KR102691492B1 - 액체 샘플 내의 성분들을 자성 추출하는 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물학적 샘플로부터 성분들을 추출하는 방법 및 시스템에 관한 것으로, 상기 시스템은:
- 팁(21)을 가진 피펫 콘(20)들 포함하는 전가 피펫(12);
- 웰 지지체(18a, 18b);
- 피펫 홀더(14)로서:
ο 각각의 웰 지지체를 제거가능하게 수용할 수 있는 베이스(34);
ο 상기 피펫(12)이 삽입되는 피펫 지지체(36)로서, 상기 지지체(18a, 18b)의 웰(62, 69) 내에 삽입되는 제 1 위치와 상기 팁(21)이 웰(62, 69)의 외부에 있는 적어도 하나의 제 2 위치 사이에서 상기 베이스(34)에 대해 이동할 수 있는 피펫 지지체(36); 및
ο 상기 피펫 지지체가 제 1 위치에 있을 때 상기 피펫 콘의 팁 위에서 피펫 콘(20)과 마주하며, 상기 피펫 지지체가 제 2 위치에 있을 때 상기 피펫 콘의 팁과 마주하는, 하우징(78);을 포함하는, 상기 피펫 홀더(14); 및
- 상기 하우징(78) 내에 제거가능하게 삽입된 자화된 부분(16);을 포함한다.
- 팁(21)을 가진 피펫 콘(20)들 포함하는 전가 피펫(12);
- 웰 지지체(18a, 18b);
- 피펫 홀더(14)로서:
ο 각각의 웰 지지체를 제거가능하게 수용할 수 있는 베이스(34);
ο 상기 피펫(12)이 삽입되는 피펫 지지체(36)로서, 상기 지지체(18a, 18b)의 웰(62, 69) 내에 삽입되는 제 1 위치와 상기 팁(21)이 웰(62, 69)의 외부에 있는 적어도 하나의 제 2 위치 사이에서 상기 베이스(34)에 대해 이동할 수 있는 피펫 지지체(36); 및
ο 상기 피펫 지지체가 제 1 위치에 있을 때 상기 피펫 콘의 팁 위에서 피펫 콘(20)과 마주하며, 상기 피펫 지지체가 제 2 위치에 있을 때 상기 피펫 콘의 팁과 마주하는, 하우징(78);을 포함하는, 상기 피펫 홀더(14); 및
- 상기 하우징(78) 내에 제거가능하게 삽입된 자화된 부분(16);을 포함한다.
Description
본 발명은 자성 입자들을 사용하여 용액 내에 함유된 성분들을 추출하는 분야에 관한 것이다.
본 발명은 특히 생물학적 샘플 준비 분야에 사용될 수 있으며, 특히 용액 내에 존재하는 생물체로부터 유래된(biological origin) 분석물들(핵산들, 미생물들, 단백질들, 펩타이드들, 등)을 포집함에 의한, 시험관내 진단(in vitro diagnosis)의 구현에 사용될 수 있다.
생물학적 샘플에 존재하며, 문헌 US 5 234 809에 기재된 핵산들의 추출을 위해 본래 개발된, "BOOM®" 기술은 관심있는 구성요소들과 결합할 수 있는 자성 입자들을 액체 샘플 내로 도입하는 단계, 그 이후 하나 이상의 자석들을 이용하여 상기 샘플로부터 상기 자성 입자들을 분리하는 단계로 구성된다. 이렇게 포집된 입자들은 이어서, 예를 들어 그들의 성분들을 회수 용액(recovery solution)으로 방출하기 위해 후속 처리를 거칠 수 있다. 이러한 기법의 효율성으로 인해, 특히 DNA 및 RNA 등을 위한 많은 장치들이 개발되었고, 판매되었으며, 상기 장치들은 수동형 장치들(예를 들어, 출원인의 NucliSENS-miniMAG®) 및 자동화된 장치들(출원인의 NucliSENS-easyMAG®) 모두이다. 그러나, 이러한 자동화된 장치들에는 여러 가지 한계들이 있다.
첫 번째 한계는 장치들의 다목적성(polyvalence) 및 장치들의 부피(bulkiness)에 관한 것이다. 사실, 이러한 장치들은 일반적으로 사용자에 의해 수정될 수 없는 일련의 처리들을 수행하도록 설계된 무겁고 부피가 큰 자동화된 장치들이다. 따라서, 자동화된 장치는 예를 들어, 핵산들의 정제를 위해 설계되지만 자기 면역농축(immunoconcentration)을 수행할 수 없는 단일 유형의 추출을 위해 설계되었다.
두 번째 한계는 추출 중에 사용되는 다양한 액체들을 주입하고 흡입하기 위한 회로들에 관한 것이다. 액체들의 수가 많기 때문에, 이는 다수의 및/또는 복잡한 회로들을 의미한다. 또한, 오염 가능성이 있기 때문에 이러한 주입/흡입 회로들은 정기적으로 워싱되어야 하며, 이는 장치들의 작동을 중단시키는 것을 의미한다.
세 번째 한계는 상기 관심있는 분석물들의 상기 입자들의 포집을 최대화하거나 상기 자성 입자들의 효율적인 워싱을 위하여, 자성 입자들을 포집하기 전에 자성 입자들을 포함하는 샘플의 균질성을 획득하기 위해 수행되는 교반 동작들(stirring operations)에 관한 것이다. 이러한 유형의 교반은 일반적으로 예를 들어, 자성 입자들을 이동시키는 이동식 자석들에 기초한 복잡한 메커니즘들을 필요로 한다.
네 번째 한계는 추출 중에 사용되는 다양한 액체들에 관한 것이다. 일반적으로 추출을 위해 수행된 단계들은 단일 컨테이너 내에서 또는 단일 컨테이너로부터 시작하여 수행된다. 결과적으로, 이러한 컨테이너는 추출 프로세스의 전반적인 효율을 제한하는, 관련된 모든 액체들(예를 들어, 샘플, 다양한 워싱 용액들, 용리 용액(eluting solution), 등)에 대해 동일한 용적을 고정한다. 실제로, 일부 처리들(예를 들어, 워싱)은 완전히 효율적이기 위해 큰 용적들을 필요로 하는 반면, 다른 처리들(예를 들어, 용리)은 적은 용적의 액체만 필요로 한다.
본 발명의 목적은 자성 입자들에 의해 액체 샘플 중의 성분들을 추출하는 방법을 제공하는 것이며, 이는 추출 중에 사용되는, 특히 최대 10ml까지의 액체 용적들의 선택에 있어서 큰 자유도를 제공한다.
이러한 효과를 위해서, 본 발명의 대상은 액체 형태의 생물학적 샘플 내에 함유된 성분들을 추출하는 방법으로서, 상기 성분들은 자성 입자들(magnetic particles)에 결합할 수 있으며, 상기 방법은:
- 상기 샘플을 상기 자성 입자들과 혼합하는 단계;
- 액체를 피펫팅(pipetting)하도록 구성된 팁(tip)을 포함하는 관형(tubular) 피펫 콘(pipette cone)이 웰(well)로부터 상기 혼합물을 흡입하는 단계;
- 상기 피펫 콘의 내벽 상에 상기 자성 입자들을 포집하는 단계로서, 상기 포집하는 단계는:
ο 상기 피펫 콘에 제 1 자기장을 인가하여, 상기 제 1 자기장이 상기 콘의 상기 팁 위의 "포집(capture)" 구역으로 지칭되는 상기 피펫 콘의 사전결정된 구역 내에 상기 자성 입자들을 끌어당겨 유지하고;
ο 웰 내의 상기 피펫 콘 내에 함유된 상기 혼합물의 흡입 및 배출하는 적어도 하나의 사이클을 적용함으로써 수행되는, 상기 포집하는 단계;
- 상기 피펫 콘의 상기 내벽 상에 포집된 상기 자성 입자들을 워싱하는 적어도 하나의 단계로서, 상기 워싱하는 단계는:
ο 상기 피펫 콘 내에 함유된 상기 혼합물을 방출하고;
ο 워싱 용액을 함유하는 웰로부터, 상기 피펫 콘 내로 상기 워싱 용액을 흡입 및 배출하는 적어도 한 사이클을 적용함으로써 수행되는, 상기 워싱하는 단계;
- 상기 제 1 자기장에 대한 상기 피펫 콘의 상대적인 이동을 수행함으로써 상기 포집 구역으로부터 상기 피펫 콘의 상기 팁으로 상기 피펫 콘의 상기 내벽 상의 상기 자성 입자들을 이동시키는 단계; 및
- 상기 피펫 콘의 상기 팁 내로 이동된 상기 자성 입자들을 용액을 함유하는 회수 웰(recovery well) 내로 전달하는 단계를 포함한다.
환언하면, 본 발명은 상기 피펫 콘의 팁을 웰 내에 담그는 동안 흡입 및 배출하는 사이클들이 수행될 수 있는 피펫 콘을 이용한다. 이러한 사이클들 덕분에, 추출이 수행되는 용적, 즉 콘보다 훨씬 더 큰 용적의 샘플 내에 존재하는 모든 입자들을 포집하는 것이 가능하다. 흡입 및 배출 사이클들 수를 조절함으로써 샘플 자체의 용적보다 훨씬 큰 누적 용적(cumulative volume)의 액체를 콘을 통과시킬 수도 있다. 마찬가지로 추출하는 동안 사용된 워싱 용액(들)의 용적은, 적절한 경우, 콘의 용적보다 훨씬 클 수 있다. 이동 단계는 그의 부분이 자성 입자들을, 매우 작은 용적의 웰 내로 담글 수 있는 콘의 부분, 팁 내로 국부화시키는 것이 가능하다. 따라서 필요한 경우 회수 용액의 용적은 작을 수 있다. 따라서 회수 용액의 용적은 샘플의 용적 및 추출이 수행되는 피펫 콘의 용적과는 무관하다. 따라서, 본 발명에 따라, 사용된 액체의 각 용적을 최적화하여 추출을 최적화할 수 있다.
또한, 튜브-형태의 콘들 및 흡입/배출 사이클들의 구조로 인해, 콘들 내의 샘플들의 효율적인 교반으로서, 상기 교반은 예를 들어 포집 이전에 수행되는, 상기 교반, 및 효율적인 워싱이 또한 획득되며, 이는 이동가능한 자석 유형의 메커니즘들에 의존하지 않는다. 또한, 본 발명자들은 입자들이 피펫 콘의 벽 상에 포집되더라도 콘 내에서 효율적인 워싱이 이루어짐을 알아냈다. 큰 용적의 워싱액을 사용할 수 있어 워싱 효율을 더욱 높일 수 있다. 결과적으로, 추출의 모든 단계들(교반, 포집, 워싱, 회수 용액으로의 이동)은 피펫 콘 내에서 수행될 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 상기 제 1 자기장에 대한 상기 콘의 상대적 이동은 상기 콘의 길이방향 축에 평행하게 상기 피펫 콘을 이동시키는 것, 및 상기 제 1 자기장을 일정하게 유지시키는 것을 포함하며, 상기 피펫 콘의 길이방향 축은 상기 피펫 콘의 이동 중에 상기 제 1 자기장으로부터 동일한 거리에 유지된다.
환언하면, 입자들의 이동은 피펫 콘을 예를 들어 영구 자석에 대해 이동시킴으로써 간단히 수행될 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 상기 전달하는 단계는:
- 상기 피펫 콘의 상기 팁을 상기 회수 웰 내에 위치시키는 단계; 및
- 상기 피펫 콘의 상기 팁 내에 함유된 상기 자성 입자들이 상기회수 웰 내로 이동하도록 상기 회수 웰의 하단으로부터 제 2 자기장을 인가하는 단계를 포함한다.
특히, 상기 제 2 자기장은 상기 피펫 콘의 상기 팁 아래에 부분적으로 또는 전체적으로 위치된 자석에 의해 생성된다. 상기 피펫 콘에 인가된 상기 제 1 자기장은 상기 제 2 자기장의 인가 동안 비활성화된다.
환원하면, 상기 제 2 자기장은 상기 입자들을 상기 회수 웰 내로 간단히 끌어모을 수 있게 하며, 이는 상기 회수 웰 내의 상기 자성 입자들의 회수 속도를 증가시키며, 또한 회수될 입자들의 수를 증가시킨다. 또한, 상기 제 2 자기장은 상기 회수 웰 내에 상기 자성 입자들을 자동으로 포집한다. 예를 들어, 상기 회수 용액이 용리 용액인 경우, 입자들에 결합된 성분들이 방출되고 기술자는 자성 입자들이 없는 용액을 직접 피펫팅할 수 있다.
하나의 바람직한 변형에 따르면, 상기 전달하는 단계는 상기 제 1 자기장을 비활성화하고 상기 피펫 콘의 상기 팁 내로 상기 회수 웰의 상기 용액을 흡입 및 배출하는 사이클들을 적용하는 동작을 포함하며, 상기 사이클들을 적용하는 동작은:
- 제 1 빈도로 상기 사이클들을 적용하는 제 1 단계; 및
- 이후에, 상기 제 1 빈도보다 낮은 제 2 빈도로 상기 사이클들을 적용하는 제 2 단계를 포함한다.
제 1 단계는 "펠릿(pellet)"이라고도 지칭되는 피펫 콘 상에 포집된 입자들의 덩어리들을 효율적으로 분해하여 입자들을 회수 용액 내에 재현탁하는 것이다. 제 2 단계는 상기 자기장의 영향 하에서 입자들의 이동을 저지하지 않는 동시에 상기 용액을 지속적으로 교반하는 것을 가능하게 한다. 이는 회수 속도를 더욱 증가시키고, 상기 회수 웰 내에서 회수되는 입자들의 수를 증가시킬 수 있게 한다. 또한, 용액이 용리 용액(eluent)인 경우, 그의 기능은 상기 자성 입자들에 의해 포집된 성분들을 방출하는 것이고, 이러한 사이클들은 용리 용액 내의 입자들을 교반시키는 효과를 가지며, 이는 특히 용리 용액이 가열 단계 없이 상기 자성 입자들로부터 분석물들을 분리하는 데 사용될 때, 용리 용액의 효율을 증가시킨다.
일 실시형태에 따르면, 상기 방법은 상기 포집하는 단계 이전에 상기 피펫 콘 내로 상기 혼합물을 흡입 및 배출하는 적어도 1회의 사이클을 적용함으로써 상기 피펫 콘 내에 함유된 상기 혼합물을 교반(stirring)하는 단계를 포함한다. 관 모양의 콘의 형태로 인해, 콘의 단면에 비해 높은 용적 처리량(volume throughput)을 획득할 수 있으며, 결과적으로 효율적인 교반이 가능하다. 또한, 액체의 유동에 의해 자연적으로 생성되는 높은 난류들(turbulences)이 콘 내에 존재하며, 상기 난류는 교반 효율을 증가시킨다. 바람직하게는, 이러한 효과를 증가시키기 위해 콘 내에 일회용 부대용품(accessory)이 제공된다.
일 실시형태에 따르면, 상기 방법은 상기 전달하는 단계 이전에, 상기 피펫 콘의 상기 내벽 상에 포집된 상기 입자들을 워싱하는 적어도 하나의 단계를 포함하며, 상기 워싱하는 적어도 하나의 단계는,
a. 상기 자기장을 비활성화시키고;
b. 워싱 용액을 포함하는 웰로부터, 상기 피펫 콘 내로 상기 워싱 용액을 흡입 및 배출하는 적어도 1회의 사이클을 적용함으로써, 상기 포집된 입자들을 방출시키고;
c. 상기 피펫 콘의 내벽 상에 입자들을 포집하는 제 2 단계를 적용함으로써, 수행되며,
상기 입자들을 포집하는 제 2 단계는,
ο 상기 피펫 콘에 상기 제 1 자기장을 인가하고,
ο 상기 워싱 용액을 함유하는 상기 웰 내로, 상기 피펫 콘 내에 함유된 상기 혼합물을 흡입 및 배출하는 적어도 1회의 사이클을 적용함으로써 수행된다.
일 실시형태에 따르면, 상기 포집된 입자들의 배출은, 상기 피펫 콘 내에 포집된 입자들의 펠릿(pellet)에 걸친 상기 용액의 메니스커스(meniscus)의 상하 운동을 수행하도록 상기 사이클들을 적용시키는 단계를 포함하며, 상기 메니스커스의 상기 상하 운동은 상기 피펫 콘의 전체 길이보다 작은 상기 콘의 부분 상에서 수행된다.
특히, 상기 포집된 입자들의 배출은 상기 콘 워싱 용액을 완전히 흡입 및 방출하도록 상기 사이클들을 적용하는 제 2 단계를 포함한다. 상기 제 2 사이클들의 적용 빈도는 상기 제 1 사이클들의 적용 빈도보다 낮다.
특히, 상기 포집된 입자들이 배출되기 전에, 상기 방법은 2개의 개별 워싱 용액들 내에서 수행되는 2회 이상의 워싱 단계들을 포함한다.
이러한 실시형태는 상기 생물학적 샘플에 함유된 성분들은 핵산들(예를 들어, DNA, RNA)일 때 특히 유리하다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 생물학적 샘플에 함유된 성분들은 미생물들(예를 들어, 박테리아, 균류, 효모)이며, 상기 방법은 단일 포집 단계 및 단일 워싱 단계를 포함한다.
특히, 샘플과 상기 자성 입자들과의 혼합물은 1 밀리리터보다 큰, 바람직하게는 2 밀리리터와 같거나 큰 용적을 가지며, 상기 회수 웰의 용적은 200 마이크로리터보다 작으며, 바람직하게는 100 마이크로리터와 같거나 작다.
일 실시형태에 따르면, 상기 방법은 상기 전달하는 단계 전에, 상기 피펫 콘의 내벽 상에 포집된 상기입자들을 워싱하는 적어도 하나의 단계를 포함하며, 상기 적어도 하나의 워싱 단계는;
- 상기 피펫 콘 내에 상기 워싱 용액을 흡입시키고;
- 그 다음, 상기 피펫 콘의 내벽 상에 상기 입자들을 포집하기 위해 상기 자성 입자들에 인가된 상기 제 1 자기장을 조절(modulating)하고;
- 그 다음, 상기 피펫 콘 워싱 용액을 배출함으로써 수행된다.
환원하면, 자기장의 조절은 콘의 벽 상에 포집된 입자들의 펠릿의 재구성(reorganization)을 유도한다. 특히, 펠릿은 형태가 바뀔 수 있거나, 피펫 콘의 벽 상에서 퍼지거나, 미끄러지거나 "롤(roll)"할 수 있다. 이러한 펠릿의 재구성은 워싱 효율을 더욱 증가시키는 것을 가능하게 하는데, 이는 이러한 재구성이 워싱 용액의 흡입 및 배출 사이클들과 함께 수행될 수 있기 때문에 더욱 그러하다.
특히, 상기 제 1 자기장의 조절은:
- 상기 콘의 길이방향 축에 평행하게 상기 피펫 콘을 이동시키고, 상기 제 1 자기장을 일정하게 유지함으로써; 및/또는
- 상기 포집된 입자들 전방에서 서로 이격된 자석들을 이동시킴으로써 수행될 수 있다.
환원하면, 조절은 예를 들어 자석들의 스트립(strip)을 미끄러지게 하는 기술자, 또는 자석들의 스트립의 병진 이동의 간단한 메커니즘을 적용하는 자동화된 장치에 의해 간단하게 얻어진다.
일 실시형태에 따르면, 상기 피펫 콘의 용적은 상기 회수 웰의 용적보다 적어도 10배 이상 크다. 일 실시형태에 따르면, 상기 혼합물의 용적은 상기 피펫 콘의 용적보다 적어도 3배 더 크다.
일 실시형태에 따라, 성분은 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(double-stranded) 핵산(DNA 및/또는 RNA), 미생물들, 단백질들, 및 펩타이드들에 의해 형성된 군에 속한다. 성분들은 자성 입자들에 부여된 기능화에 따라 다른 유형의 분자들로 구성된다.
또한, 본 발명의 목적은 방금 기술된 방법을 수행하기 위한, 용적이 그렇게 크지 않고 실험실 기술자가 사용하기에 간편한 장치를 제공하는 것이다.
또한, 이러한 효과를 위해, 본 발명의 대상은 피펫 홀더이며, 상기 피펫 홀더는:
-베이스(base);
- 웰 지지체(well support)를 제거가능하게 수용할 수 있는, 베이스 내에 형성된 오목부(recess);
- 액체를 피펫팅하기 위한 팁(tip)을 포함하는 적어도 하나의 관형 피펫 콘을 구비하는 피펫이 그 내부에 삽입될 수 있는 제 1 하우징을 포함하는 피펫 지지체(pipette suppport)로서,
상기 제 1 하우징은 상기 베이스의 상기 오목부 상으로 개방되고,
상기 피펫 지지체는 상기 피펫 콘들의 축에 평행한 방향으로 상기 베이스에 대해 병진 운동할 수 있으며(translationally mobile),
상기 피펫 지지체는 각 피펫 콘의 상기 팁이 상기 웰 지지체의 웰 내로 삽입된 제 1 위치와 상기 팁이 상기 웰의 외부에 있는 적어도 하나의 제 2 위치 간에서 이동가능한, 상기 피펫 지지체; 및
- 자화된 부분(magnetized part)을 제거가능하게 수용할 수 있는 제 2 하우징을 포함하며,
상기 제 2 하우징은 상기 피펫 지지체가 상기 제 1 위치에 있을 때 그의 팁 위의 위치에서 상기 피펫 콘들 각각과 마주하며,
상기 제 2 하우징은 상기 피펫 지지체가 상기 제 2 위치에 있을 때 상기 피펫 콘의 상기 팁과 마주한다.
환원하면, 상기 피펫 홀더는 피펫을 수용하며, 기술자는 피펫을 상승/하강시킴으로써 추출 방법의 단계들을 수행하고, 특히 웰들(플레이트, 스트립 등의 형태)을 베이스 내로 유도하고, 피펫을 작동시킴으로써 피펫 콘(들)의 팁 내의 입자 펠릿의 이동을 유도한다.
용적이 그렇게 크지 않고 운반할 수 있는 피펫 홀더는 전자 피펫이 사용될 때 추출 방법의 반자동화(semi-automation)를 가능하게 한다. 이러한 피펫은 실제로 피펫을 구비하는 각 피펫 콘 내에서의 흡입 및 배출을 위한 회로들, 및 마이크로프로세서-기반의 전자 회로를 포함한다. 이러한 전자 회로는 피펫을 구비한 인터페이스 및/또는 피펫에 연결된 컴퓨터/태블릿/스마트폰(에를 들어, 블루투스 유형의 무선 연결), 등에 의해 기술자가 입력한 설정값들(setpoints)의 함수로서 흡입/배출 회로들을 제어한다. 이러한 설정값들은 흡입/배출 사이클 명령들 및/또는 피펫 내에 사전기록된 특정 프로토콜의 선택으로 구성된다.
전자 피펫은 프로그래밍이 가능하므로, 원하는 특정 자성 포집(예를 들어, 핵산 정제, 자기 면역농축 등)에 의해서 조절될 수 있는, 본 추출 방법의 추출 능력(definition)으로 많은 다기능(polyvalence)이 또한 획득된다. 특히, 의도된 추출에 적합한 프로토콜이 피펫 내에 기록될 수 있고, 상기 프로토콜은 흡입 및 배출 사이클들의 수, 사이클 시퀀스, 사이클 빈도, 사이클들 간의 시간, 정의된 용적들, 등으로 정의된다. 따라서 자동 및 반자동 시스템이 획득된다.
마지막으로, 피펫 콘들은 피펫으로부터 탈착가능하며, 따라서 피펫은 장시간 사용이 중단되지 않으면서 용이하게 교체가능하다.
일 실시형태에 따르면, 상기 제 1 하우징은 상기 피펫의 전방 삽입 및 상기 제 1 하우징으로부터의 상기 피펫의 전방 제거를 위한 개구(opening)를 포함한다. 피펫 및 콘들의 전방 삽입 및 전방 제거는 콘 팁들이 피펫 홀더에 닿을 위험을 최소화하므로 피펫 홀더가 오염될 위험을 최소화한다.
일 실시형태에 따르면, 상기 제 2 하우징은 상기 베이스 내에 형성된다.
특히, 상기 피펫 지지체 내의 제 3 하우징을 포함하며, 상기 피펫 지지체가 상기 제 2 위치에 있을 때 상기 콘의 상기 팁 위의 위치에서 각 피펫 콘과 마주하도록 상기 자화된 부분이 제거가능하게 상기 제 3 하우징 내에 삽입될 수 있다.
환언하면, 자화된 부분(예를 들어, 하나 이상의 영구 자석들을 포함함)이 제 3 하우징 내에 존재할 때, 상기 자화된 부분은 피펫 콘들에 강하게 연결되어 있으므로 상기 베이스에 대한 피펫 콘들의 병진 이동을 따른다. 이러한 이동들 중에, 상기 자화된 부분은 상기 콘들 내에 부착된 상기 자성 입자들의 펠릿들을 유지한다. 상기 기술자는 따라서, 상기 콘들 내의 입자 펠릿들을 이동시킬 위험없이 상기 베이스 내의 웰 지지체를 보다 용이하게 이동시키기 위해서, 예를 들어 상기 피펫을 상승시킬 수 있다.
하나의 특정 실시형태에 따르면, 상기 제 2 하우징 및 제 3 하우징은 연통(communicate)하며, 상기 피펫 지지체는 상기 자화된 부분을 상기 제 3 하우징 내에 제거가능하게 유지할 수 있는 수단을 포함한다. 이러한 방식으로, 상기 기술자는 상기 자화된 부분을 상기 피펫 지지체로부터 분리할 수 있으며, 상기 피펫 지지체는 상기 제 2 하우징 내로 떨어짐으로써 상기 베이스 내의 위치를 자동적으로 취한다. 이러한 분리는 특히 상기 콘 팁들 내의 상기 자성 입자들의 이동 동작에 대해 발생한다.
일 실시형태에 따르면:
- 상기 베이스는 회전할 수 있는 적어도 하나의 치형 휠(toothed wheel)를 포함하며;
- 상기 피펫 지지체는 상기 치형 휠의 회전 중에 상기 베이스에 대하여 상기 피펫 지지체를 병진 운동시키기 위해 상기 치형 휠과 체결(engages)하는 랙(rack)을 포함한다.
특히, 피펫 홀더는 적어도 상기 제 1 위치에서 상기 피펫 지지체를 고정하거나(lock) 고정해제(unlock)하기 위한 장치를 포함한다. 특히 피펫 홀더는 적어도 하나의 핸들(handle)을 포함하며, 상기 적어도 하나의 핸들은 상기 치형 휠에 강하게 연결되어 상기 휠을 회전시키며, 또 다른 피펫 홀더의 치형 휠에 강하게 연결된 핸들에 제거가능하게 부착될 수 있으며, 이는 추출 방법 동안 피펫 콘들의 수를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 대상은 액체 형태의 생물학적 샘플 내에 함유된 성분들을 추출하는 시스템으로서, 상기 성분들은 상기 자성 입자들에 결합될 수 있으며, 상기 시스템은:
- 액체를 피펫팅하도록 구성된 팁을 포함하는 적어도 하나의 관형 피펫 콘 및 각 피펫 콘 내로의 흡입 및 배출을 위한 회로를 갖는 피펫;
- 적어도 하나의 웰 지지체;
- 피펫 홀더로서:
ο 베이스;
ο 각각의 웰 지지체를 제거가능하게 수용할 수 있는, 상기 베이스 내에 형성된 오목부;
ο 상기 피펫이 그 내부로 삽입되는 제 1 하우징을 포함하는 피펫 지지체로서, 상기 제 1 하우징은 상기 베이스의 상기 오목부 상으로 개방되며, 상기 피펫 지지체는 상기 피펫 콘들의 축에 평행한 방향으로 상기 베이스에 대해 병진 이동가능하며, 각 피펫 콘의 상기 팁이 상기 웰 지지체의 웰 내에 삽입되는 제 1 위치와 상기 팁이 상기 웰의 외부에 있는 적어도 하나의 제 2 위치 사이에서 이동가능한, 상기 피펫 지지체; 및
ο 상기 피펫 지지체가 상기 제 1 위치에 있을 때 그의 팁 위의 위치에서 상기 피펫 콘들 각각과 마주하며, 상기 피펫 지지체가 상기 제 2 위치에 있을 때 상기 피펫 콘의 상기 팁과 마주하는, 상기 제 2 하우징을 포함하는, 상기 피펫 홀더; 및
- 상기 제 2 하우징 내에 제거가능하게 삽입된 자화된 부분을 포함한다.
특히, 상기 피펫 홀더는 전술된 피펫 홀더와 일치한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 피펫 콘들의 상기 팁들로부터 회수 웰들 내로의 자성 입자들의 이동을 위한 웰 지지를 제공하는 것이다.
이러한 효과를 위해서, 또한, 본 발명의 대상은 상기 웰을 수용하기 위한 오목부들이 형성된 부분, 및 상기 부분 내에 만들어진 상기 오목부들 각각과 마주하는 적어도 하나의 자석을 포함하는 웰 지지체이다.
본 발명은 동일한 참조 번호들이 동일한 구성요소들을 나타내는, 첨부된 도면들과 관련하여, 단지 예시로서 주어지는 다음의 설명을 읽음으로써 더욱 명확하게 이해될 것이다:
- 도 1은 본 발명에 따른 추출 시스템의 사시도이다;
- 도 2a 및 도 2b는 전자 피펫 및 그의 제거가능한 피펫 콘들의 정면 사시도들이다;
- 도 3a 및 도 3b는 본 발명에 따른 피펫 홀더의 정면 사시도들이다;
- 도 4a 및 도 4b는 각각 도 3b의 평면 A-A 및 평면 B-B를 따른 도 3의 피펫 홀더의 상세 단면도이다;
- 도 5는 웰들을 포함하는 "deepwell" 플레이트의 사시도이다;
- 도 6a 및 도 6b는 자성 랙 및 랙 내에 삽입할 수 있는 PCR 용리 튜브들(PCR elution tubes)의 사시도들이다;
- 도 7은 본 발명에 따른 자화된 부분의 정면도이다;
- 도 8은 본 발명에 따른 추출 방법의 흐름도이다;
- 도 9는 콘들의 대략 중간에 배치된 자성 입자들의 펠릿들을 갖는 본 발명에 따른 시스템의 피펫 콘들의 사진이다;
- 도 10은 상기 콘들의 팁들 내에 배치된 펠릿들을 갖는 이러한 동일한 콘들의 사진이다;
- 도 11은 자성 입자들이 회수된 PCR 용리 튜브들의 사진이다;
- 도 12 및 도 13은 본 발명에 따른 피펫 홀더의 제 2 실시예를 도시한다;
- 도 14는 회전 핸들 수단에 연결된 도 1의 2개의 시스템들의 사시도이다;
- 도 15는 펠릿을 피펫 콘의 벽으로부터 분리하기 위한 입자들의 펠릿 상의 용액의 메니스커스의 상하 운동을 도시하는 개략도이다.
도 15를 제외하고는 실제 시스템의 축소된 스케일의 평면들 및 사진들과 관련하여 설명한다.
- 도 1은 본 발명에 따른 추출 시스템의 사시도이다;
- 도 2a 및 도 2b는 전자 피펫 및 그의 제거가능한 피펫 콘들의 정면 사시도들이다;
- 도 3a 및 도 3b는 본 발명에 따른 피펫 홀더의 정면 사시도들이다;
- 도 4a 및 도 4b는 각각 도 3b의 평면 A-A 및 평면 B-B를 따른 도 3의 피펫 홀더의 상세 단면도이다;
- 도 5는 웰들을 포함하는 "deepwell" 플레이트의 사시도이다;
- 도 6a 및 도 6b는 자성 랙 및 랙 내에 삽입할 수 있는 PCR 용리 튜브들(PCR elution tubes)의 사시도들이다;
- 도 7은 본 발명에 따른 자화된 부분의 정면도이다;
- 도 8은 본 발명에 따른 추출 방법의 흐름도이다;
- 도 9는 콘들의 대략 중간에 배치된 자성 입자들의 펠릿들을 갖는 본 발명에 따른 시스템의 피펫 콘들의 사진이다;
- 도 10은 상기 콘들의 팁들 내에 배치된 펠릿들을 갖는 이러한 동일한 콘들의 사진이다;
- 도 11은 자성 입자들이 회수된 PCR 용리 튜브들의 사진이다;
- 도 12 및 도 13은 본 발명에 따른 피펫 홀더의 제 2 실시예를 도시한다;
- 도 14는 회전 핸들 수단에 연결된 도 1의 2개의 시스템들의 사시도이다;
- 도 15는 펠릿을 피펫 콘의 벽으로부터 분리하기 위한 입자들의 펠릿 상의 용액의 메니스커스의 상하 운동을 도시하는 개략도이다.
도 15를 제외하고는 실제 시스템의 축소된 스케일의 평면들 및 사진들과 관련하여 설명한다.
도 1 내지 도 7을 참조하면, 액체 샘플 내에 함유된 성분들을 추출하기 위한 시스템(10)(도 1)은 전자 피펫(electronic pipette)(12)(도 2), 상기 피펫(12)이 내부에 삽입되는 피펫 홀더(pipette holder)(14)(도 3), 상기 피펫 홀더(14) 내부에 삽입될 수 있는 하나 이상의 웰 지지체들(well supports)(18a, 18b)(도 5 및 도 6), 및 제 1 자화된 부분(first magnetized part)(16)(도 7)를 포함한다.
휴대가능한 상기 피펫(12)은 피펫 콘들(pipette cones)(20)의 열(row), 및 콘들(20)이 그 상에 장착된 본체(22)를 포함한다(도 2a). 이러한 본체(20)는 콘들(20) 내의 액체의 흡입/배출을 위한 회로(예를 들어, 전기 모터에 의해 작동되는 한 세트의 피스톤들), 및 흡입/배출 회로를 제어하기 위한 전자 회로를 수용한다. 예를 들어, 마이크로프로세서 및 하나 이상의 컴퓨터 메모리들을 포함하는 전자 회로는 프로그램가능하며, 하나 이상의 피펫팅 프로토콜들(pipetting protocols)을 수행하기 위한 명령들이 내장되어 있으며, 각 프로토콜은 하나 이상의 단계들을 포함한다. 또한, 전자 회로는 본체(22)의 핸들(26) 내에 수용된 인간-머신 인터페이스(man-machine interface)(24)를 포함하며, 상기 인터페이스는 다양한 기록된 피펫팅 프로토콜들의 시각화 및 선택을 가능하게 하는 선택 및 네비게이션 버튼들(28) 및 디스플레이 스크린(30)의 세트를 포함한다. 사용자는 특히, 예를 들어 블루투스와 같은 무선 링크를 통해 상기 피펫(12)에 연결된 컴퓨터로부터의 명령들을 상기 피펫으로 다운로드함으로써, 전자 피펫(12)을 프로그래밍할 수 있다. 또한, 사용자는 인터페이스(24)를 통해 사전기록된 프로토콜을 선택할 수 있다. 더욱이, 피펫(12)은 각각의 콘들(20) 내로 미리정해진 용적의 액체를 흡입하고, 각 콘들로부터 미리정해진 용적을 방출하고, 가변 시간 및 가변 빈도로 자동 흡입/방출 사이클들을 수행할 수 있다.
도 2b에서 보다 구체적으로 도시된 바와 같이, 원통형이며 길이방향 축(X)을 갖는 상기 콘들(20)은 본체(22)로부터 돌출된 돌출부들(lugs)(32)에 끼워맞춤으로써 제거될 수 있으며, 이는 본체들이 교체될 수 있게 한다. 더욱이, 상기 콘들은 플라스틱, 예를 들어, 폴리프로필렌으로 이루어져 있으며, 이는 콘들을 자기장에 대해 "투명하게" 만드는 효과가 있으며, 이후에 자세히 설명되는 바와 같이 자성 입자를 포집(capture)할 수 있다. 마지막으로, 각각의 콘(20)은 그의 개방된 피펫팅 단부에서 테이퍼형 프로파일(tapered profile)(21) 또는 "팁(tip)"을 갖는다. 이러한 부분(21)은 축(X)에 수직인 평면에서 감소된 단면을 가지므로, 공지된 바와 같이 그것을 컨테이너들 또는 웰들 내로 용이하게 도입할 수 있게 한다.
전자 피펫(12)은 예를 들어 스위스의 회사 ⓒIntegra Biosciences AG에 의해 판매되는 "8-채널 Viaflo II"모델이며, 상기 모델의 요소들은 특허 출원 US 2009/071266, US 2009/074622, US 2011/076205, 및 US 2008/095671에 기술된다.
그의 부분을 위한 피펫 홀더(14)는 작업대(workbench)(예를 들어, 실험실 테이블 또는 벤치) 상에 배치되는 베이스(34), 및 상기 베이스(34)에 대해 이동하는 이동 부분(mobile part)(36)을 포함한다(도 3a 및 도 3b). "피펫 지지체(pipette support)"로도 불리는 상기 이동 부분(36)은 도 1에 도시된 바와 같이 피펫(12)이 제거가능하게 삽입되고 움직이지 않게 유지되는 하우징(38)을 포함한다. 상기 베이스(34)에 대한 상기 피펫 지지체(36)의 병진 운동(translational movement)을 위해, 상기 지지체(36)는, 회전하며 상기 베이스(34) 내에 삽입된 축(axle)(44) 상에 장착된 치형 휠들(42)과 맞물리는 하나 이상의 랙들(racks)(40), 예를 들어 그들 중 2개를 포함한다. 또한, 하나 이상의 로드들(rods)(46)은, 상기 지지체(36)를 그의 병진 운동으로 안내하기 위해 상기 지지체(36)(각각 상기 베이스(34) 내에 있음)에 부착되며, 상기 베이스(34)의 오리피스들(각각 상기 지지체(36) 내에 있음) 내로 미끄러진다. 또한, 1개 또는 2개의 회전 핸들들(50)은 사용자가 화살표(52)(도 1)의 방향으로 축을 용이하게 회전시킬 수 있도록 축(44)의 단부에 부착되며, 따라서 화살표(54)(도 1)로 도시된 바와 같이 피펫 지지체(36)의 상승 및 하강을 야기한다. 따라서, 상기 피펫(12)이 상기 지지체(36)의 하우징(38) 내에 놓일 때 베이스(34)에 대한 피펫 지지체(36)의 병진 운동은 콘들(20)의 축(X)에 평행하며, 따라서 상기 지지체(36)가 "상승" 또는 "하강"하도록 베이스(34)가 수평 작업대에 놓일 때 중력의 방향에 평행하다.
상기 베이스(34)는 웰 지지체들(18a, 18b)의 도입 및 제거를 가능하게 하도록 그의 전방 면(56) 상에서 개방되어, 웰 지지체들(18a, 18b)을 위한 하우징을 형성한다. 이러한 하우징은, 피펫(12)의 콘들(20)이 피펫이 하강할 때 상기 웰 지지체들에 도달할 수 있도록 그의 상부가 개방되어 있다. 따라서, 이하에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 피펫(12)은 베이스(34)에 대해, 따라서 베이스(34)에 삽입된 웰 지지체들(18a, 18b)에 대해 복수 개의 위치들을 취할 수 있다. 특히, 피펫(12)은 콘들(20)의 팁들(21)을 지지체(18a, 18b)의 웰들 내에 담그는 위치를 취할 수 있으며, 팁들(21)을 웰들 내에 담그지 않는 적어도 하나의 위치는 웰 지지체들이 사용자에 의해 다뤄지고 자성 입자들이 콘들(20)의 중심 위치에서 포집되도록 웰들로부터 거리를 두고 있다.
도 5 및 도 6을 참조하면, 상기 웰 지지체들은 원하는 추출에 따라 여러 형태들을 가질 수 있다. 특히, 웰 지지체는 "DeepWell" 유형의 "마이크로플레이트"라고 지칭되는 구획화된 플레이트(compartmentalized plate)(18a)(도 5)이다. 이러한 유형의 플레이트는 웰들(52)의 열들(rows)(60)을 포함하며, 상기 열들(60) 내에 피펫 콘들(20)의 열을 담글 수 있다. 따라서, 각각의 열(60)은 시스템(10)에 의해 수행되는 추출 단계 동안 사용된 특정 액체를 수용할 수 있다. 한 열(60)로부터 다른 열로 통과하는 것은 피펫 콘들(20)과 일치하며, 수행되어야 하는 단계에 필요한 액체를 함유하는 특정한 열(60)을 위치시키는 사용자에 의해 간단히 수행된다.
도 6a에 기술된 또 다른 웰 지지체는 피펫 콘들(20)의 팁들(21)로부터 웰들로의 자성 입자들의 이동을 위해 자화되고 특별히 설계된다. 지지체(18b)는 이러한 목적을 위해 피펫 콘들(20)의 열을 수용할 수 있는 일렬의 하우징(66)이 내부에 형성되며, 하나 이상의 영구 자석들, 예컨대 각각의 웰들(66)에 근접한 영구 자석을 포함하는 제 2 자화된 부분(68)이 삽입되는 본체(64)를 포함한다. 자화된 부분(68)은 웰들(66) 아래에 배치되거나 도시된 바와 같이 웰들의 하부들과 마주한다. 따라서, 상기 팁들이 웰들(66) 내로 담가질 때(dipped), 상기 피펫 콘들(20)의 상기 팁들(21)은 자화된 부분(68) 위에 배치된다. 마지막으로, 지지체(18b)는 그의 내부에 회수된 추출 결과물의 후속적인 이송과 같은 목적들을 위해 하우징들(66) 내의 튜브들(69), 예를 들어 도 6b에 도시된 바와 같은 PCR 용리 튜브들(PCR elution tubes)을 제거가능하게 수용하는 자성 랙(magnetic rack)으로서 작용한다.
후속적으로 더 상세히 기술된 방식으로 콘들(20) 내의 자화된 입자들을 포집하는 기능을 갖는 제 1 자화된 부분(16)은 그의 부분을 위해 하나 이상의 영구 자석들(72)을 포함하며, 상기 제 1 자화된 부분(16)이 베이스(34) 내에 완전히 삽입될 때 바람직하게는 공간들(74)에 의해 서로 분리된 영구 자석들의 열, 더욱 바람직하게는 각각의 피펫 콘(20)에 면하는(facing) 영구 자석을 포함한다. 상기 부분(16)은 또한 사용자에 의한 보다 양호한 파지를 위한 핸들(76)을 포함한다.
베이스(34) 내에는 자화된 부분(16)을 수용하는 하우징(78)이 구비되며, 상기 하우징(78)은 상기 부분(16)이 피펫 콘들(20)의 팁(21) 위에서 상기 피펫 콘들(20)을 마주하며, 바람직하게는 상기 팁들(21)을 웰들 내에 담글 때 웰 지지체에 지지되는, 상기 웰보다 더 높은 높이의 중심 구역(80)과 마주하도록 배치된다. 이러한 방식으로, 입자들은 콘들 내에 플러그들을 형성하지 않도록 충분히 큰 콘의 용적 내에 포집된다.
또한, 피펫 홀더(14)는 지지체(36)가 상승하는 속도를 제어하기 위한 수단을 포함한다. 특히, 랙 및 치형 휠은 휠(50)의 반 바퀴(180°)가 랙 전체를 가로질러 이동하고, 플라이웨이트(flyweight)(58)가 축(44)에 대하여 비축(off-axis)상으로 각각의 핸들들(50)에 통합되는 것을 가능하게 하도록 설계된다. 이러한 플라이웨이트들은 그들의 중량 및 연관된 지렛대 효과에 의해, 사용자에 의해서 수동으로 전달되는 회전 커플(rotation couple)을 제한하면서, 축(44)을 회전시키는 회전 커플을 생성한다. 바람직하게는, 도 4a에 도시된 바와 같이, 축(44)의 실질적인 부분은 또한 동일한 목적을 위해 반원통형 플라이웨이트로 형성된다. 이러한 기계적 보조는 피펫 지지체를 상승시키는 것을 돕고, 따라서 근골격계 문제들(musculoskeletal problems)을 제한하고, 사용자가 지지체(36)가 상승 및 하강하는 속도를 보다 정확하게 제어할 수 있게 하는 제동(braking)을 수행한다.
지지체(36)의 속도를 제어하기 위한 다른 메커니즘들, 특히 자성 제동(magnetic braking)을 제공할 수 있다. 예를 들어, 도 4a를 참조하면, 상기 플라이웨이트(59)는 자화가능한 재료(예를 들면, 강(steel) 또는 등가물)를 포함하고, 제 3 자화된 부분(80)(평행육면체(parallelepipedal) 또는 축(44)과 동심원을 이루는 원호의 형태)은 베이스(34) 내에 수용되며, 바람직하게는 추출을 방해하지 않도록 축(44)에 대해 자화된 부분(16)을 마주한다. 축의 플라이웨이트(59)가 자화된 부분(80)의 전방을 통과할 때, 제동 커플(braking couple)이 생성되기 때문에 축(44)의 회전 운동은 느려진다. 이는 한편으로는 (사용자를 돕는 역할을 함으로써) 상승하는 동안 피펫을 올리기 위한 노력을 보상할 수 있게 하며, 다른 한편으로, 후술되는 바와 같이 자성 입자들이 피펫 콘들의 하단으로 하강하도록 하는 것이 바람직할 때 피펫이 상승하는 속도를 제어한다.
도 4b에 도시된 바와 같이, 정지 메커니즘(stop mechanism)이 유리하게 제공된다. 이러한 변형예에서, 변형가능한 재료(예를 들어 엘라스토머)로 이루어진 휠(wheel)(84)이 축(44) 상에 장착되며, 2개의 치형부들(teeth)(86, 88)을 포함한다. 돌출부(protuberance)(82), 예를 들어 반구형 돌출부는 휠(84)에 면하는 베이스(34)로부터 돌출한다. 사용자가 휠(50)을 작동시켜 피펫(12)을 상승시키면, 제 1 치형부(86)는 돌출부(82)와 만난다. 휠(50)에 형성된 절삭부(cut)가 증가될 때, 치형부(86)는 구부러져 돌출부(82)를 통과하며, 그의 형상으로 복귀한다. 이러한 위치에서, 치형부(86)는 돌출부(82) 상에 놓일 수 있고, 이러한 치형부의 경도(hardness)는 피펫(12)과 피펫 홀더(36)의 무게의 작용 하에서 구부러지지 않도록 선택된다. 따라서, 피펫은 상단 위치에서 차단되고, 따라서 사용자는 휠(50)을 풀 수 있다(release). 치수(예를 들어, 길이 및/또는 폭)가 더 큰 제 2 치형부(88)는, 이 치형부가 이동하기 위해서 더 큰 커플(couple)을 필요로 하며, 따라서 사용자가 이러한 치형부를 파괴(breaking)할 수 있는 힘을 인가하지 않는 한, 피펫 홀더(36)가 베이스(34)로부터 분리되는 것을 방지하기 위한 스톱부(stop)를 형성한다. 변형예로서, 돌출부(82)는 베이스의 하우징 내의 스프링 상에 장착된 볼을 포함하는 스톱으로 대체된다. 따라서, 휠(84)은 경질 재료로 이루어질 수 있다. 제 1 치형부(86)의 작용은 볼을 그의 하우징 내로 밀어넣음으로써 치형부(86)를 통과시키는 효과를 갖는다.
현재, 자성 입자들에 의해 액체 샘플 내에 함유된 성분을 추출하는 방법이 기술되어 있는데, 이러한 방법은 방금 기술된 시스템에 의해 수행된다. 1ml 내지 5ml의 피펫 콘마다 샘플 용적을 처리하기 위한 자성 입자들을 포집, 워싱, 및 용리시키는 다양한 단계들을 수행하기 위해, 상기 방법은 피펫 홀더, 프로그램가능한 전자 피펫, 및 피펫 콘들(예를 들어, 1250μl의 용적)의 조합을 기반으로 한다. 자성 입자들의 포집은 처리될 샘플의 모든 용적 상에서의 흡입/배출 사이클들 동안 피펫 콘들 내에서 순차적으로 수행된다. 예로서, NucliSENSⓒ 화학을 사용하여 바이러스 핵산들(viral nucleic acids)을 정제하는 방법, 즉 자성 실리카 입자들을 사용하여 핵산들을 추출하는 방법이 도 8의 흐름도와 관련하여 기술된다.
상기 방법은 정제에 필요한 다양한 샘플들 및 시약들(reagents)을 준비하는 단계(100)로 시작하여, 단계(102)에서 상기 정제를 수행한다.
특히, 준비(100)는 핵산들을 추출하고자 하는 바이러스들을 포함하는 생물학적 샘플을 바이러스들의 화학적 용해(lysis)를 위한 시약(예를 들어, bioMιrieux, 참조번호 200292의 "Nuclisens miniMAG" 용해 시약, 또는 bioMιrieux, 참조번호 280130의 "Nuclisens easyMAG" 용해 시약과, 1 부피의 샘플에 대해 2 부피의 용해 시약의 비율로 혼합하는 것을 단계(104)에 포함한다. 상기 혼합물은 56℃에서 30분간 가열된 후, 바이러스들로부터 핵산들을 그 자체로 공지된 방식으로 방출시킨다. 핵산들과 결합하는 성질을 갖는, 자성 실리카 입자들(예를 들어, 상자성, 강자성 또는 페리자성 코어를 갖는 입자들은 잔류 자기(remanence)를 나타낼 수도 있고 나타내지 않을 수도 있으며, 상기 코어는 실리카 쉘(silica shell)로 덮여있음)은 단계(106)에서 용해된 샘플 내로 도입된다.
준비(100)는 단계(108)에서 5ml의 웰들(62)을 갖는 마이크로플레이트(18a), 및 자성 랙(18b)의 0.2ml의 PCR 용리 튜브들(69)를 다음과 같이 충진함으로써 계속된다:
- 마이크로플레이트(18a)의 제 1 열의 각 웰은 실리카 입자들을 포함하는 용해된 샘플, 이하, "용해된 샘플"로 충진된다. 제 1 열의 각 웰의 총 용적은 5ml Deepwell 마이크로플레이트 및 전자 피펫으로 처리되는 용적들의 사용으로 인해 1.5ml보다 큰 것이 바람직하다;
- 마이크로플레이트(18a)의 제 2 열의 각 웰(66)은 1250㎕의 워싱 완충액(예를 들어, BioMerieux의 bMx 참조번호 280131의 "NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 2")로 충진된다.
- 마이크로플레이트(18a)의 제 3 열의 각 웰(66)은 1250㎕의 워싱 완충액(예를 들어, BioMerieux의 bMx 참조번호 280131의 "NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 2")로 충진된다.
- 자성 랙(18b) 내에 삽입된 각 PCR 용리 튜브(69)는 100㎕의 용리 완충액(예를 들어, BioMerieux의 참조 번호 280132의 "NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 3")로 충진된다.
그 후, 사용자는 다음을 배치한다:
- 플레이트(18a)의 도입을 가능하게 하도록 상승된 위치에서, 피펫 홀더(14)의 하우징(38) 내에 콘들(20)의 열을 갖는 전자 피펫(12); 및
- 콘들(20)과 일치되는 용해된 샘플을 포함하는 웰들의 제 1 열을 갖는 베이스(34)의 하우징(56) 내의 플레이트(18a).
추출(102)은 용해된 샘플의 균질화로 시작한다. 이를 위해, 자화된 부분(16)은 베이스(34) 내에 배치되지 않으며, 따라서 콘들(20)과 간섭하지 않는다. 사용자는 용해된 샘플을 포함하는 플레이트(18a)의 웰들의 열 내에 콘들(20)의 팁들(21)을 담그도록 휠들(50) 중 하나를 회전시킨다. 이어서, 사용자는 피펫(12)의 인터페이스(24)에 의해, 콘들(20) 내의 용해된 샘플의 흡입/방출의 적어도 하나의 단계(phase)를 포함하는 제 1 피펫팅 프로토콜을 선택하며, 선택된 프로토콜을 개시한다. 이러한 단계들(예를 들어, 단계들 중 2개)은 각각 적어도 하나의 흡입/배출 사이클(예를 들어, 5 사이클들)을 포함하고, 수 분, 예를 들어 5분간의 대기 기간이 뒤따른다. 본 발명의 목적들을 위하여, 흡입 및 배출 사이클은 프로그램에 의해 달리 명시되지 않는 한, 적어도 3/4의 충진, 예를 들어 완전히 충진시키는 단계, 그리고 완전히 비우는 단계로 구성된다.
일단 균질화(homogenization)가 완료되면, 콘들(20)은 비어 있고, 그들의 팁들(21)은 용해된 샘플을 함유하는 웰들 내로 담가진다. 정제(102)는, 단계(112)에서의 콘들(20)의 내벽 상에 용해된 샘플의 실리카 입자들을 포집하는 것으로 계속된다. 이러한 효과를 위해, 사용자는 자화된 부분(16)을 베이스(34)의 하우징(78) 내에 위치시키고, 피펫(12)의 인터페이스(24)에 의해 제 2 피펫팅 프로토콜을 선택하고, 선택된 프로토콜을 개시한다. 제 2 프로토콜은 복수의 흡입/대기/배출 사이클들, 예를 들어 약 10 사이클들을 포함하고, 흡입 작동은 수 초, 예컨대 약 10초만큼 배출 작동으로부터 분리된다. 각 흡입 작동 및 각 배출 작동에서, 용해된 샘플 내에 함유된 입자들의 일부는 자화된 부분(16)에 의해 생성된 자기장에 의해 피펫 콘들의 벽 상에 포집된다. 따라서 자성 입자들, 및 이들에 결합된 핵산들은, 도 9에 도시된 바와 같이, 자화된 부분(16)을 마주보는 입자들(100)의 펠릿들(pellets)의 형태로, 바람직하게는 콘들(20)의 중간의 중심 영역 상에 포집된다.
일단 포집이 완료되면, 용해된 샘플은 콘들(20)로부터 완전히 배출되며, 자화된 부분(16)은 여전히 제 자리에 있고, 상기 정제(102)는 제 1 워싱 단계(114)로 계속된다. 이를 위해, 사용자는 플레이트(18a)를 콘들(20)로부터 분리하기 위해 피펫 홀더(14)를 들어올리고(각각 피펫(12)을 들어올림), 플레이트(18a)의 제 2 열을 콘들(20)의 열과 정렬시키며, 그 이후 플레이트(18a)의 웰들 내에 콘들의 팁들(21)을 담그도록 피펫 홀더를 재배치한다(각각 피펫을 내림). 이어서 사용자는 콘들(20) 내의 용해된 샘플의 흡입/방출의 적어도 하나의 단계를 포함하는 제 3 피펫팅 프로토콜을 인터페이스(24)에 의해 선택하고 선택된 프로토콜을 개시한다. 세 번째 프로토콜은 예를 들어 첫 번째 프로토콜과 동일하다. 따라서, 입자 펠릿들에 대한 워싱 완충액의 반복적인 통과는 상기 입자들의 워싱을 가능하게 한다. 이러한 워싱 단계는 콘들 상에 입자들을 포집하는 자기장의 조절(modulation)과 함께 유리하게 완료되거나 공동으로 수행된다. 예를 들어, 사용자는 콘들 상의 입자 펠릿들을 이동시키는 효과를 갖는 피펫(12)을 올리거나 내리거나, 또는 대안적으로 자화된 부분(16)은 영구 자석들의 세트를 포함하며, 사용자는 콘들 상의 포집된 입자들을 유지하는 동시에, 펠릿들을 포집하는 자기장들의 강도 및 라인들이 변하도록 상기 자화된 부분(16)을 그의 하우징(78)으로부터 상하 운동하도록 미끄러지게 한다. 따라서 자기장의 조절은 워싱 동안 펠릿들을 재구성하고 그의 효율을 증가시키는 효과를 갖는다.
이어서, 플레이트(18a)의 제 3 열의 워싱 완충액에 의해 단계(116)에서 제 2 워싱 동작이 수행된다. 예를 들어, 제 1 워싱 완충액이 콘들로부터 완전히 비워진 후, 제 1 워싱 동작과 동일한 제 2 워싱 동작이 수행된다.
이러한 제 2 워싱 조작에 이어서, 입자 펠릿들(200)의 콘들(20)의 팁들(21) 내로의 이동 단계(118)가 수행된다. 이를 위해, 펠릿들(200)의 미끄러짐을 용이하게 하고 플레이트(18a)의 제 2 열과 정렬된 상태로 유지하기 위해, 콘들(20)은 우선적으로 제 2 워싱 완충액으로 충진된다. 사용자는 피펫(12)을 들어올리도록 휠들(50) 중 하나를 회전시킨다. 자화된 부분(16)이 베이스(34)에 단단히 연결되기 때문에, 펠릿들은 따라서 상기 부분에 대해 움직일 수 없게 유지되며, 피펫이 상승됨에 따라 콘들(20)의 벽들을 따라 미끄러짐으로써 팁들(21)을 향해 이동한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 펠릿들(200)이 팁들(21) 내에 있을 때 사용자는 콘들의 개방 단부들로부터 수 밀리미터, 예를 들어 8mm의 평균 거리로 피펫(12)의 상승을 멈춘다. 이러한 위치에서, 사용자는 콘들(20) 내에 함유된 워싱 완충액의 플레이트(18a)의 웰들 내로의 배출을, 인터페이스(24)에 의해 선택하고 개시한다. 선택적으로, 워싱 단계들 중 하나, 또는 추가적인 워싱 단계는 자성 입자들을 방출시키도록, 그리고 흡입 및 방출 사이클들에 의해 워싱 완충액 내의 입자들을 교반하는 동시에 워싱 동작을 수행하기 위해, 자화된 부분을 제거하는 단계로 구성된다. 그 후, 입자들은 전술된 바와 같이 자화된 부분의 위치를 변경하고, 흡입 및 배출 사이클들을 수행함으로써 다시 한번 포집된다.
정제(102)는 콘들(20)의 팁들(21) 내에 존재하는 자성 입자들을 PCR 용리 튜브들(69) 내로 이동시키는 단계(120)로 끝난다. 이러한 효과를 위해, 사용자는 피펫 홀더(14)를 상승시키고, 플레이트(18a)를 제거하고, PCR 튜브들(69)이 콘들(20)의 열과 정렬되도록 자성 랙(18b)를 하우징(56) 내에 배치하고, 피펫 홀더(14)를 놓고, 콘들로부터 포집된 자성 입자들을 방출시키기 위해 베이스(14)로부터 자화된 부분(16)을 제거한다. 일단 팁들(21)이 튜브들(69) 내에 담가지면, 사용자는 인터페이스(24)에 의해 제 4 피펫팅 프로토콜을 선택하고 선택된 프로토콜을 시작한다. 이러한 프로토콜의 제 1 변형은 콘들(20)의 팁들(21) 내의 용리 완충액의 흡입 및 방출의 사이클들로 이루어져, 입자 펠릿들을 분해(break)함으로써 자성 입자를 재현탁(resuspend)할 수 있게 한다. 더욱이, 사이클들을 위해 선택된 빈도는 튜브들(69) 내에서의 각 배출시에 자성 입자들의 일부가 랙(64) 내로 삽입된 자화된 부분(68)의 자기장에 의해 튜브들(69) 내에 포집될 수 있게 한다. 또한, 이러한 사이클들은 콘들의 벽들에 부착된 입자들을 회수하기 위해 팁들(21)을 "헹구는(rinse)" 것이 가능하게 한다. 프로토콜의 제 2 변형에서, 흡입 및 배출 사이클들은 완충액과 입자들을 더욱 활발하게 교반하도록 우선 더 높은 빈도로 수행되며, 이에 따라 용리 튜브들(69)로의 이동을 용이하게 하는 가속화된 균질화를 획득한다. 상기 이동시키는 단계는 튜브들(69) 내의 용리 완충액의 완전한 배출로 끝난다. 랙(64)의 자기장의 영향 하에서, 자성 입자들은 도 11에 도시된 바와 같이 용리 완충액으로부터 명확하게 분리된다. 따라서, 사용자는 후속 처리를 위해 튜브들(69)을 회수할 수 있으며, 특히 가열에 의해 핵산들을 자체 공지된 방식으로 용리시킬 수 있다.
전술된 피펫 홀더의 실시예에서, 자화된 부분(16)은 베이스(34) 내에 삽입된다. 따라서, 사용자가 플레이트(18a)를 전방으로 이동시키기를 원할 때, 이러한 동작을 수행하기에 충분히 높이 피펫을 올릴 수 있다. 이는 팁들로의 입자들의 이동과 관련하여, 펠릿들(200)이 콘들(20)의 벽들에 걸쳐 이동하게 하고, 이는 스스로 롤 오버(roll over)할 수 있는 펠릿들을 "재구성(reorganizing)"하는 이점을 갖는다. 따라서 워싱 효과가 강화된다. 반면에, 이는 펠릿들이 콘들을 떠나지 않도록 사용자가 피펫을 너무 많이 올리지 않도록 주의해야 함을 의미한다. 이를 위해, 사용자는, 예를 들어, 콘 개구부들(cone openings)로부터 일정한 거리에 펠릿들을 유지하도록 피펫 홀더를 올리거나 기울일 수 있다. 그러나, 장치의 반복적인 상승이 필요한 이러한 옵션은 무게가 상당할 수 있어, 장기간에 근골격계 문제들로 이어질 수 있다. 또한, 사용자는 또한 펠릿들이 콘들을 떠나지 않도록 피펫 홀더를 너무 많이 들어올리지 않도록 주의해야 한다.
본 발명에 따른 피펫 홀더의 제 2 실시예는 피펫만을 상승시킴으로써 피펫 홀더(14)를 들어올리는 것을 피하여 플레이트들(18a, 18b)의 취급을 가능하게 하는 동시에, 입자 펠릿들이 콘들의 팁들(21)로부터 일정한 거리에서 유지되는 것을 보장한다. 이러한 제 2 실시예, 및 방금 설명된 방법에 대해 생성된 변형들이 도 12 및 도 13에 도시되어 있다.
특히, 제 2 실시예는 피펫 홀더(14) 내에 자화된 부분(16)을 수용하는 수단에 의해 제 1 실시예와 다르다. 특히, 베이스(34)는 전술한 바와 같이 자화된 부분(16)을 삽입 및 제거하기 위한 하우징(78)을 포함하고, 하우징(78)은 하우징(78) 내에 부분(16)을 수직 방향으로 삽입 및 제거할 수 있도록 그의 상부(130)에서 개방된다. 또한, 피펫 지지체(36)는 개방 하우징(78), 특히 이동가능한 피펫 지지체(36)의 후방 벽(134)에 부착된 자화가능한 재료(예를 들면 강철로 이루어짐)로 이루어진 하나 이상의 블록들(132)과 일치하도록 자화된 부분(16)을 부착하기 위한 수단을 포함한다(도 12c). 이러한 방식으로, 자화된 부분(16)은 도 12b 내지 도 13a에 도시된 바와 같이 사용자가 피펫을 올리거나 내릴 때(특히 워싱 단계들 중에) 콘들(20)과 마주하는 상태로 유지된다.
콘들(20)의 팁들 내로 펠릿들(200)의 이동을 수행하기 위해, 사용자는 부분(16)의 핸들(78) 상에 간단한 하향 압력을 가함으로써 피펫 지지체(36)로부터 자화된 부분(16)을 분리하고, 피펫(12)을 들어올린다. 자화된 부분(16)은 블록들(134)로부터 분리되어, 베이스의 하우징(78) 내에 잔존하고 따라서 베이스(34)에 단단히 연결되어 펠릿들(200)이 콘들의 팁들(21) 내로 이동하도록 유도한다(도 13a 및 도 13b). 일단 피펫이 올려지면, 사용자는 플레이트(18a)를 PCR 용리 튜브들이 장착된 랙(18b)으로 대체하고, 자화된 부분(16)을 제거하고 피펫을 다시 내린다(redescends)(도 13c, 튜브들(69)은 도시되지 않음). 변형예로서, 특히 워싱 단계들에서, 피펫 지지체(36)는 사용자가 자화된 부분을 미끄러지게 하는 베이스의 하우징(78)과 유사한 하우징을 포함할 수 있다.
특정 추출 방법이 기술되었다. 그러나, 본 발명은 자성 입자들의 임의의 유형의 포집 및 임의의 유형의 피펫팅 순서에 적용된다. 마찬가지로, 특정 용적을 갖는 8개의 채널들을 갖는 피펫이 기술되었다. 피펫은 의도된 용도에 따라 임의의 용적의 임의의 수의 채널들을 포함할 수 있다.
프로세싱되는 샘플들의 수를 증가시키기 위해, 도 14에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 2개의 추출 시스템들이 결합될 수 있다. 예를 들어, 회전 핸들들(50)은 2개의 추출들이 동시에 수행될 수 있도록 함께 끼워맞춰질 수 있으며(fit together), 사용자는 동시에 피펫들(12)을 들어올리고 내린다. 이를 위해, 피펫들은 예를 들어 하나의 피펫이 다른 피펫을 제어하도록 동기화될 수 있다(synchronized).
마찬가지로, 특히 매일 실시되는 추출들의 제한된 수를 갖는 시험 실험실들(test laboratories)에 적합한, 휴대용 및 반자동 추출 시스템이 기술되었다. 그러나, 본 발명은 자동화될 수 있다. 예를 들어, 피펫은 피펫을 들어올리고 내리고 자석을 움직이게 하기 위한(또는 전자석들을 활성화/비활성화시키기 위한) 프로그래밍가능한 메커니즘들을 갖는 자동화된 장치에 통합되어 있다.
마이크로플레이트(18a)의 제 2 열 및 제 3 열의 웰들에서의 두 번의 워싱 동작들이 기술되었다. 그러나, 임의의 수의 워싱 작동들이 있을 수 있다. 마찬가지로, 콘들 내에 입자들을 포집하는 단일 단계가 기술되었다. 각각 추가적인 포집 단계가 뒤따르는, 입자들을 방출시키는 하나 이상의 단계들이 또한 제공될 수 있다.
입자들을 방출하기 위해, 자화된 부분(16)을 그의 하우징으로부터 제거함으로써 입자들을 포집하기 위한 자기장이 비활성화되며, 입자 펠릿들을 콘들의 벽들로부터 분리하고, 그들을 분해(disaggregate)하도록 피펫 콘들 내에서 완충액의 흡입/방출 사이클들이 수행된다. 이러한 절차는 분당 5 사이클의 흡입/방출 빈도(콘들 내에서의 완전한 흡입 및 배출)로 콘들의 벽들로부터 펠릿들을 완전히 분리하는 데 10분 넘게 걸린다. 도 15를 참조하면, 완충액(302)이 콘(20) 내에 형성하는 메니스커스(meniscus)(300)의 펠릿(200) 상에서의 상하 운동을 수행함으로써 펠릿(200)의 보다 빠른 방출이 획득된다. 특히, 메니스커스가 펠릿을 통과하는 빈도를 증가시키기 위해 메니스커스(300)가 펠릿(200)의 양 측 상에서 제한된 경로(304)를 이동하도록 흡입/배출 사이클이 조절된다. 마찬가지로, 흡입/방출 사이클들의 빈도는 특히 자성 입자들의 펠릿이 존재하는 구역 상에서 초 당 2 사이클보다 큰 사이클 빈도로, 상기 통과 빈도를 더욱 증가시키기 위해 증가된다. 이러한 절차가 적용되면 펠릿들이 1분 이내에 콘들로부터 분리된다. 본 발명자들은 펠릿을 분리시키는 데 도움이 되는 것은 펠릿을 넘어서 메니스커스가 통과되는 것이라고 언급하였다. 실제로, 테스트들은 주목할 만한 시간 절약없이 펠릿들 너머로 메니스커스를 통과시키지 않고(즉, 펠릿들 전방에서의 액체의 "단순한" 운동) 콘들 내의 완충액을 빠르게 교반함으로써 수행되었다. 일단 펠릿 방출 단계가 수행되면, 상기 단계는 또한 펠릿들을 분해시키는 효과를 가지며, 콘들 내에서의 완전한 흡입/방출에 의한 교반 단계(예를 들면, 분 당 8회 흡입/배출 사이클들)가 수행되어 펠릿들의 분해를 종결시키고 입자들을 포함하는 완충액을 균질화시킨다. 마이크로플레이트들의 웰들 내에서의 이러한 완전한 흡입/배출 사이클들은 보다 긴 경로를 통해 더 큰 용적을 교반하여, 완충액의 균질화를 촉진시킨다.
이제, 예를 들어, 자성 실리카 입자들에 의해, 특히 바이러스성 기원(viral origin)의 핵산들(예를 들어, DNA 및 RNA)을 추출하기 위한 바람직한 방법이 설명될 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 전술된 바와 같이, 완충액 내에서의 워싱 단계, 및 입자들의 재포집 단계가 뒤따르는, 입자 방출 단계를 포함한다. 추출이 개선됨에 따라 시간을 획기적으로 절약할 수 있다. 특히, 이러한 방법은 일단 바이러스 용해 단계가 수행되면, 다음을 포함한다:
1. 예를 들어 전술된 방식으로 피펫 콘들 내에 자성 입자들을 포집하는 제 1 단계;
2. 워싱 완충액(예를 들어, BioMerieux의 참조번호 280130의 "NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 1")으로 충진되는 마이크로플레이트의 상이한 열들에서의, 뒤따른 제 1 워싱 단계, 바람직하게는 적어도 하나의 제 2 워싱 단계. 각각의 워싱 동작은 피펫 콘들 상에 포집된 입자들을 갖는 워싱 완충액의 흡입/방출 사이클들을 포함하고, 적어도 15초, 바람직하게는 25초 내지 35초, 예를 들어 30초, 바람직하게는 1분 미만으로 지속된다;
3. 워싱 완충액(예를 들어, BioMerieux의 참조번호 bMx 280131의 "NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 2")으로 충진되는 마이크로플레이트(18a)의 제 3 열에서의 적어도 하나의 제 3 워싱 단계. 이러한 제 3 워싱 단계 동안, 입자들을 재현탁하도록 자석을 제거함으로써 입자들이 방출되며, 현탁되는 입자들을 갖는 완충액이 마이크로플레이트(18a)의 대응하는 웰들 내에서 흡입/방출된다. 바람직하게는 전술된 바와 같이 펠릿들을 넘어서 메니스커스를 통과시키는 단계를 포함하는 제 3 워싱 단계는 수 분, 특히 5분 동안 지속된다;
4. 예를 들어 전술된 바와 같이 피펫 콘들 상의 입자들을 포집하는 제 2 단계;
5. 선택적으로, 상기 입자들이 워싱 완충액(예를 들어, BioMerieux의 참조번호 bMx 280131의 "NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 2")으로 충진된 마이크로플레이트(18a)의 제 3 열에서 포집되는 제 4 워싱 단계;
6. 입자 펠릿들을 튜브들(예를 들어, 용리 완충액, 예를 들어, BioMerieux의 참조번호 280132의 "NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 3"을 포함함), 예를 들어 전술된 바와 같이, 내로 이동시키는 단계가 뒤따르는 입자 펠릿들을 팁들 내로 이동시키는 단계.
NucliSens 범위의 워싱 완충액들, 특히 No. 1, No. 2, 및 No. 3 추출 완충액들이 기술되어 있다. 더욱 일반적으로:
- 추출 완충액 No. 1은 실리카의 실라놀 기들(silanol groups) 및 핵산들의 인산 기들(phosphate groups) 간에 다리들을 생성함으로써 실리카 상에 핵산들을 포집하는 것을 촉진하는 완충액이다. 이는 예를 들어, 구아니딘 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate), 즉 R.Boom 등의 문헌"Rapid and simple method for purification of nucleic acids" Journal of Clinical Microbiology. 1989; 28(3): 495-503에 기재된 바와 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함한다.
- 제 1 워싱 동작 및 제 2 워싱 동작은 잔류 기질(residual matrix) 또는 미생물 잔해(microorganism debris)를 제거할 수 있게 한다,
- 제 3 워싱 동작 및 제 4 워싱 동작은 GuSCN 및 자성 입자들에 의해 포집된 DNA/RNA 상에서 보통 후속적으로 수행되는 PCR-유형 증폭(PCR-type amplification)의 억제제들(inhibitors)의 극미량들(traces)을 제거할 수 있다,
- PCR 콘들 내에 포함된 용리 완충액은 워싱 완충액의 극미량을 제거하고 용리 단계에 있어 최적 조건들 하에 있게 한다.
다음 표는 방금 기술된 프로토콜을 적용할 때(입자들이 방출되는 제 3 워싱 동작이 뒤따르는, 2번의 처음의 워싱 동작들), 선행 기술의 장치, 즉 BioMerieux사에 의해 판매되고 바이러스성 RNA 추출에서 기준 장치로 간주되는 MiniMag®에 비하여 본 발명에 따른 장치로 획득된 결과들을 비교한다. MiniMag®에 대한 프로토콜은 워싱 완충액들("NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 1" 2개 및 "NucliSENS easyMAG 추출 완충액 No. 2" 2개)를 사용한 4회의 워싱 단계들을 포함한다.
추출의 효율을 결정하기 위해, 추출된 용해물의 실시간(real-time) PCR 증폭(또는 "qPCR")이 수행되고, 각 샘플의 Ct(샘플 내의 핵산의 검출의 임계치를 정량화하는 "사이클 임계치(cycle threshold)")가 측정된다. 2개의 테스트된 샘플들은 25그램의 라즈베리 또는 25그램의, 순수(25그램 당 게놈의 500 카피에 대응함)하거나 1/10으로 희석된 멩고 바이러스(Mengo virus) 용액이 첨가된 녹색 양파의 샘플들이다.
| 본 발명 (Ct 값) | MiniMag® (Ct 값) | ||||||
| 샘플 | 라즈베리 | 녹색 양파 | 라즈베리 | 녹색 양파 | |||
| 멩고 | pure | 25.72 | 26.29 | 25.87 | 25.55 | 24.86 | 25.06 |
| 1/10 | 27.87 | 28.61 | 28.06 | 27.95 | 28.01 | 27.81 | |
| 멩고 | pure | 26.05 | 26.11 | 25.82 | 25.87 | 24.93 | 24.99 |
| 1/10 | 28.23 | 28.44 | 27.59 | 28.13 | 28.06 | 27.76 | |
표에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 바이러스성 RNA의 추출은 MiniMag®를 사용하여 수득된 것들과 유사한 결과들을 제공한다. 또한, 테스트들은 다양한 품질의 자성 실리카 입자들의 다양한 배치들(batches)로 수행되었다. 본 발명에 따른 추출은 놀랍게도 상기 입자들의 품질에 대하여 매우 견고하다는 것이 주목되었다. 특히, 성능 등급이 더 낮은 입자들의 배치를 갖는 동일한 샘플에 대해 테스트들이 수행되었는데, 상기 추출은 전술된 바와 같은 방출/워싱/재포집 단계를 포함하지 않았다. 이러한 경우, 추출 정도가 더 낮았다. 결함 입자들(defective particles)과 함께 이전에 기술된 바람직한 방법을 사용하는 경우, 앞의 표와 유사한 결과가 획득된다.
용해로부터 기인한, 예를 들어 RNA 및/또는 DNA와 같은 핵산들의 포집으로의 본 발명을 적용이 포집/워싱/이동, 및 전달 단계들 전에 수행되었다. 또한, 본 발명은 미생물들(예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 효소)을 포집하도록 표면이 기능화된(functionalized) 자성 입자들에 의한 미생물들(파지 단백질들(phage proteins) 또는 그 자체로 공지된 방식으로 포집하기에 적합한 다가양이온들(polycations)로 덮임)의 포집에 적용된다. 포집된 미생물들을 갖는 자성 입자들은 후속적으로 용해(예를 들어, 기계적 용해)하기 위해 튜브들 내로 옮겨진다. 수득된 용해질(lysate)은 직접적으로 처리의 대상이 될 수 있으며, 예를 들어 폴리메라아제 연쇄 반응 증폭(polymerase chain reaction amplification)(예를 들어, qPCR 유형의 정량적 PCR)이 될 수 있거나, 또는 전술된 핵산 추출 방법에 따라 정제될 수 있다.
본 발명은 특히 PCR의 목적을 위한 미생물 샘플의 제조에 적합하다. 실제로, 피펫 콘들 내로의 입자들의 포집이 수행되는 샘플은 매우 큰 용적(예를 들어, 수 밀리리터)를 가질 수 있으나, 그 반면 입자들이 그 내부로 전달되는 튜브들의 최종 용적은 매우 작을 수 있다(예를 들어, 200마이크로리터 이하 또는 100마이크로리터 이하). 큰 용적의 샘플로 인해 많은 수의 미생물들이 포집된다. 아주 작은 최종 용적으로의 이동은 미생물들을 집중시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명자들은 단일 워싱 단계가 뒤따르는 수 밀리리터의 샘플로부터의 단일 포집 단계가 5㎕의 부피로 수행된 용해로부터 qPCR에 의한 결과들을 획득하는 데 있어서 충분하다는 것을 주목하였다.
특히, 41.5℃에서 5시간 동안 영양 수프를 갖는 푸드 매트릭스(food matrix)(치킨 에귀에트(aiguillette))를 풍부하게 하였다(enrichment). 살모넬라 더비(Salmonella Derby) 균주에 의한 후-오염(post-contamination)은 102CFU/ml 내지 104CFU/ml의 수준에서 수행되며, 이는 푸드 매트릭스 내의 병원균(pathogen)의 존재 하에서 풍부해진 후에 도달될 수 있는 농도들(즉, 푸드 배치가 소비에 적합하지 않다고 판단되는 농도들)에 대응한다. 하나는 프랑스의 BioMerieux사의 Geneup® 시스템의 표준화된 포집 프로토콜에 따라서, 그리고 하나는 본 발명에 따라, 각각의 오염된 샘플에 대해 두 가지 절차들이 이중으로 수행되었다.
Gene-up 프로토콜은 비드-비팅(bead-beating)을 위한 마이크로플레이트 셰이커 상에서 5분간 흔드는 단계가 뒤따르는, 20μl의 상기 샘플을 취하고, 상기 샘플을 180μl의 워싱 완충액을 함유하는 비드-비팅 튜브 내에 위치시킴에 의한 샘플의 "비드-비팅" 단계(즉, 박테리아 벽의 기계적 파괴)로 구성된다. 5 마이크로리터의 최종 용액을 취해져 qPCR이 실시된다.
본 발명에 따른 방법은 그의 부분을 위해 다음으로 구성된다:
1. 2ml의 샘플을 바이오티닐화된 파지 단백질(biotinylated phage protein) 용액(최종 농도 2μg/ml)과 접촉시킴에 의한 특정 포집 단계로서, 상기 특정 포집 단계는 다음 단계들에 의함;
a. 10분 동안 피펫 콘들 내에서 흡입/방출에 의해 교반하는 단계;
b. "Hyglos사 스트렙타아비딘(Streptavidin)" 자성 입자들(50μl)을 첨가하고, 15분 동안 흡입/방출에 의해 교반하는 단계(박테리아-바이오티닐화 파지 단백질 복합체들이 자성 입자들에 결합함);
c. 상기 콘들 내에 자성 입자들을 수집하는 단계를 위해 자석을 넣는 단계;
d. 자성 입자 포집 사이클을 개시하는 단계;
2. TST(Tris Saline Tween) 워싱 용액을 함유하는 웰들 내에서 5회의 흡입/배출 사이클들로 워싱하는 단계;
3. 비드-비팅 처리된 5-마이크로리터 튜브들 내에 자성 입자들을 수집하는 단계로서, 5마이크로리터의 최종 용액은 qPCR이 실시됨.
Gene-up® 프로토콜에 따라, 그리고 본 발명에 따라 수득된 결과들이 하기 표에 요약되었다:
| 농축 | 본 발명 (Ct 값) | Gene-up®(Ct 값) |
| 102 CFU/ml | 35.2 | No Ct |
| 35 | No Ct | |
| 103 CFU/ml | 33.8 | No Ct |
| 33.8 | No Ct | |
| 104 CFU/ml | 29.5 | 34.9 |
| 29.7 | No Ct |
감도의 예상된 증가는 Gene-up 표준 프로토콜에 비해 2 로그이다.
본 발명은 다양한 자성 포집 기술들(핵산 정제, 자성 immunoconcentration, 등)의 사용을 위한 다목적성 문제에 대한 해답이다. 본 발명에 따른 시스템은 진화적이며 모듈화 가능하며, 다음을 가능하게 한다:
- 프로그램가능한 전자 피펫 및 상기 언급된 다양한 단계들이 수행될 수 있게 하는 지지체의 조합으로 구성된 자동 시스템을 사용하여 수행되는 자성 입자들의 포집/워싱/용리 단계들;
- 사용된 전자 피펫의 구성의 기능에 따라 1 내지 8의 수의 샘플들이 처리되도록 함;
- 반자동 시스템으로 위에서 정의된 상황에서 샘플들이 병렬로 처리되도록 함;
- 처리될 샘플들의 수를 증가시키는 데 있어서 필요한 경우 2개의 시스템들이 결합될 수 있음;
- 다양한 유형들의 튜브들 내에서 용리 단계들이 수행될 수 있음: 핵산이 관련될 때 자성 실리카 입자들을 회수하기 위한 0.2ml PCR 튜브들(예를 들어, NucliSENSⓒ 화학) 또는 병원체들의 회수에 사용된 자성 입자들을 회수하는 경우(자성 면역농축)에는 다른 비드-비팅 튜브들. 이를 위해, 상기 시스템은 세라믹/유리 비드들에 의해(예를 들어, CapLyseⓒ 유형의 방법), 자성 입자들 상의 병원체들의 포집/농축 단계 및 그 자체의 용해 단계를 수행할 수 있다.
Claims (31)
- 액체 형태의 생물학적 샘플에 함유된 성분들을 추출하는 방법으로서, 상기 성분들은 자성 입자들(magnetic particles)에 결합할 수 있으며,
상기 방법은:
- 상기 샘플을 자성 입자들과 혼합하는 단계(106);
- 액체를 피펫팅(pipetting)하도록 구성된 팁(tip)(21)을 포함하는 관형 피펫 콘(tubular pipette cone)(20)이 웰(well)로부터 혼합물을 흡입하는 단계(110);
- 상기 피펫 콘(20)의 내벽 상에 상기 자성 입자들을 포집하는 단계(112)로서,
ο 상기 피펫 콘(20)에 제 1 자기장(16)을 인가하여, 상기 피펫 콘의 팁 위의 "포집(capture)" 구역으로 지칭되는 상기 피펫 콘(20)의 사전결정된 구역에 상기 자성 입자들을 끌어당겨 유지하고;
ο 웰(62)에서 상기 피펫 콘(20)에 함유된 혼합물을 흡입 및 배출하는 적어도 하나의 사이클을 적용함으로써 수행되는, 상기 포집하는 단계(112);
- 상기 피펫 콘(20)의 내벽 상에 포집된 상기 자성 입자들을 워싱(washing)하는 적어도 하나의 단계(114, 116)로서,
ο 상기 피펫 콘(20) 내에 함유된 혼합물을 방출하고;
ο 워싱 용액을 함유하는 웰(62)로부터, 상기 피펫 콘(20) 내로 상기 워싱 용액을 흡입 및 배출하는 적어도 하나의 사이클을 적용함으로써 수행되는, 상기 워싱하는 단계(114, 116);
- 상기 제 1 자기장에 대한 상기 피펫 콘(20)의 상대적인 이동을 수행함으로써, 상기 포집 구역으로부터 피펫 콘(20)의 팁(21)으로 상기 피펫 콘(20)의 내벽 상의 자성 입자들을 이동시키는 단계(118); 및
- 상기 피펫 콘(20)의 팁(21) 내로 이동된 상기 자성 입자들을 용액을 함유하는 회수 웰(recovery well)(69)로 전달하는 단계(120);를 포함하는, 성분 추출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 자기장(16)의 이동은, 상기 피펫 콘(20)의 길이방향 축(X)에 평행하게 상기 피펫 콘(20)을 이동시키는 것 및 상기 제 1 자기장을 유지시키는 것을 포함하며,
상기 피펫 콘의 길이방향 축(X)은 상기 피펫 콘(20)의 이동 중에 상기 제 1 자기장(16)으로부터 동일한 거리에 유지되는, 성분 추출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 전달하는 단계(120)는,
- 상기 피펫 콘(20)의 팁(21)을 회수 웰(69) 내에 위치시키는 단계; 및
- 상기 피펫 콘(20)의 팁(21) 내에 함유된 자성 입자들이 상기 회수 웰(69) 내로 이동하도록 상기 회수 웰(69)의 하단으로부터 제 2 자기장(68)을 인가하는 단계;를 포함하는, 성분 추출 방법. - 제 3 항에 있어서,
상기 제 2 자기장(68)은 상기 피펫 콘의 팁 아래에 부분적으로 또는 전체적으로 위치된 자석에 의해 생성되는, 성분 추출 방법. - 제 3 항에 있어서,
상기 피펫 콘에 인가된 제 1 자기장은 상기 제 2 자기장의 인가 동안 비활성화되는, 성분 추출 방법. - 제 3 항에 있어서,
상기 전달하는 단계(120)는, 상기 제 1 자기장(16)을 비활성화한 후 상기 피펫 콘의 팁(21)에서 회수 웰(69)의 용액을 흡입 및 배출하는 사이클들을 적용하는 것을 포함하며, 상기 적용은:
- 상기 사이클들을 제 1 빈도로 적용하는 제 1 단계; 및
- 이후에, 상기 제 1 빈도보다 낮은 제 2 빈도로 상기 사이클들을 적용하는 제 2 단계;를 포함하는, 성분 추출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 포집하는 단계(112) 이전에, 상기 피펫 콘에서 상기 혼합물을 흡입 및 배출하는 적어도 1회의 사이클을 적용함으로써 상기 피펫 콘 내에 함유된 혼합물을 교반(stirring)하는 단계를 포함하는, 성분 추출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 전달하는 단계(120) 이전에, 상기 피펫 콘의 내벽 상에 포집된 입자들을 워싱하는 적어도 하나의 단계를 포함하며, 상기 워싱하는 단계는,
a. 상기 자기장을 비활성화하고;
b. 워싱 용액을 포함하는 웰로부터, 상기 피펫 콘 내로 상기 워싱 용액을 흡입 및 배출하는 적어도 1회의 사이클을 적용함으로써, 상기 포집된 입자들을 방출시키고;
c. 상기 피펫 콘의 내벽 상에 입자들을 포집하는 제 2 단계를 적용함으로써, 수행되며, 상기 입자들을 포집하는 제 2 단계는,
ο 상기 피펫 콘에 제 1 자기장을 인가하고,
ο 상기 워싱 용액을 함유하는 웰에서, 상기 피펫 콘 내에 함유된 혼합물을 흡입 및 배출하는 적어도 1회의 사이클을 적용함으로써 수행되는, 성분 추출 방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 포집된 입자들의 배출은, 상기 피펫 콘 내에 포집된 입자들의 펠릿(pellet)에 대해 상기 용액의 메니스커스(meniscus)의 상하 운동을 수행하도록 상기 사이클들을 적용시키는 단계를 포함하며,
상기 메니스커스의 상하 운동은 상기 피펫 콘의 전체 길이보다 작은 상기 피펫 콘의 일 부분 상에서 수행되는, 성분 추출 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 포집된 입자들의 배출은, 상기 콘 워싱 용액을 완전히 흡입 및 방출하도록 상기 사이클들을 적용하는 제 2 단계를 포함하는, 성분 추출 방법. - 제 10 항에 있어서,
상기 제 2 단계의 사이클들의 적용 빈도는 상기 제 1 단계의 사이클들의 적용 빈도보다 낮은, 성분 추출 방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 포집된 입자들의 배출 이전에, 2회 이상의 워싱 단계들이 2개의 개별 워싱 용액들 내에서 수행되는, 성분 추출 방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 생물학적 샘플 내에 함유된 성분들은 핵산들(nucleic acids)인, 성분 추출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 생물학적 샘플 내에 함유된 성분들은 미생물들이며, 상기 방법은 단일 포집 단계 및 단일 워싱 단계를 포함하는, 성분 추출 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 샘플과 자성 입자들의 혼합물은 1 밀리리터보다 큰 용적을 가지며,
상기 회수 웰의 용적은 200 마이크로리터보다 작은, 성분 추출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 전달하는 단계(120) 전에, 상기 피펫 콘의 내벽 상에 포집된 입자들을 워싱하는 적어도 하나의 단계를 포함하며, 상기 워싱하는 단계는;
- 상기 피펫 콘 내로 워싱 용액을 흡입시키고;
- 그 다음, 상기 피펫 콘의 내벽 상에 입자들을 포집하기 위해 상기 자성 입자들에 인가된 제 1 자기장을 조절(modulating)하고;
- 그 다음, 상기 피펫 콘 워싱 용액을 배출함으로써 수행되는, 성분 추출 방법. - 제 16 항에 있어서,
상기 제 1 자기장의 조절은:
- 상기 피펫 콘을 상기 피펫 콘의 길이방향 축에 평행하게 이동시키고, 상기 제 1 자기장을 일정하게 유지함으로써; 또는
- 상기 포집된 입자들 전방에서 서로 이격된 자석들을 이동시킴으로써 수행되는, 성분 추출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 피펫 콘의 용적은 상기 회수 웰의 용적보다 적어도 10배 이상 큰, 성분 추출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 혼합물의 용적은 상기 피펫 콘의 용적보다 적어도 3배 큰, 성분 추출 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 성분들은 핵산들, 미생물들, 단백질들, 및 펩타이드들(peptides)에 의해 형성된 군에 속하는, 성분 추출 방법. - 삭제
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