KR102710207B1 - Device for electroporation - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 전기천공법에 의해 세포 내 도입대상물질을 도입하는 전기천공장치에 관한 것이다.The present specification relates to an electroporation device for introducing a target substance into a cell by electroporation.
Description
본 명세서는 전기천공법에 의해 세포 내 도입대상물질을 도입하는 전기천공장치에 관한 것이다. The present specification relates to an electroporation device for introducing a target substance into a cell by electroporation.
전기천공법(electroporation)은 세포에 전기장을 가해 세포막의 투과율을 높여 약, 화학물질, DNA 등을 세포 내로 도입하는 방법이다. 동물, 식물, 미생물을 막론하고 여러 세포 종에 적용이 가능하여 널리 사용되고 있다.Electroporation is a method of introducing drugs, chemicals, DNA, etc. into cells by increasing the permeability of the cell membrane by applying an electric field to the cell. It is widely used because it can be applied to various cell types regardless of whether they are animals, plants, or microorganisms.
세포에 전기장이 가해지면 세포막의 지질(lipid) 일부 분자들이 이동해 위치가 달라지게 되면서 친수성 구멍으로 이루어진 나노 미터 크기의 전도성 길이 생긴다. DNA의 경우 세포를 DNA 용액에 현탁하여 직류고전압의 펄스를 가하면 세포막에 구멍이 뚫림과 동시에 DNA 분자가 전기영동(electrophoresis)의 작용으로 세포 내에 DNA가 도입된다. When an electric field is applied to a cell, some lipid molecules in the cell membrane move and change position, creating a nanometer-sized conductive path made of hydrophilic pores. In the case of DNA, when cells are suspended in a DNA solution and a high direct current voltage pulse is applied, pores are created in the cell membrane and DNA molecules are introduced into the cell through electrophoresis.
화학적 성질이 달라지지 않는다는 장점이 있지만, 일정 역치 이상의 전기장을 가해야 하므로 세포의 생존성을 확보해야 하는 문제가 수반된다. Although it has the advantage of not changing chemical properties, it entails the problem of ensuring cell viability because an electric field exceeding a certain threshold must be applied.
또한, 온도, 펄스의 반복횟수, 지속시간, 전압, DNA 농도, 버퍼 용액의 종류 등 매우 다양한 변수에 영향을 받으므로 높은 효율을 얻을 수 있는 조건을 찾기 어렵다는 단점이 있다. In addition, it has the disadvantage of being difficult to find conditions that can obtain high efficiency because it is affected by a wide variety of variables such as temperature, number of pulse repetitions, duration, voltage, DNA concentration, and type of buffer solution.
특히, 기존 전기천공법에서는 세포가 전기장에 노출되는 면적이 적어 효율을 높이기 어렵다.In particular, it is difficult to increase efficiency in the existing electroporation method because the area of cells exposed to the electric field is small.
세포의 생존성도 확보하면서, 도입물질이 세포에 도입되는 효율을 높일 수 있는 방법 및 장치에 대한 연구가 필요하다.Research is needed on methods and devices that can increase the efficiency of introducing substances into cells while ensuring cell viability.
본 명세서는 전기천공법에 의해 세포 내 도입대상물질을 도입하는 전기천공장치를 제공하고자 한다. The present specification provides an electroporation device for introducing a target substance into a cell by electroporation.
본 명세서는 세포 및 도입대상물질을 포함하는 시료가 유입되는 유입구; 상기 세포 내에 상기 도입대상물질이 도입된 최종물이 배출되는 배출구; 내부가 비어있는 몸체; 상기 몸체 내부에 삽입되며, 상기 유입구와 일측 단부가 연결되고 상기 배출구에 타측 단부가 연결되며, 내부가 비어있고 스프링구조를 갖는 유로관; 상기 몸체의 축방향을 따라 상기 몸체의 표면에 구비된 양극과 음극; 및 상기 양극과 상기 음극에 각각 연결된 전원을 포함하는 전기천공장치를 제공한다. The present specification provides an electric perforation device including an inlet through which a sample including cells and a target substance is introduced; an outlet through which a final product in which the target substance is introduced into the cells is discharged; a body having an empty interior; a conduit inserted into the body, one end of which is connected to the inlet and the other end of which is connected to the outlet, the conduit having an empty interior and a spring structure; an anode and a cathode provided on a surface of the body along an axial direction of the body; and a power source respectively connected to the anode and the cathode.
본 명세서의 전기천공장치를 이용하는 경우, 세포의 생존율이 높아지는 장점이 있다. When using the electroporation device of this specification, there is an advantage of increasing cell survival rate.
도 1은 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조이다.
도 2는 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에 구비된 전극구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에서, 전위분포를 나타낸 것이다.
도 4는 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에서, 유로관의 진행방향에 수직인 단면의 전기장분포를 나타낸 것이다.
도 5는 도 2의 표시된 방향에서 바라본 측면도이다.Figure 1 is a first structure of a euro pipe according to one embodiment of the present specification.
Figure 2 illustrates an electrode structure provided in the first structure of a euro pipe according to one embodiment of the present specification.
Figure 3 shows the potential distribution in the first structure of the euro pipe according to one embodiment of the present specification.
FIG. 4 shows the electric field distribution in a cross-section perpendicular to the direction of travel of the pipe in the first structure of the pipe according to one embodiment of the present specification.
Figure 5 is a side view viewed from the direction indicated in Figure 2.
이하에서 본 명세서에 대하여 상세히 설명한다.The specification is described in detail below.
본 명세서는 전기천공법에 의해 세포 내 도입대상물질을 도입하는 전기천공장치를 제공한다. The present specification provides an electroporation device for introducing a target substance into a cell by electroporation.
본 명세서는 세포 및 도입대상물질을 포함하는 시료가 유입되는 유입구; 상기 세포 내에 상기 도입대상물질이 도입된 최종물이 배출되는 배출구; 내부가 비어있는 몸체; 상기 몸체 내부에 삽입되며, 상기 유입구와 일측 단부가 연결되고 상기 배출구에 타측 단부가 연결되며, 내부가 비어있고 스프링구조를 갖는 유로관; 상기 몸체의 축방향을 따라 상기 몸체의 표면에 구비된 양극과 음극; 및 상기 양극과 상기 음극에 각각 연결된 전원을 포함하는 전기천공장치를 제공한다.The present specification provides an electric perforation device including an inlet through which a sample including cells and a target substance is introduced; an outlet through which a final product in which the target substance is introduced into the cells is discharged; a body having an empty interior; a conduit inserted into the body, one end of which is connected to the inlet and the other end of which is connected to the outlet, the conduit having an empty interior and a spring structure; an anode and a cathode provided on a surface of the body along an axial direction of the body; and a power source respectively connected to the anode and the cathode.
본 명세서에 있어서, 상기 유입구는 세포 및 도입대상물질을 포함하는 시료가 유로관으로 유입되는 통로 또는 구멍을 의미한다. 상기 시료가 유로관으로 유입되는 것에 문제가 없다면, 상기 유입구의 형태 및 재질은 특별히 한정하지 않는다. 상기 유입구의 형태 및 재질은 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것을 채용할 수 있다. In this specification, the inlet port means a passage or hole through which a sample containing cells and a target substance is introduced into the tube. If there is no problem with the sample being introduced into the tube, the shape and material of the inlet port are not particularly limited. The shape and material of the inlet port may be those generally used in the relevant technical field.
본 명세서에 있어서, 상기 유입구는 1 이상일 수 있다. In the present specification, the number of inlets may be one or more.
상기 시료가 세포 및 도입대상물을 포함하는 혼합물인 경우, 상기 유입구는 하나일 수 있다. If the above sample is a mixture containing cells and an introduction target, the inlet may be one.
상기 시료가 세포를 포함하는 제1 시료와, 도입대상물을 포함하는 제2 시료를 따로 준비하여, 상기 유입구는 상기 제1 시료가 유입되는 제1 유입구와 상기 제2 시료가 유입되는 제2 유입구를 포함하고, 상기 유입구에서 상기 제1 및 제2 시료가 섞여 혼합 시료를 이루고, 세포 및 도입대상물질을 포함하는 혼합 시료가 유로관으로 유입될 수 있다. The above sample is prepared separately as a first sample including cells and a second sample including a target substance, and the inlet includes a first inlet through which the first sample is introduced and a second inlet through which the second sample is introduced, and the first and second samples are mixed at the inlet to form a mixed sample, and the mixed sample including cells and a target substance can be introduced into the flow tube.
본 명세서에 있어서, 상기 배출구는 상기 세포 내에 상기 도입대상물질이 도입된 최종물이 배출되는 통로 또는 구멍을 의미한다. In this specification, the outlet means a passage or hole through which the final product into which the target substance has been introduced into the cell is discharged.
트랜스펙션 효율을 높이기 위해서는 전기장이 강해져야 하지만, 전기장이 강해질수록 전기장으로 인해 발생하는 줄열(Joule heating)이 높아져 세포의 생존률이 낮아진다. 세포의 생존률을 확보하기 위해, 일정수준의 전기장을 사용하게 되며, 세포가 전기장에 노출되는 면적이 적어 트랜스펙션 효율을 높이기 어렵다. In order to increase transfection efficiency, the electric field must be strengthened, but the stronger the electric field, the higher the Joule heating generated by the electric field, which lowers the cell survival rate. In order to secure the cell survival rate, a certain level of electric field is used, and it is difficult to increase the transfection efficiency because the area exposed to the cell to the electric field is small.
그러나, 본 명세서의 전기천공장치를 사용하는 경우, 스프링구조에서 발생된 딘흐름(dean flow)을 통해 세포가 회전하여 보다 넓은 면적이 전기장에 노출되어 더 많은 구멍이 발생하므로 도입물질이 세포에 도입되는 효율을 높일 수 있다.However, when using the electroporation device of the present specification, the Dean flow generated in the spring structure causes the cells to rotate, exposing a wider area to the electric field and generating more holes, thereby increasing the efficiency of introducing the introduced substance into the cells.
상기 시료는 세포 및 도입대상물을 포함하는 혼합시료이거나, 세포를 포함하는 제1 시료와 도입대상물을 포함하는 제2 시료를 포함하는 개별시료일 수 있다. The above sample may be a mixed sample including cells and a target substance, or an individual sample including a first sample including cells and a second sample including a target substance.
상기 시료의 온도는 대체로 상온(20℃ 이상 25℃ 이하)으로 유지되어 유로관 내로 유입시킬 수 있다. 그러나, 전기장을 여러 번 가해야 하는 등 생존성에 문제가 발생할 수 있는 경우 온도를 4℃ 내외로 낮추어 진행할 수 있다.The temperature of the above sample can be generally maintained at room temperature (20℃ or higher and 25℃ or lower) so that it can be introduced into the tube. However, in cases where there is a possibility of problems with viability, such as when an electric field must be applied multiple times, the temperature can be lowered to around 4℃.
상기 세포는 전기천공법으로 트랜스펙션될 수 있는 세포라면 특별히 한정하지 않으며, 동물세포, 식물세포, 미생물 등 제약없이 선택될 수 있다.The above cells are not particularly limited as long as they can be transfected by electroporation, and can be selected without restriction, including animal cells, plant cells, and microorganisms.
상기 도입대상물은 목적에 따라 대상 세포에 도입되어야 할 물질이라면 특별히 한정하지 않으며, 약, 화학물질, DNA 등일 수 있다. The above-mentioned target substance is not particularly limited as long as it is a substance that must be introduced into the target cell according to the purpose, and may be a drug, chemical substance, DNA, etc.
상기 시료에 유동성을 부여하기 위해, 상기 시료는 완충용액(buffer solution)을 더 포함한다. 이때, 완충 용액이란 일반적으로 산이나 염기를 가해도 공통 이온 효과에 의해 그 용액의 수소 이온 농도(pH)가 크게 변하지 않는 용액을 말한다.In order to provide fluidity to the above sample, the sample further contains a buffer solution. Here, a buffer solution generally refers to a solution whose hydrogen ion concentration (pH) does not change significantly due to the common ion effect even when an acid or base is added.
상기 완충용액(buffer solution)의 종류는 특별히 한정하지 않으며, 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것을 채용할 수 있다. 구체적으로, 상기 완충용액(buffer solution)은 인산완충생리식염수(Phosphate Buffered saline), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄 술폰산 완충액(HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer) 및 hypoosmolar buffer로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특별히 세포가 환경에 민감한 경우, 상기 완충용액으로 hypoosmolar buffer를 사용하는 것이 좋다.The type of the above buffer solution is not particularly limited, and a buffer solution generally used in the art can be adopted. Specifically, the buffer solution can be selected from the group consisting of phosphate buffered saline, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid buffer (HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer), and hypoosmolar buffer. In particular, when the cell is sensitive to the environment, it is preferable to use a hypoosmolar buffer as the buffer solution.
본 명세서에 있어서, 상기 유로관은 유입구와 일측 단부가 연결되고 상기 배출구에 타측 단부가 연결된다. 또한, 상기 유로관은 내부가 비어있어, 내부에 유입구로부터 유입된 시료가 흐를 수 있다.In this specification, the flow pipe has one end connected to the inlet and the other end connected to the outlet. In addition, the flow pipe is hollow inside, so that a sample introduced from the inlet can flow inside.
상기 유로관의 재질은 특별히 한정하지 않는다. 상기 유로관의 재질은 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것을 채용할 수 있다. 예를 들면, 상기 유로관의 재질은 유리, 폴리메틸 메타크릴레이트 등과 같은 아크릴 수지 또는 폴리에틸렌 등과 같은 폴리올레핀 수지일 수 있다. The material of the above-mentioned pipe is not particularly limited. The material of the above-mentioned pipe may be one generally used in the relevant technical field. For example, the material of the above-mentioned pipe may be glass, an acrylic resin such as polymethyl methacrylate, or a polyolefin resin such as polyethylene.
상기 유로관 내, 시료의 평균 유속은 유동의 쏠림이 일어나지 않는다면, 크게 한정하지 않는다. 상기 유로관 내, 시료의 평균 유속은 0.3 m/s 이하일 수 있으며, 이에 한정되지 않고 시료, 다른 공정조건 등에 따라 조절될 수 있다. The average flow velocity of the sample within the above-mentioned flow conduit is not significantly limited as long as no flow concentration occurs. The average flow velocity of the sample within the above-mentioned flow conduit may be 0.3 m/s or less, but is not limited thereto and may be adjusted depending on the sample, other process conditions, etc.
상기 유로관 내, 평균온도는 세포 및 조건에 따라 조절될 수 있다. 동물세포를 사용하는 경우, 상기 유로관 내, 평균온도는 대부분 상온으로 유지된다. 그러나, 펄스를 여러 번 가해야 하는 등 세포의 생존에 위험도가 높다고 판단되면 약 4℃까지 온도를 낮추어 진행할 수 있으며, 이때의 전압은 상온에 비해 약 2배 정도 높여서 진행한다.The average temperature within the above-mentioned tube can be controlled according to the cell and conditions. When animal cells are used, the average temperature within the above-mentioned tube is mostly maintained at room temperature. However, if it is judged that there is a high risk to the survival of the cell, such as when multiple pulses must be applied, the temperature can be lowered to about 4℃ and the voltage at this time is increased by about twice compared to room temperature.
상기 유로관의 단면은 원 또는 다각형일 수 있으며, 구체적으로, 상기 유로관의 단면은 원이다. 유로관의 단면이 원인 경우, 딘흐름을 활용하기 좋은 장점이 있는데, 구체적으로 다각형에서는 모서리 즉, 단면에서의 꼭짓점 부근에서 딘흐름의 일부 효과가 떨어질 수 있으나 원은 그렇지 않기 때문이다.The cross section of the above-mentioned pipe may be a circle or a polygon, and specifically, the cross section of the above-mentioned pipe is a circle. If the cross section of the pipe is a circle, there is an advantage in utilizing Dean flow, specifically, in the case of a polygon, some of the effect of Dean flow may be reduced near the corners, that is, the vertices of the cross section, but this is not the case in the case of a circle.
상기 유로관의 단면적은 0.5 mm2 이상 50 mm2 이하일 수 있으며, 구체적으로 1 mm2 이상 10 mm2 이하일 수 있고, 더 구체적으로 2 mm2 이상 4 mm2 이하일 수 있다.The cross-sectional area of the above-mentioned conduit may be 0.5 mm 2 or more and 50 mm 2 or less, specifically 1 mm 2 or more and 10 mm 2 or less, and more specifically 2 mm 2 or more and 4 mm 2 or less.
상기 스프링 구조가 회전하며 이루는 원의 지름은 클수록 딘흐름이 약해지고, 작을수록 딘흐름이 강해지므로, 적정 딘흐름을 발생시키기 위해 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 스프링 구조가 회전하며 이루는 원의 지름은 3 mm 이상 50 mm 이하일 수 있고, 더 구체적으로 5 mm 이상 30 mm 이하일 수 있다. The diameter of the circle formed by the above spring structure rotating can be selected to generate an appropriate Dean flow, as the larger the diameter, the weaker the Dean flow becomes, and the smaller the diameter, the stronger the Dean flow becomes. Specifically, the diameter of the circle formed by the above spring structure rotating can be 3 mm or more and 50 mm or less, and more specifically, can be 5 mm or more and 30 mm or less.
본 명세서에서, 도 2에서 표시된 방향에서 바라보면 도 5와 같은 측면도가 나타나며, 상기 스프링 구조가 회전하며 이루는 원의 지름(600)은 상기 스프링 구조가 회전하며 이루는 원 중 외측에 형성된 원의 지름을 의미한다. In this specification, a side view like FIG. 5 is shown when viewed from the direction indicated in FIG. 2, and the diameter (600) of the circle formed by the rotation of the spring structure means the diameter of the circle formed on the outer side of the circle formed by the rotation of the spring structure.
상기 양극과 음극의 거리는 3 mm 이상 40 mm 이하일 수 있으며, 구체적으로 5 mm 이상 20 mm 이하일 수 있고, 더 구체적으로 8 mm 이상 12 mm 이하일 수 있다. 이 경우 동물세포에 전기천공 시 적절한 세기의 전기장을 형성할 수 있다.The distance between the anode and cathode may be 3 mm or more and 40 mm or less, specifically 5 mm or more and 20 mm or less, and more specifically 8 mm or more and 12 mm or less. In this case, an electric field of appropriate strength can be formed when electroporating an animal cell.
도 1은 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조로 도 1과 같이 몸체의 축방향을 따라 도 2와 같이 몸체의 표면에 양극(500)과 음극(550)을 구비하여 각각 4000V와 0V의 전압을 인가하는 경우, 도 3과 같은 전위분포, 및 도 4와 같은 수직단면의 전기장분포를 나타낸다. 이때, 도 1 및 도 2를 기준으로, 유로관의 진행방향에 대한 수직단면에서 반지름은 1 mm이고, 양극과 음극의 거리는 10 mm이고, 도 5를 기준으로, 스프링 구조가 회전하며 이루는 원의 지름은 6 mm이이며, 평균 전기장은 103 KV/m이다.FIG. 1 is a diagram showing a first structure of a pipe according to an embodiment of the present specification, in which an anode (500) and a cathode (550) are provided on the surface of the body along the axial direction of the body as in FIG. 1 and voltages of 4000 V and 0 V are applied, respectively, and a potential distribution as in FIG. 3 and an electric field distribution in a vertical cross-section as in FIG. 4 are shown. At this time, with reference to FIGS. 1 and 2, the radius in the vertical cross-section with respect to the direction of travel of the pipe is 1 mm, the distance between the anode and the cathode is 10 mm, and with reference to FIG. 5, the diameter of the circle formed by the spring structure rotating is 6 mm, and the average electric field is 103 KV/m.
본 명세서에 있어서, 상기 양극과 음극은 각각 이격되어 상기 몸체의 축방향을 따라, 상기 몸체의 표면에 구비되며, 구체적으로 상기 몸체의 외주면 또는 내부면에 구비될 수 있다. 구체적으로, 도 2 및 도 5와 같이 상기 양극(500)과 음극(550)은 몸체의 축방향(450)을 따라, 몸체의 외주면에 구비될 수 있다. In the present specification, the positive electrode and the negative electrode are respectively spaced apart and provided on the surface of the body along the axial direction of the body, and specifically, may be provided on the outer peripheral surface or the inner surface of the body. Specifically, as shown in FIG. 2 and FIG. 5, the positive electrode (500) and the negative electrode (550) may be provided on the outer peripheral surface of the body along the axial direction (450) of the body.
본 명세서에서, 몸체의 축방향은 몸체의 길이방향의 중심축을 의미하며, 구체적으로 도 2에 도면부호 450으로 표시한 것을 의미한다.In this specification, the axial direction of the body means the central axis in the longitudinal direction of the body, and specifically means the axis indicated by drawing symbol 450 in FIG. 2.
본 명세서에 있어서, 상기 유로관의 진행방향에 수직인 단면은 다각형일 수 있으며, 구체적으로 원일 수 있다. In this specification, the cross-section perpendicular to the direction of travel of the above-mentioned pipe may be a polygon, and specifically, may be a circle.
상기 유로관의 진행방향(330)은 도 1에 도시된 바와 같이, 전체 유로관이 유입구로부터 배출구까지 이어진 방향을 의미하고, 상기 유로관의 진행방향의 수직인 단면, 수직단면(350)은 원일 수 있다. 이때, 상기 수직단면은 유입구로부터 배출구까지 일정할 수 있다. The direction of movement (330) of the above-mentioned pipe means the direction in which the entire pipe extends from the inlet to the outlet, as shown in Fig. 1, and the vertical cross-section (350) of the direction of movement of the pipe may be a circle. In this case, the vertical cross-section may be constant from the inlet to the outlet.
상기 몸체의 단면이 다각형인 경우, 상기 다각형의 마주보는 두 쌍 이상의 변 중 어느 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비된다. 구체적으로, 상기 몸체의 단면이 사각형인 경우, 상기 사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 어느 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비된다. 상기 몸체의 단면이 직사각형인 경우, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 긴 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비되거나, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 짧은 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비될 수 있다. When the cross-section of the above body is a polygon, the anode and the cathode are respectively provided on one pair of sides among two or more pairs of opposite sides of the polygon. Specifically, when the cross-section of the above body is a square, the anode and the cathode are respectively provided on one pair of sides among two pairs of opposite sides of the square. When the cross-section of the above body is a rectangle, the anode and the cathode may be respectively provided on one pair of sides having a longer length among two pairs of opposite sides of the rectangle, or the anode and the cathode may be respectively provided on one pair of sides having a shorter length among two pairs of opposite sides of the rectangle.
상기 유로관의 단면이 직사각형인 경우, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 긴 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비되는 경우, 양측 전극의 거리가 짧아 보다 낮은 전위차를 전극에 인가해도 의도한 전기장을 생성할 수 있다.If the cross section of the above-mentioned pipe is rectangular, and the anode and cathode are respectively provided on one pair of sides having a longer length among the two pairs of opposing sides of the rectangle, the distance between the electrodes on both sides is short, so even if a lower potential difference is applied to the electrodes, the intended electric field can be generated.
상기 양극 및 음극 각각의 재질은 특별히 한정하지 않는다. 상기 양극 및 음극 각각의 재질은 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것을 채용할 수 있다. 예를 들면, 상기 양극의 재질은 백금, 금, 은, 구리 또는 알루미늄일 수 있고, 상기 음극의 재질은 백금, 금, 은, 구리 또는 알루미늄일 수 있다. 바람직하게는, 상기 양극의 재질이 백금이고, 상기 음극의 재질이 백금일 수 있다. 이 경우, 쉽게 산화되지 않는 장점이 있다.The material of each of the anode and cathode is not particularly limited. The material of each of the anode and cathode may be one commonly used in the relevant technical field. For example, the material of the anode may be platinum, gold, silver, copper or aluminum, and the material of the cathode may be platinum, gold, silver, copper or aluminum. Preferably, the material of the anode may be platinum, and the material of the cathode may be platinum. In this case, there is an advantage of not being easily oxidized.
본 명세서에 있어서, 상기 전원은 양극과 음극에 각각 연결된다. 상기 전원은 양극과 음극으로 각각 직류고전압의 펄스를 공급하는 것이다. In this specification, the power source is connected to the positive and negative poles, respectively. The power source supplies a pulse of high direct current voltage to the positive and negative poles, respectively.
상기 양극과 음극의 전위차는 1000V 이상 12000V 이하일 수 있으며, 구체적으로, 2000V 이상 6000V 이하, 더 구체적으로 3200V 이상 4600V 이하일 수 있다. 전원에 의해서 양극과 음극에 인가되는 전위차를 조절하여 전기장의 세기를 조절할 수 있다. The potential difference between the anode and cathode may be 1000 V or more and 12000 V or less, specifically, 2000 V or more and 6000 V or less, and more specifically, 3200 V or more and 4600 V or less. The strength of the electric field can be controlled by controlling the potential difference applied to the anode and cathode by the power source.
상기 양극과 음극에 의해서, 유로관 내 가해지는 펄스의 반복횟수는 세포에 따라 선택될 수 있으며, 1회 이상 6회 이하일 수 있고, 구체적으로 2회 이상 6회 이하일 수 있으며, 바람직하게는 4회일 수 있다. The number of repetitions of pulses applied to the tube by the above positive and negative electrodes can be selected depending on the cell, and can be 1 to 6 times, specifically 2 to 6 times, and preferably 4 times.
세포에 가해지는 펄스의 종류는 세포에 따라 선택될 수 있으며, 동물세포에는 사각파(square wave pulse)를, 박테리아나 효모 등에는 Exponential decay wave pulse를 사용할 수 있다. The type of pulse applied to the cell can be selected depending on the cell. A square wave pulse can be used for animal cells, and an exponential decay wave pulse can be used for bacteria or yeast.
전체 유로관에서, 세포가 유입되어 배출되기까지의 총 공정시간은 1 초 이상 10 초 이하일 수 있고, 구체적으로 2 초 이상 8 초 이하, 더 구체적으로 2 초 이상 5 초 이하일 수 있다. In the entire euro pipe, the total process time from the inflow to the discharge of cells may be 1 second or more and 10 seconds or less, specifically 2 seconds or more and 8 seconds or less, and more specifically 2 seconds or more and 5 seconds or less.
본 명세서에 있어서, 하나의 펄스의 지속시간은 수백 마이크로초 이상 수 밀리초 이하일 수 있고, 구체적으로 100 마이크로초 이상 1 밀리초 이하일 수 있다. 이때, 펄스를 4회 반복하는 경우, 펄스의 길이는 400 마이크로초 이상 4 밀리초 이하일 수 있다.In the present specification, the duration of one pulse may be from several hundred microseconds to several milliseconds, and specifically from 100 microseconds to 1 millisecond. In this case, when the pulse is repeated four times, the length of the pulse may be from 400 microseconds to 4 milliseconds.
본 명세서의 전기천공장치는 스프링구조에서 발생된 딘흐름(dean flow)을 통해 세포가 회전하여 보다 넓은 면적이 전기장에 노출되어 더 많은 구멍이 발생하므로 도입물질이 세포에 도입되는 효율을 높일 수 있기 때문에, 종래 대비 상대적으로 약한 전기장으로도 동일한 효율을 낼 수 있다. 구체적으로, 상기 유로관 내 평균 전기장은 80 KV/m 이상, 85 KV/m 이상, 90 KV/m 이상, 95 KV/m 이상, 또는 100 KV/m 이상 일 수 있으며, 200 KV/m 이하, 180 KV/m 이하, 150 KV/m 이하, 또는 120 KV/m 이하일 수 있다. The electroporation device of the present specification can increase the efficiency of introducing a substance into a cell by exposing a wider area to an electric field and generating more holes through the Dean flow generated in the spring structure, thereby rotating the cell. Therefore, the same efficiency can be achieved even with a relatively weaker electric field compared to the conventional one. Specifically, the average electric field within the flow tube can be 80 KV/m or more, 85 KV/m or more, 90 KV/m or more, 95 KV/m or more, or 100 KV/m or more, and can be 200 KV/m or less, 180 KV/m or less, 150 KV/m or less, or 120 KV/m or less.
상기 유로관 내 개별 전기장은 80 KV/m 이상, 85 KV/m 이상, 90 KV/m 이상, 또는 95 KV/m 이상일 수 있다. 이는 전기천공법으로 트랜스펙션할 수 있는 최소 요구 전기장이다.The individual electric fields within the above-described conduit can be 80 kV/m or more, 85 kV/m or more, 90 kV/m or more, or 95 kV/m or more. This is the minimum required electric field that can be transfected by electroporation.
상기 유로관 내 개별 전기장은 양극 또는 음극에 가까울수록 전기장이 강해지고, 양극과 음극과 멀어질수록 전기장이 약해진다. 또한, 상기 유로관 내 개별 전기장은 양극과 음극과 가장 멀리 위치한 유로관의 측면부근이 가장 약하다. The individual electric field within the above-mentioned pipe becomes stronger the closer it is to the anode or cathode, and becomes weaker the farther it is from the anode and cathode. In addition, the individual electric field within the above-mentioned pipe is weakest near the side of the pipe that is farthest from the anode and cathode.
전극과의 거리에 따라 상기 유로관 내 개별 전기장이 다양하게 분포해 있으므로, 스프링구조에 의해 발생한 딘흐름(dean flow)로 인해, 시료 내 세포가 회전하여 보다 넓은 면적이 전기장에 노출되어 효율이 높하지고, 전기장이 약한 부분에 도달하여 세포가 닫히고 주변 온도가 내려가 세포의 생존률을 높힐 수 있다.Since the individual electric fields within the above-described tube are distributed in various ways depending on the distance from the electrode, the Dean flow generated by the spring structure causes the cells within the sample to rotate, exposing a wider area to the electric field, thereby increasing efficiency, and the electric field reaches a part where it is weak, closing the cells and lowering the surrounding temperature, thereby increasing the survival rate of the cells.
여기서, 전기장의 평균은 유로부 전체 부피에 대한 전기장 평균값으로 계산될 수 있다.Here, the average electric field can be calculated as the average electric field over the entire volume of the euro area.
10: 시료 20: 최종물
100: 유입구 200: 배출구
300: 유로관
330: 유로관의 진행방향
350: 유로관의 진행방향에 대한 수직단면
400: 몸체 450: 몸체의 축방향
500: 양극 550: 음극
600: 스프링 구조가 회전하며 이루는 원의 지름10: Sample 20: Final product
100: Inlet 200: Outlet
300: Euro pipe
330: Direction of the Euro pipe
350: Vertical section along the direction of travel of the Euro pipe
400: Body 450: Axial direction of the body
500: positive 550: negative
600: Diameter of the circle formed by the rotation of the spring structure
Claims (5)
상기 세포 내에 상기 도입대상물질이 도입된 최종물이 배출되는 배출구;
내부가 비어있는 몸체;
상기 몸체 내부에 삽입되며, 상기 유입구와 일측 단부가 연결되고 상기 배출구에 타측 단부가 연결되며, 내부가 비어있고 스프링구조를 갖는 유로관;
상기 몸체의 축방향을 따라 상기 몸체의 표면에 구비된 양극과 음극; 및
상기 양극과 상기 음극에 각각 연결된 전원을 포함하며,
상기 유로관 내 평균 전기장은 80 KV/m 이상 120 KV/m 이하인 전기천공장치.An inlet through which a sample containing cells and target substances is introduced;
An outlet through which the final product into which the target substance has been introduced into the cell is discharged;
A body with an empty interior;
A pipe inserted into the body, one end of which is connected to the inlet port and the other end of which is connected to the outlet port, the interior of which is hollow and has a spring structure;
An anode and a cathode provided on the surface of the body along the axial direction of the body; and
Includes a power source connected to each of the positive and negative electrodes,
An electroporation device having an average electric field within the above-mentioned pipe of 80 KV/m or more and 120 KV/m or less.
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