KR102681869B1

KR102681869B1 - 줄기 세포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 줄기 세포를 모니터링하는 방법

Info

Publication number: KR102681869B1
Application number: KR1020200179086A
Authority: KR
Inventors: 주지현; 홍창표; 송지환
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단; 주식회사 입셀
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: KR20220088244A

Abstract

줄기 세포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 줄기 세포를 모니터링하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 미분화 상태인 줄기 세포의 질적 상태를 정량적으로 모니터링하고, 줄기 세포의 보관 및 사용 조건을 개발하는데 이용할 수 있다.

Description

줄기 세포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 줄기 세포를 모니터링하는 방법{Composition for monitoring a stem cell, kit and method for monitoring the stem cell using the same}

줄기 세포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 줄기 세포를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.

유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)는 배아 줄기 세포와 유사한 전분화능을 가져 거의 대부분의 세포로 분화시킬 수 있다. 유도만능 줄기세포는 심혈관 질환, 혈액 질환, 뇌 질환 등 세포 치료가 시도되고 있는 다양한 질병의 치료에 적용이 가능하다. iPSC를 포함한 전분화능 줄기세포(Pluripotent Stem Cell: PSC)의 임상적 응용의 가능성을 높이기 위해서는 세포주 수립의 효율성 제고, 특정 세포로의 분화 기술 개발, 유전자 도입 방법에 있어서의 안전성 확보, 배양 과정에서의 형질전환 문제, 및 종양 형성의 가능성에 대한 보완책을 필요로 한다. 특히, 줄기세포 은행을 수립하기 위한 과정에서 배양 과정 중의 형질전환 문제는 반드시 해결해야 할 선결 조건 중 하나이다.

iPSC의 경우 배아줄기세포에 비해 품질 면에서 편차가 훨씬 큰 것으로 알려져 있다(Yamanaka et al., Cell Stem Cell, 2012, 10(6):678-684). 이는 모든 종류의 iPSC가 iPSC로 적합한 기준을 맞추지 못함을 의미한다. 또한, 미분화 줄기세포의 배양 조건에서 자기-증식(self-renewing) 세포의 진행성 적응(progressive adaptation)이 일어날 수 있어 유전체의 안정성을 보장할 수 없다(Baker et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25(2): 207-2015). 계대 배양 및 장기 배양에 따른 줄기세포의 유전체 및 후성유전체의 비정상적인 변화는 사람에게 암 등의 치명적인 부작용을 불러올 수 있다.

따라서, 제작된 iPSC 세포주에 대한 품질관리 및 유용성을 검증할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다.

줄기 세포를 모니터링하기 위한 조성물을 제공한다.

줄기 세포를 모니터링하기 위한 키트를 제공한다.

줄기 세포를 모니터링하는 방법을 제공한다.

ID1(inhibitor of DNA binding 1), THY1(THYmocyte differentiation antigen 1), 및 DUSP6(Dual specificity phosphatase 6)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기 세포를 모니터링하기 위한 조성물이 제공된다.

ID1(inhibitor of DNA binding 1)은 전사인자의 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(HLH)와 헤테로이량체를 형성할 수 있는 HLH 단백질이다. ID1은 bHLHb24로도 불릴 수 있다. ID1는 DNA 결합 활성은 없어서, ID1와 상호작용하는 염기성 HLH 단백질의 DNA 결합 및 전사 활성화 활성을 저해할 수 있다. ID1는 세포 증식, 노화, 및 분화에 역할을 할 수 있다. ID1은 사람에서 Uniprot 번호 P41134의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 마우스에서 Uniprot 번호 P20067 또는 Q6GTZ3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

THY1(THYmocyte differentiation antigen 1)은 CD90, CDw90, 또는 Thy-1 세포 표면 항원이라고도 불릴 수 있다. THY1은 흉선세포 항원으로 발견된, 단일 V-유사 면역글로불린 도메인을 가진 25 내지 37 kDa의 과(heavily) N-글리코실화된 글리코포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol: GPI)이 부착된 보존된 세포 표면 단백질이다. Thy-1은 다양한 줄기 세포 및 성숙한 뉴런의 축삭 과정에 대한 마커로 이용될 수 있다. THY1는 사람에서 Uniprot 번호 P04216의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 마우스에서 Uniprot 번호 P01831의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

DUSP6(Dual specificity phosphatase 6)는 HH19, MKP3, 또는 PYST1로도 불릴 수 있다. DUSP6는 이중 특이성 단백질 포스파타제 서브패밀리에 속하는 것으로서, 포스포세린/트레오닌과 포스포타이로신 잔기 모두를 탈인산화시킴으로써 표적 키나제를 불활성화시킬 수 있다. DUSP6는 사람에서 Uniprot 번호 Q16828의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 마우스에서 Uniprot 번호 Q9DBB1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 단편(fragment)은 상기 단백질의 일부로서, 면역원성 폴리펩티드일 수 있다.

상기 발현 수준은 단백질을 암호화하는 유전자의 전사체 또는 단백질의 양일 수 있다.

상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 상기 앱타머는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이나 펩티드일 수 있다.

상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.

용어 "줄기 세포(stem cell)"는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성 세포(totipotent cell) 또는 많은 종류의 세포로 분화할 수 있는 만능성 세포(pluripotent cell) 혹은 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포(multipotent cell)를 의미하고, 줄기 세포는 미분화 세포로서 특정 조직의 세포로 분화될 수 있다. 상기 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 및 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 전능성, 만능성, 또는 다능성 줄기세포는 특정 형태의 전구세포를 거친 뒤 특정 세포로 완전히 분화될 수 있다.

상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC), 또는 핵 치환 배아 줄기 세포(Somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell)일 수 있다. 상기 배아 줄기 세포는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내 세포 괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 말한다. 상기 성체 줄기 세포는 신체 각 조직에 극히 소량만이 존재하는 미분화된 세포로서 죽은 세포나 손상된 조직을 대체하는 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)는 분화가 끝난 체세포에 세포 역분화 관련 유전자들을 주입하여 초기단계의 분화능을 가진 줄기세포 단계로 되돌려, 배아 줄기 세포처럼 만능성을 유도한 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기 세포는 예를 들면 인간 피부세포 유래 유도 만능 줄기 세포(human dermal fibroblast-iPSC: hDF-iPSC), 혈액세포 유래 유도 만능 줄기 세포(blood cell-iPSC), 또는 뇨세포 유래 유도 만능 줄기 세포(urine-iPSC)일 수 있다. 상기 핵 치환 배아 줄기 세포는 난자의 핵을 제거하고 체세포의 핵으로 치환한 뒤 이 세포로부터의 초기 발생 과정 중에 형성되는 포배기 배아에서 내 세포 괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 만능성 세포를 말한다.

상기 줄기 세포는 미분화 줄기 줄기세포의 바이오마커를 발현하는 세포일 수 있다. 상기 줄기 세포는 Oct4, Sox2, Nanog, SSEA4, Tra-1-60, Tra-1-81, 및 Lin28로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커를 발현하는 것일 수 있다.

상기 줄기 세포는 단일 세포 또는 세포의 군집(population)일 수 있다.

상기 줄기 세포는 포유동물, 예를 들면, 인간, 마우스, 래트, 유인원, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이 유래의 세포일 수 있다.

상기 줄기 세포를 모니터링하는 것은 줄기 세포의 질적 상태 또는 품질을 모니터링하는 것일 수 있다. 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 변화를 분석함으로써 줄기 세포의 질적 상태를 분석할 수 있다. 상기 조성물은 상기 줄기 세포의 유전체 불안정성(genomic instability), 배양 적응(culture adaption), 또는 이들의 조합을 모니터링하기 위한 것일 수 있다. 상기 유전체 불안정성은 유전체 안정성 또는 유전적 안정성을 측정하기 위한 것으로서, 유전자 이상(genetic abnormality), 유전자 변이(genntic variation), 이수성(aneuploidy), 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP), 카피수 변이(copy number variation: CNV), DNA 메틸화 변형, 및 히스톤 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다. 상기 배양 적응은 시험관 내에서 세포를 배양할 경우 계대 배양 또는 배지의 교환과 같은 외부 환경의 변화에 따라 세포의 유전형 또는 표현형이 변화하여 외부 환경의 변화에 순응하는 것일 수 있다. 상기 줄기 세포의 유전체 불안정성, 배양 적응, 또는 이들의 조합은 세포의 계대 배양에 의한 것일 수 있다.

ID1, THY1, 및 DUSP6로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기 세포를 모니터링하기 위한 키트가 제공된다.

ID1, THY1, DUSP6, 단편, 발현 수준, 제제, 줄기 세포, 줄기 세포의 모니터링은 전술한 바와 같다.

상기 키트는 줄기 세포의 모니터링에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 역전사 효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.

계대 배양을 수행한 줄기 세포에서 ID1, THY1, 및 DUSP6로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정된 발현 수준으로부터 상기 줄기 세포의 상태를 분석하는 단계를 포함하는 줄기 세포를 모니터링하는 방법이 제공된다.

상기 방법은 계대 배양을 수행한 줄기 세포에서 ID1, THY1, 및 DUSP6로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

용어 "계대 배양(subculture)"은 세포 증식을 위해 새로운 배양 배지로 세포들의 일부 또는 전부를 옮겨 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법을 말한다. 계대 배양은 제한된 배양접시 내에서 세포들이 계속 분열하다 세포가 증식을 멈추게 되므로 이를 막고 세포가 증식할 수 있게끔 새로운 공간 또는 배지를 제공하는 것일 수 있다. 계대 배양의 반복 회수는 계대수(passage number)라고 부를 수 있고, 계대수가 증가할 수록, 배양 조건에 적응하기 위해 유전체 이상이 증가할 수 있다.

상기 줄기 세포의 상태는 줄기 세포의 유전체 불안정성, 배양 적응, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 방법은 계대 배양 전의 줄기 세포 또는 배아체(embryoid body: EB)를 대조군으로 할 수 있다. 예를 들어, 모니터링 시작 또는 초기의 줄기 세포를 음성 대조군으로 하여 계대 배양을 반복하여 계대수가 증가한 때의 줄기 세포를 모니터링할 수 있다. 모니터링 시작 또는 초기의 줄기 세포와 계대수가 증가한 때의 줄기 세포의 상태가 유사하면, 상기 줄기 세포는 초기 줄기 세포의 상태를 유지하는 것으로 판단할 수 있다. 예를 들어, 배아체의 세포를 양성 대조군으로 하여 줄기 세포를 모니터링할 수 있다. 배아체의 줄기 세포와 모니터링한 줄기 세포의 상태가 유사하면, 상기 줄기 세포는 유전에 불안정성, 배양 적응, 또는 이들의 조합이 발생할 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

상기 방법은 시험관 내(in vitro)에서 수행될 수 있다. 상기 줄기 세포는 개체 또는 생물학적 시료로부터 분리된 줄기 세포일 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 줄기 세포는 세포주일 수 있다.

상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던(Northern) 블로팅, 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 역전사-PCR, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 상기 전기영동은 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 PCR은 실시간 PCR일 수 있다.

상기 측정된 발현 수준으로부터 상기 줄기 세포의 상태를 분석하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 ID1의 발현이 대조군에 비해 증가한 경우 상기 줄기 세포의 분화가 억제되는 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법은 상기 ID1의 발현이 감소한 경우 배양 적응이 이루어진 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법은 THY1 및 DUSP6로 이루이진 군으로부터 선택된 단백질의 발현이 증가한 경우 상기 세포의 유전체 불안정성, 배양 적응, 또는 이들의 조합이 발생할 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.

줄기 세포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 줄기 세포를 모니터링하는 방법에 따르면, 미분화 상태인 줄기 세포의 질적 상태를 정량적으로 모니터링하고, 줄기 세포의 보관 및 사용 조건을 개발하는데 이용할 수 있다.

도 1a는 준비된 줄기세포의 현미경 이미지이고, 도 1b는 줄기세포의 미분화 바이오마커를 면역세포화학방법으로 확인한 이미지이고, 도 1c는 미분화 마커인 Oct4, Sox2, Nanog, 및 Lin28을 RT-PCR로 증폭한 결과를 나타내는 이미지이고, 도 1d는 표면 미분화 마커인 SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81의 발현 여부를 FACS로 확인한 그래프이다.
도 2는 10X Genomics Chromium 시스템을 나타낸 모식도이다(A: 10X 마이크로플루이드 칩과 단일세포 RNA 시퀀싱 과정, B: GEM 형성 과정으로서, 오일 방울 안에 세포 1개와 바코드 장착된 비드 1개를 가두게 됨, C: 단일세포 GEM 형성 비율, D: 시퀀싱 리드(read)의 구조로서, 세포 바코드와 UMI 바코드를 포함함).
도 3은 단일 세포 전사체 분석(scRNA-Seq)에서 분석된 세포의 수, 세포 당 리드의 수, 및 세포당 유전자의 수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 H9 ESC 세포주와 HPS0076 iPSC에서 계대수 증가에 따른 단일 세포의 전사체 발현량 수준을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 4개의 세포주로부터 선발된 배양적응 특이적 유전자 후보 선발 결과를 나타내는 그래프이고, 도 5b는 바이오마커 ID1, THY1, 및 DUSP6의 계대수 증가에 따른 차등발현을 나타낸 그래프이다.
도 6은 Pseudotime 분석을 통해 H9의 계대수 증가(P45, P75, 및 P85)에 따라 발현 변화 추이를 나타내는 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미분화 만능줄기세포의 배양적응 바이오마커

가. 배양적응 미분화 만능줄기세포의 확보 및 특성 분석

1) 줄기세포의 준비

H9(WiCell, University of Wisconsin, USA) 1종의 배아줄기세포(ESC)와, HPS0076(CiRA, Kyoto University, Japan) 1종의 iPSC 세포주를 준비하였다. 시작 계대(starting passage)에서 20부터 30 계대(passage: P)를 더 배양한 시료를 피더 세포가 없는(feeder-free) 조건에서 배양 적응(culture adaptation)을 통해 확보하였다. 시작 계대를 'E(early)'로 표시하고, 20 계대 이상 더 배양한 계대를 'L(late)'로 표시하였다. 준비된 세포의 계대수를 표 1에 나타내었다.

세포		초기 계대(E)	후기 계대(L)
ESC	H9	P44	P75
iPSC	HPS0076	P48	P68

2) 준비된 줄기세포의 형태학적 및 면역세포화학적 분석

준비된 줄기세포를 현미경으로 관찰하여 형태학적 모습을 확인하고, 그 이미지를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 각 세포주가 형태학적으로 유사하게 관찰되었고, 모두 자기-증식(self-renewal) 군집 형태가 관찰되었다.

줄기세포의 미분화 바이오마커인 세포 핵 내에서 발현되는 Oct4, Sox2, 및 Nanog와 세포막에서 발현되는 세포 표면 미분화 마커인 SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81을 면역세포화학법(Immunocytochemistry: ICC)으로 분석하였다.

구체적으로 세포를 4웰 접시에 1x10⁴ 개의 세포를 접종하고, 약 6일 간 배양하여 미분화 줄기세포로써 형태학적인 특성인 군집 형태가 잘 이루어져 있는 것이 관찰되면 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하였다. 고정된 세포를 세포 핵 내 단백질인 Oct4, Sox2, 및 Nanog와 같은 마커들은 0.1%(v/v) Triton-X100 용액으로 3회 세척하고, 세포막에 발현하는 단백질인 SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81은 PBS로 3회 세척하였다. 이후, 고정된 세포에 항-Oct4 항체, 항-Sox2 항체, 항-Nanog 항체, 항-SSEA4 항체, 항-Tra-1-60 항체, 및 항-Tra-1-81 항체를 가하여 결합시키고, 형광 물질이 접합된 2차 항체와 핵을 염색하는 DAPI를 이용하여 세포를 염색하였다. 염색된 세포를 형광현미경으로 관찰하고, 그 이미지를 도 1b에 나타내었다.

도 1b에 나타난 바와 같이, 준비된 ESC 및 iPSC는 모두 6종의 미분화 마커를 발현하고, 초기(early) 계대와 후기(late) 계대에서 미분화 마커의 발현 수준은 큰 차이가 없음을 확인하였다.

3) 미분화 마커의 RT-PCR 분석

ESC와 iPSC 세포 주의 초기 및 후기 계대에서 미분화 마커인 Oct4, Nanog, Sox2, 및 Lin28의 바이오마커를 RT-PCR로 확인하였다.

준비된 줄기세포를 피더 세포가 없는 조건에서 35 mm 접시에서 약 7일간 배양하였다. 배양된 세포에 0.5x Tryple 용액(Gibco)을 가하고 37℃에서 약 5분간 처리한 후 iPSC-YGM으로 채워주었다. 세포 스크래퍼로 세포를 뗀 후 원심분리하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포는 -20℃에서 냉동시켰다.

세포에서 총 RNA를 분리하고 역전사시켜 cDNA를 합성하였다. 미분화 마커인 Oct4, Sox2, Nanog, 및 Lin28에 대한 하기와 같이 프라이머쌍을 준비하고(Cosmo genetech), 이를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

Oct4 증폭용 정방향 프라이머: 5'-CTGAAGCAGAAGAGGATCAC-3' (서열번호 1)

Oct4 증폭용 역방향 프라이머: 5'-GACCACATCCTTCTCGAGCC-3' (서열번호 2)

Sox2 증폭용 정방향 프라이머: 5'-GCTGCAAAAGAGAACACCAA-3' (서열번호 3)

Sox2 증폭용 역방향 프라이머: 5'-CTTCCTGCAAAGCTCCTACC-3' (서열번호 4)

Nanog 증폭용 정방향 프라이머: 5'-TTCTTGACTGGGACCTTGTC-3' (서열번호 5)

Nanog 증폭용 역방향 프라이머: 5'-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3' (서열번호 6)

Lin28 증폭용 정방향 프라이머: 5'-CACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGCAG-3' (서열번호 7)

Lin28 증폭용 역방향 프라이머: 5'-TCAATTCTGTGCCTCCGGGAGCAGGGTAGG-3' (서열번호 8)

RT-PCR은 95℃에서 1분 후, 95℃ 15초, 60℃ 또는 66℃에서 20초, 및 72℃에서 30초를 1 사이클로하여 30 사이클을 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분 동안 반응시켰다. RT-PCR 결과를 도 1c에 나타내었다(M: 크기 마커).

도 1c에 나타난 바와 같이, 한 세포주에서 마커마다 발현하는 양의 차이는 날 수 있지만, 세포주마다 초기 및 후기 계대에서의 미분화 마커의 발현 양의 차이는 크게 나지 않았다. 따라서, 준비된 ESC 및 iPSC 세포주 모두 미분화 상태를 잘 유지하고 있는 것을 확인하였다.

4) 미분화 마커의 FACS 분석

ESC와 iPSC 세포 주의 초기 및 후기 계대에서 표면 단백질 중 미분화 마커인 SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81의 바이오마커를 FACS로 확인하였다.

준비된 줄기세포를 피더 세포가 없는 조건에서 35 mm 접시에서 약 7일간 배양하였다. IgG3 이소타입/SSEA4, IgM 이소타입/TRA-1-60, 및 IgM 이소타입/TRA-1-81을 사용하여 FACS를 수행하고, 그 결과를 도 1d에 나타내었다.

도 1d에 나타난 바와 같이, ESC와 iPSC의 초기 및 후기 계대에서 세포 표면 발현 미분화 마커인 SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81의 바이오마커 모두가 75% 이상을 발현하는 것을 확인하였다. 따라서, 세포주들이 유사하게 미분화 상태를 잘 유지하고 있다는 것을 확인하였다.

5) 자성-활성화 세포 분류(Magnetic-activated cell sorting: MACS)을 이용한 단일 세포 cDNA 라이브러리 제작을 위한 세포 준비

세포 표면에서 발현하는 특정 단백질인 Tra-1-60에 자성을 가지고 있는 마마이크로비드와 결합된 특정 단백질 특이적 항체를 붙인 뒤, 자성을 이용하여 세포 표면 단백질의 발현되는 세포를 분리하였다.

분리된 줄기세포에 MACS 완충액과 TRA-1-60 마이크로비드 항체(Miltenyi Biotech)를 넣고 4℃에서 5분간 반응시켰다. LS 컬럼과 QuadroMACS™에 결합시키고, 컬럼을 MACS 완충액으로 씻어준 다음, MACS 완충액에 용해된 세포를 LS 컬럼에 로딩하였다. TRA-1-60이 발현하지 않는 세포는 제외시키고, LS 컬럼을 QuadroMACS™에서 분리한 후 컬럼에 MACS 완충액을 채웠다. MACS 완충액이 채워진 LS 컬럼을 플런저(plunger)로 밀어내어 TRA-1-60이 발현하는 세포를 수집하였다.

나. 단일세포 오믹스 기반의 단일세포 오믹스 기반의 배양적응 관련 특이적 유전자의 스크리닝

1) 10X Genomics를 이용한 단일 세포 분리 및 cDNA 라이브러리 제작

(가) GEM 제작 및 바코드달기

Chromium Single Cell 3' Reagent Kits (V2)(10x Genomics)을 사용하여 세포를 분리하고 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

구체적으로, 역전사(RT) 시약 혼합물, RT 프라이머, 첨가물(additive) A, 및 RT 효소 혼합물을 혼합하여, 단일 세포 마스터 혼합물을 준비하였다. 단일 세포 마스터 혼합물에, 준비된 세포, 겔 비드(10x 바코드 포함)(10x Genomics), 분획(partitioning) 오일을 칩 상에 표시된 표지 2, 1, 및 3의 웰에 주입하여 칩에 로딩하였다. 10x 개스킷(Gasket)을 부착시켰다. Chromium 컨트롤러를 실행하여 GemCode와 함께 분획-겔 비드가 미세관을 통과하면서 세포와 결합된 후 오일을 통과하면서 단일 세포로 분획시켰다(Gelbead-in-EMulsion(GEM) 형성)(도 2의 B). 칩 상에서 GEM 배출구를 96웰 플레이트에 옮긴 후 보관하였다.

GEM의 안정성을 확보하기 위해, Bio-Rad PX1 플레이트 실러(Sealer)로 플레이트를 실링하고, Bio-Rad C1000 Touch에서 인큐베이션하였다.

(나) cDNA 증폭

PCR 플레이트에 있는 시료에 125 ㎕의 recovery agent를 가하여 분획 오일과 수성 시료를 구분시키고 분획 오일을 제거하였다. 200 ㎕ 실란 Dynabeads Cleanup Mix를 추가적으로 넣고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 반응 혼합물에 남은 화학물질 및 프라이머들을 제거하였다.

준비된 총 RNA를 역전사시켜 cDNA를 합성하였다. PCR 증폭 조건은 98oc에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 98℃에서 15초, 67℃에서 20초, 및 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 8 내지 14 사이클을 반복하였다. 마지막으로, 72℃에서 1분에서 인큐베이션한 후 4℃에서 보관하였다. 반복 사이클은 회수된 세포의 수가 <2,000인 경우 14 사이클, 2,000 내지 6,000인 경우 12 사이클, 6,000 내지 10,000인 경우 10 사이클, 및 >10,000인 경우 8 사이클을 진행하였다.

SPRIselect 시약(Beckman)를 사용하여 증폭된 cDNA를 정제하였다. 준비된 cDNA와 뉴클레아제가 없는 물을 1:5의 비율로 희석시킨 1 ㎕의 시료를 Agilent Bioanalyzer D5000 ScreenTape High Sensitivity chip 상에서 이동시켰다. 전기영동도(Electropherogram)를 통해 크기가 200 bp 내지 9000 bp인 cDNA를 선별하고, 선별된 cDNA 양을 계산하였다.

(다) 라이브러리 제작

준비된 cDNA는 Chromium Single Cell 3' Reagent Kit의 Fragmentation Mix를 사용하여 32℃에서 5분 동안 절단하고, 65℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 말단 수선 및 A-꼬리 달기를 수행하였다. SPRIselect 시약을 사용하여 양쪽에서 절단된 폴리뉴클레오티드를 수득하였다. 회수된 폴리뉴클레오티드에 어댑터를 라이게이션시키고, SPRIselect 시약을 사용하여 라이게이션된 폴리뉴클레오티드를 수득하였다.

제작된 폴리뉴클레오티드는 1:10으로 희석하고, Bioanalyzer High Sensitivity DNA 키트 또는 TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape를 사용하여 QC를 진행하였다.

(라) 시퀀싱 라이브러리 제작 및 핵산서열분석

Illumina bridge amplification PCR에 사용되는 P5 및 P7 프라이머를 사용하여 Single Cell 3 라이브러리를 제작하였다. 핵산서열분석 커버리지를 위한 세포 당 추천되는 서열 리드의 수는 약 50000 리드이다. 3 nM의 단일 세포 라이브러리에에 phix 5% spike-in하여 클러스터를 생성하였다. Hiseq4000 장비로 Read 1 30 사이클, 인덱싱 런(indexing run) 8 사이클, Read 2 100 사이클을 조건으로 시퀀싱 진행하였다.

HiSeq 4000 플랫폼 기준 클러스터의 밀도는 2355 K/mm²이고, %PF(passing filter)는 65% 이상이었다. 핵산서열분석 결과, 시료 당 평균 리드의 수는 1127.2 M 리드, 인덱스는 9.02 Gb, R1은 29.31 Gb, R2는 110.46 Gb의 핵산서열분석원시데이터가 생산됨. GC는 50.67%, Q30 염기쌍들의 분포는 전체 염기쌍 중 86.02%, Q20 분포는 91.71%를 차지하였다. 리드 중에서 인간 참조 유전자의 엑손 영역에 맵핑된 리드의 수는 약 75.1%였고, 약 11% 정도는 인트론 영역에 맵핑되었다.

2) 단일 세포 전사체 분석

Chromium 단일 세포 3'V2 라이브러리는 반대편 끝에 P5 및 P7 서열을 갖는 표준 일루미나의 페어-엔드(pair-end) 구조를 갖고 있다. Read 1은 10X 바코드(16bp)와 UMI(10bp)로 구성되며, 샘플 인덱스 정보는 i7 에 포함되어 있고, Read 2에는 단일 세포의 전사체 서열이 암호화되어 있다. 포함되어 있는 서열의 구성이 달라 10X Genomics에서 추천하는 방법으로 FASTQ 파일을 생성했다(추천 생산량: 50,000 리드/세포).

Cellranger(버전 2.1.2)를 이용하여 Chromium 단일 세포 RNA-핵산 서열 출력을 처리하여, 판독을 정렬하고, 유전자-세포 매트릭스를 생성하며, 클러스터링 및 유전자 발현 분석을 수행하였다. FASTQ 파일을 가져와서 정렬, 필터링, 바코드 카운팅 및 UMI 카운팅을 수행하였다. 단일 세포 서열분석에서 세포 당 총 읽힌 리드의 수가 각기 다르기 때문에, 이를 정규화하였다.

단일 세포 전사체 분석(scRNA-Seq)에서 분석된 세포의 수, 세포 당 리드의 수, 및 세포당 유전자의 수를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 단일 세포 전사체 분석에서 분석된 평균 단일 세포의 개수는 약 4,026개였고, 단일 세포 당 평균 299.5 K의 서열이 확보되었고, 단일 세포 당 평균 6,619개의 유전자들이 검출되었다. 이러한 유전자들은 중간 수준의 발현 내지 고발현된 유전자들로 판단되었다. 세포 당 추천되는 리드 수 (50 K) 보다 6배 많은 리드를 생산하여 유전자 포화도 분포를 확보하였다.

세포가 죽어서 이미 RNA를 상당히 잃어버리거나, 용해가 제대로 되지 않아 RNA가 노출되지 않거나, 또는 정상 세포가 아닌 죽은 세포로부터의 부유물만이 분리되어 바코딩되는 경우들이 있다. 이런 정보들이 정상 세포의 결과와 뒤섞이면 추후 분석 과정에 큰 방해가 되므로, 검출된 유전자의 수나 미토콘드리아 유래 RNA의 비율 등 여러 지표를 이용해 정상 세포를 선별하였다(필터 기준: 0% < 미토콘드리아 유전자의 백분율(percent.mito) < 10%). Seurat R package를 이용하여 세포의 품질을 확인하고 필터링하였다.

단일 세포 핵산서열분석 데이터는 수천개에서 수만개에 이르는 세포에 대해 적어도 이만 개에서 삼만 개의 유전자의 발현양을 수치화한 고차원 정보이기 때문에, 저차원으로 축소시키는 과정이 필요하다(차원 축소). 발현이 아주 적어서 노이즈에 취약하거나, 여러 세포에서 변화가 거의 없는 유전자들은 분석에 큰 의미가 없기 때문에 이들을 제거하고 유의미한 유전자들만 남겨서 분석에 활용하는 차원 축소 기법(PCA, Principal Component Anlysis)을 적용해서, 비슷한 변화를 보이는 유전자끼리 모아주는 작업을 수행하였다.

차원 축소를 거친 데이터는 저차원 공간의 좌표라고 생각할 수 있고, 세포 하나마다 고유의 좌표를 갖게 되어 그래프로 변환할 수 있다(그래프 변환). 저차원 공간에서 군집을 이루어 특정한 기하학적 형태를 구성하게 된다.

그래프 구조로 변환된 데이터는 다양한 분석에 활용되는데, 보통 하나의 세포 타입에 속하는 세포들은 그래프에서 아주 잘 연결된 덩어리를 이루며, 이 덩어리를 찾아 세포를 분류할 수 있다(그래프 클러스터링 및 연결구조 분석).

3) 배양 적응 동안 축적된 미분화 세포의 세포 이질성의 확인

tSNE 클러스터링을 이용하여 세포 집단의 이형화(heterogeneity)를 확인하였다. 구체적으로, 각 세포주[ESCs (H9), iPSCs (HPS0076)]의 각 계대들에 대한 클러스터 형성 후, 서로 다른 계대의 데이터 [H9 (P44 vs. P75), HPS0076 (P48 vs P68)]를 접합(aggregation)시켜, 계대수 증가에 따라 단일 세포의 전사체 발현량 수준을 조사하였다. 전사체 발현량 수준을 나타나낸 그래프를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 각 세포주의 계대수 증가에 따라(초기 vs. 후기)에서 배양 적응에 의한 이형화 현상 및 달라지는(divergent) 발현을 확인하여, 배양 적응에 따른 세포 이질성(cellular heterogeneity)을 확인하였다. 심지어, 각 세포주의 동일 계대에서도 달라지는 발현을 나타내었다.

P<0.01 및 1.5-변화 배수(fold change)를 컷오프로 하여 각 세포주의 접합 클러스터로부터 차등 발현 유전자(Differentially expressed gene: DEG)를 확인하였다. H9 세포주(P44 vs. P75)에 대해 171 DEG, HPS0076 세포주(P48 vs P68)에 대해 24 DEG에 대해 40 DEG을 확인하였고, 그 목록을 하기 표 2에 나타내었다.

세포주	차등발현 유전자 목록
H9 (P44 vs. P75)	ACTG1, APLP2, APOE, APP, ARL6IP1, ATP1A1, ATP6AP2, BRI3, BSG, BST2, C9orf135, CALD1, CALR, CALU, CCNB1, CD9, CDC20, CDK1, CEBPZ, CENPF, CHGA, CITED2, CKS1B, CKS2, CLDN6, CLDN7, CLU, CPVL, CRABP2, CTGF, CTSC, CTSV, CUZD1, CXADR, CYBA, DDOST, DDX5, DEGS1, EIF3E, EIF4A1, EIF4A2, EIF4EBP1, EIF5B, ENO1, EPCAM, ERP29, FAM64A, FBLN1, FEZ1, FUS, GAPDH, GPC3, GPC4, GPX1, GRN, GUK1, HIST1H4C, HLA-A, HLA-C, HMGB2, HSP90AA1, HSP90AB1, HSP90B1, HSPA4, HSPA5, HSPA8, HSPA9, HSPD1, ID1, ID3, IGFBP2, ITM2B, KIAA0101, KPNA2, L1TD1, LAPTM4A, LDHA, LINC00678, MAGED2, MALAT1, MCM3, MDH1, MFGE8, MIF, MIR302B, MT1E, MT1G, MT1H, MT1X, MT2A, MT-ATP6, MT-CO1, MT-CYB, MTHFD2, MT-ND6, MYH10, NASP, NCL, OLFML3, PDIA3, PDIA4, PDIA6, PGK1, PHLDA1, PKM, PLA2G16, PLK1, PLS3, PMEL, PPP1R14B, PRKCSH, PSAP, PSAT1, PSIP1, PTPLAD1, RANBP1, RDX, ROMO1, RPL13, RPL18A, RPL32, RPL36, RPL37A, RPL8, RPN2, RPS12, RPS14, RPS18, RPS19, RPS2, RPS26, RPS29, RPS5, RTN3, SEC61G, SERPINB9, SERPINH1, SFRP1, SLC16A1, SLC16A3, SLC2A1, SLC2A3, SLC3A2, SON, SRRM1, SSB, TAGLN, TCEB2, TERF1, THY1, TMBIM6, TMSB10, TOMM7, TOP2A, TPI1, TPM1, TPR, TRIM24, TUBA1B, TUBA1C, TUBB, TUBB4B, TXNL4A, UBC, UBE2C, UBE2S, UGP2, USP9X, VCP, XBP1, XRCC5
HPS0076 (P48 vs P68)	CRABP2, CTNNB1, DUSP6, EIF5A, HIST1H4C, HNRNPH1, HSPA5, HSPA8, ID1, KPNA2, KRT18, MALAT1, MT1E, MT1G, MT1X, MT2A, PDIA3, PRKCDBP, PTPRS, SOX4, THY1, TOP2A, TUBA1B, UBE2C

DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)를 이용하여 각 세포주의 DEG에 대한 유전자 온톨로지(gene ontology: GO) 증폭(enrichment) (P<0.001) 분석을 수행하였다. 모든 세포주에서 세포 연접(cell junction)과 세포 구획(cell part) 관련 기능을 가진 유전자들이 유의미하게 나타나, 배양 적응 동안 세포간 연락이 중요한 것으로 나타났다. 또한, 세포 주기 및 세포골격 관련 유전자들 또한 유의미하게 증폭되었다.

4) 세포 이질성을 기반으로 배양 적응 특이적 유전자 후보의 탐색

2종의 세포주의 서로 다른 계대 사이에서 이형화 발생시 공통적으로 발현 변화를 보인 9개의 유전자를 선발하였고, 발현 변화 상태를 도 5a에 나타난 바와 같이 히트맵(heatmap)으로 분석하였다. 선발된 유전자 후보는 HSPA5, ID1, HIST1H4C, THY1, DUSP6, KPNA2, PDIA3, UBE2C, 및 TUBA1B이었다.

ID1, THY1, 및 DUSP6의 경우 초기 대 후기 계대 사이에서 명확한 발현 변화가 확인되었다(도 5b). 배양 적응 동안 계대수의 점진적 변화에 따라 특이적으로 발현이 변화된 것으로 보였다. 그 외에, HSPA5, HIST1H4C, KPNA2, PDIA3, UBE2C, 및 TUBA1B은 초기 대 후기 계대 사이에서 변화의 혼재가 심하였다. 사용된 각 세포주의 시작 계대에 해당하는 시료들이 이전에 보유하고 있던 내재적 변이가 배양 적응을 통해 점진적으로 축적되었거나(증가), 적응하면서 유전자 발현이 일부 세포에서 다시 감소한 것으로 보여졌다(변이의 혼재 및 축적). ID1, THY1, 및 DUSP6(주로 '메이저 클러스터'에서 변화)와 달리 변이의 혼재가 일어난 곳은 주로 적은 수의 세포로 구성된 클러스터('마이너 클러스터')에서 변화가 확인되었다.

따라서, 탐색된 배양적응 특이적 유전자들 중에서 유의한 발현 변화를 보인 유전자인 ID1, THY1, 및 DUSP6를 배양적응 미분화 만능줄기세포의 변화 상태를 평가할 수 있는 바이오마커 후보로 선정하였다.

5) 배양 적응 동안 ID1, THY1, 및 DUSP6의 발현 변화 확인

Pseudotime 분석을 통해 H9의 계대수 증가(P45, P75, 및 P85)에 따른 발현 변화 추이를 추적하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 계대수 75에서 ID1은 증가, THY1은 감소, DUSP6는 감소가 확인되었다. 계대수 85에서 ID1은 약간 증가, DUSP6와 THY1은 거의 변화가 없었다.

배양 적응시 후보 유전자들의 경우 발현 변화가 거의 없거나 줄어드는데, 이는 적응된 줄기 세포(adapted stem cell)을 의미한다. 위 결과를 토대로, H9의 배양적응 시, ID1의 발현증가는 줄기 세포의 분화를 억제시키고, DUSP6와 THY1 감소로 인한 EMT-연관 특성 및 종양 억제 기능에 영향을 주는 것으로 예상되었다.

6) ID1, DUSP6, THY1 발현변화에 대한 검증

단일 세포 수준 및 전체 세포 수준에서 세포주의 발현 변화를 하기 표 3에 나타내었다.

(FC: 변화 배수, L: 후기 계대, E: 초기 계대, EB: 배아체(embryoid body), SC: 단일 세포, WC: 전체 세포, SEQ: 서열분석)

표 3에 나타난 바와 같이, 단일 세포 수준에서 H9과 HPS0076의 초기 vs. 후기에서 ID1는 증가, THY1 감소, DUSP6 감소 패턴이 확인되었다. 유의미성과 함께 발현 변화 시, 대부분이 2-변화 배수 이내 범위에서 변화되었다. 전체 세포 수준에서 RNA-Seq과 RT-PCR로 검증했을 때, 발현 변화 패턴은 일치하였지만, 유의미성이 없는 범위에서 발현 변화 값을 나타내어 정량적 수준에서는 한계를 보였다. 따라서, 배양 적응처럼 이형화 또는 모자이시즘(mosaicism) 조건이 발생 시, 단일 세포 수준에서의 분석이 배양적응에서의 발현 변화 현상을 잘 감지해 낼 수 있는 것으로 판단되었다.

만일, 전체 세포 수준 또는 단일 세포 수준에서 분석 시, EB처럼 발현 변화 수준이 보일 경우 (줄기세포 후기 vs. EB, 또는 줄기세포 초기 vs. EB), 분화로 인해 미분화 만능줄기세포의 유전체 불안정성 가능성이 높다고 볼 수 있다.

<110> TheragenBio Co., Ltd. <120> Composition for monitoring a stem cell, kit and method for monitoring the stem cell using the same <130> PN124792KR <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying Oct4 <400> 1 ctgaagcaga agaggatcac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying Oct4 <400> 2 gaccacatcc ttctcgagcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying Sox2 <400> 3 gctgcaaaag agaacaccaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying Sox2 <400> 4 cttcctgcaa agctcctacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying Nanog <400> 5 ttcttgactg ggaccttgtc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying Nanog <400> 6 gcttgccttg ctttgaagca 20 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying Lin28 <400> 7 caccatgggc tccgtgtcca accagcag 28 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying Lin28 <400> 8 tcaattctgt gcctccggga gcagggtagg 30

Claims

ID1(inhibitor of DNA binding 1), THY1(THYmocyte differentiation antigen 1), 및 DUSP6(Dual specificity phosphatase 6) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기 세포를 모니터링하기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC), 또는 핵 치환 배아 줄기 세포(Somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell)인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 단일 세포인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 상기 줄기 세포의 유전체 불안정성(genomic instability), 배양 적응(culture adaption), 또는 이들의 조합을 모니터링하기 위한 것인 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 줄기 세포의 유전체 불안정성, 배양 적응, 또는 이들의 조합은 세포의 계대 배양에 의한 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는
상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머; 또는
상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 조성물.
ID1, THY1, 및 DUSP6 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 줄기 세포를 모니터링하기 위한 키트.
계대 배양을 수행한 줄기 세포에서 ID1, THY1, 및 DUSP6 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현 수준으로부터 상기 줄기 세포의 상태를 분석하는 단계를 포함하는 줄기 세포를 모니터링하는 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 줄기 세포의 유전체 불안정성, 배양 적응, 또는 이들의 조합을 모니터링하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 계대 배양 전의 줄기 세포 또는 배아체(embryoid body: EB)를 대조군으로 하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던(Northern) 블로팅, 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 역전사-PCR, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, ID1의 발현이 대조군에 비해 증가한 경우 상기 줄기 세포의 분화가 억제되고, ID1의 발현이 감소한 경우 배양 적응이 이루어진 것으로 판단하고,
THY1 및 DUSP6 의 발현이 대조군에 비해 증가한 경우 상기 세포의 유전체 불안정성, 배양 적응, 또는 이들의 조합이 발생할 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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