KR102709742B1

KR102709742B1 - 줄기세포용 냉장 보존액

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Publication number: KR102709742B1
Application number: KR1020227013398A
Authority: KR
Inventors: 아키라 아이자와; 현승휴; 현우기
Original assignee: 가부시끼가이샤 비엠지
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2024-09-24
Anticipated expiration: 2040-11-05
Also published as: KR20220063263A; WO2021090869A1; JP7636797B2; EP4056680A4; JPWO2021090869A1; EP4056680A1; CN114585255A; US20230189790A1

Abstract

인간 또는 동물의 iPS 세포 등의 줄기세포 또는 배아를 비동결 상태로 냉장 보존하기에 적합한 냉장 보존액 및 냉장 보존 방법을 제공한다. 일실시형태에 의한 냉장용 보존액은, 칼륨 이온종의 함량이 30∼80 mmoL/L이며, 나트륨 이온종의 함량이 30∼80 mmoL/L이며, 나트륨 이온종의 양은, 칼륨 이온종에 대한 이온 베이스의 몰비(Na^＋/K^＋의 비)로, 0.5∼1.3이며, 트롤록스(Trolox) 또는 그의 아날로그를 1∼8 mM의 농도로 함유하고, 아데닌 또는 그의 염 혹은 유도체를 0.1∼4.2 mM의 농도로 함유하고, 필수아미노산에 대하여, 전부, 또는, 1종, 2종 또는 3종을 제외하고 전부 함유하고, 필수아미노산의 토탈 함량은, 50∼200 mg/L이며, 비필수아미노산의 토탈 함량이 50∼200 mg/L이다.

Description

줄기세포용 냉장 보존액

본 발명은, 세포, 조직, 오르가노이드, 장기 등을, 비동결 상태로 보존하기 위한 보존액에 관한 것이다. 특히, 상온보다 낮은 온도, 예를 들면, 2∼15 ℃, 2∼8 ℃ 또는 2∼6 ℃로 보존하기 위한 냉장 보존액에 관한 것이다. 또한, 특히, 인간 iPS 세포 등의 만능성 줄기세포(pluripotent cells) 및 그 외의 줄기세포(stem cells), 또는, 이것으로부터 얻어지는 오르가노이드 등의 유도체, 초기 배아 등을, 부유 또는 침지시켜 보존하기 위한 냉장 보존액에 관한 것이다.

iPS, ES세포 등의 줄기세포를 간편하고 효율적으로 또한 안정적으로 보존·공급하는 것은, 재생의료에서의 기초적인 연구 및 임상응용연구 또는 창약(創藥) 연구 분야에 있어서 빼놓을 수 없는 중요한 기술이다. 인간의 iPS 세포 및 ES세포의 동결보존은, 완만동결보존법이면 보존 후의 생존율이 낮은 것이나, 동결보존에 사용되는 내빙재(耐氷材)인 DMSO가 가지는 세포독성, 분화 유도성 등, 많은 문제를 안고 있다. 세포의 비동결저온보존은, 단기(예를 들면 1일∼2주일)로부터 중기(예를 들면 보름∼3개월)의 보존법으로서 매우 매력적인 기술인 것 이외에, 분화 유도한 세포의 보존이나 오르가노이드의 보존 등, 재생의료기술의 산업화나 창약으로의 응용을 고려한 경우에, 그 이점은 크다. 그러나, 장기의 저온보존액으로서 널리 사용되고 있는 UW액(UW_sln; BELZER UW(등록상표) COLD STORAGE SOLUTION)을 사용하여, 인간의 iPS 세포를 포함하는 만능성 줄기세포 등을 저온보존하는 것은 곤란하며, 새로운 냉장 보존 기술의 개발이 필수적이다.

간장이나 신장 등의 이식에 사용하는 장기의 냉장 보존에는, UW액이 널리 사용되고 있고, 실질적인 골드스탠다드(최적기준)가 되어 있다. 1980년대에 개발된 UW액은, 세포내형의 저Na이온이며 고K이온의 염류조성으로 이루어지는 용액에, 락토비오네이트(Lactobionate), 라피노스(Raffinose), 글루타티온(Glutathion), 하이드록시에틸전분(Hydroxy-ethyl starch) 등을 포함하는 비교적 단순한 조성을 가진다.

PCT/JP2009/002941(JP5726525B) JP6220108B(JP2012-217342A) WO2016/076317A

COMPARE BELZER UWTM COLD STORAGE SOLUTION TO VIASPAN https://bridgetolife.com/compare-belzer-uw-cold-storage-solution-to- viaspan/ A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells, Scientific Reports 4: 3594 doi: 10.1038/srep03594 Cryopreservation and Hypothermal Storage of Hematopoietic Stem Cellshttps://etd.ohiolink.edu/!etd.send_file?accession=ucin1439307244&disposition=inline

그러나, 세포 등을 냉장 보존하는 경우, UW액은 충분히 저온보존 스트레스를 억제할 수 없다. 본건 발명자들은, 이 문제의 해결에는, 염류조성을 UW액으로 대표되는, 세포내형과, 통상의 배지가 가지는 고Na이온 저K이온 세포외형의 중간형의 염류조성이 중요하다는 가설을 세웠다. 또한, 장기 보존에 비교하여 단백질 등의 고분자의 첨가가 중요하다고 생각하여 UW액과 세포배양액의 중간형의 보존액의 개발을 행하였다.

세포의 저온보존용의 배지에 대해서는, 거의 보고가 없다. 소수이면서 최근 개발된 HTS FRS(Hypothermosol(등록상표) FRS; BioLife Solutions)에 의한 보존의 보고가 있다. 이 HTS FRS는, 인간피부 섬유아세포나, 평활근세포를 3∼5 일간 저온보존하는 것이 가능하다는 보고가 있지만, 인간 iPS 세포 등의 만능세포의 냉장 보존에 관한 보고는 없다.

본건 발명자들은, 다종다양한 조합을 시도하는 중에, MEM-alpha(Minimum Essential Medium Eagle(MEM) Alpha Modification) 또는 StemFit(등록상표) AK02N(아지노모토(주))와, 상기 UW액 또는 ES세포용 배양액(후술하는, DMEM: F12 배지를 베이스로 수정한 것; 이하, 적절하게 「ESC medium」이라고 칭함)을, 약 1/1∼1/2의 비율로 혼합한 액을 사용하는 것을 시도했다. MEM-alpha는, MEM 배지를 베이스로 하여, 비필수아미노산, 피루브산나트륨, 리포산, 비오틴 및 비타민 B12를 함유시킨 것이다.

그리고, MEM(Eagle's minimal essential medium) 배지에는, 하기 성분 (1)∼(4)가 포함된다.

(1) 아미노산(L-알기닌, L-시스틴, L-글루타민, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-페닐알라닌, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린,

(2) 염(염화칼슘, 염화칼륨, 황산마그네슘, 나트륨염화물, 인산이수소나트륨),

(3) D-글루코오스, 및

(4) 비타민(폴산, 니코틴아미드(나이아신아미드), 리보플라빈, B12, 콜린, 이노시톨, 판토텐산, 피리독살인산, 티아민).

한편, UW액은, 세포내액형 조성의 Ca2＋ 불함유액이며, 삼투압조정과 세포팽창 억제를 위한 락토비온산이나 하이드록시에틸전분(hydroxy-ethyl starch; HES)과, 항염증, 혈관이완, 및 ATP의 전구물질로서 아데노신과, 항산화를 위한 글루타티온 및 알로퓨리놀과, 완충 성분으로서의 인산 버퍼가 배합되고 있다.

StemFit(등록상표) AK02N은, 인간 iPS 세포용 피더리스 배지이며, A액 400mL, B액 100mL, 및 C액 2mL로 이루어지고, 사용 직전에 혼합하여 사용하게 되고 있지만, 이 혼합 시에, 상기한 UW액 또는 ES세포용 배양액도 혼합했다. 그리고, C액은, 염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF; basic fibroblast growth factor)를 생리적 완충액에 용해시킨 것이다.

그리고, StemFit(등록상표) AK02N은, MEM-alpha와 비교한 경우, 염류조성이 동일하다고 할 수 있고, 필수아미노산 조성이, 대략 동일하며, 또한, 비필수아미노산 조성에 대하여, 상당 부분은 동일하다. 후술하는 실험 결과에 따라 시사되는 바와 같이, 본 발명의 냉장용 보존액에 있어서, MEM-alpha와, StemFit(등록상표) AK02N을, 거의 동일하게 사용할 수 있었다. 이는, 이들의 공통 부분, 즉 염류조성, 필수아미노산 조성, 및 비필수아미노산 조성의 주요부분이, 본 발명의 작용 효과를 발휘하는 면에서 중요하다고 생각되었다. 한편, MEM-alpha와, StemFit(등록상표) AK02N이 상이한 주요한 점은, 단백질 및 성장 인자 모두가, StemFit(등록상표) AK02N에만 포함되어 있는 것이다. 이들 성분은, 본 발명의 냉장용 보존액에 있어서, 필수적이지 않으며, 또한, 그다지 기여하고 있지 않은 것으로 추측된다. 그리고, StemFit(등록상표) AK02N이 iPS 세포를 위한 배양액인 것에 대하여, MEM-alpha는, 대표적인 성장 인자인 bFGF를 첨가해도, iPS 세포를 배양할 수는 없다. 또한, ES세포용 배양액(「ESC medium」)도, 동일하게, 피더 세포없이는, iPS 세포를 배양할 수는 없다.

또한, 여기서의 ES세포용 배양액(「ESC medium」)의 베이스를 이루는 DMEM: F12 배지는, MEM(Eagle's minimal essential medium) 배지와, Ham's F12 배지를 1/1의 체적비로 혼합한 것이다. Ham's F12 배지는, 푸토레신(putrescine), 히포크산틴(Hypoxanthine) 및 티미딘(Thymidine)을 포함하는 무혈청의 기초 배지(basal media)아다.

본 발명의 바람직한 일실시형태에 의한 냉장용 보존액은, 하기 a1∼a6 또는 a1∼a9의 특징을 가진다.

a1. 칼륨 이온종의 함량이 20∼90 mmoL/L 또는 30∼80 mmoL/L이며, 나트륨 이온종의 함량이 20∼90 mmoL/L 또는 30∼80 mmoL/L이다.

a2. 나트륨 이온종의 양은, 칼륨 이온종에 대한 이온 베이스의 몰비(Na^＋/K^＋의 비)로, 0.5∼1.5, 0.5∼1.3, 또는 0.6∼1.2이다.

a3. 트롤록스(Trolox) 또는 그의 아날로그를, 0.5∼10 mM, 1∼8 mM 또는 2∼7 mM의 농도로 함유한다.

a4. 아데닌 또는 그의 염 혹은 유도체를, 0.1∼4.2 mM, 0.1∼6 mM, 1∼6 mM, 2∼5 mM 또는 3∼5 mM의 농도로 함유한다.

a5. 필수아미노산에 대하여, 전부, 또는, 1종, 2종 또는 3종을 제외하고 전부 함유하고, 필수아미노산의 토탈 함량은, 바람직하게는 50∼250 mg/L, 특히 50∼200 mg/L 또는 80∼150 mg/L이다.

a6. 비필수아미노산의 토탈 함량은, 바람직하게는 100∼500 mg/L, 특히 50∼200 mg/L 또는 80∼150 mg/L이다.

a7. 마그네슘 이온종(특히 황산마그네슘)의 함량이, 2∼8 mmoL/L, 2∼5 mmoL/L 또는 2∼4 mmoL/L이며, 칼슘의 함량이, 0.2∼1.5 mmoL/L, 0.2∼1 mmoL/L 또는 0.3∼0.8 mmoL/L이다.

a8. 글루코오스 또는 그 외의 저분자다당류(특히, 말토오스 등의 이당류나, 프룩토오스 등의 단당류)를 0.5∼10 mmoL/L의 농도로 함유한다.

a9. 하기 비타민을 포함한다. 단, 하기 중, 1종, 2종, 3종 또는 4종을 생략할 수 있다.

폴산, 니코틴아미드(나이아신아미드), 리보플라빈, B12, 콜린, 이노시톨, 판토텐산, 피리독살인산, 및 티아민.

본 발명의 바람직한 일실시형태에 의한 냉장용 보존액은, (i) 락토비온산 또는 그의 염(Lactobionic acid or lactobionate)을 락톤 환산으로 30∼100 mmoL/L(또는 10∼40 g/L), (ii) 라피노스수화물 10∼30 mmoL/L(또는 5∼20 g/L), (iii) 알로퓨리놀 0.3∼1 mmoL/L(또는 0.05∼0.1 g/L), (iv) 글루타티온(토탈 글루타티온) 1∼3 mmoL/L, (v) 아데노신 2∼10 mmoL/L(또는 0.3∼0.9 g/L), 및 (vi) 리포산 0.05∼1 μmoL/L(또는 0.03∼0.2 mg/L), (vii) 피루브산나트륨 0.1∼1 mmoL/L(또는 10∼100 mg/L), (viii) 글루코오스 0.5∼10 mmoL/L(또는 100∼1000 mg/L), (ix) 아스코르브산 0.03∼0.3 mmoL/L, 및 비타민 E 또는 그의 수용성 아날로그·유도체 1∼10 mM, (x) 아데닌 또는 그의 염 혹은 유도체 0.1∼4.2 mM, (xi) 그 외의 비타민 또는 그의 수용성 아날로그·유도체, (xii) 필수아미노산을 토탈로, 50∼200 mg/L, (xiii) 비필수아미노산을 토탈로, 100∼500 mg/L, (xiv) 칼륨 이온종 30∼80 mmoL/L, (xv) 나트륨 이온종 20∼90 mmoL/L를 포함하는 생리완충액이며, pH가 7∼7.5로 설정되어 있다.

이 냉장용 보존액은, 바람직하게는 (xv) 하이드록시에틸전분을 20∼50 g/L 포함한다. 또한, 바람직하게는, (xvi) 리보뉴클레오시드 4∼40 mg/L 및/또는 (xvii) 디옥시리보뉴클레오시드 4∼40 mg/L를 포함한다. 또한, 바람직하게는, (xviii) 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate) 인산이수소나트륨(sodium dihydrogen phosphate) 10∼25 mmoL/L를 포함한다.

인간 iPS 세포 등의 만능세포를 냉장 보존하는 데 있어서, 높은 생존율 유지 효과 및 재배양 후의 증식능을 유지할 수 있다.

도 1a는 싱글 셀 상태에서 4℃로 보존한 경우의, 보존 개시 시의 생존율을 1.0로 했을 때의 보존 일수에 의한 상대적인 생존율(Relative viability)의 변화를 나타낸 그래프이다. 그리고, 도 1∼도 7f의 실험에서는, UW액과, 임상연구용 배지StemFit(등록상표) AK02N을 2/1로 혼합한 냉장 보존 배지(「HTM1」)를 사용했다.
도 1b는 도 1a의 그래프로부터, 50% 생존율 유지 일수(ST50)를 구한 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 2a는 도 1a와 동일하게, 싱글 셀 상태에서 4℃로 보존한 경우의, 보존 일수에 의한 생존율의 변화를 나타낸 그래프이다. 다만, 도 1a와 동일하게, 보존 개시 시의 생존율을 1.0로 맞추고 있다.
도 2b는 도 2a의 그래프로부터, 80% 생존율 유지 일수(ST80)를 구한 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 2c는 6일간의 냉장 보존 후, 5일간의 배양에 의한 콜로니 형성능을 나타내는 막대 그래프이다.
도 3a는 3일간의 냉장 보존을 행한 직후에 일어나는, 아포토시스에 의한 세포사의 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 3b는 도 3a와 동일하게 3일간의 냉장 보존을 행한 직후에 일어나는, 네크로시스에 의한 세포사의 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4a는 도 3a∼3b와 동일하게 3일간의 냉장 보존을 행한 직후에 일어나는, 세포내 활성산소종(ROS)의 농도변화를 나타낸 막대 그래프이다.
도 4b는 도 3a∼3b 및 도 4a와 동일하게 3일간의 냉장 보존을 행한 직후에서의, 아포토시스의 지표로 되는 세포내카스파제3/7의 활성의 변화를 나타낸 막대 그래프이다.
도 5a는 실험에서 사용한 라디칼 스캐빈저의 화학식을 나타낸다.
도 5b는 도 5a에 나타낸 각종 라디칼 스캐빈저를 첨가한 경우의, 도 2b와 동일한 80% 생존율 유지 일수(ST80)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6a는 라디칼 스캐빈저인 트롤록스의 첨가 농도를 변화시켰을 경우의 도 2a와 동일한, 보존 일수에 의한 생존율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 도 6a의 그래프로부터, 80% 생존율 유지 일수(ST80)를 구한 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 6c는 6일간 냉장 보존하고 나서 5일간 배양했을 때의 콜로니 형성능에 대하여, 트롤록스의 첨가 농도를 변화시킨 각 배지에서의 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 6d는 6일간 보존 후, 회복 배양 1일후의 상대 생존율에 대한, 토코페롤 및 아세트산 토코페롤의 첨가의 효과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 7a는 3일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양하여 얻어진 콜로니를 나타내는 위상차화상이다.
도 7b는 도 7a의 화상을 2치화한 것이다.
도 7c는 6일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양하여 얻어진 콜로니를 나타내는 위상차화상이다.
도 7d는 도 7b의 화상을 2치화한 것이다.
도 7e는 3일간 및 6일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양한 배지에서의, 콜로니의 면적 비율을 정리하여 나타내는 막대 그래프이다.
도 7f는 3일간 및 6일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양했을 때의 콜로니수의 증가율에 대하여, 냉장 보존하지 않고 4일간 배양한 비보존 컨트롤을 1로 한 비율로 나타내는 막대 그래프이다.
도 8는 도 7f의 결과를, Trolox 등의 첨가없음, 및 Trolox 5mM에 아데닌을 1.4-8.2 mM로 한 결과도 포함시켜 나타내는 막대 그래프이다.
도 9는 냉장 보존 배지로서, UW액과, MEM-alpha를 2/1로 혼합한 냉장 보존 배지 「HTM-alpha」(UW액＋MEM-alpha, 2:1)를 사용하여, 7일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양했을 때의 콜로니수의 증가율에 대하여 나타내는, 도 7f 및 8과 동일하한 막대 그래프이다. 여기서는, 「HTM-alpha」 및 「HTM1」에, 5mM의 Trolox 및 5배 농도(x5; 10mM)의 GlutaMAX(등록상표, GIBCO)를 첨가했다. 또한, 시판하고 있는 냉장 보존 배지인 HTS FRS를 사용한 결과도 함께 나타낸다.
도 10은 마우스의 배반포기배아(체외 수정 후 3.5일)를, 도 9와 동일한 배지 중에서 3일간 냉장 보존한 후, 2일간의 배양 기간 중에 투명대(透明帶)를 탈출한 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 11은 도 10의 실험와 동일한 조건에서, 아데닌염산염의 첨가 농도의 영향을 조사한 결과를 나타낸, 도 10과 동일한 막대 그래프이다.
도 12a는 도 6a의 실험와 동일한 조건에서, 하이드록시에틸스타치(HES) 대신에 폴리비닐알코올(PVA)을 사용한 경우의 보호 효과를 나타내는, 막대 그래프이다.
도 12b는 도 12a 실험와 동일한 조건에서, 폴리비닐알코올(PVA)에 더하여, 만니톨(mannitol)을 더욱 첨가한 효과를 나타내는, 도 12a와 동일한 막대 그래프이다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 의한 냉장용 보존액은, 하기 (i)∼ (vi)을 포함하는 생리완충액이며, pH가 7∼7.5로 설정되어 있다.

(i) 락토비온산 또는 그의 염(Lactobionic acid or lactobionate)을 락톤 환산으로 20∼100 mmoL/L, 30∼100 mmoL/L, 30∼80 mmoL/L 또는 30∼60mmoL/L, 또는, 10∼50g/L, 10∼40g/L, 15∼35g/L 또는 20∼30g/L.

(ii) 라피노스수화물 10∼40 mmoL/L, 10∼30 mmoL/L 또는 10∼20 mmoL/L, 또는, 5∼20 g/L 또는 8∼15 g/L.

(iii) 알로퓨리놀 0.3∼2 mmoL/L, 0.3∼1 mmoL/L 또는 0.4∼0.8 mmoL/L, 또는, 0.03∼0.15 g/L, 0.05∼0.1 g/L 또는 0.06∼0.08 g/L.

(iv) 글루타티온(토탈 글루타티온 1∼3 mmoL/L 또는 1.5∼2.5 mmoL/L, 또는, 0.3∼1 g/L, 0.4∼0.9 g/L 또는 0.4∼0.8 g/L.

(v) 아데노신 2∼10 mmoL/L, 2∼8 mmoL/L 또는 2∼5 mmoL/L, 또는, 0.5∼1.5 g/L 또는 0.5∼1.3 g/L.

(vi) 리포산 0.05∼1μmoL/L, 0.1∼0.5 μmoL/L 또는 0.2∼0.4 μmoL/L, 또는, 0.03∼0.2 mg/L 또는 0.05∼0.1 mg/L.

(vii) 피루브산나트륨 0.1∼1 mmoL/L, 0.1∼0.7 mmoL/L 또는 0.2∼0.5 mmoL/L, 또는, 10∼100 mg/L 또는 20∼50 mg/L.

(viii) 글루코오스 0.5∼10 mmoL/L, 1∼5 mmoL/L 또는 1∼3 mmoL/L, 또는, 100∼1000 mg/L 또는 200∼500 mg/L.

(ix) 하기 항산화성의 비타민, 또는 그의 수용성 아날로그·유도체

(모두, 염의 형태를 가질 수 있다. 경우에 따라, 하기 2종 중, ix-1을 생략할 수 있다.)

ix-1. 아스코르브산 0.03∼0.3 mmoL/L, 0.05∼0.2 mmoL/L 또는 0.05∼0.15 mmoL/L, 또는, 5∼20 mg/L 또는 10∼15 mg/L.

ix-2. 비타민 E, 트롤록스(Trolox) 또는 그 외의 수용성 비타민 E 아날로그·유도체 0.5∼10 mM, 1∼8 mM 또는 2∼7 mM.

(x) 아데닌 또는 그의 염 혹은 유도체 0.1∼6 mM, 0.1∼5 mM, 0.1∼4.5 mM, 0.1∼4.2 mM 또는 2∼5 mM. 경우에 따라서는, 0.1∼0.3 mM 또는 0.05∼0.2 mM.

(xi) 상기한 다른 비타민 또는 그의 수용성 아날로그·유도체

(모두, 염의 형태를 가질 수 있다. 또한, 하기 10종 중, 1∼5 종, 1∼4 종 또는 1∼3 종을 생략할 수 있다.)

xi-1. 비오틴 0.03∼0.25 μmoL/L, 0.05∼0.2 μmoL/L 또는 0.1∼0.15 μmoL/L, 또는, 0.01∼0.1 mg/L 또는 0.02∼0.05 mg/L.

xi-2. 비타민 B12 0.03∼3 μmoL/L, 0.05∼2 μmoL/L 또는 0.1∼0.5 μmoL/L, 또는, 0.1∼0.8 mg/L 또는 0.2∼0.6 mg/L.

xi-3. 폴산 0.2∼2 μmoL/L, 0.3∼1 μmoL/L 또는 0.5∼0.9 μmoL/L, 또는, 0.1∼1 mg/L 또는 0.2∼0.5 mg/L.

xi-4. 나이아신아미드 0.5∼8 μmoL/L, 1∼6 μmoL/L 또는 1∼4 μmoL/L, 또는, 0.03∼0.2 mg/L 또는 0.05∼0.1 mg/L.

xi-5. 리보플라빈 0.03∼0.3 μmoL/L, 0.04∼0.2 μmoL/L 또는 0.05∼0.15 μmoL/L, 또는, 0.03∼0.2 mg/L 또는 0.05∼0.1 mg/L.

xi-6. 콜린 0.05∼1 μmoL/L, 0.1∼0.5 μmoL/L 또는 0.1∼0.4 μmoL/L, 또는, 0.1∼1 mg/L 또는 0.2∼0.5 mg/L.

xi-7. 이노시톨 1∼10 μmoL/L, 1∼8 μmoL/L 또는 2∼6 μmoL/L, 또는, 0.03∼0.2 mg/L 또는 0.05∼0.1 mg/L.

xi-8. 판토텐산 0.02∼0.2 μmoL/L, 0.03∼0.1 μmoL/L 또는 0.04∼0.08 μmoL/L, 또는, 0.1∼1 mg/L 또는 0.2∼0.5 mg/L.

xi-9. 피리독살 0.5∼3 μmoL/L, 0.1∼2 μmoL/L 또는 1∼2 μmoL/L, 또는, 0.1∼1 mg/L 또는 0.2∼0.5 mg/L.

xi-10. 티아민 0.3∼3 μmoL/L, 0.4∼2 μmoL/L 또는 0.5∼1.5 μmoL/L, 또는, 0.1∼1 mg/L 또는 0.2∼0.5 mg/L.

(xii) 필수아미노산 토탈로 50∼200 mg/L 또는 80∼150 mg/L.

각 성분의 양은, 표 2에 기재된 함유량을 3으로 나눈 값(하기 실시예에서의 「HTM-alpha」 중의 값)을 A로 한 경우, A/3∼3A의 범위(즉 「HTM-alpha」 중의 값의 1/3∼3 배의 값의 범위), 또는 A/2∼2A의 범위에서, 적절하게 설정할 수 있다. 후술하는 비필수아미노산이나 전술한 비타민에 대해서도 동일하다.

xii-1. 이소류신

xii-2. 류신

xii-3. 리신

xii-4. 메티오닌

xii-5. 페닐알라닌

xii-6. 트레오닌

xii-7. 트립토판

xii-8. 발린

xii-9. 히스티딘

(xiii) 비필수아미노산 토탈로 100∼500 mg/L 또는 150∼400 mg/L.

xiii-1. 글리신

xiii-2. 알라닌

xiii-3. 알기닌

xiii-4. 아스파라긴

xiii-5. 아스파라긴산

xiii-6. 시스테인

xiii-7. 시스틴

xiii-8. 글루타민산

xiii-9. 글루타민

xiii-10. 프롤린

(xiv) 칼륨 이온종 20∼90 mmoL/L, 30∼80 mmoL/L, 40∼80 mmoL/L 또는 50∼70 mmoL/L. 즉, 20mmoL/L 이상, 30mmoL/L 이상, 40mmoL/L 이상, 또는 50mmoL/L 이상이며, 90mmoL/L 미만, 80mmoL/L 미만, 또는 70mmoL/L 미만이다.

(xv) 나트륨 이온종 20∼90 mmoL/L, 30∼80 mmoL/L, 40∼80 mmoL/L 또는 50∼7 0mmoL/L. 즉, 20mmoL/L 이상, 30mmoL/L 이상, 40mmoL/L 이상, 또는 50mmoL/L 이상이며, 90mmoL/L 미만, 80mmoL/L 미만, 또는 70mmoL/L 미만이다.

이 냉장용 보존액은, 바람직하게는 하기 (xvi)∼(xviii) 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 특히 바람직하게는, 하기 (xvi)∼(xvii)과, 하기 (xviii)을 포함한다.

(xvi) 하이드록시에틸전분 10∼80 g/L, 20∼50 g/L 또는 20∼40 g/L.

(xvii) 폴리비닐알코올 3∼100 g/L, 5∼80 g/L, 5∼50 g/L, 5∼30 g/L, 5∼25 g/L, 또는 5∼20 g/L.

(xviii) 만니톨을 20∼100 mmoL/L, 30∼90 mmoL/L 또는 20∼90 mmoL/L.

이 냉장용 보존액은, 바람직하게는 하기 (xix) 및 (xx) 중 적어도 한쪽을 포함한다.

(xix) 리보뉴클레오시드 2∼4 종 토탈로, 4∼40 mg/L, 5∼30 mg/L 또는 10∼15 mg/L.

(xx) 디옥시리보뉴클레오시드 2∼4 종 토탈로, 4∼40 mg/L, 5∼30 mg/L 또는 10∼15 mg/L.

이 냉장용 보존액은, 바람직하게는 하기 (xxi)∼(xxiii)을 포함한다.

(xxi) 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate) 또는 인산이수소나트륨(sodium dihydrogen phosphate) 10∼30 mmoL/L, 10∼25 mmoL/L, 또는 15∼25 mmoL/L.

(xxii) 마그네슘 이온종(특히 황산마그네슘) 2∼8 mmoL/L, 2∼5 mmoL/L 또는 2∼4 mmoL/L.

(xxiii) 칼슘 이온종(특히 염화마그네슘) 0.2∼1.5 mmoL/L, 0.2∼1 mmoL/L 또는 0.3∼0.8 mmoL/L.

또한, 본 발명의 바람직한 일실시형태에 있어서, 나트륨 이온종이, 몰비(Na/K의 이온에서의 비)로, 예를 들면, 칼륨 이온종의 0.7∼1.3 배, 0.8∼1.2 배, 또는 0.9∼1.1 배일 수 있다. 또한, 다른 바람직한 일실시형태에 있어서, 나트륨 이온종이, 몰비로, 예를 들면, 칼륨 이온종의 0.5∼1.5 배, 0.5∼1.3 배, 또는 0.6∼1.2 배일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 의한 냉장 보존액은, 전술한 바와 같이, 트롤록스(Trolox) 또는 그 외의 수용성 비타민 아날로그를, 0.1mM 이상, 0.3mM 이상, 0.5mM 이상, 1mM 이상, 2mM 이상, 3mM 이상, 4mM 이상, 또는 5mM 이상이며, 10mM 이하, 8mM 이하, 또는 6mM 이하의 농도로 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 의한 냉장 보존액은, 전술한 바와 같이, 특히, 아데닌 또는 그의 염을, 0.1mM 이상, 0.3mM 이상, 0.5mM 이상, 1mM 이상, 2mM 이상, 3mM 이상이며, 8mM 이하, 6mM 이하, 5mM 이하 또는 4mM 이하의 농도, 예를 들면, 0.1∼4.2 mM 또는 1∼4.2 mM의 농도로 포함한다. 특히, 세포끼리가 접착되어 3차원의 덩어리를 이루는, 배아나 오르가노이드를 보존하는 데 있어서, 아데닌의 첨가가 현저한 효과를 나타낸 것으로 여겨진다. 또한, 배아나 오르가노이드를 보존하는 데 있어서는, 비교적 낮은 농도, 예를 들면, 0.01∼0.2 mM(10∼200μM) 또는 0.05∼0.3 mM(5∼300 μM)에서도 효과가 나타났다(도 11). 한편, 배아나 오르가노이드를 형성하지 않는 상태로, iPS 세포 등의 줄기세포를 배양하는 데 있어서는, 예를 들면, 0.5∼6 mM, 특히 1∼5 mM 또는 2∼4 mM의 농도로 아데닌을 첨가하는 것이, 특히 효과적인 것으로 여겨진다(도 7a∼도 8).

본 발명의 바람직한 실시형태에 의한 냉장 보존액은, 또한 L-알라닐-L-글루타민, 또는, 그 외의 디펩티드 대체품, 또는 그의 염을, 1∼6 mM, 2∼5 mM 또는 3∼5 mM의 농도로 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시형태에 의한 냉장 보존액은, 표 1에 조성을 나타내는 UW액과, 표 2에 조성을 나타내는 MEM alpha 배지를, UW액이 MEM alpha 배지의 1∼3 배, 바람직하게는 1.5∼2.5 배, 보다 바람직하게는 1.8∼2.2 배가 되도록 체적비로 혼합하여 얻어지는 것이다. 그리고, 표 1 및 표 2의 조성, 및 이 혼합비율로부터 얻어지는 각 성분의 함유량에 대하여, ±50%의 범위 내, ±40%의 범위 내, ±30%의 범위 내, 또는 ±20%의 범위 내에서, 적절하게 증감시키는 것이 가능하다. 또한, 몇 개의 성분, 특히, 표 2에 예로 든 성분 중에서, 비필수아미노산 중 일부(예를 들면 1∼5 종), 뉴클레오시드 중 일부(예를 들면 1∼5 종), 비타민의 일부(예를 들면 1∼5 종), 무기염의 일부(예를 들면 1∼3 종), 및 페놀 레드를 생략할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시형태에 의한 냉장 보존 방법은, 상기한 어느 하나의 냉장 보존액 중에서, 만능세포(pluripotent cells)를, 1×10³개/mL∼1×10⁹개/mL 또는 1×10⁴개/mL∼1×10⁸개/mL가 되도록 싱글 셀 상태에 분산시키고, 예를 들면, 1∼10 일간 또는 1∼7 일간의 냉장 보존을 행한다.

본 발명의 바람직한 일실시형태에 의한 냉장 보존 방법은, 상기한 어느 하나의 냉장 보존액을 넣은 배양 용기에서, 만능세포(pluripotent cells)를, 1×10³개/cm²∼1×10⁹개/cm² 또는 1×10⁴개/cm²∼1×10⁸개/cm²가 되도록 파종하고, 예를 들면, 2∼6 일간 배양시키고 나서, 예를 들면 1∼10 일간 또는 1∼7 일간의 냉장 보존을 행한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 의하면, 냉장 보존의 대상이 되는 만능세포 또는 줄기세포는, 예를 들면, ES세포나, iPS 세포 등의 인공만능성 줄기세포와 같은 만능세포, 또는, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 피부 줄기세포, 생식 줄기세포 등이다. 또한, 냉장 보존의 대상이 되는 만능세포는, 인간 유래이거나, 또는, 영장류, 마우스, 모르모트 등의 포유류 유래일 수 있다.

또한, 다른 실시형태에 의하면, 냉장 보존의 대상은, 인간 또는 동물의 배아, 특히, 소, 말, 돼지, 염소 등의 가축동물의 배아일 수 있다.

실시예

1. 냉장 보존 실험용 세포의 준비

교토대학 iPS 세포연구소에서 입수한 정상인 유래 인간 iPS 세포주(253G1)에 대하여, 피더 프리 조건에서 유지 배양을 행하였다. 이 배양에는, 시판하고 있는 임상연구용(인간 ES/iPS 세포용)배지인 StemFit(등록상표)AK02N(Ajinomoto)을 사용하여, 배양 개시 7일째에 70∼80 % 콘플루언트가 된 시점에서, 효소적으로(0.5X TrypLE(등록상표) Select를 사용하여) 박리하고, 분산시키고 세정했다. 이 후에, ROCK저해제로서 10μM Y27362(후지필름 와코(和光)순약)를 포함하는 새로운StemFit(등록상표)AK02N 배지에 현탁하고, 또한 세포배양 기재(基材)로서 Matrix-511(MATRIXOME, Inc.)을 0.1μg/cm²가 되도록 첨가하고, 1.3E3/cm²(1.3×10³/cm²)의 농도로 파종했다. 파종 다음날, Y27362를 포함하지 않는 StemFit(등록상표)AK02N 배지로 교환하고, 그 후 3일 간격으로 배지를 교환하고, 7일째에 계대 혹은 실험에 제공했다.

그리고, 냉장 보존 배지로서 하기 HTM-alpha를 사용하는 실험(도 9)의 경우에는, 이 HTM-alph에 사용한 것과 동일한 MEM-alpha 배지를, StemFit(등록상표)AK02N 대신에 사용하여, 냉장 보존 실험용 세포를 준비했다.

한편, 마우스 배아의 냉장 보존(도 10∼11)을 시도하기 위하여, 암컷 및 수컷의 마우스(모두 ICR)로부터의 체외 수정을 행한 후, 3.5일(84시간)의 배양을 행하였다. 이 때, 수정용 배지에 HTF(후지필름와코순약)을 사용하였고, 배양에는 KSOM(아크·리소스)을 사용하였다.

그리고, 본원 중에서, 특별히 한정하지 않는 한, 배양은, 37℃ 인큐베이터(5% CO₂)에서 행하였다.

2. 냉장 보존액

하기 3종의 냉장 보존액을 준비했다. 편의 상, 각각 HTM1, HTM2, 및 HTM-alpha로 칭하기로 한다.

·HTM1: UW액＋상기한 임상연구용 배지 StemFit(등록상표)AK02N, 혼합 체적비: 2/1.

·HTM2: UW액＋하기 인간ES세포배양액(「ESC medium」), 혼합 체적비: 2/1.

·HTM-alpha: UW액＋MEM-alpha(12571- MEM alpha, nucleosides, Thermo Fisher Scientific), 혼합 체적비: 2/1. 5mM이 되도록 Trolox를 첨가하고, 5배 농도(x5;10mM)가 되도록 GlutaMAX(등록상표, GIBCO)를 첨가하여 사용하였다.

그리고, 하기 3종의 냉장 보존액 중 어느 하나를 비교예의 냉장 보존액으로서 사용했다.

·UW액(BELZER UW(등록상표) COLD STORAGE SOLUTION)

·상기 StemFit(등록상표)AK02N

·HTS FRS(HypoThermosol(등록상표)FRS, BioLife Solutions)

인간 ES세포배양액(「ESC medium」)은, DMEM-F12(Invitrogen 21331-020)에, 하기를 첨가한 것이다. 하기에서의 % 및 mM은, 최종적으로 얻어지는 인간 ES세포배양액에 대한 중량비율 또는 몰농도를 나타낸다.

·비필수아미노산(NON-ESSENTIAL AMINO ACID(x100), invitrogen 11140) 1%,

·200mM L-글루타민(L-GLUTAMINE(x100), invitrogen 25030) 1%,

·StemSure(등록상표)Serum Replacement (SSR)(후지필름와코순약) 20%,

·2-머캅토에탄올(2-MERCAPTOETHANOL(x1000; 첨가 시의 농도) 0.1mM,

·페니실린 및 스트렙토마이신(penicillin/streptomysin).

UW액(BELZER UW(등록상표) COLD STORAGE SOLUTION)의 조성은, 상기 비특허문헌 1에 의하면, 하기 표와 같다.

[표 1] UW액의 조성

「HTM-alpha」에서 사용한 MEM alpha 배지(12571- MEM alpha, nucleosides, Thermo Fisher Scientific)는, 구체적으로는, 하기 조성을 가지고 있다(https: //www.thermofisher.com/jp/en/home/technical-resources/media-formulation.94.html).

[표 2] MEM alpha 배지의 조성

「HTM-alpha」에 첨가한 GlutaMAX(등록상표, GIBCO)는, L-글루타민의 디펩티드 대체품인 L-알라닐-L-글루타민을 생리식염수(0.85N NaCl)에 용해한 200mM 용액(「GlutaMAX^TM I(100×)」)으로서 시판되고 있다. 이것을, 1/20로 묽게 하여 10mM(5×)이 되도록, 「HTM-alpha」 중에 첨가하여 사용하였다.

상기 UW액, HTM1∼HTM2, HTM-alpha, 및 일반적으로 상용되고 있는 배양액Earls BSS(EBSS -Earle's Balanced Salt Solution; ThermoFisher scientific)에 대하여, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 및 이들의 몰비를 하기 표 3에 정리해서 나타낸다. 그리고, StemFit(등록상표) AK02N 및 MEM-alpha에서도, 이들 이온 농도는, Earls BSS와 동일하다. 후술하는 실험 결과를 참조하면, Na^＋/K＋의 몰비에 대하여, 1전후, 또는, 이보다 조금 작은 값으로 해야 할 것으로 여겨진다.

[표 3] 시판 중인 배지, 및 실시예의 배지에서의 Na^＋/K^＋의 몰비

그리고, 전술한 바와 같이, 단백질이나 펩티드, 및 성장 인자는, StemFit(등록상표) AK02N에 포함되어 있지만, MEM-alpha에 포함되어 있지 않다. 따라서, 단백질이나 펩티드, 및 성장 인자는, HTM1에 포함되어 있지만, HTM-alpha에 포함되어 있지 않다.

3. 싱글 셀 상태에서의 냉장 보존

상기 「1.」에서 얻어진 인간 iPS 세포를, 상기 「2.」의 냉장 보존액 HTM1 및 HTM2에 넣고, 1E6cells/mL(부유세포수 1×10⁶개/mL)가 되도록, 싱글 셀 상태로 현탁하고 나서, 플라스틱 튜브에 넣고, 4℃ 조건 하에서 정치(靜置)하여 보존했다. 생존율은, 트리판블루 염 색후, 살아있는 세포의 수를 카운트하여 구했다.

경시적(經時的)인 생존율 측정의 결과를 도 1a 및 2a에 나타낸다. 도 1a의 그래프로부터, 50% 생존율 유지 일수(ST50)를 구하고, 도 1b에 나타낸다. 또한 도 2a의 그래프로부터, 80% 생존율 유지 일수(ST80)를 구하고 도 2b에 나타낸다.

본원 실시예에서의 통계학적 처리는, 다음과 같이 행하였다. 도 1a 및 도 2b의 생존율의 유지 커브는, R ver 3.5.1을 사용하여 4변수 로지스틱 곡선에 피팅하여 얻었다. 또한, 1way ANOVA 및 Bonferoni 검정 및 Dunnetts 검정은, Graphpad Prism 5.04를 사용하여 계산했다.

도 1a 및 도 2a에 나타낸 바와 같이, UW액을 사용한 경우와 비교하여, 본원 실시형태의 냉장 보존액인 HTM1(UW액＋StemFit(등록상표), 2/1) 및 HTM2(UW액＋ES세포배양액(ESC medium), 2/1)를 사용한 경우에, 더욱 높은 생존성 유지 효과를 나타내었다. 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, HTM2를 사용하여 보존한 경우, UW액에 비해, 생존성 유지 기간이 약 2배까지 연장되었다. HTM1을 사용한 경우와, HTM2를 사용한 경우를 비교하면, 50% 생존율 유지 일수(ST50)는, 거의 동일하며, UW액에 비해, 모두 유의하게 높은 값을 나타낸다. 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 80%의 생존율 유지 일수(Survival time 80: ST80)를 비교한 바, HTM1을 사용한 경우에 4.6일이 되고, UW액을 사용한 경우의 2.1일에 비해, 2.2배라는 현저하게 높은 값을 나타내었다.

HTM1에 사용한 StemFit(등록상표) 배지는, 동물유래 성분 불포함(Xenofree)이므로, 이후의 실험은 HTM1을 사용하여 검토했다. 그리고, ES세포배양액(ESC medium)을 그대로 냉장 보존용 배지로 사용한 경우, 생존성 유지 효과는, UW액에 비교해도 현저하게 낮았다. 이하의 실험에서도 ES세포배양액(ESC medium)을 사용하고 있지만, 그래프 중에만 나타내고, 설명이나 언급은 생략하기로 한다.

4. 콜로니 형성능 유지 효과

냉장 보존 후의 세포 증식능을, 다음과 같이 하여 검증했다. 먼저, 상기 「1.」에서 얻어진 인간 iPS 세포를, 상기 「2.」의 냉장 보존액 HTM1에 넣고, 상기 「3.」과 같이 하여 6일간 냉장 보존했다. 다음으로, 10μM Y27362를 포함하는StemFit(등록상표)AK02N 배지에 현탁하고, iMatrix-511을 0.1μg/cm²가 되도록 첨가하여, 1.3E3/cm²의 농도로 파종했다. 배양 5일째에, 세포에 고정 알칼리 포스파타아제 염색을 행하고 나서, 일정한 크기 이상까지 형성한 콜로니의 수를, 콜로니 카운터를 사용하여 계측했다. 냉장 보존을 행하지 않고 동일하게 5일간 배양한 경우의 콜로니의 수를 동일하게 계측하여 컨트롤로 했다. 그리고, 냉장 보존 후의 5일간의 배양에 의해 얻어진 콜로니수를, 이 컨트롤에서의 콜로니의 수로 나누어, 콜로니 형성능(Relative colony efficiency)으로 했다.

도 2c에 나타낸 바와 같이, HTM1을 사용한 경우에, UW액 보존을 사용한 경우의 6.7배라는, 유의하게 높은 값을 나타내었다. 이상으로부터, 신규 세포 저온보존액 HTM1은, 인간 iPS 세포의 저온보존에 있어서 높은 생존성 유지 효과 및 재배양 후의 증식능을 유지하는 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 그리고, StemFit(등록상표)AK02N 사용한 경우에, 콜로니 형성은 관찰되지 않았다.

5. 아포토시스 세포의 검출과 계측

상기 「1.」에서 얻어진 인간 iPS 세포를, 상기 「2.」의 냉장 보존액 HTM1에 넣고, 상기 「3.」과 같이 하여 3일간 보존하고, 이 직후에 일어나는 세포사를 Annexin V/EthD-III를 사용하여 분류했다. 즉, 아포토시스 세포와 네크로시스 세포의 분별을 위해서는, 먼저, Apoptotic/Necrotic Cells Detection Kit(TAKARA)를 사용하여 프로토콜에 따라 염색했다. 그리고, Annexin V-FITC 양성 세포(아포토시스)와 에티듐호모다이머 III 양성 세포(네크로시스), Hoechst33342(Dojin)시그널(전체 세포)을 형광현미경 하에서 관찰·계측하여 결정했다.

이 결과를, 도 3a 및 3b의 막대 그래프에 의해 나타낸다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, HTM1을 사용한 경우에, UW액을 사용한 경우에 비교하여, 아포토시스의 유도를 유의하게 낮게 억제하는 것을 알수 있다. 이와 같은 보존 직후의 아포토시스의 억제 효과에 의해, HTM1이, UW액에 비해 높은 증식능(콜로니 형성능)을 가지는 것으로 여겨진다.

6. 세포내 ROS 측정

저온보존에 있어서 저온보존 기간의 생존성의 유지도 중요하지만, 보존 후의 재배양 시에 일어나는 세포사를 억제하는 것이, 보다 중요하다. 이러한, 저온보존·재배양 개시 후에 일어나는 세포사의 원인을 해명하기 위하여, 세포내 활성산소종(ROS)을 아미노페닐플루오레세인(Aminophenyl Fluorescein; APF)을 사용하여 측정했다. 상세하게는, 다음과 같이 하여 측정했다. 먼저, Aminophenyl Fluorescein(APF)(고료(五稜)화약)을, 최종농도 5μM가 되도록, 상기 「5.」와 동일하게 하여 3일간 냉장 보존한 후의 배지에 첨가하고, 이때, 37℃ 인큐베이터(5% CO₂, 5% O₂) 내에서 30분간에 걸쳐서 도입했다. 이 후에, 배지를 교환하는 동시에 Hoechst33342(Dojin)를 10μM 첨가하여 카운터 염색을 행한 후, 형광현미경으로 관찰하여, 사진 촬영했다. 각 세포의 형광 시그널은, 화상해석 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 정량(定量)했다.

이 결과를 도 4a에 나타낸다. 세포내 ROS 농도는 재배양 개시 90분 이내에 급상승하고, 그 후 서서히 저하되는 경향이 있는 것을 알았다.

7. 세포내 카스파제 활성의 측정

상기 「5.」와 동일하게 하여 3일간 냉장 보존한 후의 세포에 대하여, 아포토시스의 지표가 되는 세포내 카스파제 3/7의 활성을 측정했다. 먼저, CellEvent^TM Caspase-3/7 Green Detection Reagent(ThermoFisher)을 사용하여 프로토콜에 따라 염색했다. 그리고, 각 세포의 형광 시그널은, 화상해석 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 정량했다.

이 결과를 도 4b에 나타낸다. 아포토시스의 지표가 되는 Caspase-3/7 활성은 90분 후부터 서서히 상승하는 것을 알았다. 이 결과는, 저온보존·재배양 개시 시에, 세포내 활성산소종(ROS)이 일과적으로 상승함으로써 아포토시스를 유도하고 있는 것을 나타내고 있다.

8. 항산화물질 내지 라디칼 스캐빈저의 첨가 시험

HTM1에 항산화물질 내지 라디칼 스캐빈저를 다양한 농도로 첨가하고, 상기 「3.」과 같이 하여 냉장 보존 시험에 제공했다. 첨가한 항산화물질 내지 라디칼 스캐빈저는, 도 5a 및 이하와 같다. 트롤록스(Trx; Trolox, Wako), EGCG(Teavigo(등록상표), DSM), N-아세틸시스테인(NAC; N-acetyl cysteine, 도쿄화성), L-아스코르브산(AA; L-ascorbic acid, WAKO), 및 에다라본(3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazoline-5-one, Edaravone: Sigma).

도 5b에는, 도 2a∼2b와 동일하게 하여, 80% 생존율 유지 일수를 구하여 비교한 결과를 나타낸다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 가장 효과가 높았던 것은, 수용성 비타민 E 아날로그인 Trolox(5mM)의 첨가이며, 생존율을 UW액의 9.5배, HTM1 단독의 4.4배까지 연장하였으며, 약 20일간에 걸쳐 80% 이상의 생존율을 유지하였다(ST80: 20.11일). Trolox에 이어서, 강력한 라디칼 저해제로서 알려진 Edaravone의 효과가 높고, EGCG, N-아세틸시스테인(NAC; N-acetyl cysteine)에서, 그 다음으로 효과가 나타났다. Trolox와 협조적으로 작용하는 효과를 기대한 L-아스코르브산(AA; Ascorbic Acid)에는, 별로 효과가 나타나지 않았다. 이상의 결과로부터, 범용성이 높고 저가격으로 이용할 수 있는, Trolox의 첨가를 중심으로, 이후의 실험을 실시했다.

9. 트롤록스의 첨가 농도

생존성 유지 효과가 가장 높았던 트롤록스(Trolox)의 효과에 대하여, 첨가 농도를 0.1mM∼0.5mM로 변화시키고, 더욱 검토했다. 도 6a에는, 상기 도 2a의 경우와 동일하게 하여 얻은, 생존율의 경시 변화를, 도 2a에 중첩하는 형태로 나타낸다. 또한, 도 6b에는, 상기 도 2b 및 도 5b와 동일하게, 80% 생존율 유지 일수를 구한 결과를 나타낸다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 80% 생존율 유지 일수는, 대략, 트롤록스의 농도의 증대와 함께 증대하는 것을 알 수 있었다. 80% 생존율 유지 일수는, 무첨가 HTM1에 비교하여, 0.5mM 이상의 첨가로 유의하게 높은 값을 나타낸다.

다음으로, 냉장 보존·재배양 후의 증식능을 검증하기 위하여, 상기 「4.」와 동일하게, 6일간 냉장 보존한 세포를 파종하고, 배양 5일째의 콜로니 형성능을 비교했다. 도 6c에 나타낸 바와 같이, 상기 「4.」와 동일하게 평가한 콜로니 형성능도, Trolox의 농도에 의존하여 상승하는 것을 알 수 있었다. 가장 효과가 높았던 Trolox 5.0mM 첨가군의 콜로니 형성능은, HTM1 단독의 경우의 2.3배에 달하고, 냉장 보존하지 않고 있는 미보존 컨트롤의 41.2%에 달했다. 이 값은, 정법에 따라 -80℃의 프리저(freezer)에 넣어서 완만동결 보존한 것과 거의 동등한 값이었다. 이는, HTM1에 Trolox를 5mM 첨가함으로써, 6일간까지는 동결보존과 동등 이상의 증식능을 유지할 수 있는 것을 나타내고 있다.

9A. 비타민 E 및 비타민 E 유도체의 첨가의 비교

상기 「2.」에 기재된 HTM-alpha(UW액＋MEM-alpha, 2:1)로서, Trolox 및 GlutaMAX(등록상표, GIBCO)을 첨가하기 전의 것을 사용하여, 도 6a 및 도 2a의 경우와 동일한 수순에 의해, 토코페롤(비타민 E), 및 아세트산 토코페롤(비타민 E 유도체)을 첨가한 경우의 냉장 보존에서의 효과를 조사했다. 토코페롤, 아세트산 토코페롤을 Trolox와 동일하게 0.04mM∼5.0mM이 되도록 첨가하여 냉장 보존을 행하였다. 이 때, 수용성 비타민 E 아날로그인 Trolox 2.0mM을 첨가한 샘플에 대해서도 동시에 시험을 행하였다. 도 6d에는, 6일간 보존 후, 회복 배양 1일 후의 상대 생존율을, 정리하여 나타낸다. 이 결과에 의해, Trolox에 비교하면, 토코페롤(비타민 E), 아세트산 토코페롤 모두 냉장 보존에서의 효과가 낮은 것을 알았다.

10. 접착 상태에서의 냉장 보존(1)

상기 「1.」과 동일하게 하여 얻어진 인간 iPS 세포를 사용했다. 다만, 배양의 최후의 단계에서 상기 「1.」의 유지 배양보다 약간 옅은 농도(1.0E3/cm²)로 파종하여 배양하고, 이 파종의 다음날에, Y27362를 포함하지 않는 StemFit(등록상표)AK02N 배지로 교환하고 나서, 파종후 4일째에 배지를 제거했다.

다음으로, 냉장 보존용의 배지인 HTM1으로 교환하여 4℃ 조건 하에서 3일간 또는 6일간 정치 보존했다. 즉, 세포가, 서로 응집·접착하고, 또한 배양 용기에 접착한 상태로 3일간 또는 6일간의 냉장 보존을 행하였다. 이 냉장 보존용의 배지인 HTM1에는, Trolox를 5mM 첨가하여 사용하였다. 또한, 이와 같은 배지에, 아데닌염산염(Adenine Hydrochloride; 도쿄화성)을, 0mM, 1.4mM 및 4.1mM이 되도록, 각각 첨가하여 사용하였다. 그리고, 비교예의 냉장 보존 배지로서, UW액(BELZER UW(등록상표) COLD STORAGE SOLUTION)을 사용했다.

냉장 보존 후의 세포는, 냉장 보존 배지를 제거한 후, 배양용 배지로 가볍게 세정했다. 다음으로, StemFit(등록상표)AK02N 배지를 가하고, 4일간 배양했다. 이 배양의 종료의 시점에서, 효소적으로 (0.5X TrypLE(등록상표) Select를 사용하여) 세포를 박리하고, 분산시켜 살아있는 세포수를 계측했다. 그리고, 냉장 보존 개시 시의 세포수와 비교했다. 또한, 배양의 종료 및 개시의 시점에서의 위상차상을 촬영하고 나서, ImageJ로 화상 처리하여 콜로니 영역의 추출 2치화를 행하고, 콜로니 면적을 측정함으로써 증식능을 평가했다.

상기한 실험은, iPS 세포를 접착한 상태에서의 냉장 보존법의 개발을 목표로 한 것이며, 3일간 또는 6일간의 냉장 보존 후에, 4일간 배양함으로써, 증식능을 평가한 것이다. 실험의 결과를, 도 7a∼7f 및 도 8에 나타낸다. 도 7a∼7b는, 3일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양하여 얻어진 콜로니의 화상을 나타내고, 도 7c∼7d는, 6일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양하여 얻어진 콜로니의 화상을 나타낸다. 여기서, 도 7a 및 7c는, 위상차화상이며, 이들을 각각 2치화한 것이, 도 7b 및 7d다.

또한, 도 7e의 막대 그래프에는, 3일간 및 6일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양한 배지에서의, 콜로니의 면적 비율을 정리하여 나타낸다. 또한, 도 7f 및 도 8의 막대 그래프에는, 3일간 및 6일간의 냉장 보존 후에 4일간 재배양했을 때의 콜로니수의 증가율에 대하여, 냉장 보존하지 않고 4일간 배양한 비보존 컨트롤을 1로 한 비율로 나타낸다. 그리고, 도 8의 막대 그래프에는, 6일간 냉장 보존한 경우에 대하여, HTM1그대로(Trolox 등의 첨가없음), 및 HTM1에 Trolox를 8.2mM가 되도록 첨가한 냉장 배지를 사용한 실험 결과도 함께 나타낸다.

도 7a∼7d의 각각의 좌상 부분에 나타낸 바와 같이, UW액으로 냉장 보존한 경우에는, 3일간 또는 6일간의 냉장 보존 후의 재배양 시에, 거의 증식이 관찰되지지 않았다. HTM1에 Trolox 5mM 첨가한 냉장 보존 배지를 사용하여 3일간 냉장 보존한 경우, 도 7a∼7b의 각각의 우상 부분에 나타낸 바와 같이 상당한 증식이 관찰되고, 도 7f의 좌측 부분에 나타낸 바와 같이, 3일간 냉장 보존 후의 재배양에서의 세포증식율은, 비보존 컨트롤과, 거의 동등의 값을 나타내었다. 한편, HTM1에 Trolox 5mM 첨가한 냉장 보존 배지를 사용하여 6일간 냉장 보존한 경우, 도 7c∼7d의 각각의 우상 부분에 나타낸 바와 같이, 어느 정도의 증식이 관찰되며, 도 7f의 우측 부분에 나타낸 바와 같이 6일 냉장 보존 후에 재배양했을 때의 세포의 증식율은, 비보존 컨트롤의 10% 정도에 머물렀다.

한편, 도 7a∼7d의 각각의 좌화 및 우하 부분에 나타낸 바와 같이, HTM1에 Trolox 5mM과 함께, 아데닌을 더욱 첨가함으로써, 증식율을 상승시키는 것이 가능했다. 특히 도 8에 나타낸 바와 같이, 접착된 상태에 있는 세포를 6일간 냉장 보존한 경우, Trolox 5mM 첨가에 더하여 아데닌을 2.8mM 및 4.2mM 첨가함으로써, 재배양시의 증식율을 유의하게 상승시키는 것이 가능한 것을 알았다. 아데닌의 첨가에 의해, 4.2mM까지는 농도의 증대에 따른 증식율의 증대가 관찰되지만, 8.2mM 첨가로는 반대로 저하되는 것을 알았다.

11. 접착 상태에서의 냉장 보존(2)

상기 「2.」에 기재된 HTM-alpha(UW액＋MEM-alpha, 2:1)를 사용하여, 상기 「10.」과 동일한 조작에 의해, 접착 상태에서의 냉장 보존에 대하여 평가했다. 다만, 6일간이 아닌 7일간의 냉장 보존 후에 재배양하고 나서 평가했다. 여기서, HTM-alpha에는, 전술한 바와 같이, 5mM의 Trolox 및 5배 농도(x5; 10mM)의 GlutaMAX(등록상표, GIBCO)가 첨가되어 있다. 또한, HTM1 및 HTS FRS를, 동시에 동일한 조건에서 사용함으로써 비교했다. 그리고, HTM1에는, HTM-alpha와 동일하게, 5mM의 Trolox 및 5배 농도(x5; 10mM)의 GlutaMAX(등록상표, GIBCO)를 첨가하여 사용하였다.

이 결과를, 도 9의 그래프에 나타낸다. 도 9의 막대 그래프에서는, 도 7e 및 8과 동일하게, 냉장 보존하지 않고 4일간 배양한 비보존 컨트롤을 1로 한 비율로 나타내고 있다. 도 9의 그래프에 나타낸 바와 같이, 냉장 보존 배지로서 HTM-alpha(중앙의 것)을 사용한 경우, HTM1을 사용한 경우와 비교해도, 유의하게 높은 증식율을 나타내었다. 또한, 시판하고 있는 냉장 보존액인 HTS FRS를 사용한 경우와 비교하여, 훨씬 높은 증식율을 나타내었다.

이 결과로부터, StemFit(등록상표)AK02N의 C액에 포함되어 있는 섬유아세포증식 인자(FGF)는, 불필요하거나, 또는, 그다지 기여하지 않는 것으로 여겨진다. 또한, StemFit(등록상표)AK02N에 포함되는 성분 중, HTM-alpha에 포함되지 않는 것은, 필수적이지 않은 것으로 여겨진다. 특히, HTM-alpha가 무단백의 배지이므로, 단백질은, 필수적이지 않거나, 또는, 없는 편이 좋을 것으로 여겨진다.

12. 마우스 배아의 냉장 보존

전술한 바와 같이, 체외 수정 후 3.5일의 배반포기 배아를, 즉시, 그대로 사용하여, 냉장 보존 실험을 행하였다. 상세하게는, 이 배반포기 배아에 대하여, 배지를, 상기 「11.」에서 사용한 HTM-alpha, HTM1, 및 HTS FRS, 및 UW액으로 치환하고 나서, 플라스틱 튜브에 넣고, 4℃ 조건 하에서 정치하여 3일간(72시간) 보존했다. 그리고, 여기서의 HTM-alpha 및 HTM1은, 모두, 상기 「11.」과 동일하게, 5mM의 Trolox 및 5배 농도(x5; 10mM)의 GlutaMAX(등록상표)를 첨가한 것이다.

도 10에는, 2일간 더 배양을 행하고, 이 2일간의 배양 기간 중에 투명대를 탈출한 배아의 비율을 나타내었다. 도 10에는, 냉장 보존을 하지 않은 미보존 컨트롤(F_Control)에 대해서도 동일하게 냉장 보존 및 배양을 한 결과를, 함께 나타낸다.

도 10에 나타낸 바와 같이, HTM1 및 HTM-alpha에서는，모두 미보존 컨트롤(F_Control)과 동등한 탈출율을 나타내었으나, UW액 및 HTS FRS에서는，모두 유의하게 낮은 탈출율을 나타내었다.

다음으로, 도 7e∼7f와 동일하게로, 아데닌염산염(Adenine Hydrochloride; 도쿄화성)을 첨가하는 효과에 대하여 조사했다. 즉, 도 10의 실험과 동일한 조건에서, 아데닌염산염(Adenine Hydrochloride; 도쿄화성)을 각 농도가 되도록 첨가한 경우의, 투명대를 탈출한 배아의 비율을 구했다. 도 11에는, 좌측으로부터 순차적으로, 미보존 컨트롤(F_Control), 및 아데닌염산염을 1.4mM(1400μM), 140μM, 14μM 및 0μM이 되도록, 각각 첨가한 경우의 결과를 나타낸다. 도 11로부터 알 수 있는 바와 같이, 5일 및 7일간의 저온보존에 있어서는, 아데닌 농도가 14μM∼40μM(0.014∼0.14 mM)인 경우에, 비교적 높은 투명대 탈출율을 나타내었다.

13. 폴리비닐알코올(PVA; polyvinyl alcohol) 첨가의 효과

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, UW액에 5.0%의 하이드록시에틸스타치(HES; hydroxy ehyl starch)가 함유되어 있으므로, 상기 「2.」에 기재된 HTM-alpha(UW액＋MEM-alpha, 2:1)에는, 3.3%의 하이드록시에틸스타치(HES)가 포함되어 있다. 여기서는, 하이드록시에틸스타치(HES) 대신에, 폴리비닐알코올(PVA)을 첨가한 경우의 효과를 조사했다. 여기서는, 상기 표 1의 UW액의 조성으로부터, 하이드록시에틸스타치(HES)를 제거한 것을 사용하고, 그 외는 HTM-alpha(UW액＋MEM-alpha, 2:1)와 동일한 냉장 보존액으로서, 폴리비닐알코올(PVA)을 0.25%∼2.5% (중량)의 범위로 함유하는 것을 사용했다. 그리고, 상기한 도 6d의 경우와 동일하게 하여, 세포 생존성을 평가했다. 즉, 도 6a 및 도 2a의 경우와 동일한 수순에 의해, 폴리비닐알코올(PVA)에 의한 보호 효과를 조사했다. 이 때, 하이드록시에틸스타치(HES)의 농도를 5%(중량)로 한 샘플에 대해서도 동시에 시험을 행하였다. 도 12a에는, 6일간 보존 후, 회복 배양 1일 후의 상대 생존율을, 정리해서 나타낸다. 이 결과에 의해, 폴리비닐알코올(PVA)이, 어느 농도 범위에 있어서도, 5% 하이드록시에틸스타치(HES)와 동등한 보호 효과를 나타내는 것을 알았다. 그리고, 폴리비닐알코올(PVA)은, 하이드록시에틸스타치(HES)보다 저렴하며, 또한, 생체 조직에 대한 안전성도, 더욱 높은 것으로 여겨진다.

14. 만니톨(mannitol) 첨가의 효과

다음으로, 상기 「13.」과 동일하게 하여, 폴리비닐알코올(PVA)과 함께, 만니톨(mannitol)을 첨가하여 그 상승(相乘) 효과에 대하여 검증했다. 즉, HTM-alpha(UW액＋MEM-alpha, 2:1)로부터 하이드록시에틸스타치(HES)를 생략한 것에, 폴리비닐알코올(PVA)을 0.5%∼5%의 범위로 첨가하고 또한, 세포막 비투과성의 삼투압조정 효과를 가지는 것으로 여겨지는 만니톨(mannitol)를 0, 30, 60, 90 mM 첨가하여 사용하였다. 또한, 도 6a 및 도 2a의 경우와 동일한 수순에 의해, 보호 효과를 조사했다. 도 12b에는, 도 12a의 경우와 동일하게, 6일간 보존 후, 회복 배양 1일 후의 상대 생존율을, 정리해서 나타낸다. 도 12b의 결과에 의하면, 0.5%의 폴리비닐알코올(PVA)과 함께, 만니톨을 30mM∼90mM의 범위로 첨가하면, 하이드록시에틸스타치(HES)를 5% 농도로 함유하는 경우보다, 냉장 보존 후의 세포의 생존성이 높아지는 것을 알았다.

15. 실험 결과의 정리

UW액과, 시판하고 있는 임상연구용 배지 StemFit(등록상표)AK02N을 2/1로 혼합한 본원 실시형태의 세포 저온보존용 배지 HTM1을 사용한 경우, 도 1b및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 조직의 냉장 보존액으로서 널리 사용되고 있는 UW액에 비교하여, 인간 iPS 세포의 4℃ 저온보존에 있어서 생존성 유지 시간을 2배 정도 연장시키는 것을 가능하게 했다. 또한, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 6일간 냉장 보존하고 재배양한 후의 세포 증식능은, UW액의 약 7배까지 높일 수 있었다.

또한, HTM1에 항산화물질·라디칼 스캐빈저를 첨가함으로써, 냉장 보존 후, 재배양의 개시 시에 일어나는 ROS 농도의 급격한 상승을 억제하는 것이 가능하게 된 것으로 여겨지면, Trolox 5mM 첨가에서는, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 80% 생존율의 유지 기간을, 20일 이상으로, Trolox 첨가없음의 HTM1에 비교하여, 그 약 4배로 할 수 있었다. 또한, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 저온보존·재배양 후의 콜로니 형성율을 무첨가군의 약 2배까지 높이는 효과가 있는 것이 인정되었다.

한편, 접착 상태인 채로 저온보존을 행한 경우에는, 도 7a∼7f 및 도 8에 나타낸 바와 같이, Trolox 첨가에 더하여 Adenine의 첨가가, 그 후의 증식율을 높이는 것이 밝혀졌다.

또한, UW액과, MEM alpha를 혼합하여 얻어지는, 특히 바람직한 실시형태의 세포 저온보존용 배지 「HTM-alpha」(UW액＋MEM-alpha, 2/1)를 사용한 경우, 도 9에 나타낸 바와 같이, HTM1(UW액＋StemFit(등록상표)AK02, 2/1)보다 세포 증식능을 유지하는 효과가 큰 것으로 여겨진다.

iPS 세포의 냉장 보존 기술은, 냉동 보존에 비교하면 보존 기간은 한정되지만, 배양 상태(접착)인 채로의 보존이 가능한 점이나, 동결이 불가능한 분화 유도된 오르가노이드의 보존 및 수송, 혹은, 창약 연구에서의 온디맨드한 세포 공급 등, 응용 범위가 매우 높은 기술이다. 따라서, 인간 iPS 세포의 보존을 가능하게 한 본 기술은 매우 중요한 것이다.

본원 실시형태의 세포 저온보존용 배지 「HTM-alpha」는, 마우스 배아의 냉장 보존에 효과를 발휘하므로, 인간 및 각종 동물의 배아성, 또는 비배아성의 줄기세포나, 이것을 포함하는 조직의 냉장 보존에도 효과를 발휘할 것으로 여겨진다.

Claims

칼륨 이온종의 함량이 30∼80 mmoL/L이며, 나트륨 이온종의 함량이 30∼80 mmoL/L이며, 나트륨 이온종의 양은, 칼륨 이온종에 대한 이온 베이스의 몰비(Na^＋/K^＋의 비)로, 0.5∼1.3이며,
트롤록스(Trolox)를, 0.5∼8 mM의 농도로 함유하고,
아데닌 또는 그의 염 혹은 유도체를, 0.1∼4.2 mM의 농도로 함유하고,
필수아미노산에 대하여, 전부, 또는, 1종, 2종 또는 3종을 제외하고 전부 함유하고, 필수아미노산의 토탈 함량은, 50∼200 mg/L이며,
비필수아미노산의 토탈 함량이 50∼200 mg/L인, 인간 또는 동물의 줄기세포 또는 배아를 비동결 상태로 보존하기 위한 냉장 보존액.
(i) 락토비온산 또는 그의 염을 락톤 환산으로 30∼100 mmoL/L, (ii) 라피노스수화물 10∼30 mmoL/L, (iii) 알로퓨리놀 0.3∼1 mmoL/L, (iv) 글루타티온(토탈 글루타티온) 1∼3 mmoL/L, (v) 아데노신 2∼10 mmoL/L, (vi) 리포산 0.1∼0.5 μmoL/L, (vii) 피루브산나트륨 0.1∼0.7 mmoL/L, (viii) 글루코오스 1∼5 mmoL/L, (ix) 아스코르브산 0.03∼0.3 mmoL/L, 및 트롤록스(Trolox) 5∼8 mM, (x) 아데닌 또는 그의 염 혹은 유도체 0.1∼4.2 mM, (xi) 그 외의 비타민 또는 그의 수용성 아날로그·유도체, (xii) 필수아미노산을 토탈로 50∼200 mg/L, (xiii) 비필수아미노산을 토탈로 100∼500 mg/L, (xiv) 칼륨 이온종 30∼80 mmoL/L, 및 (xv) 나트륨 이온종 20∼90 mmoL/L를 포함하는 생리완충액이며, 나트륨 이온종의 양은, 칼륨 이온종에 대한 이온 베이스의 몰비(Na^＋/K^＋의 비)로, 0.5∼1.3이고, 상기 비타민은 폴산, 니코틴아미드(나이아신아미드), 리보플라빈, B12, 콜린, 이노시톨, 판토텐산, 피리독살인산, 티아민을 포함하는, 인간 또는 동물의 줄기세포 또는 배아를 비동결 상태로 보존하기 위한 냉장 보존액.
제1항에 있어서,
칼륨 이온종에 대한 이온 베이스의 몰비(Na^＋/K^＋의 비)가 1보다 작은, 냉장 보존액.
제1항에 있어서,
하이드록시에틸전분을 포함하지 않고, 폴리비닐알코올을 2.5∼25 g/L 포함하는, 냉장 보존액.
제4항에 있어서,
만니톨을 20∼100 mmoL/L 더 포함하는, 냉장 보존액.
제1항에 있어서,
L-알라닐-L-글루타민, 또는, 그 외의 디펩티드 대체품, 또는 그의 염을 2∼5 mM의 농도로 포함하는, 냉장 보존액.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 냉장 보존액 중에, 인간 또는 동물의 iPS 세포 혹은 그 외의 인공줄기세포, 그 외의 줄기세포, 이것으로부터 얻어지는 오르가노이드, 또는 배아를, 부유 또는 침지시키고, 2∼8 ℃에서, 1∼10 일 보존하는, 냉장 보존 방법.