KR102690427B1

KR102690427B1 - Dna, rna 동시추출 키트 및 이를 이용한 dna, rna 동시추출 방법

Info

Publication number: KR102690427B1
Application number: KR1020220079973A
Authority: KR
Inventors: 홍교창; 김혜리; 조광문; 권순재
Original assignee: 주식회사 어큐진
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2024-07-31
Anticipated expiration: 2042-06-29
Also published as: KR20240002599A

Abstract

본 발명은 동일 시료로부터 DNA, RNA를 동시에 추출할 수 있는 새로운 방식의 DNA, RNA 동시추출 키트 및 이를 이용하여 고순도의 DNA, RNA를 수득할 수 있는 새로운 추출방법에 관한 것으로서,
본 발명에 의한 추출키트는 2~4M의 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate)과 0.1~2중량%의 계면활성제를 포함하는 제1용액; 10~50mM의 알루미늄암모늄황산염염·12수화물로 이루어진 제2용액; 100부피% 이소프로판올로 이루어진 제3용액; 80%부피 에탄올로 이루어진 제4용액; 3~5M의 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)와 40~60부피% 에탄올(ethanol)을 포함하는 제5용액; 50~80부피% 에탄올(ethanol)로 이루어진 제6용액; DNA 흡착성 칼럼; 및 RNA 흡착성 칼럼;을 포함한다.

Description

DNA, RNA 동시추출 키트 및 이를 이용한 DNA, RNA 동시추출 방법{Simultaneous extraction kit of DNA and RNA from single cells and Simultaneous extraction process using the same kit}

본 발명은 DNA, RNA 동시추출 키트 및 이를 이용한 DNA, RNA 동시추출방법 에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 동일 시료로부터 DNA, RNA를 동시에 추출할 수 있는 새로운 방식의 DNA, RNA 동시추출 키트 및 이를 이용한 동시추출방법에 관한 것이다.

기존의 상용화된 DNA 또는 RAN 추출키트들은 각각의 추출키트를 별도로 구매하여 두 번의 실험을 거치거나, 또는 DNA 또는 RNA를 동시에 추출하여 둘 중 하나를 제거하는 효소를 처리하여 각각을 분리하는 번거로움이 있으며, 실험시간 및 비용이 두 배 이상 소요되는 단점이 있다.

Human Microbiome Project가 2007년에 미국 국립보건원 (National Institutes of Health, NIH)에서 시작된 이래로, 분변 샘플에 존재하는 다양한 미생물에 대한 분석이 학계에서 크게 유행하였으며, 해당 기술을 토대로 장내미생물 분석 서비스를 제공하는 업체도 다수 생겨나게 되었다.

그러나 대부분의 분석이 DNA만을 이용하여 수행되는데, DNA는 미생물의 생존여부 및 활성정도에 관계없이 추출이 가능하므로 실제로 장내에서 높은 활성을 가지는 미생물을 확인하는 데에는 한계가 있다. 대부분의 생물은 정해진 양의 DNA 사본을 가지고 있지만, 활발하게 대사작용을 수행하는 생물은 그렇지 않은 생물에 비해 더 많은 RNA 사본을 만들어내므로, 분변 샘플 내에서 활성이 높은 미생물을 확인하기 위해서는 미생물 RNA를 추출하여 분석할 필요가 있다.

중국 공개특허 CN 105925568(2016. 09. 07.) 일본특허공표 JP2017-505610(2017.02. 23)

본 발명은 상기와 같은 문제점에 착안하여 제안된 것으로서, 본 발명의 목적은 동일 시료로부터 DNA, RNA를 동시에 추출할 수 있는 새로운 방식의 DNA, RNA 동시추출 키트 및 이를 이용하여 고순도의 DNA, RNA를 수득할 수 있는 새로운 추출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 특징에 따르면, 2~4M의 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate)과 0.1~2중량%의 계면활성제를 포함하는 제1용액; 10~50mM의 알루미늄암모늄황산염·12수화물로 이루어진 제2용액; 100부피% 이소프로판올로 이루어진 제3용액; 80%부피 에탄올로 이루어진 제4용액; 3~5M의 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)와 40~60부피% 에탄올(ethanol)을 포함하는 제5용액; 50~80부피% 에탄올(ethanol)로 이루어진 제6용액; DNA 흡착성 칼럼; 및 RNA 흡착성 칼럼;을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA와 RNA 동시추출키트가 제공된다.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 상기 추출키트를 사용하여 DNA와 RNA를 추출하는 방법으로서, (1) 상기 제1용액에 시료를 넣고 볼텍싱(vortexing)하여 세포를 용해시키고, 원심분리하여 상등액을 분리수득하는 과정; (2) 상기 (1)과정에서 수득한 용액에 상기 제2용액을 15~25부피부 첨가하고 볼텍싱(vortexing)하여 불순물을 침전시키고, 상등액을 분리수득하는 과정; (3) 상기 (2)과정에서 수득한 용액 100부피부에 대해 상기 제3용액을 5~20부피부 첨가하여 DNA를 침전시키는 과정; (4) 상기 (3)과정에서 처리된 용액을 DNA 흡착성 칼럼에 옮기고 원심분리하여 DNA를 분리하는 과정; (5) 상기 (4)과정에서 DNA가 분리되고 남은 용액 100부피부에 대해 상기 제4용액을 10~30부피부 첨가하여 RNA를 침전시키는 과정; 6) 상기 (5)과정에서 처리된 용액을 RNA 흡착성 칼럼에 옮기고 원심분리하여 RNA를 분리하는 과정; (7) 상기 DNA 흡착성 칼럼을 상기 제5용액으로 세척한 후, DNA 흡착성 칼럼에서 DNA를 용출시키는 과정; 및 (8) 상기 RNA 흡착성 칼럼을 상기 제6용액으로 세척한 후, RNA 흡착성 칼럼에서 RNA를 용출시키는 과정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA, RNA 동시추출방법이 제공된다.

이상과 같은 구성의 본 발명은 동일한 시료로부터 DNA, RNA를 용이하게 동시에 추출할 수 있으므로 종래에 비해 DNA, RNA의 추출시간 및 노동력이 절감된다. 특히, 본 발명은 동일 시료로 부터 DNA, RNA를 추출하기 때문에 추출된 DNA, RNA가의 생물학적으로도 유용하다.

특히, 본 발명을 분변에 존재하는 미생물의 분석에 사용되면 장내에 존재하는 미생물과 활성이 높은 미생물을 모두 확인할 수 있으므로 장내미생물의 분석에 상당히 유용하다.

도 1은 본 발명의 실시예1에 따라 핵산을 추출하여 전기영동한 결과이다.
도 2 내 도 5는 본 발명의 비교예 1 내지 4에 따라 핵산을 추출하여 전기영동한 결과이다.

이하에서는 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.

본 발명은 DNA, RNA를 동시추출하는 키트로서, 다음과 같은 구성을 가진다.

(1) 제1용액

: 제1용액은 Lysis buffer로서, 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate)와 계면활성제를 포함한다.

구아니딘 이소티오시아네이트는 세포용해작용이 뛰어날 뿐만 아니라, 후술하는 바와 같이, DAN 및 RNA가 정제칼럼에 결합되도록 유도하는 기능이 우수하므로 본 발명에서 사용이 바람직하다.

본 발명에서 사용가능한 계면활성제의 종류가 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 음이온계 계면활성제인 N-라우릴사르코신나트륨(상표명:sarkosyl)을 사용한다.

바람직하게는 구아니딘 이소티오시아네이트의 농도는 2~4M이고, 계면활성제의 농도는 0.1~2중량%인 것이 바람직하다. 구아니딘 이소티오시아네이트의 농도가 2M 미만인 경우에는 세포를 충분히 용해시킬 수 없어 DNA, RNA의 추출수율이 현저하게 저하된다. 그리고 구아니딘 이소티오시아네이티의 농도가 4M을 초과하는 경우에는 DNA의 석출시 RNA가 함께 석출된 우려가 높아져서 DNA와 RNA의 정제효율이 저하되므로 바람직하지 않다.

(2) 제2용액

: 알루미늄암모늄황산염·12수화물(aluminium ammonium sulfate dodecahydrate-12 water)의 수용액으로서, 상기 제1용액에 의해 세포가 용해된 용액에서 단백질, 지질 등의 불순물을 침전시킨다. 이러한 바람직하게는 제2용액은 농도가 10~50mM인 것이 바람직하다.

(3) 제3용액

: DNA의 용해도를 낮추어 DNA를 침전시키는 DNA침전제로서, 100부피% 이소프로판올(Isopropanol)로 이루어진다.

(4) 제4용액

: RNA의 용해도를 낮추어 RNA를 침전시키는 RNA 침전제로서, 80부피%에탄올(ethanol)로 이루어진다.

(5) 제5용액

: DNA 세척버퍼(washing buffer)로서, 3~5M의 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)와 40~60부피% 에탄올(ethanol)을 포함한다.

(6) 제6용액

: RNA 세척버퍼(washing buffer)로서, 50~80부피% 에탄올(ethanol)로 이루어진다.

(7) DNA 흡착성 칼럼

; DAN와 높은 친화력을 가져서 DNA와 특이적으로 결합하는 것으로서, 실리카 칼럼(silica column)이 사용된다.

(8) RNA 흡착성 칼럼

: RNA와 높은 친화력을 가져서 RNA와 특이적으로 결합하는 것으로서, 실리카 칼럼(silica column)이 사용된다.

이러한 키트를 사용하여 DNA와 RNA를 동시에 추출하는 방법을 살펴보면 다음과 같다.

(1) 원심분리용 튜브에 제1용액을 넣고 머캅토에탄올(mercaptoethanol)와 Lysis beads를 투입한 다음, 시료를 넣고 10분 정도 vortexing하여 세포를 용해시킨다.

(2) 원심분리 후에 상등액을 새 튜브에 옮긴다.

(3) 상기 (2)과정에서 얻은 용액 100부피부에 대해 제2용액(알루미늄 암모늄 황산염·12수화물 수용액) 15~25부피부를 넣고 vortexing 한 다음, 4℃에서 5분 동안 정치시켜서 불순물을 침전시킨다.

(4) 원심분리 후에 상등액을 새 튜브에 옮긴 다음, 용액 100부피부에 대해 제3용액(이소프로판올)을 5~20부피부 넣고 믹싱한다.

(5) 상기 과정에서 제3용액이 혼합된 용액을 DNA silica column에 옮겨서 원심분리하여 DNA를 추출한다.

(6) DNA silica column을 빠져 나온 용액셀용 100부피부에 제4용액(80% 에탄올)을 10~30부피부 첨가하고 믹싱한다.

(7) 제4용액이 혼합된 용액을 RNA silica column에 옮겨서 원심분리하여 RNA를 추출한다.

(8) 상기 DNA silica column과 DNA silica column를 각각 제5용액(DNA세척 버퍼)와 제6용액(RNA세척버퍼)로 세척하고 원심분리한다. 각 칼럼에 세척퍼버가 잔류되지 않도록 각 칼럼을 새 튜브에 넣고 추가로 원심분리한다.

(9) 튜브를 Nuclease-free tube로 교체하고 DNA silica column에는 elution buffer를 넣고, RNA silica column에는 nuclease free water를 넣고 각각 10,000rpm으로 1분간 분원심분리하여 DNA와 RNA를 용출시킨다.

이과 같은 구성을 가지는 본 발명은 동일한 시료에서 DNA와 RNA를 동시에 고순도로 추출할 수 있다. 따라서 본 발명을 이용하면 짧은 시간에 고순도의 DNA와 RNA의 추출할 수 있어서 유용하며, 동일한 시료에서 DNA와 RNA를 추출한다는 점에서 생물학적으로도 유용하다.

실시예 1

사람의 분변을 시료로 하여, 전술한 바와 같은 방법으로 장내미생물의 DNA와 RNA를 추출하였다. 이때 사용된 각 용액의 농도 및 셀용해액(lysis solution) 대비 사용량은 표 1과 같다. 그리고 도 1은 추출된 DNA와 RNA의 전기영동 결과이다.

용 액	성 분	농도	사용량
제1용액	구아니딘 이소티오시아네이트	4M
제1용액	sarkosyl	2중량%
제2용액	알루미늄암모늄황산염·12수화물 수용액	30mM	20부피부
제3용액	이소프로판올	100부피%	10부피부
제4용액	에탄올	80부피%	20부피부
제5용액	구아니딘 하이드로클로라이드	3M
제5용액	에탄올	60부피%
제6용액	에탄올	80부피%

도 1에서 왼쪽 Gel 사진은 분변에서 추출된 Genomic DNA band 사진이다. Intact 한 Genomic DNA band size가 매우 크기 때문에 제일 위의 band가 나온 것이다. 오른쪽 Gel 사진은 분변에서 추출된 RNA band 사진으로, Stool 유래 Intact RNA band는 2줄이 밝게 나왔는데, 아래 쪽 band는 16S rRNA band이고 위쪽 밴드는 band는 23S rRNA band이다.

비교예 1, 2

제1용액의 농도를 다르게 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실험하였다. 제1용액의 농도는 표 2와 같다. 도 2와 3은 추출된 DNA와 RNA의 전기영동 결과이다.

용 액	성 분	농도
용 액	성 분	비교예 1	비교예 2
제1용액	구아니딘 이소티오시아네이트	1M	6M
제1용액	sarkosyl	2중량%	2중량%
제2용액	알루미늄암모늄황산염·12수화물 수용액	30mM	30mM
제3용액	이소프로판올	100부피%	100부피%
제4용액	에탄올	80부피%	80부피%
제5용액	구아니딘 하이드로클로라이드	3M	3M
제5용액	에탄올	60부피%	60부피%
제6용액	에탄올	80부피%	80부피%

도 2의 DNA fraction에서 보면 Intact genomic DNA가 도 1에 비해 현저히 낮은 band 밝기를 보인다. RNA 역시 도 1과 비교하였을 때, Intact RNA band가 선명하지 않음을 할 수 있다.

도 3의 DNA fraction에서 보면 Intact genomic DNA band가 있지만, RNA가 포함이 되어 있다. RNA는 도 1과 비교하였을 때, Intact RNA band가 선명하지 않음을 할 수 있다.

비교예 3

제3용액(이소프로판올)의 셀용해액(lysis solution) 대비 사용량을 30부피부, 70부피부, 100부피부로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실험하였다. 도 4는 추출된 DNA와 RNA의 전기영동 결과이다.

도 4를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, DNA fraction에서 RNA band가 보이고, RNA fraction에서 DNA band가 보인다.

비교예 4

제4용액(에탄올)을 농도 90부피%, 95부피%, 100부피% 인 것으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실험하였다. 도 5는 추출된 DNA와 RNA의 전기영동 결과이다.

도 5를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 고농도의 에탄올을 사용한 경우에 RNA 추출시 short band(붉은색 화살표 부분)가 집중적으로 추출되었다.

Claims

2~4M의 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate)과 0.1~2%(w/v)의 계면활성제를 포함하는 제1용액;
10~50mM의 알루미늄암모늄황산염·12수화물로 이루어진 제2용액;
100%(v/v) 이소프로판올로 이루어진 제3용액;
80%(v/v) 에탄올로 이루어진 제4용액;
3~5M의 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)와 40~60%(v/v) 에탄올(ethanol)을 포함하는 제5용액;
50~80%(v/v) 에탄올(ethanol)로 이루어진 제6용액:
DNA 흡착성 칼럼; 및
RNA 흡착성 칼럼;을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA와 RNA 동시추출키트.
청구항1에 기재된 추출키트를 사용하여 DNA와 RNA를 추출하는 방법으로서,
(1) 상기 제1용액에 시료를 넣고 볼텍싱(vortexing)하여 세포를 용해시키고, 원심분리하여 상등액을 분리수득하는 과정;
(2) 상기 (1)과정에서 수득한 용액에 상기 제2용액을 15~25 부피부 첨가하고 볼텍싱(vortexing)하여 불순물을 침전시키 다음, 상등액을 분리수득하는 과정;
(3) 상기 (2)과정에서 수득한 용액 100부피부에 대해 상기 제3용액을 5~20부피부 첨가하여 DNA를 침전시키는 과정;
(4) 상기 (3)과정에서 처리된 용액을 DNA 흡착성 칼럼에 옮기고 원심분리하여 DNA를 분리하는 과정;
(5) 상기 (4)과정에서 DNA가 분리되고 남은 용액 100부피부에 대해 상기 제4용액을 10~30부피부 첨가하여 RNA를 침전시키는 과정;
(6) 상기 (5)과정에서 처리된 용액을 RNA 흡착성 칼럼에 옮기고 원심분리하여 RNA를 분리하는 과정;
(7) 상기 DNA 흡착성 칼럼을 상기 제5용액으로 세척한 후, DNA 흡착성 칼럼에서 DNA를 용출시키는 과정; 및
(8) 상기 RNA 흡착성 칼럼을 상기 제6용액으로 세척한 후, RNA 흡착성 칼럼에서 RNA를 용출시키는 과정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA, RNA 동시추출방법.
제2항에 있어서, 상기 시료는 사람의 분변인 것을 특징으로 하는 DNA, RNA 동시추출방법.