KR102688113B1 - 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents
메소텔린에 대한 친화도가 상승된 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
Description
종류 | 아미노산 시퀀스 | 서열번호 |
MSLN34 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 1 |
MSLN34 D31L | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 2 |
MSLN34 S192R | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 3 |
MSLN34 D31L/S192R | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 4 |
도 2는 Discovery studio 2021에서 계산된 항체인, MSLN 34의 3차 구조를 확인한 도이다.
도 3은 Discovery studio를 통해 확인한 다양한 도킹모델 중 각 클러스터의 대표되는 도킹 모델을 나타낸 도이다.
도 4는 최종적으로 선정된 MSLN과 MSLN34 항체에 대한 도킹 모델의 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 야생형(WT)을 포함한 7 종의 돌연변이 항체 후보물질(D31K, D31R, D31W, D31L, S192F, S192R, Y228R)의 정제하고 이의 SDS-PAGE 결과를 확인한 도이다.
도 6은 WT 및 5 종의 돌연변이 항체(D31W, D31L, S192F, S192R, Y228R)에 대해 ELISA 기반 메소텔린에 대한 친화도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 MSLN34의 WT, 각각의 D31L 및 S192R의 단일 돌연변이체 및 D31L과 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체의 메소텔린에 대한 친화도를 확인한 도이다.
도 8은 MSLN34의 WT, D31L 및 S192R의 각각 단일 돌연변이체 및 D31L과 S192R 돌연변이를 모두 포함하는 돌연변이체를 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN 키메릭 항원 수용체 벡터의 scFv의 아미노산 서열을 확인하고 이를 나타낸 도이다.
도 9 및 10은 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 특성 분석을 Batch #1 실험을 통해 확인한 도이다.
도 11 및 12는 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 특성 분석을 Batch #2 실험을 통해 확인한 도이다.
도 13은 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 중피종 및 난소암 세포에 대한 세포사멸 효과를 Calcein-AM(calcein release assay)법으로 Batch #1 실험을 통해 확인한 도이다.
도 14는 친화도가 상승된 돌연변이체 MSLN CAR-T의 중피종 및 난소암 세포에 대한 세포사멸 효과를 Calcein-AM(calcein release assay)법으로 Batch #2 실험을 통해 확인한 도이다.
도 15는 친화력이 상승 및 개선된 항-MSLN-CAR-T 세포의 in vitro에서 췌장암세포 사멸 효과를 Incucyte based real-time cytotoxicity assay를 통해 확인한 도이다.
도 16은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 17은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 부피 변화를 나타낸 도이다.
도 18은 CAR-T 세포 처리 후 49일째의 췌장암 동물 모델을 육안으로 관찰한 도이다.
도 19는 CAR-T 세포 처리 후 49일째의 췌장암 동물 모델의 종양을 분리하여 육안으로 관찰한 도이다.
도 20은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 무게를 나타낸 도이다.
도 21은 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 절편의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다 (배율: 5x). 인간 CD3ε 항체로 염색하였다.
도 22는 CAR-T 세포 처리 후 췌장암 동물 모델의 종양 절편의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다 (배율: 20x). 인간 CD3ε 항체로 염색하였다.
시약명 | 제조사 | Cat. No. |
Top10F' chemically competent E. coli | Invitrogen | 44-0300 |
JUMBO HIT-DH5α | RBC | TH617-J80 |
Gibson assembly® | NEB | E2611 |
LB broth miller | EMD Millipore Corp. | 71753-6 |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-2 |
Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside | GenDEPOT | I0355-005 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-5KG |
Strep- Tactin® XT 4Flow® resin | IBA | 2-5010-025 |
10X PBS | 바이오세상 | HP2007-1 |
10X Buffer BXT | IBA | 2-1042-025 |
Human Mesothelin/MSLN (296-580) | Acrobiosystems | MSN-H5223 |
ELISA plate | Costar | 3690 |
Anti-strep HRP | abcam | Ab191338 |
TMB substrate | Sigma | T0440 |
10X PBST | LPS solution | CBP007T |
장비명 | 제조사 | Cat. No. |
Discovery studio 2021 system | Dassault Systems Biovia corp | Dassault Systems Biovia corp. |
Shaking incubator | DAIHAN Scientific | WIS-20R |
Centrifuge | Thermo fisher Scientific | Sorvall Micro21R |
Centrifuge | Thermo fisher Scientific | Sorvall ST16R |
Microplate reader | Molecular sevices | VERSA max |
프라이머 | 서열 (5'->3') | 서열번호 |
D31K_F | AAATATGGTATGCACTGGGTTCG | 5 |
D31K_R | ATACCATATTTAGAGAAAGTAAAACCCGAG | 6 |
D31W_F | CTCTTGGTATGGTATGCACTGGGTTCG | 7 |
D31W_R | ATACCATACCAAGAGAAAGTAAAACCCGAG | 8 |
D31L_F | CTCTCTGTATGGTATGCACTGGGTTCG | 9 |
D31L_R | ATACCATACAGAGAGAAAGTAAAACCCGAG | 10 |
D31R_F | CTCTCGTTATGGTATGCACTGGGTTCG | 11 |
D31R_R | ATACCATAACGAGAGAAAGTAAAACCCGAG | 12 |
S192F_F | GCAGTTTGGTGTACCGTCCCGT | 13 |
S192F_R | GGTACACCAAACTGCAGAGAGGAAG | 14 |
S192R_F | GCAGCGTGGTGTACCGTCCCGT | 15 |
S192R_R | GGTACACCACGCTGCAGAGAGGAAG | 16 |
Y228R_F | CGCTCTTTTCCGTTTACGTTCGG | 17 |
Y228R_R | AAACGGAAAAGAGCGAGATTGCTGACAAT | 18 |
세포주 정보 | 293T |
Organism | Homo sapiens, human |
Tissue | Embryonic kidney |
Disease | Normal cell |
Properties | Adherent |
Culture conditions | DMEM, 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin, 5% CO2, 37℃ |
Supplier | ATCC (CRL-3216) |
세포주 정보 | AsPC-1/GFP |
Organism | Homo sapiens, human |
Tissue | Pancreas |
Disease | Adenocarcinoma |
Properties | Adherent |
Culture conditions | RPMI1640, 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin, 5% CO2, 37℃ |
Supplier | In-house |
세포주 정보 | NCI-H2052 |
Organism | Homo sapiens, human |
Tissue | Lung |
Disease | Mesothelioma |
Properties | Adherent |
Culture conditions | RPMI1640, 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin, 5% CO2, 37℃ |
Supplier | ATCC (CRL-5915) |
세포주 정보 | OVCAR-3 |
Organism | Homo sapiens, human |
Tissue | Ovary |
Disease | Adenocarcinoma |
Properties | Adherent |
Culture conditions | RPMI1640, 20% FBS, 1% penicillin and streptomycin, 5% CO2, 37℃ |
Supplier | ATCC (HTB-161) |
No. | 유형 | 벡터 종류 | Cat. No. | 제조사 | Remark |
1 | Packaging vector | pMDLg/pRRE | 12251 | Addgene | - |
2 | Packaging vector | pRSV-Rev | 12253 | Addgene | - |
3 | Packaging vector | pMD2.G | 12259 | Addgene | - |
4 | Expression vector | pLV-MSLN | - | KBIO | 2nd G. KBIO CAR |
시약 | Cat. No. | 제조사 |
RPMI1640 | 11875093 | Gibco |
Fetal Bovine Serum | 16000044 | Gibco |
DPBS, 1X | 14190250 | Gibco |
Trypsin-EDTA (0.05%) | 25300054 | Gibco |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | 15140122 | Gibco |
Protamine sulfate | P3369-10G | Sigma |
KOD plus mutagenesis kit | SMK-101 | Toyobo |
PBMC | CC-2702 | Lonza |
IL-2 recombinant human protein | CTP0021 | Gibco |
TransAct bead | 130-128-758 | MACS |
APC CD3 | 555342 | BD |
Biotin-MSLN | MSN-H8223 | Acrobiosystems |
PE anti-biotin | 130-110-951 | MACS |
Sucrose | S1030 | Biosesang |
APC Mouse Anti-Human CD3 | 555342 | BD |
NucleoBond® Xtra Maxi EF plasmid DNA purification | 740424.5 | MACHEREY-NAGEL |
NucleoBond® Xtra Midi plasmid DNA purification | 740410.50 | MACHEREY-NAGEL |
Calcein-AM | C-1439 | Invitrogen |
장비 | 모델번호 | 제조사 |
Biological Safety Cabinet | 1367 | ThermoFisher |
Centrifuge | 5810R | Eppendorf |
CO2 incubator | Galaxy 170S | Eppendorf |
CountessTM II Automated Cell Counter | AMQAX1000 | ThermoFisher |
Ultracentrifuge | Optima XE-100 | Beckman Coulter |
Incucyte | Incucyte zoom | Essen bioscience |
FACSCantoTM II | 338960 | BD |
NanoDropTM 2000 Spectrophotometer | ND-2000 | ThermoFisher |
Multi-mode microplate reader | FilterMax F5 | Molecular devices |
FLOWJO Single Cell Analysis Software V10 | 663335 | FlowJo, LLC. |
GraphPad Prism (Ver. 9) | - | GraphPad Software |
그룹 | n= | 세포주 (세포수/마리) |
시험물질 | 용량 (CAR-Ts/마리) |
투여경로 | 부피 |
G1 | 5 | AsPC-1 (5x106) |
HBSS | - | I.V | 200uL |
G2 | 5 | Mock (1.5x106) | - | |||
G3 | 5 | MSLN34 (WT) | 1.5x106 | |||
G4 | 5 | MSLN34 (WT) | 0.5x106 | |||
G5 | 5 | MSLN34-D31L | 1.5x106 | |||
G6 | 5 | MSLN34-D31L | 0.5x106 |
Cluster-3 calculate mutation energy (Binding) | ||||||
Mutation | Mutation Energy | Effect of Mutation | VDW term | Electrostatic Term | Entropy Term | Non-polar Term |
B:ASP31>ARG | -3.24 | STABILIZING | -4.66 | -4.26 | 1.53 | 0 |
B:ASP31>LYS | -3.22 | STABILIZING | -6.14 | -2.55 | 1.4 | 0 |
B:ASP31>TRP | -3.1 | STABILIZING | -4.37 | -2.52 | 0.43 | 0 |
B:ASP31>LEU | -3.05 | STABILIZING | -3.8 | -2.69 | 0.24 | 0 |
B:SER192>ARG | -3.04 | STABILIZING | -6.8 | -0.8 | 0.95 | 0 |
B:ASP31>HIS | -2.73 | STABILIZING | -3.89 | -2.17 | 0.38 | 0 |
B:SER192>PHE | -2.73 | STABILIZING | -4.98 | -0.28 | -0.12 | 0 |
B:ASP31>PHE | -2.62 | STABILIZING | -2.83 | -2.68 | 0.17 | 0 |
B:ASP31>ILE | -2.57 | STABILIZING | -2.7 | -2.57 | 0.08 | 0 |
B:TYR102>ARG | -2.46 | STABILIZING | -4.6 | -1.89 | 0.98 | 0 |
B:ASP31>TYR | -2.44 | STABILIZING | -3.15 | -2.49 | 0.48 | 0 |
B:HIS100>ARG | -2.33 | STABILIZING | -3.45 | -1.83 | 0.39 | 0 |
B:TYR104>ARG | -2.14 | STABILIZING | -5.04 | -1.08 | 1.15 | 0 |
B:TYR228>ARG | -0.87 | STABILIZING | -1.6 | -1.58 | 0.9 | 0 |
항체 | 영역 | 아미노산 서열 |
서열
번호 |
MSLN34 WT |
HCDR1 | DYGMH | 19 |
HCDR2 | SIYGSGGHTGYADSVKG | 20 | |
HCDR3 | QHAYRYSYAFDV | 21 | |
LCDR1 | RASQSISNWLN | 22 | |
LCDR2 | ATSSLQS | 23 | |
LCDR3 | QQSYSFPFT | 24 | |
VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSS | 25 | |
VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 26 | |
MSLN34 D31L |
HCDR1 | L YGMH | 27 |
HCDR2 | SIYGSGGHTGYADSVKG | 28 | |
HCDR3 | QHAYRYSYAFDV | 29 | |
LCDR1 | RASQSISNWLN | 30 | |
LCDR2 | ATSSLQS | 31 | |
LCDR3 | QQSYSFPFT | 32 | |
VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS L YGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSS | 33 | |
VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 34 | |
MSLN34 S192R |
HCDR1 | DYGMH | 35 |
HCDR2 | SIYGSGGHTGYADSVKG | 36 | |
HCDR3 | QHAYRYSYAFDV | 37 | |
LCDR1 | RASQSISNWLN | 38 | |
LCDR2 | ATSSLQ R | 39 | |
LCDR3 | QQSYSFPFT | 40 | |
VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSS | 41 | |
VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQ R GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 42 | |
MSLN34 D31L/S192R |
HCDR1 | L YGMH | 43 |
HCDR2 | SIYGSGGHTGYADSVKG | 44 | |
HCDR3 | QHAYRYSYAFDV | 45 | |
LCDR1 | RASQSISNWLN | 46 | |
LCDR2 | ATSSLQ R | 47 | |
LCDR3 | QQSYSFPFT | 48 | |
VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS L YGMHWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGHTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQHAYRYSYAFDVWGQGTLVTVSS | 49 | |
VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQ R GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPFTFGQGTKVEIK | 50 |
이름 | 염기서열 (5'-3') | 서열 번호 |
CD8 | ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG | 51 |
MSLN34 scFv | GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGGTATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCATCTATCTACGGTTCTGGTGGTCACACTGGTTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGCATGCATACCGTTACTCTTACGCATTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTTTACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA | 52 |
MSLN34 D31L scFv |
GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTCTTTATGGTATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCATCTATCTACGGTTCTGGTGGTCACACTGGTTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGCATGCATACCGTTACTCTTACGCATTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTTTACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA | 53 |
MSLN34 S192R scFv |
GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGGTATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCATCTATCTACGGTTCTGGTGGTCACACTGGTTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGCATGCATACCGTTACTCTTACGCATTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGCGTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTTTACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA | 54 |
MSLN34 D31L/S192R scFv |
GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTCTTTATGGTATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCATCTATCTACGGTTCTGGTGGTCACACTGGTTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGCATGCATACCGTTACTCTTACGCATTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGCGTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTTTACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA | 55 |
CD8 hinge | ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT | 56 |
CD8 TM | ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC | 57 |
4-1BB | AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG | 58 |
CD3z | AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACACAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC | 59 |
시료 | 측정된 역가(TU/mL) |
MSLN34 | 1.76 Х 107 |
MSLN34-D31L | 1.74 Х 107 |
MSLN34-S192R | 2.20 Х 107 |
MSLN34-D31L/S192R | 1.65 Х 107 |
CAR-T
생산 Batch # |
그룹 | CAR 발현(%) | CD3 |
Batch #1 | Mock T cell | < 1 | ≥ 99.9% |
MSLN34 CAR-T cell | 46.1 | ≥ 99.3% | |
MSLN34-D31L CAR-T cell | 39.3 | ≥ 99.6% | |
MSLN34-S192R CAR-T cell | 54.6 | ≥ 99.4% | |
MSLN34-D31L/S192R CAR-T cell | 43.3 | ≥ 99.5% | |
Batch #2 | Mock T cell | < 1 | ≥ 99.9% |
MSLN34 CAR-T cell | 43.9 | ≥ 99.3% | |
MSLN34-D31L CAR-T cell | 46.9 | ≥ 99.0% | |
MSLN34-S192R CAR-T cell | 37.9 | ≥ 99.3% | |
MSLN34-D31L/S192R CAR-T cell | 52.9 | ≥ 99.4% |
CAR-T
생산 Batch # |
Target cell | E:T | % of specific lysis | ||||
Mock | MSLN34 |
MSLN34
D31L |
MSLN34
S192R |
MSLN34
D31L/S192R |
|||
#1 | NCI-H2052 | 10:1 | -0.2 | 51.9 | 76.6 | 41.2 | 57.9 |
5:1 | 1.9 | 30.3 | 69.7 | 28.2 | 45.5 | ||
2.5:1 | 0.3 | 21.7 | 55.7 | 21.5 | 36.5 | ||
1.25:1 | 1.7 | 12.2 | 40.1 | 8.8 | 24.4 | ||
OVCAR-3 | 10:1 | -1.9 | 36.1 | 55.4 | 25.6 | 45.4 | |
5:1 | 0.5 | 25.9 | 54.6 | 27.1 | 41.1 | ||
2.5:1 | 3.1 | 13.9 | 29.4 | 14.3 | 26.1 | ||
1.25:1 | 0.5 | 9.6 | 22.2 | 9.8 | 19.9 | ||
#2 | NCI-H2052 | 10:1 | 3.7 | 54.8 | 71.5 | 50.4 | 62.3 |
5:1 | 1.7 | 37.3 | 53.4 | 35.7 | 56.2 | ||
2.5:1 | 4.5 | 29.3 | 59.9 | 32.4 | 53.1 | ||
1.25:1 | 1.8 | 20.0 | 44.4 | 22.0 | 45.1 | ||
OVCAR | 10:1 | -0.1 | 25.1 | 50.4 | 26.1 | 44.6 | |
5:1 | 0.3 | 17.9 | 41.1 | 18.6 | 38.6 | ||
2.5:1 | 1.4 | 13.2 | 30.1 | 14.5 | 32.3 | ||
1.25:1 | 0.5 | 9.2 | 21.8 | 8.6 | 21.1 |
Days | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 |
0 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
42 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
45 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
49 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 1/5 | 0/5 |
Days | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 |
0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 | 100.0 ± 0.0 |
4 | 103.4 ± 0.7 | 103.8 ± 0.6 | 102.7 ± 1.9 | 105.6 ± 3.5 | 105.3 ± 1.7 | 104.2 ± 2.4 |
8 | 107.0 ± 2.8 | 105.0 ± 1.6 | 106.9 ± 1.5 | 105.7 ± 2.5 | 107.4 ± 2.4 | 108.2 ± 2.8 |
11 | 105.5 ± 4.8 | 102.7 ± 1.7 | 104.6 ± 2.8 | 106.0 ± 3.6 | 104.8 ± 1.1 | 105.9 ± 4.0 |
15 | 111.3 ± 6.1 | 106.3 ± 1.8 | 109.0 ± 5.8 | 108.4 ± 5.0 | 105.8 ± 6.6 | 108.2 ± 6.3 |
18 | 110.5 ± 5.2 | 108.3 ± 3.1 | 111.3 ± 3.3 | 111.7 ± 4.2 | 101.2 ± 9.4 | 109.0 ± 5.9 |
21 | 110.9 ± 8.2 | 108.5 ± 5.0 | 108.0 ± 6.2 | 110.8 ± 4.4 | 99.1 ± 10.8 | 111.7 ± 6.0 |
24 | 112.2 ± 6.4 | 107.9 ± 4.4 | 105.8 ± 3.8 | 111.7 ± 4.8 | 93.8 ± 12.3***,# | 108.4 ± 6.4 |
28 | 110.2 ± 8.9 | 109.8 ± 3.8 | 102.6 ± 5.1 | 112.1 ± 5.2 | 88.5 ± 12.4***.## | 109.0 ± 4.4 |
31 | 107.2 ± 8.0 | 109.6 ± 3.2 | 100.6 ± 7.5 | 112.8 ± 4.5 | 83.9 ± 10.7***,### | 108.6 ± 4.4 |
35 | 109.6 ± 8.9 | 108.8 ± 3.1 | 96.2 ± 9.1 | 115.8 ± 4.3 | 82.5 ± 14.3***,## | 109.0 ± 5.2 |
38 | 109.8 ± 9.0 | 108.5 ± 0.5 | 92.7 ± 10.4* | 116.7 ± 4.3 | 82.2 ± 13.6***,## | 107.9 ± 6.8 |
42 | 112.1 ± 10.9 | 110.6 ± 2.3 | 90.4 ± 11.2**,# | 117.8 ± 3.5 | 80.2 ± 12.3***,### | 108.7 ± 4.7 |
45 | 107.2 ± 9.4 | 114.0 ± 2.8 | 87.4 ± 11.2**,## | 119.6 ± 5.6 | 78.9 ± 11.2***,### | 109.1 ± 3.8 |
49 | 106.5 ± 13.4 | 112.2 ± 2.9 | 83.8 ± 9.2**,### | 118.5 ± 5.5 | 77.0 ± 12.0***,### | 106.7 ± 3.6 |
Days | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 |
0 | 275.7 ± 48.8 | 276.8 ± 46.0 | 277.5 ± 44.9 | 276.3 ± 46.2 | 275.7 ± 50.2 | 275.3 ± 51.9 |
4 | 437.4 ± 101.4 | 454.8 ± 81.6 | 435.7 ± 67.0 | 459.5 ± 56.3 | 471.0 ± 77.9 | 343.4 ± 63.3 |
8 | 599.1 ± 108.8 | 617.3 ± 84.9 | 498.1 ± 89.5 | 560.2 ± 85.1 | 400.4 ± 79.2*,# | 390.4 ± 79.8**,# |
11 | 827.9 ± 249.6 | 711.3 ± 85.3 | 419.9 ± 61.8***,# | 595.4 ± 125.7 | 326.2 ± 72.7***,## | 328.1 ± 88.8***,## |
15 | 987.1 ± 291.8 | 853.8 ± 120.5 | 436.8 ± 120.4***,## | 688.0 ± 94.5* | 289.1 ± 71.2***,### | 337.9 ± 153.1***,### |
18 | 1247.2 ± 459.1 | 928.1 ± 148.9 | 341.6 ± 67.1***,## | 691.5 ± 105.6** | 233.6 ± 78.6***,### | 294.6 ± 259.6***,### |
21 | 1264.4 ± 413.6 | 930.8 ± 144.7 | 405.7 ± 136.8***,# | 693.2 ± 152.4** | 230.6 ± 103.3***,## | 319.5 ± 372.7***,## |
24 | 1360.0 ± 552.3 | 949.5 ± 164.0 | 351.6 ± 60.4***,# | 758.1 ± 120.7** | 187.5 ± 47.1***,## | 377.6 ± 523.8***,# |
28 | 1534.8 ± 364.6# | 987.7 ± 160.7 | 345.8 ± 45.6***,# | 854.5 ± 260.9** | 145.9 ± 34.8***,### | 372.2 ± 531.2***,# |
31 | 1450.0 ± 497.3 | 984.2 ± 172.6 | 368.4 ± 129.2*** | 852.0 ± 208.8* | 106.2 ± 40.9***,## | 417.0 ± 617.7*** |
35 | 2018.0 ± 498.9### | 921.3 ± 176.4*** | 267.9 ± 132.2*** | 1085.7 ± 232.9** | 97.4 ± 37.5***,# | 460.0 ± 643.7*** |
38 | 2075.7 ± 481.0## | 994.9 ± 247.7*** | 203.7 ± 100.2***,# | 1058.9 ± 194.6** | 81.9 ± 60.3***,## | 493.6 ± 751.1*** |
42 | 2274.7 ± 621.4## | 961.2 ± 324.4*** | 178.2 ± 83.2*** | 1219.7 ± 197.7** | 78.7 ± 97.0*** | 671.5 ± 984.3*** |
45 | 2444.7 ± 558.3## | 922.3 ± 332.4*** | 140.9 ± 36.8*** | 1204.1 ± 297.9** | 72.3 ± 86.1*** | 763.7 ± 1187.3*** |
49 | 2623.1 ± 795.3## | 1011.7 ± 467.4** | 143.8 ± 80.8*** | 1344.5 ± 267.8* | 74.4 ± 73.3*** | 807.2 ± 1257.5*** |
G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | |
(mg) | 1394.6 ± 447.3## | 462.8 ± 276.1** | 30.8 ± 23.7*** | 560.0 ± 102.5** | 39.3 ± 38.2*** | 378.5 ± 671.6*** |
Claims (20)
- 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2) 및 서열번호 21으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2) 및 서열번호 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고,
상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
상기 하나 이상의 아미노산 치환은 하기의 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환됨,
2) 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨; 및
3) 서열번호 19의 1번째 아미노산이 D에서 L로 치환되고, 서열번호 23의 7번째 아미노산이 S에서 R로 치환됨. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 29로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 30으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 31로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 32로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 35로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 36으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 37로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 38로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 39로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 40으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 43으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 44로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 45로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 46으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 47로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 48로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 청구항 1에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 33으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 34로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 41로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 42로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 49로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 50으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 청구항 1에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
2) 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
3) 서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 메소텔린에 대한 친화도를 상승시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 청구항 1 및 5 내지 8 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산.
- 청구항 9의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
- 청구항 10의 벡터로 형질전환된 분리된 숙주세포.
- 청구항 11의 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항-메소텔린 항체를 제조하는 방법.
- 항원 결합 도메인, 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체로서,
상기 항원 결합 도메인은 청구항 1 및 5 내지 8 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메릭 항원 수용체. - 청구항 13에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 scFv (single chain variable fragment)인 것인, 키메릭 항원 수용체. - 청구항 13의 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 15에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 53 내지 55로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드. - 청구항 15의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 청구항 17의 벡터로 형질전환된 분리된 세포.
- 청구항 18에 있어서,
상기 분리된 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 감마델타 T 세포 (gamma delta (γδ) T cells)인 것인, 분리된 세포. - 청구항 18의 분리된 세포를 포함하는, 메소텔린을 발현하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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