KR102697956B1

KR102697956B1 - 항균성 아미노글리코사이드 유도체

Info

Publication number: KR102697956B1
Application number: KR1020217040773A
Authority: KR
Inventors: 동동 탕; 쯔강 황; 청 리; 찰스 지. 딩; 슈후이 천
Original assignee: 쭈어허 파마수티컬 그룹 코., 엘티디
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2024-08-21
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: JP7249438B2; EP3978506A1; UA127070C2; MX2021014544A; CN114026105A; AU2020285280B2; US12338263B2; WO2020239096A1; CA3142199C; EP3978506A4; CA3142199A1; JP2022534319A; US20220227802A1; CN114026105B; KR20220007688A; AU2020285280A1

Abstract

본 발명은 새로운 유형의 항균성 아미노글리코사이드 유도체, 및 이러한 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 및 이들이 박테리아 감염 관련 질환을 치료하는 약물의 제조에 있어서의 응용을 개시한다. 구체적으로 식 (II)로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이의 이성질체를 개시한다.
(II)

Description

항균성 아미노글리코사이드 유도체

[상호참조]

본 출원은 2019년 05월 30일자로 출원된 중국 출원 제 201910463155.1호 및 2020년 04월 16일자로 출원된 중국 출원 제 202010299506.2호로부터 우선권을 주장한다.

[기술분야]

본 발명은 약물 분야에 관한 것이고, 구체적으로 새로운 유형의 아미노글리코사이드 유도체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용 가능한 조성물, 및 이들이 박테리아 감염 관련 질환을 치료하는 약물의 제조에 있어서의 응용에 관한 것이다.

현대 의약품은 RNA를 결합하여 작동하는 새로운 소분자 경구 생체이용 약물의 개발에 특히 관심이 있다. DNA와 단백질 사이의 메신저로서 RNA는 한때 현저한 구조적 복잡성 없이 완전히 유연한 분자로 간주되었다. 최근 연구에 따르면 RNA의 구조는 놀라울 정도로 복잡합니다. RNA는 DNA와 같은 단순한 서열이 아니라 복잡한 구조를 가진 경쟁적인 단백질을 가지고 있다. 게놈 시퀀싱은 단백질과 단백질을 암호화하는 mRNA의 서열을 밝혀냈다. 단백질은 RNA 주형을 사용하여 합성되기 때문에 먼저 mRNA의 번역을 방해하여 단백질 생산을 방지함으로써 단백질을 억제할 수 있다. 단백질과 RNA 모두 잠재적인 약물 표적 부위이기 때문에 게놈 시퀀싱에 의해 밝혀진 표적의 수는 효과적으로 두 배가 되었다. 이러한 관찰은 제약 산업이 작은 분자를 사용하여 RNA를 표적으로 삼는 새로운 장을 열었다.

현대 생화학 및 분자 생물학 연구에 따르면 박테리아 리보솜의 30S 소단위(subunit)가 tRNA에 결합하는 것은 단백질 합성의 핵심 단계 중 하나이다. 지금까지 2개 이상의 박테리아(Thermus thermophiles 및 Escherichia coli)의 리보솜 30S 서브유닛의 결정 구조가 성공적으로 보고되었으며, 이들의 결정 구조로부터 tRNA에 결합하는 3개 부위, 즉 아미노아실 부위 A(Aminoacyl), 펩티딜 부위 P(Peptite) 및 E(Exit) 부위가 명확하게 구별될 수 있다. 아미노글리코사이드계 약물은 박테리아 리보솜의 30S 서브유닛의 16S rRNA 해독 영역의 A 부위에 특이적으로 결합하여 mRNA의 오역을 일으켜 단백질 합성을 방해하여 병원성 세균을 죽인다. 아미노글리코사이드계 약물은 매우 효과적인 광범위 항생제이며 가장 일반적으로 사용되는 항 감염 약물이다. 대부분의 아미노글리코사이드계 약물은 약동학 특성이 예상되며 다른 항감염 약물과 상승 작용을 하여 생명을 위협하는 감염의 치료에 탁월한 다양성을 제공할 수 있다. 지난 수십 년 동안 이러한 종류의 항생제의 많은 종류가 임상적으로 인기가 있었다.

아미노글리코사이드계 약물은 1944년 스트렙토마이신의 발견으로 시작되었으며, 이후 일련의 획기적인 화합물(카나마이신, 겐타마이신, 토브라마이신)을 성공적으로 출시되었으며 아미노글리코사이드계 약물은 그람 음성 박테리아 감염 치료에서 위치를 확립했다. 1970년대부터 1990년대에는 반합성 아미노글리코사이드계 항생제인 디베카신, 아미카신, 네틸마이신, 이세파마이신 및 에티마이신이 잇달아 등장하여 반합성 경로가 초기 항생제 내성균에 효과적이고 부작용이 적은 아미노글리코사이드계 항생제를 성공적으로 얻을 수 있음을 시사하였다. 그러나 아미노글리코사이드계 항생제의 개발 속도가 느려지고 있다. 동시에 사람들은 아미노글리코사이드계 약물에 대한 광범위한 기초 및 임상 연구를 수행했다. 특히, 그 살균 기전과 약제 내성 기전에 대한 연구는 이러한 종류의 항생제에 대한 이해를 심화시킬 뿐만 아니라, 연구 결과는 약물의 합리적인 임상 사용, 약물 내성균 감소, 약물 내성균에 대한 새로운 항내성균 아미노글리코사이드계 약물 설계에 대한 이론적 근거를 제공하였다.

아미노글리코사이드계 약물은 아미노당과 아미노시클로알코올을 산소 다리를 통해 연결하여 형성된 배당체(glycosides)이다. 스트렙토마이세스 유래 스트렙토마이신 등, 마이크로모나스 유래 겐타마이신 등과 같은 천연 아미노글리코사이드계 약물, 에티마이신, 아미카신 등과 같은 반합성 아미노글리코사이드계 약물이 있으며 모두 광범위한 항균제이다. 아미노글리코사이드계 약물은 민감한 호기성 그람 음성 간균에 의한 전신 감염에 주로 사용된다. 최근 몇 년간 다양한 세팔로스포린과 퀴놀론계 약물이 임상에서 널리 사용되고 있지만, 아미노글리코사이드계 약물은 녹농균, 페렴간균, 대장균과 같은 일반 그람 음성 간균에 대한 PAE가 더 길기 때문에, 호기성 그람 음성 박테리아에 의한 심각한 감염을 치료하는 데 여전히 사용된다.

임상에서 아미노글리코사이드계 약물의 장기간 및 대규모 사용으로 내약성 문제도 나타났고, 동시에 이독성 및 신독성과 같은 아미노글리코사이드계 약물의 일반적인 부작용도 아미노글리코사이드계 약물의 사용을 제한했다. 최근에는 3상 임상 연구를 마친 Achaogen 사에서 새롭게 개발된 Plazomicin(WO 2009067692)과 같이 기존의 항생제 내성 문제를 해결할 수 있는 약물 분자가 등장하고 있다.

본 발명은 에티마이신(etimicin), 아미카신(amikacin), 겐타마이신(gentamicin) 등과 같은 전통적인 항생제의 불활성화 효소에 대한 심각한 내약성 및 이독성과 신독성이 존재하는 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 종래 기술에 비해 더 간단한 합성 방법을 사용하여 더 넓은 항균 스펙트럼과 더 우수한 활성을 가진 새로운 아미노글리코사이드계 약물을 제조한다.

본 발명은 식 (II)로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 이성질체를 제공한다.

(II),

상기 식에서,

R'는 이고;

L은 -O-CH₂-CH₂- 또는 -CH₂-이며;

R₁은 H 또는 C_1-3 알킬이고;

R₂는 H, C_1-3 알킬 또는 이며,

상기 식에서, C_1-3 알킬은 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN, -NH₂ 또는 -NO₂로부터 독립적으로 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 임의로 치환되고;

R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H, -C(=O)-NH₂, -C(=O)-C_1-3 알킬 또는 C_1-3 알킬이며, 여기서 -C(=O)-C_1-3 알킬 및 C_1-3 알킬은 1, 2 또는 3개의 R에 의해 임의로 치환되고;

각 R은 독립적으로 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN 또는 -NH₂이다.

본 발명은 식 (I)로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 이성질체를 제공한다.

(I),

상기 식에서, R₁은 H 또는 C_1-3 알킬이고;

R₂는 H, C_1-3 알킬 또는 이며,

각 R은 독립적으로 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN 또는 -NH₂이다.

본 발명의 일부 해결수단에서, 상기 화합물은 식 (I-1)의 구조를 가진다.

(I-1),

상기 식에서, R_a, R_b 및 R₁은 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 R₁은 H 또는 -CH₃이고, 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 R₁은 H 이고, 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

본 발명의 일부 해결수단에서, 상기 화합물은 식 (I-2)의 구조를 가진다.

(I-2),

상기 식에서, R_a 및 R_b는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 각 R은 독립적으로 F 또는 Cl이고, 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 각 R은 독립적으로 F이고, 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H, -C(=O)-NH₂, -C(=O)-CH₃, -CH₃ 또는 -CH₂CH₃이고, 여기서 상기 -C(=O)-CH₃, -CH₃ 및 -CH₂CH₃은 1, 2 또는 3개의 R에 의해 임의로 치환되며, R 및 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H, -C(=O)-NH₂, -C(=O)-CH₃, -CH₃ 또는 -CH₂CH₃이고, 여기서 상기 -C(=O)-CH₃, -CH₃, -CH(R)₂, -CH₂CH₃또는 -CH₂CH(R)₂, R 및 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H 또는 이고, 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 R₂는 H, -CH₃, -CH₂CH₃ 또는 이고, 여기서 -CH₃ 및 -CH₂CH₃은 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN, -NH₂ 또는 -NO₂로부터 독립적으로 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 임의로 치환되며, R_a 및 R_b 및 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 R₂는 또는 이고, 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 상기 구조 단위 는 이고, 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

일부 해결 수단에서, 구조 단위 는 또는 이고, 다른 변수는 본 발명에 정의된 바와 같다.

본 발명의 일부 해결수단은 또한 상기 변수의 임의의 조합으로 이루어진다.

일부 해결 수단에서, 상기 화합물은

,

또는

이고.

본 발명은 활성 성분으로서 치료 유효량의 상기 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 이성질체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 더 제공한다.

본 발명은 상기 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 이성질체 및 상기 약학적 조성물이 박테리아 감염 관련 질환을 치료하는 약물의 제조에 있어서의 응용을 더 제공한다. 일부 해결 수단에서, 상기 박테리아는 카바페넴 내성 장내세균이다.

[기술효과]

본 발명은 보다 간단한 제조 방법으로 식 (II) 화합물 및 이의 이성질체를 합성하여, 새로운 유형의 아미노글리코사이드계 항생제를 획득하여, CRE(카바페넴 내성 장내세균)와 같은 슈퍼박테리아로 인한 약물 내성균 감염에 대항하도록 함으로써, 기존 항생제의 불활성화 효소에 대한 내약성 및 이독성과 신독성이 존재하는 문제를 해결한다. 아울러, 본 발명의 화합물은 항균 스펙트럼이 더 넓고, 활성이 더 우수하며, 세포 독성이 없다.

[정의 및 설명]

본문에서 사용되는 하기 용어 및 문구는 달리 명시되지 않는 한 다음과 같은 의미를 갖는다. 특정 용어나 문구는 특별한 정의가 없는 한 불확실하거나 불분명한 것으로 간주되어서는 안 되며, 일반적인 의미로 이해되어야 한다. 본문에 상품명이 표시되면 이에 대응되는 상품 또는 이의 활성 성분을 나타냄을 의미한다.

"약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 신뢰할 수 있는 의학적 판단의 범위 내에 있고 과도한 독성이나 자극, 과민 반응이 없거나 또는 기타 문제 또는 합병증이 합당한 이익/위험 비율에 상응하게 인간 및 동물 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 의미한다.

"약학적으로 허용 가능한 염"이라는 용어는 본 발명에서 발견된 특정 치환기를 갖는 화합물 및 비교적 무독성인 산 또는 염기로부터 제조된 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 본 발명의 화합물이 비교적 산성의 관능기를 함유하는 경우, 염기 부가염은 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충분한 양의 염기와 이런 화합물을 중성 형태로 접촉시켜 얻을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민 또는 마그네슘 염 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 비교적 염기성의 관능기를 함유하는 경우, 산 부가염은 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충분한 양의 산과 이런 화합물을 중성 형태로 접촉시켜 얻을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산 부가염의 구현예는 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 탄산수소염, 인산, 인산일수소, 인산이수소, 황산, 황산수소, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 무기산; 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 젖산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 시트르산, 타르타르산 및 메탄설폰산 등 유사한 산과 같은 유기산을 포함하고, 또한 아미노산(예: 아르기닌 등)의 염 및 글루쿠론산 등 유기산의 염을 더 포함한다. 본 발명의 일부 특정 화합물은 염기성 및 산성 관능기를 함유하기에, 임의의 염기 또는 산 부가염으로 전환될 수 있다.

본 발명의 약학적으로 허용 가능한 염은 산 또는 염기를 함유하는 모화합물로부터 통상적인 화학방법에 의해 합성될 수 있다. 이러한 염은 일반적으로 물 또는 유기 용매 또는 이 둘의 혼합물에서 유리 산 또는 염기 형태의 이러한 화합물을 화학양론적으로 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조된다.

본 발명의 화합물은 특정한 기하학적 또는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 호변이성질체, 시스 및 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)- 거울상 이성질체, (R)- 및 (S)- 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, (D)- 이성질체, (L)- 이성질체, 및 이들의 라세미 혼합물 및 기타 혼합물, 예를 들어 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체가 풍부한 혼합물일 수 있고, 이러한 모든 혼합물은 본 발명의 범위에 속한다. 알킬 등 치환기에는 추가로 비대칭 탄소 원자가 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 및 이들의 혼합물은 본 발명의 범위에 포함된다.

달리 명시되지 않는 한, "거울상 이성질체"또는 "광학 이성질체"라는 용어는 서로 거울상인 입체 이성질체를 지칭한다.

달리 명시되지 않는 한, "시스-트랜스 이성질체" 또는 "기하학적 이성질체"라는 용어는 이중 결합 또는 고리를 형성하는 탄소 원자의 단일 결합으로 인해 자유롭게 회전할 수 없기 때문에 발생한다.

달리 명시되지 않는 한, "부분입체 이성질체"라는 용어는 분자가 2개 이상의 키랄 중심을 갖고 분자 간이 거울상 관계에 있지 않는 입체 이성질체를 의미한다.

달리 명시되지 않는 한, "(D)"또는 "(+)"는 우회전을 의미하고 "(L)" 또는 "(-)"는 좌회전을 의미하며 "(DL)" 또는 "(±)"는 라세미를 의미한다.

달리 명시되지 않는 한, 쐐기 모양의 실선 결합()과 쐐기 모양의 점선 결합()을 사용하여 입체 중심의 절대 구성을 나타내고, 직선 실선 결합()과 직선 점선 결합()을 사용하여 입체 중심의 상대 구성을 나타내며, 물결선()을 사용하여 쐐기 모양의 실선 결합() 또는 쐐기 모양의 점선 결합()을 나타내고, 또는 물결선()을 사용하여 직선 실선 결합()과 직선 점선 결합()을 나타낸다.

본 발명의 화합물은 특이적일 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "호변이성질체"또는 "호변이성질체 형태"라는 용어는 상이한 관능기의 이성질체가 실온에서 동적 평형 상태에 있고 서로 빠르게 전환될 수 있음을 의미한다. 호변 이성질체가 가능한 경우(예: 용액에서), 호변 이성질체의 화학적 평형에 도달할 수 있다. 예를 들어, 양성자 호변 이성질체(proton tautomer)(양성자 전이성 호변 이성질체(prototropic tautomer)라고도 함)는 케토-엔올 이성질체화 및 이민-엔아민 이성질체화와 같은 양성자 이동을 통한 상호 전환을 포함한다. 원자가 이성질체(valence tautomer)는 상호 변환을 수행하기 위해 결합 전자의 일부 재조합을 포함한다. 그 중, 케토-엔올 호변이성질체화의 구체적인 예는 펜탄-2,4-디온과 4-히드록시펜탄-3-엔-2-온 사이의 상호전환이다.

달리 명시되지 않는 한, "하나의 이성질체가 풍부한", "이성질체가 풍부한", "하나의 거울상 이성질체가 풍부한" 또는 "거울상 이성질체가 풍부한"이라는 용어는 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 100 % 미만인 것을 의미한다. 그리고 상기 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량은 60 % 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80 % 이상, 또는 90 % 이상, 또는 95% 이상, 또는 96% 이상, 또는 97% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상, 또는 99.5% 이상, 또는 99.6% 이상, 또는 99.7% 이상, 또는 99.8% 또는 99.9% 이상이다.

달리 명시되지 않는 한, "이성질체 과잉" 또는 "거울상 이성질체 과잉"이라는 용어는 2개의 이성질체 또는 2개의 거울상 이성질체의 상대 백분율 간의 차이를 지칭한다. 예를 들어, 한 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 90 %이고 다른 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 10 %인 경우, 이성질체 또는 거울상 이성질체 과잉(ee 값)은 80 %이다.

광학 활성 (R)- 및 (S)-이성질체 및 D 및 L 이성질체는 키랄 합성 또는 키랄 시약 또는 기타 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물의 거울상 이성질체를 얻고자 한다면, 비대칭 합성 또는 키랄 보조제를 사용한 유도체화에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 생성된 부분입체 이성질체 혼합물은 분리되고 보조 그룹은 절단되어 순수한 원하는 거울상 이성질체를 제공한다. 또는 분자가 염기성 관능기(예: 아미노기) 또는 산성 관능기(예: 카르복실기)를 포함하는 경우, 적절한 광학 활성 산 또는 염기와 부분입체 이성질체 염을 형성한 다음 통상적인 방법에 의해 부분입체 이성질체의 분리를 수행하여 회수를 거쳐 순수한 거울상 이성질체를 얻었다. 또한, 거울상 이성질체와 부분입체 이성질체의 분리는 일반적으로 크로마토그래피에 의해 수행된다. 크로마토그래피는 키랄 고정상을 사용하고 선택적으로 화학적 유도체화와 결합된다(예: 아민으로부터 카바메이트 생성). 본 발명의 화합물은 상기 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에 비천연 비율의 원자 동위원소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 삼중수소(³H), 요오드-125(¹²⁵I) 또는 C-14(¹⁴C)와 같은 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 또 다른 예를 들어, 중수소는 수소를 대체하여 중수소화 약물을 형성할 수 있다. 중수소와 탄소의 결합은 일반 수소와 탄소의 결합보다 견고하여, 비중수소화 약물에 비해 중수호화 약물은 독성 및 부작용 감소, 약물 안정성 증가, 약효 향상, 생물학적 반감기 연장 등의 장점이 있다. 방사성 여부에 관계없이 본 발명의 화합물의 동위원소 조성의 모든 변환은 본 발명의 범위에 포함된다. "선택적" 또는 "선택적으로"는 후술하는 사건 또는 조건이 발생할 수 있으나 반드시 발생하지는 않는 것을 의미하며, 해당 설명에는 사건 또는 조건이 발생하거나 발생하지 않는 상황이 모두 포함된다.

약물 또는 약리학적 활성제의 경우, "유효량" 또는 "치료 유효량"이라는 용어는 무독성이지만 원하는 효과를 달성할 수 있는 약물 또는 제제의 충분한 양을 지칭한다. 본 발명의 경구 제형의 경우, 조성물 중 하나의 활성 물질의 "유효량"은 상기 조성물 중 다른 활성 물질과 병용될 때 원하는 효과를 달성하는 데 필요한 복용양을 지칭한다. 유효량의 결정은 사람마다 다르고 대상자의 연령과 일반적인 상태에 따라 다르며 또한 특정 활성 물질에 따라 다르고, 개별적인 케이스에서 적절한 유효량은 통상적인 실험에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.

"활성 성분", "치료제", "활성 물질" 또는 "활성제"라는 용어는 표적 장애, 질환 또는 병증을 효과적으로 치료할 수 있는 화학 물질을 지칭한다.

"치환된"이라는 용어는 특정 원자의 임의의 하나 이상의 수소 원자가 치환기로 대체됨을 의미하며, 특정 원자의 원자가가 정상이고 치환된 화합물이 안정한 한 중수소 및 수소 변이체를 포함할 수 있다. 치환기가 산소(즉, =O)인 경우, 두 개의 수소 원자가 대체됨을 의미한다. 방향족 그룹에서는 산소 치환이 일어나지 않는다. "임의로 치환된"이라는 용어는 치환 또는 비치환될 수 있음을 의미하며, 달리 명시되지 않는 한, 치환기의 종류 및 개수는 화학적으로 구현될 수 있는 것을 기준으로 임의적일 수 있다.

임의의 변수(예: R)가 화합물의 구성 또는 구조에서 한 번 이상 발생하는 경우, 각 경우의 정의는 독립적이다. 따라서, 하나의 그룹이 0-2개의 R로 치환되는 경우, 그룹은 최대 2개의 R로 임의로 치환될 수 있으며, R은 각각의 경우에 독립적인 옵션을 갖는다. 또한, 치환기 및/또는 이의 변이체의 조합은 해당 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용된다.

-(CRR)₀-와 같이 연결기의 수가 0인 경우, 해당 연결기가 단일 결합임을 의미한다.

하나의 변수가 단일 결합으로부터 선택될 경우, 연결된 두 그룹이 직접 연결됨을 의미하며, 예를 들어 A-L-Z에서 L이 단일 결합을 나타내는 경우 해당 구조가 실제로 A-Z임을 의미한다.

치환기가 비어 있다는 것은 치환기가 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, A-X의 X가 비어 있으면 해당 구조가 실제로 A임을 의미한다. 열거된 치환기에서 치환기에 연결된 원자를 지정하지 않는 경우, 이러한 치환기는 임의의 원자를 통해 결합될 수 있다. 예를 들어, 피리딜기는 치환기로서 피리딘 고리 중 어느 하나의 탄소 원자를 통해 치환될 그룹에 연결될 수 있다.

나열된 연결기가 연결 방향을 지정하지 않는 경우 연결 방향은 임의적이다. 예를 들어 에서 연결기 L은 -M-W-이고, 이때 -M-W-는 왼쪽에서 오른쪽으로 읽는 순서와 같은 방향으로 고리 A와 고리 B를 연결하여 를 구성하거나, 반대방향으로 고리 A와 고리 B를 연결하여 를 구성하는 것도 가능하다. 연결기, 치환기 및/또는 이의 변이체의 조합은 이러한 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용된다.

달리 명시되지 않는 한, 용어 "C_1-6 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 나타내기 위해 사용된다. C_1-6 알킬에는 C_1-5, C_1-4, C_1-3, C_1-2, C_2-6, C_2-4, C₆ 및 C₅ 알킬 등이 포함되며, 1가(예: 메틸), 2가 (예: 메틸렌) 또는 다가(예: 메틴)일 수 있다. C_1-6 알킬의 예에는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(n-프로필 및 이소프로필 포함), 부틸(n-부틸, 이소부틸, s-부틸 및 t-부틸 포함), 펜틸(n-펜틸, 이소펜틸 및 네오펜틸 포함), 헥실 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

달리 명시되지 않는 한, 용어 "C_1-3 알킬"은 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 나타내기 위해 사용된다. C_1-3 알킬에는 C_1-2 및 C_2-3 알킬 등이 포함되며, 1가(예: 메틸), 2가(예: 메틸렌) 또는 다가(예: 메틴)일 수 있다. C_1-3 알킬의 예에는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(n-프로필 및 이소프로필 포함) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

"이탈기"라는 용어는 치환 반응(예: 친핵성 치환 반응)을 통해 다른 관능기 또는 원자로 치환될 수 있는 관능기 또는 원자를 의미한다. 대표적인 이탈기에는 트리플루오로메탄술포네이트; 염소, 브롬 및 요오드; 메실레이트, 토실레이트, p-브로모벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트 등과 같은 술포네이트기; 아세톡시, 트리플루오로아세톡시 등과 같은 아실옥시 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

"보호기"라는 용어는 "아미노 보호기", "히드록시 보호기" 또는 "티올 보호기"를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 용어 "아미노 보호기"는 아미노 질소 위치에서 부반응을 방지하기에 적합한 보호기를 의미한다. 대표적인 아미노 보호기에는 포르밀; 알카노일(예: 아세틸, 트리클로로아세틸 또는 트리플루오로아세틸)과 같은 아실; tert-부톡시카르보닐(Boc)과 같은 알콕시카르보닐, 벤질옥시카르보닐(Cbz) 및 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)과 같은 아릴메틸옥시카르보닐; 벤질(Bn), 트리틸(Tr), 1,1-디(4'-메톡시페닐)메틸과 같은 아릴메틸; 트리메틸실릴(TMS) 및 tert-부틸디메틸실릴(TBS) 등과 같은 실릴이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 용어 "히드록실 보호기"는 히드록실기의 부반응을 방지하기에 적합한 보호기를 의미한다. 대표적인 히드록시 보호기로는 메틸, 에틸 및 tert-부틸과 같은 알킬; 알카노일(예: 아세틸)과 같은 아실; 벤질(Bn), p- 메틸옥시벤질(PMB), 9-플루오레닐메틸(Fm) 및 디페닐메틸(디페닐메틸, DPM)과 같은 아릴메틸; 트리메틸실릴(TMS) 및 tert-부틸 디메틸실릴(TBS) 등과 같은 실릴이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 화합물은 하기 열거된 특정 실시양태, 이들을 다른 화학적 합성 방법과 조합하여 형성된 실시양태, 및 당업자에게 널리 공지된 동등한 대안을 포함하는 당업자에게 널리 공지된 다양한 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 실시예는 본 발명의 실시예를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용매는 상업적으로 입수 가능하다.

본 발명에서, CFU는 콜로니 수를 나타내고, Boc는 tert-부톡시카르보닐을 나타내고, MIC는 최소 저지 농도를 나타낸다.

도 1은 마우스 허벅지 근육 모델(장내세균 ATCC-25922)에서 화합물 1(용량 30 mpk) 및 플라조미신(Plazomicin)(용량 30 mpk)의 생체내 약효 데이터이다.
도 2는 마우스 폐렴 모델(폐렴간균(Klebsiella Pneumoniae) ATCC-BAA-1705)에서 화합물 1(용량 10 mpk 및 30 mpk), 플라조미신(용량 10 mpk 및 30 mpk) 및 메로페넴(용량 100 mpk)의 생체내 약효 데이터이다.
도 3은 복합 활동 전위 진폭 변화를 보여주고, 고정 주파수 32 kHz에서 화합물 1, 겐타마이신 및 플라조미신의 CAP 진폭의 서로 다른 강도의 변화를 보여준다.
도 4는 복합 활동 전위 진폭 변화를 보여주고, 고정 주파수 16 kHz에서 화합물 1, 겐타마이신 및 플라조미신의 CAP 진폭의 서로 다른 강도의 변화를 보여준다.
도 5는 복합 활동 전위 진폭 변화를 보여주고, 클릭음(Click) 시 화합물 1, 겐타마이신 및 플라조미신의 CAP 진폭의 서로 다른 강도의 변화를 보여준다.
도 6은 달팽이관 유모세포 손상 상황이고, 그중 A는 화합물 1, 겐타마이신 및 플라조미신이 내유모세포에 대한 손상 상황이며; B는 화합물 1, 겐타마이신 및 플라조미신이 외유모세포에 대한 손상 상황이다.
도 7은 화합물 1, 겐타마이신 및 플라조미신이 일으키는 나선 신경절 세포 밀도의 변화이다.
도 8은 플라조미신이 HK-2 세포에 대한 독성 회귀 곡선이다.
도 9는 화합물 1이 HK-2 세포에 대한 독성 회귀 곡선이다.
도 10은 네틸마이신이 HK-2 세포에 대한 독성 회귀 곡선이다.
도 11은 아미카신이 HK-2 세포에 대한 독성 회귀 곡선이다.

하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명에 불리한 제한을 가하려는 것은 아니다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 특정 실시예에 다양한 변경 및 개선이 이루어질 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 화합물 1

단계 1:

디페닐포스피닐히드록실아민(10 g, 42.88 mmol, 1 eq) 및 화합물 1-1(13.65 g, 128.64 mmol, 12.19 mL, 3 eq)과 나트륨 tert-부톡사이드(4.95 g, 51.46 mmol, 1.2 eq)를 테트라히드로퓨란(100 mL)에 용해시키고, 5-15 ℃ 조건에서 교반하면서 16 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 여과하고 여과액을 농축하여 화합물 1-2를 얻었다.

단계 2:

이전 단계에서 얻은 화합물 1-2(5.19 g, 42.84 mmol, 1 eq)의 테트라히드로퓨란(100 mL)　용액과 N,N-비스-BOC-1H-피라졸-1-카르복스아미딘(13.30 g, 42.84 mmol, 1 eq)을 66 ℃에서 교반하면서 16 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 실온으로 냉각시키고, 물(300 mL)을 추가하고 에틸 아세테이트(100 mL×2)로 추출하였다. 유기상을 합하고 황산나트륨으로 건조하고 여과한 후, 여과액을 농축하여 조생성물을 얻었다. 컬럼크로마토그래피(실리카, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 20/1, 1/1(v/v))에 통과시켜 화합물 1-3을 얻었다.

단계 3:

화합물 1-3(1 g, 2.75 mmol, 1 eq)과 2-요오독시벤조산(847.59 mg, 3.03 mmol, 1.1 eq)을 디메틸 설폭사이드(10 mL)에 용해시키고, 반응액을 40 ℃에서 교반하면서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 여과하고, 여과액에 물(40 mL)을 추가하고 tert-부틸 메틸 에테르(20 mL×2회)로 추출하였다. 유기상을 합하고 포화 티오황산나트륨(10 mL)으로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 화합물 1-4를 얻었다.

단계 4:

앰버라이트(이온 교환 수지) IRA-402(OH)(500 g)를 메탄올(500 mL)에 첨가하고, 이 용액을 20 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 메탄올(500 mL)에 첨가한 후, 화합물 1-5를 이 혼합액에 넣고, 혼합물을 20 ℃에서 11 시간 동안 교반하였다. 반응 과정에서, 화합물 1-5이 용해되었다. 반응액을 여과하고 여과액을 농축하여 화합물 1-6을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 448.4(M+1).

단계 5:

화합물 1-6(15 g, 33.52 mmol, 1 eq)을 메탄올(150 mL)에 용해시키고, S-에틸2,2,2-트리플루오로에틸티오에스테르(4.24 g, 26.82 mmol, 0.8 eq)의 메탄올(150 mL) 용액을 상기 메탄올 용액에 적가하며, 혼합액을 20 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 아연 아세테이트(14.72 g, 80.44 mmol, 2.4 eq)를 용액에 첨가하고, (N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미도)-tert-부틸 에스테르(16.85 g, 60.33 mmol, 1.8 eq) 및 트리에틸아민(10.17 g, 100.55 mmol, 14.00 mL, 3 eq)의 테트라히드로퓨란(170 mL) 용액을 혼합액에 적가하였다. 반응액을 20 ℃에서 30 시간 동안 교반하였다. 반응액을 글리신(7 g)으로 ??칭한 다음 농축하였다. 디클로로메탄(1000 mL)으로 농축 용액을 희석하고, 각각 암모니아 수용액(300 mL)(물:암모니아수=7:3)로 2번 세척하며, 유기상을 농축하였다. 조생성물을 컬럼크로마토그래피법(실리카, 디클로로메탄/메탄올=50/1~5/1(v/v), 소량 암모니아수를 포함)으로 정제하여 화합물 1-7을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 744.3(M+1).

단계 6:

(2S)-4-(tert-부틸옥시카르보닐아미노)-2-히드록시-부티르산(6.85 g, 31.26 mmol, 1.5 eq)을 N,N-디메틸포름아미드(150 mL)에 용해시키고, 용액에 N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디이미드(5.60 g, 31.26 mmol, 1.5 eq) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드(4.85 g, 31.26 mmol, 5.53 mL, 1.5 eq)를 첨가하였다. 반응액을 20 ℃에서 2 시간 동안 교반한 후, 화합물 1-7(15.5 g, 20.84 mmol, 1 eq)을 반응액에 넣고, 반응액을 20 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 이어서 물(200 mL)로 희석하고, 각각 에틸 아세테이트(50 mL×3)로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 식염수(100 mL)로 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조하고 여과하며, 여과액을 농축하여 혼합물을 얻었다. 혼합물을 컬럼크로마토그래피(실리카, 디클로로메탄/메탄올=50/1~10/1(v/v))로 정제하여 화합물 1-8을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 945.5(M+1).

단계 7:

화합물 1-8(16.40 g, 17.35 mmol, 1 eq), 디-tert-부틸 디카보네이트(4.55 g, 20.83 mmol, 4.78 mL, 1.2 eq), DIEA(2.69 g, 20.83 mmol, 3.6 mL, 1.2 eq)를 테트라히드로퓨란(170 mL)에 용해시키고, 질소 가스 3번 교체 후, 반응액을 20 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 물(200 mL)을 추가하여 희석한 후 디클로로메탄(100 mL×2)으로 추출하고, 합한 유기상을 순차적으로 0.1M 염산(20 mL) 및 포화 식염수(60 mL)로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 여과액을 농축하여 고체 혼합물을 얻고, 혼합물을 컬럼크로마토그래피(실리카, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 15/1~0/1(v/v))로 정제하여 목적 화합물 1-9을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 1045.3(M+1).

단계 8:

화합물 1-9(15.00 g, 14.35 mmol, 1 eq) 및 암모니아수(63.70 g, 1.82 mol, 70 mL, 126.62 eq)를 메탄올(80 mL)에 용해시키고, 혼합액을 20 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응액을 농축하여 용매를 제거하고, 물(100 mL)을 추가하여 희석한 후, 디클로로메탄(100 mL×3회)으로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 식염수(200 mL)로 세척한 후, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 여과액을 농축하여 얻은 혼합물은 컬럼크로마토그래피(실리카, 먼저 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1~0/1(v/v)를 사용한 후 디클로로메탄/메탄올=6/1(v/v)을 사용, 용리제는 소량 암모니아수를 포함)로 정제하여 화합물 1-10을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 949.3(M+1).

단계 9:

화합물 1-4(50.63 mg, 0.15 mmol) 및 화합물 1-10(145.00 mg, 0.15 mmol)을 메탄올(5.00 mL)에 용해시키고, 4A 분자체(0.5 g)를 넣고, 질소 분위기, 18 ℃에서 0.5 시간 동안 교반한 다음, 나트륨 시아노보로하이드라이드(19.20 mg, 0.30 mmol)를 추가하고 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응 종료를 검출하고, 여과하고 농축하며 제조용-HPLC(Phenomenex Synergi C18 150×25mm×10㎛; 이동상: [물(0.225 % 포름산)-아세토니트릴]; 아세토니트릴 %: 60 % ~ 90 %, 10 min)로 분리하여 화합물 1-11을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 1294.7(M+1).

단계 10:

화합물 1-11(91.00 mg, 71.97 μmol)을 무수디클로로메탄(2.00 mL)에 용해시키고, 질소 분위기 보호 하에 0 ℃로 냉각하고 트리플루오로아세트산(1.54 g, 13.51 mmol)을 첨가하고, 0-19 ℃에서 9 시간 동안 교반하였다. 상온에서 농축하고 아세토니트릴/tert-부틸 메틸 에테르(4 mL, 1/3)로 비팅(beating)하며, 여과하고 농축하여 화합물 1을 얻었다.

¹H NMR(400 MHz, D₂O) δ(ppm): 5.62(s, 1H), 5.24(s, 1H), 5.08(s, 1H), 4.09-4.06(m, 1H), 3.98-3.96(m, 2H), 3.94-3.93(m, 5H), 3.77-3.73(m, 4H), 3.24(s, 1H), 3.22-3.10(m, 6H), 2.83(s, 3H), 2.61-2.14(m, 2H), 2.04-2.14(m, 6 H), 1.26(s, 3H); LCMS (ESI) m/z: 664.5(M+1).

실시예 2: 화합물 2

단계 1:

화합물 2-1(1 g, 12.19 mmol, 71.94μL, 1.2 eq), N,N-비스-BOC-1H-피라졸-1-카르복스아미딘(3.15 g, 10.16 mmol, 1 eq) 및 트리페닐포스핀(3.20 g, 12.19 mmol, 1.2 eq)을 테트라히드로퓨란(40 mL)에 용해시키고, 0 ℃에서 DIAD(2.46 g, 12.19 mmol, 2.37 mL, 1.2 eq)를 적가한 후, 20 ℃로 가열하여 12 시간 동안 교반하였다. 반응액에 물(100 mL)을 추가한 후 에틸 아세테이트(50 mL, 3회)로 추출하고, 합한 유기상을 물(30 mL, 3회)로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 조생성물을 얻고, 조생성물을 크로마토그래피 컬럼(실리카, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 20/1(v/v))으로 정제하여 화합물 2-2를 얻었다.

단계 2:

화합물 1-2(2.1 g, 17.34 mmol, 1 eq)을 테트라히드로퓨란(50 mL)에 용해시키고, 20 ℃에서 화합물 2-2(3.25 g, 8.67 mmol, 0.5 eq)을 추가하여, 반응액을 67 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응액에 물(100 mL)을 추가하고, 에틸 아세테이트(50 mL×3)로 추출하고, 합한 유기상을 물(30 mL, 3회)로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 조생성물을 얻고, 조생성물을 크로마토그래피 컬럼(실리카, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1(v/v))으로 정제하여 화합물 2-3을 얻었다.

단계 3:

화합물 2-3(150 mg, 350.93 μmol, 1 eq)을 디메틸 설폭사이드(3 mL)에 용해시키고, 40 ℃에서 2-요오독시벤조산(108.09 mg, 386.02 μmol, 1.1 eq)을 첨가하며, 반응액을 40 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응액에 포화 중탄산나트륨/티오황산나트륨(30 mL,(v/v))을 넣고, 에틸 아세테이트(20 mL×2)로 추출하고, 합한 유기상을 포화 중탄산나트륨/티오황산나트륨(10 mL×3회(1/1, v/v))로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 화합물 2-4를 얻었다.

단계 4:

화합물 1-10(239.32 mg, 252.16 μmol, 1 eq)을 1,2-디클로로에탄(2 mL)에 용해시키고, 20 ℃에서 화합물 2-5(118 mg, 277.37 μmol, 1.1 eq) 및 4A 분자체(300 mg)를 넣고 1 시간 동안 교반한 후 나트륨 보로하이드라이드(64.13 mg, 302.59 μmol, 1.2 eq)를 추가하고, 반응액을 20 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응액에 물(20 mL)을 추가하고, 디클로로메탄(20 mL×3)으로 추출하고, 합한 유기상을 물(10 mL×3)로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 조생성물을 얻고, 제조용 HPLC(컬럼: Phenomenex Synergi C18 150×25 mm×10㎛; 이동상: [물(0.225 % 포름산)-아세토니트릴]; 아세토니트릴 %: 35 % ~ 56 %, 7 min)로 정제하여 화합물 2-6을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 1358.7(M+1).

단계 5:

화합물 2-8(40 mg, 29.44 μmol, 1 eq)을 디클로로메탄(1 mL)에 용해시키고, 0 ℃에서 트리플루오로아세트산(1.54 g, 13.51 mmol, 1 mL, 458.70 eq)을 추가한 후 20 ℃로 가열하고 2 시간 동안 교반하였다. 반응액을 0 ℃로 냉각하고 tert-부틸 메틸 에테르(15 mL)를 추가하고 여과한 후, tert-부틸 메틸 에테르(2 mL×3)로 세척한 후 오일 펌프로 40 ℃에서 건조하여 화합물 2를 얻었다.

¹H NMR(400 MHz, D₂O) δ=6.18-5.87(m, 1H), 5.63(s, 1H), 5.28-5.22(m, 1H), 5.08(d, J=3.8 Hz, 1H), 4.23-4.16(m, 1H), 4.09-4.03(m, 3H), 3.98-3.89(m, 2H), 3.83(br t, J=5.2 Hz, 1H), 3.79-3.68(m, 8H), 3.46-3.38(m, 1H), 3.33(br d, J=13.0 Hz, 1H), 3.26-3.22(m, 2H), 3.16-3.07(m, 2H), 2.83(s, 3H), 2.69-2.55(m, 1H), 2.42-2.28(m, 1H), 2.19-2.06(m, 2H), 1.95-1.85(m, 1H), 1.83-1.71(m, 1H), 1.29-1.23(m, 3H).

LCMS (ESI) m/z: 758.3(M+1).

실시예 3: 화합물 3

단계 1:

화합물 3-1(16.00 g, 115.12 mmol)을 아세토니트릴(200.00 mL)에 용해시키고, 순차적으로 N-BOC-히드록실아민(15.33 g, 115.12 mmol) 및 DBU(19.28 g, 126.63 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 11 ℃ ~ 25 ℃에서 16 시간 동안 반응시킨 후 농축하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(350 mL)로 희석하고, 물(100 mL×3)로 세척하며, 포화 식염수(100 mL)로 1번 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하며, 잔류물을 컬럼크로마토그래피(충진물: 실리카겔 파우더, 용리제: 에틸 아세테이트/석유 에테르=0-1/1(v/v))로 분리하여 화합물 3-2를 얻었다.

단계 2:

화합물 3-2(1.00 g, 5.23 mmol) 및 염화수소의 디옥산 용액(10 mL,4 mmol)을 혼합하고 20 ℃에서 16 시간 동안 교반한 후, 감압 농축하여 화합물 3-3을 얻었다.

단계 3:

화합물 3-3(581.27 mg, 6.38 mmol) 및 비스Boc피라졸구아니딘(1.80 g, 5.8 mmol)을 테트라히드로퓨란(20 mL)에 용해시키고 트리에틸아민(1 mL)을 추가하고, 80 ℃에서 용액을 16 시간 동안 교반하여 LCMS로 반응 종료를 검출하였다. 이 혼합물을 물(100 mL)에 넣고, 에틸 아세테이트(100 mL×3)로 희석하고 추출하였다. 포화 식염수(30 mL)로 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하였다. 잔류물을 컬럼크로마토그래피(충진물: 실리카겔 파우더, 용리제: 에틸 아세테이트/석유 에테르=50/1-20/1(v/v))로 분리하여 화합물 3-4를 얻었다.

단계 4:

화합물 3-4(0.40 g, 1.50 mmol)를 디메틸 설폭사이드(5.00 mL)에 용해시키고, 2-요오독시벤조산(0.34 g, 1.2 mmol)을 추가하고, 질소 분위기, 40 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하고, 물(50 mL×2) 및 포화 식염수(50 mL)로 세척 및 농축하며, 잔류물을 컬럼크로마토그래피(충진물: 실리카겔 파우더, 용리제: 에틸 아세테이트/석유 에테르=0-1/1)로 분리하여 화합물 3-5를 얻었다.

단계 5:

화합물 3-5(50.63 mg, 0.15 mmol) 및 화합물 1-10(145.00 mg, 0.15 mmol)을 메탄올(5.00 mL)에 용해시키고, 4A 분자체(0.5 g)를 넣고, 질소 분위기, 18 ℃에서 0.5 시간 동안 교반한 다음, 나트륨 시아노보로하이드라이드(19.20 mg, 0.30 mmol)를 추가하고 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응 종료를 검출하고, 여과 및 농축한 후 제조용-HPLC(Phenomenex Synergi C18 150×25×10㎛; 이동상: [물(0.225 % 포름산)-아세토니트릴]; 아세토니트릴 %: 60 % ~ 90 %, 10 min)로 분리하여 화합물 3-7을 얻었다.

단계 6:

화합물 3-7(91.00 mg, 71.97 μmol)을 무수디클로로메탄(2.00 mL)에 용해시키고, 질소 분위기 보호하에 0 ℃로 냉각시키고 트리플루오로아세트산(1.54 g, 13.51 mmol)을 추가하고 0-19 ℃에서 9 시간 동안 교반하였다. 상온에서 농축하고 잔류물을 아세토니트릴/tert-부틸 메틸 에테르(4 mL, 1/3)로 세척하여 화합물 3을 얻었다.

생체 활성 테스트

실험예 1: 화합물 항균 작용 측정(MIC)

3가지 장내세균 E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC BAA-2523, K. pneumonia ATCC BAA-1705을 이용하여 임상 및 실험실 표준 기구(Institute of clinical and laboratory standard, CLSI)의 요구에 따라 미세액 희석법으로 각 화합물의 최소 저지 농도(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)를 측정하였다. 둥근 바닥 96-웰 플레이트(Catalog# 3788, Corning)에 2배 연속 구배 희석 화합물(최종 농도 범위 0.125 μg/mL - 128 μg/mL)을 넣고, 밤새 배양한 뮬러 힐튼 한천 배지 Mueller Hinton II Agar(MHA, Cat. No. 211438, BD BBL^TM) 플레이트에서 신선한 박테리아 단일 클론을 선택하고, 멸균 생리 식염수에 현탁하여 농도를 1×10⁸ CFU/mL로 조절한 후, 양이온 조정된 뮬러 힐튼 배지 Cation-Adjusted Mueller Hinton II Broth (MHB, Catalog# 212332, BD BBL^TM)를 사용하여 5×10⁵ CFU/mL로 희석하고, 100 μL를 취하여 약물이 포함된 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃에 뒤집어 놓고 20-24 h 동안 배양한 후 MIC 값을 읽고, 박테리아 생장을 억제하는 최저 약물 농도를 MIC로 하였다. 결과는 표 1과 같다.

<표 1> 본 발명의 화합물의 항균 작용(MIC) 측정 데이터

결론: 본 발명의 화합물은 우수한 체외(in vitro) 항균 활성을 구비한다.

실험예 2: 래트 생체내 약동학 평가

실험 목적:

래트 생체내에서의 본 발명의 화합물의 약동학 매개변수를 측정한다.

실험 방법:

1) 실험 약품: 화합물 1;

2) 실험 동물: 7-9주령의 수컷 SD 래트 3마리;

3) 약물 제조: 약물 적당량을 칭량하여 취하고, 생리 식염수에 용해시켜, 60 mg/mL 용액을 제조하였다.

실험 조작:

동물의 꼬리 정맥에 단일 정맥내 주입을 통해 용량이 150 mg/kg이고 농도가 60 mg/mL인 약물을 30 min 동안 투여하였다. 투여 후 0, 0.0333, 0.0833, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간이 지난 후 동물의 혈장 샘플을 수집하였다. LC-MS/MS 방법으로 혈장 샘플 중 약물 농도를 측정하여 약동학 매개변수를 얻었고 결과는 표 2와 같다.

<표 2> 본 발명의 화합물의 래트 생체내 약동학 평가 결과

결론: 본 발명의 화합물은 래트 생체내에서 약동학 특성이 우수하다.

실험예 3: 마우스 생체내 약동학 연구

실험 목적:

본 실험의 목적은 화합물의 단일 정맥 주사 및 위내 투여 후 약동학 거동을 평가하고 위내 투여 후 생체이용율을 조사하는 것이다.

실험 조작:

7~10 주령의 CD-1 수컷 마우스를 선택하고 정맥 투여량은 1 mg/kg이다. 마우스는 투여 전 최소 12시간 동안 금식하고, 투여 후 4시간 후에 섭식을 재개하였으며, 전반 테스트 기간 자유롭게 음용하였다.

실험 당일, 정맥주사군 동물의 꼬리 정맥에 상응한 화합물을 1회 주사하였고, 투여 부피는 5 mL/kg이다. 투여 전 동물의 체중을 측정하고 체중에 따라 투여 부피를 계산하였다. 샘플 수집 시간은 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24 h이다. 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석(LC-MS/MS)을 통해 농도를 측정하기 위해, 각 시점에 복재 정맥에서 약 30 μL의 전혈을 수집하여 혈장을 준비하였다. 모든 동물은 마지막 시점에서 PK 샘플을 수집한 후 CO₂ 마취로 안락사시켰다. WinNonlin™ Version 6.3 (Pharsight, Mountain View, CA) 약동학 소프트웨어의 비구획 모델을 사용하여 혈장 농도를 처리하고, 선형 대수 사다리꼴 방법을 사용하여 약동학 매개변수를 계산하였다.

실험 결과: 마우스 PK 특성 평가 결과는 표 3과 같다.

<표 3> 본 발명의 화합물의 마우스 생체내 약동학 특성 평가 결과

결론: 본 발명의 화합물은 마우스 생체내에서 약동학 특성이 우수하다.

실험예 4: 마우스 생체내 약효 실험 평가(마우스 허벅지 근육 모델)

12 마리의 CD-1 암컷 마우스를 케이지당 3마리씩 4개의 케이지로 나누고, 면역억제제 사이클로포스파마이드(150 mpk)를 복강내 주사하였다.

24 시간 후, 4개 케이지의 마우스에 면역억제제 사이클로포스파마이드(100 mpk)를 다시 복강내 주사하였고; MHA 플레이트에서 균주 E.coli ATCC-25922(장내세균 ATCC-25922)를 소생시켰다. 소생된 콜로니를 선택하여 생리 식염수에 용해시키고, 농도가 1.00E+07 CFU/mL인 E.coli ATCC-25922 균액을 제조하여, 마우스 허벅지 근육 감염에 사용하였다. 실험 마우스의 허벅지 근육 주사 균액의 량은 100 μL/마리이고, 즉 접종량은 1.00E+06 CFU/마우스이다. 감염 2시간 후 대조군 마우스의 허벅지 근육 조직을 취하여 10 mL 생리 식염수에 넣고, 허벅지 근육 조직을 균질화하고 구배 희석하여 플레이팅하였다.

마우스의 구체적인 투여 상황은 아래와 같다.

(1) 감염 2 h 후: 첫 번째 케이지의 마우스 감염 2 h 후 종료하고, 허벅지 근육 조직을 취하여 10 mL 생리 식염수에 넣고, 허벅지 근육 조직을 균질화하고 구배 희석하여 플레이팅하였다. 마우스마다 2번씩 반복하고, 마우스 허벅지 근육 조직에 있는 박테리아 량을 계수하고, 3번째, 4번째 케이지에 각각 30 mpk의 플라조미신 및 화합물 1을 피하 주사하였다.

(2) 감염 10 h 후: 3번째, 4번째 케이지에 각각 30 mpk의 플라조미신 및 화합물 1을 피하 주사하고, 제2-4번째 케이지의 마우스 감염 24 h 후 종료하고, 허벅지 근육 조직을 취하여 10 mL 생리 식염수에 넣고, 허벅지 근육 조직을 균질화하고 구배 희석하여 플레이팅하였다. 마우스마다 2번씩 반복하고, 마우스 허벅지 근육 조직에 있는 박테리아 량을 계수하였다. 정리된 실험 결과는 도 1과 같다.

결론: 도 1의 결과는 화합물 1이 30 mpk에서 생체내 약효가 플라조미신보다 우수함을 보여준다.

실험예 5: 마우스 생체내 약효 실험 평가(마우스 폐렴 모델)

21 마리의 CD-1 암컷 마우스를 케이지당 3마리씩 7개의 케이지로 나누고, 4일차에 면역억제제 사이클로포스파마이드(150 mpk)를 복강내 주사하였다.

1일차에 7개 케이지의 마우스에 면역억제제 사이클로포스파마이드(100 mpk)를 다시 복강내 주사하였고; MHA 플레이트에서 균주 Kpn ATCC-BAA-1705(폐렴간균 ATCC-BAA-1705)를 소생시켰다. 소생된 콜로니를 선택하여 생리 식염수에 용해시키고, 농도가 4.00E+08 CFU/mL인 Kpn ATCC-BAA-1705 균액을 제조하여, 마우스 폐 감염에 사용하였다. 실험 마우스의 폐 감염 균액의 량은 50 μL/마리이고, 즉 접종량은 2.00E+07 CFU/마우스이다. 감염 2시간 및 24 시간 후 대조군 마우스의 폐 조직을 취하여 5 mL 생리 식염수에 넣고, 폐 조직을 균질화하고 구배 희석하여 플레이팅하였다.

마우스의 구체적인 투여 상황은 아래와 같다.

(1) 감염 2 h 후: 첫 번째 케이지의 마우스 감염 2 h 후 종료하고, 폐 조직을 취하여 5 mL 생리 식염수에 넣고, 폐 조직을 균질화하고 구배 희석하여 플레이팅하였다. 마우스마다 2번씩 반복하고, 마우스 폐 조직에 있는 박테리아 량을 계수하고, 3번째, 4번째 케이지에 각각 30 mpk 및 10 mpk의 플라조미신을 피하 주사하고, 5번째, 6번째 케이지에 각각 30 mpk 및 10 mpk의 화합물 1을 피하 주사하며, 7번째 케이지에 100 mpk의 메로페넴을 피하 주사하였다.

(2) 감염 10 h 후: 3번째, 4번째 케이지에 각각 30 mpk 및 10 mpk의 플라조미신을 피하 주사하고, 5번째, 6번째 케이지에 각각 30 mpk 및 10 mpk의 화합물 1을 피하 주사하며, 7번째 케이지에 100 mpk의 메로페넴을 피하 주사하였다. 2-7번째 케이지의 마우스 감염 24 h 후 종료하고, 폐 조직을 취하여 5 mL 생리 식염수에 넣고, 폐 조직을 균질화하고 구배 희석하여 플레이팅하였다. 마우스마다 2번씩 반복하고, 마우스 폐 조직에 있는 박테리아 량을 계수하였다. 정리된 실험 결과는 도 2와 같다.

결론: 도 2의 결과는 플라조미신 및 화합물 1이 페렴간균 균주 1705의 폐 감염 모델에서 생체내 활성이 우수함을 보여준다. 동시에 화합물 1의 약효가 플라조미신보다 우수하고, 10 mpk 용량의 화합물 1의 약효가 30 mpk 용량의 플라조미신의 약효와 동일하다.

실험예 6: 새로운 아미노글리코사이드계 항생제 약물의 청각 안전성 연구 보고

연구 목적:

기니피그 생체내에서 화합물 1과 기존의 항생제 플라조미신의 청각 기능에 대한 영향을 평가하고, 화합물 1의 청각 독성을 평가한다.

연구 방법:

건강한 성체 기니피그(150-250 g)를 연구 대상으로 하고, 무작위로 생리 식염수 대조군, 겐타마이신 군, 플라조미신 군 및 화합물 1 군에 각각 8마리씩 나누었다. 피하 투여 방식을 사용하여 연속 14일 동안 투여하고 투여 종료 후 아래 시험을 수행하였다.

1. 상이한 약물이 기니피그 청각 기능에 대한 영향을 분석하기 위해, 투여 종료 후 14일차 후(29일, 즉 4주) 동물 복합 활동 전위(Compound Action Potential, CAP)를 각각 기록하였다. 결과를 분석하고 상이한 처리군 사이의 임계값 이동 및 진폭, 잠복기 등 지표 변화를 비교하였다.

2. 상이한 군의 동물을 처리하고 청각 기능 데이터를 수집한 후, 동물 달팽이관을 꺼내어 고정하고 염색하였다. 한쪽의 달팽이관의 기저막의 Stretch에서 유모세포의 손실을 계산하고 달팽이관 맵을 제작하며, 다른 한쪽의 달팽이관을 탈석회화한 후 동결 절편을 시행하여 나선 신경절 밀도를 계산하고 군 간 비교를 수행하였다.

연구 결과:

1. 투여 방법 및 처리

약물 겐타마이신(Gentamicin), 플라조미신, 및 화합물 1에서, 겐타마이신은 Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.에서 구입하였고, 플라조미신 및 화합물 1은 WuXi AppTec(WuHan) Co., Ltd.에서 제공하였다. 매회 사용할 때마다 제조하여 사용하고, 생리 식염수를 사용하여 용해시키고 농도는 50 mg/mL이며, 주사 용량은 100 mg/kg 체중이다. 방법: 피하 주사, 매번 주사 후 액체 누출이 없는지 확인하였다.

2. 복합 활동 전위 결과(Compound action potential, CAP) 분석

각 군의 동물에 클릭음(Click) 및 상이한 주파수 순음(1 kHz ~ 32 kHz)을 다르게 주었을 때의 복합 활동 전위(Compound action potential, CAP)를 측정 및 기록하고, 주로 클릭음 및 중고주파 순음(16, 32 kHz)을 주었을 때의 진폭 및 잠복기의 변화를 비교하였다. 진폭의 크기는 유모세포 및 청각 신경의 응답 능력을 반영한다. 진폭이 클 수록 I/O 곡선의 기울기가 더 크고, 반응성이 더 좋으며 기능도 더 좋다. 이 밖에, 달팽이관은 첨단부(apical turn)로부터 기저부(basal turn)까지 각각 저주파에서 고주파 소리에 대해 응답성이 있고, 즉 달팽이관의 기저막의 주파수 대응성이 있으며, 상이한 주파수의 기능 변화에 대응되는 것은 달팽이관의 첨단부로부터 기저부까지 상이한 구조의 기능적 변화이다. 잠복기의 길이도 유모세포 및 청각 신경 응답 기능과 관련이 있다. 일반적으로 달팽이관이 손상되면 임계값의 증가로 잠복기가 길어진다. 또한 임계값에 큰 변화가 없을 때 잠복기의 연장도 청각 신경 방전의 동시성이 감소한 것을 반영한다. 다시 말하면, 잠복기가 길어지고 반응 기능이 저하된다. 과거에는 아미노글리코사이드계 항생제의 이독성이 주로 고주파 영역에 집중되어 있었는데, 본 연구에서 겐타마이신 군은 이전 결과와 일치하는 것으로 나타났으며, 이를 요약하면 다음과 같다.

화합물 1은 실험군의 고주파(32 kHz) CAP 진폭만 감소시켜 고주파 영역에서 청력 손상을 시사하지만, 그 진폭은 여전히 겐타마이신과 플라조미신 군보다 높고; 플라조미신 군은 손상 범위가 큰 바 16 kHz 및 32 kHz에서 모두 손상이 있었고 32 kHz에서의 손상이 화합물 1보다 크며 겐타마이신 군보다 현저히 낮았다. 겐타마이신은 실험군의 손상이 고주파(32 kHz) 영역에 집중되어 있으나, 32 kHz의 임계값 이동이 현저하며 손상이 다른 두개 군의 약물보다 더 컸다(도 3 내지 도 5를 참조).

1) 16 kHz 진폭 결과는 화합물 1과 대조군(Control) 간에 차이가 없고, 플라조미신 군이 25.9 %의 손상을 보였다.

2) 32 kHz에서, CAP 진폭 결과는 화합물 1, 플라조미신 및 겐타마이신이 각각 32 kHz에 34.7 %, 48.2 % 및 74.3 %의 청력 손상을 일으켰고, 즉 화합물 1이 여전히 32 kHz의 청력 손상을 일으켰으나, 플라조미신 및 겐타마이신의 손상에 비해 각각 13.5 % 및 39.6 % 감소하였다.

3) 클릭음(Click) CAP 진폭은 화합물 1 및 겐타마이신이 모두 대조군(Control)과 일치하고, 플라조미신이 청력 손상을 일으킴을 보여주었다.

구체적인 수치는 아래와 같다.

1) 16 kHz CAP 진폭: 이원 분산 분석(Holm-Sidak method)에 따르면, 4개 군의 동물은 차이가 있음을 보여준다. F3,570=7.858, p<0.001. 여기서 화합물 1 동물 군과 대조군(Control) 및 겐타마이신 군 동물의 청력은 통계학적 차이가 없었다. 플라조미신 군 동물의 청력은 각각 Ctrl 군(t=4.566,p<0.001), 겐타마이신 군(t=4.099, p<0.001) 및 화합물 1 군 (t=2.799,p=0.021)보다 낮았다. *: p<0.05. 90 dB에서 각 군의 응답은 모두 최대였고, 이때 화합물 1 동물의 청력(381.646±20.895uv)은 플라조미신 군(282.058±22.569uv, t=2.799, p=0.021)보다 유의하게 높았고, 대조군(Control)(383.130±19.545) 및 겐타마이신 군(373.329±15.332uv)과는 유의한 차이가 없었다.

2) 32 kHz CAP 진폭: 이원 분산 분석(Holm-Sidak method)에 따르면, 4개 군의 동물은 차이가 있음을 보여준다. F3,570=100.611, p<0.001. 화합물 1 동물의 청력은 대조군(Control)(t=5.019, p<0.001)보다 낮았고, 플라조미신 군(t=3.128, p=0.002) 및 겐타마이신 군(t=10.484, p<0.001)보다 높았다. 90 dB에서 각 군의 응답은 모두 최대였고, 이때 화합물 1 군 동물의 청력(79.420±7.000uv)은 대조군(Control)(121.608±6.548uv, t=4.401, p<0.001)보다 낮았고, 겐타마이신 군(31.272±5.137uv, t=5.545, p<0.001)과 플라조미신 군(62.982±7.561uv, t=1.595, p=0.111)보다 높았다.

3) 클릭음(Click) CAP 진폭: 이원 분산 분석(Holm-Sidak method)에 따르면, 4개 군의 동물은 차이가 있음을 보여준다. F3,570=6.751, p<0.001. 화합물 1 동물 군의 청력은 플라조미신 군(t=3.493, p=0.003)보다 유의하게 우수하고, 대조군(Control) 및 Gentamicin 군과는 유의한 차이가 없었다.

종합해보면, CAP 진폭 결과는 화합물 1이 실험 동물에 대한 청각 기능 손상이 겐타마이신 및 플라조미신보다 현저히 적음을 입증하였다.

3. 유모세포 수 변화

상이한 약물이 유모세포에 대한 영향을 비교하기 위해, 달팽이관 기저막의 전체 길이에 대해 유모세포 염색 및 계수를 진행한 결과, 겐타마이신 군이 중주파 및 고주파 영역(첨단부로부터 60-100 %)에서 12-67.7 %의 외유모세포 손실이 있었고, 고주파에서 더 현저하였다. 플라조미신 군은 고주파 영역(첨단부로부터 70~100 %)에서 11.2-28.1 %의 외유모세포 손실이 있었고 첨단부 시작단(10-20 %)에서 16.7-24.2 %의 외유모세포 손실이 있었다. 그러나 화합물 1 군의 외유모세포 손실은 첨단부로부터 저주파 영역(첨단부로부터 -40 %)에만 발생하였고, 외유모세포 손실률이 이 범위에서 약 2.5-11 %이며, 고주파 영역에서 외유모세포는 비교적 완벽했다(도 6의 B 참조). 구체적인 수치는 표 4를 참조하기 바란다.

화합물 1 군의 내유모세포는 거의 손상되지 않았고, 플라조미신 및 겐타마이신 군은 모두 기저부 말단에 가까운 위치(첨단부로부터 100 %)에서 각각 3.5±3.0 % 및 9.3±4.1 %의 내유모세포 손실이 있었다(도 6의 A 참조). 구체적인 수치는 표 5를 참조하기 바란다.

종합하면, 화합물 1 군은 첨단부에서만 약간의 외유모세포 손실이 있었고, 나머지 부분에서는 기저부 및 내유모세포가 비교적 완전하게 보존되었으며, 그 유모세포 독성이 겐타마이신 군 및 플라조미신 군보다 현저히 낮은 것을 보여준다.

4. 나선 신경절 변화

기니피그 달팽이관을 기저부로부터 첨단부까지 각각 1회(Turn), 2회, 3회 및 4회로 나열하고, 나선 신경절 뉴런(Spiral ganglion neurons, SGNs)에서 동결 절편에 TuJ로 표지 및 염색 후, 특정 면적 내에서의 SGNs의 밀도를 계산하고 군 간 비교를 수행하였다. 화합물 1 군의 각 회 SGN 밀도는 대조군과 유의한 차이가 없고, 즉 나선 신경절 손상이 없으며, 겐타마이신 군의 각 회는 현저한 손상이 있으며, 플라조미신 군은 첨단부에 가까운 위치에서 SGN 밀도가 낮아졌으나 겐타마이신 군보다 우수했다. 이원 분산 분석에 따르면, 군 간 유의한 차이가 있었다. F(3, 74)=35.43, p<0.0001(도 7 참조). 구체적인 수치는 표 6을 참조하기 바란다.

결론: 상이한 군 간 복합 활동 전위에 대한 분석 결과, 화합물 1 군이 고주파(32 kHz)에서만 청력 손상이 있었고 플라조미신 및 겐타마이신 군보다 우수함이 입증되었다. 유모세포 및 나선 신경절에 대한 관찰을 통해, 첨단부 2.5-11 %에 가까운 외유모세포가 손상된 것을 제외하고 화합물 1은 다른 영역의 외유모세포의 현저한 손상이 발생하지 않았고, 내유모세포 수 및 나선 신경절 수 역시 영향을 받지 않았으며, 겐타마이신 및 플라조미신 군보다 현저히 우수함이 입증되었다. 따라서, 화합물 1을 동물(기니피그)에 연속 14일 동안 피하 투여한 후, 또 14일 회복하면 이독성이 플라조미신 및 겐타마이신 군보다 작았다. 본 연구의 각항 결과를 종합하면, 본 발명의 화합물 1의 청각 독성은 플라조미신과 겐타마이신보다 우수한 것이 입증되었다.

<표 4> 29일차 외이 유모세포 손상 상황(%, 백분율)

<표 5> 29일차 내이 유모세포 손상 상황(%, 백분율)

<표 6> 29일차 나선 신경절 밀도 변화(n/10000μm²)

실험예 7: 본 발명의 화합물의 세포 HK-2에 대한 독성 실험

세포 준비:

실험 당일, 배양 플라스크의 세포 HK-2 합류율이 80 % ~ 90 %에 달할 경우, 배지를 폐기하였다. 둘베코의 인산 완충액(DPBS)으로 2번 세척하고, 3 mL의 트립신(T150 세포 배양 플라스크)으로 1~2 분 동안 소화시켰다. 즉시 9 mL 완전 배지(RPMI 1640+10 % FBS)를 추가하여 소화를 중지시키고, 중지 후 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 피펫을 부드럽게 불어 균일하게 하였다. 초당 1000회전으로 5분동안 원심분리하고, 상층액을 버리고 신선한 완전 배지를 추가하며 불어 균일하게 하였다. 세포 카운터로 실제 세포 밀도를 측정하고, 세포 현탁액을 2.5×0⁵ cells/mL로 조절하였다. 피펫을 이용하여 80 mL세포 현탁액을 96웰 검정색 바닥판 내(2×10⁴ cells/웰)에 추가하였다. 그 다음, 96 웰 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 4.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 이것이 세포 배양 플레이트이다.

화합물 제조:

a.아래 표에 따라 화합물 모액을 제조하고, 용매는 완전 배지이다.

<표 7> 화합물 정보

b. 96-v 웰 플레이트의 3-11열에 50 μL 완전 배지를 추가하였다.

c. 96-v 웰 플레이트의 2열에 75 μL 테스트 화합물(50 mg/mL) 및 양성 대조군을 추가하였다.

d. 2열에서 25 μL화합물을 취하여 3열에 넣고, 피펫을 이용하여 몇 번 불고, 3열에서 25 μL를 취하여 4열에 넣고 이렇게 10열까지 3배 구배로 희석하고, 2열에서 11열까지 화합물의 농도는 각각 50, 16.67, 5.56, 1.85, 0.62, 0.21, 0.07, 0.02, 0.008, 0 mg/mL이다.

e. 피펫을 이용하여 20 μL의 제조된 다양한 농도의 화합물 용액을 세포 배양 플레이트의 대응되는 웰에 옮기고, 이것이 테스트 플레이트이다.

테스트 플레이트 배양:

모든 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 43 시간 동안 배양하였다.

수치 읽기:

상응한 시간까지 배양한 후, 테스트 플레이트에 10 μL의 Alamar Blue를 추가하고, 즉시 테스트 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂ 인큐베이터에 넣고 3 시간 동안 배양하였다. 그 다음 효소면역분석기로 테스트 플레이트의 각 웰의 형광 값(파장Ex 540nm/Em 585nm)을 읽었다. prism 소프트웨어 시뮬레이션 곡선으로 CC₅₀ 값을 계산하였다.

연구 결과:

<표 8> 실험 결과 및 CC₅₀ 예측

결론: 화합물 1과 플라조미신의 HK-2 세포에 대한 독성은 네틸마이신 및 아미카신보다 현저히 작고, 독성 회귀 곡선과 소프트웨어 예측(도 8 ~ 도 11)을 결부하면, 화합물 1이 HK-2 세포에 대한 독성은 플라조미신보다 작다.

Claims

식 (II)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서,
(II),
상기 식에서,
R'는 이고;
L은 -O-CH₂-CH₂- 또는 -CH₂-이며;
R₁은 H 또는 C_1-3 알킬이고;
R₂는 H, C_1-3 알킬 또는 이며, 상기 C_1-3 알킬은 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN, -NH₂ 또는 -NO₂로부터 독립적으로 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 임의로 치환되고;
R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H, -C(=O)-NH₂, -C(=O)-C_1-3 알킬 또는 C_1-3 알킬이며, 상기 -C(=O)-C_1-3 알킬 및 C_1-3 알킬은 1, 2 또는 3개의 R에 의해 임의로 치환되고;
각 R은 독립적으로 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN 또는 -NH₂인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서,
이의 화합물은 식 (I)로 표시되는 구조를 가지고,
(I),
상기 식에서, R₁은 H 또는 C_1-3 알킬이고;
R₂는 H, C_1-3 알킬 또는 이며, 상기 C_1-3 알킬은 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN, -NH₂ 또는 -NO₂로부터 독립적으로 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 임의로 치환되고;
R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H, -C(=O)-NH₂, -C(=O)-C_1-3 알킬 또는 C_1-3 알킬이며, 상기 -C(=O)-C_1-3 알킬 및 C_1-3 알킬은 1, 2 또는 3개의 R에 의해 임의로 치환되고;
각 R은 독립적으로 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN 또는 -NH₂인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항에 있어서,
이의 화합물은 식 (I-1)로 표시되는 구조를 가지고,
(I-1),
상기 식에서, R_a, R_b 및 R₁은 제2항에 정의된 바와 같은,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
R₁은 H 또는 -CH₃인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제4항에 있어서,
이의 화합물은 식 (I-2)로 표시되는 구조를 가지고,
(I-2),
상기 식에서, R_a 및 R_b는 제4항에 정의된 바와 같은,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 또는 제2항에 있어서,
각 R은 독립적으로 F 또는 Cl인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H, -C(=O)-NH₂, -C(=O)-CH₃, -CH₃ 또는 -CH₂CH₃이고, 상기 -C(=O)-CH₃, -CH₃ 및 -CH₂CH₃은 1, 2 또는 3개의 R에 의해 임의로 치환되는,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제7항에 있어서,
R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H, -C(=O)-NH₂, -C(=O)-CH₃, -CH₃, -CH(R)₂, -CH₂CH₃ 또는 -CH₂CH(R)₂인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제8항에 있어서,
R_a 및 R_b는 각각 독립적으로 H 또는 인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 또는 제2항에 있어서,
R₂는 H, -CH₃, -CH₂CH₃ 또는 이고, 상기 -CH₃ 및 -CH₂CH₃은 F, Cl, Br, I, -OH, -OCH₃, -CN, -NH₂ 또는 -NO₂로부터 독립적으로 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 임의로 치환되는,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제10항에 있어서,
R₂는 또는 인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 또는 제2항에 있어서,
구조 단위 는 인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제12항에 있어서,
구조 단위 는 또는 인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
하기 식 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
,
또는
박테리아 감염 관련 질환 치료용 약학적 조성물로서,
활성 성분으로서 치료 유효량의 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는,
박테리아 감염 관련 질환 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
박테리아 감염 관련 질환의 치료에 사용하기 위한,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제15항에 있어서,
박테리아 감염 관련 질환의 치료에 사용하기 위한,
약학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 박테리아는 카바페넴 내성 장내세균인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제17항에 있어서,
상기 박테리아는 카바페넴 내성 장내세균인,
약학적 조성물.