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KR102680060B1 - 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법 - Google Patents

바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법 Download PDF

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KR102680060B1
KR102680060B1 KR1020207032909A KR20207032909A KR102680060B1 KR 102680060 B1 KR102680060 B1 KR 102680060B1 KR 1020207032909 A KR1020207032909 A KR 1020207032909A KR 20207032909 A KR20207032909 A KR 20207032909A KR 102680060 B1 KR102680060 B1 KR 102680060B1
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랜들 에스. 프래더
케빈 디. 웰즈
크리스틴 엠. 위트워스
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더 큐레이터스 오브 더 유니버시티 오브 미주리
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Abstract

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법. 상기 방법은 암컷 돼지 동물을 수컷 돼지 동물과 브리딩시키는 것을 포함한다. 상기 암컷 돼지 동물은 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함하되, 상기 변형된 염색체 서열은 그것의 CD163 유전자의 대립 유전자에서 임의의 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 암컷 돼지 동물의 PRRSV 감염에 대한 감수성과 비교하여 PRRSV 감염에 대한 암컷 돼지 동물의 감수성을 감소시킨다. 상기 수컷 돼지 동물은 적어도 하나의 야생형 CD163 대립유전자를 포함한다.

Description

바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법
전자적으로 제출된 서열목록에 대한 참조
서열목록의 공식 사본은 2018년 3월 27일에 형성되고 그 크기가 175.5 킬로바이트인 "SEQ LISTING 18054WO" 명칭의 파일과 함께 ASCII-형식 서열목록으로 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고, 명세서와 함께 출원되어 있다. 상기 ASCII-형식 문서에 포함된 서열목록은 명세서의 일부이고, 전체적으로 참고로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)은 북미, 유럽 및 아시아에서 경제적으로 가장 중요한 돼지류 질환으로, 북미 생산자에게 연간 대략 6억 달러의 비용이 발생한다 (Holtkamp 등, 2013). 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 감염으로 인한 임상 질환 증후군은 1987년 미국에서 최초로 보고되었고 (Keffaber, 1989) 이후 1990년 유럽에서 보고되었다 (Wensvoort 등, 1991). PRRSV에 감염되면 기침과 발열을 포함한 호흡기 질환, 임신 후기 동안 생식 장애, 및 성장 능력 감소가 발생한다. 이 바이러스는 또한 평생 무증상 감염을 유지하면서 다양한 다균성 질환 증후군 상호작용에 관여한다 (Rowland 등, 2012). 손실은 어린 돼지의 호흡기 질환, 불량한 성장 능력, 생식 장애 및 자궁 감염의 결과이다 (Keffaber, 1989).
상기 질환 중 생식 형태는 유산, 태아 사망 및 신생아의 호흡기 질환으로 인한 손실의 45% 추정치를 차지한다. 가장 심각한 형태의 생식 PRRS는 어미 짐승의 사망률 증가와 더불어 태아/신생아의 90% 사망률을 야기할 수 있다. PRRS의 생식 형태는 임신한 어미 암퇘지 또는 114일의 임신 기간 중 약 90일째 되는 암퇘지의 감염 후 발생한다 (Christianson 등, 1993; Rowland, 2010). 모계 대식세포에서 복제의 초기 단계 후에 상기 바이러스는 태반을 통과하여 태아를 활동적으로 감염시키기 시작한다. 상기 바이러스는 초기에는 단지 적은 수의 태아만을 감염시킨 다음 태아에서 태아로 바이러스를 수평 전파시킨다 (Wilkinson 등, 2016). 상기 바이러스가 태반을 통과하는 정확한 기전은 알려져 있지 않지만, 앞서 락테이트 탈수소효소-증진 바이러스 (LDV)에 대해 설명된 감염된 "트로이 목마" 대식세포와 유사할 수 있다 (Cafruny, 1996). 성인 동물의 폐포 대식세포와 달리, 태아에서 PRRSV 복제의 원발 부위는 가슴샘이다 (Rowland, 2003). 돼지 태아는 임신 약 70일에 면역 능력이 생기기 때문에, PRRSV 감염은 기능적 B 및 T 세포가 포함된 태아 면역 환경에서 발생한다 (Rowland, 2003; Rowland, 2010).
자궁 감염에서 살아남은 돼지는 다운스트림 생산 단계에서 바이러스의 지속적인 공급원이 되어, 풍토병성으로 감염된 무리를 발생시킨다 (Rowland, 등, 2003). 가장 심각한 형태의 생식 질환은 비정형 PRRSV로 칭해지는 매우 독성이 강한 분리주 그룹과 관련이 있다 (Halbur 등, 1997; Mengeling 등, 1998). 흥미롭게도, 많은 비정형 PRRSV 분리주가 PRRS-백신접종된 농장에서 나왔다 (Key 등, 2001). 2006년에는 고병원성 PRRSV (HP-PRRSV)라고 하는 비정형 바이러스가 중국에 나타났으며, 그 나라의 돼지 개체군을 계속해서 대량으로 살상하고 있다 (Tian 등, 2007). 표준의 상업 사육 시설에는 약 5,000 마리의 암퇘지가 있기 때문에, 사망률이 높은 생식 PRRS가 발생하면 엄청난 영향을 미칠 수 있다. 돼지고기 생산 및 식량 안보의 지속 가능성을 보장하기 위해, 생식 PRRS 제어 솔루션이 우선순위로 남아 있다. 백신은 주로 바이러스의 구조 단백질 내의 유전적 다양성 때문에 질환을 통제할 수 없었다 (Shi 등, 2010). 실제로, 집중적인 생물보안 조치는 번식 무리를 보호하는 수단만을 제공한다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)는 쥣과 락테이트 탈수소효소-증진 바이러스, 유인원 출혈열 바이러스, 및 말 동맥염 바이러스와 함께 아테리바다에(Arterividae)과에 속한다. 구조적으로 아테리바이러스(arterivirus)는 토가바이러스(togavirus)를 닮았지만, 코로나바이러스(coronavirus)와 유사하며, 공통 리더 및 폴리-A 꼬리를 갖는 서브게놈 mRNA의 내재된 3'-공동-말단 세트를 통해 복제된다. 아테리바이러스는 대식세포에 대한 향성과 심각한 질환 및 지속적인 감염을 유발하는 능력을 포함하여 바이러스 발병과 관련된 중요한 특성을 공유한다 (Plagemann, 1996). 북미 바이러스와 유럽 바이러스 간의 분자 비교는 모든 PRRSV 분리주를 각각 2형 또는 1형의 두 유전자형 중 하나로 배치한다. 두 유전자형이 뉴클레오타이드 수준에서 단지 약 70%의 동일성을 보유하더라도 (Nelsen 등, 1999), 둘 다 CD163-양성 세포에 대한 향성을 공유하고, 장기 감염을 확립하고, 유사한 임상 징후를 생성한다.
CD163은 막관통 도메인 및 짧은 세포질 꼬리와 함께 9개의 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 (SRCR) 도메인과 2개의 스페이서 도메인으로 구성된 130 kDa의 1형 막 단백질이다 (Fabriek 등, 2005). 돼지 CD163은 펩타이드 신호 서열에 이어서 9개의 SRCR 도메인, 2개의 링커 도메인 (또한 일명 SRCR 6 및 SRCR 9 뒤에 위치한 프롤린 세린 트레오닌 (PST) 도메인), 및 세포질 도메인에 이어서 짧은 세포질 꼬리를 코딩하는 17개의 엑손을 함유한다. CD163의 표면 발현은 단핵구-대식세포 계통의 세포로 제한된다. 바이러스 수용체로 기능하는 것 외에도, CD163은 정상적인 항상성 유지와 관련된 몇 가지 중요한 기능을 나타낸다. 예를 들어, 감염 또는 조직 손상 후에, CD163은 스캐빈저 분자로 기능하여 혈액에서 합토글로빈-헤모글로빈 복합체를 제거한다 (Kristiansen 등, 2001). 그 결과 헴 분해 산물은 관련된 염증 반응을 조절한다 (Fabriek 등, 2005). HbHp 소거는 CD163의 주요 기능이며, SRCR 3에 위치한다 (Madsen 등, 2004). HbHp 분해 후 대식세포에 의해 방출된 대사물은 빌리루빈, CO, 및 유리 철을 포함한다. CD163의 중요한 기능 중 하나는 유리 헤모글로빈으로 인한 산화 독성 예방이다 (Kristiansen 등, 2001; Soares 등, 2009).
C163의 다른 중요한 기능으로는 적아세포 접착 (SRCR2), TWEAK (종양 괴사 인자-유사 약한 세포자멸사 유발제) 수용체 (SRCR1-4 및 6-9), 박테리아 수용체 (SRCR5), 및 아프리카 돼지류 바이러스 수용체로서의 기능이 포함된다 (Sanchez-Torres 등 2003). CD163은 또한 면역-조절제로서의 역할을 할 수 있다(Van Gorp 등 2010에서 논의됨).
CD163은 Calvert 등 (2007)에 의해 PRRSV에 대한 수용체로 처음 설명되었다. 유인원, 인간, 갯과 및 마우스를 포함한 다양한 종의 CD163 cDNA로 비-허용 세포주를 형질감염하면 세포가 PRRSV 감염을 허용할 수 있다 (Calvert 등, 2007). CD163 외에도 제2 수용체 단백질인 CD169 (시알로아드헤신 또는 SIGLEC1로도 알려져 있음)는 비리온 표면의 주요 단백질인 GP5-매트릭스 (M) 이종이량체와의 초기 상호작용을 형성하는데 관여하는 주요 PRRSV 수용체로 확인되었다 (Delputte 등, 2002). 이 모델에서, 엔도좀 구획 내 CD163과 GP2, 3, 4 헤테로트리머 사이의 후속적인 상호작용은 바이러스 게놈의 탈외피 및 세포질로의 방출을 매개한다 (Van Breedam 등, 2010, Allende 등, 1999). 폐포 대식세포의 PRRSV 감염을 설명하는 이전 모델에서는 SIGLEC1 (CD169)이 대식세포 표면의 일차 바이러스 수용체로 확인되었지만; SIGLEC1 -/- 돼지를 사용한 이전 연구에서는 야생형 돼지와 비교하여 바이러스 복제에 차이가 없는 것으로 나타났다 (Prather 등, 2013). 이러한 결과는 표면 CD169 및 CD163이 없는 PRRSV-내성 세포주가 CD163 플라스미드로 형질감염 후 바이러스 복제를 지원한다는 것을 보여주는 이전의 시험관내 연구를 뒷받침하였다 (Welch 등, 2010).
PRRSV 발병 기전 (특히 분자 수준에서) 및 동물유행병학 둘 모두의 많은 특성이 불충분하게 이해되고 있으며, 이로 인해 제어 노력을 어렵게 만든다. 현재, 생산자는 종종 PRRSV에 대해 변형된-생약독화 균주 또는 사멸된 바이러스 백신으로 돼지류에게 백신접종하지만, 현재의 백신은 종종 만족스러운 보호를 제공하지 못한다. 이것은 균주 변동과 면역계의 부적절한 자극 둘 모두 때문이다. 이용가능한 PRRSV 백신의 효능에 관한 우려 외에도, 돼지의 실험적 감염 후 독성 부위 분리주로 입증된 바와 같이 (Rowland 등, 1999), 현재 사용중인 변형 생백신이 개별 돼지 및 돼지류 무리에서 지속되고 돌연변이를 축적할 수 있다는 강력한 증거가 있다 (Mengeling 등 1999). 또한, 백신 바이러스가 백신접종된 수퇘지의 정액에서 배출되는 것으로 나타났다 (Christopher-Hennings 등, 1997). 백신접종의 대안으로 일부 전문가들은 사육중인 무리에서 "검사 및 제거" 전략을 옹호하고 있다 (Dee 등, 1998). 이 전략의 성공적인 사용은 PRRSV에 급성으로 또는 지속적으로 감염된 모든 돼지를 제거한 다음 바이러스의 재도입을 방지하기 위한 엄격한 통제에 달려있다. 이 전략과 관련된 어려움과 많은 비용은 지속적인 PRRSV 감염의 발병기전에 대해 알려진 것이 거의 없으므로 지속적으로 감염된 돼지를 식별하는 신뢰할 수 있는 기술이 없다는 것이다.
알 수 있는 바와 같이, 동물에서 PRRSV 내성을 유발하기 위한 전략의 개발이 당업계에 필요하다. 또한, 자궁에 있는 동안 PRRSV 감염으로부터 태아를 보호하고 모체에서 태아로의 PRRSV 전파를 방지하기 위한 기술이 특히 필요하다.
발명의 간략한 요약
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 암컷 돼지 동물을 수컷 돼지 동물과 브리딩(breeding)시키는 것을 포함한다. 상기 암컷 돼지 동물은 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함하되, 상기 변형된 염색체 서열은 그것의 CD163 유전자의 대립 유전자에서 임의의 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 암컷 돼지 동물의 PRRSV에 의한 감염에 대한 감수성과 비교하여 PRRSV 감염에 대한 암컷 돼지 동물의 감수성을 감소시킨다. 상기 수컷 돼지 동물은 적어도 하나의 야생형 CD163 대립유전자를 포함한다.
다른 목적 및 특징은 부분적으로 명백하고 이하에서 부분적으로 지적될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1. CD163을 변형시키는데 사용되는 표적화 벡터 및 CRISPR. 패널 A는 CRISPR을 사용한 변형을 위해 표적화된 CD163 유전자의 야생형 엑손 7, 8 및 9를 도시한다. 패널 B는 돼지 엑손 7 (CD163의 돼지 도메인 SRCR5)을 CD163L의 인간 SRCR8을 인코딩하는 DNA로 대체하도록 설계된 표적화 벡터를 보여준다. 이 표적화 벡터는 G418에 의한 약물 선택으로 형질감염에 사용되었다. 장범위, 왼쪽 아암 및 오른쪽 아암 검정을 위한 PCR 프라이머는 1230, 3752, 8791, 7765 및 7775에 대한 화살표로 표시된다. 패널 C는 패널 B에 표시된 것과 동일한 표적화 벡터를 나타내지만 Neo 카세트가 제거되었다. 이 표적화 벡터는 이미 네오마이신 내성이 있는 세포에서 CD163을 표적화하는데 사용되었다. 작은 결실 검정에 사용된 프라이머는 화살표로 표시되고 GCD163F 및 GCD163R로 라벨링된다. 패널 D는 CRISPR이 표적으로 하는 엑손을 강조한다. CRISPR 10, 131, 256 및 282의 위치는 엑손 7에서 아랫쪽을 향한 화살표로 표시된다. CRISPR 번호는 인트론 6과 엑손 7의 인트론-엑손 접합부에서 염기쌍의 수를 나타낸다.
도 2. CD1D를 변형시키는데 사용된 표적화 벡터 및 CRISPR. 패널 A는 CRISPR에 의한 변형을 위해 표적화된 CD1D 유전자의 야생형 엑손 3, 4, 5, 6 및 7을 도시한다. 패널 B는 엑손 3을 선별 마커 Neo로 대체하도록 설계된 표적화 벡터를 보여준다. 이 표적화 벡터는 CD1D를 변형시키기 위해 CRISPR과 조합하여 사용되었다. 장범위, 왼쪽 아암 및 오른쪽 아암 검정을 위한 PCR 프라이머는 3991, 4363, 7373 및 12806에 대한 화살표로 표시된다. 패널 C는 CRISPR이 표적으로 하는 엑손을 도시한다. CRISPR 4800, 5350, 5620 및 5626의 위치는 엑손 3에서 아랫쪽을 향한 화살표로 표시된다. 작은 결실 검정에 사용된 프라이머는 화살표로 표시되고 GCD1DF 및 GCD1DR로 라벨링된다.
도 3. CRISPR/Cas9 및 SCNT에 의한 CD163 및 CD1D 녹아웃 돼지의 생산. A) CRISPR/Cas9 및 공여체 DNA로 형질감염 후 체세포에서 CD163의 표적화된 결실. 야생형 (WT) 유전자형은 6545 염기쌍 (bp) 밴드를 초래한다. 레인 1-6은 Cas9 및 Neo를 함유하는 공여체 DNA와 함께 CRISPR 10을 사용한 단일 형질감염으로부터의 6개의 상이한 콜로니를 나타낸다. 레인 1, 4, 및 5는 1500-2000 bp의 큰 동형접합성 결실을 보여준다. 레인 2는 더 작은 동형접합성 결실을 나타낸다. 레인 3 및 6은 WT 대립유전자 및 작은 결실 또는 두 대립유전자의 이중 대립유전자 변형을 나타낸다. 각 콜로니의 정확한 변형은 SCNT에 사용된 콜로니에 대한 서열분석에 의해서만 결정되었다. 일부 레인에서의 희미한 WT 밴드는 인접한 WT 콜로니로부터의 태아 섬유모세포의 교차-오염을 나타낼 수 있다. NTC = 주형이 없는 대조군(no template control). B) CRISPR/Cas9 및 공여체 DNA로 형질감염 후 체세포에서 CD1D의 표적화된 결실. WT 유전자형은 8729 bp 밴드를 초래한다. 레인 1-4는 CD1D의 500-2000 bp 결실이 있는 콜로니를 나타낸다. 레인 4는 WT 콜로니로 보인다. NTC = 주형이 없는 대조군. C) 연구 동안 SCNT에 의해 생산된 CD163 녹아웃 돼지의 이미지. 이 수컷 새끼돼지는 CD163의 동형접합성 1506 bp 결실을 포함한다. D) 연구 동안 생산된 CD1D 돼지의 이미지. 이 새끼돼지는 CD1D의 1653 bp 결실을 포함한다. E) CD163의 1506 bp 결실을 포함하는 두 SCNT 한배새끼의 유전자형. 레인 1-3 (한배새끼 63) 및 레인 1-4 (한배새끼 64)는 각각의 한배새끼로부터의 각각의 새끼돼지에 대한 유전자형을 나타낸다. Sow는 SCNT 배아를 수령한 암컷을 나타내고 WT는 WT 대조군을 나타낸다. NTC = 주형이 없는 대조군. F) CD1D의 1653 bp 결실을 포함하는 두 SCNT 한배새끼의 유전자형. 레인 1-7 (한배새끼 158) 및 레인 1-4 (한배새끼 159)는 각각의 새끼돼지에 대한 유전자형을 나타낸다.
도 4. 돼지 배아에서 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) 상이한 농도의 CRISPR/Cas9 시스템을 접합체에 주입한 후 배반포 형성 빈도. CRISPR/Cas9 시스템의 독성은 10 ng/μl에서 가장 낮았다. B) CRISPR/Cas9 시스템은 접합체에 도입될 때 배반포에서 eGFP의 발현을 성공적으로 방해할 수 있다. 최초 배율 X4. C) CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 생성된 eGFP에서의 돌연변이 유형: WT 유전자형 (서열번호:16), #1 (서열번호:17), #2 (서열번호:18), 및 #3 (서열번호:19).
도 5. 돼지 배아에서 CD163을 표적화하는 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) CRISPR/Cas9 시스템에 의해 CD163에서 생성된 돌연변이의 예: WT 유전자형 (서열번호:20), #1-1 (서열번호:21), #1-4 (서열번호:22), 및 #2-2 (서열번호:23). DNA 서열분석으로 검사된 모든 배아는 CD163에서 돌연변이를 나타냈다 (18/18). CRISPR 131은 굵게 강조 표시된다. B) CRISPR/Cas9 시스템에 의한 동형접합성 결실의 서열분석 판독. 이미지는 CD163의 2bp 결실을 지닌 패널 A의 # 1-4를 나타낸다.
도 6. 두 가지 유형의 CRISPR을 도입했을 때 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) 접합체로서 CRISPR/ Cas9가 주입된 배반포에서 CD163의 PCR 증폭. 레인 1, 3, 6, 및 12는 두 가지 상이한 CRISPR 간의 설계된 결실을 보여준다. B) 접합체로서 CRISPR/Cas9가 주입된 배반포에서 CD1D의 PCR 증폭. CD1D는 CD163과 비교하여 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같이 더 낮은 결실 빈도를 나타냈으며 (3/23); 레인 1, 8, 및 15는 CD1D에서 명백한 결실을 보여준다. C) CRISPR/Cas9 시스템은 CD163 및 eGFP를 표적화하는 2개의 CRISPR이 시스템에 제공되었을 때 2개의 유전자를 성공적으로 표적화하였다. CD163 및 eGFP의 변형은 다음과 같이 표시된다: CD163 WT (서열번호:24), CD163 #1 (서열번호:25), CD163 #2 (서열번호:26), CD163 #3 (서열번호:27), eGFP WT (서열번호:28), eGFP #1-1 (서열번호:29), eGFP #1-2 (서열번호: 30), eGFP #2 (서열번호:31), 및 eGFP #3 (서열번호:32).
도 7. 접합체에 주입된 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 생성된 CD163 녹아웃 돼지. A) 녹아웃 돼지로부터 CD163의 PCR 증폭; 한배새끼 67-2 및 67-4에서 뚜렷한 결실 징후가 감지되었다. B) 대리모와 함께 CD163 녹아웃 돼지의 이미지. 모든 동물은 건강하며 이상 징후를 보이지 않는다. C) CD163 녹아웃 돼지의 유전자형. 야생형 (WT) 서열은 서열번호: 33으로 표시된다. 2마리의 동물 (한배새끼 67-1 (서열번호:34) 및 67-3 (서열번호:37)으로부터의 동물)은 CD163에서 동형접합성 결실 또는 삽입을 지니고 있다. 다른 2마리의 동물 (한배새끼 67-2 및 67-4로부터의 동물)은 CD163의 이중 대립유전자 변형: #67-2 A1 (서열번호:35), #67-2 A2 (서열번호:36), #67-4 A1 (서열번호:38), 및 #67-4 a2 (서열번호:39)을 지니고 있다. 결실은 Cas9 시스템에 2개의 상이한 CRISPR을 도입하여 발생하였다. CD163에 대한 접합체 주입으로부터 얻은 동물은 모자이크 유전자형을 나타내지 않았다.
도 8. 접합체에 주입된 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 생성된 CD1D 녹아웃 돼지. A) 녹아웃 돼지로부터 CD1D의 PCR 증폭; 166-1은 CD1D에 대한 모자이크 유전자형을 보여준다. 166-2, 166-3, 및 166-4는 앰플리콘에 대한 크기 변화를 보여주지 않지만, 앰플리콘의 서열분석에서는 변형을 나타냈다. WT FF = 야생형 태아 섬유모세포. B) 장범위 검정의 PCR 증폭은 새끼돼지 166-1 및 166-2에서 1개의 대립유전자의 명확한 결실을 보여주었다. C) 대리모와 함께 CD1D 녹아웃 돼지의 이미지. D) CD1D 녹아웃 돼지의 서열 데이터; WT (서열번호:40), #166-1.1 (서열번호: 41), #166-1.2 (서열번호:42), #166-2 (서열번호:43), #166-3.1 (서열번호:44), #166-3.2 (서열번호:45), 및 #166-4 (서열번호:46). 엑손 3의 atg 시작 코돈은 굵게 또한 소문자로 표시된다.
도 9. 급성 PRRSV 감염 동안의 임상 징후. CD163 +/+ (n=6) 및 CD163 -/- (n=3)에 대한 호흡기 징후의 존재 및 발열에 대한 매일 평가 결과.
도 10. 급성 PRRSV 감염 동안의 폐 조직병리. 야생형 및 녹아웃 돼지의 H 및 E 염색된 조직의 대표적인 현미경사진. 왼쪽 패널은 부종과 단핵 세포의 침윤을 보여준다. 녹아웃 돼지로부터의 오른쪽 패널은 정상 폐의 폐 구조를 보여준다.
도 11. 다양한 유전자형에서의 바이러스혈증. CD163-/-새끼돼지 데이터는 X 축을 따라 놓여 있음에 유의한다.
도 12. null, 야생형 및 특성규명되지 않은 대립유전자 돼지에서 항체 생산.
도 13. 개별 돼지에서 CD163의 세포 표면 발현. 특성규명되지 않은 A, 특성규명되지 않은 B, 및 CD163 +/+ 패널에서 오른쪽을 향하여 나타나는 선은 CD163 항체를 나타내는 반면, 이들 패널의 왼쪽을 향하여 나타나는 선은 항체가 없는 대조군 (배경)이다. CD163-/- 동물에서, CD163 염색은 배경 대조군과 겹치고, 특성규명되지 않은 대립유전자의 CD163 염색은 WT 수준과 배경 사이의 대략 절반 정도라는 점에 유의한다 (또한 이것은 로그 스케일이므로 ~ 10% 미만임에 유의한다).
도 14. 3마리의 대표 돼지 및 항체가 없는 대조군 (FITC 라벨링된 항-CD169)으로부터의 폐포 대식세포에 대한 CD169의 수준.
도 15. 다양한 유전자형에서의 바이러스혈증. Δ43 아미노산 새끼돼지 데이터는 X-축을 따라 놓여 있음에 유의한다.
도 16. 참조 서열로 사용되는 야생형 CD163 엑손 7-10의 게놈 서열 (서열번호: 47). 서열은 엑손 7의 업스트림에서 엑손 10의 마지막 염기까지 3000 bp를 포함한다. 밑줄친 영역은 각각 엑손 7, 8, 9, 및 10의 위치를 보여준다.
도 17. 돼지 폐포 대식세포 (PAM)에서 표면 CD163의 수준으로 측정된 바와 같은 몇 개의 CD163 염색체 변형, 각각의 변형에 대한 예상된 단백질 산물, 각각의 변형에 대한 상대적 대식세포 발현을 보여주는 CD163 변형 다이어그램. 검은색 영역은 인트론을 나타내고 흰색 영역은 엑손을 나타낸다. 빗금친 영역은 돼지 엑손 7의 동족체인 hCD163L1 엑손 11 모방체를 나타낸다. 회색 영역은 PGK Neo 작제물을 갖는 합성된 인트론을 나타낸다.
도 18. 돼지 CD163 단백질 및 유전자 서열의 다이어그램. A) CD163 단백질 SRCR (타원형) 및 PST (정사각형) 도메인과 상응하는 유전자 엑손. B) 돼지 CD163 SRCR 5 (서열번호: 120)와 인간 CD163L1 SRCR 8 (서열번호: 121) 동족체와의 비교.
도 19. 야생형 및 CD163-변형된 돼지의 PAM에서 CD163 및 CD169의 표면 발현에 대한 대표적인 결과. 패널 A-E는 도 17에 설명된 바와 같이 CD163 변형에 대한 결과를 보여준다. d7(1467) 및 d7(1280)에 대한 풀링된 데이터는 패널 D에 표시된다.
도 20. 야생형 및 CD163-변형된 돼지에서 혈청 합토글로빈 수준.
도 21. 2형 PRRSV 분리주에 의한 감염에 대한 야생형 및 HL11m PAM의 상대 허용성.
도 22. 1형 및 2형 PRRSV 분리주에 의한 CD163 변형된 돼지의 감염.
도 23. 2형 바이러스로 감염된 WT 및 CD163-변형된 돼지에 대한 바이러스 부하.
도 24. PRRSV에 의한 모체 감염 후 태아 결과. 왼쪽의 숫자는 각각의 암컷(dam)을 식별한다 ("암컷 번호"; 아래의 표 16 참고). 괄호 안의 각각의 암컷 번호 아래는 반응당 log10 주형으로 측정된 혈청에서 PRRS PCR 결과이다. "N"은 PRRSV 핵산에 대해 음성이다 (Ct> 39). 태아는 각각의 자궁각 내의 수와 상대적 위치로 식별된다. 별표는 복부 유체에서 얻은 태아 PCR 샘플을 식별한다. 각각의 태아 아래의 숫자는 태아 혈청의 PRRS PCR 결과이다 (반응당 log10 주형). 각 원 내의 숫자는 해부학적 병리의 존재를 나타낸다: 1) 정상 태아; 2) 작은 태아; 3) 박리된 태반 및/또는 괴사와 같은 태반 변화; 4) 태변 착색된 태아; 5) 태아 사망 및 괴사. 소문자는 개별 태아의 유전자형을 식별한다 (표 16 참고). 기호 풀이: a, A/A; b, C/A; c, B/A; d, E/A; e, B/C; f, B/D; g, D/C; h, D/D; i, E/C; j, E/D; ND 태아가 괴사했기 때문에 결정되지 않음; nd, 유전자형이 결정되지 않았음.
발명의 상세한 설명
본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법에 관한 것이다. CD163 유전자의 두 대립유전자 모두에 불활성화 돌연변이가 있는 돼지는 PRRSV 감염에 내성이 있다. CD163-양성 태아 (예를 들어, 1개 또는 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 가진 태아)는 암컷이 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 불활성화 돌연변이를 보유하는 한 자궁에 있는 동안 PRRSV 감염으로부터 보호될 수 있다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 따라서, 예를 들어, CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 불활성화 돌연변이를 갖는 암컷은 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 갖는 수컷과 교배될 수 있으며, 그 결과로 생성된 이형접합성 태아는 PRRSV 감염으로부터 보호될 것이다.
정의
본 발명의 요소 또는 이의 바람직한 구현예(들)를 도입할 때, 관사 "a", "an", "the" 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 있음을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "및/또는"은 항목 중 임의의 하나, 항목의 임의의 조합 또는 이 용어와 관련된 모든 항목을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "브리딩"은 수정이 일어나도록 수컷 및 암컷 배우자의 결합을 의미한다. 그와 같은 결합은 교배 (교미)에 의해 또는 시험관내 또는 생체내 인공 방법에 의해 발생할 수 있다. 그와 같은 인공 방법은, 비제한적으로, 인공 정액주입, 외과적 보조된 인공 정액주입, 시험관내 수정, 세포질내 정자 주입, 투명대 드릴링, 수정된 난모세포의 시험관내 배양, 난소 이식 및 난소 분할을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "브리딩"은 또한 수정된 난모세포를 암컷 동물의 생식관으로 옮기는 것을 포함한다.
용어들 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"은 포괄적인 것으로 의도되고 열거된 요소 이외의 추가 요소가 있을 수 있음을 의미한다.
용어 "CRISPR"은 "클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복"을 나타낸다. CRISPR 시스템은 I형, II형, 및 III형 CRISPR 시스템을 포함한다.
용어 "Cas"는 "CRISPR 관련된 단백질"을 지칭한다. Cas 단백질은 비제한적으로 Cas9 패밀리 일원 단백질, Cas6 패밀리 일원 단백질 (예를 들어, Csy4 및 Cas6), 및 Cas5 패밀리 일원 단백질을 포함한다.
용어 "Cas9"는 일반적으로 야생형 Cas9 폴리펩타이드 (예를 들어, S. 파이오 제네스(S. pyogenes )로부터의 Cas9)에 대한 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 예시적인 Cas9 서열은 미국 특허 공보 번호 2016/0046963의 서열번호 1-256 및 795-1346에 의해 제공된다. 미국 특허 공보 번호 2016/0046963의 서열번호 1-256 및 795-1346은 본원에 참고로 편입되어 있다. "Cas9"는 (예를 들어, S. 파이오제네스로부터의) 야생형 Cas9 폴리펩타이드에 대해 최대 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. "Cas9"는 아미노산 변화 예컨대 결실, 삽입, 치환, 변이체, 돌연변이, 융합, 키메라, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 Cas9 단백질의 야생형 또는 변형된 형태를 지칭할 수 있다.
용어 "Cas5"는 일반적으로 야생형 예시적인 Cas5 폴리펩타이드 (예를 들어, D. 불가리스(D. vulgaris )로부터의 Cas5)에 대해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 예시적인 Cas5 서열은 미국 특허 공보 번호 2016/0046963의 도 42에서 제공된다. 미국 특허 공보 번호 2016/0046963의 도 42는 본원에 참고로 편입되어 있다. "Cas5"는 일반적으로 야생형 Cas5 폴리펩타이드 (예를 들어, D. 불가리스로부터의 Cas5)에 대해 최대 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. "Cas5"는 아미노산 변화 예컨대 결실, 삽입, 치환, 변이체, 돌연변이, 융합, 키메라, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 Cas5 단백질의 야생형 또는 변형된 형태를 지칭할 수 있다.
용어 "Cas6"은 일반적으로 야생형 예시적인 Cas6 폴리펩타이드 (예를 들어, T . 써모필루스(T. thermophilus ) 로부터의 Cas6)에 대해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 예시적인 Cas6 서열은 미국 특허 공보 번호 2016/0046963의 도 41에 제공된다. 미국 특허 공보 번호 2016/0046963의 도 41은 편입된 본원에 참고로 편입되어 있다. "Cas6"은 야생형 Cas6 폴리펩타이드 (예를 들어, T. 써모필루스(T. thermophilus)로부터)에 대해 최대 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. "Cas6"은 아미노산 변화 예컨대 결실, 삽입, 치환, 변이체, 돌연변이, 융합, 키메라, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 Cas6 단백질의 야생형 또는 변형된 형태를 지칭할 수 있다.
용어들 "CRISPR/Cas9" 또는 "CRISPR/Cas9 시스템"은 Cas9 단백질, 또는 이의 유도체, 및 CRISPR RNA (crRNA)의 기능을 제공할 수 있는 하나 이상의 비-코딩 RNA 및 Cas9에 대한 트랜스-활성화 RNA (tracrRNA)를 포함하는 유전공학을 위한 프로그래밍가능한 뉴클레아제를 지칭한다. crRNA 및 tracrRNA는 개별적으로 사용될 수 있거나 "가이드 RNA" (gRNA)를 생산하기 위해 조합될 수 있다. crRNA 또는 gRNA는 게놈 표적에 대해 상보적인 서열을 제공한다.
본원에서 뉴클레오타이드 x에서 뉴클레오타이드 y까지의 뉴클레오타이드 서열의 결실에 대한 언급은 x 및 y를 포함하여 그 범위 내의 모든 뉴클레오타이드가 결실되었음을 의미한다. 따라서, 예를 들어, "서열 번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,137에서 뉴클레오타이드 3,147까지 11개의 염기쌍 결실"이라는 어구는 뉴클레오타이드 3,317 및 3,147을 포함하여 뉴클레오타이드 3,317 내지 3,147 각각이 결실되었음을 의미한다.
질환에 대한 동물의 "내성"은 동물의 특징이며, 여기서 동물은 돼지 동물과 PRRSV 사이의 상호작용과 같은 동물-병원체 상호작용의 결과인 질환 증상을 피한다. 즉, 병원체는 동물 질환 및 관련된 질환 증상이 유발되는 것을 예방하거나, 또는 대안적으로 임상 징후의 발생률 및/또는 중증도를 감소시키거나 임상 증상을 감소시킨다. 당해 분야의 숙련가는 본원에 개시된 방법이 병원체 공격으로부터 동물을 보호하기 위해 당업계에서 이용가능한 다른 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 편집", "유전적으로 편집된", "유전적으로 편집된" 및 "유전자 편집 효과기"는 일명 "분자 가위", "호밍 엔도뉴클레아제" 또는 "표적화 엔도뉴클레아제"로도 지칭되는 것으로, 자연 발생 또는 인공적으로 조작된 뉴클레아제에 의한 호밍 기술의 이용을 지칭한다. 뉴클레아제는 게놈의 원하는 위치에서 특이적 이중-가닥 염색체 절단 (DSB)을 생성하며, 일부 경우에 세포의 내인성 기전을 활용하여 상동 재조합 (HR) 및/또는 비상동성 말단-결합 (NHEJ)의 자연적 과정에 의해 유도된 절단을 복구한다. 유전자 편집 효과기로는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복 (CRISPR) 시스템 (예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템), 및 메가뉴클레아제 (예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제로 재-조작된 메가뉴클레아제)가 포함된다. 이 용어는 또한, 예를 들어, 변경이 결실 또는 비교적 작은 삽입 (전형적으로 20nt 미만)이고/이거나 외래 종으로부터 DNA를 도입하지 않는 경우를 포함하여 형질전환 절차 및 기술의 사용을 포함한다. 이 용어는 또한 초기 유전자 편집된 동물에서 성적 교배 또는 무성 브리딩에 의해 생성된 것과 같은 자손 동물을 포함한다.
용어들 "게놈 조작", "유전공학", "유전적으로 조작된", "유전적으로 변경된", "유전적 변경", "게놈 변형", "게놈 변형" 및 "게놈 변형된"은 특정 핵산 서열을 결실, 삽입, 돌연변이 또는 치환함으로써 게놈을 변경하는 것을 지칭할 수 있다. 변경은 유전자 또는 위치에 따라 다를 수 있다. 게놈 조작에서는 뉴클레아제를 사용하여 핵산을 절단하여 변경 부위를 생성할 수 있다. 비-게놈 핵산의 조작도 고려된다. 뉴클레아제 도메인을 함유하는 단백질은 핵산-표적화 핵산과 복합체를 형성함으로써 표적 핵산에 결합하여 이를 절단할 수 있다. 일 예에서, 절단은 표적 핵산에 이중가닥 절단을 도입할 수 있다. 핵산은 예를 들어 내인성 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 기구에 의해 복구될 수 있다. 추가 예에서, 핵산 조각을 삽입할 수 있다. 핵산-표적화 핵산 및 부위 지향적 폴리펩타이드의 변형은 게놈 조작에 사용되는 새로운 기능을 도입할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "호밍 DNA 기술", "호밍 기술" 및 "호밍 엔도뉴클레아제"는 특정 분자가 아연 핑거 (ZF) 단백질, 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 메가뉴클레아제 및 CRISPR 시스템 (예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템)을 포함하는 특정 DNA 서열로 표적화되도록 하는 임의의 기전을 포함한다..
본원의 용어들 "증가된 내성" 및 "감소된 감수성"은, 비제한적으로, 병원체에 의한 감염과 관련된 임상 징후 또는 임상 증상의 발생률 및/또는 중증도의 통계적으로 유의미한 감소를 의미한다. 예를 들어, "증가된 내성" 또는 "감소된 감수성"은 비변형된 염색체 서열을 갖는 대조군 동물과 비교하여 CD163 유전자 단백질에서 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물에서 PRRSV에 의한 감염과 관련된 임상 징후 또는 임상 증상의 발생률 및/또는 중증도의 통계적으로 유의미한 감소를 지칭할 수 있다. 용어 "임상 증상의 통계적으로 유의미한 감소"는, 비제한적으로, 변형된 대상체 그룹에서 적어도 하나의 임상 증상의 발생 빈도가 감염원으로 챌린지(challenge) 후 비-변형된 대조군 그룹보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 70% 더 낮음을 의미한다.
"넉아웃"은 유전자의 구조 또는 조절 기전의 파괴를 의미한다. 넉아웃은 표적화 벡터, 대체 벡터 또는 히트-앤드-런(hit-and-run) 벡터의 상동 재조합 또는 유전자 트랩 벡터의 랜덤 삽입을 통해 생성되어 유전자 기능의 완전한, 부분적인 또는 조건적 손실을 초래할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 야생형 서열과 비교하여 예를 들어 유전자 또는 코딩 DNA 서열 (CDS)과 같은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열에서의 변경을 포함한다. 이 용어는, 비제한적으로, 치환, 삽입, 프레임 이동, 결실, 역전, 전좌, 복제, 스플라이스-공여체 부위 돌연변이, 점-돌연변이 및 기타 동종의 것을 포함한다.
본원에서, "임상 징후의 발생률 및/또는 중증도의 감소" 또는 "임상 증상의 감소"는, 비제한적으로, 야생형 감염과 비교하여, 그룹 내 감염된 대상체의 수 감소, 감염의 임상 징후를 나타내는 대상체의 수 감소 또는 제거, 또는 하나 이상의 대상체에게 존재하는 임의의 임상 징후의 중증도 감소를 의미한다. 예를 들어, 이들 용어들은 감염, 폐 병리, 바이러스혈증, 항체 생산, 병원체 부하 감소, 병원체 쉐딩, 병원체 전파 감소, 또는 PRRSV의 임의의 임상 징후 증상 감소로 이루어진 임의의 임상 징후를 포함한다. 바람직하게는 이들 임상 징후는 CD163 유전자에 변형이 없고 감염된 대상체와 비교하여 본 발명의 하나 이상의 동물에서 적어도 10% 감소된다. 더 바람직하게는 임상 징후는 본 발명의 대상체에서 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 40%, 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 50% 감소된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복 도메인은 TALE와 그것의 동족 표적 DNA 서열의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위" (또한 일명 "반복")는 전형적으로 길이가 33-35개 아미노산이고, 자연 발생 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 아연 핑거 및 TALE 결합 도메인은, 예를 들어 자연 발생 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 사전결정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 DNA 결합 단백질 (아연 핑거 또는 TALE)은 비-자연 발생 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하는 방법의 비-제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 설계/구성이 주로 합리적인 기준에서 비롯된 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 합리적인 설계 기준으로는 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계의 정보와 바인딩 데이터를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261을 참고하며; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개 번호 20110301073을 참고한다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 구조가 아연 이온의 배위를 통해 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
"선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 자연에서 발견되지 않는 단백질로서, 그의 생산이 파아지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 경험적 과정에서 주로 발생된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,789,538; 미국 특허 번호 5,925,523; 미국 특허 번호 6,007,988; 미국 특허 번호 6,013,453; 미국 특허 번호 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084 및 미국 공개 번호 20110301073을 참고한다.
다양한 다른 용어들은 아래에 정의된다.
PRRSV 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법은 제공된다. 상기 방법은 암컷 돼지 동물을 수컷 돼지 동물과 브리딩시키는 것을 포함한다. 암컷 돼지 동물은 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함하되, 상기 변형된 염색체 서열은 그것의 CD163 유전자의 대립 유전자에서 임의의 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 암컷 돼지 동물의 PRRSV에 의한 감염에 대한 감수성과 비교하여 PRRSV 감염에 대한 암컷 돼지 동물의 감수성을 감소시킨다. 상기 수컷 돼지 동물은 적어도 하나의 야생형 CD163 대립유전자를 포함한다.
본원에 기재된 방법에서, 변형된 염색체 서열은, PRRSV 감염과 관련된 CD163 단백질 기능이 손상되거나, 감소되거나, 또는 제거되도록 변경된 서열일 수 있다. 따라서, 본원에서 기재된 방법에서 사용된 암컷 돼지 동물은 "넉아웃(knock-out)" 동물로 칭할 수 있다.
수컷 돼지 동물은 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "야생형 CD163 대립유전자"는, CD163 대립유전자의 서열이 자연에서 발견되는 서열이거나, 또는 CD163 대립유전자의 서열이 CD163 활성을 실질적으로 손상시키지 않는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 삽입, 결실, 또는 치환)을 함유하는 것을 의미한다. 따라서, 야생형 CD163 대립유전자는, 다형성 또는 돌연변이가 CD163 활성을 실질적으로 손상시키지 않는 한 다형성 및/또는 돌연변이를 함유할 수 있다.
본원에서 기재된 방법을 사용하여, 태아는 다양한 1형 및 2형 PRRSV 단리물을 포함하는 1형 및 2형 PRRSV 바이러스 둘 모두로부터 보호될 것이다.
따라서, 본원에서 기재된 방법에서, 변형된 염색체 서열은 c1형 PRRSV 바이러스, 2형 PRRSV에 대한, 또는 1형 및 2형 PRRSV 바이러스 둘 모두에 대한 상기 암컷 돼지 동물의 감수성을 감소시킨다.
변형된 염색체 서열은 NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, 렐리스타드, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 PRRSV 단리물에 대한 상기 암컷 돼지 동물의 감수성을 감소시킬 수 있다.
암컷 돼지 동물은 유전적으로 편집된 암컷 돼지 동물을 포함할 수 있다.
유전적으로 편집된 암컷 돼지 동물은 호밍 엔도뉴클레아제를 사용하여 편집된 동물일 수 있다. 호밍 엔도뉴클레아제는 자연 발생 엔도뉴클레아제일 수 있지만, 바람직하게는 CD163 단백질인 인코딩하는 유전자에서 염색체 서열을 표적으로 하도록 설계된 DNA 인식 서열을 갖는 합리적으로 설계된, 비-자연 발생 호밍 엔도뉴클레아제이다.
따라서, 호밍 엔도뉴클레아제는 설계된 호밍 엔도뉴클레아제일 수 있다. 호밍 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 클러스터링된 규칙적 공간사이 짧은 회문성 반복 (CRISPR) 시스템, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 재조합효소 융합 단백질, 메가뉴클레아제, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
호밍 뉴클레아제는 바람직하게는 CRISPR 시스템을 포함한다. 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 암컷 돼지 동물을 만드는데 사용될 수 있는 CRISPR 시스템의 예는, 비제한적으로 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas5, 및 CRISPR/Cas6을 포함한다. 유전적으로 편집된 동물을 생성하기 위한 CRISPR 시스템의 사용은 아래에서 추가로 논의된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 대립 유전다 둘 모두에서 동일한 변형된 염색체 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 제1 대립유전자에서 제1 변형된 염색체 서열 및 CD163 유전자의 제2 대립유전자에서 제2 변형된 염색체 서열을 포함할 수 있되, 상기 제1 및 제2 변형된 염색체 서열은 서로 상이하다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 각각의 대립유전자는 삽입, 결실, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 적어도 하나의 대립유전자는 결실을 포함할 수 있다.
적어도 하나의 CD163 유전자의 대립유전자는 인-프레임 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 적어도 하나의 대립유전자는 삽입을 포함할 수 있다.
본원에서 기재된 방법에서, 변형된 염색체 서열은 바람직하게는, 변형된 염색체 서열이 없는 암컷 돼지 동물에서의 CD163 단백질 생산 또는 활성과 비교하여 CD163 단백질 생산 또는 활성이 감소되도록 한다.
바람직하게는, 변형된 염색체 서열은 상기 암컷 돼지 동물에 의해 기능성 CD163 단백질을 실질적으로 생산하지 않는다. "실질적으로 기능성 CD163 단백질 없음"이란, 동물, 자손, 또는 세포에서 CD163 단백질의 수준이 검출불가능하거나, 또는 검출가능하다면, 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 동물, 자손, 또는 세포에서 관측된 수준 보다 적어도 약 90% 미만, 바람직하게는 적어도 약 95% 미만, 더 바람직하게는 적어도 약 98% 미만, 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 99% 미만인 것을 의미한다.
예를 들어, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 암컷 돼지 동물은 CD163 단백질을 생산하지 않는다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 각각의 대립유전자는 엑손 7에서의 변형, 엑손 8에서의 변형, 엑손 7 또는 엑손 8과 인접한 인트론에서의 변형, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자는 CD163 유전자의 엑손 7에서의 변형을 포함할 수 있다.
엑손 7에서의 변형은 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자가 결실을 포함하는 본원에서 기재된 방법 중 임의의 것에서, 상기 결실은 인-프레임 결실을 포함할 수 있다.
엑손 7에서의 변형은 삽입을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자에서의 변형된 염색체 서열은 미스코딩을 초래할 수 있다.
변형된 염색체 서열이 CD163 유전자의 대립유전자에서 미스코딩을 초래하는 경우, 상기 미스코딩은 CD163 유전자의 대립유전자에서의 미스코딩의 미성숙 정지 코돈 다운스트림을 초래할 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 포함한다: 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,137에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 11개의 염기쌍 결실; 동일한 대립유전자 상의 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,573에서 뉴클레오타이드 2,949까지의 377개의 염기쌍 결실과 함께, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,024에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 124개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,024에서 뉴클레오타이드 3,146까지의 123개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,147과 3,148 사이의 1개의 염기쌍 삽입; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,030에서 뉴클레오타이드 3,159까지의 130개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,030에서 뉴클레오타이드 3,161까지의 132개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 1,525에서 뉴클레오타이드 3,030까지의 1506개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍 삽입; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,818에서 뉴클레오타이드 4,097까지의 1280개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,724에서 뉴클레오타이드 4,096까지의 1373개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,431에서 뉴클레오타이드 3,897까지의 1467개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 488에서 뉴클레오타이드 2,417까지의 1930개의 염기쌍 결실로서, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 488에서 시작하는 12개의 염기쌍 삽입으로 대체되고, 그리고 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,044에서 뉴클레오타이드 3,172까지 엑손 7에서 추가의 129개의 염기쌍 결실이 있는, 상기 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,145에서 뉴클레오타이드 3,172까지의 28개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,145에서 뉴클레오타이드 4,531까지의 1387개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,113에서 뉴클레오타이드 4,494까지의 1382개의 염기쌍 결실로서, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 3,113에서 시작하는 11개의 염기쌍 삽입으로 대체되는, 상기 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,440에서 뉴클레오타이드 4,160까지의 1720개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,015에서 뉴클레오타이드 3,466까지의 452개의 염기쌍 결실; 및 이들의 임의 조합.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,137에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 11개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 동일한 대립유전자 상의 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,573에서 뉴클레오타이드 2,949까지의 377개의 염기쌍 결실과 함께, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입을 포함할 수 있다.
변형이 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입을, 동일한 대립유전자 상의 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,573에서 뉴클레오타이드 2,949까지의 377개의 염기쌍 결실과 함께 포함하는 경우, 그리고 상기 2개의 염기쌍 삽입은 디뉴클레오타이드 AG를 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,024에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 124개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,024에서 뉴클레오타이드 3,146까지의 123개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,147과 3,148 사이의 1개의 염기쌍 삽입을 포함할 수 있다.
상기 변형이 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,147과 3,148 사이의 1개의 염기쌍 삽입을 포함하는 경우, 상기 1개의 염기쌍 삽입은 단일 아데닌 잔기를 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,030에서 뉴클레오타이드 3,159까지의 130개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,030에서 뉴클레오타이드 3,161까지의 132개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 1,525에서 뉴클레오타이드 3,030까지의 1506개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍 삽입을 포함할 수 있다.
상기 변형이 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍 삽입을 포함하는 경우, 7개의 염기쌍 삽입은 서열 TACTACT (서열번호: 115)을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,818에서 뉴클레오타이드 4,097까지의 1280개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,724에서 뉴클레오타이드 4,096까지의 1373개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,431에서 뉴클레오타이드 3,897까지의 1467개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 488에서 뉴클레오타이드 2,417까지의 1930개의 염기쌍 결실을 포함하되, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 488에서 시작하는 12개의 염기쌍 삽입으로 대체되고, 그리고 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,044에서 뉴클레오타이드 3,172까지 엑손 7에서의 추가의 129개의 염기쌍 결실이 있다.
상기 변형이 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 488에서 뉴클레오타이드 2,417까지의 1930개의 염기쌍 결실을 포함하는 경우, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 488에서 시작하는 12개의 염기쌍 삽입으로 대체되고, 그리고 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,044에서 뉴클레오타이드 3,172까지 엑손 7에서의 추가의 129개의 염기쌍 결실이 있고, 상기 12개의 염기쌍 삽입은 서열 TGTGGAGAATTC (서열번호: 116)를 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,145에서 뉴클레오타이드 3,172까지의 28개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,145에서 뉴클레오타이드 4,531까지의 1387개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,113에서 뉴클레오타이드 4,494까지의 1382개의 염기쌍 결실로서, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 3,113에서 시작하는 11개의 염기쌍 삽입으로 대체되는, 상기 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
변형이 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,113에서 뉴클레오타이드 4,494까지의 1382개의 염기쌍 결실을 포함하는 경우, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 3,113에서 시작하는 11개의 염기쌍 삽입으로 대체되고, 11개의 염기쌍 삽입은 서열 AGCCAGCGTGC (서열번호: 117)을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,440에서 뉴클레오타이드 4,160까지의 1720개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,015에서 뉴클레오타이드 3,466까지의 452개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
예를 들어, 암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 포함한다: 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍 삽입; 동일한 대립유전자 상의 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,573에서 뉴클레오타이드 2,949까지의 377개의 염기쌍 결실과 함께, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,137에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 11개의 염기쌍 결실; 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,113에서 뉴클레오타이드 4,494까지의 1382개의 염기쌍 결실로서, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 3,113에서 시작하는 11개의 염기쌍 삽입으로 대체되는, 상기 염기쌍 결실; 및 이들의 임의 조합.
암컷 돼지 동물에서 CD163 유전자는 본원에 기재된 변형된 염색체 서열의 임의의 조합을 포할 수 있다.
예를 들어, 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍 삽입; 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,573에서 뉴클레오타이드 2,949까지의 377개의 염기쌍 결실과 함께, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,113에서 뉴클레오타이드 4,494까지의 1382개의 염기쌍 결실로서, 상기 결실된 서열은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 뉴클레오타이드 3,113에서 시작하는 11개의 염기쌍 삽입으로 대체되는, 상기 염기쌍 결실; 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,573에서 뉴클레오타이드 2,949까지의 377개의 염기쌍 결실과 함께, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍 삽입; 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,137에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 11개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,113에서 뉴클레오타이드 4,494까지의 1382개의 염기쌍 결실로서, 상기 결실된 서열은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 뉴클레오타이드 3,113에서 시작하는 11개의 염기쌍 삽입으로 대체되는, 상기 염기쌍 결실; 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,137에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 11개의 염기쌍 결실을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 100% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자에서 서열번호: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 또는 119를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자에서 서열번호: 99, 102, 103, 또는 113을 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자는 서열번호: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 또는 119를 포함하는 염색체 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 또는 119 중 임의의 하나를 포함하는 염색체 서열 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 또는 119 중 임의의 하나를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 99를 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 103를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 113을 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 99를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 99를 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 102를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 113을 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 102를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 브리딩은 CD163 유전자의 단일 대립유전자에서 변형된 염색체 서열을 포함하는 하나 이상의 태아를 생산할 것이다. 본원에서 기재된 방법에서 사용된 암컷 돼지 동물이 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함하기 때문에, 암컷 돼지 동물을 적어도 하나의 야생형 CD163 대립유전자를 포함하는 수컷 돼지 동물과 브리딩시키는 것은 암컷 돼지 동물로부터의 변형된 염색체 서열을 포함하는 CD163 대립유전자 및 수컷 돼지 동물로부터의 야생형 CD163 대립유전자를 물려받은 태아를 생산할 것이다. 따라서, 브리딩은 변형된 CD163 염색체 서열에 대해 이종접합성인 태아를 생산할 것이다. 수컷 동물이 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 포함하는 경우, 브리딩의 결과로서 생산된 모든 태아는 변형된 CD163 염색체 서열에 대해 이종접합이 될 것이다.
브리딩에 의해 생산된 태아는 야생형 암컷 돼지 동물에서의 자궁내 태아와 비교하여, 자궁 내에 있는 동안 PRRSV 감염에 대한 감수성을 감소시킬 것이다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 브리딩은 암컷 돼지 동물을 수컷 돼지 동물과 교배(교미)시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 브리딩은 수컷 동물로부터 얻은 정자로 상기 암컷 동물에게 인공 정자주입하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 브리딩은 수정된 난모세포를 상기 암컷 돼지 동물의 생식관으로 옮기는 것을 포함할 수 있다.
브리딩이 수정된 난모세포를 상기 암컷 돼지 동물의 생식관으로 옮기는 것을 포함하는 방법에서, 수정된 난모세포는 수컷 돼지 동물로부터 얻은 정자로 난모세포의 시험관내 수정에 의해 생성될 수 있다.
시험관내 수정은 수컷 돼지 동물로부터 얻은 정자를 난모세포의 세포질내에 주사하는 것을 포함할 수 있다.
브리딩이 수정된 난모세포를 상기 암컷 돼지 동물의 생식관으로 옮기는 것을 포함하는 경우, 난모세포는 돼지 암컷 동물로부터 유래된 난모세포일 수 있어서, 상기 난모세포는 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함한다. 대안적으로, 난모세포는 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함하는 상이한 암컷 돼지 동물로부터 유래된 난모세포일 수 있되, 상기 변형된 염색체 서열은 그것의 CD163 유전자의 대립 유전자에서 임의의 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 암컷 돼지 동물의 PRRSV에 의한 감염에 대한 감수성과 비교하여 PRRSV에 의한 감염에 대한 동물의 감수성을 감소시킨다. 따라서, 예를 들어, CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두 (예를 들어, C163 유전자의 대립유전자 둘 모두의 녹아웃)에서 변형된 염색체 서열을 갖는 임의의 난모세포가 사용될 수 있다.
그러나, 브리딩이 수정된 난모세포를 상기 암컷 돼지 동물의 생식관으로 옮기는 것을 포함하는 경우에, 난모세포는 그것의 CD163 유전자의 대립 유전자에서 임의의 변형된 염색체 서열을 포함할 필요는 없다. 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 함유하는 난모세포가 사용될 수 있다. 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 함유하는 난모세포는 수컷 돼지 동물로부터 수득된 정자로 수정될 수 있되, 상기 정자는 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 함유하는 수정된 난모세포를 만들기 위해 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 포함한다. 그와 같은 수정된 난모세포 (2개의 야생형 CD163 대립유전자 포함)가 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함하는 암컷 돼지 동물의 생식관으로 ?グ保嗤?, 생성된 태아는 PRRSV 감염으로부터 보호될 것이다.
대안적으로, 브리딩이 수정된 난모세포를 상기 암컷 돼지 동물의 생식관으로 옮기는 것을 포함하는 경우, 수정된 난모세포는 그것의 CD163 유전자의 단일 대립유전자에서 변형된 염색체 서열을 포함할 수 있다. 그와 같은 수정된 난모세포는 또한, 수정된 난모세포를, 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함하는 암컷 돼지 동물의 생식관으로 ?ケ? 때 PRRSV 감염으로부터 보호되는 태아를 생산할 것이다.
따라서, 브리딩이 수정된 난모세포를 상기 암컷 돼지 동물의 생식관으로 옮기는 것을 포함하는 경우, 수정된 난모세포는 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열 (예를 들어, 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두의 녹아웃)은 그것의 CD163 유전자의 단 하나의 대립유전자에서 변형된 염색체 서열을 포함할 수 있거나, 또는 야생형 CD163 대립유전자만을 포함할 수 있다.
친화도 태그
"친화도 태그"는 펩타이드 친화도 태그 또는 핵산 친화도 태그일 수 있다. 용어 "친화도 태그"는 일반적으로 분자에 의해 결합될 수 있는 (예를 들어, 소분자, 단백질, 또는 공유결합에 의해 결합될 수 있는) 단백질 또는 핵산 서열을 지칭한다. 친화도 태그는 비-천연 서열일 수 있다. 펩타이드 친화도 태그는 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드 친화도 태그는 분할 시스템의 일부일 수 있는 것일 수 있다 (예를 들어, 2개의 불활성 펩타이드 단편은 트랜스에서 함께 결합하여 활성 친화도 태그를 형성할 수 있다). 핵산 친화도 태그는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산 친화도 태그는 (예를 들어 혼성화를 통해) 알려진 핵산 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 서열일 수 있다. 핵산 친화도 태그는 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 서열일 수 있다. 친화도 태그는 천연 단백질에 융합될 수 있다. 친화도 태그는 뉴클레오타이드 서열에 융합될 수 있다.
때때로, 1, 2, 또는 복수의 친화도 태그는 천연 단백질 또는 뉴클레오타이드 서열에 융합될 수 있다. 친화도 태그는 시험관내 또는 생체내 전사의 방법을 사용하여 핵산-표적화 핵산에 도입될 수 있다. 핵산 친화도 태그는, 예를 들어, 화학 태그, RNA-결합 단백질 결합 서열, DNA-결합 단백질 결합 서열, 친화도-태깅된 폴리뉴클레오타이드에 혼성화가능한 서열, 합성 RNA 압타머, 또는 합성 DNA 압타머를 포함할 수 있다. 화학 핵산 친화도 태그의 예는, 비제한적으로, 바이오틴, 형광 염료, 및 디곡세기닌을 함유하는 리보-뉴클레오트리포스페이트를 포함할 수 있다. 단백질-결합 핵산 친화도 태그의 예는, 비제한적으로, MS2 결합 서열, U1A 결합 서열, 스템-루프 결합 단백질 서열, boxB 서열, eIF4A 서열, 또는 RNA 결합 단백질에 의해 인식된 임의의 서열을 포함할 수 있다. 핵산 친화도-태깅된 올리고뉴클레오타이드의 예는, 비제한적으로, 바이오티닐화된 올리고뉴클레오타이드, 2, 4-디니트로페닐 올리고뉴클레오타이드, 플루오레세인 올리고뉴클레오타이드, 및 일차 아민-접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
핵산 친화도 태그는 RNA 압타머일 수 있다. 압타머는, 테오필린, 스트렙타비딘, 덱스트란 B512, 아데노신, 구아노신, 구아닌/잔틴, 7-메틸-GTP, 아미노산 압타머 예컨대 아르기닌, 시트룰린, 발린, 트립토판, 시아노코발라민, N-메틸메소포르피린 IX, 플라빈에 결합하는 압타머, NAD에 결합하는 압타머, 및 항생제 압타머 예컨대 토브라마이신, 네오마이신, 리비도마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 비오마이신, 및 클로르암페니콜에 결합하는 압타머.
핵산 친화도 태그는 부위 지향적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 부위 지향적 폴리펩타이드는 조건적으로 효소적으로 불활성일 수 있다. RNA 서열은 멤버 of I형, II형, 및/또는 III형 CRISPR 시스템의 멈베에 의해 결합될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. RNA 서열은 램프 패밀리 일원 단백질. RNA 서열은 Cas9 패밀리 일원 단백질, Cas6 패밀리 일원 단백질 (예를 들어, Csy4, Cas6)에 의해 결합될 수 있다. RNA 서열은 Cas5 패밀리 일원 단백질 (예를 들어, Cas5)에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, Csy4는 고친화도 (Kd ~50 pM)로 특정 RNA 헤어핀 서열에 결합할 수 있고 헤어핀의 부위 3'에서 RNA를 절단할 수 있다.
핵산 친화도 태그는 부위 지향적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 부위 지향적 폴리펩타이드는 조건적으로 효소적으로 불활성. DNA 서열은 I형, II형 및/또는 III형 CRISPR 시스템의 멤버에 의해 결합될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. DNA 서열은 아르고너트(Argonaut) 단백질에 의해 결합될 수 있다. DNA 서열은 아연 핑거 도메인, TALE 도메인, 또는 임의의 다른 DNA-결합 도메인을 함유하는 단백질에 의해 결합될 수 있다.
핵산 친화도 태그는 리보자임 서열을 포함할 수 있다. 적합한 리보자임은 펩티딜 전달효소 23 SrRNA, RnaseP, 그룹 I 인트론, 그룹 II 인트론, GIR1 분지화 리보자임, 리드자임, 헤어핀 리보자임, 헤머헤드 리보자임, HDV 리보자임, CPEB3 리보자임, VS 리보자임, glmS 리보자임, CoTC 리보자임, 및 합성 리보자임을 포함할 수 있다.
펩타이드 친화도 태그는 추적 또는 정제를 위해 사용될 수 있는 태그 (예를 들어, 형광 단백질 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato; His 태그, (예를 들어, 6XHis 태그); 혈구응집소 (HA) 태그; FLAG 태그; Myc 태그; GST 태그; MBP 태그; 키틴 결합 단백질 태그; 칼모듈린 태그; V5 태그; 스트렙타비딘 결합 태그; 등)을 포함할 수 있다.
핵산 및 펩타이드 친화도 태그 둘 모두는 소분자 태그 예컨대 바이오틴, 또는 디지톡신, 및 형광 표지 태그, 예컨대, 플루오로세인, 로다민, 알렉사 플루오르 염료(Alexa fluor dye), 시아닌3 염료, 시아닌5 염료를 포함할 수 있다.
핵산 친화도 태그는 핵산 (예를 들어, 핵산- 표적화 핵산)의 5'에 위치할 수 있다. 핵산 친화도 태그는 핵산의 3'에 위치할 수 있다. 핵산 친화도 태그는 핵산의 5' 및 3'에 위치할 수 있다. 핵산 친화도 태그는 핵산 내에 위치할 수 있다. 펩타이드 친화도 태그는 폴리펩타이드 서열의 N-말단에 위치할 수 있다. 펩타이드 친화도 태그는 폴리펩타이드 서열의 C-말단에 위치할 수 있다. 펩타이드 친화도 태그는 폴리펩타이드 서열의 N-말단 및 C-말단에 위치할 수 있다. 복수의 친화도 태그는 핵산 및/또는 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
포획제
본원에서 사용된 바와 같이, "포획제"는 일반적으로 폴리펩타이드 및/또는 핵산을 정제할 수 있는 제제를 지칭한다. 포획제는 생물학적 활성 분자 또는 물질일 수 있다 (예를 들어 자연에서 또는 합성으로 발견되는 임의의 생물학적 물질, 그리고 세포, 바이러스, 세포하 입자, 항체, 면역글로불린, 항원, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 복합체, (스트렙트)아비딘-바이오틴 복합체, 리간드, 수용체, 또는 소분자를 더 구체적으로는 포함하는 단백질, 압타머, 핵산, DNA, RNA, 펩타이드 핵산, 올리고당, 다당류, 리포폴리사카라이드, 세포 대사물, 합텐, 약리적으로 활성 서브스턴스, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 및 당류를 비제한적으로 포함한다). 일부 구현예에서, 포획제는 친화도 태그를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포획제는 관심 표적 폴리펩타이드 또는 핵산에 우선적으로 결합할 수 있다. 포획제는 혼합물에서 자유롭게 부유할 수 있다. 포획제는 입자 (예를 들어 비드, 마이크로비드, 나노입자)에 결합될 수 있다. 포획제는 고체 또는 반고체 표면에 결합될 수 있다. 일부 사례에서, 포획제는 표적에 비가역적으로 결합된다. 다른 사례에서, 포획제는 (예를 들어, 표적이 화학물질 예컨대 이미다졸의 사용에 의해 용출된다면) 표적에 가역적으로 결합된다.
DNA-결합 폴리펩타이드
부위-특이적인 통합은, 예를 들어, 숙주 유기체의 게놈에서 특정 뉴클레오타이드 서열을 인식하고 이에 결합할 수 있는 인자를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 많은 단백질은 부위-특이적 방식으로 DNA를 인식하고 이에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 도메인을 포함한다. DNA-결합 폴리펩타이드에 의해 인식된 DNA 서열은 "표적" 서열로 칭해질 수 있다. 부위-특이적 방식으로 DNA를 인식하고 이에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 도메인은 일반적으로 정확하게 폴딩되고 독립적으로 기능하여 도메인이 본래 단리된 단백질이 아닌 다른 폴리펩타이드에서 발현되는 경우에도 부위-특이적 방식으로 DNA에 결합한다. 유사하게, DNA-결합 폴리펩타이드에 의한 인식 및 결합을 위한 표적 서열은 일반적으로 큰 DNA 구조 (예를 들어, 염색체)에 존재하는 경우에도, 특히 표적 서열이 위치한 부위가 가용성 세포 단백질에 접근가능한 것으로 알려진 부위 (예를 들어, 유전자)인 경우에도 그와 같은 폴리펩타이드에 의해 인식되고 결합될 수 있다.
자연에 존재하는 단백질로부터 식별된 DNA-결합 폴리펩타이드는 전형적으로 별개의 뉴클레오타이드 서열 또는 모티프 (예를 들어, 공통 인식 서열)에 결합하지만, 상이한 뉴클레오타이드 서열 또는 모티프를 인식하기 위해 그와 같은 많은 DNA-결합 폴리펩타이드를 변형시키는 방법이 존재하고 당업계에 알려져 있다. DNA-결합 폴리펩타이드는, 예를 들어 및 비제한적으로: 아연 핑거 DNA-결합 도메인; 류신 지퍼; UPA DNA-결합 도메인; GAL4; TAL; LexA; Tet 억제인자; LacI; 및 스테로이드 호르몬 수용체를 포함한다.
예를 들어, DNA-결합 폴리펩타이드는 아연 핑거일 수 있다. 개별 아연 핑거 모티프는 임의의 광범위한 DNA 부위를 표적화하고 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있다. 정규 Cys2His2 (및 비-정규 Cys3His) 아연 핑거 폴리펩타이드는 α-나선을 표적 DNA 이중 나선의 주요 홈에 삽입하여 DNA와 결합한다. 아연 핑거에 의한 DNA의 인식은 모듈식이고; 각각의 핑거는 주로 표적에 있는 3개의 연속적인 염기쌍과 접촉하고, 폴리펩타이드 내 몇 개의 핵심 잔기가 인식을 매개한다. 표적화 엔도뉴클레아제에 다수의 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 포함함으로써, 표적화 엔도뉴클레아제의 DNA-결합 특이성이 더욱 증가될 수 있다 (따라서 이에 의해 부여되는 임의의 유전자 조절 효과의 특이성이 또한 증가될 수 있다). 예를 들어, Urnov 등 (2005) Nature 435:646-51을 참고한다. 따라서, 하나 이상의 아연 핑거 DNA-결합 폴리펩타이드는 숙주 세포에 도입된 표적화 엔도뉴클레아제가 숙주 세포의 게놈 내에서 고유한 DNA 서열과 상호작용하도록 조작되고 이용될 수 있다.
바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비-자연적으로 발생한다. 예를 들어, Beerli 등 (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo 등 (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan 등 (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal 등 (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo 등 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; U.S. 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공보 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061을 참고한다.
조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연 발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은, 비제한적으로, 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함한다. 합리적인 설계는, 예를 들어, 삼중항 (또는 사중항) 뉴클레오타이드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하고, 상기 각각의 삼중항 또는 사중항 뉴클레오타이드 특정한 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, U.S. 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261을 참고한다.
파아지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법은 U.S. 특허 번호 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어, WO 02/077227에 기재되었다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 아연 핑거 단백질은 예를 들어, 5개 이상 길이의 아미노산의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, U.S. 예시적인 링커 서열 6개 이상 길이의 아미노산에 대해 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참고한다. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 임의 조합을 포함할 수 있다.
표적 부위의 선택: 융합 단백질 (및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구축을 위한 ZFP 및 방법은 당업자에게 알려져 있고 U.S. 특허 번호 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496에 상세히 기재되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 아연 핑거 단백질은 예를 들어, 5개 이상 길이의 아미노산의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 예시적인 링커 서열 6개 이상 길이의 아미노산에 대해 U.S. 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참고한다. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 임의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 기재된 방법에 사용하기 위한 돼지 암컷 동물은 아연-핑거 뉴클레아제를 사용하여 유전자적으로 편집된 경우, 암컷 동물은 표적화된 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 분자 및, 선택적으로, 적어도 하나의 부속 폴리뉴클레오타이드를 배아 또는 세포에 도입하는 포함하는 과정을 사용하여 생성될 수 있다. 상기 방법은 추가로 아연 핑거 뉴클레아제의 발현을 허용하도록 배아 또는 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하고, 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 표적화된 염색체 서열에 도입된 이중-가닥 절단은 오류유발 비-상동성 말단-결합 DNA 회복 과정 또는 상동성-지향된 DNA 회복 과정에 의해 보수된다. 표적화된 아연 핑거 뉴클레아제 기술을 사용하여 생식계열 발달과 관련된 단백질을 인코딩하는 염색체 서열을 편집하는 방법은 신속하고, 정확하고, 고도로 효율적이다.
대안적으로, DNA-결합 폴리펩타이드는 GAL4로부터의 DNA-결합 도메인이다. GAL4는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 모듈식 교차활성인자이지만, 또한 많은 다른 유기체에서 교차활성인자로서 작동한다. 예를 들어, Sadowski 등 (1988) Nature 335:563-4를 참고한다. 이러한 조절 시스템에서, S. 세레비지아에(S. cerevisiae)에서 갈락토스 대사 경로의 효소를 인코딩하는 유전자의 발현은 이용가능한 탄소원에 의해 엄격하게 조절된다. Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51:458-76. 이들 대사 효소의 전사 조절은 양성 조절 단백질인 GAL4와, GAL4가 특이적으로 결합하는 17 bp 대칭 DNA 서열 (업스트림 활성화 서열 (UAS)) 사이의 상호작용에 의해 매개된다.
천연 GAL4는 99 kDa의 분자량을 갖는 881개의 아미노산 잔기로 구성된다. GAL4는 기능적으로 자율적 도메인을 포함하되, 그의 조합된 활성은 생체내에서 GAL4의 활성을 설명한다. Ma 및 Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent 및 Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2):729-36. GAL4의 N-말단 65 아미노산은 GAL4 DNA-결합 도메인을 포함한다. Keegan 등 (1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5. 서열-특이적 결합은 DNA 결합 도메인이 존재하는 6개의 Cys 잔기에 의해 배위된 2가 양이온의 존재를 필요로 한다. 배위된 양이온-함유 도메인은 DNA 나선의 주요 홈과의 직접 접촉을 위해 17 bp UAS의 각 말단에서 보존된 CCG 삼중항과 상호작용하고 인식한다. Marmorstein 등 (1992) Nature 356:408-14. 단백질의 DNA-결합 기능은 활성화 도메인이 전사를 지시할 수 있도록 프로모터의 부근에서 C-말단 전사 활성화 도메인을 위치시킨다.
사용될 수 있는 추가의 DNA-결합 폴리펩타이드는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, AVRBS3-유도성 유전자로부터의 결합 서열; AVRBS3-유도성 유전자로부터의 공통 결합 서열 또는 이로부터 조작된 합성 결합 서열 (예를 들어, UPA DNA-결합 도메인); TAL; LexA (참고, 예를 들어, Brent & Ptashne (1985), 상동); LacR (참고, 예를 들어, Labow 등 (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-56; Baim 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(12):5072-6); 스테로이드 호르몬 수용체 (Ellliston 등 (1990) J. Biol. Chem. 265:11517-121); Tet 억제자 (미국 특허 번호 6,271,341) 및 테트라사이클린 (Tc)의 부재는 아니지만 그 존재에서 tet 작동자 서열에 결합하는 돌연변이된 Tet 억제자; NF-카파B의 DNA-결합 도메인; 및 GAL4, 호르몬 수용체, 및 VP16의 융합을 활용하는, Wang 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(17):8180-4에 기재된 조절 시스템의 구성요소를 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용된 뉴클레아제 중 하나 이상의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2011/0301073을 참고한다.
대안적으로, 뉴클레아제는 CRISPR 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템을 포함할 수 있다.
(CRISPR-관련된) 시스템은 바이러스 공격을 방어하기 위한 적응 면역계로서 박테리아와 고세균에서 진화하였다. 바이러스에 노출되면, 바이러스 DNA의 짧은 분절이 CRISPR 유전자좌에 통합된다. RNA는 바이러스 서열을 포함하는 CRISPR 유전자좌의 일부로부터 전사된다. 바이러스 게놈에 상보적인 서열을 함유하는 RNA는 바이러스 게놈의 서열에 대한 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질)의 표적화를 매개한다. Cas 단백질은 절단되어 바이러스 표적을 침묵시킨다. 최근에는, CRISPR/Cas 시스템이 진핵 세포의 게놈 편집에 적용되었다. 부위-특이적 이중 가닥 절단 (DSB)을 도입하면 2개의 내인성 DNA 회복 기전인, 비-상동성 말단-결합 (NHEJ) 또는 상동 지정 복구 (HDR) 중 하나를 통해 표적 서열을 변경할 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 또한 표적 서열을 변경하지 않고 전사 억제 및 활성화를 포함한 유전자 조절에 사용되었다. CRISPR/Cas 시스템에 기초한 표적화된 유전자 조절은, 예를 들어, 효소적으로 불활성 Cas9 (촉매적으로 죽은 Cas9로도 알려져 있음)를 사용할 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 상기 시스템의 RNA 구성요소를 인코딩하는 CRISPR (클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복) 유전자좌 및 단백질을 인코딩하는 Cas (CRISPR-관련된) 유전자좌를 포함한다 (Jansen 등, 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova 등, 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova 등, 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft 등, 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60). 미생물 숙주의 CRISPR 유전자좌는 Cas 유전자의 조합, 및 CRISPR-매개된 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소를 포함한다.
II형 CRISPR은 가장 잘 특성규명된 시스템 중 하나이며, 4개의 순차적 단계로 자연에서 표적화된 DNA 이중-가닥 절단을 수행한다. 첫째, 2개의 비-코딩 RNA인, pre-crRNA 어레이 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 둘째, tracrRNA는 pre-crRNA의 반복 영역에 혼성화하고 pre-crRNA를 개별 스페이서 서열을 포함하는 성숙한 crRNA로 처리하는 것을 매개한다. 셋째, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체는 표적 인식을 위한 추가의 요건인, crRNA의 스페이서와 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 옆에 있는 표적 DNA의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 통해 Cas9를 표적 DNA로 유도한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에서 이중-가닥 절단을 생성한다.
표적화된 삽입 및 결실을 생성하기 위한 CRISPR/Cas 시스템의 사용을 위해, 2개의 비-코딩 RNA (crRNA 및 TracrRNA)는 가이드 RNA (gRNA)로 칭해지는 단일 RNA로 대체될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 활동은 다음의 세 단계로 구성된다: (i) "적응"이라는 과정에서 향후 공격을 방지하기 위해 외인성 DNA 서열을 CRISPR 어레이에 삽입, (ii) 관련된 단백질의 발현, 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 처리, 이어서 (iii) 외래 핵산에 대한 RNA-매개된 간섭. 박테리아 세포에서 몇 개의 Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 천연 기능에 관여하며 외래 DNA 삽입 등과 같은 기능에 역할을 한다.
Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩타이드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩타이드와 공통적인 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는, 비제한적으로, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩타이드 및 그것의 단편의 유도체를 포함하지만, 단, 이들은 상응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 생물학적 활성을 갖는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형물 및 이들의 융합물을 모두 포함한다. Cas 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 적합한 유도체는 비제한적으로 Cas 단백질 또는 이의 단편의 돌연변이체, 융합물, 공유 변형물을 포함한다. Cas 단백질 또는 이의 단편, 뿐만 아니라 Cas 단백질 또는 이의 단편의 유도체를 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 얻거나 화학적으로 합성되거나 또는 이들 두 절차의 조합에 의해 얻을 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하는 세포이거나 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고 더 높은 발현 수준에서 내인성 Cas 단백질을 생산하거나 핵산이 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 인코딩하는 외인성으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 세포일 수 있다. 일부 경우에, 세포는 자연적으로 Cas 단백질을 생산하지 않고 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된다.
본원에서 기재된 방법에 사용하기 위한 돼지 암컷 동물이 CRISPR 시스템을 사용하여 유전적으로 편집된 경우, CRISPR/Cas9 시스템은 돼지 암컷 동물을 생성하도록 사용될 수 있다. Cas9를 사용하여 게놈 서열을 편집하기 위해 단백질을 세포에 직접 전달할 수 있다. 대안적으로, Cas9를 인코딩하는 mRNA가 세포에 전달될 수 있거나, Cas9를 인코딩하는 mRNA의 발현을 제공하는 유전자가 세포에 전달될 수 있다. 또한, 표적 특이적 crRNA 및 tracrRNA는 세포에 직접 전달될 수 있거나 표적 특이적 gRNA(들)가 세포에 있을 수 있다 (이들 RNA는 대안적으로 이들 RNA를 발현하도록 구성된 유전자에 의해 생성될 수 있다). 표적 부위의 선택 및 crRNA/gRNA의 설계는 당업계에 잘 알려져 있다. gRNA의 구성 및 클로닝에 대한 논의는 http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/CRISPR-Reagent-Description-Rev20140509.pdf에서 찾을 수 있다.
DNA-결합 폴리펩타이드는 숙주 유기체의 게놈 핵산 내에 포함된 표적 뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있다. 표적 뉴클레오타이드 서열의 임의의 수의 개별 사례가 일부 예에서 숙주 게놈에서 발견될 수 있다. 표적 뉴클레오타이드 서열은 유기체의 게놈 내에서 드물게 존재할 수 있다 (예를 들어, 표적 서열의 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 또는 약 1개 미만의 사본(들)이 게놈에 존재할 수 있다). 예를 들어, 표적 뉴클레오타이드 서열은 유기체의 게놈 내의 고유한 부위에 위치할 수 있다. 표적 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 및 비제한적으로, 서로에 대해 게놈 전체에 무작위로 분산될 수 있고; 게놈 내의 상이한 연결 그룹에 위치하고; 동일한 연결 그룹에 위치하고; 상이한 염색체에 위치하고; 동일한 염색체에 위치하고; 유기체에서 유사한 조건하에 (예를 들어, 동일한 또는 실질적으로 기능적으로 동일한 조절 인자의 제어하에) 발현되는 부위의 게놈에 위치하고; 게놈에서 서로 밀접하게 위치할 수 있다 (예를 들어, 표적 서열은 게놈 유전자좌에서 연쇄동일서열로 통합된 핵산 내에 포함될 수 있다).
엔도뉴클레아제의 표적화
표적 뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 인식하고 그 서열에 결합하는 DNA-결합 폴리펩타이드는 특이적 결합을 키메라 폴리펩타이드 상의 표적 서열에 부여하기 위해 키메라 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있다. 예에서, 그와 같은 키메라 폴리펩타이드는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 폴리펩타이드가 상기에 기재된 바와 같이 뉴클레아제, 재조합효소, 및/또는 리가제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. DNA-결합 폴리펩타이드 및 뉴클레아제, 재조합효소, 및/또는 리가제 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 또한 다른 기능성 폴리펩타이드 모티프 및/또는 도메인, 예컨대 그리고 비제한적으로 다음을 포함할 수 있다: 키메라 단백질에서 기능성 폴리펩타이드 사이에 자리잡은 스페이서 서열; 리더 펩타이드; 융합 단백질을 소기관 (예를 들어, 핵)으로 표적으로 하는 펩타이드; 세포 효소에 의해 절단된 폴리펩타이드; 펩타이드 태그 (예를 들어, Myc, His, 등); 및 키메라 폴리펩타이드의 기능을 방해하지 않는 다른 아미노산 서열.
키메라 폴리펩타이드에서의기능성 폴리펩타이드 (예를 들어, DNA-결합 폴리펩타이드 및 뉴클레아제 폴리펩타이드)는 작동가능하게 연결될 수 있다. 키메라 폴리펩타이드의 기능성 폴리펩타이드는 키메라 단백질을 인코딩하는 키메라 유전자를 생성하기 위해 프레임 내에서 서로 결합될 적어도 기능성 폴리펩타이드를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드로부터의 발현에 의해 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 키메라 폴리펩타이드의 기능성 폴리펩타이드는 다른 수단에 의해, 예컨대 독립적으로 발현된 폴리펩타이드의 교차-연결에 의해 작동가능하게 연결될 수 있다.
표적 뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 인식하고 결합하는 DNA-결합 폴리펩타이드, 또는 가이드 RNA는 천연 단리된 단백질 (또는 이의 돌연변이체) 내에 포함될 수 있되, 상기 천연 단리된 단백질 또는 이의 돌연변이체는 또한 뉴클레아제 폴리펩타이드를 포함한다 (그리고 또한 재조합효소 및/또는 리가제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다). 상기 단리된 단백질의 예는 TALEN, 재조합효소 (예를 들어, Cre, Hin, Tre, 및 FLP 재조합효소), RNA-가이드된 CRISPR/Cas9, 및 메가뉴클레아제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 엔도뉴클레아제"는 DNA-결합 폴리펩타이드 또는 가이드 RNA 및 뉴클레아제 폴리펩타이드를 포함하는 천연 또는 조작된 단리된 단백질 및 이의 돌연변이체, 뿐만 아니라 DNA-결합 폴리펩타이드 또는 가이드 RNA 및 뉴클레아제를 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 지칭한다. (예를 들어, 표적 서열이 유전자좌의 천연 서열 내에 포함되기 때문에, 또는 표적 서열이 예를 들어, 재조합에 의해 유전자좌에 도입되었기 때문에) CD163 유전자좌 내에 포함된 표적 뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 인식하고 그 서열에 결합되는 DNA-결합 폴리펩타이드 또는 가이드 RNA를 포함하는 임의의 표적화 엔도뉴클레아제는 사용될 수 있다.
적합한 키메라 폴리펩타이드의 일부 예는, 비제한적으로, 다음의 폴리펩타이드의 조합을 포함한다: 아연 핑거 DNA-결합 폴리펩타이드; FokI 뉴클레아제 폴리펩타이드; TALE 도메인; 류신 지퍼; 전사 인자 DNA-결합 모티프; 및 예를 들어 그리고 비제한적으로, TALEN, 재조합효소 (예를 들어, Cre, Hin, RecA, Tre, 및 FLP 재조합효소), RNA-가이드된 CRISPR/Cas9, 메가뉴클레아제로부터 단리된 DNA 인식 및/또는 절단 도메인; 및 당업자에게 알려진 기타. 특정 예는 부위-특이적인 DNA 결합 폴리펩타이드 및 뉴클레아제 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 키메라 폴리펩타이드는 키메라 폴리펩타이드를 관심 특정 뉴클레오타이드 서열로 표적화하기 위해 키메라 폴리펩타이드 내에 포함된 DNA-결합 폴리펩타이드의 인식 서열을 변경하기 위해 당업자에게 알려진 방법에 의해 조작될 수 있다.
키메라 폴리펩타이드는 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거, TAL-효과기 도메인, 등) 및 뉴클레아제 (절단) 도메인을 포함할 수 있다. 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어 뉴클레아제로부터 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인 또는 상이한 뉴클레아제로부터 TALEN DNA-결합 도메인 및 절단 도메인, 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인에 대해 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는, 비제한적으로, 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass.; 및 Belfort 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388을 참고한다. DNA를 절단하는 추가 효소가 알려져 있다 (예를 들어, 51 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNAse I; 마이크로코칼 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 Linn 등 (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993을 참고한다). 이들 효소 (또는 이의 기능성 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 반-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 반-도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는 상기 기재된 임의의 뉴클레아제 또는 또는 그것의 일부로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 반-도메인을 포함하는 경우 절단을 위해 2개의 융합 단백질이 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있거나, 각각의 절단 반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 바람직하게는, 2개의 융합 단백질의 이들의 각각의 표적 부위에 대한 결합이 절단 반-도메인을 서로 공간적 배향으로 배치하여 절단 반-도메인이, 예를 들어, 이량체화에 의해 기능적 절단 도메인을 형성할 수 있도록 서로에 대해 배치된다. 따라서, 표적 부위의 가까운 가장자리는 5-8개 뉴클레오타이드 또는 15-18개 뉴클레오타이드로 분리될 수 있다. 그러나 임의의 정수의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍 (예를 들어, 2 내지 50개의 뉴클레오타이드 쌍 또는 그 초과)이 두 표적 부위 사이에 개입할 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 있다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에 존재하며, DNA (인식 부위)에 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 예를 들어, 하나 이상의 외인성 서열 (공여체/이식유전자)이 결합 (표적) 부위에서 또는 그 근처에서 통합되도록 결합 부위에서 또는 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, IIS형)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, IIS형 효소 Fok I은 한 가닥의 인식 부위에서 9개 뉴클레오타이드, 및 다른 가닥의 인식 부위에서 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 Li 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim 등 (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim 등 (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982를 참고한다. 따라서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 반-도메인) 및 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함할 수 있다.
예시적인 IIS형 제한 효소는 그의 절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 것으로, Fok I이다. 이 특정 효소는 이량체로 활동한다. Bitinaite 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에 사용되는 Fok I 효소의 일부는 절단 반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-Fok I 융합물을 사용하는 세포 서열의 표적화된 이중-가닥 절단 및/또는 표적화된 대체를 위해, 각각 FokI 절단 반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 촉매적 활성 절단 도메인을 재구성하는데 사용할 수 있다. 대안적으로, DNA 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 분자도 사용될 수 있다.
절단 도메인 또는 절단 반-도메인은 절단 활성을 보유하거나, 또는 기능성 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화하는 (예를 들어, 이량체화하는) 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 IIS형 제한 효소는 미국 특허 공보 번호 2007/0134796에 기재되어 있다. 추가의 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 포함하고, 이들은 본 개시내용에 의해 고려된다. 예를 들어, Roberts 등 (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420을 참고한다.
절단 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2005/0064474; 2006/0188987 및 2008/0131962에 기재된 바와 같이 동종이량체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 반-도메인 (또한 일명 이량체화 도메인 돌연변이체)를 포함할 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체내 조립될 수 있다 (참고 예를 들어 미국 특허 공보 번호 20090068164). 그와 같은 분할 효소의 구성요소는 별도의 발현 작제물 상에서 발현될 수 있거나, 또는 개별 구성요소가 예를 들어, 자가-절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 열린 해독틀에서 연결될 수 있다. 구성요소는 개별 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
아연 핑거 뉴클레아제
키메라 폴리펩타이드는 외인성 핵산, 또는 공여체 DNA가 통합될 수 있는 표적화 부위-특이적인 이중-가닥 DNA 절단을 전달하도록 설계된 맞춤-설계된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)이다 (참고 US 특허 공보 2010/0257638). ZFN은 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)로부터의 비-특이적 절단 도메인 및 아연 핑거 DNA-결합 도메인 폴리펩타이드를 함유하는 키메라 폴리펩타이드이다. 예를 들어, Huang 등 (1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim 등 (1997a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20; Kim 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-60; Kim 등 (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7; Kim 등 (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9; Kim 등 (1997c) Gene 203:43-9; Kim 등 (1998) Biol. Chem. 379:489-95; Nahon 및 Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26:1233-9; Smith 등 (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81을 참고한다. ZFN은 비-정식 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다 (US 특허 공보 2008/0182332를 참고한다). FokI 제한 엔도뉴클레아제는 DNA를 절단하고 이중-가닥 파손을 도입하기 위해 뉴클레아제 도메인을 통해 이량체화되어야 한다. 결과적으로, 그와 같은 엔도뉴클레아제로부터 뉴클레아제 도메인을 함유하는 ZFN은 또한 표적 DNA를 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인의 이량체화를 필요로 한다. Mani 등 (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7; Smith 등 (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9. ZFN의 이량체화는 2개의 인접한, 반대편의 지향된 DNA-결합 부위에 의해 촉진될 수 있다. Id.
외인성 핵산의 숙주의 적어도 하나의 CD163 유전자좌로의 부위-특이적인 통합을 위한 방법은 숙주의 세포로 ZFN을 도입하는 것을 포함하되, 상기 ZFN은 표적 뉴클레오타이드 서열을 인식하고 그 서열에 결합하고, 상기 표적 뉴클레오타이드 서열은 숙주의 적어도 하나의 CD163 유전자좌 내에 포함된다. 특정 예에서, 상기 표적 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 CD163 유전자좌 이외의 임의의 다른 위치에서 숙주의 게놈 내에 포함되지 않는다. 예를 들어, ZFN의 DNA-결합 폴리펩타이드는 (예를 들어, CD163 유전자좌를 서열분석함으로써) 적어도 하나의 CD163 유전자좌 내에서 확인된 표적 뉴클레오타이드 서열을 인식하고 그 서열에 결합하기 위해 조작될 수 있다. 숙주의 세포에 ZFN을 도입하는 것을 포함하는 숙주의 적어도 하나의 CD163 성능 유전자좌로 외인성 핵산의 부위-특이적인 통합을 위한 방법은 또한 세포에 외인성 핵산을 도입하는 것을 포함할 수 있고, 외인성 핵산의, 적어도 하나의 CD163 유전자좌를 포함하는 숙주의 핵산으로의 재조합은 부위-특이적인 인식 및 ZFN의 표적 서열으로의 결합 (및 CD163 유전자좌를 포함하는 핵산의 후속적인 절단)에 의해 촉진된다.
CD163 유전자좌에서 통합을 위한 선택적인 외인성 핵산
CD163 유전자좌에서 통합을 위한 외인성 핵산은 다음을 포함한다: 적어도 하나의 CD163 유전자좌에서 부위-특이적인 통합을 위한 외인성 핵산, 예를 들어 그리고 비제한적으로, ORF; 표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및 전술한 것 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 벡터. 따라서, 특정 핵산은 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 구조적 뉴클레오타이드 서열, 및/또는 DNA-결합 폴리펩타이드 인식 및 결합 부위를 포함한다.
부위-특이적인 통합을 위한 선택적인 외인성 핵산 분자
전술한 바와 같이, 외인성 서열 (또한 소위 "공여체 서열" 또는 "공여체" 또는 "이식유전자")의 삽입은, 예를 들어 폴리펩타이드의 발현, 돌연변이 유전자의 수정 또는 야생형 유전자의 발현 증가를 위해 제공된다. 공여체 서열은 전형적으로 배치되는 게놈 서열과 동일하지 않다는 것은 쉽게 명백할 것이다. 공여체 서열은 관심 위치에서 효율적인 상동 지정 복구 (HDR)를 허용하기 위해 상동성의 2개의 영역에 의해 측접된 비-상동성 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 공여체 서열은 세포 염색질에서 관심 영역에 대해 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 공여체 분자는 세포 염색질에 대해 상동성의 몇 개의, 불연속 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역에 정상적으로 존재하는 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 공여체 핵산 분자에 존재할 수 있고 관심 영역에서 서열에 대한 상동성의 영역에 의해 측접될 수 있다.
공여체 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2010/0047805, 2011/0281361, 2011/0207221, 및 2013/0326645를 참고한다. 선형 형태로 도입되면, 공여체 서열의 단부는 당업자에게 알려진 방법에 의해 (예를 들어 핵산외부분해 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 첨가되고/거나 자가-상보성 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 둘 모두 단부에 결찰된다. 예를 들어, Chang 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls 등 (1996) Science 272:886-889를 참고한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하기 위한 추가 방법은, 비제한적으로, 말단 아미노 기(들)의 첨가 및 변형된 뉴클레오타이드간 연결기 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보오스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 복제 기원, 프로모터 및 항생제 내성을 코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 또한, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 제제 예컨대 리포좀 또는 폴록사머와 복합된 핵산과 같은 네이키드 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함있는 렌티바이러스 (IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여체는 일반적으로, 그것의 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉 공여체가 통합되는 내인성 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (예를 들어, CD163)에 의해 유도되도록 통합된다. 그러나, 공여체가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있는 것이 명백할 것이다.
또한, 발현에 필요하지 않지만, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 절연체, 내부 리보솜 유입 부위, 2A 펩타이드를 인코딩하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
CD163 유전자좌를 변형시키기 위해 부위-특이적인 방식으로 적어도 하나의 CD163 유전자좌로 통합될 수 있는 외인성 핵산은, 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 작물학적 유전자를 포함하는 핵산; RNAi 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 또는 CD163 유전자를 파괴하는 핵산을 포함한다.
외인성 핵산은 CD163 유전자좌에서 통합되어, CD163 유전자좌를 변형시킬 수 있되, 상기 핵산은 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하여, 상기 뉴클레오타이드 서열은 CD163 유전자좌로부터의 숙주에서 발현된다. 일부 예에서, 관심 폴리펩타이드 (예를 들어, 외래 단백질)은 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로부터 상업적 양으로 발현된다. 그와 같은 예에서, 관심 폴리펩타이드는 숙주세포, 조직, 또는 바이오매스로부터 추출될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자
표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 표적화 엔도뉴클레아제 내에 포함된 폴리펩타이드를 인코딩하는 천연 뉴클레오타이드 서열의 조작 (예를 들어, 결찰)에 의해 조작될 수 있다. 예를 들어, DNA-결합 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 DNA-결합 폴리펩타이드에 상응하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 식별하기 위해 검사될 수 있고, 그 뉴클레오타이드 서열은 DNA-결합 폴리펩타이드를 포함하는 표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 요소로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 표적화 엔도뉴클레아제의 아미노산 서열은, 예를 들어, 유전자 암호의 축퇴에 따라 표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추론하는데 사용될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 예시적인 핵산 분자에서, 뉴클레아제 폴리펩타이드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열의 마지막 코돈, 및 DNA-결합 폴리펩타이드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열의 제1 코돈은, 예를 들어, 인트론 또는 "정지(STOP)"를 코딩하지 않고 임의의 수의 뉴클레오타이드 삼중항에 의해 분리될 수 있다. 마찬가지로, DNA-결합 폴리펩타이드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 마지막 코돈, 및 뉴클레아제 폴리펩타이드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열의 제1 코돈도 임의의 수의 뉴클레오타이드 삼중항에 의해 분리될 수 있다. 뉴클레아제 폴리펩타이드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열 및 DNA-결합 폴리펩타이드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열의 마지막 코돈 (즉, 핵산 서열에서 3'의 가장 마지막)은 이에 바로 인접하거나 합성 뉴클레오타이드 링커 (예를 들어, 융합을 달성하기 위해 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 링커)에 의해 인코딩된 것과 같은 단지 짧은 펩타이드 서열에 의해 이로부터 분리된 추가의 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열의 제1 코돈과 위상-레지스터(phase-register)에서 융합될 수 있다. 그와 같은 추가 폴리뉴클레오타이드 서열의 예로는, 예를 들어 및 비제한적으로, 태그, 표적화 펩타이드, 및 효소적 절단 부위가 포함된다. 마찬가지로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 서열의 (핵산 서열에서) 5'의 가장 마지막의 제1 코돈은 이에 바로 인접하거나 단지 짧은 펩타이드 서열에 의해 이로부터 분리된 추가의 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열의 마지막 코돈과 위상-레지스터에서 융합될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제에서 기능적 폴리펩타이드 (예를 들어, DNA-결합 폴리펩타이드 및 뉴클레아제 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 분리하는 서열은, 예를 들어, 인코딩된 아미노산 서열이 표적화 엔도뉴클레아제의 번역을 유의미하게 변경하지 않도록 하는 임의의 서열로 구성될 수 있다. 알려진 뉴클레아제 폴리펩타이드 및 알려진 DNA-결합 폴리펩타이드의 자율적 특성으로 인해, 개재 서열은 이들 구조의 각각의 기능을 방해하지 않을 것이다.
다른 녹아웃 방법
당업계에 알려진 다양한 다른 기술을 사용하여 유전자를 불활성화하여 넉아웃 동물을 만들고/만들거나 핵산 작제물을 동물에게 도입하여 시조 동물을 생산하고, 동물 계통을 만들 수 있으며, 여기서 녹아웃 또는 핵산 작제물은 게놈에 통합된다. 그와 같은 기술은, 비제한적으로, 전핵(pronuclear) 미세주입 (미국 특허 번호 4,873,191), 생식 계열로 레트로바이러스 매개된 유전자 전달 (Van der Putten 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-1652), 배아 줄기 세포로의 유전자 표적화 (Thompson 등 (1989) Cell 56, 313-321), 배아의 전기천공 (Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814), 정자-매개된 유전자 전달 (Lavitrano 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 14230-14235; Lavitrano 등 (2006) Reprod. Fert. Develop. 18, 19-23), 및 체세포, 예컨대 난구 세포 또는 유선 세포, 또는 성인, 태아, 또는 배아 줄기 세포의 시험관내 형질전환, 이어서 핵 이식 (Wilmut 등 (1997) Nature 385, 810-813; 및 Wakayama 등 (1998) Nature 394, 369-374)을 포함한다. 전핵 미세주입, 정자 매개된 유전자 전달, 및 체세포 핵전이가 특히 유용한 기술이다. 게놈 변형된 동물은 생식 계열 세포를 포함하여 모든 세포가 변형된 동물이다. 변형된 모자이크 동물을 생산하는 방법이 사용되는 경우, 동물은 근친교배될 수 있고 게놈 변형된 자손이 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로닝은 세포가 배반포 상태에서 변형된 모자이크 동물을 만드는데 사용될 수 있으며, 단일-세포가 변형될 때 게놈 변형이 발생할 수 있다. 성적으로 성숙하지 않도록 변형된 동물은 사용되는 특정 접근법에 따라 변형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 특정 유전자가 녹아웃 변형에 의해 불활성화되는 경우, 일반적으로 동형접합성이 필요할 것이다. 특정 유전자가 RNA 간섭 또는 우세한 음성 전략에 의해 불활성화되는 경우, 이형접합성이 종종 적절하다.
전형적으로, 배아/접합체 미세주입에서, 핵산 작제물 또는 mRNA는 수정란에 도입되고; 1 또는 2개의 세포 수정란은 정자 머리의 유전 물질을 포함하는 핵 구조로 사용되며 상기 수정란은 원형질 내에서 보인다. 전핵 단계 수정란은 시험관내 또는 생체내 (즉, 공여체 동물의 난관으로부터 수술로 회수됨)에서 얻을 수 있다. 시험관내 수정란은 다음과 같이 생산될 수 있다. 예를 들어, 돼지류 난소는 도축장에서 수집되어 운송 중에 22-28℃에서 유지될 수 있다. 난소를 세정하고 여포 흡인을 위해 단리할 수 있으며, 4-8 mm 범위의 여포는 진공하에 18 게이지 니들을 사용하여 50 mL 원추형 원심관으로 흡인될 수 있다. 여포액과 흡인된 난모세포는 상업적 TL-HEPES (Minitube, Verona, Wis.)를 사용하여 프리-필터를 통해 헹굴 수 있다. 조밀한 난구세포 덩어리로 둘러싸인 난모세포를 선택하고, 가습 공기에서 38.7℃. 및 5% CO2에서 대략 22시간 동안 0.1 mg/mL 시스테인, 10 ng/mL 표피 성장 인자, 10% 돼지 여포액, 50 μM 2-머캅토에탄올, 0.5 mg/ml cAMP, 임신한 암말 혈청 고나도트로핀 (PMSG) 및 인간 융모막 고나도트로핀 (hCG) 각각 10 IU/mL가 보충된 TCM-199 난모세포 성숙 배지 (Minitube, Verona, Wis.)에 두었다. 그 후, 난모세포를 cAMP, PMSG 또는 hCG가 포함되는 신선한 TCM-199 성숙 배지로 옮기고 추가 22 시간 동인 인큐베이션할 수 있다. 성숙된 난모세포는 0.1% 히알루로니다제에서 1분 동안 와동하여 난구 세포를 박리할 수 있다.
돼지류의 경우, 성숙한 난모세포는 미니튜브 5-웰 수정 접시 내 500 μl 미니튜브 PORCPRO IVF 배지 시스템 (Minitube, Verona, Wis.)에서 수정될 수 있다. 시험관내 수정 (IVF)을 위한 준비로 새롭게-수집되거나 냉동된 수퇘지 정액을 세정하고 PORCPRO IVF 배지에서 정자 400,000개까지 재현탁시킬 수 있다. 정자 농도는 컴퓨터 보조된 정액 분석 (SPERMVISION, Minitube, Verona, Wis.)으로 분석될 수 있다. 최종 시험관내 정액주입은 수퇘지에 따라 대략 40개의 운동성 정자/난모세포의 최종 농도에서 10 μl 부피로 수행될 수 있다. 모든 수정된 난모세포를 5.0% CO2 분위기에서 38.7 ℃에서 6시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 정액주입 6시간 후 추정 접합체를 NCSU-23에서 2회 세정하고 0.5 mL의 동일한 배지로 옮길 수 있다. 이 시스템은 10-30%의 다정자수정 정액주입 비율로 대부분의 수퇘지에서 통상적으로 20-30%의 배반포를 생산할 수 있다.
선형화된 핵산 작제물 또는 mRNA는 전핵 중 하나 또는 세포질에 주입될 수 있다. 그 다음 주입된 수정란은 수령체 암컷 (예를 들어, 수령체 암컷의 난관)으로 전달되고 수령체 암컷에서 발달하여 형질전환 또는 유전적으로 편집된 동물을 생산할 수 있다. 특히, 시험관내 수정된 배아를 15,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 지질을 침전시켜 전핵이 가시화될 수 있다. 에펜도르프 FEMTOJET 인젝터를 사용하여 배아를 주입할 수 있으며, 배반포가 형성될 때까지 배양할 수 있다. 배아 절단 및 배반포 형성 비율 및 품질을 기록할 수 있다.
배아는 비동시적인 수령체의 자궁으로 수술로 옮겨질 수 있다. 전형적으로, 5.5-인치 TOMCAT® 카테터를 사용하여 100-200개 (예를 들어, 150-200개)의 배아를 난관의 팽대-지협 접합부에 침착시킬 수 있다. 수술 후, 실시간 임신 초음파 검사를 수행할 수 있다.
체세포 핵전이에서, 상기에 기재된 핵산 작제물을 포함하는 배아 할구, 태아 섬유모세포, 성체 귀 섬유모세포, 또는 과립막 세포와 같은 형질전환 또는 유전자 편집된 세포를 제핵된 난모세포에 도입하여 조합된 세포를 확립할 수 있다. 난모세포는 극체 근처에서 부분적인 투명대 절개에 이어서 절개 영역에서 세포질을 밀어냄으로써 제핵될 수 있다. 전형적으로, 급격히 경사진 팁이 있는 주입 피펫을 사용하여 감수분열 2에서 정지된 제핵된 난모세포에 형질전환 또는 유전적으로 편집된 세포를 주입한다. 일부 관례에서, 감수분열-2에서 정지된 난모세포를 수정란이라고 한다. 돼지 또는 소 배아를 생성한 후 (예를 들어, 난모세포를 융합하고 활성화함으로써), 배아는 활성화 후 약 20 내지 24시간 후에 수령체 암컷의 난관으로 옮겨진다. 예를 들어, Cibelli 등 (1998) Science 280, 1256-1258 및 미국 특허 번호 6,548,741, 7,547,816, 7,989,657, 또는 6,211,429를 참고한다. 돼지의 경우, 수령체 암컷은 배아 이식 후 대략 20-21일 후에 임신 여부를 확인할 수 있다.
초기 이형접합성 시조 동물로부터 불활성화된 유전자에 대해 동형접합성인 동물을 만들기 위해 표준 브리딩 기술이 사용될 수 있다. 그러나 동형접합성은 필요하지 않을 수 있다. 본원에 기재된 유전자 편집된 돼지는 다른 관심 돼지와 함께 사육될 수 있다.
유전자 편집된 동물이 생성되면, 표준 기술을 사용하여 내인성 핵산의 불활성화를 평가할 수 있다. 초기 스크리닝은 불활성화가 발생했는지 여부를 결정하기 위해 서던 블랏 분석에 의해 수행될 수 있다. 서던 분석에 대한 설명은 Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview; N.Y의 섹션 9.37-9.52를 참고한다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술이 또한 초기 스크리닝에 사용될 수 있다. PCR은 표적 핵산이 증폭되는 절차 또는 기술을 지칭한다. 일반적으로, 관심 영역의 끝 또는 그 너머의 서열 정보는 증폭될 주형의 반대 가닥과 서열이 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하는데 사용된다. PCR은 전체 게놈 DNA 또는 전체 세포 RNA의 서열을 비롯하여, DNA 뿐만 아니라 RNA의 특정 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로 길이가 14 내지 40개의 뉴클레오타이드이지만, 길이가 10개 뉴클레오타이드에서 수백 개의 뉴클레오타이드까지 다양할 수 있다. PCR은, 예를 들어 PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. Dieffenbach and Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995에 기재되어 있다. 핵산은 또한 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭, 자가-지속된 서열 복제에 의해 증폭될 수 있거나, 핵산 서열-기반으로 증폭될 수 있다. 예를 들어, Lewis (1992) Genetic Engineering News 12,1; Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; 및 Weiss (1991) Science 254:1292를 참고한다. 배반포 단계에서, 배아는 PCR, 서던 혼성화 및 스프링커렛(splinkerette) PCR 분석을 위해 개별적으로 처리될 수 있다 (참고, 예를 들어, Dupuy 등 Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99:4495).
간섭 RNA
다양한 간섭 RNA (RNAi) 시스템이 알려져 있다. 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 상동성 유전자 전사체의 서열-특이적 분해를 유도한다. RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)는 dsRNA를 작은 21-23-뉴클레오타이드 작은 간섭 RNA (siRNA)로 대사한다. RISC는 이중가닥 RNAse (dsRNAse, 예를 들어, Dicer) 및 ssRNAse (예를 들어, Argonaut 2 또는 Ago2)를 포함한다. RISC는 안티센스 가닥을 가이드로 사용하여 절단가능한 표적을 찾는다. siRNA 및 microRNA (miRNA) 둘 모두 알려져 있다. 유전적으로 편집된 동물에서 유전자를 불활성화하는 방법은 표적 유전자 및/또는 핵산의 발현이 감소되도록 표적 유전자 및/또는 핵산에 대한 RNA 간섭을 유도하는 것을 포함한다.
예를 들어 외인성 핵산 서열은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 대한 RNA 간섭을 유도할 수 있다. 예를 들어, 표적 DNA에 상동성인 이중-가닥 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 사용하여 그 DNA의 발현을 감소시킬 수 있다. siRNA를 위한 작제물은, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다: Fire 등 (1998) Nature 391:806; Romano 및 Masino (1992) Mol. Microbiol. 6:3343; Cogoni 등 (1996) EMBO J. 15:3153; Cogoni 및 Masino (1999) Nature 399:166; Misquitta 및 Paterson (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1451; 및 Kennerdell 및 Carthew (1998) Cell 95:1017. shRNA를 위한 작제물은 McIntyre 및 Fanning (2006) BMC Biotechnology 6:1에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다. 일반적으로, shRNA는 어닐링하여 짧은 헤어핀을 형성하는 상보적 영역을 포함하는 단일-가닥 RNA 분자로 전사된다.
특정 유전자에 대한 단일 개별 기능적 siRNA 또는 miRNA를 찾을 확률이 높다. 예를 들어, siRNA의 특정 서열에 대한 예측가능성은 약 50%이지만 간섭 RNA 중 적어도 하나가 효과적일 것이라는 확신을 가지고 수많은 간섭 RNA를 만들 수 있다.
CD163을 인코딩하는 유전자를 겨냥하는 RNAi를 발현시키는 시험관내 세포, 생체내 세포, 또는 유전적으로 편집된 동물 예컨대 가축 동물이 사용될 수 있다. RNAi는, 예를 들어, siRNA, shRNA, dsRNA, RISC 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
유도성 시스템
유도성 시스템을 사용하여 CD163 유전자를 불활성화할 수 있다. 유전자 불활성화의 공간적 및 시간적 제어를 가능하게 하는 다양한 유도성 시스템이 알려져 있다. 몇몇은 돼지 동물의 생체내에서 기능하는 것으로 입증되었다.
유도성 시스템의 예는 핵산의 전사를 조절하기 위해 사용될 수 있는 테트라사이클린 (tet)-온(on) 프로모터 시스템이다. 이 시스템에서, 돌연변이된 Tet 억제인자 (TetR)는 단순 포진 바이러스 VP 16 트랜스-활성화 단백질의 활성화 도메인에 융합되어 tet 또는 독시사이클린 (dox)에 의해 조절되는 테트라사이클린-제어된 전사 활성제 (tTA)를 생성한다. 항생제가 없으면 전사가 최소화되지만, tet 또는 dox의 존재하에 있는 동안에는 전사가 유도된다. 대안적인 유도성 시스템으로는 엑디손 또는 라파마이신 시스템이 포함된다. 엑디손은 엑디손 수용체의 이종이량체, 및 울트라스피라클(ultraspiracle) 유전자 (USP) 산물에 의해 생산이 제어되는 곤충 탈피 호르몬이다. 발현은 엑디손 또는 엑디손 유사체 예컨대 뮤리스테론 A로 처리하여 유도된다. 유도성 시스템을 촉발시키기 위해 동물에게 투여되는 제제를 유도 제제로 칭한다.
보다 통상적으로 사용되는 유도성 시스템 중에는 테트라사이클린-유도성 시스템 및 Cre/loxP 재조합효소 시스템 (구성적 또는 유도성)이 있다. 테트라사이클린-유도성 시스템은 테트라사이클린-제어된 교차활성인자 (tTA)/역 tTA (rtTA)를 포함한다. 생체내에서 이들 시스템을 사용하는 방법은 두 계통의 유전적으로 편집된 동물을 생성하는 것을 포함한다. 한 동물 계통은 선택된 프로모터의 제어하에 활성제 (tTA, rtTA, 또는 Cre 재조합효소)를 발현한다. 또 다른 동물 계통은 수용체를 발현하는데, 여기서 관심 유전자 (또는 변경될 유전자)의 발현은 tTA/rtTA 교차활성인자에 대한 표적 서열의 제어하에 있다 (또는 loxP 서열에 측접되어 있음). 두 동물을 교미하면 유전자 발현이 제어된다.
테트라사이클린-의존적 조절 시스템 (tet 시스템)은 2개의 구성요소, 즉, 테트라사이클린-의존 방식으로 다운스트림 cDNA의 발현을 제어하는 tTA/rtTA-의존적 프로모터 및 테트라사이클린-제어된 교차활성인자 (tTA 또는 rtTA)에 의존한다. 테트라사이클린 또는 그것의 유도체 (예컨대 독시사이클린)가 없는 경우 tTA는 tetO 서열에 결합하여 tTA-의존적 프로모터의 전사 활성화를 가능하게 한다. 그러나, 독시사이클린이 있는 경우 tTA는 그것의 표적과 상호작용할 수 없으며, 전사가 발생하지 않는다. tTA를 사용하는 tet 시스템은 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 전사 하향-조절을 가능하게 하기 때문에 tet-OFF라고 한다. 테트라사이클린 또는 그것의 유도체의 투여는 생체내에서 이식유전자 발현의 시간적 제어를 가능하게 한다. rtTA는 독시사이클린이 없으면 기능하지 않지만 상호활성화를 위한 리간드의 존재를 필요로 하는 tTA의 변이체이다. 따라서 이러한 tet 시스템을 tet-ON이라고 한다. tet 시스템은, 예를 들어, 리포터 유전자, 종양유전자, 또는 신호전달 캐스케이드에 관여된 단백질을 인코딩하는 몇 개의 이식유전자의 유도성 발현을 위해 생체내에서 사용되었다.
Cre/lox 시스템은 2개의 떨어져 있는 Cre 인식 서열, 즉, loxP 부위 사이의 교차에 의해 부위-특이적인 재조합을 촉매하는 Cre 재조합효소를 사용한다. 2개의 loxP 서열 사이에 도입된 DNA 서열 (일명 플록싱된 DNA)은 Cre-매개된 재조합에 의해 절단된다. 공간 제어 (조직 특이적 또는 세포 특이적 프로모터 사용) 또는 시간 제어 (유도성 시스템 사용)를 사용하여 형질전환 및/또는 유전적으로 편집된 동물에서 Cre 발현을 제어하면 2개의 loxP 부위 사이의 DNA 절개가 제어된다. 한 가지 적용은 조건적 유전자 불활성화 (조건적 녹아웃)를 위한 것이다. 또 다른 접근법은 단백질 과발현을 위한 것으로, 프로모터 서열과 관심 DNA 사이에 플록싱된 정지 코돈이 삽입된다. 유전적으로 편집된 동물은 Cre가 발현될 때까지 이식유전자를 발현하지 않아 플록싱된 정지 코돈이 절개된다. 이 시스템은 B 림프구에서 조직-특이적 종양형성 및 제어된 항원 수용체 발현에 적용되었다. 유도성 Cre 재조합효소도 개발되었다. 유도성 Cre 재조합효소는 외인성 리간드의 투여에 의해서만 활성화된다. 유도성 Cre 재조합효소는 원래 Cre 재조합효소 및 특정 리간드-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. Cre 재조합효소의 기능적 활성은 융합 단백질에서 이러한 특정 도메인에 결합할 수 있는 외부 리간드에 따라 달라진다.
유도성 시스템의 제어하에 CD163 유전자를 포함하는 시험관내 세포, 생체내 세포, 또는 유전적으로 편집된 동물 예컨대 가축 동물이 사용될 수 있다. 동물의 염색체 변형은 게놈 또는 모자이크일 수 있다. 유도성 시스템은, 예를 들어, Tet-On, Tet-Off, Cre-lox, 및 Hif1 알파로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
벡터 및 핵산
다양한 핵산은 녹아웃 목적으로, 유전자의 불활성화를 위해, 유전자의 발현을 얻기 위해, 또는 다른 목적을 위해 세포에 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 핵산은 DNA, RNA, 및 핵산 유사체, 및 이중-가닥 또는 단일-가닥 (즉, 센스 또는 안티센스 단일 가닥)인 핵산을 포함한다. 핵산 유사체는 염기 모이어티, 당 모이어티, 또는 포스페이트 골격에서 변형되어 개선하다, 예를 들어, 핵산의 안정성, 혼성화, 또는 용해도를 개선할 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형은 데옥시티미딘에 대한 데옥시우리딘, 및 데옥시시티딘에 대한 5-메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-브로모-2'-옥시시티딘을 포함한다. 당 모이어티의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-O-알릴 당류를 형성하도록 리보오스 당의 2’하이드록실의 변형을 포함한다. 데옥시리보스 포스페이트 골격은 변형되어 모폴리노 핵산를 생성할 수 있고, 각각의 염기 모이어티은 6개의 원, 모폴리노 고리, 또는 펩타이드 핵산엥 연결되고, 상기 데옥시포스페이트 골격은 유사펩타이드 골격에 의해 대체되고 4개의 염기는 유지된다. Summerton 및 Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7(3):187; 및 Hyrup 등 (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5를 참고한다. 또한, 데옥시포스페이트 골격은, 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 골격, 포스포로아미다이트, 또는 알킬 포스포트리에스테르 골격으로 대체될 수 있다.
상기 표적 핵산 서열은 조절 영역 예컨대 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 영역은 돼지 조절 영역일 수 있거나 또는 다른 종으로부터의 것일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 작동가능하게 연결된 것은 표적 핵산의 전사를 허용하거나 촉진하는 방식으로 핵산 서열에 대한 조절 영역의 위치결정을 지칭한다.
임의의 유형의 프로모터는 표적 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 예는, 비제한적으로, 조직-특이적 프로모터, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 및 특정 자극에 반응하거나 반응하지 않는 프로모터를 포함한다. 적합한 조직 특이적 프로모터는 베타 세포에서 핵산 전사체의 우선적인 발현을 초래할 수 있고, 예를 들어, 인간 인슐린 프로모터를 포함한다. 다른 조직 특이적 프로모터는, 예를 들어, 간세포 또는 심장 조직에서 우선적인 발현을 초래할 수 있고 알부민 또는 알파-미오신 중쇄 프로모터, 각각을 포함할 수 있다. 상당한 조직 또는 시간적-특이성 없이 핵산 분자의 발현을 촉진하는 프로모터 (즉, 구성적 프로모터)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 베타-액틴 프로모터 예컨대 닭 베타-액틴 유전자 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, miniCAGs 프로모터, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH) 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터가 사용될 수 있을 뿐만 아니라 바이러스 프로모터 예컨대 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK) 프로모터, SV40 프로모터, 또는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 닭 베타 액틴 유전자 프로모터와 CMV 인핸서의 융합은 프로모터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Xu 등 (2001) Hum. Gene Ther. 12:563; 및 Kiwaki 등 (1996) Hum. Gene Ther. 7:821을 참고한다.
핵산 작제물에 유용할 수 있는 추가의 조절 영역은 비제한적으로, 폴리아데닐화 서열, 번역 조절 서열 (예를 들어, 내부 리보솜 entry 분절, IRES), 인핸서, 유도성 요소, 또는 인트론을 포함할 수 있다. 그와 같은 조절 영역은 전사, mRNA의 안정성, 번역 효율 등에 영향을 주어 발현을 증가시킬 수 있지만 필요하지 않을 수 있다. 그와 같은 조절 영역은 세포(들)에서 핵산의 최적의 발현을 얻기 위해 원하는 대로 핵산 작제물에 포함될 수 있다. 그러나 충분한 발현은 때때로 그와 같은 추가의 요소없이 수득될 수 있다.
신호 펩타이드 또는 선별 마커를 인코딩하는 핵산 작제물이 사용될 수 있다. 신호 펩타이드는, 인코딩된 폴리펩타이드가 특정 세포 위치 (예를 들어, 세포 표면)로 향하도록 사용될 수 있다. 선별 마커의 비-제한적인 예는 퓨로마이신, 강시클로비르, 아데노신 데아미나제 (ADA), 아미노글리코시드 인산전달효소 (neo, G418, APH), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 하이그로마이신-B-인산전달효소, 티미딘 키나제 (TK), 및 크산틴-구아닌 포스포리보실전달효소 (XGPRT)를 포함한다. 그와 같은 마커는 배양에서 안정한 형질전환체를 선택하는데 유용하다. 다른 선별 마커는 형광 폴리펩타이드, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 황색 형광 단백질을 포함한다.
선별 마커를 인코딩하는 서열은 재조합효소 예컨대 Cre 또는 Flp에 대한 인식 서열에 의해 측접될 수 있다. 예를 들어, 선별 마커는, 상기 선별 마커가 작제물로부터 절단될 수 있도록 loxP 인식 부위 (Cre 재조합효소에 의해 인식된 34-bp 인식 부위) 또는 FRT 인식 부위에 의해 측접될 수 있다. Cre/lox 기술의 검토를 위한 Orban, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:6861, 및 Brand 및 Dymecki, Dev. Cell (2004) 6:7을 참고한다. 선별 마커 유전자에 의해 차단된 Cre- 또는 Flp-활성화 이식유전자를 함유하는 트랜스포존은 또한 이식유전자의 조건적 발현을 갖는 동물을 얻기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 마커/이식유전자의 발현을 유도하는 프로모터는 편재성 존재하는 또는 조직-특이적일 수 있는데, 이는 F0 동물 (예를 들어, 돼지)에서 마커의 편재성 또는 조직-특이적 발현을 초래할 수 있다. 이식유전자의 조직 특이적 활성화는, 예를 들어, 마커-중단된 이식유전자를 편재적으로 발현시키는 돼지를 조직-특이적 방식으로 Cre 또는 Flp를 발현시키는 돼지와 교배시키거나, 또는 조직-특이적 방식으로 마커-중단된 이식유전자를 발현시키는 돼지를 Cre 또는 Flp 재조합효소를 편재적으로 발현시키는 돼지와 교배시킴으로써 달성될 수 있다. 이식유전자의 제어된 발현 또는 마커의 제어된 절개는 이식유전자의 발현을 허용한다.
외인성 핵산은 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 인코딩된 폴리펩타이드의 후속적인 조작을 촉진하기 위해 (예를 들어, 편재화 또는 검출을 촉진하기 위해) 설계된 "태그"를 인코딩하는 태그 서열을 포함한다. 태그 서열은, 인코딩된 태그가 폴리펩타이드의 카복실 또는 아미노 말단에 위치하도록 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열에서 삽입될 수 있다. 인코딩된 태그의 비-제한적인 예는 글루타티온 S-전달효소 (GST) 및 FLAGTMtag (Kodak, New Haven, Conn.)를 포함한다.
핵산 작제물은 SssI CpG 메틸화효소 (New England Biolabs, Ipswich, Mass.)를 사용하여 메틸화될 수 있다. 일반적으로, 핵산 작제물은 37℃에서 완충액에서 S-아데노실메티오닌 및 SssI CpG-메틸화효소와 함께 인큐베이션될 수 있다. 과메틸화는 37℃에서 1시간 동안 1 단위의 HinP1I 엔도뉴클레아제와 함께 작제물을 인큐베이팅하고 아가로스 겔 전기영동으로 분석함으로써 확인될 수 있다.
핵산 작제물은 다양한 기술을 사용하여, 예를 들어, 생식세포 예컨대 난모세포 또는 난황, 선조 세포, 성인 또는 배아 줄기 세포, 원시 생식세포, 신장 세포 예컨대 PK-15 세포, 소도세포, 베타 세포, 간 세포, 또는 섬유모세포 예컨대 진피 섬유모세포를 포함하는 임의의 유형의 배아, 태아, 또는 성인 동물 세포에 도입될 수 있다. 기술의 비-제한적인 예는 트랜스포존 시스템, 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 리포좀 또는 다른 비-바이러스 방법 예컨대, 핵산을 세포에 전달할 수 있는 전기천공, 미세주입, 또는 인산칼슘 침전의 사용을 포함한다.
트랜스포존 시스템에서, 핵산 작제물의 전사 단위, 즉, 외인성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 영역은 트랜스포존의 역반복 서열에 의해 측접된다. 예를 들어, 슬리핑 뷰티 (참고, 미국 특허 번호 6,613,752 및 U.S. 공개 번호 2005/0003542); 프로그 프린스(Frog Prince) (Miskey 등 (2003) Nucleic Acids Res. 31:6873); Tol2 (Kawakami (2007) Genome Biology 8(Suppl.1):S7; 미노스(Minos) (Pavlopoulos 등 (2007) 게놈 생물학 8(Suppl.1):S2); Hsmar1 (Miskey 등 (2007)) Mol Cell Biol. 27:4589); 및 패스포트(Passport)를 포함하는 몇 개의 트랜스포존 시스템은 마우스, 인간, 및 돼지 세포를 포함하는 세포에 핵산을 도입하기 위해 개발되었다. 슬리핑 뷰티 트랜스포존이 특히 유용하다. 전위효소는 단백질로서 전달될 수 있고, 외인성 핵산과 동일한 핵산 작제물 상에서 인코딩될 수 있고, 별도의 핵산 작제물 상에 도입될 수 있거나, 또는 mRNA (예를 들어, 시험관내-전사된 및 캡핑된 mRNA)로서 제공될 수 있다.
절연체 요소는 또한 외인성 핵산의 발현의 유지하기 위해 그리고 숙주 유전자의 원치않는 전자를 억제하기 위해 핵산 작제물에 포함될 수 있다. 예를 들어, U.S. 공개 번호 2004/0203158을 참고한다. 전형적으로, 절연체 요소는 전사 단위의 각 측면에 측접해 있고, 트랜스포존의 역반복 서열 내부에 있다. 절연체 요소의 비-제한적인 예는 매트릭스 부착 영역-(MAR) 유형 절연체 요소 및 경계-유형 절연체 요소를 포함한다. 예를 들어, U.S. 특허 번호 6,395,549, 5,731,178, 6,100,448, 및 5,610,053, 및 U.S. 공개 번호 2004/0203158를 참고한다.
핵산은 벡터에 편입될 수 있다. 벡터는 담체에서 표적 DNA로 이동하도록 설계된 임의의 특이적 DNA 분절을 포함하는 넓은 용어이다. 벡터는 발현 벡터, 또는 벡터 시스템로 칭할 수 있고, 이는 DNA를 게놈 또는 다른 표적화된 DNA 서열 예컨대 에피솜, 플라스미드, 또는 심지어 바이러스/파아지 DNA 분절에 삽입하는데 필요한 구성요소의 세트이다. 동물에서 유전자 전달을 위해 사용된 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 통합 파아지 바이러스), 및 비-바이러스 벡터 (예를 들어, 트랜스포존)와 같은 벡터 시스템은 2개의 기본 구성요소를 갖는다: 1) DNA (또는 cDNA로 역전사된 RNA)를 포함하는 벡터 및 2) 벡터 및 DNA 표적 서열 둘 모두를 인식하고 벡터를 표적 DNA 서열에 삽입하는 전위효소, 재조합효소, 또는 다른 인테그라제 효소. 벡터는 가장 자주 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 함유하고, 발현 조절 서열은 또 다른 DNA 서열 또는 mRNA, 각각의 전사 및/또는 번역을 제어하고 조절하는 DNA 서열이다.
많은 상이한 유형의 벡터가 알려져 있다. 예를 들어, 플라스미드 및 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 알려져 있다. 포유동물 발현 플라스미드는 전형적으로 복제의 기원, 적합한 프로모터 및 선택적 인핸서, 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 측접 비-전사된 서열을 갖는다. 벡터의 예는 다음을 포함한다: 플라스미드 (이는 또한 또 다른 유형의 벡터의 담체일 수 있음), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 (예를 들어, 변형된 HIV-1, SIV 또는 FIV), 레트로바이러스 (예를 들어, ASV, ALV 또는 MoMLV), 및 트랜스포존 (예를 들어, 슬리핑 뷰티, P-엘리먼트(element), Tol-2, 프로그 프린스(Frog Prince), piggyBac).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 핵산은 예를 들어, cDNA, 게놈 DNA, 합성 (예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA를 포함하는 RNA 및 DNA 둘 모두뿐만 아니라 자연 발생 및 화학적으로 변형된 핵산, 예를 들어, 합성 염기 또는 대안적인 골격을 지칭한다. 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥 (즉, 센스 또는 안티센스 단일 가닥)일 수 있다.
본 발명을 상세히 기재하였으므로, 첨부된 청구범위에서 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 수정 및 변경이 가능함이 명백할 것이다.
실시예
다음의 비제한적인 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공된다.
실시예 1: 시험관내 유도된 난모세포 및 배아로부터 유전적으로 조작된 돼지를 생산하기 위한 CRISPR/Cas9 시스템의 사용
호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease), 예컨대 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)/CRISPR 관련(Cas9) 시스템 내의 구성요소를 설명하는 최근 보고서들은 돼지의 유전공학(GE)이 이제 더 효율적일 수 있음을 시사한다. 표적화된 호밍 엔도뉴클레아제는 게놈의 특정 위치에서 이중 가닥 절단(double-strand break, DSB)을 유도할 수 있고, 공여체 DNA가 제공되면 비상동 말단 연결(nonhomologous end joining, NHEJ)을 통해 또는 상동 재조합(homologous recombination, HR)의 자극을 통해 무작위 돌연변이를 일으킬 수 있다. HR을 통한 게놈의 표적화된 변형은 공여체 DNA가 표적화된 뉴클레아제와 함께 제공되면 호밍 엔도뉴클레아제를 이용하여 달성될 수 있다. 체세포에 특정 변형을 도입한 후, 이들 세포는 SCNT를 통해 다양한 목적의 GE 돼지를 생산하는 데 사용되었다. 따라서, 호밍 엔도뉴클레아제는 GE 돼지의 생성에서 유용한 도구이다. 상이한 호밍 엔도뉴클레아제 중에서, 방어 메커니즘으로서 사용되는 원핵생물로부터 개조된 CRISPR/Cas9 시스템이 효과적인 접근법인 것으로 보인다. 자연에서, Cas9 시스템은 3가지 구성요소, 즉 표적 서열에 상보적인 영역을 함유하는 RNA(~20개의 염기)(시스-억제된 RNA[crRNA]), crRNA에 상보적인 영역을 함유하는 RNA(트랜스-활성화 crRNA[tracrRNA]), 및 이 복합체에서의 효소 단백질 구성요소인 Cas9를 필요로 한다. 염기쌍을 형성한 crRNA 및 tracrRNA의 역할을 수행하기 위해 단일 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)가 제작될 수 있다. gRNA/단백질 복합체는 게놈을 스캔하여 crRNA/gRNA에 상보적인 영역에서 DSB를 촉매할 수 있다. 다른 설계된 뉴클레아제와 달리, 관심 유전자를 표적화하는 데 필요한 시약을 제작하기 위해서는 짧은 올리고머만이 설계될 필요가 있는 반면, ZFN 및 TALEN을 조립하기 위해서는 일련의 클로닝 단계가 필요하다.
유전자 파괴를 위한 현재의 표준 방법과 달리, 설계된 뉴클레아제의 사용은 GE를 위한 출발 물질로서 접합자(zygote)를 사용할 기회를 제공한다. 가축에서의 유전자 파괴를 위한 표준 방법은 배양된 세포에서의 HR 및 체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT)에 의한 배아의 후속적인 재구성을 포함한다. SCNT를 통해 생산된 복제 동물은 때때로 발달 결함의 징후를 나타내기 때문에, 창시자(founder) 동물이 실험에 사용되는 경우 발생할 수 있는 교란 SCNT 이상 및 표현형을 피하기 위해 SCNT/GE 창시자의 자손이 일반적으로 연구에 사용된다. 설치류와 비교하여 돼지의 더 긴 임신 기간 및 더 높은 사육 비용을 고려할 때, 브리딩 필요성 감소에 대한 시간 및 비용 이점이 있다. 최근 보고는 ZFN 및 TALEN을 돼지 접합자에 직접 주입하는 것이 내인성 유전자를 파괴하여 원하는 돌연변이를 갖는 새끼 돼지를 생산할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 새끼 돼지의 약 10%만이 표적 유전자의 이중대립유전자 변형을 나타내었고, 일부는 모자이크 유전자형을 나타내었다. 최근 기사는 CRISPR/Cas9 시스템이 발달 배아에서 돌연변이를 유도하고, ZFN 또는 TALEN보다 더 높은 효율로 GE 돼지를 생산할 수 있음을 입증하였다. 그러나, CRISPR/Cas9 시스템으로부터 생산된 GE 돼지도 모자이크 유전자형을 가지고 있었다. 또한, 상기 언급된 모든 연구들은 실험을 위해 생체내 유도된 접합자를 사용하였고, 이는 충분한 수의 접합자를 얻기 위해 집중적인 노동과 수많은 암퇘지를 필요로 한다.
본 실시예는 시험관내 유도된 접합자의 주입 및 체세포의 변형 후 SCNT를 통한 GE 돼지 생성에서 CRISPR/ Cas9 시스템을 사용하는 효율적인 접근법을 설명한다. 2개의 내인성 유전자(CD163 및 CD1D) 및 1개의 이식유전자(eGFP)를 표적화하였고, 시험관내 유도된 난모세포 또는 접합자만을 각각 SCNT 또는 RNA 주입에 사용하였다. CD163은 양돈 산업에 상당한 경제적 손실을 초래하는 것으로 알려진 바이러스인 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스에 의한 생산적 감염에 필요한 것으로 보인다. CD1D는 비고전적인 주조직 적합성 복합 단백질로 간주되며, 불변 자연 살해 T 세포에 지질 항원을 제시하는 데 관여한다. 이들 유전자가 결핍된 돼지를 농업 및 생물의학을 위한 모델로 설계하였다. eGFP 이식유전자를 예비 개념증명 실험 및 방법의 최적화를 위한 표적으로서 사용하였다.
물질 및 방법
화학 및 시약. 달리 언급하지 않는 한, 본 연구에 사용된 모든 화학물질은 시그마(Sigma)로부터 구입하였다.
특정 CRISPR를 구축하기 위한 gRNA의 설계
CRISPR이 야생형 CD163 내에서는 DSB를 초래하지만 도메인 스왑 표적화 벡터에서는 DSB를 초래하지 않도록 가이드 RNA를 야생형 CD163에 고유하고 도메인 스왑(swap) 표적화 벡터(하기 기재됨)에는 존재하지 않는 CD163의 엑손 7 내의 영역에 대해 설계하였다. 표적화 벡터가 S. 파이오제네스(Spy) 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, PAM)를 변경하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 도입할 위치는 단지 4개였다. 다음을 포함하는 4개의 모든 표적을 선택하였다:
(서열번호:1) GGAAACCCAGGCTGGTTGGAgGG (CRISPR 10),
(서열번호:2) GGAACTACAGTGCGGCACTGtGG (CRISPR 131),
(서열번호:3) CAGTAGCACCCCGCCCTGACgGG (CRISPR 256) 및
(서열번호:4) TGTAGCCACAGCAGGGACGTcGG (CRISPR 282).
PAM은 각각의 gRNA에서 굵은 글꼴에 의해 식별될 수 있다.
CD1D 돌연변이의 경우, CRISPR 표적에 대한 검색은 일차 전사체의 처음 1000 bp 내의 코딩 가닥에 임의로 제한되었다. 그러나, RepeatMasker[26]("돼지" 반복 라이브러리)는 일차 전사체의 염기 943에서 시작하는 반복 요소를 확인하였다. 이후, CRISPR 표적에 대한 검색은 일차 전사체의 처음 942 bp로 제한되었다. 마지막 Spy PAM이 염기 873에 위치하므로, 검색은 일차 전사체의 처음 873 bp로 추가로 제한되었다. 첫 번째 표적(CRISPR 4800)은 일차 전사체 내의 염기 42에 위치한 시작 코돈과 중복되기 때문에 선택되었다(CCAGCCTCGCCCAGCGACATgGG(서열번호:5)). 2개의 추가의 표적(CRISPR 5620 및 5626)은 임의로 선택된 영역 내의 첫 번째 선택에 가장 멀기 때문에 선택되었다(CTTTCATTTATCTGAACTCAgGG(서열번호:6)) 및 TTATCTGAACTCAGGGTCCCcGG(서열번호:7)). 이들 표적은 중복된다. 시작 코돈과 관련하여, 가장 근접한 Spy PAM은 시각적 평가에 의해 결정된 바와 같이 광범위하게 동종중합체성 서열을 함유하는 단순 서열에 위치하였다. 4번째 표적(CRISPR 5350)은 첫 번째 표적 선택과 관련하여 광범위한 동종중합체성 영역을 함유하지 않는 가장 근접한 표적이었기 때문에 선택되었다(CAGCTGCAGCATATATTTAAgGG(서열번호:8)). 설계된 crRNA의 특이성을 GenBank에서 유사한 돼지 서열을 검색함으로써 확인하였다. 올리고뉴클레오타이드(표 1)를 어닐링하고 2개의 발현 카세트인 인간 코돈 최적화된 S. 파이오제네스(hSpy) Cas9 및 키메라 가이드 RNA를 함유하는 p330X 벡터 내로 클로닝하였다. P330X을 Zhang 실험실 프로토콜(http://www.addgene.org/crispr/zhang/)에 따라 BbsI(New England Biolabs)로 분해하였다.
eGFP를 표적화하기 위해, eGFP 코딩 서열을 표적화하는 2개의 특이적 gRNA를 eGFP 시작 코돈의 처음 60 bp 내에서 설계하였다. eGFP1 및 eGFP2 gRNA는 안티센스 가닥 상에 있었고, eGFP1은 시작 코돈을 직접 표적화하였다. eGFP1 gRNA 서열은 CTCCTCGCCCTTGCTCACCAtGG(서열번호:9)였고, eGFP2 gRNA 서열은 GACCAGGATGGGCACCACCCcGG(서열번호:10)였다.
CD163 및 CD1D 유전자에 대한 공여체 DNA의 합성
표적화 벡터 및 형질감염된 세포주 사이의 동종 일치(isogenic match)를 보장하기 위해 이후의 형질감염에 사용될 태아 섬유모세포로부터 단리된 DNA로부터 PCR에 의해 돼지 CD163 및 CD1D 모두를 증폭시켰다. 간략하게, 정방향 프라미어 CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT(서열번호:11), 및 역방향 프라이머 TATTTCTCTCACATGGCCAGTC(서열번호:12)를 사용하는 LA taq(Clontech)를 사용하여 CD163의 9538 bp 단편을 증폭시켰다. 단편을 DNA 서열 검증하고, 도메인-스왑 표적화 벡터를 구축하는 데 사용하였다(도 1). 이 벡터는 엑손 11로부터의 인간 CD163L과 동일한 아미노산 서열을 코딩하도록 엑손 7에 33개의 점 돌연변이를 포함하였다. 대체 엑손은 315 bp였다. 또한, 후속 인트론을 Cre-재조합효소(Cre)로 제거할 수 있는 선택 마커 유전자를 포함하고 보유된 loxP 부위를 가질 때 정상적인 스플라이싱을 이전에 입증한 변형된 마이오스타틴 인트론 B로 대체하였다(Wells, 비공개된 결과). 작제물의 긴 아암(arm)은 3469 bp였고, 도메인 스왑 DS 엑손을 포함하였다. 짧은 아암은 1578 bp였고, 엑손 7 및 8을 포함하였다(도 1, 패널 B). 이 플라스미드는 첫 번째 형질감염 실험에서 엑손 7의 코딩 영역을 대체하기 위해 사용되었고, 선택 마커(G418)를 통한 표적화 사건의 선택을 허용하였다. 표적화가 발생하였다면, 마커는 Cre-재조합효소에 의해 결실될 수 있다. 이후, Cre 결실될 수 없는 Neo로 파괴된 SIGLEC1 유전자를 이미 함유한 세포주와 함께 사용하기 위해 CD163 DS-표적화 벡터를 변형하였다. 이 표적화 벡터에서, Neo 카세트, loxP 및 마이오스타틴 인트론 B가 제거되고, DS 엑손만이 WT 긴 및 짧은 아암에 남았다(도 1, 패널 C).
돼지 CD1D에 대한 게놈 서열을 정방향 프라미어 CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT(서열번호:13) 및 역방향 프라이머 GACTGGCCATGTGAGAGAAATA(서열번호:14)를 사용하여 LA taq로 증폭시켜, 8729 bp 단편을 생성하였다. 단편을 DNA 시퀀싱하고, 도 2에 표시된 표적화 벡터를 구축하는 데 사용하였다. Neo 카세트는 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터의 제어하에 있으며 선택을 위해 도입된 loxP 서열의 측면에 있다. 작제물의 긴 아암은 4832 bp였고, 짧은 아암은 3563 bp였으며, 엑손 6 및 7을 포함하였다. 성공적인 HR이 발생하면, 엑손 3, 4, 및 5가 제거되어 Neo 카세트로 대체될 것이다. NHEJ 복구가 부정확하게 발생하면, 엑손 3은 파괴될 것이다.
태아 섬유모세포 수집
세포주를 생성하기 위해 돼지 태아 조직을 임신 35일에 수집하였다. 2개의 야생형(WT) 수컷 및 암컷 태아 섬유모세포주를 라지 화이트 국내 잡종으로부터 확립하였다. Neo 카세트(SIGLEC1-/- 유전학)를 함유하도록 이전에 변형된 수컷 및 암컷 태아 섬유모세포를 또한 이들 연구에 사용하였다. 태아 섬유모세포를 약간 변형하여 기재된 바와 같이 수집하였다. 각각의 태아로부터의 다진 조직을 38.5℃에서 5시간 동안 20 mL의 소화 배지(200 units/ml 콜라겐분해효소 및 25 Kunitz units/ml DNAseI이 보충된 L-글루타민 및 1 g/L D-글루코스[Cellgro]를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지[DMEM])에서 소화시켰다. 소화 후, 태아 섬유모세포를 세척하고 DMEM, 15% 우태아 혈청(FBS), 및 40 μg/ml 겐타마이신과 함께 배양하였다. 밤새 배양 후, 세포를 트립신화하고 10% 디메틸 설폭사이드를 갖는 FBS 중의 분취량으로 -80℃에서 냉동하고 액체 질소에 보관하였다.
세포 형질감염 및 유전자형 분석
형질감염 조건은 본질적으로 이전에 보고된 바와 같았다. 공여체 DNA는 항상 다양한 양의 CRISPR/Cas9 플라스미드(하기에 열거됨)와 함께 1 μg의 일정량으로 사용하였다. 공여체 DNA를 형질감염 전에 MLUI(CD163)(NEB) 또는 AFLII(CD1D)(NEB)로 선형화하였다. 확립된 세포주의 성별을 형질감염 전에 이전에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 결정하였다. 수컷 및 암컷 세포주를 형질감염시키고, 게놈 변형 데이터를 형질감염 사이에 함께 분석하였다. 유사한 계대 횟수(2-4)의 태아 섬유모세포주를 2일 동안 배양하고, 15% FBS, 2.5 ng/ml 염기성 섬유모세포 성장 인자, 및 10 mg/ml 겐타마이신이 보충된 L-글루타민 및 1 g/L D-글루코스(Cellgro)를 함유하는 DMEM에서 75%-85% 컨플루언시(confluency)까지 성장시켰다. 섬유모세포를 인산 완충 식염수(PBS, Life Technologies)로 세척하고, 트립신화하였다. 세포가 탈착되자마자, 세포를 전기천공 배지(75% cytosalt[120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4, pH 7.6, 5 Mm MgCl2]) 및 25% Opti-MEM(LifeTechnologies)으로 헹구었다. 세포 농도를 혈구계를 사용하여 정량화하였다. 세포를 600 X g에서 5분 동안 펠렛화하고, 전기천공 배지에 1 X 106의 농도로 재현탁시켰다. 각각의 전기천공은 250 V에서 BTX ECM 2001을 통해 투여된 3개의(1 msec) 방형파 펄스와 함께 2 mm 갭 큐벳 내의 200 μl의 세포를 사용하였다. 전기천공 후, 세포를 상기 기재된 DMEM에 재현탁시켰다. 선택을 위해, 600 μg/ml G418(Life Technologies)을 형질감염 24시간 후에 첨가하고, 배지를 7일째에 교체하였다. 콜로니를 형질감염 후 14일째에 픽킹(picking)하였다. G418 선별이 사용된 경우 태아 섬유모세포를 10,000 세포/플레이트로 플레이팅하고, G418 선별이 사용되지 않은 경우 50 세포/플레이트로 플레이팅하였다. 오토클레이브된 진공 그리스(grease)에 의해 각각의 콜로니 주위에 밀봉된 10 mm 오토클레이브된 클로닝 실린더를 적용함으로써 태아 섬유모세포 콜로니를 수집하였다. 콜로니를 PBS로 헹구고, 트립신을 통해 채취한 다음; DMEM 배양 배지에 재현탁시켰다. 재현탁된 콜로니의 일부(1/3)를 96-웰 PCR 플레이트로 옮기고, 나머지(2/3) 세포를 24-웰 플레이트의 웰에서 배양하였다. 세포 펠렛을 6 μl의 세포용해 버퍼(40 mM 트리스, pH 8.9, 0.9% 트리톤 X-100, 0.4 mg/ml 프로테이나제 K[NEB])에 재현탁시키고, 세포 용해를 위해 65℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 85℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 프로테이나제 K를 불활성화시켰다.
DS 및 큰 및 작은 결실에 대한 PCR 스크리닝
HR 지시 복구(HR-directed repair)의 검출. 장거리(Long-range) PCR을 사용하여 CD163 또는 CD1D 상의 돌연변이를 확인하였다. 3개의 상이한 PCR 분석을 사용하여 HR 사건을 확인하였다: 공여체 DNA 내의 CD163 또는 CD1D 서열부터 좌측 또는 우측의 내인성 CD163 또는 CD1D 서열에 이르는 영역의 PCR 증폭 및 설계된 공여체 DNA를 포함하는 CD163 또는 CD1D의 큰 영역을 증폭하는 장거리 PCR. 외인성 Neo 서열의 부가로 인해 발생하는 1.8 kb(CD1D) 또는 3.5 kb(CD163)의 PCR 산물의 크기 증가는 유전자의 HR 지시 복구의 증거로 간주되었다. 모든 PCR 조건은 95℃에서 2분 간의 초기 변성 후, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 및 68℃에서 7-10분의 33 사이클을 포함하였다. LA taq를 제조사의 권장에 따라 모든 분석에 사용하였다. 프라이머가 표 2에 나타나 있다.
작은 결실 분석( NHEJ ). 작은 결실을 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 도입된 돌출된 절단 부위의 측면에 있는 CD163 또는 CD1D를 PCR 증폭함으로써 결정하였다. 앰플리콘의 크기는 각각 CD163 및 CD1D의 경우 435 bp 및 1244 bp였다. 배아 및 태아 섬유모세포 모두로부터의 용해물을 LA taq로 PCR 증폭하였다. 분석의 PCR 조건은 95℃에서 2분 간의 초기 변성 후, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 33 사이클이었다. 형질감염된 세포의 유전자형 분석을 위해, 아가로스 겔 전기영동에 의해 PCR 앰플리콘을 분리함으로써 삽입 및 결실(INDEL)을 확인하였다. 배아 유전자형 분석을 위해, 생성된 PCR 산물을 이후에 DNA 시퀀싱하여 PCR에 사용된 정방향 프라미어를 사용하여 작은 결실을 확인하였다. 프라이머 정보가 표 3에 나타나 있다.
체세포 핵 이식(SCNT)
SCNT 배아를 생산하기 위해, 지역 도축장으로부터의 암퇘지(sow) 유래의 난모세포(ART, Inc.) 또는 어린 암퇘지(gilt) 유래의 난모세포를 사용하였다. 암퇘지 유래의 난모세포를 성숙 배지(2.9 mM Hepes, 5 μg/ml 인슐린, 10 ng/ml 표피 성장 인자[EGF], 0.5 μg/ml 돼지 난포 자극 호르몬[p-FSH], 0.91 mM 피루베이트, 0.5 mM 시스테인, 10% 돼지 난포액, 및 25 ng/ml 겐타마이신을 갖는 TCM-199)에 밤새 두고, 24시간 후에 새로운 배지로 옮겼다. 40-42시간의 성숙 후, 0.1% 히알루로니다제의 존재하에 볼텍싱하여 난모세포로부터 난구 세포를 제거하였다. 어린 암퇘지 유래의 난모세포를 체외 수정(IVF)을 위해 아래에 기재된 바와 같이 성숙시켰다. 조작 동안, 난모세포를 7.0 μg/ml 사이토칼라신 B가 보충된 조작 배지(0.6 mM NaHCO3, 2.9 mM Hepes, 30 mM NaCl, 10 ng/ml 겐타마이신, 및 3 mg/ml BSA를 갖는 TCM-199[Life Technologies], 305 mOsm의 삼투질농도를 가짐)에 넣었다. 중기 II 판(metaphase II plate)을 함유할 것으로 추정되는 인접한 세포질의 일부와 함께 극체를 제거하고, 공여체 세포를 얇은 유리 모세관을 사용하여 난황주위공간(perivitelline space)에 넣었다. 이후, 재구성된 배아를 BTX 전기 세포 조작기(Harvard Apparatus)를 사용하여 1.2 kV/cm에서 30초 동안 2개의 DC 펄스(1초 간격)로 융합 배지(0.3 M 만니톨, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 및 0.5 mM Hepes)에서 융합하였다. 융합 후, 융합된 배아를 어두운 곳에서 10분 동안 200 μM 티메로살 및 30분 동안 8 mM 디티오트레이톨을 이용하여 완전히 활성화시켰다. 이후, 이전에 기재된 바와 같이 배아를 히스톤 탈아세틸화효소 억제제인 0.5 μM 스크립타이드(Scriptaid, S7817; Sigma-Aldrich)를 갖는 변형된 돼지 접합자 배지 PZM3-MU1에서 14-16시간 동안 인큐베이션하였다.
체외 수정(IVF)
IVF를 위해, 사춘기전 어린 암퇘지의 난소를 도살장(Farmland Foods Inc.)으로부터 수득하였다. 미성숙한 난모세포를 10 ml 주사기에 부착된 18-게이지 피하 주사침을 사용하여 중간 크기(3-6 mm) 난포로부터 흡인하였다. 이후, 고르게 어두운 세포질을 갖는 난모세포 및 온전한 주위 난구 세포를 성숙을 위해 선택하였다. 약 50개의 난구 난모세포 복합체를 가습된 공기 중에서 38.5℃, 5% CO2에서 42-44시간 동안 500 μl의 성숙 배지인 3.05 mM 글루코스, 0.91 mM 피루브산 나트륨, 0.57 mM 시스테인, 10 ng/ml EGF, 0.5 μg/ml 황체형성 호르몬(LH), 0.5 μg/ml FSH, 10 ng/ml 겐타마이신(APP Pharm), 및 0.1% 폴리비닐 알코올을 갖는 TCM-199(Invitrogen)를 함유하는 웰에 넣었다. 성숙 말기에, 0.1% 히알루로니다제의 존재하에 3분 동안 볼텍싱하여 난모세포로부터 주위 난구 세포를 제거하였다. 이후, 시험관내 성숙된 난모세포를 25-30개의 난모세포의 그룹에서 IVF 배지(113.1 mM NaCl, 3 mM KCl, 7.5 mM CaCl2, 11 mM 글루코스, 20 mM Tris, 2 mM 카페인, 5 mM 피루브산 나트륨, 및 2 mg/ml 소 혈청 알부민[BSA]을 함유하는 변형된 트리스 완충 배지)의 50 μl 액적에 넣었다. 1개의 100 μl 냉동된 정액 펠렛을 0.1% BSA가 보충된 3 mL의 Dulbecco PBS에서 해동시켰다. 냉동된 WT 또는 신선한 eGFP 정액을 원심분리에 의해 650 3 g에서 20분 동안 60% Percoll에서 그리고 10분 동안 변형된 트리스 완충 배지에서 세척하였다. 일부 경우에, 이전에 기재된 eGFP 이식유전자에 대해 이종접합성인 새롭게 수집된 정액을 PBS에서 3회 세척하였다. 이후, 정액 펠렛을 IVF 배지를 이용하여 0.5 X 106 세포/ml로 재현탁시켰다. 50 마이크로리터의 정액 현탁액을 난모세포를 갖는 액적에 도입하였다. 배우자(gamete)를 공기 중의 5% CO2의 분위기에서 38.5℃에서 5시간 동안 공동배양하였다. 수정 후, 배아를 공기 중의 38.5℃ 및 5% CO2에서 PZM3-MU1에서 인큐베이션하였다.
배아 이식
GE CD163 또는 CD1D 돼지를 생산하기 위해 생성된 배아를 첫 번째 발정기 후 1일(SCNT) 또는 6일(주입된 접합자)에 대리모(surrogate) 내로 이식하였다. 6일째 이식을 위해, 접합자를 10 ng/ml ps48(Stemgent, Inc.)의 존재하에 PZM3-MU1에서 추가로 5일 동안 배양하였다. 배아를 대리모의 난관의 팽대부-협부 접합부(ampullary-isthmic junction) 내로 수술로 이식하였다.
CRISPR/Cas9 시스템을 위한 RNA의 시험관내 합성
시험관내 전사를 위한 주형 DNA를 PCR을 사용하여 증폭하였다(표 4). 세포 형질감염 실험에 사용된 CRISPR/Cas9 플라스미드를 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 접합자에서 Cas9를 발현하기 위해, mMESSAGE mMACHINE Ultra 키트(Ambion)를 사용하여 Cas9의 mRNA를 생산하였다. 이후, 폴리 A 신호를 폴리(A) 테일링 키트(Ambion)를 사용하여 Cas9 mRNA에 부가하였다. CRISPR 가이드 RNA를 MEGAshortscript(Ambion)에 의해 생산하였다. 합성된 RNA의 품질을 1.5% 아가로스 겔 상에서 시각화한 다음, 10 ng/μl의 최종 농도(gRNA 및 Cas9 모두)로 희석하고 3 μl 분취액으로 분배하였다.
접합자에서 설계된 CRISPR/Cas9 시스템의 미세주입
Cas9 및 gRNA를 코딩하는 메신저 RNA를 FemtoJet 미세주입기(에펜도르프)를 사용하여 수정후 14시간에 수정된 난모세포(추정 접합자)의 세포질 내로 주입하였다. 미세주입을 니콘 도립 현미경(Nikon Corporation; Tokyo, Japan)의 가열된 재물대(stage) 상에서 조작 배지에서 수행하였다. 이후, 주입된 접합자를 추가 사용 때까지 10 ng/ml ps48을 갖는 PZM3-MU1 내로 옮겼다.
통계 분석
변형된 게놈을 갖는 콜로니의 수를 1로 분류하고, 게놈이 변형되지 않은 콜로니를 0으로 분류하였다. 차이를 PROC GLM(SAS)을 사용하여 결정하였고, 0.05의 P-값은 유의미한 것으로 간주하였다. 평균은 최소 제곱 평균으로서 계산하였다. 데이터는 수치 평균 ± SEM으로 표시된다.
결과
체세포에서 CD163 및 CD1D의 CRISPR/Cas9 매개 녹아웃
CD163을 표적화하는 4개의 상이한 CRISPR 플라스미드(가이드 10, 131, 256, 및 282)의 효율을 2 μg/μl의 공여체 DNA의 양으로 시험하였다(표 5). CRISPR 282는 CRISPR 10 및 256 처리보다 유의하게 더 많은 평균적인 콜로니 형성을 초래하였다(P < 0.05). 상기 기재된 장거리 PCR 분석으로부터, 본래 의도된 HR을 통한 DS 대신에 503 bp부터 1506 bp 범위의 큰 결실이 발견되었다(도 3, 패널 A). 이것은 예상되지 않았는데, 다른 DNA-편집 시스템에 대한 이전의 보고들이 돼지에서 ZFN을 사용하여 6-333 bp의 훨씬 더 작은 결실을 보여주었기 때문이다. CRISPR 10 및 4개의 모든 CRISPR의 혼합물은 CRISPR 256 및 282보다 변형된 게놈을 갖는 더 많은 수의 콜로니를 초래하였다(표 5, P < 0.002). Neo를 함유하지만 CD163과 상동성이 없는 플라스미드 및 CRISPR 10을 이용한 형질감염은 큰 결실을 나타내는 콜로니를 초래하지 않았다. 흥미롭게도, 공여체 DNA가 임의의 CRISPR 없이 도입되었을 때 1개의 단일대립유전자 결실이 또한 검출되었다. 형질감염된 체세포에서 아가로스 겔 상에서 검출될 수 없는 시퀀싱에 의한 임의의 잠재적인 작은 결실이 스크리닝되지 않았기 때문에 이 분석은 돌연변이율의 과소평가를 나타낼 가능성이 높다.
초기 목표는 CD163에 대해 HR에 의해 도메인 스왑(DS)-표적화 사건을 얻는 것이었지만, CRISPR은 CD163을 표적화하는 효율을 증가시키지 않았다. 이 표적화 벡터의 다양한 조합이 전통적인 형질감염에 의한 HR에 의해 CD163을 변형하는 데 사용되었고 3399개의 콜로니를 스크리닝한 후 0개의 표적화 사건을 초래하였음에 유의해야 한다(Whitworth and Prather, 미공개 결과). 공여체 DNA로서 CRISPR 10 및 DS-표적화 벡터로 형질감염하여 도입하고자 한 33개의 모든 돌연변이를 함유한 HR로부터 비롯된 전체 DS를 갖는 2마리의 돼지를 수득하였다.
다음으로, 약물 선택 없이 CRISPR/Cas9 유도된 돌연변이의 효율을 시험하였다. 이 연구에 사용된 태아 섬유모세포주는 이미 Neo 내성 카세트 및 SIGLEC1의 녹아웃의 통합을 가지고 있었다. CRISPR/Cas9 및 공여체 DNA의 비율이 게놈 변형을 증가시키거나 고농도에서 독성 효과를 초래하는지 여부를 또한 시험하였다. CRISPR 131은 이전 실험에서 많은 수의 총 콜로니 및 변형된 게놈을 갖는 콜로니의 백분율 증가를 초래하였기 때문에 이 시험에 선택하였다. CRISPR 131 DNA의 양을 3:1에서 20:1로 증가시키는 것은 태아 섬유모세포 생존성에 유의미한 영향을 미치지 않았다. NHEJ에 의해 변형된 게놈을 갖는 콜로니의 백분율은 다양한 CRISPR 농도 사이에서 유의미하게 상이하지 않았지만, 10:1 비율에서 가장 높은 수의 NHEJ를 가지고 있었다(표 6, P = 0.33). CRISPR DNA 대 공여체 DNA(20:1)의 가장 높은 비율에서도, HR은 관찰되지 않았다.
이러한 경험에 기초하여, 체세포에서 CD1D의 표적화된 파괴를 시도하였다. 4개의 상이한 CRISPR을 설계하고 수컷 및 암컷 세포 모두에서 시험하였다. CD1D의 변형은 적용된 CRISPR 중 3개로부터 검출될 수 있지만, CRISPR 5350의 사용은 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출될 정도로 충분히 큰 결실을 갖는 CD1D의 변형을 초래하지 않았다(표 7). 흥미롭게도, 공여체 DNA가 제공되었음에도 불구하고 HR을 통해 유전적 변화를 얻지 못하였다. 그러나, CD163 녹아웃 실험과 유사한 큰 결실이 관찰되었다(도 3, 패널 B). CRISPR/Cas9가 공여체 DNA와 함께 사용되지 않았을 때 큰 결실을 갖는 CD1D의 표적화된 변형이 검출되지 않았다. CRISPR/Cas9 가이드된 표적화로부터의 CD1D의 변형은 각각 세포의 수컷 및 암컷 콜로니에서 4/121 및 3/28이었다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출가능한 INDEL만이 형질감염 데이터에 포함되었다.
GE 세포를 사용한 SCNT를 통한 CD163 및 CD1D 돼지의 생산
CD163 또는 CD1D의 변형을 나타내는 세포를 SCNT에 사용하여 CD163 및 CD1D 녹아웃 돼지를 생산하였다(도 3). 수령체 어린 암퇘지 내로의 7개의 배아 이식(CD163 표 8), 6개의 배아 이식(CD163-Neo 없음), 및 5개의 배아 이식(CD1D)을 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 형질감염된 수컷 및 암컷 태아 섬유모세포로부터의 SCNT 배아를 이용하여 수행하였다. 수령체 어린 암퇘지 중 6마리(CD163), 2마리(CD163-Neo 없음), 및 4마리(CD1D)(표 9)는 출산일까지 임신을 유지하여 각각 85.7%. 33.3%, 및 80%의 임신율을 유지하였다. CD163 수령체 중에서, 5마리는 제왕절개에 의해 건강한 새끼 돼지를 출산하였다. 1마리(O044)는 자연분만하였다. 한배새끼 수는 1마리 내지 8마리였다. 4마리의 돼지는 출생 후 성장 장애 때문에 안락사되었다. 1마리의 새끼 돼지는 심한 구개파열(cleft palate)로 인해 안락사되었다. 나머지 모든 새끼 돼지는 건강해 보인다(도 3, 패널 C). 도 3, 패널 B에 기재된 CRISPR 10 및 공여체 DNA로 형질감염된 태아 섬유모세포로부터 생성된 수컷 새끼 돼지의 2개의 한배새끼는 CRISPR 10에 인접한 엑손 7에서 30 bp 결실 및 이전 인트론에서 추가의 1476 bp 결실을 가지고 있었고, 따라서 CD163의 인트론 6/엑손 7 접합부를 제거하였다(도 3, 패널 E). 유전자형 및 예측된 번역이 표 10에 요약되어 있다. 1마리의 수컷 새끼 돼지 및 1개의 암컷 한배새끼(4마리의 새끼 돼지)를 이전에 변형된 SIGLEC1 세포의 CD163-Neo 없음 형질감염으로부터 수득하였다. 5마리의 모든 새끼 돼지는 SIGLEC1 및 CD163에 대한 이중 녹아웃이었다. 수컷 새끼 돼지는 하나의 대립유전자 상의 엑손 7에 28 bp 결실을 갖고 엑손 7의 부분적인 결실 및 엑손 8의 완전한 결실 및 진행하는 인트론을 포함하는 다른 대립유전자 상에 1387 bp 결실을 갖는 CD163의 이중대립유전자 변형을 가지고 있었고, 따라서 인트론 엑손 접합부를 제거하였다. 암컷 새끼 돼지는 하나의 대립유전자 상에 11 bp 삽입과 함께 1382 bp 결실 및 다른 대립유전자 상에 CD163의 1720 bp 결실을 포함하는, CD163의 이중대립유전자 돌연변이를 가지고 있었다. CD163 변형 및 예측된 번역의 요약은 표 10에서 발견될 수 있다. CD1D 변형 및 CRISPR 변형에 의해 예측된 번역은 표 11에서 발견될 수 있다. 간략하게, 1개의 암컷 및 2개의 수컷 한배새끼가 태어나 13마리의 새끼 돼지를 생성하였다. 1마리의 새끼 돼지는 출생 직후 사망하였다. 13마리의 새끼 돼지 중 12마리는 CD1D의 이중대립유전자 또는 동종접합 결실을 함유하였다(도 3, 패널 F). 1마리의 새끼 돼지는 WT였다.
돼지 접합자에서 CRISPR / Cas9 시스템의 효율
CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 체세포에서의 CD163 및 CD1D의 표적화된 파괴에 기초하여, 이 접근법을 돼지 배아발생에 적용하였다. 먼저, 발달하는 배아에서 CRISPR/Cas9 시스템의 유효성을 시험하였다. eGFP를 표적화하는 CRISPR/Cas9 시스템을 eGFP 이식유전자에 대해 이종접합성인 수퇘지의 정액으로 수정된 접합자 내로 도입하였다. 주입 후, eGFP를 발현하는 후속 배아를 모니터링하였다. 다양한 농도의 CRISPR/Cas9 시스템을 시험하였고, 전달된 CRISPR/Cas9 시스템의 세포독성이 관찰되었다(도 4, 패널 A). CRISPR/Cas9 주입 후 배아 발달은 대조군과 비교하여 더 낮았다. 그러나, CRISPR/Cas9 주입된 그룹에서 eGFP 발현을 갖는 배아가 발견되지 않았기 때문에 조사된 CRISPR/Cas9의 모든 농도는 eGFP의 변형을 생성하는 데 효과적이었다(도 4, 패널 B). 주입되지 않은 대조군 배아 중에서, 67.7%는 녹색이었고, 이는 eGFP의 발현을 나타낸다. 개별 배반포(blastocyst)를 유전자형 분석한 경우, CRISPR 결합 부위 근처에서 작은 돌연변이를 확인할 수 있었다(도 4, 패널 C). 독성 및 유효성에 기초하여, 10 ng/μl의 gRNA 및 Cas9 mRNA를 다음 실험에 사용하였다.
CD163을 표적화하도록 설계된 CRISPR/Cas9 구성요소가 추정 접합자 내로 도입한 경우, 후속 배반포에서 유전자의 표적화된 편집이 관찰되었다. 개별 배반포를 CD163의 돌연변이에 대해 유전자형 분석한 경우, 모든 배아에서 특정 돌연변이가 발견되었다(100% GE 효율). 더욱 중요하게는, 동종접합성 또는 이중대립유전자 변형을 갖는 배아(각각 8/18 및 3/18)가 발견될 수 있지만(도 5), 모자이크(단일대립유전자 변형) 유전자형이 또한 검출되었다(4/18 배아). 풀(pool)의 일부 배아(8/10)에 2 ng/μl Cas9 및 10 ng/μl CRISPR을 주입하였고, 돌연변이유발 효율에서 차이가 발견되지 않았다. 다음으로, 시험관내 결과에 기초하여, 상이한 gRNA를 나타내는 2개의 CRISPR을 도입하여 배아발생 동안 CD163 또는 CD1D를 파괴하여 표적 유전자의 특이적 결실을 유도하였다. 그 결과, 2개의 가이드를 도입함으로써 CD163 및 CD1D의 설계된 결실을 성공적으로 유도할 수 있었다. 설계된 결실은 도입된 2개의 가이드 사이의 게놈 서열을 제거하는 결실로 정의된다. CD163을 표적화하는 2개의 CRISPR을 받은 배아 중에서, 하나를 제외한 모든 배아는 CD163의 표적화된 변형을 초래하였다. 또한, 5/13 배아는 CD163에서 설계된 결실을 갖는 것으로 밝혀졌고(도 6, 패널 A), 10/13 배아는 동종접합성 또는 이중대립유전자 방식으로 CD163의 변형을 갖는 것으로 나타났다. 모든 배아(23/23)가 CD1D의 변형을 나타내었기 때문에 2개의 CRISPR로 CD1D를 표적화하는 것은 또한 효과적이었다. 그러나, CD1D의 설계된 결실은 2개의 배아(2/23)에서만 발견될 수 있었다(도 6, 패널 B). 모자이크 유전자형을 가진 23개의 배아 중 5개가 또한 발견되었지만, 나머지 배아는 CD1D의 동종접합성 또는 이중대립유전자 변형을 가지고 있었다. 마지막으로, 동일한 배아 내에서 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 다수의 유전자가 표적화될 수 있는지 여부를 시험하였다. 이러한 목적을 위해, CD163 및 eGFP 모두의 표적화를 이종접합성 eGFP 정액으로 수정된 접합자에서 수행하였다. 주입된 배아의 배반포를 CD163 및 eGFP에 대해 유전자형 분석한 경우, CD163 및 eGFP는 배아발생 동안 성공적으로 표적화된 것으로 밝혀졌다. 시퀀싱 결과는 Cas9와 함께 다수의 CRISPR을 도입함으로써 다수의 유전자가 표적화될 수 있음을 입증하였다(도 6, 패널 C).
CRISPR/Cas9 주입된 접합자로부터 CD163 및 CD1D 돌연변이체의 생산
이전의 시험관내 연구로부터의 성공에 기초하여, 일부 CRISPR/Cas9 주입된 접합자를 생산하였고, 수령체당 46-55개의 배반포를 이식하였다(이 개수가 시험관내 유도된 배아로부터 돼지를 생산하는 데 효과적인 것으로 나타났기 때문임). CD163 및 CD1D에 대해 각각 2개씩 4개의 배아 이식을 수행하였고, 각각의 변형에 대해 임신을 얻었다. CD163에 변형을 갖는 4마리의 건강한 새끼 돼지를 생산하였다(표 8). 모든 새끼 돼지, 즉 수령체 암퇘지 ID O083으로부터의 한배새끼 67은 CD163의 동종접합성 또는 이중대립유전자 변형을 나타내었다(도 7). 2마리의 새끼 돼지는 전달된 2개의 CRISPR에 의해 CD163의 설계된 결실을 나타내었다. 모든 새끼 돼지는 건강하였다. CD1D의 경우, 한 번의 임신이 또한 4마리의 새끼 돼지(수령체 암퇘지 식별번호 O165로부터의 한배새끼 166)인 1마리의 암컷 및 3마리의 수컷을 생산하였다(표 9). 1마리의 새끼 돼지(166-1)는 시작 코돈을 함유하는 엑손 3을 완전히 제거한 362 bp 결실을 포함하는 CD1D의 모자이크 돌연변이를 가지고 있었다(도 8). 1마리의 새끼 돼지는 하나의 대립유전자 상에 2 bp 미스매치를 갖는 6 bp 삽입과 다른 대립유전자 상에 큰 결실을 가지고 있었다. 2마리의 추가의 새끼 돼지는 이중대립유전자 단일 bp 삽입을 가지고 있었다. CD163에 대해 모자이크 돌연변이가 검출되지 않았다.
논의
GE 돼지 생산의 효율 증가는 농업 및 생물의학을 위한 더 많은 GE 돼지를 제공함으로써 광범위한 영향을 가질 수 있다. 전술한 데이터는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용함으로써 특정 돌연변이를 갖는 GE 돼지를 높은 효율로 생산할 수 있음을 보여준다. CRISPR/Cas9 시스템은 체세포 및 이식전 배아 모두에서 유전자를 편집하는 데 성공적으로 적용되었다.
CRISPR/Cas9 시스템이 체세포에 도입되는 경우, 그것은 NHEJ에 의해 표적 유전자의 표적화된 파괴를 성공적으로 유도하였지만, HR에 의해 표적화하는 능력을 증가시키지는 않았다. 체세포에서 개별 CRISPR/Cas9의 표적화 효율은 가변적이었고, 이는 가이드의 설계가 표적화 효율에 영향을 미칠 수 있음을 나타내었다. 특히, CRISPR 5350 및 Cas9가 체세포에 도입되는 경우 CD1D의 표적화된 변형을 찾을 수 없었다. 이는 돼지를 생산하기 전에 다수의 gRNA를 설계하고 그의 효율성을 검증하는 것이 유익할 수 있음을 시사한다. 공여체 DNA의 존재시 HR 지시 복구가 부족한 이유는 아직 명확하지 않다. CRISPR 및 공여체 DNA로 형질감염된 886개의 콜로니(CD163 및 CD1D 모두)를 스크리닝한 후, 하나의 콜로니만이 부분적인 HR 사건에 대한 증거를 가지고 있었다. 결과는 CRISPR/Cas9 시스템이 도입된 공여체 DNA와 함께 작동하여 표적 유전자 상에 예상치 못한 큰 결실을 일으키지만 이들 2개의 특정 표적화 벡터에 대한 HR 효율을 증가시키지는 않는다는 것을 입증한다. 그러나, 큰 결실 관찰에 대한 구체적인 메커니즘은 알려져 있지 않다. 본 발명자들의 이전의 보고는 공여체 DNA가 ZFN과 함께 효과적으로 사용되어 HR 지시 복구를 유도할 수 있음을 시사하였다. 유사하게, 공여체 DNA를 CRISPR/Cas9 시스템과 함께 사용하였을 때 표적화 효율의 증가가 관찰되었지만, 완전한 HR 지시 복구는 관찰되지 않았다. ZFN을 사용한 이전의 연구에서, ZFN에 의해 DSB를 유도한 후 도입된 공여체 DNA의 부분적인 재조합이 발견되었기 때문에 표적화된 변형이 HR 및 NHEJ의 조합을 통해 일어날 수 있음이 관찰되었다. 한 가지 설명은 HR 및 NHEJ 경로가 독립적인 것이 아니라 함께 작용하여 DSB가 호밍 엔도뉴클레아제에 의해 유도된 후 복구 과정을 완료할 수 있다는 것일 수 있다. 이들 실험 결과에서 통계적인 차이가 발견되지 않았음에도 불구하고, 더 높은 농도의 CRISPR은 체세포에서 표적화 효율을 개선할 수 있다. 이는 CRISPR이 CRISPR/Cas9 시스템에서 제한 인자이지만, 추가 검증이 필요하다는 것을 시사할 수 있다. 표적화된 세포가 SCNT를 통해 GE 돼지를 생산하는 데 성공적으로 사용되었고, 이는 CRISPR/Cas9의 적용이 클로닝될 세포의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 몇몇 새끼 돼지는 건강 문제로 안락사되었지만, 이것은 SCNT 유도된 새끼 돼지에서 흔하다.
CRISPR/Cas9 시스템이 접합자 주입에 의해 발달하는 배아에 도입되는 경우, 거의 100%의 배아 및 돼지가 표적화된 유전자 내에 INDEL을 포함하였고, 이는 상기 기술이 배아발생 동안 매우 효과적이라는 것을 입증한다. 이 연구 동안 관찰된 효율은 배아발생 동안 호밍 엔도뉴클레아제를 이용하는 다른 연구에서 보고된 빈도를 능가한다. 배반포 단계에 도달하는 배아의 수의 감소는 이 연구에서 도입된 CRISPR/Cas9의 농도가 배아에 독성일 수 있음을 시사하였다. 전달 시스템의 추가 최적화는 배아의 생존성을 증가시켜 공정의 전체적인 효율을 개선할 수 있다. 여기서 관찰된 거의 100%의 돌연변이유발율은 돼지의 CRISPR/Cas9 매개된 녹아웃에서의 이전의 보고와 상이하였지만; 연구 간의 효율 차이는 선택된 가이드 및 표적의 조합일 수 있다. 본 연구에서, 더 낮은 농도의 CRISPR/Cas9(각각 10 ng/μl)가 발달하는 배아에서 돌연변이를 생성하고 GE 돼지를 생산하는 데 효과적이었다. 농도는 이전에 돼지 접합자에서 보고된 것(125 ng/μl의 Cas9 및 12.5 ng/μl의 CRISPR)보다 더 낮다. 더 낮은 농도의 CRISPR/Cas9 구성요소는 발달하는 배아에 유익할 수 있는데, 발달하는 배아 내로 과량의 핵산을 도입하는 것이 독성일 수 있기 때문이다. 일부 모자이크 유전자형이 시험관내 분석으로부터 CRISPR/Cas9 주입된 배아에서 관찰되었지만; 상기 접근법을 통해 생산된 1마리의 새끼 돼지만이 모자이크 유전자형을 가지고 있었다. 잠재적으로, CRISPR/Cas9 구성요소를 주입하는 것이 다른 호밍 엔도뉴클레아제를 도입하는 것보다 더 효과적일 수 있는데, 모자이크 유전자형이 접합자에서 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 주요 장애물로 간주되었기 때문이다. 본 결과에 의해 입증된 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 또 다른 이점은 CRISPR/Cas9 시스템이 주입된 IVF 유래 접합자로부터 생산된 CD163 녹아웃 돼지는 손실되지 않은 반면, SCNT로부터 비롯된 몇 마리의 새끼 돼지는 며칠 후에 안락사되었다는 것이다. 이는 상기 기술이 녹아웃 돼지를 생성할 때 SCNT의 필요를 우회할 수 있을 뿐만 아니라 SCNT와 관련된 일반적인 건강 문제를 극복할 수 있음을 시사한다. CRISPR/Cas9 mRNA를 접합자에 주입하는 것이 최적화되었으므로, 향후 실험은 또한 공여체 DNA의 공동 주입을 포함할 것이다.
본 연구는 접합자에서 Cas9와 함께 2개의 CRISPR을 도입하는 것이 발달하는 배아에서 염색체 결실을 유도할 수 있고 의도된 결실, 즉, 2개의 CRISPR 가이드 사이의 특정 결실을 갖는 돼지를 생산할 수 있음을 입증한다. 이 설계된 결실은 NHEJ에 의해 야기되는 무작위 사건에 의존하지 않고 결실의 크기를 특정할 수 있기 때문에 유익할 수 있다. 특히, 만약 호밍 엔도뉴클레아제에 의해 야기된 3의 배수의 뉴클레오타이드의 삽입/결실이 존재한다면, 프레임 이동이 발생하지 않을 것이기 때문에 돌연변이는 오히려 정상하위대립인자(hypomorphic) 돌연변이를 초래할 수 있다. 그러나, 2개의 CRISPR을 도입함으로써, 비기능성 단백질을 생성할 가능성이 더 높은 더 큰 결실을 유발할 수 있다. 흥미롭게도, CD1D CRISPR은 CD163보다 게놈 내의 더 큰 영역에 걸쳐 설계되었고; CD163 CRISPR 10 및 131 사이에는 124 bp 거리가 있는 반면, CD1D의 경우 CRISPR 4800 및 5350 사이에는 550 bp의 거리가 있었다. CRISPR 사이의 더 긴 거리는 연구에서 나타난 바와 같이 결실을 생성하는데 그다지 효과적이지 않았다. 그러나, 본 연구는 제한된 수의 관찰만을 포함하였고, 본원에서 다루지 않은 개별 CRISPR의 효능을 고려할 필요가 있기 때문에, CRISPR 사이의 거리와 의도된 결실을 유발할 가능성 사이의 관계를 확인하기 위해 추가의 연구가 필요하다.
CRISPR/Cas9 시스템은 또한 동일한 배아 내의 2개의 유전자를 동시에 표적화하는 데 효과적이었고, 유일한 추가의 단계는 crRNA와 함께 하나의 추가의 CRISPR을 도입하는 것이다. 이는 다른 호밍 엔도뉴클레아제와 비교하여 다수의 유전자를 파괴하기 쉽다는 것을 예시한다. 이들 결과는 이 기술이 보상 효과를 가질 수 있는 유전자 클러스터 또는 유전자 계열을 표적화하는 데 사용될 수 있음을 시사하고, 따라서 모든 유전자가 파괴되지 않는 한 개별 유전자의 역할을 결정하기 어렵다는 것을 증명한다. 결과는 CRISPR/Cas9 기술이 체세포에서 유전자 표적화 효율의 증가에 의해 그리고 직접적인 접합자 주입에 의해 GE 돼지를 생성하는 데 적용될 수 있음을 입증한다.
실시예 2: CD163 단백질을 코딩하는 유전자 내에 변형된 염색체 서열을 갖는 돼지류에서 PRRSV에 대한 내성 증가
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 지난 25년 동안 양돈 산업을 황폐화시켰다. 바이러스 유입 방식에 관한 추측은 SIGLEC1 및 CD163 모두를 포함하였다. SIGLEC1의 녹아웃은 바이러스 공격에 대한 반응에 영향을 미치지 않았지만, 본 실시예에서 CD163 null 동물은 PRRSV 감염의 모든 특징인 감염, 폐 병리, 바이러스혈증 또는 항체 생산의 임상적 징후를 보이지 않는 것으로 나타난다. PRRSV 유입 매개체가 확인되었을 뿐만 아니라; 유사하게 생성된 동물이 식량 공급에 들어가게 된다면, 상당한 경제 손실 및 동물 고통을 방지하기 위한 전략이 기술되었다.
물질 및 방법
유전자형 분석
유전자형 분석은 DNA 시퀀싱 및 mRNA 시퀀싱 모두에 기초하였다. 웅돈(sire)의 유전자형은 하나의 대립유전자에 11 bp 결실을 가지고 있었는데, 이는 번역시 45개의 아미노산을 도메인 5로 예측하여 아미노산 64에서 미성숙 정지 코돈을 초래하였다. 다른 대립유전자에는 엑손 7에 2 bp 부가 및 엑손 7 앞의 인트론에 377 bp 결실이 존재하였는데, 이는 번역시 도메인 5의 처음 49개 아미노산을 예측하여 아미노산 85에 미성숙 정지 코드를 초래하였다. 한 마리의 암퇘지는 하나의 대립유전자에 7 bp 부가를 가지고 있었는데, 이는 번역시 도메인 5의 처음 48개 아미노산을 예측하여 아미노산 70에 미성숙 정지 코돈을 초래하였다. 다른 대립유전자는 특성이 규명되지 않았는데(A), PCR 또는 장거리 6.3 kb PCR에 의해 엑손 7로부터의 밴드가 없었기 때문이었다. 다른 3마리의 암퇘지는 클론이었고, 도메인 5로부터 43개의 아미노산의 결실을 초래할 것으로 예측되는 엑손 7에 129 bp 결실을 가지고 있었다. 다른 대립유전자는 특성이 규명되지 않았다(B).
돼지 감염을 위한 바이러스 접종물의 배양 및 생산에서 PRRSV의 성장은 승인된 IBC 지원 973 하에 커버된다
PRRSV의 A 유형 균주인 단리물 NVSL 97-7895(GenBank # AF325691 2001-02-11)를 승인된 IBC 프로토콜 973에 기재된 대로 성장시켰다. 이 실험실 단리물은 약 20년 동안 실험 연구에 사용되었다(Ladinig 등, 2015). 두 번째 단리물을 이전에 기재된 바와 같이(Prather 등, 2013) 두 번째 시험 KS06-72109에 사용하였다.
PRRSV를 이용한 돼지의 감염
PRRSV에 대한 표준화된 감염 프로토콜을 돼지 감염에 사용하였다. 3주령 새끼 돼지에 근육내(IM) 및 비강내(IN) 경로에 의해 투여된 대략 104 TCID50의 PRRS 바이러스를 접종하였다. 돼지를 매일 모니터링하였고, 질환 증상을 보이는 돼지는 CMG 수의사의 권고에 따라 치료한다. 심한 고통을 보이고 감염에 굴복할 위험이 있는 돼지는 인도적으로 안락사시키고 샘플을 수집한다. 평가 또는 치료에서 편견을 없애기 위해 스텝 및 수의사는 돼지의 유전적 상태를 알지 못하게 하였다. PRRSV는 감염 동안 체액에 존재하며; 따라서, 혈액 샘플을 수집하고 각 돼지에서 바이러스혈증의 양 또는 정도를 결정하기 위해 측정할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 실험 말기에, 돼지의 무게를 재고, 인도적으로 안락사시키고, 조직을 수집하고, 10% 완충된 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 포매시키고, 면허가 있는 병리학자가 조직병리학을 위해 처리하였다.
시험감염된 돼지의 표현형 점수
돼지의 표현형을 아래와 같이 매일 맹검으로 채점하였다: 돼지의 태도는 어떠한가? 태도 점수: 0: BAR, 1: QAR, 2: 약간 우울함, 3: 우울함, 4: 빈사(Moribund). 돼지의 몸 상태는 어떠한가? 몸 상태 점수: 1: 수척, 2: 마름, 3: 이상적, 4: 살찜, 5: 과잉비만/비만. 돼지의 직장 온도는 얼마인가? 정상 체온 101.6-103.6°F (열은 ≥104°F로 간주됨). 다리를 저는가(등급)? 어느 다리? 관절 종창 및 발굽 병변을 평가함(발굽의 바닥 및 측면 확인). 절뚝거림 점수: 1: 절뚝거림 없음, 2: 걸을 때 약간 고르지 않음, 일부 관절이 뻣뻣해 보이지만 절뚝거림은 없음. 3: 가벼운 절뚝거림, 걸으면서 약간 절뚝거림, 4: 중간 정도의 절뚝거림, 발가락 터칭 절름발이(toe touching lame)를 포함한 명백한 절뚝거림, 5: 심한 절뚝거림, 다리로 체중을 지탱하지 못함, 서고 걷는데 자극이 필요함. 호흡 곤란이 있는가(등급)? 입을 벌리고 호흡하는가? 코 분비물이 있는가(분비물 색, 분비물 양: 약함/중간/심함)? 동물 기침을 알아챘는가? 눈 분비물이 있는가? 호흡 점수: 0: 정상, 1: 스트레스 받을 때(다루어질 때) 약한 호흡곤란 및/또는 빈호흡), 2: 쉴 때 약한 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 3: 스트레스 받을 때(다루어질 때) 중간 정도의 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 4: 쉴 때 중간 정도의 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 5: 스트레스 받을 때(다루어질 때) 심한 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 6: 쉴 때 심한 호흡곤란 및/또는 빈호흡. 설사(등급) 또는 구토의 증거가 있는가? 혈액 또는 점액이 있는가? 설사 점수: 0: 보이는 분변이 없음, 1: 정상적인 대변, 2: 무르지만 형태가 있는 대변(소프트 요거트 점도, 소 패티를 생성함), 3: 미립자 분변 물질을 가진 갈색/황갈색의 액체 설사, 4: 미립자 분변 물질이 없는 갈색/황갈색의 액체 설사, 5: 물과 유사해 보이는 액체 설사.
이 점수 시스템은 KSU의 메건 니더워더(Megan Niederwerder) 박사에 의해 개발되었으며, 다음의 간행물에 기초한다(Halbur 등, 1995; Merck; Miao 등, 2009; Patience and Thacker, 1989; Winckler and Willen, 2001). 치료로서 유전자형에 기초하여 분리된 ANOVA를 사용하여 점수 및 온도를 분석하였다.
PRRSV 바이러스혈증의 측정
바이러스혈증을 두 가지 접근법을 통해 결정하였다. 96 웰-플레이트에서 컨플루언트 MARC-145 세포에 혈청의 연속 1:10 희석액을 첨가하여 바이러스 적정을 수행하였다. 혈청을 이전에 기재된 바와 같이(Prather 등, 2013) 8% 우태아 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신, 및 암포테리신 B가 보충된 이글 최소 필수 배지에서 희석하였다. 세포를 4일의 인큐베이션 후 현미경을 사용하여 세포병변 효과의 존재에 대해 조사하였다. 세포병변 효과를 나타내는 최고 희석을 적정 종점으로서 채점하였다. 바이러스 핵산을 측정하기 위해 총 RNA를 Life Technologies MagMAX-96 바이러스 RNA 단리 키트를 사용하여 혈청으로부터 단리하였다. 역전사 중합효소 연쇄 반응을 제조자의 지침에 따라 CFX-96 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad) 상에서 Tetracore로부터의 EZ-PRRSV MPX 4.0 키트를 사용하여 수행하였다. 각각의 반응물(25 μl)은 5.8 μl의 혈청으로부터의 RNA를 함유하였다. 표준 곡선을 키트(Tetracore)에 공급된 RNA 대조군의 연속 희석액을 제조함으로써 작성하였다. PCR당 주형의 수를 기록한다.
PAM 세포의 SIGLEC1 및 CD163 염색
폐를 절개하고 이를 ~100 ml 차가운 인산 완충 식염수로 채움으로써 돼지 폐포 대식세포(PAM)를 수집하였다. 인산 완충 식염수 세척물을 회수한 후, 세포를 펠렛화하고, 5 ml 차가운 인산 완충 식염수에 재현탁시키고, 얼음 위에서 보관하였다. 대략 107개의 PAM을 5 mL의 다양한 항체(항-돼지 CD169(클론 3B11/11; AbD Serotec); 5% 우태아 혈청 및 0.1% 아지드화나트륨을 갖는 인산 완충 식염수에서 희석된 항-돼지 CD163(클론 2A10/11; AbD Serotec))에서 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 염색 완충액에서 희석된 염소 항-마우스 IgG에 접합된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(life Technologies)의 1/100 희석액에 재현탁시키고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 적어도 104개의 세포를 FACSCalibur 유세포측정기 및 Cell Quest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
PRRSV-특이적 Ig의 측정
PRRSV 특이적 Ig를 측정하기 위해, 재조합 PRRSV N 단백질을 박테리아에서 발현시키고(Trible 등, 2012), 키트(Luminex Corporation)를 사용하여 자성 Luminex 비드에 접합시켰다. N 단백질 결합된 비드를 10% 염소 혈청을 함유하는 인산 완충 식염수에서 2,500 비드/50 μl로 희석하고, 96-웰 둥근바닥 폴리스티렌 플레이트의 웰에 넣었다. 혈청을 10% 염소 혈청을 함유하는 인산 완충 식염수에서 1:400으로 희석하고, 50 μl를 이중 웰에 첨가하고, 실온에서 부드럽게 흔들면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 플레이트를 10% 염소 혈청을 함유하는 인산 완충 식염수로 세척(3X)하고, 10% 염소 혈청을 함유하는 인산 완충 식염수에서 2 μg/ml로 희석된 50 μl의 바이오틴-SP-접합된 친화성 정제된 염소 항-돼지류 이차 항체(IgG, Jackson ImmunoResearch) 또는 바이오틴 표지된 친화성 정제된 염소 항-돼지류 IgM(KPL)을 첨가하였다. 플레이트를 30분의 인큐베이션 후 세척(3X)한 다음, 50 μl의 스트렙타비딘 접합된 피코에리트린(10% 염소 혈청을 함유하는 인산 완충 식염수 중의 2 μg/ml(Moss, Inc.))을 첨가하였다. 30분 후 플레이트를 세척하고, 미소구체를 10% 염소 혈청을 함유하는 100 μl의 인산 완충 식염수에 재현탁시키고, MAGPIX 및 Luminex xPONENT 4.2 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 평균 형광 강도(MFI)를 기록한다.
결과
CD163의 돌연변이를 실시예 1에서 상기 기재된 바와 같이 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 생성하였다. 접합자 주입 및 체세포 핵 이식으로부터 몇 마리의 창시자 동물을 생산하였다. 이들 창시자 중 일부를 교배하여 연구할 자손을 생성하였다. 단일 창시자 수컷을 2개의 유전자형을 가진 암컷과 교배하였다. 창시자 수컷(67-1)은 하나의 대립유전자 상의 엑손 7에 11 bp 결실 및 다른 대립유전자의 엑손 7에 2 bp 부가(및 이전 인트론에 377 bp 결실)를 가지고 있었고, null 동물(CD163 -/-)인 것으로 예측되었다. 한 마리의 창시자 암컷(65-1)은 하나의 대립유전자 내의 엑손 7에 7 bp 부가 및 특성이 규명되지 않은 상응하는 대립유전자를 가지고 있었고, 따라서 녹아웃(CD163 -/?)에 대해 이종접합성인 것으로 예측되었다. 두 번째 창시자 암컷 유전자형(클론인 3마리의 동물)은 아직 특성이 규명되지 않은 대립유전자 및 엑손 7 내에 129 bp 결실을 갖는 대립유전자를 함유하였다. 이 결실은 도메인 5에서 43개의 아미노산의 결실을 초래할 것으로 예측된다. 이들 동물 간의 교배는 수퇘지로부터 null 대립유전자 및 암퇘지로부터 43개의 아미노산 결실 또는 특성이 규명되지 않은 대립유전자 중 하나를 물려받은 새끼 돼지를 모두 초래하였다. 바이러스 시험감염에 대한 양성 대조군으로서 작용하는 야생형 새끼 돼지 이외에, 이것은 4개의 추가의 유전자형을 생성하였다(표 12).
이유기에, 유전자 편집된 새끼 돼지 및 야생형 연령 일치된 새끼 돼지를 PRRSV 시험감염을 위해 캔자스 주립 대학교로 이송하였다. PRRSV 시험감염을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Prather 등, 2013). 3주령의 새끼 돼지를 시험감염 시설로 옮겨 단일 그룹으로 유지시켰다. 모든 실험은 동물 사용 및 생물안전 위원회의 승인 후 시작하였다. 순응 후, 돼지를 MARC-145 세포 상에서 증식된 PRRSV 단리물인 NVSL 97-7895(Ladinig 등, 2015)로 시험감염시켰다(Kim 등, 1993). 돼지를 대략 105 TCID50의 바이러스로 시험감염시켰다. 접종물의 절반은 근육내로 전달하고, 나머지는 비강내로 전달하였다. 감염된 모든 돼지를 단일 그룹으로 유지시켰고, 이는 감염된 같은 우리 돼지(pen mate)로부터 바이러스의 지속적인 노출을 허용하였다. 혈액 샘플을 감염 후 최대 35일까지의 다양한 일수에 그리고 종결시에 35일에 수집하였다. 돼지를 부검하고, 조직을 10% 완충된 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 포매시키고, 조직병리학을 위해 처리하였다. 감염 과정 동안 기록된 PRRSV 관련 임상 징후는 호흡 곤란, 식욕부진, 무기력 및 발열을 포함하였다. 연구 기간 동안의 임상 징후 결과가 도 9에 요약되어 있다. 예상대로, 야생형 Wild Type(CD163+/+) 돼지는 PRRSV 감염의 초기 징후를 나타내었고, 이는 5일 및 14일 사이에 정점에 이르렀고, 연구 나머지 동안 그룹에서 지속되었다. 열성(febrile) 돼지의 백분율은 약 10일에 정점에 이르렀다. 대조적으로, Null(CD163-/-) 새끼 돼지는 전체 연구 기간 동안 임상 징후의 증거를 나타내지 않았다. 급성 PRRSV 감염 동안 호흡 징후는 폐에서 유의미한 조직병리학적 변화에 반영된다(표 9). 야생형 돼지의 감염은 단핵 세포의 침윤과 함께 간질성 부종을 포함하는 PRRS와 일치하는 조직병리학을 나타내었다(도 10). 대조적으로 Null(CD163-/-) 돼지에서는 폐 변화에 대한 증거가 없었다. 다양한 유전자형에 대한 샘플 크기는 작고; 그럼에도 불구하고 평균 점수는 야생형의 경우 3.85(n=7), 특성이 규명되지 않은 A의 경우 1.75(n=4), 특성이 규명되지 않은 B의 경우 1.33(n=3), 및 null(CD163-/-)의 경우 0(n=3)이었다.
최대 임상 징후는 혈중 PRRSV 수준과 상관관계가 있었다. 바이러스 핵산의 측정을 혈청으로부터 총 RNA의 단리 후 상업적 역전사효소 실시간 PRRSV PCR 시험(Tetracore, Rockville, MD)을 사용한 PRRSV RNA의 증폭에 의해 수행하였다. RT-PCR 키트에 공급된 PRRSV RNA 대조군의 연속 희석액을 제조함으로써 표준 곡선을 작성하고, 결과를 50 μl PCR 반응당 주형 수로서 표준화하였다. PRRSV 단리물은 야생형 CD163+/+ 돼지에서 PRRSV 바이러스혈증의 과정을 따랐다(도 11). 바이러스혈증은 4일째에 뚜렷하였고, 11일째에 정점에 이르렀고, 연구 말기까지 감소하였다. 대조적으로, 바이러스 RNA는 연구 기간 동안 어느 시점에도 CD163 -/- 돼지에서 검출되지 않았다. 바이러스혈증과 일치하게, null 및 특성이 규명되지 않은 대립유전자 돼지에 의한 항체 생산은 14일째에 검출가능하였고, 28일째까지 증가하였다. null 동물에서는 항체 생산이 없었다(도 12). 이와 함께, 이들 데이터는 야생형 돼지가 PRRS와 일치하는 임상 징후의 발생과 함께 PRRSV 복제를 지원한다는 것을 보여준다. 대조적으로, 돼지가 접종되고 감염된 우리 동료에 지속적으로 노출되었음에도 불구하고, 녹아웃 돼지는 바이러스혈증과 임상 징후를 나타내지 않았다.
연구 말기에, 돼지 폐포 대식세포를 폐 세척에 의해 제거하고, 이전에 기재된 바와 같이 SIGLEC1(CD169, 클론 3B11/11) 및 CD163(클론 2A10/11)의 표면 발현을 위해 염색하였다(Prather 등, 2013). 비교적 높은 수준의 CD163 발현이 CD163+/+ 야생형 동물에서 검출되었다(도 13). 대조적으로, CD163-/- 돼지는 배경 수준의 항-CD163 염색만을 나타내었고, 따라서 녹아웃 표현형을 확인하였다. 다른 대식세포 마커 CD169에 대한 발현 수준은 야생형 및 녹아웃 돼지 모두에 대해 유사하였다(도 14). MHC II 및 CD172를 포함하는 다른 대식세포 표면 마커는 두 유전자형에 대해 동일하였다(데이터는 도시되지 않음).
샘플 크기는 작았지만, 야생형 돼지는 다른 3개의 유전자형의 돼지(특성이 규명되지 않은 A 1.32 kg ± 0.17, n=4; 특성이 규명되지 않은 B 1.20 kg ± 0.16, n =3; null 1.21 kg ± 0.16, n=3)에 비해 실험 과정 동안 체중이 덜 증가하는 경향이 있었다 (평균 일일 증가 0.81 kg ± 0.33, n=7).
두 번째 시험에서, 6마리의 야생형, 6마리의 △43 아미노산, 및 특성이 규명되지 않은 대립유전자(B)를 갖는 6마리의 돼지를 KS06-72109를 사용하여 새끼 돼지를 접종한 것을 제외하고 상기에 기재된 바와 같이 투여시험하였다. NVSL 데이터와 유사하게, 야생형 및 특성이 규명되지 않은 B 새끼 돼지는 바이러스혈증을 발병하였다. 그러나, △43 아미노산 돼지에서는 KS06이 바이러스혈증을 유발하지 않았다(도 15; 표 7).
결과 및 결론
양돈 산업에 가장 임상적으로 관련된 질환은 PRRS이다. 백신접종 프로그램이 대부분의 돼지류 병원체를 예방하거나 개선하는 데 성공적이었지만, PRRSV는 더 도전해야 하는 것으로 입증되었다. 여기서 CD163이 이러한 바이러스 균주의 유입 매개체로서 확인된다. 창시자 숫퇘지는 CRISPR/Cas9를 접합자에 주입함으로써 생성되었으므로(Whitworth 등, 2014), 이식유전자가 없다. 추가로, 암퇘지(또한 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성됨)로부터의 대립유전자 중 하나는 이식유전자를 함유하지 않는다. 따라서 새끼 돼지 #40은 하나의 대립유전자에 7 bp 부가 및 다른 대립유전자에 11 bp 결실을 갖지만, 이식유전자를 갖지 않는다. 이러한 CD163의 바이러스-내성 대립유전자는 돼지류 게놈이 약 28억 bp라는 점을 고려하여 작은 게놈 편집을 나타낸다(Groenen 등, 2012). 유사하게 생성된 동물이 식량 공급에 도입되면, 상당한 경제적 손실을 예방할 수 있다.
실시예 3: 인간 CD163-유사 상동성 SRCR 도메인 8로 대체된 CD163 SRCR 도메인 5를 갖는 돼지류에서 유전자형 1 돼지 생식 및 PRRS 바이러스에 대한 증가된 내성
CD163은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 대한 주요 수용체로 간주된다. 이 연구에서, 돼지를 다음의 유전자형 중 하나를 갖도록 유전적으로 편집(GE)하였다: CD163의 완전한 녹아웃(KO), CD163 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 도메인 5 내의 결실, 또는 SRCR 도메인 5를 인간 CD163-유사(hCD163L1) SRCR 8 도메인의 동족체를 코딩하는 합성된 엑손으로 대체(도메인 스왑). 돼지 폐포 대식세포(PAM)의 면역표현형분석은 KO 또는 SRCR 도메인 5 결실을 갖는 돼지가 CD163을 발현하지 않았고 PAM이 PRRSV 감염을 지원하지 않았음을 보여주었다. hCD163L1 도메인 8 동족체를 갖는 돼지로부터의 PAM은 CD163을 발현하였고, 2형 유전자형 바이러스의 복제를 지원하였지만, 1형 유전자형 바이러스의 복제는 지원하지 않았다. 대표적인 1형 및 2형 바이러스를 이용한 CD163-변형된 돼지의 감염은 유사한 결과를 생성하였다. 1형 및 2형 바이러스는 수용체로서 CD163의 요건을 포함하여 몇 가지 수준에서 유전적으로 그리고 표현형으로 유사한 것으로 간주되지만, 결과는 CD163 분자의 인식에서 PRRSV 유전자형 사이의 뚜렷한 차이를 입증한다.
물질 및 방법
돼지 CD163 유전자의 게놈 변형
동물 및 바이러스를 수반하는 실험은 연구 및 교시에서 농업 동물의 관리와 사용을 위한 동물 과학 학회 연합 지침(Federation of Animal Science Societies Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Research and Teaching), USDA 동물 복지법 및 동물 복지규정에 따라 수행하였고, 캔자스 주립 대학교 및 미주리 대학교 동물관리사용 위원회 및 기관 생물안정성 위원회에 의해 승인받았다. 이 연구에 사용된 CD163의 돌연변이를 이전 실시예에 기재된 바와 같이 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 생성하였다. 돌연변이가 도 17에 도식화되어 있다. 도 17에 표시된 도식화된 게놈 영역은 돼지 CD163 유전자의 인트론 6부터 인트론 8까지의 서열을 포함한다. 도 17에 도식화된 인트론 및 엑손은 일정한 척도로 그려진 것은 아니다. 예측된 단백질 산물은 각각의 게놈 구조의 우측에 예시되어 있다. PAM 상의 표면 CD163의 수준에 의해 측정된 바와 같은 상대적 대식세포 발현은 도 17의 맨 우측에 표시되어 있다. 검은색 영역은 인트론을 나타내고, 흰색 영역은 엑손을 나타내며, 빗금 친 영역은 돼지 엑손 7의 동족체인 hCD163L1 엑손 11 모방체를 나타내고, 회색 영역은 도 17에 나타낸 바와 같이 PGK Neo 작제물을 갖는 합성된 인트론을 나타낸다.
도 17에 나타낸 CD163 유전자 작제물 KO-d7(11)은 뉴클레오타이드 3,137부터 뉴클레오타이드 3,147까지의 엑손 7에서의 11개의 염기쌍 결실을 갖는다. CD163 유전자 작제물 KO-i7(2)는 뉴클레오타이드 3,149 및 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입뿐만 아니라 뉴클레오타이드 2,573부터 뉴클레오타이드 2,949까지의 엑손 7의 업스트림에 있는 인트론에 377개의 염기쌍 결실을 갖는다. 이러한 편집은 프레임시프트 돌연변이 및 미성숙 정지 코돈을 유발하여, SRCR 5 및 KO 표현형의 부분적인 번역만을 초래할 것으로 예측된다. 3개의 다른 돌연변이는 엑손 7에서 결실을 생성하였다. 첫 번째 d7(129)는 뉴클레오타이드 3,044부터 뉴클레오타이드 3,172까지의 엑손 7에 129개의 염기쌍 결실을 갖는다. d7(129) 작제물은 또한 엑손 6에서 뉴클레오타이드 488부터 뉴클레오타이드 2,417까지의 결실을 가지며, 여기서 결실된 서열은 12 bp 삽입으로 대체된다. 다른 2개의 결실 작제물인 d7(1467) 및 d7(1280)은 도 17에 예시된 바와 같이 엑손 7 및 8의 완전한 결실을 갖는다. d7(1467)은 뉴클레오타이드 2,431부터 뉴클레오타이드 3,897까지의 1467개의 염기쌍 결실을 갖고, d7(1280)은 뉴클레오타이드 2,818부터 뉴클레오타이드 4,097까지의 1280개의 염기쌍 결실을 갖는다. 이들 결실 작제물의 경우, 다른 CD163 엑손은 온전한 상태를 유지하였다.
도 17에 나타낸 마지막 작제물인 HL11m을 엑손 7을 결실시키고 이를 인간 CD163-유사 1 단백질의 SRCR 8의 동족체를 코딩한 합성 엑손으로 대체한 표적화 사건을 사용하여 생산하였다(hCD163L1 도메인 8은 hCD163L1 엑손 11에 의해 코딩됨). 돼지 엑손 7 서열에서 33개의 뉴클레오타이드를 변화시킴으로써 SRCR 8 펩타이드 서열을 생성하였다. 변형을 스크리닝할 수 있도록 합성된 엑손에 네오마이신 카세트를 포함시켰다. 서열번호: 118은 참조 서열 서열번호: 47에서의 동일한 영역에 상응하는 영역에서 HL11m 작제물에 대한 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
돼지 CD163 단백질 및 유전자의 다이어그램이 도 18에 제공되어 있다. 상응하는 유전자 엑손과 함께 CD163 단백질 SCRC(타원형) 및 PST(정사각형) 도메인이 도 18의 패널 A에 나타나 있다. 돼지 CD163 SRCR 5(서열번호: 120) 및 인간 CD163 SRCR 8 동족체(서열번호: 121)에 대한 펩타이드 서열 비교가 도 18의 패널 B에 나타나 있다. 도면은 GenBank 등록 번호 AJ311716(돼지 CD163) 및 GQ397482(hCD163-L1)에 기초한다.
바이러스
이 실시예에서 사용된 바이러스의 패널이 표 14에 열거되어 있다. 단리물을 증식시키고 MARC-145 세포 상에서 적정하였다(Kim 등, 1993). 적정을 위해, 각각의 바이러스를 7% FBS, Pen-Strep(각각 80 Units/ml 및 80 μg/ml), 3　μg/ml FUNGIZONE(암포테리신 B), 및 25 mM HEPES가 보충된 MEM에서 1:10으로 연속 희석하였다. 희석된 샘플을 96 웰 플레이트에서 컨플루언트 MARC-145 세포에 4중으로 200 μl/웰의 최종 부피로 첨가하고, 5% CO2에서 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 적정 종점은 세포병변 효과(CPE)가 있는 마지막 웰로서 확인하였다. 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50/ml)을 앞서 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 계산하였다(Reed and Muench 1938).
폐포 대식세포의 감염
대식세포의 제조 및 감염을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Gaudreault 등, 2009 및 Patton 등, 2008). 안락사된 돼지로부터 폐를 제거하고, 100 mL의 차가운 인산 완충 식염수(PBS)를 기관(trachea)에 부어 세척하였다. 기관을 고정하고, 폐를 부드럽게 마사지하였다. 폐포 내용물을 50 ml 원심분리 튜브에 붓고, 얼음 위에서 보관하였다. 돼지 폐포 대식세포(PAM)를 4℃에서 10분 동안 1200　x　g에서 원심분리하여 침전시켰다. 펠렛을 재현탁시키고 차가운 멸균 PBS에서 1회 세척하였다. 세포 펠렛을 45% RPMI 1640, 45% 우태아 혈청(FBS), 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유하는 동결 배지에 재현탁시키고, 사용할 때까지 액체 질소에 보관하였다. 냉동된 세포를 얼음 위에서 해동하고, 계수하고, 배지(10% FBS, PenStrep, 및 FUNGIZONE이 보충된 RPMI 1640; RPMI-FBS)에서 5x105　세포/ml로 조정하였다. 웰당 대략 103개의 PAM을 96 웰 플레이트에 첨가하고, 5% CO2에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 부드럽게 세척하여 비부착성 세포를 제거하였다. 바이러스의 연속 1:10 희석액을 삼중 웰에 첨가하였다. 밤새 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고 80% 아세톤으로 10분 동안 고정시켰다. 건조 후, 웰을 1% 생선 젤라틴을 갖는 PBS(PBS-FG; Sigma Aldrich)에서 1:1000으로 희석된 PRRSV N-단백질 특이적 SDOW-17 mAb(Rural Technologies Inc.)로 염색하였다. 37℃에서 30분 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, PBS-FG에서 1:200으로 희석된 ALEXAFLUOR 488 표지된 항-마우스 IgG(Thermofisher Scientific)로 염색하였다. 플레이트를 어두운 곳에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, 형광 현미경 하에 관찰하였다. 50% 조직 배양 감염성 용량 (TCID50)/ml을 이전에 기재된 바와 같은 방법에 따라 계산하였다(Reed and Muench 1938).
PAM 상에서 CD169 및 CD163 표면 발현의 측정
CD169 및 CD163의 표면 발현에 대한 염색을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Prather 등, 2013). 대략 1X106 개의 PAM을 12 mm x 75 mm 폴리스티렌 유세포측정(FACS) 튜브에 넣고, 10% 정상 마우스 혈청을 갖는 1 mL의 PBS에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 Fc 수용체를 차단하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 5 μl의 FITC 접합된 마우스 항-돼지 CD169 mAb(클론 3B11/11; AbD Serotec) 및 5 μl의 PE 접합된 마우스 항-돼지 CD163 mAb(클론:　2A10/11, AbD Serotec)에 재현탁시켰다. 30분 인큐베이션 후, 세포를 1% 소 혈청 알부민(BSA 분획 V; Hyclone)을 함유하는 PBS로 2회 세척하고, FCS Express 5 소프트웨어(De Novo Software)를 갖는 BD LSR Fortessa 유세포측정기(BD Biosciences)에서 즉시 분석하였다. 최소 10,000개의 세포를 각각의 샘플에 대해 분석하였다.
PRRS 바이러스혈증의 측정
RNA를 제조자의 지침에 따라 Ambion의 MagMAX 96 바이러스 단리 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 50 μl의 혈청으로부터 단리하였다. PRRSV RNA를 제조자의 지침에 따라 수행된 EZ-PRRSV MPX 4.0 실시간 RT-PCR 표적 특이적 시약(Tetracore)을 사용하여 정량화하였다. 각각의 플레이트는 RT-PCR 시약과 함께 사용하도록 설계된 Tetracore 정량화 표준 및 대조군 세트를 함유하였다. PCR을 권고된 사이클링 파라미터를 사용하여 96-웰 형식으로 CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad) 상에서 수행하였다. PCR 분석 결과를 50 μl 반응 부피당 log10 PRRSV RNA 복제수로서 보고하였고, 이는 혈청 mL당 복제수에 가깝다. 시간 경과에 따른 바이러스혈증에 대한 곡선하 면적(AUC)을 윈도우용 GraphPad Prism　버전 6.00을 사용하여 계산하였다.
PRRSV 항체의 측정
PRRSV 뉴클레오캡시드(N) 단백질에 대한 항체의 검출을 위해 미소구체 형광 면역분석(FMIA)을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Stephenson 등, 2015). 재조합 PRRSV N 단백질을 제조자의 지시에 따라 카복실화된 Luminex MAGPLEX 폴리스티렌 미소구체 비드에 결합시켰다. FMIA를 위해, 10% 염소 혈청을 갖는 50 μL PBS(PBS-GS)에 현탁된 대략 2500개의 항원 코팅된 비드를 96-웰 폴리스티렌 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 넣었다. 혈청을 PBS-GS에서 1:400으로 희석하고, 50 μl을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 호일로 싸고, 부드럽게 흔들면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 자석 위에 두고, 비드를 190 μl의 PBS-GS로 3회 세척하였다. IgG의 검출을 위해, 50 μl의 바이오틴-SP 접합된 친화성 정제된 염소 항-돼지류 이차 항체(IgG, Jackson ImmunoReserch)를 PBS-GS 중의 2 μg/ml로 희석하고, 100 μl를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 3회 세척한 후, 50 μl의 스트렙타비딘 접합된 피코에리트린(PBS-GS 중의 2 μg/ml; SAPE)을 첨가하였다. 30분 후, 미소구체를 세척하고, 100 μl의 PBS-GS에 재현탁시키고, MAGPIX 기구(LUMINEX) 및 LUMINEX xPONENT 4.2 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 평균 형광 강도(MFI)를 최소 100개의 미소구체 비드 상에서 계산하였다.
합토글로빈(HP)의 측정
혈청 내의 Hp의 양을 돼지 특이적 Hp ELISA 키트(Genway Biotech Inc.)를 사용하여 측정하고, 제조자의 지침에 따라 단계를 수행하였다. 혈청 샘플을 1X 희석 용액에서 1:10,000으로 희석하고, 미리 코팅된 항-돼지 Hp 96 웰 ELISA 플레이트에서 이중으로 피펫팅하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 3회 세척하였다. 항-Hp-홀스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP) 접합체를 각 웰에 첨가하고, 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 100 μl 색원체-기질액을 각 웰에 첨가하였다. 어두운 곳에서 10분 동안 인큐베이션 후, 100 μl의 정지 용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 Fluostar 오메가 필터 기반의 마이크로플레이트 판독기(BMG Labtech) 상에서 450 nm에서 판독하였다.
결과
CD163 변형된 돼지의 PAM의 표현형 특성
폐 세척 물질에서의 세포의 전방 및 측면 산란 특성을 사용하여 세포의 단핵 하위집단을 게이팅(gating)하였다. 도 17에 나타낸 상이한 염색체 변형에 대한 대표적인 CD169 및 CD163 염색 결과가 도 19에 제시되어 있다. 도 19의 패널 A에 제시된 대표적인 예에서, WT 돼지로부터의 PAM의 91% 초과는 CD169 및 CD163 모두에 대해 양성이었다. 이 연구에 사용된 12마리의 WT 돼지에 대한 결과는 이중-양성 세포의 85 +/- 8%의 평균을 나타내었다. 도 19의 패널 B에 나타낸 바와 같이, CD163 KO 돼지로부터의 PAM은 CD163의 증거를 나타내지 않았지만, CD169의 정상 표면 수준을 유지하였다. d7(1467) 및 d7(1280) 결실 유전자형으로부터 유래된 CD163 폴리펩타이드는 PAM 표면에 고정된 변형된 CD163 폴리펩타이드를 생산할 것으로 예측되었지만, 면역염색 결과는 CD163의 표면 발현을 나타내지 않았다(도 19, 패널 D 참고). MAb 2A10은 처음 3개의 SRCR 도메인에 위치한 에피토프를 인식하므로, 검출의 부재는 면역반응성 에피토프의 결실의 결과가 아니었다. d7(129) 유전자형은 SRCR 5에 43개의 아미노산 결실을 갖는 것으로 예측되었다(도 17 참고). 도 19의 패널 C에 제시된 예에서, 2.4%의 세포만이 이중-양성 사분면에 속하였다. 이 연구에 사용된 9마리의 d7(129) 돼지로부터의 PAM의 분석은 0% 내지 3.6%(평균 = 0.9%) 범위의 이중-양성 세포의 백분율을 나타내었다. CD169의 표면 발현은 WT PAM과 유사하게 유지되었다. 이 연구의 목적을 위해, KO, d7(1467), d7(1280), 및 d7(129) 유전자형을 갖는 돼지는 모두 CD163-null 표현형을 갖는 것으로 분류하였다.
hCD163L1 도메인 8 펩타이드 서열 HL11m을 함유하는 CD163 변형은 PAM 상에서 CD163+ 및 CD169+의 이중 발현을 나타내었다(도 19의 패널 E). 그러나, 이 연구에서 분석된 모든 HL11m 돼지에서, CD163의 표면 발현은 WT PAM과 비교하여 현저하게 감소되었다. CD163의 수준은 검출가능한 CD163이 없는 것부터 중간 수준의 CD163을 갖는 돼지까지, 연속적인 발현으로 떨어졌다. 도 19의 패널 E에 표시된 예에서, 세포의 대략 60%는 이중-양성 사분면에 있는 반면, 세포의 40%는 CD169에 대해서만 염색되었다. 총 24마리의 HL11m 돼지로부터의 PAM의 분석은 PAM 세포의 38 +/- 12%가 CD169에 대해서만 양성이었고 54+/-14%가 이중-양성(CD169+CD163+)이었다는 것을 보여주었다.
WT 및 CD163 변형된 돼지에서 순환하는 합토글로빈 수준
스캐빈징 분자로서, CD163은 혈액으로부터 HbHp 복합체를 제거하는 역할을 한다(Fabriek, 등, 2005; Kristiansen 등, 2001; 및 Madsen 등, 2004). 혈청 내 Hp의 수준은 CD163 발현 대식세포의 전체적인 기능적 특성을 결정하는 편리한 방법을 제공한다. WT, HL11m 및 CD163-null 돼지로부터의 혈청 내 Hp 수준을 PRRSV 감염 직전에 3 내지 4주령에 측정하였다. 도 20에 제시된 결과는 WT 돼지로부터의 혈청이 가장 낮은 양의 Hb를 가지고 있었음을 보여주었다(평균 A450=23+/-0.18, n=10). 각 그룹에 대한 평균 및 표준 편차는 WT, 0.23+/-0.18, n=10; HL11m, 1.63+/-0.8, n=11; 및 null 그룹의 경우 2.06 +/-0.57, n=9였다. null 그룹은 CD163을 발현하지 않은 유전자형으로 구성되었다(CD163 null 표현형 돼지). Hp 측정을 단일 ELISA 플레이트 상에서 수행하였다. 같은 문자를 갖는 그룹은 유의미하게 상이하지 않았다(p>0.05, 던넷 사후 시험(Dunnett's post-test)을 갖는 크루스칼-왈리스 일원 ANOVA(Kruskal-Wallis one-way ANOVA)). WT 돼지에 대한 평균 A450 값은 HL11m 및 CD163-null 돼지와 유의미하게 상이하였다(p< 0.05). 평균 A450 값은 CD163-null 그룹과 비교하여 HL11m 그룹에서 더 낮았지만(A450 = 1.6+/-0.8 대 2.1+/-0.6), 차이는 통계적으로 유의미하지 않았다. HbHp 및 CD163 사이의 상호작용은 SRCR 3을 통해 발생하므로(Madsen 등, 2004), WT 돼지와 비교하여 HL11m 돼지에서 순환하는 Hp의 증가는 Hb/Hp에 대한 CD163의 감소된 친화성의 결과가 아니라, 나머지 대식세포 상의 CD163 발현의 감소와 함께 CD163+ 대식세포 수의 감소의 결과일 가능성이 높았다(도 19의 패널 E 참고).
1형 및 2형 바이러스를 이용한 PAM의 감염
PRRSV에 대한 CD163 변형된 돼지의 허용성을 6개의 1형 및 9개의 2형 PRRSV 단리물의 패널을 사용하여 시험관내에서 PAM 세포를 감염시킴으로써 초기에 평가하였다(바이러스의 목록에 대해 표 14 참조). 패널 내의 바이러스는 상이한 유전자형뿐만 아니라 뉴클레오타이드 및 펩타이드 서열의 차이, 발병, 및 단리 연도를 나타낸다. 표 15에 제시된 데이터는 각각의 CD163 유전자형 그룹에 대해 3마리의 돼지로부터의 PAM을 사용한 실험의 결과를 보여준다. 열거된 바이러스는 표 14에 열거된 PRRSV 단리물에 해당한다. 결과는 감염된 PAM의 백분율의 평균 +/- 표준 편차로 표시되어 있다. CD163-null PAM은 d7(129) 대립유전자를 발현하는 돼지로부터 유래되었다(각각 PAM 상의 CD163 유전자 작제물 및 CD163 발현의 경우 도 17 및 19 참고).
예상대로, WT PAM은 모든 바이러스에 의해 감염되었다. 대조적으로, CD163-null 표현형 돼지는 모든 바이러스에 의한 감염에 대해 음성이었다. HL11m 돼지로부터의 PAM의 반응에서 현저한 차이가 관찰되었다. 1형 바이러스의 어떠한 것도 HL11m PAM을 감염시킬 수 없는 반면; 2형 패널 내의 모든 바이러스는 WT PAM과 비교하여 훨씬 더 낮은 백분율에도 불구하고 HL11m PAM을 감염시켰다.
동일한 2형 바이러스에 대해 WT 및 HL11m PAM 사이의 바이러스 적정 종점을 비교함으로써 허용성을 또한 평가하였다. 결과가 2마리의 WT 및 2마리의 HL11m 돼지에 대해 나타나 있다(도 21). log10TCID50 값을 동일한 바이러스 샘플을 이용한 대식세포 배양의 감염에 기초하여 계산하였다. 감염 결과는 각각의 유전자형으로부터의 2개의 상이한 돼지를 나타낸다. 감염에 사용된 바이러스가 표 14에 열거되어 있다. HL11m 돼지로부터의 PAM에 대한 log10TCID50 값은 동일한 바이러스로 감염된 WT PAM과 비교하여 1-3 로그 더 낮았다. 유일한 예외는 변형된 생 바이러스 백신 균주를 이용한 감염이었다. 종합하면, 결과는 HL11m 돼지로부터의 PAM이 2형 바이러스 감염에 대해 감소된 민감성 또는 허용성을 갖는다는 것을 시사한다.
1형 및 2형 바이러스를 이용한 CD163 변형된 돼지의 감염
WT(원형), HL11m(정사각형), 및 CD163-null(삼각형) 돼지를 대표적인 1형(SD13-15)(도 22, 패널 A, 좌측 그래프) 및 2형(NVSL 97-7895)(도 22, 패널 A, 우측 그래프) 바이러스로 감염시켰다. null 표현형 돼지는 KO 및 d(1567) 대립유전자로부터 유래되었다(도 17 참고). 동일한 바이러스로 접종된 3개의 유전자형으로부터의 돼지를 하나의 축사에서 함께 혼합하였고, 이는 WT 우리 동료로부터 떨어져 나온 바이러스에 대한 CD163 변형된 돼지의 연속적 노출을 허용하였다. 대표적인 1형 바이러스로 감염된 돼지의 수는 WT(n=4), HL11m(n=5), 및 Null(n=3); 및 2형 바이러스: WT(n=4), HL11m(n=4), 및 Null(n=3)이었다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 1형 또는 2형 바이러스로 감염된 CD163-null 돼지는 모든 시점에 바이러스혈증에 대해 음성이었고, 혈청전환하지 않았다. 예상대로, WT 돼지는 생산적으로 감염되어, 두 바이러스에 대해 감염 후 7일째에 50 μl PCR 반응당 106 주형에 근접한 평균 바이러스혈증 수준을 가지고 있었다. 14일째까지, 모든 WT 돼지는 혈청전환되었다(도 22, 패널 B 참고). PAM 감염 결과(표 15)와 일치하게도, 1형 바이러스로 감염된 5마리의 HL11m 돼지는 바이러스혈증 또는 PRRSV 항체의 증거를 나타내지 않았다. 2형 단리물인 NVSL로 감염된 모든 HL11m 돼지는 감염을 지원하고 혈청전환되었다(도 22, 패널 B). HL11m 돼지의 감소된 허용치의 존재는 불확실하였다. 4마리의 HL11m 돼지 중 3마리에 대한 평균 바이러스혈증은 WT 돼지와 유사하였다. 그러나, 1마리의 HL11m 돼지 #101(도 22에서 개방 사각형, 패널 A 우측 그래프)의 경우, HL11m 유전자형 그룹 내의 다른 돼지와 비교하여 바이러스혈증이 크게 감소하였다. 돼지 #101에 대한 바이러스혈증의 3 내지 4 로그 감소에 대한 설명은 명확하지 않았지만, 일부 HL11m 돼지가 PRRSV에 대해 덜 허용될 수 있음을 시사하였고, 이는 시험관내 PAM 감염 결과를 뒷받침하는 관찰이다(표 15). 모든 돼지에 동량의 바이러스를 접종하고, WT 돼지와 함께 섞은 상태를 유지하였으므로, 돼지 #101의 더 낮은 바이러스혈증은 더 적은 양의 바이러스 또는 적은 노출의 결과는 아니였다. 대식세포의 유세포측정은 돼지 #101에 대한 CD163 발현이 다른 HL11m 돼지와 대등하다는 것을 보여주었다(데이터는 도시되지 않음). 엑손 11 모방 서열에 차이가 없었다.
추가의 바이러스 감염 시험을 2개의 바이러스인 NVSL 97-7895 및 KS06-72109를 사용하여 수행하였다. 결과가 도 23에 나타나 있다. 돼지를 감염 후 35일 동안 추적하고, 데이터를 감염 후 3, 7, 11, 14, 21, 28 및 35일째에 취한 바이러스혈증 측정에 대한 곡선하 면적(AUC)으로서 보고하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, NVSL의 경우, NVSL로 감염된 7마리의 WT 돼지에 대한 평균 AUC 값은 7마리의 HL11m 돼지에 대해 168 +/- 8 대 165 +/- 15였다. KS06의 경우, 6마리의 WT 및 6마리의 HL11m 돼지에 대한 평균 AUC 값은 각각 156 +/- 9 및 163 +/-13이었다. 두 바이러스의 경우, WT 및 HL11m 돼지 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없었다(p> 0.05). 종합하면, 결과는 HL11m 돼지가 1형 PRRSV 감염을 지원하지 못하였지만, 2형 바이러스 감염에 대한 허용성을 유지하였다는 것을 보여주었다. 2형 단리물로 시험관내에서 감염된 HL11m 돼지의 PAM의 PRRSV 허용성의 감소가 있었지만, 이러한 차이는 돼지에게 전달되지 않았다. 도 23에 나타난 결과의 경우, 35일 감염 기간 동안 각각의 돼지에 대해 곡선하 면적(AUC)을 계산함으로써 바이러스 부하를 결정하였다. 감염 후 0, 4, 7, 10, 14, 21, 28 및 35일째에 취한 log10 PCR 바이러스혈증 측정을 사용하여 AUC 계산을 수행하였다. 수평선은 평균 및 표준 편차를 보여준다. 기호: WT = 야생형 돼지, HL11 = HL11m 유전자형 돼지; Null = CD163-null 유전자형.
논의
CD163은 혈액으로부터 과잉의 Hb를 제거하고 조직 손상에 반응으로 염증을 조절하는 데 중요한 대식세포 표면 단백질이다. 그것은 또한 바이러스 수용체로서 기능한다. CD163은 전염증 및 항염증 반응 모두에 참여한다(Van Gorp 등, 2010). CD163-양성 대식세포는 대식세포의 대안적으로 활성화된 M2 그룹 내에 위치하며, 이는 일반적으로 높은 식세포성 및 항염증성으로 설명된다. M2 대식세포는 기계적 조직 손상 또는 감염 후 정화 및 복구에 참여한다(Stein 등, 1992). 항염증 능력에서, CD163 발현은 항염증성 단백질, 예컨대 IL-10에 의해 상향조절된다(Sulahian, 등, 2002). 염증 동안, CD163은 혈액으로부터 순환하는 헴의 제거를 통해 산화를 감소시켜 염증을 감소시킨다. 헴 분해 생성물, 예컨대 빌베르딘, 빌리루빈, 및 일산화탄소는 강력한 항염증성 분자이다(Soares and Bach, 2009 및 Jeney 등, 2002). 전염증 능력에서, 항-CD163 항체 또는 박테리아에 의한 대식세포 표면 상의 CD163의 가교는 IL-6, GM-CSF, TNFα 및 IL-1β를 포함하는 전염증 사이토카인의 국소화된 방출을 초래한다(Van den Heuvel 등, 1999 및 Fabriek 등, 2009).
CD163이 없는 GE 돼지는 2형 PRRSV 단리물의 복제를 지원하지 못한다(Whitworth 등, 2016). 이 연구에서, 시험관내 감염 시험은 1형 및 2형 PRRSV 단리물의 광범위한 패널에 대한 CD163 null 표현형 대식세포의 내성을 입증하여, 잠재적으로 모든 PRRSV 단리물을 포함하도록 내성을 더 확장시킨다(표 15). 1형 및 2형 바이러스에 대한 CD163-null 표현형 대식세포의 내성을 생체내에서 확인하였다(도 22 및 도 23). 이들 결과에 기초하여, 이전에 문헌(Zhang and Yoo, 2015)에 기재된 다른 PRRSV 수용체의 기여를 배제할 수 있다. 예를 들어, Shanmukhappa 등(2007)은 CD151 플라스미드로 형질감염된 비허용된 BHK 세포가 PRRSV 복제를 지원하는 능력을 획득하였음을 보여주었고, 다클론성 항-CD151 항체와의 인큐베이션은 MARC-145 세포의 감염을 유의하게 감소시킨 것으로 나타났다. 또한, 원래 돼지류 인플루엔자 바이러스를 증식하는 데 사용하기 위해 개발된 유인원 세포주인 SJPL은 이전에 PRRSV 복제를 지원하는 것으로 나타났다(Provost, 등, 2012). SJPL 세포주의 중요한 특성은 CD151의 존재 및 시알로어드헤신(sialoadhesin) 및 CD163의 부재를 포함하였다. 종합해 보면, 이들 데이터는 CD151 존재만으로도 PRRSV 복제를 지원하는 데 충분하다는 설득력 있는 증거를 제공하였다. CD163 null 표현형을 갖는 대식세포 및 돼지에서 PRRSV 감염의 부재는 PRRSV에 대한 대체 수용체로서 CD151이 생물학적으로 무관하다는 것을 나타낸다.
PRRSV 표면 상에 GP2a, GP3, GP4 이종삼량체 복합체의 일부를 형성하는 바이러스 단백질 GP2a 및 GP4는 GP2 및 GP4 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 풀-다운(pull-down) 분석에서 CD163과 함께 공동 침전될 수 있다(Das, 등, 2009). 아마도, GP2 및 GP4는 하나 이상의 CD163 SRCR 도메인과 상호작용을 형성한다. 돼지 SRCR 5 및 hCD163-L1 SRCR 8의 동족체 사이에 도메인 스왑을 함유하는 돼지 CD163 cDNA 골격을 포함하는 시험관내 감염성 분석은 1형 바이러스에 의해 이용되는 영역을 SRCR 5로 추가로 국소화하였다(Van Gorp, 등, 2010). GP2/GP4 및 CD163 사이의 안정적인 상호작용이 SRCR 5를 통해 발생한다고 추측하는 것은 흥미롭다. GP3 및 GP5와 같은 추가의 바이러스 당단백질은 바이러스-수용체 복합체를 추가로 안정화시킬 수 있거나 공동-수용체 분자로서 기능할 수 있다. HL11m 대립유전자를 갖는 대식세포 및 돼지를 감염시킴으로써 SRCR 5에 대한 요건을 이 연구에서 조사하였고, 이는 돼지 엑손 7에서 33 bp 치환을 수행하여 CD163L1 SRCR 8 도메인을 재생성하였다. HL11m 대립유전자는 또한 유전적 변이에 양성인 세포의 선택을 위해 네오마이신 카세트를 포함하였다(도 17). HL11m 돼지는 WT PAM과 비교하여 감소된 수준이긴 하지만 PAM 상에서 CD163을 발현하였다(도 19, 패널 A 및 E 비교). 발현 감소는 엑손 11 모방체 및 다음의 인트론 사이에 위치한 네오마이신 카세트의 존재 때문일 가능성이 높았다. HL11m 돼지는 1형 바이러스 감염을 허용하지 않았고, 이는 SRCR 5의 중요성을 확인시켜 주었다. 그러나, HL11m 대식세포 및 HL11m 돼지는 2형 바이러스 감염을 지원하지 않았다. 바이러스 적정 및 백분율 감염 결과에 기초하여, HL11m 돼지로부터의 PAM은 WT 대식세포와 비교하여 바이러스에 대한 허용성의 전반적인 감소를 나타내었다(표 15 및 도 17). 허용성 감소는 변형된 CD163 단백질에 대한 바이러스의 친화성 감소와 조합된, HL11m 대식세포 상의 CD163의 수준 감소 때문일 수 있다. 2형 바이러스가 SRCR 5의 요구사항을 가지고 있고 L1 SRCR 8이 적합한 대체물로서 기능할 수 있다고 가정하면, 더 낮은 친화성은 인간 SRCR 8 및 돼지 SRCR 5 사이의 펩타이드 서열 차이에 의해 설명될 수 있다(도 18, 패널 B 참고). 그러나, PAM의 허용성 감소는 돼지에게 전달되지 않았다. HL11m 돼지에 대한 평균 바이러스혈증은 WT 돼지와 비교하여 유의하게 상이하지 않았다(도 23). PAM 외에도, 혈관내, 중격 및 림프양 조직 대식세포의 PRRSV 감염은 바이러스혈증에 기여한다(Lawson 등, 1997 및 Morgan 등, 2014). HL11m 돼지에서 전체 바이러스 부하를 유지하는 데 있어서 이들 및 다른 CD163-양성 세포 집단의 잠재적인 기여는 추가 연구할 가치가 있다.
SRCR 도메인의 결실을 갖는 CD163 플라스미드는 HEK 세포에서 안정적으로 발현되지만(Van Gorp 등, 2010), d7(1467) 및 d7(1280)에서 엑손 7 및 8의 결실은 CD163의 검출가능한 표면 발현의 결여를 초래하였다(도 19, 패널 D). 유세포분석에 사용된 2A10 mAB는 3개의 N-말단 SRCR 도메인(Van Gorp 등, 2010), 및 아마도 7번째 및 8번째 도메인(Sanchez, 등, 1999)을 인식하므로, 검출의 부재는 돌연변이된 단백질에서 2A10 에피토프의 제거로 인한 것이 아니였다. 소량의 CD163 발현이 일부 d7(129) 돼지로부터의 PAM 상에서 검출될 수 있지만(도 19, 패널 C 참고), 발현된 단백질의 양은 PAM 또는 돼지에서 PRRSV 감염을 지원하기에 충분하지 않았다. 엑손 7 및 8 결실 돌연변이체에서 CD163 발현의 부재는 완전히 이해되지 않지만, mRNA 및/또는 단백질 분해의 결과일 가능성이 높다.
2003년에, CD163은 아프리카 돼지류 열병 바이러스(ASFV; Sanchez-Torres 등, 2003)에 대한 수용체로서 확인되었다. 이 결론은 감염된 대식세포가 성숙한 CD163-양성 표현형을 갖고, 항-CD163 항체, 예컨대 2A10이 시험관내에서 대식세포의 ASFV 감염을 차단한다는 관찰에 기초하였다. CD163-null 돼지가 ASFV 감염에 내성인지 여부는 아직 결정되지 않았다.
PRRSV 수용체에 대한 변형을 포함하는 세포 배양 모델은 PRRSV 유입, 복제 및 발병의 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하였다. 이 연구의 한 가지 독특한 측면은 수용체 변형된 돼지를 사용하여 생체내에서 병렬 실험을 수행하는 것이었다. 이 연구는 전세계 양돈 산업이 직면하는 가장 심각한 질환 중 하나에 대한 예방적 치료를 개발하는 타당성에 중요한 영향을 미친다.
실시예 4: 모계 CD163 의 녹아웃은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 감염으로부터 태아를 보호한다.
상기 실시예 1 내지 3은 CD163 유전자의 완전한 녹아웃(KO)을 갖는 돼지가 대식세포 상에서 CD163 발현이 결여되고 PRRSV 감염을 지원하지 못한다는 것을 입증한다(또한 Whitworth 등, 2016; Wells 등, 2017 참고). CD163 발현은 우성 형질이고 고전적인 멘델 방식으로 유전되므로, 정상 CD163 발현 및 기능을 갖는 자손은 KO CD163 -/- 암컷 돼지를 야생형(WT) CD163 +/+ 수컷과 교배함으로써 유래될 수 있다. 이 연구를 위해, 암컷(dam)의 CD163 KO 유전자형의 존재가 PRRSV로 모계 감염 후 태아를 보호하기에 충분할지 여부를 결정하기 위해 CD163 KO 어린 암퇘지를 WT 숫퇘지와 교배하여 이종접합성 CD163 +/- 태아를 생산하였다. 이 연구에서, 임신 109일 또는 모계 감염 후 20일 사이에 회수된 CD163-양성 태아는 CD163 수용체의 완전한 녹아웃을 갖는 암컷에서 PRRSV로부터 완전히 보호되었다. 결과는 농업의 경제적 어려움의 주요 원인인 PRRSV 관련 생식 질환을 제거하는 실용적인 수단을 보여준다.
물질 및 방법
CD163 유전자 편집. 모든 KO 대립유전자를 생성하는 데 사용된 CRISPR/Cas9 방법이 상기 실시예 1-3에 상세히 기재되어 있다. 야생형 동물 및 녹아웃, 또는 실시예 1-3에 기재된 바와 같이 생성되고 표 16에 기재된 대립유전자를 갖는 이종접합성 동물을 본 실시예에 기재된 실험에 사용하였다. 이들 대립유전자 각각은 실시예 1-3 및 PCT 공개 WO 제2017/023570호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 대립유전자 B, D 및 E에 대한 특정 편집은 또한 Whitworth 등, 2014에 기재되어 있으며, 대립유전자 C에서의 특정 편집(2 bp 삽입)은 Whitworth 등, 2016에 기재되어 있다. 표 16에 기재된 모든 대립유전자를 DNA 시퀀싱에 기초하여 확인하였다. 녹아웃 유전자형을 CD163 발현의 부재에 의해 확인하였고, 이는 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, 폐포 대식세포를 항-CD163 mAb인 2A10으로 염색함으로써 측정하였다.
PRRSV 감염. 이 연구에 사용된 PRRSV 균주인 NVSL 97-7895(NVSL)는 PRRS 낙태 폭풍을 겪고 있었던 미국 남동 아이오와의 무리로부터 1997년에 단리된 실험실 균주이다(Halbur 등, 1997). 낮은 계대 단리물로서 유지된 바이러스를 증식시키고 MARC-145 세포에서 적정하였다. 임신 89 내지 91일째에, 어린 암퇘지에게 5 mL의 배양 배지에 희석된 105 TCID50의 바이러스를 접종하였다. 접종물의 절반은 근육내 주사에 의해 투여하고, 나머지는 비강내로 투여하였다. 모든 어린 암퇘지를 감염된 우리 동료에 의해 떨어져 나온 바이러스에 지속적으로 노출되는 환경에 유지시켰다. 감염 전, 접종 후 7일(dpi), 및 안락사 시점에 어린 암퇘지로부터 혈액 샘플을 채혈하였다. 혈청으로부터 총 RNA를 단리한 다음 역전사효소 실시간 PRRSV PCR(Tetracore, Rockville, MD)에 의해 PRRSV 핵산을 측정하였다. 표준 곡선을 RT-PCR 키트에 제공된 정량화 표준을 사용하여 작성하였다. 결과를 25 μl 반응당 log10 주형으로서 보고하며, 이는 혈액 ml당 바이러스 RNA 주형의 수에 가깝다.
결과
이 연구에 사용된 녹아웃 대립유전자의 상세한 설명이 상기 표 16에 나타나 있다. 각각의 녹아웃 대립유전자는 mRNA에서 코돈 프레임시프트 이후에 미성숙 정지 코돈을 초래할 것으로 예측되는 엑손 7에 돌연변이를 가지고 있었다. WT 및 CD163 KO 부모 사이의 교배는 표 17에 요약되어 있다. 양성 감염 대조군으로서 역할을 하는 3마리의 암컷의 첫 번째 그룹은 CD163 +/+ 태아를 갖는 CD163 +/+ 암컷(++/++ 그룹)이었다. 두 번째 그룹(- -/+-)은 CD163 +/- 태아를 갖는 CD163 -/- 암컷이었다. 이 그룹에서, CD163 -/- 암컷은 PRRS 복제를 지원할 수 없는 반면, CD163 +/- 태아는 PRRS 감염에 대해 민감성을 유지한다. 그리고, 마지막으로, 세 번째 그룹(- -/- -)은 CD163 -/-- 태아를 갖는 CD163 -/- 암컷으로 구성되었다. 마지막 그룹의 경우, 암컷 및 태아 모두는 감염에 내성이어야 한다.
감염된 야생형(WT) 암컷에서의 임상 징후는 무기력 및 일시적 식욕부진을 포함하였다. KO 암컷은 임상 징후를 나타내지 않았다. 연구 기간 동안, 하나의 WT 암컷 139번은 임신 106일째(15 dpi)에 유산하였다. 7 dpi에 측정된 PRRSV 핵산은 암컷 139에 대해 반응당 5.5 log10 주형의 바이러스혈증 수준을 나타내었고, 이는 생산적인 PRRSV 감염의 존재를 입증한다. 15 및 20 dpi 사이에, 나머지 모든 암컷을 안락사시키고, 자궁각(uterine horn)을 즉시 제거하였다. 각각의 뿔의 끝에서 시작하여, 태아 및 태반을 제거하고 해부학적 병리의 존재에 대해 평가하였다. 각각의 태아로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액을 얻을 수 없는 경우, 복강으로부터 체액 샘플을 수집하였다. 각각의 암컷으로부터 회수된 태아의 수가 표 17에 열거되어 있다. CD163 WT 그룹(++/++)(유산한 암컷 포함)의 경우, 태아의 수는 16, 14 및 12마리(평균 =14.0)였다. CD163 +/- 태아를 갖는 CD163 KO 암컷(- -/+- 그룹)은 14, 17 및 11마리의 태아(평균= 13.6)를 생성하였다. CD163 KO 태아를 갖는 CD163 KO 암컷(- -/- - 그룹)의 경우, 태아의 수는 7 및 9마리였다. 태아 바이러스혈증 및 총 병리학 결과가 도 24 및 표 18에 요약되어 있다.
도 24는 PRRSV 모계 감염 후 각각의 태아 결과를 도시한다. 좌측의 숫자는 각각의 암컷을 식별한다. 괄호 안의 각각의 암컷 아래는 반응당 log10 주형으로서 측정된 혈청 내 PRRS PCR의 결과이다. "N"은 PRRSV 핵산에 대해 음성이다(Ct>39). 태아는 각각의 자궁각 내의 수와 상대적 위치에 의해 식별된다. 별표는 복부 유체로부터 수득된 태아 PCR 샘플을 식별한다. 각각의 태아 아래의 숫자는 태아 혈청에서 PRRS PCR 결과이다(반응당 log10 주형). 각각의 원 안의 숫자는 해부학적 병리의 존재를 나타낸다: 1) 정상 태아; 2) 작은 태아; 3) 태반 변화, 예컨대 탈착된 태반 및/또는 괴사; 4) 태변(meconium)으로 얼룩진 태아; 5) 태아가 죽고 괴사됨. 소문자는 개별 태아의 유전자형을 식별한다(표 17 참고). 기호: a, A/A; b, C/A; c, B/A; d, E/A; e, B/C; f, B/D; g, D/C; h, D/D; i, E/C; j, E/D; ND 태아가 괴사했기 때문에 결정되지 않음; nd, 유전자형이 결정되지 않았음.
해부학적 수준에서, 2개의 CD163 WT(++/++) 암컷 138번 및 140번으로부터 유래된 태아의 50% 및 72%는 정상 태아보다 더 작은 것(모든 태아의 11%), 탈착된 또는 괴사성 태반을 갖는 태아(14%), 태변 얼룩(7%), 및 죽고 괴사된 태아(25%)를 포함하는 어느 정도의 병리를 나타내었다. 병리 관찰은 생식 PRRS의 전형이다. 동일한 한배새끼들은 높은 비율의 PRRSV 감염을 나타내었고, 태아의 92%는 PRRSV 핵산의 존재에 양성을 보였다. WT 암컷으로부터의 태아에 대한 PCR 결과는 태아 PRRSV 감염의 두 가지 중요한 특성을 설명한다. 첫째, 혈청에서 검출된 바이러스의 농도에서 태아 사이에 광범위한 편차가 있었고, 상이한 시간에 감염된 태아의 결과였다. 둘째, 바이러스혈증의 수준이 항상 병리와 상관관계가 있는 것은 아니었다. 예를 들어, 암컷 138번으로부터의 태아 5번은 높은 수준의 바이러스혈증(반응당 7.3 log10 주형)을 가지고 있었지만, 태아는 영향을 받지 않는 것처럼 보였다. 바이러스혈증 및 병리 사이의 차이에 대한 이유는 불확실하다. 한 가지 가능성은 태아 병리가 모계 쪽에서 발생하고 태아 바이러스혈증의 수준과 관련이 없는 조직 손상의 결과라는 것이다. 현장에서, 이러한 정상이지만 감염된 신생 새끼 돼지는 생산 시스템 전반에 PRRSV의 신속한 전파를 촉진하는 "슈퍼전파자(supershedder)"로서 기능할 수 있다. - -/+ -그룹(암컷 84, 87 및 122번)의 경우, 다른 한배새끼보다 작은 2마리의 태아를 제외하고는 모든 태아는 정상으로 보였다. 정상 크기보다 작은 것은 태반의 표면적을 감소시키는 자궁각 내의 밀집 결과일 가능성이 높으며, 따라서 발달하는 태아의 성장을 제한한다. - -/+ - 그룹 내의 모든 암컷 및 태아는 PRRSV 핵산의 존재에 대해 음성이었다. 마지막 그룹 - -/- -의 경우, 가시적인 병리가 없었고, 모든 암컷(86번 및 121번) 및 태아는 PRRSV 핵산에 대해 음성이었다.
이 연구의 결과는 암컷에서 CD163의 부재가 PRRSV 민감성 태아를 보호하기에 충분하다는 것을 입증한다. CD163 KO 암컷으로부터 유래된 CD163-양성 자손은 출생 직후 바이러스에 취약하지만, 자궁 내에서 PRRSV로부터의 보호는 경제적 손실 및 동물 고통의 주요 원인을 제거하는 수단을 제공한다.
본원에 개시된 실시예는 예시로서 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
상기에 비추어 볼 때, 본 발명의 몇 가지 목적이 달성되고 다른 유리한 결과가 획득된다는 것을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 상기 산물 및 방법에 다양한 변화가 이루어질 수 있으므로, 상기 설명에 포함되고 첨부된 도면에 표시된 모든 사항은 예시적이며 제한하는 의미가 아닌 것으로 해석되어야 한다.
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actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220 tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccaggctg gttggagctg acatgccctg ctctggtcgt gttgaagtaa 3060 aacatgcaga cacgtggggc tccgtctgtg attctgactt ctctctgcat gcggccaacg 3120 tgctgtgcag ggaactaaat tgcggcgatg cgatttccct ctcggtggga gatcactttg 3180 gaaaaggaaa tggactgacc tgggctgaaa aattccagtg tgaggggagc gagacccacc 3240 ttgcactctg cccaatagta caacaccctg aagacacatg tatccacagc agggaagtcg 3300 gcgtagtctg ctcaagtaag agtttactga aaataacact cttaaaatct tgttatgttt 3360 ttattcataa tgtgaatgag tagtagtgga aaataactac cagtttccta agcttataac 3420 ttcgtatagc atacattata cgaagttata agcctgcagg aattctaccg ggtaggggag 3480 gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc 3540 tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct 3600 ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc 3660 cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt 3720 ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc 3780 caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg 3840 ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg 3900 gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg 3960 ggcctttcga cctgcagcca ccatggccat gattgaacag gatggcctgc atgcaggttc 4020 tccagctgcc tgggtggaga gactgtttgg ctatgactgg gcacagcaga ccattggttg 4080 ctctgatgca gcagtgttca gactgtcagc ccagggcagg ccagtcctgt ttgtgaagac 4140 agacctcagt ggggctctca atgagctgca ggatgaggct gccagactct cctggctggc 4200 aacaactggg gtcccctgtg cagctgtcct ggatgtggtc acagaagctg gaagggactg 4260 gctcctgctg ggtgaggtgc ctgggcagga cctcctgtcc tctcacctgg ctccagctga 4320 gaaagtgtca atcatggctg atgccatgag aagactccac accctggacc cagccacctg 4380 cccctttgac caccaggcca agcacaggat tgagagggcc agaaccagga tggaggctgg 4440 cctggtggac caggatgacc tggatgaaga acaccagggc ctggcccctg ctgaactgtt 4500 tgccaggctc aaggcatcca tgccagatgg tgaggacctg gtggtgactc atggggatgc 4560 ctgcctgccc aacatcatgg tggaaaatgg aaggttctct ggcttcattg actgtggcag 4620 gctgggagtg gctgacaggt accaggacat tgccctggca accagggaca ttgcagaaga 4680 gctgggggga gaatgggcag acaggttcct ggtgctctat ggcattgcag cccctgactc 4740 ccagagaatt gccttctaca gactgctgga tgagttcttc taaatcgatt ataatcagcc 4800 ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc 4860 tgaaacataa aatgaatgca atgttgttgt taaacttgtt tattgcagct tataatggtt 4920 acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 4980 gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtgg aaaataacta ccagtttcct aagcttataa 5040 cttcgtatag catacattat acgaagttat aagctagaca aaagtatctt accccaatgg 5100 tagccctgta cccaataaaa gtaggtgttc agtttcatat cctatgaaat accctcttga 5160 tacttttact ttgcatgagg atttagaaga aaaaagtttt actataatcc ttaacttagg 5220 aaattctttt gaattggaaa tgaaacacaa attgcttttc attgatatgc catatgatta 5280 tatgaataaa acatgaaatc ttcatattgg attctagtat atacccaagt aaatattttt 5340 tccctagaag agtgccaagt gtgttaaaac cttttggttt aataaagcag aaaaaaataa 5400 actctaaaaa tcataattaa aaatgaaatg cttttattta tagcaattaa ctacaacatg 5460 tttagactta catactatta aatataatat atttaagatc ccctcatgat aaatatgttc 5520 attattttgt aggctgttga tgcactaata tgtatgtaga ttactttgtg aattgccctt 5580 aataaaattt aaaactttag gctagtaaac ctgtaacact caacttagtt ctgaactatc 5640 tcactattct tttgcaagaa tttacttagg taatgccaac taatttattc caaggccaaa 5700 aagatgacaa tgtcttatat attataaaaa ctaataaaaa ccattttaaa acctagtata 5760 aatttaaagg tacttgctct tctggttcat ctcttctttt gtttacttct gctttcaaaa 5820 acttatttat tgtgaccata ttctttactt ccatttattg ttataattta taagatacta 5880 tacttgcaag caataaatgt tatcttttta gcttttaaat ggtctcattt gaaaagaata 5940 tataattagt aagtcatagc tactttaaat aaaaacttat tctttaagag attaaacact 6000 tctccaagtg atctgttttt ctttaattaa aacgttatta actcccaaaa tgatgttatt 6060 gtttttttat aatcttaaat accaataatt accaggtcta ttttgatttt gatacaggat 6120 aaaaactact attaattact taagaatgtg ttctttttta tatgtaccat tttcatgatc 6180 aaagttggtg atatgactga ggttttgatt attattaaac agatagttaa tatgatatat 6240 tcctcatttt tccaaatgaa aggaaaaatg tcttatatgg aggaaaagat tggggcaggg 6300 ggattagtaa attattactt aaatatctga ataggaggat ttttcaatga aaggataaag 6360 gaagaatgat tgtatcatct gaatctttcc ctccctttcc tggagtttgt cctttcaacc 6420 cagtatacct accactccct tcatcaccta ctttcccatt acagtcccta tgtgttgggt 6480 ggtaactatt ttgttttggt gttaatatcc aagtttccct taataacacc tagtgaatgg 6540 aggaaggatg agcataccta cccatcagac atatttagcc accatattta atcaacaagc 6600 atgaagaaag gaagctagcc tctccccttc ctttcctcct gcctctctct ctcttctctg 6660 tcctcgctcc ctttcttccc atcaatattt tcagagcacc tcttatgcgc caggcattgg 6720 gatactcaaa ctggaggaaa caagaaaaaa aaaaaaaaaa ggcgaagacc tcagggaaat 6780 ttatattgct gctatatttt tttgagccta gtgtaaatta aaattcctta atgctgtgcc 6840 ttttaaaaac acaaataagc aaaatagttt atttcttcaa cagttaaatc cttagggtag 6900 gaaagtgatt caggatctat tgctactatt aactcttctt tcattttcac acaggataca 6960 cacaaatccg cttggtgaat ggcaagaccc catgtgaagg aagagtggag ctcaacattc 7020 ttgggtcctg ggggtccctc tgcaactctc actgggacat ggaagatgcc catgttttat 7080 gccagcagct taaatgtgga gttgcccttt ctatcccggg aggagcacct tttgggaaag 7140 gaagtgagca ggtctggagg cacatgtttc actgcactgg gactgagaag cacatgggag 7200 attgttccgt cactgctctg ggcgcatcac tctgttcttc agggcaagtg gcctctgtaa 7260 tctgctcagg taagagaata agggcagcca gtgatgagcc actcatgacg gtgccttaag 7320 agtgggtgta cctaggagtt cccattgtgg ctcagtggta acaaactcga ctggtatcca 7380 tgagggtatg ggtttgatcc ctggccttgc tcaatgggtt aaggatccag cattgctgtg 7440 agctgtggta taggttgcag actctgctca ggtcccatgt tgctgtgatt gtggtgtagg 7500 ctgactgctg cagcttcaat ttgaccccta gcccgggaat ttccataggc cacacgtgca 7560 gcactaagga aggaaaaaaa gaaaaaaaaa aaaaaagagt gggtgtgcct atagtgaaga 7620 acagatgtaa aagggaagtg aaagggattc ccccattctg agggattgtg agaagtgtgc 7680 cagaatatta acttcatttg acttgttaca gggaaagtaa acttgacttt cacggacctc 7740 ctagttacct ggtgcttact atatgtcttc tcagagtacc tgattcattc ccagcctggt 7800 tgacccatcc ccctatctct atggctatgt ttatccagag cacatctatc taacactcca 7860 gctgatcttc ctgacacagc tgtggcaacc ctggatcctt taaccaactg tgccaggctg 7920 gagatcaaac ctaagcctct gcagcaaccc aagctgctgc agtcagattt ttaaccccct 7980 gtgccactgt gggtatctcc gatattttgt atcttctgtg actgagtggt ttgctgtttg 8040 cagggaacca gagtcagaca ctatccccgt gcaattcatc atcctcggac ccatcaagct 8100 ctattatttc agaagaaaat ggtgttgcct gcataggtga gaatcagtga ccaacctatg 8160 aaaatgatct caatcctctg aaatgcattt tattcatgtt ttatttcctc tttgcaggga 8220 gtggtcaact tcgcctggtc gatggaggtg gtcgttgtgc tgggagagta gaggtctatc 8280 atgagggctc ctggggcacc atctgtgatg acagctggga cctgaatgat gcccatgtgg 8340 tgtgcaaaca gctgagctgt ggatgggcca ttaatgccac tggttctgct cattttgggg 8400 aaggaacagg gcccatttgg ctggatgaga taaactgtaa tggaaaagaa tctcatattt 8460 ggcaatgcca ctcacatggt tgggggcggc acaattgcag gcataaggag gatgcaggag 8520 tcatctgctc gg 8532 <210> 119 <211> 4538 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 119 tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60 agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120 ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180 tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240 ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300 ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360 attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420 tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480 gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540 gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600 cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660 tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720 atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780 caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840 gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900 tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960 aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020 tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080 actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140 agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200 aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260 cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320 ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380 tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440 cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500 atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560 cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620 aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680 aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740 gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800 cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860 gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920 gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980 tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040 gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100 cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160 aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220 tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280 tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340 tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400 taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460 atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520 aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580 ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640 tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700 gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760 aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820 agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880 ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940 tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000 cccacaggaa acccagctca acattcttgg gtcctggggg tccctctgca actctcactg 3060 ggacatggaa gatgcccatg ttttatgcca gcagcttaaa tgtggagttg ccctttctat 3120 cccgggagga gcaccttttg ggaaaggaag tgagcaggtc tggaggcaca tgtttcactg 3180 cactgggact gagaagcaca tgggagattg ttccgtcact gctctgggcg catcactctg 3240 ttcttcaggg caagtggcct ctgtaatctg ctcaggtaag agaataaggg cagccagtga 3300 tgagccactc atgacggtgc cttaagagtg ggtgtaccta ggagttccca ttgtggctca 3360 gtggtaacaa actcgactgg tatccatgag ggtatgggtt tgatccctgg ccttgctcaa 3420 tgggttaagg atccagcatt gctgtgagct gtggtatagg ttgcagactc tgctcaggtc 3480 ccatgttgct gtgattgtgg tgtaggctga ctgctgcagc ttcaatttga cccctagccc 3540 gggaatttcc ataggccaca cgtgcagcac taaggaagga aaaaaagaaa aaaaaaaaaa 3600 aagagtgggt gtgcctatag tgaagaacag atgtaaaagg gaagtgaaag ggattccccc 3660 attctgaggg attgtgagaa gtgtgccaga atattaactt catttgactt gttacaggga 3720 aagtaaactt gactttcacg gacctcctag ttacctggtg cttactatat gtcttctcag 3780 agtacctgat tcattcccag cctggttgac ccatccccct atctctatgg ctatgtttat 3840 ccagagcaca tctatctaac actccagctg atcttcctga cacagctgtg gcaaccctgg 3900 atcctttaac caactgtgcc aggctggaga tcaaacctaa gcctctgcag caacccaagc 3960 tgctgcagtc agatttttaa ccccctgtgc cactgtgggt atctccgata ttttgtatct 4020 tctgtgactg agtggtttgc tgtttgcagg gaaccagagt cagacactat ccccgtgcaa 4080 ttcatcatcc tcggacccat caagctctat tatttcagaa gaaaatggtg ttgcctgcat 4140 aggtgagaat cagtgaccaa cctatgaaaa tgatctcaat cctctgaaat gcattttatt 4200 catgttttat ttcctctttg cagggagtgg tcaacttcgc ctggtcgatg gaggtggtcg 4260 ttgtgctggg agagtagagg tctatcatga gggctcctgg ggcaccatct gtgatgacag 4320 ctgggacctg aatgatgccc atgtggtgtg caaacagctg agctgtggat gggccattaa 4380 tgccactggt tctgctcatt ttggggaagg aacagggccc atttggctgg atgagataaa 4440 ctgtaatgga aaagaatctc atatttggca atgccactca catggttggg ggcggcacaa 4500 ttgcaggcat aaggaggatg caggagtcat ctgctcgg 4538 <210> 120 <211> 101 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 120 Pro Arg Leu Val Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu Val 1 5 10 15 Gln His Gly Asp Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Ser Asp Phe Ser Leu 20 25 30 Glu Ala Ala Ser Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val 35 40 45 Ser Leu Leu Gly Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp 50 55 60 Ala Glu Glu Phe Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu Ser Leu Cys 65 70 75 80 Pro Val Ala Pro Arg Pro Asp Gly Thr Cys Ser His Ser Arg Asp Val 85 90 95 Gly Val Val Cys Ser 100 <210> 121 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Leu Arg Leu Val Asp Gly Asp Ser Arg Cys Ala Gly Arg Val Glu Ile 1 5 10 15 Tyr His Asp Gly Phe Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Gly Trp Asp Leu 20 25 30 Ser Asp Ala His Val Val Cys Gln Lys Leu Gly Cys Gly Val Ala Phe 35 40 45 Asn Ala Thr Val Ser Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Pro Ile Trp 50 55 60 Leu Asp Asp Leu Asn Cys Thr Gly Met Glu Ser His Leu Trp Gln Cys 65 70 75 80 Pro Ser Arg Gly Trp Gly Gln His Asp Cys Arg His Lys Glu Asp Ala 85 90 95 Gly Val Ile Cys 100

Claims (41)

  1. 돼지 태아를 자궁 내에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 감염으로부터 보호하는 방법으로서, 암컷 돼지 동물을 수컷 돼지 동물과 브리딩(breeding)시키는 것을 포함하되,
    상기 암컷 돼지 동물은 그것의 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 변형된 염색체 서열을 포함하며, 상기 변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 인코딩하는 유전자에서의 삽입, CD163 단백질을 인코딩하는 유전자에서의 결실, 또는 이들의 조합이고,
    상기 삽입은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍의 삽입, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍의 삽입, 및 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,147과 3,148 사이의 1개의 염기쌍의 삽입으로부터 선택되며;
    상기 결실은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,137에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 11개의 염기쌍의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,818에서 뉴클레오타이드 4,097까지의 1280개의 염기쌍의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 488에서 뉴클레오타이드 2,417까지의 1930개의 염기쌍의 결실로서, 결실된 서열은 뉴클레오타이드 488에서 시작하는 12개의 염기쌍 삽입으로 대체된 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,044에서 뉴클레오타이드 3,172까지 엑손 7에서 129개의 염기쌍의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,431에서 뉴클레오타이드 3,897까지의 1467개의 염기쌍의 결실, CD163 단백질을 인코딩하는 유전자의 엑손 7에서의 인-프레임 결실, CD163 단백질을 인코딩하는 유전자의 엑손 7 및 엑손 8의 결실, 엑손 7에 정지 코돈의 삽입을 야기하는 CD163 단백질을 인코딩하는 유전자의 엑손 7에서의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,024에서 뉴클레오타이드 3,146까지의 123개의 염기쌍의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,724에서 뉴클레오타이드 4,096까지의 1373개의 염기쌍의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,440에서 뉴클레오타이드 4,160까지의 1720개의 염기쌍의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,024에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 124개의 염기쌍의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,030에서 뉴클레오타이드 3,159까지의 130개의 염기쌍의 결실, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,030에서 뉴클레오타이드 3,161까지의 132개의 염기쌍의 결실, 및 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,145에서 뉴클레오타이드 3,172까지의 28개의 염기쌍의 결실로부터 선택되고;
    상기 변형된 염색체 서열은 그것의 CD163 유전자의 대립 유전자에서 임의의 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 암컷 돼지 동물의 PRRSV에 의한 감염에 대한 감수성과 비교하여 PRRSV 감염에 대한 암컷 돼지 동물의 감수성을 감소시키고;
    상기 수컷 돼지 동물은 적어도 하나의 야생형 CD163 대립유전자를 포함하며;
    상기 돼지 태아가 자궁 내에서 PRRSV 감염으로부터 보호되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수컷 돼지 동물은 2개의 야생형 CD163 대립유전자를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형된 염색체 서열은 1형 PRRSV 바이러스, 2형 PRRSV, 또는 1형 및 2형 PRRSV 바이러스 둘 모두에 대한 상기 암컷 돼지 동물의 감수성을 감소시키는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 변형된 염색체 서열은 NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, 렐리스타드, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 PRRSV 단리물에 대한 상기 암컷 돼지 동물의 감수성을 감소시키는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 유전자적으로 편집된 암컷 돼지 동물을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease)를 사용하여 유전적으로 편집되었던 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 설계된 호밍 엔도뉴클레아제를 포함하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 클러스터링된 규칙적 공간사이 짧은 회문성 반복 (CRISPR) 시스템, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 재조합효소 융합 단백질, 메가뉴클레아제, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자적으로 편집되었던 것인, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 대립유전자 둘 모두에서 동일한 변형된 염색체 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 제1 대립유전자에서 제1 변형된 염색체 서열 및 CD163 유전자의 제2 대립유전자에서 제2 변형된 염색체 서열을 포함하되, 상기 제1 및 제2 변형된 염색체 서열은 서로 상이한 것인, 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형된 염색체 서열은, 변형된 염색체 서열이 없는 암컷 돼지 동물에서의 CD163 단백질 생산 또는 활성과 비교하여 CD163 단백질 생산 또는 활성이 감소되도록 하는, 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형된 염색체 서열은 상기 암컷 돼지 동물에 의해 기능적 CD163 단백질을 실질적으로 생성하지 않는, 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 CD163 단백질을 생성하지 않는, 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 각각의 대립유전자는 엑손 7에서의 변형, 엑손 8에서의 변형, 엑손 7 또는 엑손 8과 인접한 인트론에서의 변형, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자는 CD163 유전자의 엑손 7에서의 변형을 포함하는, 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자 중 하나 또는 둘 모두에서의 변형 염색체 서열은 미스코딩(miscoding)을 초래하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 미스코딩은 CD163 유전자의 대립유전자에서의 미스코딩의 다운스트림에서 미성숙 정지 코돈을 초래하는, 방법.
  25. 삭제
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 변형은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입을, 동일한 대립유전자 상의 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,573에서 뉴클레오타이드 2,949까지의 377개의 염기쌍 결실과 함께 포함하고, 그리고 상기 2개의 염기쌍 삽입은 디뉴클레오타이드 AG를 포함하고;
    상기 변형은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,147과 3,148 사이의 1개의 염기쌍 삽입을 포함하고, 그리고 상기 1개의 염기쌍 삽입은 단일 아데닌 잔기를 포함하고;
    상기 변형은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍 삽입을 포함하고, 그리고 상기 7개의 염기쌍 삽입은 서열 TACTACT (서열번호: 115)를 포함하고;
    상기 변형은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 488에서 뉴클레오타이드 2,417까지의 1930개의 염기쌍 결실을 포함하되, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 488에서 시작하는 12개의 염기쌍 삽입으로 대체되고, 그리고 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,044에서 뉴클레오타이드 3,172까지 엑손 7에서의 추가의 129개의 염기쌍 결실이 있고, 그리고 상기 12개의 염기쌍 삽입은 서열 TGTGGAGAATTC (서열번호: 116)을 포함하거나; 또는
    상기 변형은 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,113에서 뉴클레오타이드 4,494까지의 1382개의 염기쌍 결실을 포함하되, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 3,113에서 시작하는 11개의 염기쌍 삽입으로 대체되고, 그리고 상기 11개의 염기쌍 삽입은 서열 AGCCAGCGTGC (서열번호: 117)을 포함하는, 방법.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물에서의 CD163 유전자의 대립유전자 중 적어도 하나는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 포함하는, 방법:
    참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,148과 뉴클레오타이드 3,149 사이의 7개의 염기쌍 삽입;
    동일한 대립유전자 상의 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 2,573에서 뉴클레오타이드 2,949까지의 377개의 염기쌍 결실과 함께, 참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,149와 3,150 사이의 2개의 염기쌍 삽입;
    참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,137에서 뉴클레오타이드 3,147까지의 11개의 염기쌍 결실;
    참조 서열 서열번호: 47과 비교하여 뉴클레오타이드 3,113에서 뉴클레오타이드 4,494까지의 1382개의 염기쌍 결실로서, 상기 결실된 서열은 뉴클레오타이드 3,113에서 시작하는 11개의 염기쌍 삽입으로 대체되는, 상기 염기쌍 결실;
    및 이들의 임의의 조합.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물의 CD163 유전자의 대립유전자는 삽입 또는 결실 외부에 있는 상기 염색체 서열 영역에서 서열번호: 47에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함하는, 방법.
  31. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자에서 서열번호: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 또는 119를 포함하는 염색체 서열을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 CD163 유전자의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자에서 서열번호: 99, 102, 103, 또는 113을 포함하는 염색체 서열을 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 하기를 포함하는, 방법:
    (a) CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 99를 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 103를 포함하는 염색체 서열;
    (b) CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 113을 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 99를 포함하는 염색체 서열;
    (c) CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 99를 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 102를 포함하는 염색체 서열; 또는
    (d) CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 113을 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 102를 포함하는 염색체 서열.
  34. 제33항에 있어서, 상기 암컷 돼지 동물은 하기를 포함하는, 방법:
    (a) CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 99를 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 103를 포함하는 염색체 서열; 또는
    (b) CD163 유전자의 하나의 대립유전자에서 서열번호: 113을 포함하는 염색체 서열, 및 CD163 유전자의 다른 대립유전자에서 서열번호: 99를 포함하는 염색체 서열.
  35. 제1항 또는 제2항에 있어서, 브리딩은 CD163 유전자의 단일 대립유전자에서 변형된 염색체 서열을 포함하는 하나 이상의 태아를 생성하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 태아는 야생형 암컷 돼지 동물에서 자궁내 태아와 비교하여, 자궁 내에 있는 동안 PRRSV에 의한 감염에 대한 감수성을 감소시켰던 것인, 방법.
  37. 제1항 또는 제2항에 있어서, 브리딩은 상기 암컷 돼지 동물을 상기 수컷 돼지 동물과 교배시키는 것을 포함하는, 방법.
  38. 제1항 또는 제2항에 있어서, 브리딩은 수컷 동물로부터 얻은 정자로 상기 암컷 동물에게 인공 정자주입하는 것을 포함하는, 방법.
  39. 제1항 또는 제2항에 있어서, 브리딩은 수정된 난모세포를 상기 암컷 돼지 동물의 생식관으로 옮기는 것을 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 수정된 난모세포는 수컷 돼지 동물로부터 얻은 정자로 난모세포의 시험관내 수정에 의해 생성되었던 것인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 시험관내 수정은 수컷 돼지 동물로부터 얻은 정자를 난모세포의 세포질내에 주사하는 것을 포함하는, 방법.
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