KR102676631B1

KR102676631B1 - 과민성 방광의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102676631B1
Application number: KR1020210133441A
Authority: KR
Inventors: 박철승; 안진희; 이나라샘; 수바나 하우샤바우 파기레; 하우샤바우 시바지 파기레
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2020-10-07
Filing date: 2021-10-07
Publication date: 2024-06-19
Anticipated expiration: 2041-10-07
Also published as: WO2022075780A1; KR20220046505A

Abstract

본 발명은 과민성 방광 치료에 관한 것으로서, 구체적으로, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이용한 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물; 과민성 방광 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물; 및 과민성 방광 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 또한, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 BKca 채널을 활성화 시키는 효능이 우수하여, BKca 채널의 비활성화에 의한 방광 평활근 수축을 억제하고, 이로 인한 과민성 방광을 치료 또는 개선할 수 있기에, 과민성 방광 치료제로서 널리 사용될 수 있다.

Description

과민성 방광의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for preventing or treatment of overactive bladder}

본 발명은 과민성 방광 치료에 관한 것으로서, 구체적으로, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이용한 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물; 과민성 방광 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물; 및 과민성 방광 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 또한, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

과민성 방광(overactive bladder)이라는 용어는 요역동학검사(urodynamic study)에서 배뇨근 과활동성(detrusoroveractivity)이 관찰되고, 특징적으로 배뇨주기(micturition cycle)의 충만기(filling phase)에 불수의적인 방광수축이 나타나는 만성증상을 이름 붙이기 위하여 1988년 국제요실금학회(International Continence Society)에서 도입되었다. 이후, 국제요실금학회는 과민성 방광을 증상증후군으로 다시 정의하였는데, 여기에 포함되는 증상은 소변못참음(urinary urgency), 절박요실금(urgency urinary incontinence), 주간 빈뇨(increased daytime frequency), 야간뇨(nocturia)가 있다.

2002년 국제요실금학회에서는 요역동학검사에서 반드시 배뇨근 과활동성(detrusor overactivity: 요역동학검사에서 방광이 충만될 때 자발적으로 발생하거나 유발되는 억제 불가능한 배뇨근수축)이 증명되어야 할 필요는 없다고 하였으나, 과민성 방광으로 진단받은 환자의 50%이상에서는 요역동학검사에서 배뇨근 과활동성이 관찰되므로 과민성 방광 증상을 유발하는 중요한 병태생리학적 변화로 생각되고 있다. 또한, 전립선비대 등의 이유로 방광출구폐색(bladder outlet obstruction)이 발생하는 경우에 이차적으로 방광비후(bladder hypertrophy)가 유발되는데, 이에 따른 부분적 탈신경초민감성(denervation supersensitivity)으로 수축자극에 대하여 방광배뇨근이 민감하게 반응할 수 있다고 한다. 클리브랜드 클리닉(Cleveland Clinic)에서는 과민성 방광 환자들에게 몇 가지 음식을 피하라고 권하고 있는데, 이를 고려하자면 과민성 방광 환자의 방광배뇨근은 정상적인 환경에서도 흥분성이 증대되어 있을 가능성이 있다.

EPIC(European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) 연구에 따르면 지역사회인구의 약 12%가 과민성 방광 증상을 보이며, 이들의 약 50%가 과민성 방광 증상 때문에 심각한 고통을 받는다고 한다. 과민성 방광 증상을 가지는 환자들은 사회 활동 및 대인 관계에서 고립되기 쉬운데, 이는 과민성 방광 환자가 사회생활을 하면서 소변 누출(leakage of urine)이 발생하는 것을 두려워하기 때문이다. 요실금은 과민성 방광 환자의 3분의 1에서 나타나며, 나머지 3분의 2는 요실금으로는 고생하지 않는다. 요실금은 절박요실금 단독으로 나타나거나, 절박요실금과 복압성 요실금(stress incontinence)이 같이 나타나는 복합성 요실금(mixed incontinence)으로 나타날 수 있다. 가족들이 가장 불편해 하는 것은 빈뇨인데, 빈뇨로 말미암아 가족들의 활동이 제약 받기 때문이다. 반면, 야간뇨는 잠을 설치게 하여 환자에게 피로감을 증가시킨다. 과민성 방광 증상의 직접 또는 간접적인 효과로서 과민성 방광 환자에서 우울증의 위험이 높아진다. 또한 절박성 요실금 환자의 낙상 위험은 절박성 요실금이 없는 군에 비해 30% 가량 높으며 이로 인한 골절의 위험도 3% 가량 높은 것으로 나타났다.

과민성 방광의 치료 목표는 방광의 수축력을 감소시키고, 방광용량(bladder capacity)을 증가시키며, 배뇨감각을 둔화시켜 방광충만, 즉 요저장을 쉽게 하도록 하는 것이다. 과민성 방광의 일차 치료방법으로는 행동치료와 약물 치료이다. 과민성 방광의 약물치료방법 중에서 근거수준이 가장 높은 것은 항무스카린제제(antimuscarinic drug)이다. 개별약물의 효능은 거의 비슷하다고 한다. 방광근의 수축은 신경말단에서 분비되는 아세틸콜린(acetylcholine)이 방광근육에 존재하는 무스카린 수용체에 작용할 때 일어난다. 항무스카린 제제는 아세틸콜린이 무스카린 수용체에 작용하는 것을 경쟁적으로 억제함으로써 불수의적 배뇨근 수축을 억제한다. 항무스카린 제제는 배뇨주기의 충만기에 소변못참음(urgency)을 감소시키고 방광용량을 증가시킨다. 그러나 배뇨를 위하여 방광이 수축하는 단계에서는 많은 양의 아세틸콜린이 분비되기 때문에 치료 용량의 항무스카린 약물은 배뇨 시 배뇨근 수축에는 영향을 미치지 않아 방광의 수축력이 정상인 경우 배뇨 후 잔뇨량을 증가시키지 않는다. 현재 권장되는 항무스카린제제로는 다리페나신(Darifenacin), 페소테로딘(Fesoterodine), 옥시뷰티닌(Oxybutynin), 프로피베린(Propiverine), 솔리페나신(Solifenacin), 톨테로딘(Tolterodine), 트로스피움(Trospium) 등이 있는데, 과민성 방광 증상개선 효능은 서로 비슷하므로 치료약물을 선택할 때는 이상반응 양상을 고려하여야 한다.

상기 항무스카린제제를 사용하였을 때 나타날 수 있는 이상반응 중, 중증도 이상인 것에는 위장관 통증, 위염, 구역, 구토, 흐려보임(blurred vision), 요폐(urinary retention), 배뇨장애(voiding difficulty), 배뇨통(dysuria), 요로감염(urinary tract infection), 피로(fatigue), 졸림(somnolence), 진정(sedation), 불면증(insomnia), 혼동(confusion), 인지장애(cognitive impairment), 우울증(depression), 두통(headache), 두근거림(palpitation), 빈맥(tachycardia), 고혈압, 기립성 조절장애(orthostatic disturbance), 낙상(fall) 등이 있다.

따라서, 과민성 방광 증상의 효과적인 치료법에서 이상반응이 적은 방법을 개발하면 많은 환자들에게 큰 도움을 줄 수 있을 것이며, 배뇨근 과수축으로 인한 과민성 방광 증상을 개선하고 치료할 수 있는 효과적이며 안전한 치료법의 개발하고자, 국내등록특허 10-1513800에서는 생강 추출물을 유효성분으로 하는 과민성 방광의 예방 또는 치료 효능에 대하여 개시하고 있으며, 국내등록특허 10-1362539에서는 호박씨오일 또는 호박씨추출물, 대두추출물 및 마그네슘을 주성분으로 포함하는 조성물의 과민성 방광 증후군 예방 또는 치료 효능에 대하여 개시하고 있으나, 아직까지 연구가 미미한 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 이상반응부작용이 적으며, 안전한 과민성 방광 증상을 치료하기 위한 치료제를 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 본 발명의 화합물이 BKca 채널을 활성화시켜 방광 근육의 이완을 통한 과민성 방광을 예방 또는 치료하는 효능이 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 과민성 방광 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 과민성 방광 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 과민성 방광 예방 또는 치료는 방광 평활근 이완, BKca 채널의 활성화, 또는 BKca 채널의 활성화를 위한 전압 역치가 감소되어 최대 열림-가능성 상태의 증가에 의해 이루어지는 것일 수 있으며, BKca 채널 열림 상태의 안정한 유지에 의해 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 하나의 실시예에서는, compound 4(CTIBD)의 BKca 채널 활성화 효능을 세포-기반 형광 어세이(도 2 내지 도 4) 및 전기생리 검사(도 5)를 통해 확인하였고, 이를 방광 평활근에 전처리 한 뒤, ACh로 수축을 유도하여도 대조군과 비교하여 수축이 억제되어 평활근이 이완되는 효능을 확인하였으며(도 8), 랫트 모델에서도 실험한 결과, 배뇨 현상이 감소하는 것을 확인하여(도 9), 과민성 방광 개선 또는 치료 달성을 확인하였다.

본 발명에서 과민성 방광의 예방 또는 치료를 달성하는 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카르복시메틸페닐, 또는 메톡시피리디닐이고,

R₆는 수소 또는 할로겐임.

구체적으로, 상기 R₁ 내지 R₅의 할로겐은 플루오로, 클로로, 또는 브로모일 수 있으며, 보다 구체적으로 클로로일 수 있다.

구체적으로, 상기 R₆의 할로겐은 플루오로, 클로로, 또는 브로모일 수 있으며, 보다 구체적으로 클로로 또는 브로모일 수 있다.

하나의 예시로서, 상기 R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소 또는 클로로(Cl)이고, R₁ 내지 R₅중 적어도 하나 이상은 클로로인 것일 수 있다. 구체적으로, R₁ 내지 R₅ 중 하나 이상의 Cl 치환기를 가지는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, Cl 하나, 둘 혹은 2 이상을 가질 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2 내지 7로 표시되는 것일 수 있다:

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

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상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 4-(4-(4-클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젤-1,3-다이올 (4-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 CTIBD로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

또한, 본 발명에서는 상기 화학식 2로 표시되는 CTIBD의 우수한 BKca 채널 활성 및 이의 과민성 방광 치료 효능이 있음을 확인한 바, 유도체의 구조-활성상관(structure-activity relationship; SAR)을 조사하여, CTIBD와 유사한 또는 CTIBD 보다 뛰어난 BKca 채널 활성 및 이의 과민성 방광 치료 효능이 있는, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 CTIBD를 기반으로 신규 합성한 화합물을 확인하였으며, 이는 상기 화학식 3 내지 7로 표시되는 것일 수 있다.

상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 4-(4-(3,4-다이클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젤-1,3-다이올 (4-(4-(3,4-dichlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90178로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 4-(4-(2,3-다이클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젤-1,3-다이올 (4-(4-(2,3-dichlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90174으로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 4-(4-(3-클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젤-1,3-다이올 (4-(4-(3-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90172로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 6으로 표시되는 화합물은 4-(4-(2,4-다이클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젤-1,3-다이올 (4-(4-(2,4-dichlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90170으로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 7로 표시되는 화합물은 4-(4-(2-클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젤-1,3-다이올 (4-(4-(2-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90181로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

다른 하나의 예시로서, 상기 R₁, R₂, R₄ 및 R₅는 수소이고, 상기 R₃는 플루오로, 클로로, 브로모, 카르복시메틸페닐, 또는 메톡시피리디닐일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 8 내지 15로 표시되는 것일 수 있다:

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

.

상기 화학식 8로 표시되는 화합물은 4-(4-(4-플루오로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올 (4-(4-(4-fluorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90113으로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 9로 표시되는 화합물은 4-(4-(4-브로모페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올 (4-(4-(4-bromophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90114으로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 10으로 표시되는 화합물은 2-(4'-(5-(2,4-다이하이드록시페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-4-일)-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세트산 (2-(4'-(5-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-4-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)acetic acid)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90116으로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 11로 표시되는 화합물은 4-(4-(4-(6-메톡시피리딘-3-일)페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올 (4-(4-(4-(6-methoxypyridin-3-yl)phenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90120으로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 12로 표시되는 화합물은 4-클로로-6-(4-(4-클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올 (4-chloro-6-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90163으로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 13으로 표시되는 화합물은 4-클로로-6-(4-(4-플루오로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올 (4-chloro-6-(4-(4-fluorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90164로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 14로 표시되는 화합물은 4-(4-(4-브로모페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)-6-클로로벤젠-1,3-다이올 (4-(4-(4-bromophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)-6-chlorobenzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90165로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 15로 표시되는 화합물은 4-브로모-6-(4-(4-클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올 (4-bromo-6-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90176으로 명명하였으며, 상기 화합물의 BKca 채널 활성화로 인해 유도되는 방광 평활근 이완에 의한 뛰어난 과민성 방광 치료 또는 예방 효능을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

본 발명의 구체적인 하나의 실시예에서는, 상기 화합물들을 발굴하기 위하여 스크리닝을 진행하였으며(도 1), compound 1이 BKca 채널 활성 효능이 있음을 확인한 후, 동일한 방법으로 이의 유도체들의 구조-활성상관을 조사한 결과, compound 4(CTIBD)가 월등한 BKca 채널 활성화 효능이 있음을 세포-기반 형광 어세이(도 2 내지 도 4) 및 전기생리 검사(도 5)를 통해 확인하였고, 상기 CTIBD 화합물의 유도체들을 대상으로 동일한 방법을 통해 일정 수준 이상의 우수한 효능을 갖는 다수의 화합물을 확인하여(도 10 내지 도 13), CTIBD를 포함하는 과민성 방광 치료 및 개선 효능을 갖는 다수의 화합물을 발굴하였다.

본 발명에서의 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "유효성분"은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "과민성 방광(overactive bladder)"은 요역동학검사(urodynamic study)에서 배뇨근 과활동성(detrusoroveractivity)이 관찰되고, 특징적으로 배뇨주기(micturition cycle)의 충만기(filling phase)에 불수의적인 방광수축이 나타나는 만성증상을 이름 붙이기 위하여 1988년 국제요실금학회(International Continence Society)에서 도입되었으며, 이에 포함되는 증상은 소변못참음(urinary urgency), 절박요실금(urgency urinary incontinence), 주간 빈뇨(increased daytime frequency), 야간뇨(nocturia) 등이 있다.

본 발명에서의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물에 의해 질환의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서의 용어, "치료"는 상기 약학적 조성물에 의해 질환의 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서의 용어, "약학 조성물"은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

구체적으로, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 본 발명 조성물의 피부과색소 침착성 질환 증상의 예방 또는 치료 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균, 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적으로 허용가능한 담체는 비자연적 담체를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락틱액시드(Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(poly-L-lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버 등을 포함할 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 익상편 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 구체적인 하나의 실시예에서는, 방광 평활근 수축에 의한 과민성 방광 증상을 치료하고, 방광 평활근을 이완시키는 BKca 채널 활성화용 화합물을 발굴하기 위하여 스크리닝을 진행하였으며(도 1), compound 1이 BKca 채널 활성 효능이 있음을 확인한 후, 동일한 방법으로 이의 유도체들의 구조-활성상관을 조사한 결과, compound 4(CTIBD)가 월등한 BKca 채널 활성화 효능이 있음을 세포-기반 형광 어세이(도 2 내지 도 4) 및 전기생리 검사(도 5)를 통해 확인하였고, 전류 측정을 통해 CTIBD의 채널 활성화 메커니즘을 확인하였으며(도 6), 채널의 gating 동역학을 확인하였고(도 7), 이를 방광 평활근에 전처리 한 뒤, ACh로 수축을 유도하여도 대조군과 비교하여 수축이 억제되어 평활근이 이완되는 효능을 확인하였으며(도 8), 랫트 모델에서도 실험한 결과, 배뇨 현상이 감소하는 것을 확인하여(도 9), 본 발명의 CTIBD의 과민성 방광 개선 또는 치료 효능을 확인하였다.

또한, 본 발명의 구체적인 다른 하나의 실시예에서는, 상기 CTIBD의 유도체들을 동일한 방법으로 BKca 채널 활성화를 세포-기반 형광 어세이를 통해 일정 수준 이상의 우수한 효능의 다수의 화합물을 확인하여(도 10 내지 도 13), CTIBD를 포함하는 다수의 화합물의 과민성 방광 치료 및 개선 효능을 확인하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 과민성 방광 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

이때, 상기 용어 "약학적으로 허용 가능한 염", "유효성분", "약학 조성물", "과민성 방광", 및 "예방"은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "개선"이란, 본 발명의 조성물 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서의 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 그대로 첨가되거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 방부제, 살균제, 산화방지제, 착색제, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 강화제, 유화제, 증점제, 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 과민성 방광의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태는, 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 과민성 방광 예방 또는 치료방법을 제공한다.

이때, 상기 용어 "약학적으로 허용 가능한 염", "유효성분", "약학 조성물", "과민성 방광", "예방", 및 "치료"는 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "개체"는 주름 또는 피부 노화가 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2 ~ 3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 과민성 방광 개선 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태는, 화학식 1로 표시되는 화합물의 과민성 방광 예방 또는 치료 용도를 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₆는 수소 또는 할로겐임.

이때, 상기 용어 "과민성 방광" 및 "치료"는 상기에서 서술한 바와 같다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카르복시메틸페닐, 에톡시카보닐메틸페닐, 트리플루오로메틸페닐 또는 메톡시피리디닐이고,

R₆는 수소 또는 할로겐임.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 대해서는 전술한 바와 같으며, 추가로 R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카르복시메틸페닐, 에톡시카보닐메틸페닐, 트리플루오로메틸페닐 또는 메톡시피리디닐일 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 3 내지 17 중 어느 하나로 표시되는 것일 수 있으며, 이 때 화학식 3 내지 15에 대해서는 전술한 바와 같으며, 화학식 16 및 17은 다음과 같다. 또한, 상기 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 상기에서 서술한 바와 같다.

[화학식 16]

[화학식 17]

상기 화학식 16으로 표시되는 화합물은 에틸 2-(4'-(5-(2,4-다이하이드록시페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-4-일)-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세테이트 (ethyl 2-(4'-(5-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-4-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)acetate)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90118으로 명명하였으며, 상기 화합물은 일정 수준의 BKca 채널 활성화 효능이 있음을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

상기 화학식 17로 표시되는 화합물은 4-(3-(트라이플루오로메틸)-4-(4'-트라이플루오로메틸)-[1,1'-바이페닐]-4-일)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올 (4-(3-(trifluoromethyl)-4-(4'-(trifluoromethyl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 GM 90119로 명명하였으며, 상기 화합물은 일정 수준의 BKca 채널 활성화 효능이 있음을 확인하였으며, 이는 본 발명자에 의해 최초로 발견되었다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 BKca 채널을 활성화 시키는 효능이 우수하여, BKca 채널의 비활성화에 의한 방광 평활근 수축을 억제하고, 이로 인한 과민성 방광을 치료 또는 개선할 수 있기에, 과민성 방광 치료제로서 널리 사용될 수 있다.

도 1의 A는 세포-기반 형광 어세이를 통한 8,364개의 화합물 라이브러리의 스크리닝을 나타내는 그래프이다.
도 1의 B는 대표적인 8개의 화합물 및 vehicle(DMSO, 1%)의 형광 값을 RFU 값을 통해 나타내는 그래프이다.
도 1의 C는 대표적인 8개의 화합물 및 vehicle(DMSO, 1%)의 형광 값을 fold increase 값을 통해 나타내는 그래프이다.
도 2의 A는 compound 1 및 이의 유도체를 나타내는 모식도이다.
도 2의 B는 compound 1 및 이의 유도체의 형광 값 결과를 RFU 값을 통해 나타내는 그래프이다.
도 2의 C는 compound 1 및 이의 유도체의 형광 값 결과를 fold increase 값을 통해 나타내는 그래프이다.
도 3의 A는 compound 1, compound 4, 및 compound 7의 BKca 채널 강화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 세포-기반 형광 어세이를 통해 형광 값 결과를 RFU 값으로 나타내는 그래프이다.
도 3의 B는 compound 1, compound 4, 및 compound 7의 형광 값 결과를 fold increase 값을 통해 나타내는 그래프이다.
도 4의 A는 다양한 농도의 CTIBD를 활동과잉 돌연변이 BKca 채널을 발현하는 AD-293 세포에 처리한 후 이의 형광 값을 RFU를 통해 나타내는 그래프이다.
도 4의 B는 다양한 농도의 CTIBD를 활동과잉 돌연변이 BKca 채널을 발현하는 AD-293 세포에 처리한 후 이의 형광 값을 fold increase를 통해 나타내는 그래프이다.
도 5는 전기생리 검사를 통해 CTIBD에 의한 BKca 채널의 바깥 전류의 역강화 유도를 나타내는 그래프이다
도 6의 A는 CTIBD 및 vehicle 처리 후, BKca 채널의 전류 값을 나타내는 그래프이다
도 6의 B는 CTIBD의 G-V 관계에 대한 효능을 나타내는 그래프이다.
도 6의 C는 CTIBD의 V_1/2에 대한 효능을 나타내는 그래프이다.
도 7의 A는 CTIBD 또는 vehicle을 처리하였을 때 BKca 채널의 활성화 상태의 전류 값을 나타내는 그래프이다.
도 7의 B는 CTIBD 또는 vehicle을 처리하였을 때 BKca 채널의 비활성화 상태의 전류 값을 나타내는 그래프이다.
도 7의 C는 CTIBD 또는 vehicle을 처리하였을 때 BKca 채널의 활성화 시간-전도도 값을 나타내는 그래프이다.
도 7의 D는 CTIBD 또는 vehicle을 처리하였을 때 BKca 채널의 비활성화 시간-전도도 값을 나타내는 그래프이다.
도 8의 A는 CTIBD가 분리된 랫트 방광 힘줄의 ACh-유도 수축에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8의 B는 Ach-유도 수축의 피크에 따른 CTIBD의 Ach-유도 수축 완화 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9의 A는 증류수, 아세트산, 및 CTIBD에 의한 랫트 내 방광내압곡선을 나타내는 그래프이다.
도 9의 B는 증류수, 아세트산, 및 CTIBD에 의한 랫트 내 기저 압력을 나타내는 그래프이다.
도 9의 C는 증류수, 아세트산, 및 CTIBD에 의한 랫트 내 배뇨 수축의 최대 압력을 나타내는 그래프이다.
도 9의 D는 증류수, 아세트산, 및 CTIBD에 의한 랫트의 상호 수축 간격을 나타내는 그래프이다.
도 9의 E는 증류수, 아세트산, 및 CTIBD에 의한 랫트의 배뇨 양을 나타내는 그래프이다.
도 10은 CTIBD 및 이의 유도체가 BKca 채널에 미치는 영향을 알아보기 위하여 화합물을 3uM 농도로 한 세포-기반 형광 어세이의 형광 값 결과를 RFU 값으로 나타내는 그래프이다.
도 11은 CTIBD 및 이의 유도체가 BKca 채널에 미치는 영향을 알아보기 위하여 화합물을 1uM 농도로 한 세포-기반 형광 어세이의 형광 값 결과를 RFU 값으로 나타내는 그래프이다.
도 12는 CTIBD 및 이의 유도체가 BKca 채널에 미치는 영향을 알아보기 위하여 화합물을 5uM 농도로 한 세포-기반 형광 어세이의 형광 값 결과를 RFU 값으로 나타내는 그래프이다.
도 13은 CTIBD 및 이의 유도체가 BKca 채널에 미치는 영향을 알아보기 위하여 화합물을 2uM 농도로 한 세포-기반 형광 어세이의 형광 값 결과를 RFU 값으로 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전 하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실험예 1. 스크리닝을 위한 화합물 라이브러리 준비

스크리닝을 위한 화합물 라이브러리는 8,364개의 유니크한 화합물을 포함하는 KRICT 다양성 라이브러리를 Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT, Daejon, South Korea; www.chembank.org)에서 득하였다.

또한, 4-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol (CTIBD) 및 다른 isoxazolyl 벤젠 유도체는 Vitas-M Laboratory (Causeway Bay, Hong Kong; www.vitasmlab.biz)에서 득하였다.

또한, CTIBD Stock solutions 및 이의 유도체는 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에 용해하여 준비하였다.

또한, 양성 대조군 CTBIC (4-chloro-7-(trifluoromethyl)-10H-benzofuro[3,2-b] indole-1-carboxylic acid)의 Stock solution도 DMSO에 용해하여 준비하였다.

실험예 2. 세포 배양 및 접종

세포-기반 어세이를 위한 세포는 돌연변이 BKca 채널(G803D/N806K)을 안정적으로 발현하는 변형된 인간배아신장 세포(AD-293 세포)를 사용하였다.

구체적으로, 상기 세포는 10% 소 태아 혈청 (Hyclone) 및 항생제 (1 mg/ml geneticin; Gibco/Life Technologies, Waltham, MA)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (High glucose)에서 배양하였다.

이후, 상기 세포는 poly-d-lysine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 코팅한 96-웰 투명-바닥 검은-벽 플레이트(Corning Incorporated, Corning, NY)에 접종하여 배양하였다.

실험예 3. 형광 어세이 및 데이터 분석

세포-기반 형광 어세이는 FluxOR 포타슘 채널 어세이 키트(Invitrogen, Eugene, OR)를 이용하여 수행하였다.

구체적으로, 상기 어세이는 세포를 배양 중인 플레이트에서 성장 배지를 제거하고, FluxOR 형광 염료를 포함하는 80μl의 로딩 버퍼를 플레이트의 각 웰에 추가한 뒤, 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 로딩 버퍼를 제거하고 화합물 라이브러리 내 테스트 화합물이 다양한 농도로 포함된 100μl의 어세이 버퍼를 플레이트의 각 웰에 추가한 뒤, 20 내지 30분간 반응시켰다.

또한, Vehicle 군으로는 DMSO (1%)를, 양성 대조군으로는 BKca 채널의 활성제인 CTBIC를 DMSO에 용해하여 각각 사용하였다.

또한, 형광 염료 측정은 FlexStation 3 multimode microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 및 SoftMax Pro software를 사용하였다. 형광 excitation-파장은 485 nm, emission-파장은 528 nm를 사용하였다. 형광 신호는 매 2초마다 측정하였으며, 세포막의 탈분극은 고농도의 TI+가 포함된 자극 버퍼를 추가하여 화학적으로 유도하였다. 구체적으로, 측정 시작 시점의 20초 후에 각 웰에 20μl의 자극 버퍼를 처리하였다. Relative fluorescence unit (RFU or F/F0, F0: minimum value of fluorescence signals of each well)는 형광의 밝기를 분석하기 위하여 사용하였다.

실험예 4. 제노푸스 난모 세포(Xenopus oocytes) 내 BKca 채널의 기능적 발현

제노푸스 난모 세포 내에서 랫트 BKca 채널 α (Slo1) 서브유닛을 발현하였다. 구체적으로, 랫트 BKca 서브클로닝 및 기능적 발현을 위하여는 난모 발현 벡터(pNBC1.0 or pNBC2.0)를 사용하였으며, 랫트 BKca 채널 α 서브유닛의 cDNA 서열정보는 GenBank에서 득하였으며, 이의 accession number는 AF135265이다.

난모 세포는 V-VI 단계의 X. laevis (Nasco, Fort Atkinson, WI)의 난소로부터 외과수술적 방법을 통해 추출하였다. 추출 후, 상기 난모 세포는 3 mg/ml 콜라게네이즈(Collagenases) (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ)가 포함된 Ca2+-free oocyte Ringer's (OR) 배양액 (86 mM NaCl, 1.5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 및 10 mM HEPES, pH 7.6)에 옮겼으며, 난모의 난포 세포층(follicular cell layer)을 제거하기 위하여 1.5 내지 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 난모 세포는 Ca2+-free OR 배양액 및 ND-96 배양액(96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, 및 50 g/ml gentamicin, pH 7.6)으로 여러 번 헹구었다. 그 뒤, 난모 세포를 안정화하기 위하여 적어도 24시간 동안, 18℃조건으로 ND-96 배양액에서 배양하였다. 이후, 전기생리검사를 위해 대략 50 ng의 합성 Slo1 cRNA가 포함된 뉴클레이즈(nuclease)-free 증류수를 각 난모 세포에 주입하였다. 주입 후, 난모 세포는 ND-96 배양액에서 1 내지 3일, 18℃조건으로 배양하였다.

실험예 5. 전기생리 검사(electrophysiologic recdording) 및 데이터 분석

붕규산염(Borosilicate) 유리-파이펫 (WPI, Sarasota, FL)은 당긴 후 가열연마(fire-polish)하여 준비하였으며, 이때, 가열연마 파이펫의 저항력은 3-5 MΩ이다. 채널 전류는 Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, San Jose, CA)를 통해 증폭하였으며, 1kHz 저역 필터는 four-pole Bessel filter를 사용하였다. 채널 전류는 Digidata 1200A (Molecular Devices)을 사용하여 10 또는 20 points/ms의 비율로 디지털화하였다.

BK_Ca 채널 전위는 전압-클램프(voltage-clamp) 펄스를 통해 -80 내지 200 mV 범위에서 10 mV씩 증가시키며 활성화되었다. 휴지전위는(resting potential)는 -100 mV에서 고정하였다. 검사 용액은 pH 7.2 조건으로 120 mM의 글루콘산칼륨(potassium gluconate), 10 mm HEPES, 4 mM KCl, 및 5 mM EGTA를 포함하여 구성하였다.

세포 내 용액의 free [Ca²⁺]i 계산은 MaxChelator program (Patton et al., 2004)을 통해 수행하였으며, 데이터 수집 및 분석은 Clampex 8.0 및 Origin 9.1 (OriginLab Corp.)을 통해 수행하였고, 데이터 단위는 ± S.E.M (standard error of the mean). (* P value < 0.05, ** P value < 0.01, *** P value < 0.001)으로 계산하였다.

실험예 6. UBSM의 수축 장력(Isometric tension) 검사

수축 장력(Isometric tension) 실험은 기존의 실험 방법을 사용하였다(Lee et al. Mol Pharmacol. 2016). 구체적으로, 방광 힘줄을 수컷 Sprague-Dawley 랫트(300-350 g)에서 분리하여(대략 2 x 8 mm), Krebs 용액(118.4 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 25.0 mM NaHCO₃, 2.5 mM CaCl₂, 및 12.2 mM glucose, pH 7.4, mixture 95 % O₂ 및 5 % CO₂ (37℃))으로 구성된 10 ml의 조직 배스(organ bath)에 고정(mount)하였다. 수축 장력 측정은 Power Lab Data Acquisition System (ADIntruments, Australia)과 LabChart Software (Version 7, AD Instruments)를 통해 측정하였으며, 매 실험 전, 방광 힘줄은 1g의 휴지 장력(resting tension)을 받고, 적어도 1시간 동안 안정화 하였다. 안정화 이후, 각 힘줄은 30분의 휴약기간(washout period)에도 지속적인 반응이 나타날 때까지 10 μM ACh에 반복적으로 노출하였다. 그 후, 상기 힘줄은 CTIBD 또는 0.1%의 DMSO (대조군)에 30분간 전처리 한 뒤, ACh-유도 수축 반응을 (CTIBD가 존재하는 상황에서) 진행하였다. CTIBD에 의한 이완 반응은 장력의 감소되는 비율을 통해 나타내었다.

실험예 7. In vivo 방광내압측정 (Cystometry)

무게 296 ± 15 g (13~14 주령)의 성인 암컷 Sprague-Dawley 랫트를 통해 실험을 수행하다. 구체적으로, isoflurane (3 %, 3 mL/min)을 통해 마취한 뒤, polyethylene catheter (PE-50)을 방광에 주입하였다. 방광내압측정은 3일 후, urethane 1.3 g/kg, s.c.를 통해 마취 후, 카테터(catheter) 삽입을 통해 도출하였다. 랫트는 마취하여 테이블에 수직으로 반듯이 고정한 후, 요도관을 아래쪽으로 향하게 하였다. 배뇨 측정을 위하여 플라스틱 컵을 요도관 아래에 두었으며, 무게 측정을 위한 압력 변환기를 연결하였다(FT0314618, Natus). 모든 실험 동물은 마취 후, 열 패드를 이용하여 37℃의 조건을 유지하였다. 방광은 실온에서 증류수 또는 0.5% 아세트산 (AA)이 포함된 증류수를 0.05 mL/min 의 비율로 주입하였다. 구체적으로, 정상군으로는 증류수를 적어도 1시간 동안 지속적으로 주입하거나, 방광 수축이 일어날 때까지 0.5% AA를 주입하였다. CTIBD는 AA 투여 40분 후, 20 mg/kg 1회 용량으로 복강을 통해 주입하였다. 방광내압은 투여 후 90분간 측정하였다. 기저 압력 (Baseline pressure; BP, mmHg), 배뇨 수축의 최대 압력(MPVC; mmHg), 상호 수축 간격(intercontraction interval; ICI, sec), 및 배뇨 양 (voiding volume; VV, ml)은 투여 후 30 내지 90분간의 평균을 내어 계산하였다(* P value < 0.05, ** P value < 0.01).

실시예 1. 세포-기반 형광 어세이를 통해 BKca 채널 활성제 확인

실시예 1-1. 1차 스크리닝

과민성 방광 치료를 위한 BKca 채널 활성 물질을 발굴을 위해 스크리닝을 진행하였다.

구체적으로, 총 8,364 물질을 포함하는 화학 라이브러리의 화합물을 세포-기반 형광 어세이를 통해 스크리닝하여 신규한 BKca 채널 활성제를 확인하였으며, 실험예 1 내지 실험예 3의 방법을 통해 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, Vehicle (1% DMSO)과 비교하여 Compound 1의 5 μM 최종 농도에서 형광 신호 값이 월등하게 증가하였다(도 1A).

또한, RFU 측정을 통해 compound 1이 다른 물질들과 비교하여 월등히 우수함을 확인하였으며, vehicle과 비교하여 100 초 내에 형광 값이 6배 증가하는 것을 확인하였다(도 1B).

이를 통해, compound 1(4-(4-phenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)이 BKca 채널 활성에 우수한 효능을 지니는 화합물임을 확인하였다.

실시예 1-2. 2차 스크리닝

상기에서 compound 1이 BKca 채널 활성에 우수한 효능이 있음을 확인하여, 이의 유도체를 확보하여 상기와 같은 방법으로 2차 스크리닝을 진행하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 19개의 추가 화합물(도 2A) 중 2개의 화합물에서 형광 값이 현저히 증가하였으며, 이들 중 compound 4에서 형광 값이 가장 강한 것을 확인하였다(도 2B 내지 도 2C). 구체적으로, 5μM 농도에서, compound 4는 vehicle과 비교하여 7.9배 증가된 형광 값이 나타났다(도 2C).

형광 값이 가장 강하게 나타난 compound 4 및 7을 보다 구체적으로 조사한 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, compound 4(CTIBD)(화학식 2)가 가장 우수함을 확인하였다.

[화학식 2]

.

스크리닝 후 compound 4(CTIBD)가 가장 우수한 효능을 지니는 물질임을 확인하여, 상기 화합물로 BKca 채널 활성에 대한 상기 세포-기반 형광 어세이를 수행한 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, CTIBD의 농도에 의존하여 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, BKca 채널 특이적 저해제인 paxilline 1 μM 에 의해 이의 활성이 완벽히 저해되는 것을 확인하였다(도 4A 내지 도 4B).

실시예 2. CTIBD의 BKca 채널의 전류(Macroscopic Currents)에 대한 효능 확인

상기에서 선정한 CTIBD의 BKca 채널에 대한 효능을 전기생리 검사를 통해 평가하였다.

구체적으로, 실험예 4의 방법을 통해 야생형 랫트의 BKca 채널의 α-서브유닛은 제노푸스(Xenopus)의 난모 세포에서 발현하였으며, 척출한 난모 세포를 통해 세포막에서의 전류를 측정하였다. 보다 구체적으로, 척출된 세포의 세포 내 Ca²⁺ 농도는 3 μM 으로 고정하였으며, 전위 측정 시작부터 30초간 3 μM CTIBD 를 세포 막의 바깥 부분에 처리하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, CTIBD는 시간의존적으로 기준 값으로부터 전류를 증가시켰다. 또한, CTIBD를 제거하자 채널 전위가 감소하여 기준 값으로 다시 돌아가는 것을 확인하였다.

이를 통해, CTIBD는 BKca 채널의 두 상태인 강화 및 약화를 조절하는 것을 확인하였다.

또한, 강화 과정에서 채널의 전류가 수 초 내로 급격히, 수 분 동안 꾸준히 점진적으로 증가하는 것을 확인하여, 전류 데이터는 이중-지수 함수에 적용하여 시간-상수를 계산하자, 상기 시간 상수 값이 각각 결합(association)에서는 5.1 ± 1.5 및 48.3 ± 5.1 초, 분리(disassociation)에서는 4.3 ± 1.8 및 76.1 ± 18.5 초인 것을 확인하였다.

실시예 3. CTIBD-유도 BKca 채널 강화작용의 메커니즘 확인

본 발명의 화합물 CTIBD가 BKca 채널의 강화 및 약화를 조절하는 것을 확인하여, 이의 메커니즘을 확인하였다.

구체적으로, 연속적인 전압 펄스는 BKca 채널을 활성화시키는데 적용하고, 여러 농도의 CTIBD 조건에서 전류를 측정하였다.

그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 세포 외 CTIBD 농도가 증가하면, 낮은 전압에서도 채널이 활성화되었으며, 재분극에 의한 후미-전류는 현저하게 증가하였다(도 6A).

또한, 다양한 CTIBD의 농도 조건에서의 BKca 채널 전류의 전도도-전류(G-V) 관계 및 전압 반-활성화(V_1/2)에 대한 전도도의존적인 G-V 관계의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 6B에서 볼 수 있듯이, CTIBD는 농도의존적으로 G-V 곡선을 음의 전류로 움직였으며, 최대 전도도(Gmax)를 증가시켰다.

또한, 도 6C에서 볼 수 있듯이, 세포 외 CTIBD 농도가 0.1 μM에서 10μM으로 증가할수록, V_1/2는 155.8 ± 2.3mV에서 105.2 ± 3.6 mV로 약 50m V_1/2 감소하였다.

이를 통해, CTIBD가 활성화를 위한 전압 역치를 낮추고, BKca 채널의 최대 열림-가능성(maximum open-probability)을 증가시키는 것을 확인하였다.

실시예 4. CTIBD의 BKca 채널의 게이팅 동역학(Gating Kinetics)에 대한 효과 확인

상기에서 BKca 채널의 후미-전류(tail-current)가 CTIBD에 의해 증가함을 확인하여, 상기 CTIBD의 게이팅 동역학에 대한 효과를 추가 조사하였다.

구체적으로, 상기 실험예 5의 방법을 통해, 10μM CTIBD의 유무에 따른 BKca 채널의 활성화 및 비활성화를 조사하였다.

그 결과, 도 7A 내지 도 7B에서 볼 수 있듯이, 10 μM CTIBD 유무에 따른 BKca 채널의 활성화(열림) 및 비활성화(닫힘)의 대표적인 전류 값을 확인하였다(도 7A 내지 7B).

또한, 상기 활성화 시간-전도(τ_activation) 값을 각 전압에서의 단일 지수(single-exponential)에 대입하여 구하였다.

그 결과, 도 7C 내지 도 7D에서 볼 수 있듯이, 10 μM CTIBD가 존재할 때에는, 모든 전압에서 활성화 비율이 유의하게 상승하는 것을 확인하였으며(도 7C), 비활성화에서의 시간-전도 값도 월등히 증가하는 것을 확인하였다(도 7D).

즉, 조사한 모든 전압에서 10 μM CTIBD가 존재할 때 채널의 닫힘이 현저하게 느려졌으며, 비활성화 비율도 월등히 감소하였다.

이를 통해, CTIBD가 BKca 채널의 열림에는 많은 영향을 미치지 않으면서, 채널 닫힘을 느리게 하여, 안정하게 활성화 상태를 유지하기에, 잠재적 BKca 채널 활성제로서 활용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. CTIBD의 랫트 방광 평활근 힘줄에 대한 이완 효능 확인

상기 실시예들을 통해 CTIBD가 BKca 채널의 활성화를 강화시키는 것을 확인하였다. 이에, 상기 CTIBD가 BKca 채널 활성화를 통해 실제 방광에서 이완 효능이 나타내는지를 랫트의 방광 힘줄을 통해 확인하였다.

구체적으로, 상기 실험예 6의 방법을 통해 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, 10 μM의 아세틸콜린(ACh)을 랫트의 배뇨근에 처리하고 수축 장력을 측정하자, 수축 장력이 현저하게 증가하였으며, 이후 바로, 피크의 절반으로 감소하여 안정한 상태를 유지하는 것을 확인하였다.

반면, CTIBD를 전처리한 경우, ACh에 의한 수축이 급격하게 감소하였으며, 이는 전처리 농도에 의존적임을 확인하였다(도 8A). 또한, 3 μM 내지 10 μM의 CTIBD는 현저한 이완 효능이 나타나지 않은 반면, 그 이상의 농도에서는 현저한 이완 효능이 나타남을 확인하였다.

또한, vehicle군과 비교하여, CTIBD의 이완 효능은 30 μM 에서 약 42.1%, 100 μM에서 약 65.3%, 및 300 μM에서 약 81.4%임을 확인하였다(도 8B).

이를 통해, CTIBD가 ACh에 의한 방광 평활근의 수축을 농도의존적 저해하여, 상기 방광 평활근의 이완을 유도하는 것을 확인하였다.

실시예 6. CTIBD의 랫트 내 배뇨 기능에 대한 효과 확인

상기 실시예 5에서 방광 평활근을 이완시킴을 확인하였기에, 실제 방광 근육 이완에 따른 배뇨에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, CTIBD의 배뇨 기능에 대한 약학적 효과를 측정하기 위하여, AA-유도 OAB 랫트 모델에 CTIBD를 복강으로 주입하였다.

구체적으로, 실험예 7의 방법을 통해 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 9A에서 볼 수 있듯이, 증류수를 주입한 랫트에서는 평상시 간격에서 3번의 배뇨 수축이 나타난 반면, 0.5 % AA를 주입한 랫트에서는 매우 빈번한 배뇨 수축이 나타나는 것을 확인하였다. 그러나, 20 mg/kg의 CTIBD를 전처리한 경우, 상기 AA를 주입한 랫트의 배뇨 수축이 감소함을 확인하였다.

이를 통해, CTIBD가 AA에 의해 증가하는 잦은 배뇨 수축을 억제하여, 증가 전 상태로 회복시킴을 확인하였다.

또한, in vivo 방광내압측정법을 통해 기저 압력 (Baseline pressure; BP, mmHg), 배뇨 수축의 최대 압력(MPVC; mmHg), 상호 수축 간격(intercontraction interval; ICI, sec), 및 배뇨 양 (voiding volume; VV, ml)을 측정하였다.

그 결과, 도 9B 내지 9E에서 볼 수 있듯이, BP 및 MPVC의 경우, 증류수, 0.5% AA, 및 CTIBD 군 모두에서 유의한 차이는 발견되지 않았으며, ICI 및 VV의 경우, 0.5% AA 값이 다른 군들에 비해 다소 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 CTIBD가 방광/배뇨 근육을 이완하여 과민성 방광의 치료 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 7. CTIBD의 유도체의 BKca 채널 활성 효능 확인

실시예 7-1. 구조-활성상관 조사를 통한 CTIBD 유도체의 BKca 채널 활성 효능 1차 비교

상기 실시예를 통해 CTIBD의 우수한 BKca 채널 활성 및 이의 과민성 방광 치료 효능이 있음을 확인한 바, CTIBD 유도체의 구조-활성상관(structure-activity relationship; SAR)을 조사하여 이의 효능을 확인하였다.

구체적으로, 상기 CTIBD의 화합물을 모체로 하고 이의 작용기를 치환하여, 작용기 종류 차이에 의한 BKca 채널 활성 효능을 비교하였다. 또한, 이의 효능 확인은 상기 실시예 1과 동일한 방법을 통해 조사하였다.

CTIBD		GM 90114
GM 90113		GM 90116
GM 90120		GM 90112
GM 90118		GM 90119
GM 90115		GM 90117

그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, 10개의 유도체 화합물을 3uM의 농도로 하여 비교한 결과, 상기 10개의 유도체 화합물 중 GM90117을 제외한 나머지 화합물은 음성 대조군 대비 높은 BKca 채널 활성 효능을 가지는 것을 확인하였으며, 그 중에서도 CTIBD, GM90114, GM90113, 및 GM90116은 양성 대조군 CTBIC 보다 높은 RFU 값을 가지어, BKca 채널 활성 효능이 높은 것을 확인하였다.

이후, 상기 4개의 화합물을 1uM의 농도에서 동일한 실험을 반복하였다.

그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, 1uM 농도에서 4개의 화합물 모두 우수한 BKca 채널 활성 효능을 갖는 것을 확인하였으며, 특히 CTIBD의 RFU 값이 가장 높은 것을 확인하여, BKca 채널 활성 효능이 가장 우수한 것을 확인하였다.

이를 통해, CTIBD 화합물이 다른 작용기를 갖는 이의 유도체보다 1uM의 저농도에서 BKca 채널 활성 효능이 현저히 우수한 것을 확인하였다.

실시예 7-2. 구조-활성상관 조사를 통한 CTIBD 유도체의 BKca 채널 활성 효능 2차 비교

구체적으로, 상기 CTIBD를 모체로 하여, Cl 작용기의 위치/개수의 변화, 작용기 추가 및 모체 화합물 변형에 의한 유도체들의 BKca 채널 활성 효능을 확인하였다. 또한, 이의 효능 확인은 상기 실시예 1과 동일한 방법을 통해 조사하였다.

GM 90181		GM 90178
GM 90170		GM 90174
GM 90169		GM 90172
GM 90179		GM 90171
GM 90173		GM 90167
GM 90164		GM 90175
GM 90180		GM 90166
GM 90165		GM 90163
GM 90176		GM 90177
GM 90168

그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, 표 2의 19개의 유도체를 5uM의 농도로 하여 효능을 비교한 결과, GM90168을 제외한 모든 화합물이 음성 대조군 대비 높은 BKca 채널 활성 효능을 가지는 것을 확인하였으며, 그 중에서도 특히 RFU 값이 뛰어난 6개의 유도체 화합물 GM 90181, GM 90178, GM 90170, GM 90174, GM 90169, 및 GM 90172 를 확인하였다.

이후, 상기 6개의 유도체 화합물을 2uM 농도에서 동일한 실험을 반복하였다.

그 결과, 도 13에서 볼 수 있듯이, GM 90169는 상기 실시예에서 선정한 CTIBD 보다 RFU 값이 낮은 것을 확인하였으나, 이를 제외한 하기 5가지의 CTIBD의 유도체 화합물이 CTIBD 보다 우수한 RFU 값을 가지는 것을 확인하였다

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

.

이를 통해, 상기 화학식 3 내지 화학식 7로 표시되는 화합물이 CTIBD와 유사한 또는 보다 우수한 BKca 채널 활성이 있음을 확인하였으며, 따라서 우수한 방광 평활근 이완 효능 및 과민성 방광 치료 효능이 있음을 확인하였다.

다시 말해, 방광 평활근 수축에 의한 과민성 방광을 치료하고, 방광 평활근을 이완시키는 BKca 채널을 활성화용 화합물을 발굴하기 위하여 스크리닝을 진행하였으며, compound 1이 BKca 채널 활성 효능이 있음을 확인한 후, 동일한 방법으로 이의 유도체들의 구조-활성상관을 조사한 결과, compound 4(CTIBD)가 월등한 BKca 채널 활성화 효능이 있음을 확인하였고, 추가 실험을 통해, 이의 방광 평활근 이완 및 배뇨 감소 효능을 확인하였으며, 상기 CTIBD의 유도체들의 구조-활성상관을 동일한 방법으로 확인하여, 우수한 BKca 채널 활성화를 통한, 과민성 방광 치료 및 개선 효능을 가지는 본 발명의 CTIBD 및 추가로 다수의 화합물을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

합성예: 본 발명의 화합물 합성 방법

상기 실시예에서 합성한 화합물의 합성 방법을 기재하면 다음과 같다.

시약 및 조건:

(a) BF₃.Et₂O, 90^oc, 55%;

(b) 트리플루오로아세트산 무수물(trifluoroacetic anhydride), 피리딘(pyridine), 0^oc to rt, 48 h (분리 없이 다음 단계 사용);

(c) 히드록실아민 염산염(hydroxylamine hydrochloride), 피리딘(pyridine), 환류(reflux), 12 h, 51% (2단계에 걸쳐).

2-(4-클로로페닐)-1-(2,4-다이히드록시페닐)에탄-1-온(2-(4-chlorophenyl)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)ethan-1-one)(3)을 제조하기 위한 단계는 다음과 같다. BF3·Et2O(20mL) 내의 레조르시놀(1)(1.42g, 12.89mmol)의 용액에 2-(4-클로로페닐)아세트산(2)(2g, 11.72mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 질소 대기에서 70-75℃에서 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고 EtOAc로 희석하였다. 층을 분리하고 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. EtOAc/헥산을 용리액으로 이용하는 컬럼 크로마토그래피로 생성된 잔류물을 정제하여, 2-(4-클로로페닐)-1-(2,4-디히드록시페닐)에탄-1-온(3)을 제공하였다 (1.7 g, 55% 수율).

¹H NMR (DMSO-d6) δ 12.40 (s, 1H), 10.69 (s, 1H), 7.93 (d, J = 8.85 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.54 Hz, 2H), 6.40 (dd, J = 8.85, 2.14 Hz, 1H), 6.26 (d, J = 2.44 Hz, 1H), 4.33 (s, 2H).

4-(4-(4-클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올(4-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)(5)을 제조하기 위한 단계는 다음과 같다. 피리딘 (5 mL) 내에서 2-(4-클로로페닐)-1-(2,4-다이히드록시페닐)에탄-1-온(2-(4-chlorophenyl)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)ethan-1-one)(3)의 용액에 트리플루오로아세트산 무수물 (2.8 ml, 19.42 mmol)을 아이스배스(ice bath)에서 냉각하면서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축 건조시켜 3-(4-클로로페닐)-7-하이드록시-2-(트라이플루오로메틸)-4H-크로멘-4-온(3-(4-chlorophenyl)-7-hydroxy-2-(trifluoromethyl)-4H-chromen-4-one)(4)을 수득하고 다음 단계에 사용하였다. 3-피리딘 내에서 (4-클로로페닐)-7-하이드록시-2-(트라이플루오로메틸)-4H-크로멘-4-온(4)의 혼합물 및 히드록실아민 히드로클로라이드 (856.7 mg, 12.33 mmol)를 환류 하에 12시간 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 희석된 HCl로 산성화하고 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 4-(4-(4-클로로페닐)-3-(트라이플루오로메틸)이소옥사졸-5-일)벤젠-1,3-다이올(4-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol)(5)를 2단계에 걸쳐 800 mg, 51%로 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d6) δ 9.96 (s, 1H), 9.95 (s,1H), 7.52-7.42 (m, 2H), 7.28 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 2.14 Hz, 1H), 6.28 (dd, J = 8.54, 2.14 Hz, 1H); LC-MS (m/z): 356.1 (M+H).

다른 화합물들은 상기 방법과 유사한 방식으로 상응하는 출발물질로부터 합성하였고, 그 정보는 다음과 같다.

GM Code	구조	명칭	NMR
90113		4-(4-(4-fluorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (CDCL3) δ 7.37-7.23 (m, 2H), 7.19-7.07 (m, 2H), 6.93 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 2.44 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 8.54, 2.44 Hz, 1H).
90114		4-(4-(4-bromophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) 9.95 (s, 2H), 7.61 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 6.32 (d, J = 2.14 Hz, 1H), 6.28 (dd, J = 8.39, 2.14 Hz, 1H).
90116		2-(4'-(5-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-4-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)acetic acid	¹H NMR (DMSO-d6) δ 11.80 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.70 (d, J= 8.24 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 7.31 (dd, J = 8.24, 2.75 Hz, 4H), 7.10 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 2.14 Hz, 1H), 6.25 (dd, J = 8.54, 2.14 Hz, 1H), 3.72 (s, 2H).
90118		ethyl 2-(4'-(5-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-4-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)acetate	¹H NMR (DMSO-d6) δ 9.98 (s, 1H), 7.95 (s,1H), 7.71 (d, J= 8.24 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 7.35 (dd, J = 8.24, 2.75 Hz, 4H), 7.08 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 2.14 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 8.54, 2.14 Hz, 1H), 4.09 (q, J = 7.02 Hz, 2H), 3.70 (s, 2H), 1.19 (t, J = 7.02 Hz, 3H).
90119		4-(3-(trifluoromethyl)-4-(4'-(trifluoromethyl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) δ 10.00 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 8.02-7.92 (m, 2H), 7.86-7.76 (m, 3H), 7.40 (d, J= 8.24 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.35 (d, J = 2.14 Hz, 1H), 6.28 (dd, J = 8.39, 2.14 Hz, 1H).
90120		4-(4-(4-(6-methoxypyridin-3-yl)phenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) δ 9.98 (s, 1H), 8.52 (d, J= 2.44 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.70, 2.75 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.71 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 7.93 Hz, 2H), 7.08 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.85 Hz, 1H), 6.34 (s, 1H), 6.26 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H).
90163		4-chloro-6-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) δ 10.80 (s, 1H), 10.20 (s,1H), 7.49 (d, J= 8.54 Hz, 2H), 7.35-7.26 (m, 3H), 6.54 (s, 1H).
90164		4-chloro-6-(4-(4-fluorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) δ 10.75 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 7.38-7.22 (m, 5H), 6.55 (s, 1H).
90165		4-(4-(4-bromophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)-6-chlorobenzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) δ 10.78 (s, 1H), 10.21 (s, 1H), 7.68-7.60 (m, 2H), 7.34-7.18 (m, 3H), 6.55 (s, 1H).
90170		4-(4-(2,4-dichlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (MeOD) δ 7.55 (d, J= 1.83 Hz, 1H), 7.42-7.28 (m, 2H), 7.14 (d, J= 8.54 Hz, 1H), 6.32 (dd, J = 8.39, 2.14 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 2.14 Hz, 1H), 5.55-5.41 (m, 2H).
90172		4-(4-(3-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) δ 10.00 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 7.62-7.40 (m, 2H), 7.33 (s, 1H), 7.23 (d, J = 7.02 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 2.14 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 8.39, 2.14 Hz, 1H).
90174		4-(4-(2,3-dichlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) δ 10.20-9.90 (m, 2H), 7.72 (dd, J = 7.02, 2.44 Hz, 1H), 7.52-7.36 (m, 2H), 7.10 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 2.44 Hz, 1H), 6.27 (dd, J = 8.39, 2.44 Hz, 1H).
90176		4-bromo-6-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (CDCl3) δ 7.39 (d, J = 8.54 Hz, 2H), 7.27-7.20 (m, 3H), 6.59 (s, 1H).
90178		4-(4-(3,4-dichlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (DMSO-d6) δ 10.00 (s, 2H), 7.69 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 1.83 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 8.39, 2.14 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 9.16 Hz, 1H), 6.38-6.29 (m, 2H).
90181		4-(4-(2-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol	¹H NMR (CDCl3) δ 7.50 (d, J = 7.63 Hz, 1H), 7.45-7.28 (m, 3H), 6.82 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 2.14 Hz, 1H), 6.25 (dd, J = 8.70, 2.14 Hz, 1H).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카르복시메틸페닐, 또는 메톡시피리디닐이고,
R₆는 수소 또는 할로겐임.
제1항에 있어서, 상기 할로겐은 플루오로, 클로로, 또는 브로모인 것인, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소 또는 클로로이고, R₁ 내지 R₅중 적어도 하나 이상은 클로로인 것인, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 R₁, R₂, R₄ 및 R₅는 수소이고, 상기 R₃는 플루오로, 클로로, 브로모, 카르복시메틸페닐, 또는 메톡시피리디닐인 것인, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 것인, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]
.
제1항에 있어서, 상기 과민성 방광 예방 또는 치료는 방광 평활근 이완에 의한 것인, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 과민성 방광 예방 또는 치료는 BKca 채널의 활성화에 의한 것인, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 과민성 방광 예방 또는 치료는 BKca 채널의 활성화를 위한 전압 역치가 감소되어 최대 열림-가능성 상태의 증가에 의해 이루어지는 것인, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 과민성 방광 예방 또는 치료는 BKca 채널의 열림 상태의 안정한 유지에 의해 이루어지는 것인, 과민성 방광 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 과민성 방광 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
[화학식 1]

R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카르복시메틸페닐, 또는 메톡시피리디닐이고,
R₆는 수소 또는 할로겐임.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 과민성 방광 예방 또는 치료방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카르복시메틸페닐, 또는 메톡시피리디닐이고,
R₆는 수소 또는 할로겐임.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카르복시메틸페닐, 에톡시카보닐메틸페닐, 트리플루오로메틸페닐 또는 메톡시피리디닐이고,
R₆는 수소 또는 할로겐이되,
단, R₁, R₂, R₄, R₅ 및 R₆이 수소이고, R₃이 수소, 클로로 또는 브로모인 화합물은 제외함.
제13항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 3 내지 8 및 10 내지 17 중 어느 하나로 표시되는 것인, 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]
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