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KR102721257B1 - 가교 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물 - Google Patents

가교 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물 Download PDF

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KR102721257B1
KR102721257B1 KR1020240018571A KR20240018571A KR102721257B1 KR 102721257 B1 KR102721257 B1 KR 102721257B1 KR 1020240018571 A KR1020240018571 A KR 1020240018571A KR 20240018571 A KR20240018571 A KR 20240018571A KR 102721257 B1 KR102721257 B1 KR 102721257B1
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KR
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cross
gelatin
linked
linking
degree
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KR1020240018571A
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김창수
오준석
노용권
박미경
Original Assignee
주식회사 엘앤씨이에스
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Abstract

본 발명은 가교된 젤라틴을 기반으로 하는 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물은 정량화된 젤라틴 가교도를 기반으로 제조되어, 단독으로 사용하여도 기존 상용화된 지혈 제품 대비 지혈능이 우수한 효과가 있을 뿐만아니라, 의료현장에서 필요한 경우 혈장분획제재를 추가로 혼합하여 지혈능을 더욱 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

가교 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물{Crosslinked gelatin based biodegradable composition for hemostatic agents}
본 발명은 가교된 젤라틴을 기반으로 하는 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 제조된 가교 젤라틴 지혈 조성물의 가교도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
혈액은 전체 혈액의 55%를 차지하는 액체 성분인 혈장과 나머지 45%를 차지하는 세포 성분의 혈구로 이루어지고, 혈구는 액체 상(phase) 내에 분산된 적혈구, 백혈구, 기타 혈구 및 혈소판을 포함한다.
일반적으로, 외과 영역에서 출혈 시에 출혈 부위에 지혈을 실시하고 있으며, 지혈법은 결찰법, 압박법, 전기 응고법, 트롬빈 또는 피브린 아교 등 생리 활성물질 등을 이용하여 지혈하는 방법이 있다. 여기서, 출혈점이 명확한 동맥성 출혈의 경우, 결찰법 또는 전기 응고법을 이용하고 있으며, 정맥성 출혈의 경우, 결찰법 또는 압박 등의 방법이 일반적으로 사용된다.
그러나, 실질 장기로부터 모세 혈관 출혈 또는 혈관 문합부로부터의 출혈이 발생될 경우, 상술한 지혈법이 유효하지 않은 경우가 발생되며, 이로 인해 심장 혈관 외과 영역에서는 항응고제인 헤파린을 사용하여 수술하는 경우나, 간부전으로 출혈 경향이 있는 경우나, 또는 일반적인 수술 시에도 광범위한 박리 조작을 수반하는 수술 등의 경우에는 지혈에 곤란을 초래할 수 있다.
지혈에 곤란을 초래할 경우, 출혈면에 접촉시키는 것만으로도 혈액 응고 반응이 촉진되고, 빠르게 혈전을 형성하여 출혈을 저지하는 국소 흡수성 지혈제가 이용되고 있다. 이는 수술 시간을 단축시킬 뿐만 아니라, 수술 후의 재출혈까지도 방지할 수 있어 외과 수술 시에 자주 사용되고 있다.
일반적인 국소 흡수성 지혈제로는 셀룰로스를 소재로 하는 지혈제, 젤라틴을 소재로 하는 지혈제, 아텔로 콜라겐을 소재로 하는 지혈제 및 미세 섬유성 콜라겐을 소재로 하는 지혈제가 일반적이다.
단백질-기반 지혈 재료는 외과 수술에서 사용하기 위해 고체 스폰지 형태나 분말 형태로 시판되고 있다. 분말을 유체, 예를 들어 식염수 또는 트롬빈 용액과 혼합하면, 혼합 조건 및 재료의 상대 비율에 따라, 특히 요철 표면 또는 도달하기 어려운 영역으로부터 확산 출혈의 경우에 사용하는 지혈 조성물로서 유용한 페이스트(paste) 또는 슬러리(slurry)를 형성할 수 있다.
종래의 지혈 페이스트는 친수성의 혈액 흡수성 매트릭스 원료로서 천연고분자 또는 합성 고분자를 사용하고, 이를 액체(예를 들어, 트롬빈 용액 등)와 혼합하여 사용시에 제조된다. 페이스트를 형성하기 위한 혼합은 통상 광범위한 혼합, 예를 들어 2개 시린지 사이의 혼련(kneading) 또는 이동을 필요로 한다.
친수성의 혈액 흡수성 매트릭스 원료로서 천연 고분자 또는 합성 고분자가 사용될 수 있다. 천연 고분자로는 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin) 등의 생분해성 물질들이 알려져 있다. 그 중 콜라겐은 피부, 뼈, 연골, 힘줄, 인대 등 결합조직의 중요한 구성 성분으로써 지혈제, 조직공학용 지지체 등 의료용 소재로 많이 이용되는데, 기계적 물성이 매우 제한되어 있기 때문에 화학적 가교를 통하여 물리적 성질을 향상시켜야 하며 잠재적인 면역 반응 및 높은 가격이 단점이다. 키토산은 두번째로 풍부하게 자연에 존재하는 천연 고분자로서 의료용으로 자주 사용되며 생체적합성이 뛰어나고 독성이 낮다. 하지만, 일반적으로 유기용매의 용해도가 낮고 생체 분해속도가 상대적으로 느리며 결정화되는 성질이 단점이다. 이에 반하여, 젤라틴은 콜라겐의 삼중나선 구조를 단일 나선형태로 변형시킨 천연 고분자로서 생체적합성 및 흡습력이 뛰어나고 가공의 용이성도 우수하며 원재료 가격도 저렴한 편이어서 조직공학 및 지혈제로 유용하게 활용될 수 있다.
가교 처리하지 않은 젤라틴은 제조 공정 중 멸균 처리에 취약하고 투여 직후 체내에서 바로 분해되어 지혈 기능이 저하되기 때문에 젤라틴의 가교 공정이 필요하고, 지혈 조성물 내 가교 정도(가교도)는 개발된 지혈제의 물성 및 유효성에 큰 영향을 미친다. 기존에 상용화된 젤라틴 또는 콜라겐 기반 흡수성 체내용 지혈제 제품은 많지만 지혈 조성물 내 가교도를 정량화하여 지혈능을 향상시킨 제품은 현재까지 없는 실정이다.
한편, 젤라틴의 가교도를 정량적으로 분석할 수 있는 분석방법은 매우 중요하나 기존 통상적으로 사용되는 NMR(nuclear magnetic resonance)이나 FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy)을 활용한 방법으로는 한계가 있다.
이에, 본 발명자는 젤라틴의 가교도를 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 기기를 활용하여 정량 수치화할 수 있는 방법을 알아내고, 이를 바탕으로 적정 범위의 가교도를 갖는 가교 젤라틴을 포함하는 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물의 지혈능이 현저히 향상하는 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적 1은 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적 2는 가교도 2-15%의 가교 젤라틴의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적 3은 가교 젤라틴의 가교도를 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물
본 발명은 가교도 2-15%의 가교 젤라틴을 포함하는 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물을 제공한다.
상기 가교도는 바람직하게 3-12%, 더욱 바람직하게 4-10%, 특히 바람직하게 8-10%일 수 있다. 만약, 상기 가교도 범위의 하한 미만일 경우 젤라틴이 분해되어 보관 및 유통이 어려운 문제가 있을 수 있고, 상한 초과일 경우 체내에서 수개월 내 분해가 완전히 이루어지지 않고 잔류하여 동물성 단백질의 알레르기 반응 등 부작용이 발생하는 문제가 있을 수 있다.
상기 가교 젤라틴은 조성물 총 중량의 9-20 중량%, 바람직하게 11-17 중량%, 더욱 바람직하게 12-15 중량%일 수 있다. 만약, 상기 함량 범위의 하한 미만일 경우 혼합하였을 때 묽어서 제형이 흐르며 페이스트 형태 제작하는데 어려움의 문제가 있을 수 있고, 상한 초과일 경우 혼합하였을 때 푸석해서 섞이지 않아 제작하는데 어려움의 문제가 있을 수 있다.
상기 가교 젤라틴은 CaCl2 수용액, PBS(phosphate-buffered saline), 생리식염수, 멸균증류수 등의 생체적합성 용매와 혼합하여 페이스트 형태로 제조할 수 있고, 가교 젤라틴을 분산할 수 있는 공지의 생체적합성 용매라면 아무런 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 혈장분획제재를 더 포함할 수 있다.
상기 혈장분획제재의 예로는 트롬빈; 피브리노겐; 프로트롬빈; 조직트롬보플라스틴; Ca2+; Ac글로불린; 프로콘버틴; 항혈우병 인자; 크리스마스 인자; 스튜어트-프라워 인자; 혈장트롬보플라스틴 전구물질; 하게만 인자; 피브린 안정화 인자; 플레처 인자; Fizgerald, Williams, Flaujeac 인자; 단백질 C; 단백질 S; 트롬보모듈린; 혈액응고제 Ⅷ인자; 혈액응고제 Ⅸ인자; 항트롬빈 Ⅲ; 알부민 등을 단독으로 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 젤라틴은 돼지 진피 또는 소 진피 유래 젤라틴을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 가교도는 젤라틴의 구성 아미노산의 전체 라이신 중 가교 결합한 라이신 비율로, 하기 수학식 1로 수치화한 것일 수 있다.
[수학식 1]
가교도 2-15%의 가교 젤라틴의 제조방법
본 발명은 수용성 용매에 젤라틴 입자를 분산하여 젤라틴 분산액을 얻는 단계(단계 1);
상기 젤라틴 분산액에 가교제를 첨가하여, 가교도 2-15%의 가교 젤라틴을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 가교 젤라틴을 세척한 후, 환원제를 첨가하여 환원된 가교 젤라틴을 얻는 단계(단계 3);를 포함하는,
가교도 2-15%의 가교 젤라틴의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1의 수용성 용매는 PBS(phosphate-buffered saline), 생리식염수, 멸균증류수 등을 사용할 수 있고, 젤라틴을 분산할 수 있는 공지의 생체적합성 용매라면 아무런 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 2의 가교제는 글루타르알데하이드(glutaraldehyde, GTA), 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 포름알데하이드(formaldehyde), 부탄디올글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 제니핀(genipin) 등을 단독으로 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있고, 젤라틴 가교를 위한 공지의 가교제 중에서 생체에 유해하지 않은 성분이라면 아무런 제약없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 3의 환원제는 소듐 보로하이드라이드(NaBH4), 소듐 시아노보로하이드라이드(NaBH3CN), 포타슘 보로하이드라이드(KBH4), 리튬 보로하이드라이드(LiBH4), 리튬 트리에틸보로하이드라이드(C6H13BLi), 보란 피리딘 컴플렉스(C5H8BN), 하이드라진(N2H4) 등을 사용할 수 있고, 가교 젤라틴 환원을 위한 공지의 환원제 중에서 생체에 유해하지 않은 성분이라면 아무런 제약없이 사용할 수 있다.
가교 젤라틴의 가교도를 정량 분석하는 방법
본 발명은 가교 젤라틴 입자를 가수분해하여 가수분해물을 얻는 단계(단계 1);
상기 가수분해물을 건조하는 단계(단계 2);
상기 건조 가수분해물을 용해한 후, OPA(o-phthalaldehyde)로 유도체화하여 시료를 준비하는 단계(단계 3); 및
상기 시료를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기기로 가교도를 정량 분석하는 단계(단계 4);를 포함하고,
상기 단계 4에서 가교도는 OPA(o-phthalaldehyde)와 반응한 가교 젤라틴 내의 라이신(Lysine)을 글라이신(Glycine)으로 정규화(normalization)하여, 젤라틴의 구성 아미노산의 전체 라이신 중 가교 결합한 라이신 비율로, 하기 수학식 1로 수치화한 것인, 가교 젤라틴의 가교도를 정량 분석하는 방법을 제공한다.
[수학식 1]
본 발명에 따른 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물은 정량화된 젤라틴 가교도를 기반으로 제조되어, 단독으로 사용하여도 기존 상용화된 지혈 제품 대비 지혈능이 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라, 의료현장에서 필요한 경우 혈장분획제재를 추가로 혼합하여 지혈능을 더욱 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 가교제인 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GTA)를 이용한 젤라틴 가교(crosslinking) 및 환원(reduction) 메카니즘을 설명하는 모식도이다. 젤라틴 분자의 라이신(Lysine)과 글루타르알데히드가 반응하여 인접한 젤라틴 분자간 가교가 이루어진다.
도 2a는 푸리에 변환 적외선 분광(Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR) 기기를 이용하여 가교 전후의 젤라틴 내 파수(wave number)에 따른 흡광도(absorbance)를 측정한 결과이다.
도 2b는 양성자 핵자기 공명(proton nuclear magnetic resonance, 1H-NMR) 기기를 이용하여 가교 전후(가교 전: Gelatin, 가교 후: Crosslinked Gelatin)의 젤라틴 내 공명 진동수에 따른 스펙트럼을 나타낸 결과이다.
도 2c는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기기를 활용하여 글루타르알데히드 가교량(0, 8, 15, 27%)에 따른 가교 젤라틴의 라이신(Lysine)피크의 면적을 정량화하고(위), 이로부터 가교도 측정치(아래)를 나타낸 결과이다.
도 3은 다양한 가교도(0, 1, 2, 5, 7, 8%)에 따른 젤라틴 입자를 50℃ 조건에서 1시간 보관 후 안정성을 확인한 결과이다.
도 4a는 가교도가 8 % 및 15 % 인 젤라틴 입자를 SD rat 동물 모델(n=2)의 등 부분에 주입한 가교된 젤라틴의 in vivo 분해 양상을 주입 1주, 2주, 3주, 그리고 7주 후에 잔존 젤라틴의 크기를 관찰하고 측정하여 비교 확인한 결과이다.
도 4b는 가교도가 8 % 및 15 % 인 젤라틴 입자를 SD rat 동물 모델(n=2)의 등 부분에 주입한 가교된 젤라틴의 in vivo 분해 양상을 주입 2주, 3주, 그리고 7주 후 해당 부위를 sectioning 한 다음 H&E 염색(Hematoxylin and eosin staining)을 통하여 현미경으로 관찰하고 측정하여 비교 확인한 결과이다.
도 5은 SD rat 동물 모델을 통하여 지혈 유효성을 평가하는 과정을 (i)제모, (ii)소독, (iii)절개 및 간조직 노출, (iv)출혈유도, 그리고 (v)시료 물질 적용 순으로 보여주는 이미지이다.
도 6a는 SD rat 동물 모델(n=10)을 이용하여 혈장분획제재(thrombin)를 포함하지 않은 시료들의 지혈시간(hemostasis time, sec)을 측정하고 유효성을 비교한 결과이다.
시료#1: 멸균거즈, sterilized gauze, 음성대조군(negative control)
시료#2: 상용 콜라겐 기반 지혈제(오스젠, 대한민국), 양성대조군(positive control)
시료#3: 가교도 4 % 젤라틴 기반 지혈제
시료#4: 가교도 9 % 젤라틴 기반 지혈제
도 6b는 SD rat 동물 모델(n=10)을 이용하여 혈장분획제재(thrombin)를 포함하지 않은 시료들의 출혈량(total blood loss, mg)을 측정하고 유효성을 비교한 결과이다.
도 6c는 SD rat 동물 모델(n=10)을 이용하여 혈장분획제재(thrombin)를 포함하지 않은 시료들의 3분 지혈 성공률(hemostasis in 3 minutes, %)을 수치화하고 유효성을 비교한 결과이다.
도 6의 데이터 = 평균 ± 표준오차; 및 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.
도 7a는 SD rat 동물 모델(n=10)을 이용하여 시료#1 및 혈장분획제재(thrombin)를 포함한 시료들의 지혈시간(hemostasis time, sec)을 측정하고 유효성을 비교한 결과이다.
시료#1: 멸균거즈, sterilized gauze, 음성대조군(negative control)
시료#5: 상용 젤라틴 기반 지혈제(Baxter, USA) w/트롬빈, 양성대조군(positive control)
시료#6: 가교도 4 % 젤라틴 기반 지혈제 w/트롬빈
시료#7: 가교도 9 % 젤라틴 기반 지혈제 w/트롬빈
도 7b는 SD rat 동물 모델(n=10)을 이용하여 시료#1 및 혈장분획제재(thrombin)를 포함한 시료들의 출혈량(total blood loss, mg)을 측정하고 유효성을 비교한 결과이다.
도 7c는 SD rat 동물 모델(n=10)을 이용하여 시료#1 및 혈장분획제재(thrombin)를 포함한 시료들의 3분 지혈 성공률(hemostasis in 3 minutes, %)을 수치화하고 유효성을 비교한 결과이다.
도 7의 데이터 = 평균 ± 표준오차; 및 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
지혈제는 분말형(powder type), 페이스트 타입(paste type), 시트 타입(sheet type) 등으로 출시되고 있다. 본 발명의 "페이스트 타입(paste type)" 지혈제는 액체를 약제에 부가하고, 용기 내에 있는 함유물을 혼합하기에 적합한 봉쇄 유닛 내의 분말형 제제를 포함하여 적용 범위에 제한 없이 외과 수술시 광범위하게 사용될 수 있다.
천연 지혈제 원료로는 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin) 등의 생분해성 물질들이 알려져 있다. 그 중 콜라겐은 피부, 뼈, 연골, 힘줄, 인대 등 결합조직의 중요한 구성 성분으로써 지혈제, 조직공학용 지지체 등 의료용 소재로 많이 이용되는데, 기계적 물성이 매우 제한되어 있기 때문에 화학적 가교를 통하여 물리적 성질을 향상시켜야 하며 잠재적인 면역 반응 및 높은 가격이 단점이다. 키토산은 두번째로 풍부하게 자연에 존재하는 천연고분자로서 의료용으로 자주 사용되며 생체적합성이 뛰어나고 독성이 낮다. 하지만, 일반적으로 유기용매의 용해도가 낮고 생체 분해속도가 상대적으로 느리며 결정화되는 성질이 단점이다. 이에 반하여, 젤라틴은 콜라겐의 삼중나선 구조를 단일 나선형태로 변형시킨 천연 고분자로서 생체적합성 및 흡습력이 뛰어나고 가공의 용이성으로 조직공학 및 지혈제로 활용될 수 있다.
본 발명의 가교 젤라틴을 포함하는 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물은 지혈제의 매트릭스(matrix)인 젤라틴의 가교 공정을 거쳐서 제조되어야 지혈제로서의 적절한 물성, 흡습성, 그리고 생체 분해도를 가질 수 있다. "가교(crosslinking)"는 고분자 사슬(polymer chains) 사이를 화학적 또는 물리적 방법을 통해 연결시켜 고분자 중합체의 물리화학적 성질을 개량할 목적으로 이용되고 있으며, 일반적으로 가교도(가교의 정도, Degree of crosslinking)가 높을수록 고분자 재료의 열가소성 특성은 감소하는 반면 기계적인 강도와 내열 특성이 증가한다. 젤라틴의 가교를 위한 가교제로서 글루타르알데하이드(glutaraldehyde, GTA), 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 포름알데하이드(formaldehyde), 부탄디올글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 제니핀(genipin) 등이 사용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
가교도는 고분자 중합체 물질의 물리화학적, 생물학적 특성을 결정하는 중요한 요소이므로 제조 공정에서 합성된 젤라틴의 가교도 분석이 필요하다. 현재 진행되고 있는 젤라틴 가교도 분석법에는 양성자 핵자기 공명(proton nuclear magnetic resonance, 1H-NMR) 기기를 이용하는 방법이 있다. 양성자 핵자기 공명 분광 스펙트럼 시그널(signal) 적분 강도는 해당 시그널에 나타나는 핵 종에 비례하기 때문에, 이를 통하여 정량하고자 하는 화합물의 특정 시그널을 기준으로 정량화가 가능하다. 즉, 정확한 정량 분석을 위하여 시료에 분자 구조를 알고 있는 표준 물질(standard material)을 함께 넣으면, 1H-NMR 스펙트럼에서 표준 물질의 시그널 적분 강도와 정량하고자 하는 화합물의 특정 시그널 적분 강도를 얻을 수 있고, 이때 표준 물질의 분자구조 및 사용량을 알고 있기에 시료 내 화합물의 정량 분석이 가능하다. 이와 같이 시료와 함께 넣는 표준 물질을 'internal standard'라고 한다. 그러나, 상기와 같은 정량 분석은 젤라틴과 같은 불용성 시료에는 적용하기 어려운 문제가 있다. 유의미한 1H-NMR 스펙트럼을 얻기 위해서는 시료와 표준 물질이 균일하게 혼합되어야 하는데, 불용성 시료의 경우 용매 내에 균일하게 혼합되기 어렵기 때문이다.
또 다른 분석법으로써 젤라틴과 고분자 사슬간의 결합 형성 여부를 확인하기 위하여 푸리에 변환 적외선 분광(Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR) 기기를 이용하는 방법이 있다. FT-IR 기기를 이용하면 젤라틴의 가교도를 in situ에서 실시간으로 고체와 액체 계면에서 일어나는 진동에너지 변화를 측정하여 정량화할 수 있다. 하지만 진동방식, 시스템의 복잡성, 또는 젤라틴 가교도의 유사성에 따라 흡광이 측정되는 밴드가 쉽게 겹쳐질 수 있다는 한계가 있다.
젤라틴은 돼지 피부, 소 피부 또는 가죽 및 동물 뼈와 같은 물질 내에 포함된 콜라겐의 변성(denaturation)에 의해 제조된다. 또한 젤라틴은 콜라겐과 같이 아미노산의 독특한 조합(blend)에 의해 확인되는데, 천연 콜라겐(native collagen)은 약 1,050개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드(polypeptide) 사슬에 기반한다. 이러한 콜라겐의 3차원 네트워크 구조로 인하여 일반적으로 용매에 불용성이며 혼합물을 형성한다. 이러한 콜라겐이 분해되면 젤라틴이 되고 젤라틴이 가수분해 과정을 거치면 가수분해물로서 가용성 형태가 된다. 가수 분해 후 아미노산은 약 1/3은 글리신, 22%는 프롤린 및 4-히드록시프롤린이며 나머지 45%는 17종의 상이한 아미노산이다. 이와 같이, 젤라틴은 가수분해를 통하여 아미노산으로 분석이 가능하여 가교된 젤라틴은 가교제의 농도 및 종류에 따라 아미노산의 달라진 분포를 측정하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량 분석이 가능할 수 있다.
흡수성 체내용 지혈 조성물은 외과 수술 시 인체 부위에 적용해야 하므로 발열, 염증, 독성 등의 부작용이 없어야 하며 투여 후 뛰어난 생체내 분해능이 요구된다. 젤라틴 기반 지혈 조성물은 생체 내에서 시간이 지남에 따라 수분, 미생물, 온도 등 다양한 환경적 요인에 따라 스스로 분해가 되지만 분해가 잘 안될 시에는 과도한 면역반응을 일으켜 생체내 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서, 흡수성 체내용 지혈 조성물은 일반적으로 투여 후 생체 내에서 수개월내에 완전분해 되어야 하는 것이 권고되고 있다.
혈장분획제재는 혈액 내에 함유되어 있는 특정 단백질로서 혈액응고인자, 면역글로불린(항체를 함유한 단백질), 혈장 단백질 (알부민, 글로불린) 등이 있다. 이와 같은 다양한 혈장분획제제는 천연 또는 재조합 단백질로 제조될 수 있으나 천연 물질은 규제사항이 존재하여 수득하기 어렵고 합성 물질은 제작에 많은 비용이 드는 제한 점이 있다. 본 발명에서 제안하는 가교 젤라틴을 포함하는 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물은 지혈제의 매트릭스로 활용되어 혈소판과 결합하여 혈소판 응괴를 형성하고 혈액응고 제 12인자 활성화를 하는데 이는 곧 2차 지혈과정의 내인성 경로 시작을 유도한다. 이러한 과정은 트롬빈 생성을 촉진할 수 있어 외과 수술 시 뛰어난 지혈능을 보여줄 수 있다. 또한, 본 발명의 젤라틴 기반 지혈 조성물은 기존에 상용화된 혈장분획제재(일반적으로 thrombin 등의 혈액응고인자)를 혼합하여 사용이 가능하다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 가교 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물의 제조
본 발명의 일 제조예에서 흡수성 체내용 지혈 조성물 제조를 위해 먼저, 3차 증류수에 0.05 내지 0.1M PBS, 0.15 내지 0.5M NaCl, 0.5 내지 1.0% triton X-114를 4℃ 내지 상온 조건 하에 용해시켜 젤라틴 입자의 분산 용매를 제조하였다. 용해된 용매에 젤라틴 입자를 투입하고 가교도 농도에 맞게 글루타르알데히드(GTA)를 첨가하고 10 내지 16시간 동안 교반하였다. 젤라틴 가교는 도 1에서 보여주는 바와 같이 젤라틴의 라이신(Lysine)의 아민(Amine)기와 글루타르알데히드(GTA)의 알데하이드(aldehyde)기가 만나 결합을 형성한다(도 1). 가교반응후 진공상태 PP(polypropylene) 필터에 3차 증류수를 이용하여 1차 세척을 수행하였다. 1차 세척 후 소듐 보로하이드라이드(NaBH4) 환원제를 이용하여 가교제 대비 2 내지 4배 비율로 실온에서 1 내지 2시간 반응시켜 젤라틴 입자 내에서 가교 되지 않은 아민기와 글루타르알데히드(GTA)에서 가교 반응을 못한 알데하이드기를 제거하였다. 환원반응 후 진공상태 PP 필터에 3차 증류수를 이용하여 2차 세척을 수행하였으며, 이후 가교된 젤라틴 입자를 16 내지 48시간 동안 동결 건조시켰다. 동결 건조된 젤라틴 입자를 500 내지 750 ㎛ 체(sieve)가 장착된 컷팅 밀로 분쇄하여 지혈제 조성물로 제조하였다. 제조된 가교 젤라틴 분말을 0.1 내지 1%의 CaCl2 용액으로 수화시켜 완제 조성물을 구성하였고, 혈장분획 제제를 포함하는 경우에는 상기 조성물에 thrombin 500IU를 첨가하였다.
<분석예 1> FT-IR을 이용한 가교 젤라틴 조성물의 가교도 분석
푸리에 변환 적외선 분광기(FT-IR) 기기를 이용하여 상기 제조예 1로 제조된 가교 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물의 가교도를 측정하기 위하여 가교 전 젤라틴 및 가교 후 젤라틴 샘플 2개를 각각 1:10 내지 100 중량비의 비율로 KBr(Spectrum pure)와 혼합하고 투명한 시트로 압착하였다. 이후, FT-IR(Perkin Elmer, Inc., USA) 기기를 이용하여 실온에서 400 ~ 4000 cm-1의 파수(wave number) 범위로 투과율(transmittance)를 측정하였다. 측정 결과, 도 2a에서 보여지는 것처럼 가교 전 젤라틴 및 가교 후 젤라틴에서 1620-1690㎝-1의 파수에서 이민결합(imine bonds)이 나타났지만 1630㎝-1 아마이드(amide I) 피크와 겹쳐 정량적인 가교도 분석이 어려운 것을 확인하였다(도 2a).
<분석예 2> 1 H-NMR을 이용한 가교 젤라틴 조성물의 가교도 분석
상기 제조예 1을 통하여 제조된 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물의 양성자 핵자기 공명(1H-NMR) 기기를 이용한 가교도 측정을 위하여 가교 전 젤라틴 및 가교 후 젤라틴 샘플 2개를 NMR 용매인 D2O에 용해시켜 핵 종인 1H로 셋팅하였다. 이후, 400MHz FT-NMR Spectrometer(Avance III HD 400, Bruker, USA) 기기를 이용하여 흡광도(absorbance)를 측정하여 분자 구조를 확인하였다. 그러나, 도 2b의 결과에서 보여주는 바와 같이(회색 음영 부분) 가교 전 및 가교 후 젤라틴의 동일한 피크 중첩(1.2~1.5ppm)으로 인해 신뢰할 수 있는 데이터를 수득하기 어려웠다(도 2b).
<분석예 3> HPLC를 이용한 가교 젤라틴 조성물의 가교도 분석
본 발명에서 제안된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 활용하여 제조된 조성물의 가교도를 측정하기 위하여 먼저 가교된 건조 젤라틴 입자의 가수분해를 진행하였다. 유리관에 가교된 젤라틴을 넣은 후 1 내지 6N HCl과 함께 진공 퍼지(purge)를 10 내지 20분간 실시한 후 히트블록(heat block)을 이용하여 90 내지 110℃에서 10 내지 16시간 동안 가수 분해를 실시하였다. 가수분해가 완료된 샘플은 시린지 필터를 이용하여 필터링하고 진공 건조로 완전히 건조시킨 후에 3차 증류수로 세척을 진행하였고 이후 다시 진공 건조를 진행하였다. 건조가 완료된 샘플을 0.1 내지 1N HCl로 용해하고 0.45 μm PTFE(poly-tetra-fluoro-ethylene) 시린지 필터로 여과하여 준비하였다. 이후, 보레이트 버퍼, 용해된 젤라틴, OPA(o-phthalaldehyde), 인산염 완충액을 혼합하여 유도체화시켜 Agilent 1260 series LC(USA) 기기를 이용하여 유속(flow rate)은 1.3 ml/min, 시료 주입량은 1 μl, 그리고 338, 262 nm 흡광도 조건에서 3회 반복하여 피크 위치 및 크기를 측정하였다.
가교된 젤라틴의 가교도는 OPA(o-phthalaldehyde)와 반응한 라이신(Lysine)을 글라이신(Glycine)으로 정규화(normalization)하여 전체 라이신 중 가교 결합한 라이신 비율로 다음 수학식 1로 수치화하였다(도 1 참조).
[수학식 1]
도 2c는 상기 방법으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기기를 활용하여 글루타르알데히드 첨가양에 따른 라이신의 피크 면적을 정량화하고(위), 이로부터 가교도 측정치(아래, n=3)를 나타낸 결과이다. 이로부터, 본 발명에서 제시한 HPLC 기기를 활용하면 가교된 젤라틴 입자의 가교도를 수치적으로 정량화할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 1> 가교 젤라틴 입자의 in vitro 열적 안정성 확인
도 3은 0, 1, 2, 5, 7 그리고 8 %의 가교도를 가지는 젤라틴 입자 1g을 10 ml 3차 증류수에 희석하고 50 ℃ 조건에서 1 시간 보관 후에 젤라틴 입자 분해 양상을 확인한 이미지이다. 각 시험 샘플의 가교도는 투입한 글루타르알데히드의 양을 달리하여 분석예 3의 방법으로 측정하였다. 도 3의 이미지에서 보여주는 바와 같이 흡수성 체내용 지혈 젤라틴 입자의 가교도가 2 % 미만일 경우, 50 ℃ 조건에서 단기적으로 분해되어 의료기기로 제품화시 보관 및 유통에 제한이 있을 수 있으며 체내 투입 후 지혈제로서의 기능성에 한계가 있을 수 있다. 이로부터, 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물 내 가교 젤라틴 입자의 가교도는 2 % 이상이 되어야 함을 알 수 있었다.
<실시예 2> 가교 젤라틴 입자의 in vivo 분해도 확인
제조된 가교 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물의 in vivo 분해도를 확인하기 위하여, SD rat(n=2)을 3% 이소풀루란(isoflurane)으로 마취하며 등 부위의 털을 클리퍼로 제거하고 등 부위의 척추 라인을 기준으로 좌, 우측의 피하조직내에 아이리스 시저(Iris scissors)를 사용하여 가교 젤라틴 조성물을 이식할 수 있는 포켓을 형성하였다. 이후 도 4a에서 보여주는 바와 같이(도 4a 좌측 열 이미지) 가교도 8, 15 % 젤라틴 조성물을 각각 SD rat의 좌, 우측 등에 주사기로 400 μL씩 주입하고 절개 부위를 봉합하였다.
젤라틴 지혈 조성물 주입 1 주, 2 주, 3 주, 그리고 7 주 후에 SD rat을 희생하여 샘플을 획득하고 육안 관찰을 통하여 잔존 젤라틴 조성물의 크기를 측정하였다. 도 4a의 중간, 우측 열은 각각 가교도가 8, 15 % 일 경우 1 주, 2 주, 3 주, 그리고 7 주 후에 피하 포켓 내 관찰된 주입 조성물을 보여준다. 도4a에서 보여주는 바와 같이 가교도가 8 % 일 경우 주입 1 주 후에 대부분의 주입물이 분해되었고 주입 2 주 이후에는 주입된 가교 젤라틴이 관찰되지 않았다. 반면에, 가교도가 15 %일 경우 주입 7 주 후까지도 잔존 조성물이 관찰되었다. 표 1은 조성물 주입 1 주, 2 주, 3 주, 그리고 7 주 후 잔존하는 가교 젤라틴의 가로 및 세로 크기를 측정하고 수치화한 데이터이다(n=2, 데이터=평균±표준오차).
도 4b는 가교 젤라틴 조성물 주입 2 주, 3 주, 그리고 7 주 후에 샘플을 적출하여 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin staining)을 통하여 잔존하는 젤라틴 입자를 확인한 결과이다. 도 4b의 보라색 염색 결과에서 보여주는 바와 같이 가교도가 8 % 일 경우 주입 2주 후에는 in vivo 남아있는 젤라틴이 관찰되지 않았으며, 가교도가 15 % 일 경우 주입 7 주까지 잔존 젤라틴 입자들이 발견되었다. 이로부터 가교 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물의 젤라틴 가교도는 15 % 미만이어야 함을 알 수 있었다.
실시예 1 및 실시예 2로부터 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물의 가교도는 2 내지 15 %가 되어야 유통 및 보관에 적절하며 또한 수개월 내에 체내 완전 분해가 가능할 것임을 확인하였다.
<실시예 3> in vivo 동물 모델 지혈능 평가(혈장분획 제제 미포함)
in vivo 동물 모델을 이용하여 제조된 가교 젤라틴 기반 지혈 조성물의 지혈능을 평가하기 위하여 SD rat(n=10)을 주사 마취(Zoletil 50(30 mg/kg)/Rompun (10 mg/kg), 복강주사(intraperitoneal injection)) 후 호흡 및 마취 상태를 관찰하며 복부 부위를 제모한 뒤, 알코올과 포비돈으로 3회 반복하여 소독 이후 SD rat의 복부 중앙을 수술용 가위를 이용하여 약 4-5 ㎝ 절개하였다. 절개 부위 내부의 간을 복강 외부로 노출 이후 간 표면에 있는 체액 및 혈액을 멸균거즈를 이용하여 닦은 뒤, 간중엽(median lobe) 하단에 라운드 필터 페이퍼를 배치했다. 이후 간중엽 표면 내 중앙 부분 5.0 mm 생검 펀치(biopsy puncher)를 사용하여 약 4 mm 정도에 위치한 표시선까지 찌른 뒤 간중엽을 빼내어 출혈을 유발 이후 출혈을 확인한 뒤, 즉시 실험물질을 적용하였다. 도 5는 이러한 SD rat 동물 모델 제작의 순차적인 (i)제모, (ii)소독, (iii)절개 및 간조직 노출, (iv)출혈 유도, 그리고 (v)실험물질 적용 과정을 보여준다.
도 6 및 표 2에 혈장분획 제제(Thrombin)를 포함하지 않은 지혈 조성물들을 SD rat 출혈 동물 모델에 적용한 후 지혈능을 평가한 결과를 나타내었다.
시료#1: 멸균거즈, sterilized gauze, 음성대조군(negative control)
시료#2: 상용 콜라겐 기반 지혈제(오스젠, 대한민국), 양성대조군(positive control)
시료#3: 가교도 4 % 젤라틴 기반 지혈제
시료#4: 가교도 9 % 젤라틴 기반 지혈제
도 6a 및 표 2(n=10, 데이터=평균±표준오차)에 각 시료들을 적용한 후 지혈 시간(hemostasis time)을 측정한 결과를 나타내었다. 멸균 거즈(음성대조군)에 대비하여 상용 콜라겐 지혈제(양성대조군), 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 그리고 가교도 9 % 젤라틴 지혈제 모두 통계적으로 유의미하게 지혈 시간이 개선되었으나, 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 가교도 9 % 젤라틴 지혈제의 평균 지혈 시간은 각각 183.0, 161.7 s로서 상용 콜라겐 지혈제의 지혈 시간인 202.9 s와 비교하여 지혈 시간이 각각 9.8, 20.3 % 단축되었음을 확인하였다.
도 6b 및 표 2(n=10, 데이터=평균±표준오차)에 각 시료들을 적용한 후 출혈량(total blood loss)을 측정한 결과를 나타내었다. 멸균 거즈(음성대조군)에 대비하여 상용 콜라겐 지혈제(양성대조군), 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 그리고 가교도 9 % 젤라틴 지혈제 모두 통계적으로 유의미하게 출혈량이 개선되었으나, 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 가교도 9 % 젤라틴 지혈제의 평균 출혈량은 각각 1,467, 1,160 mg로서 상용 콜라겐 지혈제의 출혈량인 1,606 mg 와 비교하여 출혈량이 각각 8.6, 27.7 % 적음을 확인하였다.
도 6c 및 표 2(n=10, 데이터=평균±표준오차)에 각 시료들을 적용한 후 3분 이내 지혈 성공률(hemostasis in 3 min, %)을 측정한 결과를 나타내었다. 멸균 거즈(음성대조군)에 대비하여 상용 콜라겐 지혈제(양성대조군), 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 그리고 가교도 9 % 젤라틴 지혈제 모두 유의미하게 3분 이내 지혈 성공률이 개선되었으나, 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 가교도 9 % 젤라틴 지혈제의 지혈 성공률은 90 %로서 상용 콜라겐 지혈제의 3분 이내 지혈 성공률 70% 와 비교하여 20% 높음을 확인하였다.
<실시예 4> in vivo 동물 모델 지혈능 평가(혈장분획 제제 포함)
본 발명의 가교 젤라틴 기반 페이스트 타입 흡수성 체내용 지혈 조성물은 외과 수술 의료 현장에서 혈장분획 제제와 물리적으로 혼합하여 사용될 수 있다.
도 7 및 표 3에 500 IU의 혈장분획 제제(thrombin)를 물리적으로 혼합한 지혈 조성물들을 SD rat 출혈 동물 모델에 적용한 후 지혈능을 평가한 결과를 나타내었다.
시료#5: 상용 젤라틴 기반 지혈제(Baxter, USA) w/트롬빈, 양성대조군(positive control)
시료#6: 가교도 4 % 젤라틴 기반 지혈제 w/트롬빈
시료#7: 가교도 9 % 젤라틴 기반 지혈제 w/트롬빈
도 7a 및 표 3에 각 시료들을 적용한 후 지혈 시간(hemostasis time)을 측정한 결과(n=10, 데이터=평균±표준오차)를 나타내었다. 멸균 거즈(음성대조군)에 대비하여 상용 젤라틴 지혈제(양성대조군), 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 그리고 가교도 9 % 젤라틴 지혈제 모두 통계적으로 유의미하게 지혈 시간이 개선되었으나, 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 가교도 9 % 젤라틴 지혈제의 평균 지혈 시간은 각각 178.8, 162.3 s로서 상용 젤라틴 기반 지혈제의 지혈 시간인 190.7 s와 비교하여 지혈 시간이 각각 6.24, 14.89 % 단축되어 본 발명의 지혈 조성물이 기존 상용 젤라틴 지혈제보다 빠른 지혈 시간을 보임을 알 수 있었다.
도 7b 및 표 3에 각 시료들을 적용한 후 출혈량(total blood loss)을 측정한 결과(n=10, 데이터=평균±표준오차)를 나타내었다. 멸균 거즈(음성대조군)에 대비하여 상용 젤라틴 지혈제(양성대조군), 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 그리고 가교도 9 % 젤라틴 지혈제는 통계적으로 유의미하게 출혈량이 개선되었다. 상용 젤라틴 지혈제의 출혈량과 비교할 때 가교도 4 % 젤라틴 지혈제는 상용 젤라틴 지혈제 대비 하에 출혈량이 다소 증가했으나, 가교도 9 % 젤라틴 지혈제의 평균 출혈량은 785 g로서 상용 젤라틴 지혈제의 평균 출혈량인 1,187g와 비교하여 평균 출혈량이 33.86 % 적음을 확인하였다.
도 7c 및 표 3에 각 시료들을 적용한 후 3분 이내 지혈 성공률(hemostasis in 3 min)을 측정한 결과(n=10, 데이터=평균±표준오차)를 나타내었다. 멸균 거즈(음성대조군)에 대비하여 상용 젤라틴 지혈제(양성대조군), 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 그리고 가교도 9 % 젤라틴 지혈제 모두 유의미하게 3분 이내 지혈 성공률이 개선되었다. 가교도 4 % 젤라틴 지혈제, 가교도 9 % 젤라틴 지혈제의 지혈 성공률은 90, 100 %로서 상용 젤라틴 지혈제의 3분 이내 지혈 성공률 80% 보다 우수함을 확인하였다.
실시예 3 및 실시예 4의 결과로부터 본 발명에 의하여 제조된 가교도 4 내지 9 %의 젤라틴 기반 흡수성 체내용 지혈 조성물은 혈장분획제재를 혼합하여 사용하지 않는 경우와 혼합하여 사용하는 경우 모두 전반적으로 기존 상용화 제품보다 뛰어난 지혈 효능을 보일 수 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (14)

  1. 가교도 2-15%의 가교 젤라틴을 포함하는 페이스트 타입의 흡수성 체내용 지혈 조성물로써,
    상기 가교도는 젤라틴의 구성 아미노산의 전체 라이신 중 가교 결합한 라이신 비율로, 하기 수학식 1로 수치화한 것인, 조성물:
    [수학식 1]
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가교도는 3-12%인 것인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 가교도는 4-10%인 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 가교도는 8-10%인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 가교 젤라틴은 조성물 총 중량의 9-20 중량%인 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    혈장분획제재를 더 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 혈장분획제재는 트롬빈; 피브리노겐; 프로트롬빈; 조직트롬보플라스틴; Ca2+; Ac글로불린; 프로콘버틴; 항혈우병 인자; 크리스마스 인자; 스튜어트-프라워 인자; 혈장트롬보플라스틴 전구물질; 하게만 인자; 피브린 안정화 인자; 플레처 인자; Fizgerald, Williams, Flaujeac 인자; 단백질 C; 단백질 S; 트롬보모듈린; 혈액응고제 Ⅷ인자; 혈액응고제 Ⅸ인자; 항트롬빈 Ⅲ; 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 젤라틴은 돼지 진피 또는 소 진피 유래 젤라틴인 것인, 조성물
  9. 삭제
  10. 수용성 용매에 젤라틴 입자를 분산하여 젤라틴 분산액을 얻는 단계(단계 1);
    상기 젤라틴 분산액에 가교제를 첨가하여, 가교도 2-15%의 가교 젤라틴을 얻는 단계(단계 2); 및
    상기 가교 젤라틴을 세척한 후, 환원제를 첨가하여 환원된 가교 젤라틴을 얻는 단계(단계 3);를 포함하고,
    상기 단계 2의 가교도는 젤라틴의 구성 아미노산의 전체 라이신 중 가교 결합한 라이신 비율로, 하기 수학식 1로 수치화한 것인, 가교도 2-15%의 가교 젤라틴의 제조방법:
    [수학식 1]
    .
  11. 제10항에 있어서,
    상기 단계 1의 수용성 용매는 PBS, 생리식염수 및 멸균증류수로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 단계 2의 가교제는 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 포름알데하이드(formaldehyde), 부탄디올글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE) 및 제니핀(genipin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 단계 3의 환원제는 소듐 보로하이드라이드(NaBH4), 소듐 시아노보로하이드라이드(NaBH3CN), 포타슘 보로하이드라이드(KBH4), 리튬 보로하이드라이드(LiBH4), 리튬 트리에틸보로하이드라이드(C6H13BLi), 보란 피리딘 컴플렉스(C5H8BN) 및 하이드라진(N2H4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 제조방법.
  14. 가교 젤라틴 입자를 가수분해하여 가수분해물을 얻는 단계(단계 1);
    상기 가수분해물을 건조하는 단계(단계 2);
    상기 건조 가수분해물을 용해한 후, OPA(o-phthalaldehyde)로 유도체화하여 시료를 준비하는 단계(단계 3); 및
    상기 시료를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기기로 가교도를 정량 분석하는 단계(단계 4);를 포함하고,
    상기 단계 4에서 가교도는 OPA(o-phthalaldehyde)와 반응한 가교 젤라틴 내의 라이신(Lysine)을 글라이신(Glycine)으로 정규화(normalization)하여, 젤라틴의 구성 아미노산의 전체 라이신 중 가교 결합한 라이신 비율로, 하기 수학식 1로 수치화한 것인, 가교 젤라틴의 가교도를 정량 분석하는 방법.
    [수학식 1]
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