가한 다음, 이 두 성분을 유화하여 최종 에멀전으로 제조함으로써 제형된다.
[표 14]
G1이 최선의 결과를 보였을 때, 수중유 에멀전에 대한 용량 용적의 대부분을 비 항원 성분이 차지하였음은 주목할만하다(위에 보인 바와 같이, 유질 성분 대 수성 항원 성분의 비는 2:1이었음).
지금부터 본 발명은 하기 번호를 매긴 문단들에 의해 요약될 것이다:
1. 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw가 350 kDa 내지 650 kDa의 범위인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
2. 제1 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염은 배타적으로 아크릴산의 염에 대응하는 단위로 이루어지거나, 배타적으로 아크릴산의 유리 산 형태에 대응하는 단위와 아크릴산의 염에 대응하는 단위로 이루어진 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
3. 제1 문단 또는 제2 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 산화제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
4. 제1 문단 내지 제3 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.001 %w/w 미만의 산화제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
5. 제1 문단 내지 제3 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 과황산염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
6. 제1 문단 내지 제5 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.001 %w/w 미만의 과황산염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
7. 제1 문단 내지 제6 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머는 Na+와의 염인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
8. 제1 문단 내지 제7 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 다분산 지수는 4 이하, 바람직하게는 2.5 이하인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
9. 제1 문단 내지 제8 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw는 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 4 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw는 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 4 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw는 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 2.5 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw는 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 2 이하인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
10. 제1 문단 내지 제9 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 기울기는 0.7 이상인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
11. 제1 문단 내지 제10 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 유리 산 형태 또는 염 형태의 아크릴산 모노머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
12. 제1 문단 내지 제11 문단 중 어느 한 문단에 있어서, pH가 5.5 내지 8.0의 범위인 액체 제형 중에 있는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
13. 제10 문단에 있어서, 완충된 수용액, 특히 인산염 완충제 또는 TRIS, HEPES, 히스티딘 또는 시트르산염 완충제를 갖는 완충된 수용액 중에 있는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
14. 제1 문단 내지 제13 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 정용여과되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
15. 제1 문단 내지 제14 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 멸균되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
16. 제1 문단 내지 제15 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 백신 조성물로 수득된 Th1 면역 반응을 향상시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물에서 아쥬반트로서 사용되는 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염.
17. 아쥬반트로서 제1 문단 내지 제16 문단 중 어느 한 문단에 따른 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염과, 적어도 하나의 백신 제제를 포함하는 백신 조성물.
18. 제17 문단에 있어서, 용량당 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염 0.1 mg 내지 8 mg, 바람직하게는 0.1 mg 내지 4 mg, 더욱 바람직하게는 0.1 mg 내지 2 mg을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
19. 제17 문단 또는 제18 문단에 있어서, 적어도 하나의 백신 제제는 항원을 발현하는 핵산 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터 또는 항원인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
20. 제18 문단에 있어서, 항원은 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 디프테리아에, 보르데텔라 페르투시스, 해모필러스 인플루엔자 B형, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 네이세리아 메닝기티디스, 쉬겔라 종, 살모넬라 타이피, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스타필로코커스 에피더미디스, 마이코박테리움 튜베르큘로시스, 클라미디아 트라코마티스 또는 클라미디아 뉴모니아에 또는 스트렙토코커스 종으로부터 기원하는 세균 항원이거나; A형, B형 또는 C형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기융합 바이러스, 리노 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 광견병 바이러스, 소아마비 바이러스, HIV 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 거대세포바이러스 또는 헤르페스 바이러스로부터 기원하는 바이러스 항원이거나; 또는 플라스모듐 종, 리슈마니아 종, 쉬스토소마로부터 기원하는 기생체 항원이거나; 또는 종양 항원인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
21. 제17 문단 내지 제19 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 적어도 하나의 백신 제제는 항원 또는 항원을 암호화하는 벡터, 예컨대 핵산 또는 재조합 바이러스이고, 상기 항원은 스타필로코커스 아우레우스 또는 거대세포바이러스로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
22. 제17 문단 내지 제21 문단 중 어느 한 문단에 있어서, pH가 6.0 내지 8.0 범위인 액체 형태인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
23. 제21 문단에 있어서, 완충된 수용액, 특히 인산염 완충제 또는 TRIS, HEPES, 히스티딘 또는 시트르산염 완충제를 갖는 완충된 수용액 중에 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
24. 제17 문단 내지 제23 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 수득된 Th1 면역 반응의 향상 및/또는 수득된 Th1 면역 반응 및 Th2 면역 반응 간 균형과 함께, 개체, 특히 인간 내에서 면역 반응을 증강시키는데 사용되기 위한 백신 조성물.
25. 제1 문단 내지 제16 문단 중 어느 한 문단에 따른 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위한 방법으로서, 하기 연속 단계들, 즉
a) 폴리아크릴산 폴리머 용액을 제공하는 단계,
b) 불순물을 제거하기 위하여 폴리아크릴산 폴리머 용액을 정제하는 단계, 및
c) 폴리아크릴산 폴리머의 정제된 용액을 멸균하는 단계
를 포함하는 방법.
26. 제25 문단에 있어서, 단계 a)의 용액의 폴리아크릴산 폴리머의 중량 평균 분자량 Mw는 300 kDa 내지 550 kDa의 범위인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
27. 제25 문단 또는 제26 문단에 있어서, 정제는 투석, 정용여과, 한외여과 또는 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
28. 제27 문단에 있어서, 정제는 컷-오프 1 kDa 내지 80 kDa, 바람직하게 2 kDa 내지 50 kDa인 막이 사용되는 정용여과에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
29. 제25 문단 내지 제28 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 정제는
- 정제 후 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만의 산화제, 및/또는 정제 후 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 바람직하게 0.001 %w/w 미만의 과황산염,
- 정제 후 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 유리산 형태 또는 염 형태 아크릴산 모노머
를 갖고,
- 폴리아크릴산 폴리머 염에 대하여: 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 4 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 4 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2.5 이하이거나; 또는 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2 이하인, 용액 중의 폴리아크릴산 폴리머의 수득을 허용하는 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
30. 제25 문단 내지 제29 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 멸균은 고압증기멸균기 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
31. 제25 문단 내지 제30 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 정제 및 멸균은 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염의 용액에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
32. 제25 문단 내지 제31 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 정제는 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염 2 mg/mL 내지 50 mg/mL를 함유하는 용액에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
33. 제1 문단 내지 제16 문단 중 어느 한 문단에 따른 폴리아크릴산 폴리머 염의 용액의 보관 방법으로서, 제25 문단 내지 제32 문단 중 어느 한 문단에 따른 제조 방법을 포함하고, 이후 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염을 용액 중에 보관하는 단계가 뒤따르는 보관 방법.
34. 제33 문단에 있어서, 보관 단계는 적어도 1 일 내지 2 년 이하로 지속되는 것을 특징으로 하는 보관 방법.
35. 제33 문단 또는 제34 문단에 있어서, 보관 단계는 0℃ 내지 30℃의 범위, 바람직하게는 2℃ 내지 8℃의 범위의 온도에서 폴리아크릴산 폴리머 염의 용액을 용기에 넣음으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 보관 방법.
36. 제33 문단 내지 제35 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 보관 중 폴리아크릴산 폴리머 염의 용액은 광선이 닿지 않는 것을 특징으로 하는 보관 방법.
37. 항원 성분의 치료적 유효량, 약학적으로나 수의학적으로 허용 가능한 담체, 그리고 Mw 약 350 kDa 내지 약 650 kDa이고, 다분산 지수 약 4 미만 또는 약 2 미만인 비 가교 폴리아크릴산(PAA) 폴리머를 포함하거나 본질적으로 이것으로 이루어진 아쥬반트를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
38. 제35 문단의 조성물로서, PAA의 Mw는 약 400 kDa 내지 약 600 kDa인 조성물.
39. 제36 문단의 조성물로서, PAA의 Mw는 약 400 kDa 내지 약 500 kDa인 조성물.
40. 제35 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 약독화된 재조합 바이러스 벡터, 자연 발생 또는 유전자 조작된 약독화 생 바이러스 또는 미생물, 비활성화된 바이러스 또는 미생물, 콕시디안 미생물, 조숙 콕시디안 미생물, 단백질 서브유닛, 단세포 기생체, 다세포 기생체 또는 앞서 열거된 것들의 임의의 조합을 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
41. 제35 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 상기 항원 성분은 에이메리아 종 또는 이의 항원, 에스케리치아 콜라이(이. 콜라이) 또는 이의 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에(엠. 하이오), 소 설사 바이러스(BDV) 항원, 적어도 하나의 방어적 면역원을 함유하고, 이를 생체내 발현시킬 수 있는 재조합 카나리아 두창 벡터, 비활성화된 전장 광견병 당단백, 에리시펠로트릭스 종, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에, 이. 루시오파티아에로부터 유래하는 방어적 표면 항원(SpaA), 추가의 면역원 적어도 하나의 적어도 일부분을 포함하는 SpaA 융합 단백질, SpaA-FlaB 융합 단백질, SpaA-FlaB-His 융합 단백질, 클로스트리듐(씨.) 퍼프린젠스 B/C 독소, 씨. 퍼프린젠스 D 독소, 씨. 셉티큠 독소, 씨. 노비이 독소, 씨. 테타니 독소 또는 앞서 열거된 것들의 임의의 조합을 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
42. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 비활성화된 전장 광견병 당단백을 포함하거나 이것으로 이루어진 면역학적 또는 백신 조성물.
43. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 씨. 퍼프린젠스 B/C 독소, 씨. 퍼프린젠스 D 독소, 씨. 셉티큠 독소, 씨. 노비이 독소, 씨. 테타니 독소 또는 이것들의 조합을 포함하거나 이것으로 이루어진 면역학적 또는 백신 조성물.
44. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 씨. 퍼프린젠스 B/C 독소, 씨. 퍼프린젠스 D 독소, 씨. 셉티큠 독소, 씨. 노비이 독소 및 씨. 테타니 독소를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
45. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 SpaA 항원 또는 이 SpaA 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
46. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 인플루엔자 유전자를 함유하고 이 유전자의 생체내 발현이 가능한 DNA 플라스미드 또는 약독화된 조류 두창 바이러스를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
47. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 광견병 당단백 유전자를 함유하고 이 유전자의 생체내 발현이 가능한 DNA 플라스미드 또는 약독화된 조류 두창 바이러스를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
48. 세균에 의해 유발되는 감염에 대해 소과 동물을 치료하는 방법으로서, 소과 동물에 제41 문단의 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
49. 인플루엔자에 의해 유발되는 감염에 대해 개과 동물 또는 말과 동물을 치료하는 방법으로서, 개과 동물 또는 말과 동물에 제44 문단의 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
50. 광견병 바이러스에 의해 유발되는 감염에 대해 개과 동물을 치료하는 방법으로서, 개과 동물에 제44 문단의 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
51. (a) 평균 Mw 약 350 kDa 내지 약 650 kDa인 비 가교 PAA를 포함하는 아쥬반트; 및
(b) (1) 하나 이상의 재조합 발현 단백질; (2) 종래 방법으로 원생동물로부터 분리된 하나 이상의 단백질 또는 기타 거대분자; (3) 원생동물로부터 유래하는 전세포 추출물 또는 제제; 및 (4) 에이메리아(이.) 아세르불리나, 이. 아데노에이데스, 이. 브루네티, 이. 콜히치, 이. 커바타, 이. 디스페르사, 이. 듀오데날리스, 이. 프라테르큘라에, 이, 갈로파보니스, 이. 이노쿠아, 이. 프라에콕스, 이. 막시마, 이. 멜레아그리디스, 이. 멜레아그리미티스, 이. 미티스, 이. 네카트릭스, 이. 파시아니, 이. 프로세라, 이. 테넬라 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 비활성화, 생 또는 조숙 생 콕시디안으로부터 선택되는 원생동물 항원
을 포함하는, 난자내 투여용 조류 콕시디아증 백신.
52. 이. 콜라이 또는 엠. 하이오에 의해 유발되는 감염에 대해 소과 동물을 치료하는 방법으로서, 소과 동물에 제39 문단의 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 항원 성분은 이. 콜라이 또는 엠. 하이오를 포함하는 방법.
53. 제39 문단에 있어서, 항원 성분은 엠. 하이오를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
54. 엠. 하이오에 의해 유발되는 감염에 대해 돼지를 치료하는 방법으로서, 돼지에 제51 문단의 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
55. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 FIV를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
56. FIV에 의해 유발되는 감염에 대해 고양이과 동물을 치료하는 방법으로서, 고양이과 동물에 제53 문단의 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
57. 제39 문단의 백신 조성물로서, 항원 성분은 암 항원을 포함하는 백신 조성물.
58. 암에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에 제55 문단의 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
59. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 개 코로나바이러스(CCV)를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
60. CCV에 의해 유발되는 감염에 대해 개과 동물을 치료하는 방법으로서, 제57 문단의 백신 조성물을 개과 동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
61. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 소 로타바이러스를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
62. 소 로타바이러스에 의해 유발되는 감염에 대해 소과 동물을 치료하는 방법으로서, 제59 문단의 백신 조성물을 소과 동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
63. 제39 문단의 면역학적 또는 백신 조성물로서, 항원 성분은 개 인플루엔자 바이러스(CIV)를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
64. CIV에 의해 유발되는 감염에 대해 개과 동물을 치료하는 방법으로서, 제61 문단의 백신 조성물을 개과 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
* * *
본원에 개시된 바와 같이, 출원인들은 비 가교(즉 선형 및 분지형) 폴리아크릴산(PAA) 폴리머의 어떤 분자량 범위가 면역원성 항원의 효과를 보강하고, 또한 항원과는 독립적으로 면역 반응을 유도하기에 특히 적합하다는 것을 처음으로 발견하였다. 중요한 점은, 놀랍게도 출원인들이 이러한 비 가교 PAA 아쥬반트가 다수의 상이한 항원 유형, 즉 약독화 재조합 바이러스 벡터; 관행에 의해 비활성화된 광견병 당단백; SpaA 펩티드 서브유닛; 및 세균 독소에 대해서도 폭넓게 유용하였음을 발견하였다는 점이다. 게다가, 개시된 PAA 아쥬반트는 다수의 동물 유형에 대해서도 기능을 잘 발휘하였다. 그러므로 출원인들은 비 가교 PAA가 신규, 즉 본 발명의 "보편적 아쥬반트(universal adjuvant)"를 대표한다는 사실을 진술하고자 한다.

Claims (64)

  1. 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 20 - 80 kDa 컷-오프로 정용여과된 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진, 백신 조성물을 위한 아쥬반트 조성물로서,
    상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw가 350 kDa 내지 650 kDa의 범위이고 다분산 지수가 4 이하이며, 폴리아크릴산 폴리머 염이 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 산화제를 0.005 %w/w 미만 포함하고, 폴리아크릴산 폴리머 염이 배타적으로 아크릴산의 염인 아크릴산 단위로 이루어지거나, 배타적으로 아크릴산의 유리 산 형태인 아크릴산 단위와 아크릴산의 염인 아크릴산 단위로 이루어진 것을 특징으로 하는, 아쥬반트 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.001 %w/w 미만의 산화제; 또는 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만 또는 0.001 %w/w 미만의 과황산염을 포함하고, 폴리머는 임의로 Na+ 와의 염인 것을 특징으로 하는, 아쥬반트 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 중량 평균 분자량 Mw는 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 4 이하이거나; 중량 평균 분자량 Mw는 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 4 이하이거나; 중량 평균 분자량 Mw는 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 2.5 이하이거나; 중량 평균 분자량 Mw는 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수는 2 이하인 것을 특징으로 하는, 아쥬반트 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 마크-하우윙크 (Mark Houwink) 기울기는 0.7 이상인 것을 특징으로 하는, 아쥬반트 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 완충된 수용액 중에 있는 것을 특징으로 하는, 아쥬반트 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 완충된 수용액이 인산염 완충제 또는 TRIS, HEPES, 히스티딘 또는 시트르산염 완충제를 갖는 완충된 수용액인 것을 특징으로 하는, 아쥬반트 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 멸균되는 것을 특징으로 하는, 아쥬반트 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 백신 조성물로 수득된 Th1 면역 반응을 향상시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는, 아쥬반트 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 아쥬반트 조성물과 적어도 하나의 백신 제제를 포함하는 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 용량 당 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염 0.1 mg 내지 8 mg, 또는 0.1 mg 내지 4 mg, 또는 0.1 mg 내지 2 mg을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 백신 제제는 항원 또는 항원을 발현하는 벡터, 또는 바이러스 벡터 또는 핵산인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 항원은 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 디프테리아에, 보르데텔라 페르투시스, 해모필러스 인플루엔자 B형, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 네이세리아 메닝기티디스, 쉬겔라 종, 살모넬라 타이피, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 마이코박테리움 튜베르큘로시스, 클라미디아 트라코마티스 또는 클라미디아 뉴모니아에 또는 스트렙토코커스 종으로부터 기원하는 세균 항원이거나; A형, B형 또는 C형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기융합 바이러스, 리노 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 광견병 바이러스, 소아마비 바이러스, HIV 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 거대세포바이러스 또는 헤르페스 바이러스로부터 기원하는 바이러스 항원이거나; 플라스모듐 종, 리슈마니아 종, 또는 쉬스토소마 종으로부터 기원하는 기생체 항원이거나; 종양 항원인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 백신 제제는 항원 또는 항원을 암호화하는 벡터 또는 재조합 바이러스 또는 핵산이고, 상기 항원은 스타필로코커스 아우레우스 또는 거대세포바이러스로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 수득된 Th1 면역 반응의 향상 및/또는 수득된 Th1 면역 반응 및 Th2 면역 반응 간 균형과 함께, 개체, 또는 인간 내에서 면역 반응을 증강시키는데 사용되기 위한 백신 조성물.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 아쥬반트 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 하기 연속 단계들, 즉
    a) 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염의 용액을 제공하는 단계,
    b) 불순물을 제거하기 위하여 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염의 용액을 정제하는 단계, 및
    c) 선형 또는 분지형 폴리아크릴산 폴리머의 약학적으로 허용 가능한 염의 정제된 용액을 멸균하는 단계
    를 포함하고,
    정제는 정용여과에 의해 수행되고,
    정용여과는 컷-오프가 20 kDa 내지 80 kDa 인 막으로 수행되는 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 정제는
    - 정제 후 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 또는 0.001 %w/w 미만의 산화제, 및/또는 정제 후 수득된 상기 폴리아크릴산 폴리머의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만, 또는 0.001 %w/w 미만의 과황산염,
    - 정제 후 수득된 폴리아크릴산 폴리머의 총 건조 중량을 기준으로 0.005 %w/w 미만의 유리산 형태 또는 염 형태의 아크릴산 모노머
    를 갖고,
    - 폴리아크릴산 폴리머 염에 대하여: 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 4 이하이거나; 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 4 이하이거나; 중량 평균 분자량 Mw가 380 kDa 내지 620 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2.5 이하이거나; 중량 평균 분자량 Mw가 400 kDa 내지 600 kDa의 범위이고, 다분산 지수가 2 이하인, 용액 중의 폴리아크릴산 폴리머의 수득을 허용하는 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  17. 항원 성분의 치료적 유효량, 약학적으로나 수의학적으로 허용 가능한 담체, 그리고 Mw 350 kDa 내지 650 kDa이고, 다분산 지수 4 미만 또는 2 미만인 선형 또는 분지형 비(非) 가교 폴리아크릴산(PAA) 폴리머의 20 - 80 kDa 컷-오프로 정용여과된 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 아쥬반트를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물로서, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 산화제를 0.005 %w/w 미만 포함하고, 폴리아크릴산 폴리머 염이 배타적으로 아크릴산의 염인 아크릴산 단위로 이루어지거나, 배타적으로 아크릴산의 유리 산 형태인 아크릴산 단위와 아크릴산의 염인 아크릴산 단위로 이루어진 면역학적 또는 백신 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 항원 성분은 약독화된 재조합 바이러스 벡터, 자연 발생 또는 유전자 조작된 약독화 생 바이러스 또는 미생물, 비활성화된 바이러스 또는 미생물, 콕시디안 미생물, 조숙 콕시디안 미생물, 단백질 서브유닛, 단세포 기생체, 다세포 기생체 또는 앞서 열거된 것들의 임의의 조합을 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 항원 성분은 에이메리아 종 또는 이의 항원, 에스케리치아 콜라이(이. 콜라이) 또는 이의 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에(엠. 하이오), 소 설사 바이러스(BDV) 항원, 적어도 하나의 방어적 면역원을 함유하고, 이를 생체내 발현시킬 수 있는 재조합 카나리아 두창 벡터, 비활성화된 전장 광견병 당단백, 에리시펠로트릭스 종, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에, 이. 루시오파티아에로부터 유래하는 표면 보호 항원(SpaA), 추가의 면역원 적어도 하나의 적어도 일부분을 포함하는 SpaA 융합 단백질, SpaA-FlaB 융합 단백질, SpaA-FlaB-His 융합 단백질, 클로스트리듐(씨.) 퍼프린젠스 B/C 독소, 씨. 퍼프린젠스 D 독소, 씨. 셉티큠 독소, 씨. 노비이 독소, 씨. 테타니 독소 또는 앞서 열거된 것들의 임의의 조합을 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
  20. (a) 평균 Mw 350 kDa 내지 650 kDa이고, 다분산 지수가 4 이하인 선형 또는 분지형 비 가교 폴리아크릴산(PAA) 폴리머의 20 - 80 kDa 컷-오프로 정용여과된 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어지고, 상기 폴리아크릴산 폴리머 염의 총 건조 중량을 기준으로 산화제를 0.005 %w/w 미만 포함하며, 폴리아크릴산 폴리머 염이 배타적으로 아크릴산의 염인 아크릴산 단위로 이루어지거나, 배타적으로 아크릴산의 유리 산 형태인 아크릴산 단위와 아크릴산의 염인 아크릴산 단위로 이루어진 아쥬반트; 및
    (b) (1) 하나 이상의 재조합 발현 단백질; (2) 종래 방법으로 원생동물로부터 분리된 하나 이상의 단백질 또는 기타 거대분자; (3) 원생동물로부터 유래하는 전세포 추출물 또는 제제; 및 (4) 에이메리아 아세르불리나, 이. 아데노에이데스, 이. 브루네티, 이. 콜히치, 이. 커바타, 이. 디스페르사, 이. 듀오데날리스, 이. 프라테르큘라에, 이, 갈로파보니스, 이. 이노쿠아, 이. 프라에콕스, 이. 막시마, 이. 멜레아그리디스, 이. 멜레아그리미티스, 이. 미티스, 이. 네카트릭스, 이. 파시아니, 이. 프로세라, 이. 테넬라 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 비활성화, 생 또는 조숙 생 콕시디안으로부터 선택되는 원생동물 항원
    을 포함하는, 난자내 (in ovo) 투여용 조류 콕시디아증 백신.
  21. 제18항에 있어서, 항원 성분은 엠. 하이오; FIV; 암 항원; 개 코로나바이러스; 소 로타바이러스; 또는 개 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
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