KR102669477B1 - Novel anti-PVR antibodies or antigen-binding fragments thereof, and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 항-PVR 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 이들의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 마우스의 PVR 단백질에 특이적으로 결합하여, NK 세포 매개 ADCC를 통해 PVR 발현 암세포의 사멸을 촉진하며, TIGIT 면역관문 수용체 억제를 통해 T 세포의 항암 활성 증진 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 인간 항체여서 거부 반응의 염려 없이 인간을 대상으로 한 약학적 조성물의 유효성분으로 적용할 수 있어, 암의 치료나 예방에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention relates to novel anti-PVR antibodies or antigen-binding fragments thereof and their uses. The antibodies or antigen-binding fragments of the present invention specifically bind to human or mouse PVR proteins, thereby inhibiting NK cell-mediated ADCC. It not only promotes the death of PVR-expressing cancer cells and enhances the anti-cancer activity of T cells by inhibiting the TIGIT immune checkpoint receptor, but is also a human antibody, so it can be applied as an active ingredient in pharmaceutical compositions for humans without fear of rejection. Therefore, it can be useful in the treatment or prevention of cancer.
Description
본 발명은 신규한 항-PVR 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 이들의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to novel anti-PVR antibodies or antigen-binding fragments thereof and their uses.
CD155라고도 하는 폴리오바이러스 수용체(Poliovirus Receptor, PVR)는 세포외 기질 분자에 대한 세포 부착을 매개하는 데 관여하는 막횡단 당단백질이며, 종래 연구에서, 교모세포종, 수모세포종 및 결장직장암을 포함한 신경외배엽암 및 췌장암과 관련이 있는 종양 항원으로 알려진 바 있다. PVR은 Ras-Raf-MEK-ERK 신호 전달을 통한 혈청 유도 활성화, 사이클린 D2 및 E의 상향조절, 세포주기 진행을 억제하는 p27Kip1의 하향조절을 통해, 결국 세포 주기의 GO/GI 단계 기간을 단축시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, 종양 세포의 PVR을 차단하면, 종양세포의 생존력을 감소시킬 것으로 예상하고 있다.Poliovirus Receptor (PVR), also known as CD155, is a transmembrane glycoprotein involved in mediating cell adhesion to extracellular matrix molecules and, in previous studies, neuroectodermal cancers including glioblastoma, medulloblastoma, and colorectal cancer. and is known to be a tumor antigen associated with pancreatic cancer. PVR promotes serum-induced activation through Ras-Raf-MEK-ERK signaling, upregulation of cyclins D2 and E, and downregulation of p27Kip1, which inhibits cell cycle progression, ultimately shortening the duration of the GO/GI phase of the cell cycle. It is known that For this reason, blocking the PVR of tumor cells is expected to reduce the viability of tumor cells.
또한, PVR은 혈관신생에 중요한 역할을 하며, 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)와 인테그린 및 VEGFR2-매개 Rap I-Akt 신호전달 경로의 상호작용을 조절함으로써 VEGF 유도 혈관신생을 조절하는 것으로 알려져 있다. 추가적으로, PVR은 IGFIR과 복합체를 형성하고, 티로신-단백질 키나아제 Met(cMet) 신호전달에 참여하고, 복합체 형성을 차단하여 세포 생존율 및 혈관신생을 감소시킨다.In addition, PVR plays an important role in angiogenesis and regulates the interaction of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) with integrin and VEGFR2-mediated Rap I-Akt signaling pathway, thereby promoting VEGF-induced vascularization. It is known to regulate neogenesis. Additionally, PVR forms a complex with IGFIR, participates in tyrosine-protein kinase Met (cMet) signaling, and blocks complex formation, reducing cell viability and angiogenesis.
나아가, 최근 몇 년 동안 PVR이 중요한 면역 체크포인트 리간드임이 밝혀졌다. PVR 은 다양한 암세포에서 발현되는 세포 표면마커로서 면역 세포에서 발현되는 TIGIT 등의 면역관문 수용체들과 결합하여 항암면역반응을 조절할 수 있다. Furthermore, in recent years, PVR has been shown to be an important immune checkpoint ligand. PVR is a cell surface marker expressed in various cancer cells and can regulate anti-cancer immune responses by combining with immune checkpoint receptors such as TIGIT expressed in immune cells.
최근 TIGIT 억제 항체 치료제의 항암 효능이 보고되면서 PVR 조절을 통한 암세포와 면역 세포 동시 타겟의 중요성이 대두되고 있다. 이에, 면역 관문 수용체 억제를 통한 항암 활성을 증진시키고, NK 세포 매개 ADCC를 통해 PVR 발현 암세포의 사멸을 촉진시킬 수 있는 항-PVR 항체에 대한 연구, 개발이 필요한 실정이다.As the anti-cancer efficacy of TIGIT-inhibiting antibody treatments has recently been reported, the importance of simultaneously targeting cancer cells and immune cells through PVR regulation is emerging. Accordingly, there is a need for research and development of anti-PVR antibodies that can enhance anti-cancer activity by inhibiting immune checkpoint receptors and promote the death of PVR-expressing cancer cells through NK cell-mediated ADCC.
본 발명의 일 목적은 PVR에 특이적을 결합하는 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다. One object of the present invention is to provide a novel antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to PVR.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자와, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a gene encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, an expression vector and a transformant containing the gene.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고 PVR에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. In order to achieve the above object, one aspect of the present invention is a heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. area; and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and specifically binding to PVR. Antibodies or antigen-binding fragments thereof are provided.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 마우스의 PVR 단백질에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. The antibody or antigen-binding fragment thereof may specifically bind to human or mouse PVR protein.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자와, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체를 제공한다.In order to achieve the above object, another aspect of the present invention provides a gene encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, an expression vector and a transformant containing the gene.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
본 발명의 상기 신규 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 또는 마우스의 PVR 단백질에 결합하여, NK 세포 매개 ADCC를 통해 PVR 발현 암세포의 사멸을 촉진하며, TIGIT 면역관문 수용체 억제를 통해 T 세포의 항암 활성 증진 효능을 나타낼 수 있다. 상기 신규 항체는 인간 항체로, 거부 반응의 염려 없이 인간을 대상으로 한 약학적 조성물의 유효성분으로 적용할 수 있어, 암의 치료나 예방에 유용하게 이용될 수 있다. 아울러, 기존 알려진 면역관문 억제제와 병용 처리시, 종양 세포에 대하여 ADCC에서 시너지 효능을 나타냄으로써, 기존 치료제의 한계를 보완할 수 있다. 또한, 상기 항체는 인간 PVR과 마우스 PVR에 동시에 결합하는 교차 반응성(cross-reactivity)을 갖고 있어, 약물 유효성 평가의 편이성이 높다.The novel antibody or antigen-binding fragment of the present invention binds to the PVR protein of humans or mice, promotes the death of PVR-expressing cancer cells through NK cell-mediated ADCC, and enhances the anticancer activity of T cells through inhibition of the TIGIT immune checkpoint receptor. can indicate. The novel antibody is a human antibody and can be applied as an active ingredient in pharmaceutical compositions for humans without fear of rejection, so it can be usefully used in the treatment or prevention of cancer. In addition, when combined with known immune checkpoint inhibitors, it exhibits synergistic efficacy in ADCC against tumor cells, thereby making up for the limitations of existing treatments. In addition, the antibody has cross-reactivity, binding simultaneously to human PVR and mouse PVR, making it highly convenient to evaluate drug effectiveness.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.However, the effects of the present invention are not limited to the effects mentioned above, and other effects not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
도 1은 본 발명 항체의 중쇄를 제작하기 위한 벡터맵이다.
도 2는 본 발명 항체의 경쇄를 제작하기 위한 벡터맵이다.
도 3은 본 발명의 항체와 인간 PVR 단백질의 결합력을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 항체와 인간 PVR을 발현하는 CHO 세포의 결합력을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 항체의 인간 TIGIT 단백질과 인간 PVR 단백질의 결합을 차단하는 것을 확인한 ELISA 결과이다.
도 6은 본 발명의 항체의 인간 TIGIT 단백질과 인간 PVR 단백질의 결합을 차단하는 것을 확인한 FACS결과이다.
도 7은 본 발명의 항체가 인간 뿐만 아니라 마우스 PVR 단백질에 대해서도 교차 반응성을 나타냄을 확인한 결과이다.
도 8은 만성 골수성 백혈암 세포에 본 발명의 항체를 처리하는 경우, NK 세포에 의한 ADCC가 증가함을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 항체와 면역관문 억제제를 병행 처리하였을 때 단독으로 처리하였을 때보다 시너지 효과를 나타내는 것을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 항체를 처리하였을 때의 T 세포의 암세포 사멸 효능이 증진되는 것을 확인한 결과이다. Figure 1 is a vector map for producing the heavy chain of the antibody of the present invention.
Figure 2 is a vector map for producing the light chain of the antibody of the present invention.
Figure 3 shows the results of confirming the binding force between the antibody of the present invention and human PVR protein.
Figure 4 shows the results of confirming the binding affinity between the antibody of the present invention and CHO cells expressing human PVR.
Figure 5 is an ELISA result confirming that the antibody of the present invention blocks the binding of human TIGIT protein and human PVR protein.
Figure 6 is a FACS result confirming that the antibody of the present invention blocks the binding of human TIGIT protein and human PVR protein.
Figure 7 shows the results confirming that the antibody of the present invention shows cross-reactivity not only to human but also to mouse PVR protein.
Figure 8 shows the results confirming that ADCC by NK cells increases when chronic myeloid leukemia cells are treated with the antibody of the present invention.
Figure 9 shows the results confirming that when the antibody of the present invention and the immune checkpoint inhibitor are treated in parallel, a synergistic effect is shown compared to when treated alone.
Figure 10 shows the results confirming that the cancer cell killing efficacy of T cells is improved when treated with the antibody of the present invention.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.First, the terms used in the specification of the present invention will be explained.
본 발명에서 일컫는 '항체'는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 두 개의 중쇄 각각에 하나씩의 경쇄가 이황화 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 면역글로불린 분자 및 이들의 다량체를 의미한다. 경쇄는 두 개의 영역, 즉 하나의 가변영역(경쇄 가변영역, VL)과 하나의 불변 영역(경쇄 불변 영역, CL)을 포함하고, 중쇄는 네 개의 영역, 즉 하나의 가변영역(중쇄 가변영역, VH)과 세 개의 불변 영역(중쇄 불변 영역, CH; CH1, CH2 및 CH3)을 포함한다. 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 경쇄 및/또는 중쇄들 간의 결합, 분비, 보체 결합, Fc 수용체(FcR)와의 결합 등과 같은 생물학적 성질을 부여하는 역할을 하고, 경쇄와 중쇄의 가변영역은 항원에 대한 인식 및 결합 특이성을 결정한다. 특히, 항체의 결합 특이성은 항체 결합 자리(antigen binding site) 및 항원 결정기(epitope) 사이의 구조적인 상보성에 의한 것인데, 상기와 같은 항체 결합 자리는 주로 중쇄와 경쇄의 가변영역에 포함된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라고 불리는 3개의 초가변영역에서 유래한 잔기들로 이루어지기 때문에, 상기와 같은 상보성 결정 영역을 항체의 결합 특이성을 정의하는 아미노산 서열들로 지칭한다. 상기와 같은 3개의 CDR은 프레임워크 영역(framework region, FR)이라고 불리는 4개의 비교적 잘 보존된 영역들 사이에 배치되는데, 이들은 N-말단에서 C-말단의 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배치되어 연결된다. 이때, 상기 중쇄 가변영역에 포함되는 3개의 CDR을 각각 CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H라고 하고, 상기 경쇄 가변영역에 포함되는 3개의 CDR을 각각 CDR1-L, CDR2-L 및 CDR3-L이라고 한다.'Antibody' as used in the present invention refers to immunoglobulin molecules and multimers thereof having a structure in which one light chain is linked to each other by a disulfide bond to two heavy chains linked to each other by a disulfide bond. The light chain contains two regions, one variable region (light chain variable region, VL) and one constant region (light chain constant region, CL), while the heavy chain contains four regions, one variable region (heavy chain variable region, VH) and three constant regions (heavy chain constant region, CH; CH1, CH2, and CH3). The constant regions of the light and heavy chains play a role in imparting biological properties such as binding between light and/or heavy chains, secretion, complement binding, and binding to Fc receptors (FcR), while the variable regions of the light and heavy chains provide antigen recognition. and determine binding specificity. In particular, the binding specificity of an antibody is due to the structural complementarity between the antibody binding site and the epitope. The antibody binding site is mainly a complementarity-determining region contained in the variable region of the heavy and light chains. Since it consists of residues derived from three hypervariable regions called (complementarity determining region, CDR), the complementarity determining region is referred to as the amino acid sequence that defines the binding specificity of the antibody. These three CDRs are located between four relatively well-conserved regions called framework regions (FR), which are FR1, CDR1, FR2, CDR2, from N-terminus to C-terminus. They are arranged and connected in the order of FR3, CDR3, and FR4. At this time, the three CDRs included in the heavy chain variable region are called CDR1-H, CDR2-H, and CDR3-H, respectively, and the three CDRs included in the light chain variable region are called CDR1-L, CDR2-L, and CDR3-H, respectively. It is called L.
본 발명에서 일컫는 '항원 결합 단편'은 온전한 항체의 일부분, 특히 온전한 항체의 항원 결합 자리 또는 가변영역을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 당단백질을 의미한다. 상기와 같은 항체 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의하거나, 온전한 항체를 효소적 또는 화학적으로 분해함으로써 생성될 수 있고, 상기 항체 결합 단편의 예로는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디(diabodies) 등은 물론, 이들로부터 형성된 이중특이적 및 다중특이적 항체들도 포함하며, 이에 국한되지 않는다.The 'antigen-binding fragment' referred to in the present invention refers to a portion of an intact antibody, particularly any polypeptide or glycoprotein containing the antigen-binding site or variable region of the intact antibody. The above antibody-binding fragments can be produced by recombinant DNA techniques or by enzymatically or chemically decomposing intact antibodies. Examples of the antibody-binding fragments include Fv, Fab, F(ab')2, Fab', This includes, but is not limited to, dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, diabodies, etc., as well as bispecific and multispecific antibodies formed therefrom.
상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1 개의 항원 결합 부위를 가진다. 상기 Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 상기 Fab와 차이가 있다. 상기 F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. 상기 Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통해 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은, 단백질 가수분해 효소를 이용하거나(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다.), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The Fab has a structure that includes the variable regions of the light and heavy chains, the constant region of the light chain, and the first constant region (CH1 domain) of the heavy chain, and has one antigen binding site. The Fab' differs from the Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C terminus of the heavy chain CH1 domain. The F(ab')2 is generated when the cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond. The Fv refers to the minimum antibody fragment containing only the heavy chain variable region and the light chain variable region. In a two-chain Fv, the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond, while in the single-chain Fv (single-chain Fv) the heavy chain variable region and the light chain variable region are generally covalently linked through a peptide linker. It can be connected to or directly at the C-terminus to form a dimer-like structure like double-chain Fv. The antigen-binding fragment can be generated using a proteolytic enzyme (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab')2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), or It can be produced through genetic recombination technology, but is not limited to this.
상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10 내지 25개 아미노산 길이를 가지는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 링커에는 글리신(G) 및/또는 세린(S)과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m(n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으며, 예를 들어 (GnS)m(n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The linker may be a peptide linker and may have a length of about 10 to 25 amino acids. For example, the linker may include hydrophilic amino acids such as glycine (G) and/or serine (S). The linker may include, for example, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n or (GnS)m (n, m are each 1 to 10), for example (GnS)m( n and m may be 1 to 10, respectively, but are not limited thereto.
본 발명에서 일컫는 '단일클론 항체'는 "mAb"라고도 지칭되는 단일 아미노산 서열의 항체 분자를 지칭하는데, 이는 특정 항원을 대상으로 하며, 임의의 특별한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예컨대, 단일클론 항체는 B 세포의 단일 클론 또는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있지만, 재조합될 수도 있다.The 'monoclonal antibody' referred to in the present invention refers to an antibody molecule of a single amino acid sequence, also referred to as "mAb", which targets a specific antigen and is not interpreted as requiring antibody production by any special method. For example, monoclonal antibodies may be produced by a single clone or hybridoma of B cells, but may also be recombinant.
본 발명에서 일컫는 '인간화 항체'는 전체적으로 또는 부분적으로 비인간 동물에서 유래한 것이고, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화하기 위하여, 예를 들어 중쇄 및 경쇄의 가변영역의 프레임워크 영역의 특정 아미노산을 교체하도록 변형된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 불변 영역은 대부분의 경우 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이다.'Humanized antibodies', as referred to in the present invention, are derived in whole or in part from non-human animals, and are used to evade or minimize immune responses in humans, for example, by replacing specific amino acids in the framework regions of the variable regions of heavy and light chains. Refers to a modified antibody. The constant regions of humanized antibodies are in most cases those of human heavy and light chains.
본 발명에서 일컫는 '인간 항체'는 인간 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 사람 항체는, 예를 들면, CDR에서, 특히 CDR3에서 인간 면역글로불린 서열(예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 일컫는 '인간 항체'는 마우스와 같은 다른 비인간 동물 유래의 배선로부터 유도된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열 상에 절편이식된 항체를 포함하지 않는다.'Human antibody' as used in the present invention refers to an antibody having variable and constant regions derived from human immunoglobulin sequences. Human antibodies of the invention are encoded by human immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo), e.g., in the CDRs, particularly in CDR3. It may contain amino acid residues that are not However, the 'human antibody' referred to in the present invention does not include an antibody in which a CDR sequence derived from the germline of another non-human animal, such as a mouse, is grafted onto a human framework sequence.
본 발명에서 일컫는 '항원 결정기(epitope)'는 파라토프로서 공지되어 있는 항체의 항원 결합 자리에 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부위를 의미한다. 단일 항원은 1개 이상의 항원 결정기를 가질 수 있고, 동일한 항원에 결합하는 것이라도 항체가 결합하는 항원의 구체적인 부위가 다른 경우에 이들 항체는 항원 결정기가 다른 것이다. 상기 항원 결정기는 통상적으로 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 또한, 상기 항원 결정기는 입체적인 또는 비입체적인 구조를 갖는 것일 수도 있고, 입체적 항원 결정기와 비입체적 항원 결정기는 변성 용매의 존재 하에서 입체적 항원 결정기에 대한 결합은 소실되지만 비입체적 항원 결정기에 대한 결합은 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.The 'epitope' referred to in the present invention refers to a portion of an antigen that can specifically bind to the antigen binding site of an antibody, known as a paratope. A single antigen can have one or more antigenic determinants, and even if they bind to the same antigen, if the specific sites of the antigen to which the antibodies bind are different, these antibodies have different antigenic determinants. The antigenic determinants typically consist of a group of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and generally have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. In addition, the antigenic determinant may have a three-dimensional or non-steric structure, and the binding to the three-dimensional antigenic determinant is lost in the presence of a denaturing solvent, but the binding to the non-steric antigenic determinant is not lost. It is distinguished in that it does not.
본 발명에서 일컫는 '보존적 치환'은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘과 같은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들 중에서 치환되는 것이 보존적인 치환에 해당한다. 그 밖에, 아스파르트산, 글루탐산과 같은 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인과 같은 비대전성 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판과 같은 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 트레오닌, 발린, 이소류신과 같은 β-분지 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘과 같은 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들 중에서의 치환도 마찬가지로 보존적인 치환에 해당한다.'Conservative substitution' as referred to in the present invention means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. For example, substitution among amino acid residues with basic side chains such as lysine, arginine, and histidine corresponds to conservative substitution. In addition, amino acid residues with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; Amino acid residues with non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine; Amino acid residues with non-polar side chains such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; Amino acid residues with β-branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine; Substitutions among amino acid residues with aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine are also conservative substitutions.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편1. New antibody or antigen-binding fragment thereof
본 발명의 일 측면은 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.One aspect of the present invention provides a novel antibody or antigen-binding fragment thereof.
본 발명에서 PVR(Poliovirus Receptor, PVR)은 세포외 기질 분자에 대한 세포 부착을 매개하는 데 관여하는 막횡단 당단백질이다.In the present invention, Poliovirus Receptor (PVR) is a transmembrane glycoprotein involved in mediating cell adhesion to extracellular matrix molecules.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-H, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2-H 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3-H 를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-L, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR2-L 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR3-L을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is a heavy chain comprising CDR1-H having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, CDR2-H having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and CDR3-H having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. variable region; and a light chain variable region including CDR1-L having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2-L having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and CDR3-L having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 인간 항체 또는 이들의 항원 결합 단편일수 있고, 특히 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be a humanized antibody, a human antibody, or an antigen-binding fragment thereof, and particularly may be a human antibody or an antigen-binding fragment thereof.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예컨대 인간으로부터 유래하는 항체의 중쇄 불변영역 및/또는 경쇄 불변영역을 더 포함할 수 있으며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 PVR에 대해 특이적으로 결합하는 특성을 저해하지 않는 것이라면, 상기 인간으로부터 유래하는 항체의 중쇄 불변영역 및/또는 경쇄 불변영역은 그 종류나 아미노산 서열에 제한없이 이용될 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may further include, for example, a heavy chain constant region and/or a light chain constant region of an antibody derived from a human, and the antibody or antigen-binding fragment thereof may specifically bind to PVR. As long as the properties are not impaired, the heavy chain constant region and/or light chain constant region of the human-derived antibody can be used without limitation in type or amino acid sequence.
앞서 설명한 아미노산 서열들은, 이를 포함하는 폴리펩타이드의 구조, 기능, 활성 등에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 가지는 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열들은 당업계에 알려진 통상적인 변형이 일어난 아미노산을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 아미노산 변형은 예컨대 인산화 (phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등일 수 있다. 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 앞서 설명한 아미노산 서열들을 포함하는 것뿐만 아니라, 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이나 이의 변이체를 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것의 의미는, 앞서 설명한 아미노산 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amino acid sequences described above may include variants with different sequences due to deletion, insertion, substitution, or combinations of amino acid residues, to the extent that they do not affect the structure, function, activity, etc. of the polypeptide containing them. . In addition, the amino acid sequences may include amino acids that have undergone common modifications known in the art, and the amino acid modifications include, for example, phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, and methylation ( methylation), farnesylation, etc. The humanized antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention not only includes the amino acid sequences described above, but also includes amino acid sequences substantially identical thereto or variants thereof. Having a substantially identical amino acid sequence means that the amino acid sequence described above is 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more. It may include an amino acid sequence having % or more, 99% or more, or 99.5% or more homology, but is not limited thereto.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, the heavy chain variable region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or the light chain variable region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
또한, 상기 중쇄는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 경쇄는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.Additionally, the heavy chain may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or the light chain may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 10nM 이하, 7nM 이하, 5nM 이하, 3nM 이하, 2nM 이하, 1.5nM 이하 또는 1.0nM 이하의 EC50 값을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1.4nM 이하, 1.3nM 이하, 1.2nM 이하, 1.1nM 이하, 1.0nM 이하, 0.97nM 이하, 0.95nM 이하, 0.93nM 이하, 0.90nM 이하, 0.87nM 이하, 0.85nM 이하, 0.83nM 이하, 0.80nM 이하, 0.77nM 이하, 0.75nM 이하, 0.73nM 이하, 0.70nM 이하, 0.67nM 이하, 0.65nM 이하, 0.63nM 이하, 0.60nM 이하, 0.57nM 이하, 0.55nM 이하, 0.53nM 이하, 0.50nM 이하, 0.47nM 이하, 0.45nM 이하, 0.43nM 이하, 0.40nM 이하, 0.37nM 이하, 0.35nM 이하, 0.33nM 이하, 0.30nM 이하, 0.27nM 이하, 0.25nM 이하, 0.23nM 이하, 0.20nM 이하, 0.17nM 이하, 0.15nM 이하, 0.13nM 이하, 0.10nM 이하, 0.07nM 이하, 0.05nM 이하, 0.03nM 이하, 0.02nM 이하, 0.01nM 이하, 0.009nM 이하, 0.008nM 이하, 0.007nM 이하, 0.006nM 이하, 0.005nM 이하, 0.004nM 이하, 0.003nM 이하, 0.002nM 이하 또는 0.001nM 이하의 EC50 값으로 PVR 단백질에 결합할 수 있다.Additionally, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may have an EC 50 value of 10 nM or less, 7 nM or less, 5 nM or less, 3 nM or less, 2 nM or less, 1.5 nM or less, or 1.0 nM or less. For example, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has a molecular weight of 1.4nM or less, 1.3nM or less, 1.2nM or less, 1.1nM or less, 1.0nM or less, 0.97nM or less, 0.95nM or less, 0.93nM or less, 0.90nM or less, 0.87 nM or less. nM or less, 0.85nM or less, 0.83nM or less, 0.80nM or less, 0.77nM or less, 0.75nM or less, 0.73nM or less, 0.70nM or less, 0.67nM or less, 0.65nM or less, 0.63nM or less, 0.60nM or less, 0.57nM or less , 0.55nM or less, 0.53nM or less, 0.50nM or less, 0.47nM or less, 0.45nM or less, 0.43nM or less, 0.40nM or less, 0.37nM or less, 0.35nM or less, 0.33nM or less, 0.30nM or less, 0.27nM or less, 0.25 nM or less, 0.23nM or less, 0.20nM or less, 0.17nM or less, 0.15nM or less, 0.13nM or less, 0.10nM or less, 0.07nM or less, 0.05nM or less, 0.03nM or less, 0.02nM or less, 0.01nM or less, 0.009nM or less , can bind to PVR protein with an EC 50 value of 0.008nM or less, 0.007nM or less, 0.006nM or less, 0.005nM or less, 0.004nM or less, 0.003nM or less, 0.002nM or less, or 0.001nM or less.
일 측면에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 마우스의 PVR 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 이와 같은 교차 반응성(cross-reactivity)로 인해, 약물 유효성 평가의 편이성이 높다. In one aspect, the antibody or antigen-binding fragment thereof can specifically bind to human or mouse PVR protein. Due to this cross-reactivity, the convenience of evaluating drug effectiveness is high.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 70℃ 이상, 73℃ 이상, 75℃ 이상, 77℃ 이상 또는 80℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 81℃ 이상, 82℃ 이상, 83℃ 이상, 84℃ 이상, 85℃ 이상, 86℃ 이상, 87℃ 이상, 88℃ 이상, 89℃ 이상, 90℃ 이상, 91℃ 이상, 92℃ 이상, 93℃ 이상, 94℃ 이상 또는 95℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는 것일 수 있다.Additionally, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may have a melting temperature (Tm) of 70°C or higher, 73°C or higher, 75°C or higher, 77°C or higher, or 80°C or higher. For example, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has a temperature of 81°C or higher, 82°C or higher, 83°C or higher, 84°C or higher, 85°C or higher, 86°C or higher, 87°C or higher, 88°C or higher, 89°C or higher, 90°C or higher. It may have a melting temperature (Tm) of ℃ or higher, 91 ℃ or higher, 92 ℃ or higher, 93 ℃ or higher, 94 ℃ or higher or 95 ℃ or higher.
한편, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 PVR 단백질에 결합하여, TIGIT과의 결합을 억제하는 활성을 갖는다. 면역세포 표면에 발현되는 TIGIT 면역관문 수용체와 종양세포 표면에 발현되는 PVR의 결합을 차단하는 것을 통해, T 세포의 항암 활성을 증진시키는 역할을 할 수 있다.Meanwhile, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention binds to PVR protein and has the activity of inhibiting binding to TIGIT. It can play a role in enhancing the anticancer activity of T cells by blocking the combination of the TIGIT immune checkpoint receptor expressed on the surface of immune cells and PVR expressed on the surface of tumor cells.
또한, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 10nM 이하, 7nM 이하, 5nM 이하, 3nM 이하, 2nM 이하, 1.5nM 이하 또는 1.0nM 이하의 IC50 값을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1.4nM 이하, 1.3nM 이하, 1.2nM 이하, 1.1nM 이하, 1.0nM 이하, 0.97nM 이하, 0.95nM 이하, 0.93nM 이하, 0.90nM 이하, 0.87nM 이하, 0.85nM 이하, 0.83nM 이하, 0.80nM 이하, 0.77nM 이하, 0.75nM 이하, 0.73nM 이하, 0.70nM 이하의 IC50 값으로 PVR과 TIGIT 사이의 상호 결합을 효과적으로 차단할 수 있다. Additionally, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may have an IC 50 value of 10 nM or less, 7 nM or less, 5 nM or less, 3 nM or less, 2 nM or less, 1.5 nM or less, or 1.0 nM or less. For example, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has a molecular weight of 1.4nM or less, 1.3nM or less, 1.2nM or less, 1.1nM or less, 1.0nM or less, 0.97nM or less, 0.95nM or less, 0.93nM or less, 0.90nM or less, 0.87 nM or less. With an IC 50 value of less than nM, less than 0.85nM, less than 0.83nM, less than 0.80nM, less than 0.77nM, less than 0.75nM, less than 0.73nM, less than 0.70nM, mutual coupling between PVR and TIGIT can be effectively blocked.
2. 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 관련 유전자, 및 이를 포함하는 벡터 및 형질전환체2. Genes related to new antibodies or antigen-binding fragments thereof, and vectors and transformants containing them
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a gene encoding all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
본 발명의 일 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자와 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 각각 제공할 수 있다. 상기 중쇄 또는 경쇄의 가변영역을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 가변영역들의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 가변영역들의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.In one embodiment of the present invention, a gene encoding the heavy chain variable region of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention and a gene encoding the light chain variable region of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be provided, respectively. . The gene encoding the variable region of the heavy or light chain can be modified in various ways in the coding region within the range of not changing the amino acid sequences of the variable regions expressed from the coding region, and can affect gene expression even in parts other than the coding region. Various changes can be made within the range that do not affect it. Ultimately, as long as the genes of the variable regions encode proteins with equivalent activity, one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and such mutated genes are also included within the scope of the present invention. do.
또한, 본 발명의 다른 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자를 제공한다. 구체적으로, CDR1-H를 암호화하는 유전자, CDR2-H를 암호화하는 유전자 및 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 각각 개별적으로 제공한다. 특히, 상기 CDR1-H를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 상기 CDR2-H를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 상기 CDR3-H를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. In addition, another embodiment of the present invention provides genes encoding each of the CDRs included in the heavy chain variable region of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention. Specifically, the gene encoding CDR1-H, the gene encoding CDR2-H, and the gene encoding CDR3-H are provided individually. In particular, the gene encoding the CDR1-H may encode the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the gene encoding the CDR2-H may encode the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the CDR3-H The gene encoding may encode the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자를 제공한다. 구체적으로, CDR1-L를 암호화하는 유전자, CDR2-L를 암호화하는 유전자 및 CDR3-L를 암호화하는 유전자를 각각 개별적으로 제공한다. 특히, 상기 CDR1-L를 암호화하는 유전자는 서열번호6의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 상기 CDR2-L를 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 상기 CDR3-L를 암호화하는 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다.In addition, another embodiment of the present invention provides genes encoding each of the CDRs included in the light chain variable region of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention. Specifically, the gene encoding CDR1-L, the gene encoding CDR2-L, and the gene encoding CDR3-L are provided individually. In particular, the gene encoding the CDR1-L may encode the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, the gene encoding the CDR2-L may encode the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the CDR3-L The gene encoding may encode the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
상기 CDR들을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 CDR들의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 CDR들의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.The genes encoding the CDRs can be modified in various ways in the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the CDRs expressed from the coding region, and does not affect the expression of the gene in parts other than the coding region. Various mutations can occur in . Ultimately, as long as the genes of the CDRs encode proteins with equivalent activity, one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and such mutated genes are also included in the scope of the present invention. .
구체적으로, 본 발명의 유전자는 상기 PVR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 중쇄는 서열번호 11의 염기서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.Specifically, the gene of the present invention may include a base sequence encoding an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to the PVR. More specifically, the heavy chain includes the base sequence of SEQ ID NO: 11, and the light chain includes It may include the base sequence of SEQ ID NO: 12.
본 발명의 유전자는 상기 나열된 염기서열과 실질적으로 동일한 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열이란, 예컨대 전사 및 번역되었을 때 동일한 아미노산이 합성될 수 있는 경우를 포함하며, 상기 나열된 염기서열들과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The gene of the present invention may include a base sequence substantially identical to the base sequences listed above. The substantially identical base sequence includes, for example, cases where the same amino acid can be synthesized when transcribed and translated, and is at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, and at least 94% of the base sequences listed above. It may be a base sequence having homology of more than 95%, more than 96%, more than 97%, more than 98%, more than 99%, or more than 99.5%, but is not limited thereto.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자는 이를 도입시켜 발현시키고자 하는 생물의 종류와 상기 생물의 전사, 번역 등 발현 시스템에 따라, 최적화된 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 코돈의 축퇴성(degeneracy)에서 기인한 것으로, 이에 따라 발현되는 단백질을 암호화할 수 있는 다양한 조합의 뉴클레오티드 서열이 존재할 수 있으며 이들은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 코돈 최적화에 따른 폴리뉴클레오티드의 변형은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시켜 적용시키고자 하는 생물의 종류에 따라 결정될 수 있으며, 예컨대 본 발명의 유전자는 포유동물, 영장류의 코돈 선택에 최적화하여 변형된 유전자일 수 있고, 더욱 구체적으로는 인간으로부터 발현시켜 작용하기에 적합하도록 최적화되어 변형된 것일 수 있다.The gene encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof may include an optimized base sequence depending on the type of organism into which it is to be introduced and expressed and the expression system such as transcription and translation of the organism. This is due to the degeneracy of codons, and accordingly, various combinations of nucleotide sequences that can encode the expressed protein may exist, and all of them are included within the scope of the present invention. The modification of the polynucleotide according to the codon optimization may be determined depending on the type of organism to which the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is expressed and applied. For example, the gene of the present invention can be used for codon selection in mammals and primates. It may be a gene that has been optimized and modified, and more specifically, it may be a gene that has been optimized and modified to be suitable for expression and function in humans.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.In addition, another aspect of the present invention provides a recombinant expression vector containing a gene encoding all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention and a transformant into which the expression vector is introduced.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 포함하고, 상기 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.The recombinant expression vector of the present invention includes a gene encoding all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and the gene may be operably linked to a promoter.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. The expression vectors include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and viral vectors.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 발현 또는 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.The recombinant expression vector includes a promoter, terminator, enhancer, etc. depending on the type of host cell in which all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is to be expressed or produced. The same expression control sequence or sequence for secretion can be appropriately combined according to the purpose.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. The expression vector may further include a selection marker for selecting the host cell into which the vector is introduced, and if it is a replicable expression vector, it may include an origin of replication.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag), c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다. 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단 위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식 부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 수득한 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부가 생산될 수 있도록 할 수 있다.In addition, the recombinant expression vector may contain a sequence to facilitate purification of the expressed protein, and specifically, a tag for separation and purification to be operable on the gene encoding all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention. Genes encoding can be linked. At this time, the tag for separation and purification may be GST, poly-Arg, FLAG, histidine-tag, c-myc, etc., used alone, or two or more of them may be used sequentially connected. The gene encoding all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be cloned through a restriction enzyme cleavage site, and if a gene encoding a protein cleavage enzyme recognition site is used in the vector, the gene encoding the protein cleavage enzyme recognition site is used in the vector. is linked in frame with a gene encoding all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof to obtain all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and then cleaved with a protein cleavage enzyme. In this case, all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention in its original form can be produced.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.Additionally, a recombinant expression vector containing a gene encoding all or part of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is introduced into the transformant of the present invention.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. Transformants can be prepared by transforming the recombinant expression vector according to the present invention into any appropriate host cell selected from the group consisting of bacteria, yeast, E. coli, fungi, plant cells, and animal cells, depending on the expression purpose. . For example, the host cell may be an Escherichia coli (E. coli BL21 (DE3), DH5α, etc.) or yeast cell (Saccharomyces genus, Pichia genus, etc.). At this time, appropriate culture methods and medium conditions depending on the type of host cell can be easily selected by a person skilled in the art from known techniques in the field.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 인간 또는 마우스의 PVR 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.Additionally, the present invention provides a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a human or mouse PVR protein, comprising culturing the transformant.
본 발명의 형질전환체 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉, 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.The method of introducing the recombinant expression vector for producing the transformant of the present invention can use known techniques, such as heat shock method and electric shock method.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 대량 생산을 용이하게 할 수 있다.Since the protein expressed from the transformant is an antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, mass-production of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is facilitated by mass culturing the transformant to express the gene. can do.
3. 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도3. Use of novel antibodies or antigen-binding fragments thereof
본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention as an active ingredient.
상기 암은 종양 세포의 표면에 PVR을 발현하는 암일 수 있다. The cancer may be a cancer that expresses PVR on the surface of tumor cells.
예시적으로, 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 신장암, 신경교종, 흑색종, 위암, 신경모세포종, 대장암, 유방암, 자궁암, 췌장암, 만성 골수성 백혈암, 전립선암 및 두경부암일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 예방 또는 치료될 수 있다면, 그러한 암은 제한없이 상기 암의 범위에 포함될 수 있다. Illustratively, in one aspect of the present invention, the cancer includes lung cancer, liver cancer, kidney cancer, glioma, melanoma, stomach cancer, neuroblastoma, colon cancer, breast cancer, uterine cancer, pancreatic cancer, chronic myeloid leukemia, prostate cancer, and It may be head and neck cancer, but is not limited thereto, and if it can be prevented or treated by the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, such cancer may be included in the scope of the cancer without limitation.
PVR은 다양한 암세포에서 발현되는 세포 표면 마커로서, 면역 세포에서 발현되는 TIGIT 등의 면역관문 수용체와 결합하여 항암 면역반응을 조절할 수 있다. 여기서, 상기 면역 세포는 암세포에 대한 사멸 효능이 있는 NK 세포, T 세포를 포함할 수 있다. 따라서, TIGIT과 PVR의 결합을 억제하면, 면역관문 수용체 억제를 통해 면역 세포의 항암 활성이 감소되는 것을 방지할 수 있다. PVR is a cell surface marker expressed in various cancer cells, and can regulate anticancer immune responses by binding to immune checkpoint receptors such as TIGIT expressed in immune cells. Here, the immune cells may include NK cells and T cells that have a killing effect on cancer cells. Therefore, inhibiting the combination of TIGIT and PVR can prevent the anticancer activity of immune cells from decreasing through inhibition of immune checkpoint receptors.
또한, 본 발명의 항체를 이용하는 경우, NK 세포는 항체 의존 세포 독성(Antibody-Dependent cellular Cytotoxicity, ADCC)을 통한 암세포의 사멸을 촉진할 수 있다. 종양 세포의 표면에 존재하는 PVR에 본 발명의 항체가 결합하게 되고, NK 세포의 표면 수용체는 종양 세포에 결합한 항체를 인식하여, NK 세포의 세포 사멸 활성이 증가할 수 있다. Additionally, when using the antibody of the present invention, NK cells can promote the death of cancer cells through antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). The antibody of the present invention binds to the PVR present on the surface of tumor cells, and the surface receptor of NK cells recognizes the antibody bound to tumor cells, thereby increasing the cell death activity of NK cells.
따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PVR을 발현하는 암의 예방 또는 치료에 유효성분으로 이용될 수 있다.Therefore, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be used as an active ingredient in the prevention or treatment of cancer expressing PVR.
상기 예방은 암의 시작을 억제 또는 지연되도록 하는 모든 조치를 의미한다. 또한, 상기 치료는 발현된 암의 증상이 개선되거나 호전되도록 하는 모든 조치를 의미하며, 상기 치료의 바람직한 효과에는 암의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 암의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후 등을 포함한다.Prevention refers to all measures aimed at inhibiting or delaying the onset of cancer. In addition, the treatment refers to all measures to improve or improve the symptoms of the cancer that has developed, and the desirable effects of the treatment include preventing the occurrence or recurrence of cancer, alleviating symptoms, and eliminating any direct or indirect pathology of the cancer. Reduction of outcome, prevention of metastasis, reduction of the rate of disease progression, improvement or alleviation of the disease state, and remission or improved prognosis.
상기 약학적 조성물은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 외에, 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.In addition to the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
상기 '약학적으로 허용 가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 담체는 세포 또는 조직 내로의 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하고, 상기 첨가제는 약학적 조성물을 필요한 제형으로 제조하기 위해 필요한 임의의 성분들, 예컨대 부형제, 붕해제, 결합제, 착향제, 방부제, 활택제, 안정화제, 점성화제 등을 의미한다.The meaning of 'pharmaceutically acceptable' means that it does not inhibit the activity of the active ingredient and does not have any toxicity beyond what the subject of application (prescription) can adapt to. The carrier refers to a compound that facilitates the addition of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention into cells or tissues, and the additive refers to any ingredients necessary to prepare the pharmaceutical composition into the required formulation, such as excipients. , disintegrant, binder, flavoring agent, preservative, lubricant, stabilizer, viscosifier, etc.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용투여용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 이 때, 상기 약학적 조성물은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 더하여, 적어도 하나의 면역관문 억제제를 더 포함할 수 있다. Additionally, the present invention can provide a pharmaceutical composition for combined administration for the prevention or treatment of cancer containing the antibody or antigen-binding fragment thereof. At this time, the pharmaceutical composition may further include at least one immune checkpoint inhibitor in addition to the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
일 측면에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 세투시맙(cetuximab) 또는 티라골루맙(tiragolumab)일 수 있다. 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 면역관문 억제제와 병용 투여하는 경우, 각각을 단독으로 처리한 경우에 비해, 항암 효능에서 상승 효과가 나타날 수 있다.In one aspect, the immune checkpoint inhibitor may be cetuximab or tiragolumab. When the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is administered in combination with an immune checkpoint inhibitor, a synergistic effect may appear in anticancer efficacy compared to when each is treated alone.
이때, 상기 병용투여용 약학적 조성물에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역관문 억제제와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 면역관문 억제제를 개체에 먼저 투여한 후, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 상기 개체에 추가로 투여하거나, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 개체에 먼저 투여한 후, 면역관문 억제제를 개체에 추가로 투여할 수 있다. 또한, 경우에 따라서, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물과 면역관문 억제제를 동시에 개체에 투여할 수도 있다.At this time, in the pharmaceutical composition for combined administration, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be administered simultaneously or sequentially with the immune checkpoint inhibitor. For example, after first administering the immune checkpoint inhibitor to the subject, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, or the pharmaceutical composition is further administered to the subject, or the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention , Alternatively, the pharmaceutical composition may be first administered to the subject, and then an immune checkpoint inhibitor may be additionally administered to the subject. Additionally, in some cases, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, or the pharmaceutical composition and the immune checkpoint inhibitor may be administered to the subject simultaneously.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.In addition, another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, or the pharmaceutical composition to a subject in need.
상기 개체는 포유 동물일 수 있고, 예컨대 인간일 수 있으며, 특히 환자일 수 있다. 또한, 상기 '필요한 개체'는 암을 앓고 있거나, 앓을 가능성이 있는 개체를 의미한다.The subject may be a mammal, such as a human, and especially a patient. Additionally, the 'individual in need' refers to an individual suffering from cancer or likely to suffer from cancer.
또한, 상기 조성물은 1회량 또는 다회 용량으로 나누어서 투여될 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약의 종류, 투여경로 및 투여 시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경된다. 특히, 상기 약학적 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 인간을 포함하는 포유 동물 내로 전형적으로 허용된 경로, 예컨대, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 복강내로(intraperitoneally), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.Additionally, the composition may be administered in one dose or divided into multiple doses. Taking these factors into full consideration, it is important to administer the minimum amount sufficient to obtain maximum effect without side effects, and this dosage can be readily determined by an expert in the field. The dosage of the pharmaceutical composition is not particularly limited, but varies depending on various factors including the patient's health condition and weight, severity of the disease, type of drug, administration route, and administration time. In particular, the pharmaceutical compositions can be administered by typically accepted routes into mammals, including humans, in single or multiple doses per day, such as orally, rectally, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally. It may be administered intraperitoneally, intrauterinely, or intracerebrovascularly.
상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 '약학적으로 유효한 양'은 모든 의학적 치료에 적용 가능한 합당한 이익/위험 비율(benefit/risk ratio)로 충분히 예방 또는 치료의 효과를 나타내는 양을 의미한다. 또한, 상기 '약학적으로 유효한 양'은 치료해야 할 질환의 중증도, 환자의 나이 및 성별, 질환의 종류, 약제의 활성도, 약제에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 치료기간, 약제의 공투여 및 본 분야에서 알려진 다른 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라서 달라진다.The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, or the pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount. The ‘pharmacologically effective amount’ refers to an amount that sufficiently exhibits a preventive or therapeutic effect with a reasonable benefit/risk ratio applicable to all medical treatments. In addition, the 'pharmacologically effective amount' refers to the severity of the disease to be treated, the patient's age and gender, type of disease, activity of the drug, sensitivity to the drug, administration time, administration route, secretion rate, treatment period, drug It depends on a variety of factors, including co-administration and other parameters known in the art.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.However, the following examples specifically illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
[실시예 1][Example 1]
신규 항체의 설계 및 제작Design and production of new antibodies
암 세포에서 발현되는 PVR 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항-PVR 항체로, 하기 표 1에 기재된 서열번호 1, 2 및 3의 CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H를 포함하는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄와, 서열번호 6, 7 및 8의 CDR1-L, CDR2-L 및 CDR3-L을 포함하는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하도록 설계하였다. An anti-PVR antibody capable of specifically binding to PVR protein expressed in cancer cells, sequences comprising CDR1-H, CDR2-H, and CDR3-H of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 shown in Table 1 below. It was designed to include a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, including CDR1-L, CDR2-L, and CDR3-L of SEQ ID NOs: 6, 7, and 8.
상기의 서열을 포함하도록 제작된 항체 AHPVR-34(Anti-hPVR-34, 이하 'AHPVR-34')를 제조하였다. 구체적으로, 상기와 같이 설계된 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 암호화하는 서열번호 11의 염기서열을 pFUSEss-CHIg-hG1 벡터에 클로닝하고(도 1 참고), 상기와 같이 설계된 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열을 pFUSE2ss-CLILg-hl2 벡터에 클로닝하였다(도 2 참고). 그리고 상기와 같이 클로닝된 두 발현 벡터 pFUSEss-CHIg-hG1 벡터 및 pFUSE2ss-CLILg-hl2 벡터를 각 50ug씩 총 100ug을 Opti-MEM 배지 6ml에 희석하고, ExpiFectamineTM 293 Transfection Kit의 시약(ExpiFectamine TM 293 Reagent) 320ul를 Opti-MEM 배지 6ml에 희석하여 각각 5분간 정치하였다. 상기 벡터를 첨가한 배지와 상기 시약을 첨가한 배지를 섞어 10분 간 더 정치한 후, Expi293FTM 세포 100ml(2.0x106cells/ml)에 첨가하여 24시간 동안 부유 배양하였다. 상기와 같이 배양된 세포에 ExpiFectamineTM293 Transfection Enhancer를 첨가하여 4일 동안 추가 배양한 다음, 10,000xg로 30분 동안 원심분리하고 0.2um필터로 여과하여 상층액을 회수하였다. 그리고 상층액 내로 발현된 단백질을 AKTA purifier100 기기를 이용하여 친화성 컬럼(MabSelect prismA)에 결합시킨 후 산성 용출액(50mM의 아세트산 완충용액, pH 4.0)으로 용출시켰다. 상기와 같이 용출시킨 단백질을 제염 컬럼(desalting column, Hiprep 6/10)을 사용하여 PBS 완충용액으로 최종 정제하였다. 상기와 같이 정제된 단백질은 비환원(non-reducing) 및 환원(reducing) 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석을 통해, 중쇄(약 50 kDa) 및 경쇄(약 25 kDa)를 갖는 총 분자량 약 150 kDa의 항체임을 확인하였다.Antibodies constructed to contain the above sequences AHPVR-34 (Anti-hPVR-34, hereinafter referred to as 'AHPVR-34') was prepared. Specifically, the base sequence of SEQ ID NO: 11, which encodes the heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 designed as above, was cloned into the pFUSEss-CHIg-hG1 vector (see Figure 1), and the amino acid of SEQ ID NO: 10 designed as above was cloned into the pFUSEss-CHIg-hG1 vector. The base sequence of SEQ ID NO: 12, which encodes the light chain consisting of the sequence, was cloned into the pFUSE2ss-CLILg-hl2 vector (see Figure 2). Then, a total of 100 ug of the two expression vectors pFUSEss-CHIg-hG1 vector and pFUSE2ss-CLILg-hl2 vector cloned as above, 50 ug each, was diluted in 6 ml of Opti-MEM medium, and the reagent of the ExpiFectamine TM 293 Transfection Kit (ExpiFectamine TM 293 Reagent) was diluted as described above. ) 320ul was diluted in 6ml of Opti-MEM medium and left to stand for 5 minutes. The medium containing the vector and the medium containing the reagent were mixed and allowed to stand for another 10 minutes, then added to 100ml of Expi293F TM cells (2.0x10 6 cells/ml) and cultured in suspension for 24 hours. ExpiFectamine TM 293 Transfection Enhancer was added to the cells cultured as above and cultured for an additional 4 days, then centrifuged at 10,000xg for 30 minutes and filtered through a 0.2um filter to recover the supernatant. Then, the protein expressed in the supernatant was bound to an affinity column (MabSelect prismA) using an AKTA purifier100 device and then eluted with an acidic eluate (50mM acetic acid buffer solution, pH 4.0). The protein eluted as above was finally purified with a PBS buffer solution using a desalting column (Hiprep 6/10). The protein purified as above was analyzed by SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions to reveal that it was an antibody with a total molecular weight of about 150 kDa and a heavy chain (about 50 kDa) and a light chain (about 25 kDa). It was confirmed that it was.
[실시예 2] [Example 2]
항체의 항원에 대한 친화도 확인Confirmation of affinity of antibody to antigen
상기 실시예 1에서 준비한 항체의 인간 PVR 단백질에 대한 결합력을 확인하였다. The binding ability of the antibody prepared in Example 1 to human PVR protein was confirmed.
인간 PVR 단백질에 대한 AHPVR-34의 결합력을 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)로 분석하였다. 결합 분석은 25℃에서 수행하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 인간 PVR-his 단백질을 코팅 용액 (1.59 g/L Na2CO3, 2.93 g/L NaHCO3 pH 9.6)에 0.5 μg/mL 농도로 희석하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 블로킹 용액 (5% skim milk in PBS [8.0 g/L NaCl, 0.2 g/L KH2PO4 1.15 g/L Na2HPO4, 0.2 g/L KCl pH 7.4])에 희석된 항체를 플레이트에 첨가한 후, 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, HRP (horseradish peroxidase)가 부착된 항-인간 IgG Fc 항체를 블로킹 용액에 희석 후 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 배양하였다. 100μL/웰 처리 후, 50μL/웰의 0.5N H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450nm에서 5분 이내에 ELISA 플레이트 판독기로 흡광도를 측정하고 SoftMax Pro 5.4 소프트웨어(Molecular Device)의 4개 매개변수 물류 방정식을 사용하여 데이터를 분석했다. The binding ability of AHPVR-34 to human PVR protein was analyzed by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Binding assays were performed at 25°C. Human PVR-his protein was diluted to a concentration of 0.5 μg/mL in coating solution (1.59 g/L Na 2 CO 3 , 2.93 g/L NaHCO 3 pH 9.6) in each well of a 96-well plate and coated at 4°C overnight. Antibody diluted in blocking solution (5% skim milk in PBS [8.0 g/L NaCl, 0.2 g/L KH 2 PO 4 1.15 g/L Na 2 HPO 4 , 0.2 g/L KCl pH 7.4]) was added to the plate. Afterwards, it was cultured for 1 hour. After washing, HRP (horseradish peroxidase)-attached anti-human IgG Fc antibody was diluted in blocking solution and added, and the plate was incubated for 1 hour. After 100 μL/well treatment, 50 μL/well of 0.5NH 2 SO 4 was added to stop the reaction. Absorbance was measured with an ELISA plate reader within 5 min at 450 nm and data were analyzed using a four-parameter logistic equation in SoftMax Pro 5.4 software (Molecular Device).
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 인간 PVR 단백질에 결합하는 AHPVR-34의 EC50는 0.0005786 nM로 측정되어, 1pM 이하의 수준으로, 항원인 인간 PVR 단백질에 대하여 매우 우수한 친화력을 나타내는 것으로 확인되었다. As a result, as shown in Figure 3, the EC 50 of AHPVR-34 binding to the human PVR protein was measured at 0.0005786 nM, which was confirmed to exhibit very excellent affinity for the antigen, the human PVR protein, at a level of 1 pM or less. .
[실시예 3] [Example 3]
본 발명 항체의 인간 PVR 발현 세포에 대한 세포 결합력 확인Confirmation of cell binding ability of the antibody of the present invention to human PVR expressing cells
상기 실시예 1에서 준비한 항체가 정제된 단백질 항원뿐만 아니라, 항원을 발현하는 세포에 대해서도 특이적으로 결합하는지 여부를 확인하였다. It was confirmed whether the antibody prepared in Example 1 specifically binds not only to the purified protein antigen but also to cells expressing the antigen.
AHPVR-34 항체를 FACS 버퍼 (0.5 % BSA, 0.05 % 아자이드화 나트륨 (NaN3) in 1x PBS)에 희석한 후, 인간 PVR을 발현하는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에 다양한 농도로 처리하고, 4℃에서 30분 배양하였다. 이 후, CHO-PVR 세포를 FACS 버퍼로 세척한 후 APC 형광물질이 결합된 이차 항체로 배양하였다. 음성대조군으로는 hIgG 항체(BioXcell, Catalog #BP0297)를 사용하였다. AHPVR-34 항체의 세포 결합은 유세포 분석기(CytoFlex, Beckman coulter)를 이용하여 측정하였으며, EC50 값은 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 8.3.0; GraphPad)를 사용하여 결정하였다. The AHPVR-34 antibody was diluted in FACS buffer (0.5% BSA, 0.05% sodium azide (NaN 3 ) in 1x PBS) and then treated with CHO (Chinese hamster ovary) cells expressing human PVR at various concentrations. It was incubated at 4°C for 30 minutes. Afterwards, CHO-PVR cells were washed with FACS buffer and then incubated with secondary antibody conjugated with APC fluorescent material. hIgG antibody (BioXcell, Catalog #BP0297) was used as a negative control. Cell binding of the AHPVR-34 antibody was measured using flow cytometry (CytoFlex, Beckman coulter), and EC 50 values were determined using GraphPad Prism software (version 8.3.0; GraphPad).
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 인간 PVR 발현 CHO에 결합하는 AHPVR-34의 EC50는 0.9924nM로 측정되어, 수백 pM의 수준으로, 항원인 인간 PVR을 발현하는 세포에 대해서도 매우 우수한 친화력을 나타내는 것으로 확인되었다. As a result, as shown in Figure 4, the EC 50 of AHPVR-34 binding to CHO expressing human PVR was measured at 0.9924 nM, at a level of several hundred pM, showing very excellent affinity even for cells expressing the antigen, human PVR. It has been confirmed that it represents
[실시예 4] [Example 4]
인간 TIGIT 단백질과 인간 PVR 단백질 결합에 대한 본 발명 항체의 차단 특성 확인Confirmation of blocking properties of the antibody of the present invention for binding to human TIGIT protein and human PVR protein
종양 세포 표면에서 발현되는 PVR은 면역세포 표면에서 발현되는 TIGIT과 결합하여 항암 면역반응을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 이용하는 경우, 본 발명의 상체가 TIGIT과 PVR이 결합하는 것을 차단할 수 있는지 여부를 확인하였다.PVR expressed on the surface of tumor cells can regulate anticancer immune responses by combining with TIGIT expressed on the surface of immune cells. Therefore, when using the antibody of the present invention, it was confirmed whether the antibody of the present invention could block the binding of TIGIT and PVR.
[4-1] ELISA를 이용한 분석[4-1] Analysis using ELISA
구체적으로, 인간 TIGIT 단백질과 인간 PVR 단백질의 결합에 대한 AHPVR-34의 차단 특성을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 기반 블로킹 에세이를 사용하여 분석하였다. 해당 실험은 25℃에서 수행하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 정제한 인간 PVR-his 단백질을 코팅 용액 (1.59 g/L Na2CO3, 2.93 g/L NaHCO3 pH 9.6)에 0.5 μg/mL 농도로 희석하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 블로킹 용액 (5% skim milk in PBS [8.0 g/L NaCl, 0.2 g/L KH2PO4 1.15 g/L Na2HPO4, 0.2 g/L KCl pH 7.4])에 희석된 항체 및 재조합 인간 TIGIT-mIgG2a 단백질을 플레이트에 첨가한 다음, 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, HRP(horseradish peroxidase)가 부착된 항-마우스 IgG Fc 항체를 블로킹 용액에 희석 후 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 배양하였다. 100μL/웰 처리 후, 50μL/웰의 0.5N H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450nm에서 5분 이내에 ELISA 플레이트 판독기로 흡광도를 측정하고 SoftMax Pro 5.4 소프트웨어(Molecular Device)의 4개 매개변수 물류 방정식을 사용하여 데이터를 분석했다. ELISA를 사용하여 PVR과 TIGIT 사이의 상호 결합의 AHPVR-34에 의한 결합 차단 효능을 평가했다. Specifically, the blocking properties of AHPVR-34 against the binding of human TIGIT protein and human PVR protein were analyzed using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based blocking assay. The experiment was performed at 25°C. Purified human PVR-his protein was diluted to a concentration of 0.5 μg/mL in coating solution (1.59 g/L Na 2 CO 3 , 2.93 g/L NaHCO 3 pH 9.6) in each well of a 96-well plate and incubated overnight at 4°C. Coated. Antibodies and recombinant human TIGIT diluted in blocking solution (5% skim milk in PBS [8.0 g/L NaCl, 0.2 g/L KH 2 PO 4 1.15 g/L Na 2 HPO 4 , 0.2 g/L KCl pH 7.4]) -mIgG2a protein was added to the plate and incubated for 1 hour. After washing, horseradish peroxidase (HRP)-attached anti-mouse IgG Fc antibody was diluted in blocking solution and added, and the plate was incubated for 1 hour. After treatment at 100 μL/well, the reaction was stopped by adding 50 μL/well of 0.5NH 2 SO 4 . Absorbance was measured with an ELISA plate reader within 5 min at 450 nm and data were analyzed using a four-parameter logistic equation in SoftMax Pro 5.4 software (Molecular Device). The efficacy of binding blocking by AHPVR-34 of the cross-binding between PVR and TIGIT was evaluated using ELISA.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, AHPVR-34의 IC50 값은 0.1474nM로 측정되어, TIGTI과 PVR이 결합하는 것을 효과적으로 차단할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 5, the IC 50 value of AHPVR-34 was measured at 0.1474nM, confirming that it can effectively block the binding of TIGTI and PVR.
[4-2] FACS를 이용한 분석[4-2] Analysis using FACS
나아가, 인간 PVR과 인간 TIGIT 단백질의 결합에 대한 AHPVR-34의 차단 특성을 FACS를 사용하여 분석하였다.Furthermore, the blocking properties of AHPVR-34 on the binding of human PVR and human TIGIT protein were analyzed using FACS.
AHPVR-34 항체를 FACS 버퍼 (0.5 % BSA, 0.05 % 아자이드화 나트륨(NaN3) in 1x PBS)에 희석한 후 인간 PVR을 발현하는 CHO 세포에 다양한 농도로 처리하고 재조합 인간 TIGIT-mIgG2a 단백질과 함께 4℃에서 30분 배양하였다. 이 후 CHO-PVR 세포를 FACS 버퍼로 세척한 후 APC 형광물질이 결합된 항-마우스 이차 항체로 배양하였다. 음성대조군으로는 hIgG 항체를 사용하였다. AHPVR-34 항체의 차단 특성은 유세포 분석기(CytoFlex, Beckman coulter)를 이용하여 측정하였으며, IC50 값은 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 8.3.0; GraphPad)를 사용하여 결정하였다.The AHPVR-34 antibody was diluted in FACS buffer (0.5% BSA, 0.05% sodium azide (NaN 3 ) in 1x PBS) and then treated with CHO cells expressing human PVR at various concentrations and incubated with the recombinant human TIGIT-mIgG2a protein. They were incubated together at 4°C for 30 minutes. Afterwards, CHO-PVR cells were washed with FACS buffer and incubated with anti-mouse secondary antibody conjugated with APC fluorescent substance. hIgG antibody was used as a negative control. The blocking properties of the AHPVR-34 antibody were measured using a flow cytometer (CytoFlex, Beckman coulter), and the IC 50 values were determined using GraphPad Prism software (version 8.3.0; GraphPad).
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, AHPVR-34의 IC50 값은 0.5214nM로 측정되어, AHPVR-34가 PVR와 TIGIT 사이의 상호 결합을 억제할 수 있음을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 6, the IC 50 value of AHPVR-34 was measured to be 0.5214nM, confirming that AHPVR-34 can inhibit the mutual binding between PVR and TIGIT.
[실시예 5] [Example 5]
본 발명 항체의 마우스 PVR 발현 세포에 대한 교차 반응성(cross-reactivity) 확인Confirmation of cross-reactivity of the antibody of the present invention to mouse PVR-expressing cells
상기 실시예 1에서 준비한 항체가 인간뿐만 아니라 마우스 PVR 단백질에 대해서도 교차 결합 반응성을 나타내는지 여부를 확인하였다.It was confirmed whether the antibody prepared in Example 1 showed cross-linking reactivity not only to human but also to mouse PVR protein.
AHPVR-34 항체를 FACS 버퍼 (0.5 % BSA, 0.05 % 아자이드화 나트륨(NaN3) in 1x PBS)에 희석한 후 마우스 PVR을 발현하는 CHO 세포에 2 ug/ml로 처리하고 4℃에서 30분 배양하였다. 이 후, CHO-마우스 PVR 세포를 FACS 버퍼로 세척한 후 APC 형광물질이 결합된 이차 항체로 배양하였다. 음성대조군으로는 hIgG 항체를 사용하였다. AHPVR-34 항체의 세포 결합은 유세포 분석기(CytoFlex, Beckman coulter)를 이용하여 측정하였다.AHPVR-34 antibody was diluted in FACS buffer (0.5% BSA, 0.05% sodium azide (NaN 3 ) in 1x PBS) and then treated at 2 ug/ml on CHO cells expressing mouse PVR and incubated at 4°C for 30 minutes. Cultured. Afterwards, CHO-mouse PVR cells were washed with FACS buffer and then incubated with secondary antibody conjugated with APC fluorescent substance. hIgG antibody was used as a negative control. Cellular binding of the AHPVR-34 antibody was measured using a flow cytometer (CytoFlex, Beckman coulter).
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, AHPVR-34 항체는 세포 표면에 발현된 마우스 PVR 수용체에 결합함이 확인되었다. AHPVR-34 항체는 인간 PVR과 마우스 PVR 단백질에 교차 반응성을 갖는 독특한 성질을 지닌다는 것을 보여준다. As a result, as shown in Figure 7, it was confirmed that the AHPVR-34 antibody binds to the mouse PVR receptor expressed on the cell surface. We show that the AHPVR-34 antibody has the unique property of cross-reactivity to human PVR and mouse PVR proteins.
[실시예 6] [Example 6]
항체 처리시 NK 세포에 의한 ADCC (Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 증가 확인Confirmed increase in ADCC (Antibody-dependent cellular cytotoxicity) by NK cells upon antibody treatment
상기 실시예 1에서 준비한 항체를 처리하는 경우, NK 세포에 의한 ADCC 가 증가하는지 여부를 만성 골수성 백혈암 세포에서 확인하였다. It was confirmed in chronic myeloid leukemia cells whether ADCC by NK cells increased when treated with the antibody prepared in Example 1.
우선, NK 세포를 얻기위한 인간 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 혈액 샘플로부터 퍼콜 밀도 기울기 원심분리(Percoll density gradient centrifugation)를 이용해 분리하였다. 인간 PBMC를 미토마이신C 50ug/ml (Sigma)이 처리된 K562 세포와 함께 RPMI1640 배지에 재조합 인간 IL-2 100U/mL을 첨가하여 공동 배양하였다. 배지는 이틀마다 재조합 인간 IL-2를 포함한 새로운 배지로 교체하였다. 일주일 배양 후, 남아있는 T 세포를 CD3 양성 선택 키트(positive selection kit)를 이용하여 제거하였다. 남아있는 NK 세포는 인간 IL-15 (5ng/ml)을 포함한 배지에 이틀마다 새 배지로 교체되면서 2주 더 배양시켰다. NK 세포의 순도는 항-인간 CD56 항체를 이용하여 유세포 분석기(CytoFlex, Beckman coulter)로 측정하여, 95% 이상 될 경우만 에세이에 사용하였다. First, human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) to obtain NK cells were isolated from blood samples using Percoll density gradient centrifugation. Human PBMC were co-cultured with K562 cells treated with 50ug/ml of mitomycin C (Sigma) by adding 100U/mL of recombinant human IL-2 to RPMI1640 medium. The medium was replaced with fresh medium containing recombinant human IL-2 every two days. After one week of culture, the remaining T cells were removed using a CD3 positive selection kit. The remaining NK cells were cultured in medium containing human IL-15 (5 ng/ml) for an additional 2 weeks while being replaced with new medium every two days. The purity of NK cells was measured using a flow cytometer (CytoFlex, Beckman coulter) using an anti-human CD56 antibody, and only those exceeding 95% were used in the assay.
또한, K562 세포를 반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 발현하도록 변형하여 K562-Luc 세포를 제조하였다. ADCC(Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 분석에서, 이들 K562-Luc 세포는 인간 IgG1 또는 AHPVR-34 항체(33nM 또는 67nM의 농도)의 존재 하에 인간 NK 세포와 함께 인간 NK 세포 배양 배지(RPMI + 10% FBS + 20mM HEPES + 1X GlutaMAX + 1X MEM NEAA + 1mM 피루브산 나트륨 + 1% 페니실린 스트렙토마이신)에서 배양하였다. 공동 배양은 4시간 동안 5% CO2로 37℃에서 수행하였다. NK세포의 세포 살상력은 살아있는 세포의 루시퍼라아제 활성을 측정하여 결정하였다. 공동 배양 후 세포 용해 용액 (25mM 트리스 인산염(pH 7.8) + 2mM DTT + 2mM 1,2-다이아미노사이클로헥세인-N,N,N´,N´-테트라아세트산 + 10% 글리세롤 + 1% 트리톤® X-100) 을 50ul/웰 처리한 후 10분 뒤 루시퍼라아제의 기질인 D-루시페린이 첨가된 루시퍼라아제 반응 버퍼(PBS)를 50ul/웰 처리하여 세포 용해물에서 방출된 발광 신호를 루시퍼라아제 분석 시스템 (GloMax® Discover Microplate Reader) 을 사용하여 정량화하였다.Additionally, K562 cells were modified to express the firefly luciferase gene to produce K562-Luc cells. In the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) assay, these K562-Luc cells were incubated with human NK cells in the presence of human IgG1 or AHPVR-34 antibodies (concentrations of 33 nM or 67 nM) in human NK cell culture medium (RPMI + 10% FBS). + 20mM HEPES + 1X GlutaMAX + 1X MEM NEAA + 1mM sodium pyruvate + 1% penicillin streptomycin). Co-culture was performed at 37°C with 5% CO 2 for 4 hours. The cell killing ability of NK cells was determined by measuring the luciferase activity of living cells. Cell lysis solution after co-culture (25mM Tris phosphate (pH 7.8) + 2mM DTT + 2mM 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N´,N´-tetraacetic acid + 10% glycerol + 1% Triton® 10 minutes after treatment with 50ul/well of Quantification was performed using the Lase Assay System (GloMax® Discover Microplate Reader).
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 hIgG1을 이용한 경우보다, 본 발명의 항체를 이용한 경우, ADCC에 의한 세포 사멸 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 항체의 농도를 33nM을 사용했을 경우보다, 67nM을 사용하였을 때 세포 사멸 활성이 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 항체를 이용하는 경우, PVR을 발현하는 세포에서 NK 세포에 의한 ADCC 가 증가함을 알 수 있다. As a result, as shown in Figure 8, it was confirmed that the cell death activity by ADCC increased when the antibody of the present invention was used compared to when hIgG1, a negative control, was used. In addition, it was confirmed that the cell death activity increased more when 67 nM antibody concentration was used than when 33 nM antibody concentration was used. Therefore, when using the antibody of the present invention, it can be seen that ADCC by NK cells increases in cells expressing PVR.
[실시예 7] [Example 7]
본 발명의 항체와 세투시맙(cetuximab) 항체 병용 처리 시 NK 세포에 의한 폐암 세포의 ADCC 증가ADCC of lung cancer cells increased by NK cells during combined treatment with the antibody of the present invention and cetuximab antibody.
상기 실시예 1에서 준비한 항체와 다른 항암제 중 하나인 면역관문 억제제 세투시맙(cetuximab)과 병행 처리시, 각각을 단독으로 처리했을 때보다 NK 세포에 의한 ADCC를 더욱 증가시킬 수 있는지 확인하였다. It was confirmed whether ADCC by NK cells could be further increased when treated in parallel with the antibody prepared in Example 1 and the immune checkpoint inhibitor cetuximab, one of the other anticancer drugs, compared to when each was treated alone.
구체적으로, 반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 A549 세포에 도입하여 A549-Luc 세포를 제조하였다. ADCC (Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 분석에서, A549-Luc 세포는 모두 67nM의 농도에서 인간 IgG1, AHPVR-34, 세투시맙 또는 AHPVR-34와 세투시맙 항체의 조합의 존재 하에 인간 NK 세포와 함께 인간 NK 세포 배양 배지(RPMI + 10% FBS + 20mM HEPES + 1X GlutaMAX + 1X MEM NEAA + 1mM 피루브산 나트륨 + 1% 페니실린 스트렙토마이신)에 배양시켰다. 공동 배양은 4시간 동안 5% CO2, 37℃에서 수행하였다. NK세포의 세포 살상력은 살아있는 세포의 루시퍼라아제 활성을 측정하여 결정하였다. 공동 배양 후 세포 용해 용액 (25mM 트리스 인산염(pH 7.8) + 2mM DTT + 2mM 1,2-다이아미노사이클로헥세인-N,N,N´,N´-테트라아세트산 + 10% 글리세롤 + 1% 트리톤® X-100) 을 50ul/웰 처리한 후 10분 뒤 루시퍼라아제의 기질인 D-루시페린이 첨가된 루시퍼라아제 반응 버퍼(PBS)를 50ul/웰 처리하여 세포 용해물에서 방출된 발광 신호를 루시퍼라아제 분석 시스템 (GloMax® Discover Microplate Reader)을 사용하여 정량화하였다.Specifically, the firefly luciferase gene was introduced into A549 cells to prepare A549-Luc cells. In an antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) assay, A549-Luc cells co-localized with human NK cells in the presence of human IgG1, AHPVR-34, cetuximab, or a combination of AHPVR-34 and cetuximab antibodies, all at a concentration of 67 nM. Human NK cells were cultured in culture medium (RPMI + 10% FBS + 20mM HEPES + 1X GlutaMAX + 1X MEM NEAA + 1mM sodium pyruvate + 1% penicillin streptomycin). Co-culture was performed at 37°C with 5% CO 2 for 4 hours. The cell killing ability of NK cells was determined by measuring the luciferase activity of living cells. Cell lysis solution after co-culture (25mM Tris phosphate (pH 7.8) + 2mM DTT + 2mM 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N´,N´-tetraacetic acid + 10% glycerol + 1% Triton® 10 minutes after treatment with 50ul/well of Quantification was performed using the Lase Assay System (GloMax® Discover Microplate Reader).
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 hIgG1을 이용한 경우 세포 사멸 활성이 약 18%인 것에 반해, 본 발명의 항체 또는 세투시맙을 이용한 경우, ADCC에 의한 세포 사멸 활성이 각각 약 38%, 약 35%로 증가하는 것을 확인하였다. 나아가, 본 발명의 항체와 세투시맙을 각각 단독으로 처리한 경우보다, 병용하여 처리한 경우, 세포 사멸 활성 약 55%로, 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 9, when hIgG1, a negative control, was used, the cell death activity was about 18%, whereas when the antibody of the present invention or cetuximab was used, the cell death activity by ADCC was about 38%, respectively. %, it was confirmed that it increased to about 35%. Furthermore, it was confirmed that when the antibody of the present invention and cetuximab were treated in combination, the cell killing activity significantly increased to about 55%, compared to when the antibody of the present invention and cetuximab were treated individually.
[실시예 8] [Example 8]
본 발명 항체에 의한 암항원 특이적 T 세포의 암세포 사멸 효능 증진Enhancement of cancer cell killing efficacy of cancer antigen-specific T cells by the antibody of the present invention
본 발명의 항체를 이용하여 암세포 발현 PVR을 차단하여 T 세포의 암세포 사멸 효능을 증진시킬 수 있는지 여부를 확인하였다. 여기서 이용한 티라골루맙(Tiragolumab)은 T세포에서 발현하는 TIGIT과 결합할 수 있는 면역 항암제의 일종이다. T 세포의 암살상 효능을 티라골루맙과 비교하여 확인하였다.It was confirmed whether the antibody of the present invention could be used to enhance the cancer cell killing efficacy of T cells by blocking PVR expressed in cancer cells. Tiragolumab used here is a type of anticancer immunotherapy agent that can bind to TIGIT expressed in T cells. The killing efficacy of T cells was confirmed by comparison with tiragolumab.
인간 CD8+ T세포는 EasySep 인간 T 세포 분리 키트 (STEMCELL Technologies)을 이용하여 PBMC로부터 분리시켰다. 분리된 인간 CD8+ T세포는 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Invitrogen)을 이용하여 인간 IL-2 100ng/ml의 존재 하에 자극하였다. RPMI1640 배지에 배양 3일 후, HLA-A2 제한 NY-ESO-1 펩티드 항원(NY-ESO-1:157-165)에 특이적인 T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 렌티바이러스를 polybrene 8ug/ml과 함께 활성화된 CD8+ T세포에 형질도입 시켰다. 48시간 후, polybrene과 Dynabeads가 포함된 렌티바이러스 배양액을 제거하고 RPMI1640 배지에 IL-2 100ng/ml과 함께 배양하였다. NY-ESO-1 특이적 TCR의 발현은 항-인간 Vβ13.1 TCR chain 항체를 이용하여 유세포 분석기(CytoFlex, Beckman coulter)로 측정하였다. 다음으로, NY-ESO-1 TCR을 발현하는 인간 CD8+ T 세포를 안정적으로 반딧불이 루시퍼라아제와 NY-ESO-1 펩티드 항원을 발현하는 A375 세포와 함께 배양하였다. 공동 배양은 72시간 동안 5% CO2, 37℃에서 수행하였다. 음성대조군으로는 hIgG1 항체를 사용하였다. hIgG1, 티라골루맙 또는 AHPVR-34의 존재 하에 인간 T 세포 배양 배지 (RPMI + 10% FBS + 20mM HEPES + 1X GlutaMAX + 1X MEM NEAA + 1mM 피루브산 나트륨 + 1% 페니실린 스트렙토마이신)에서 진행하였다. 이어서, 루시퍼라아제 활성의 손실을 측정함으로써 종양세포 세포독성을 결정하였다.Human CD8 + T cells were isolated from PBMCs using the EasySep human T cell isolation kit (STEMCELL Technologies). Isolated human CD8 + T cells were stimulated using Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Invitrogen) in the presence of 100 ng/ml of human IL-2. After 3 days of culture in RPMI1640 medium, lentivirus encoding the T-cell receptor (TCR) specific for the HLA-A2-restricted NY-ESO-1 peptide antigen (NY-ESO-1:157-165) was incubated with 8ug/ml of polybrene. and transduction into activated CD8+ T cells. After 48 hours, the lentivirus culture medium containing polybrene and Dynabeads was removed and cultured in RPMI1640 medium with 100ng/ml of IL-2. The expression of NY-ESO-1 specific TCR was measured by flow cytometry (CytoFlex, Beckman coulter) using anti-human Vβ13.1 TCR chain antibody. Next, human CD8+ T cells expressing NY-ESO-1 TCR were co-cultured with A375 cells stably expressing firefly luciferase and NY-ESO-1 peptide antigen. Co-culture was performed at 37°C with 5% CO 2 for 72 hours. hIgG1 antibody was used as a negative control. Processed in human T cell culture medium (RPMI + 10% FBS + 20mM HEPES + 1X GlutaMAX + 1X MEM NEAA + 1mM sodium pyruvate + 1% penicillin streptomycin) in the presence of hIgG1, tiragolumab or AHPVR-34. Tumor cell cytotoxicity was then determined by measuring the loss of luciferase activity.
공동 배양 후 세포 용해 용액 (25mM 트리스 인산염 (pH 7.8) + 2mM DTT + 2mM 1,2- 다이아미노사이클로헥세인-N,N,N´,N´ 테트라아세트산 + 10% 글리세롤 + 1% 트리톤® X-100) 을 50ul/웰 처리한 후 10분 뒤, 루시퍼라아제의 기질인 D-루시페린이 첨가된 루시퍼라아제 반응 버퍼(PBS)를 50ul/웰 처리하여 세포 용해물에서 방출된 발광 신호를 루시퍼라아제 분석 시스템 (GloMax® Discover Microplate Reader) 을 사용하여 정량화하였다.After co-culture, cell lysis solution (25mM Tris Phosphate (pH 7.8) + 2mM DTT + 2mM 1,2- diaminocyclohexane-N,N,N´, N´ tetraacetic acid + 10% glycerol + 1% Triton® -100) was treated with 50ul/well, and 10 minutes later, 50ul/well of luciferase reaction buffer (PBS) containing D-luciferin, a substrate of luciferase, was added, and the luminescent signal emitted from the cell lysate was converted to luciferase. Quantification was performed using the Lase Assay System (GloMax® Discover Microplate Reader).
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 hIgG1을 5ug/ml, 10ug/ml 이용한 경우 모두 세포 사멸 활성이 약 5%인 것에 반해, 티라골루맙을 5ug/ml, 10ug/ml 사용한 경우 각각 약 12%, 14%였고, 본 발명의 항체를 5ug/ml, 10ug/ml 사용한 경우 약 15%, 18%의 세포 사멸 활성을 나타냈다. 즉, 본 발명의 항체를 이용하는 경우, 기존에 알려진 면역 항암제인 티라골루맙보다 동일한 양을 처리하더라도 더욱 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다. 해당 결과는 PVR과 TIGIT이 상호 결합하여 T 세포의 활성을 조절하더라도, 암세포 발현 PVR을 차단하는 접근 방법이 T 세포 발현 TIGIT을 차단하는 접근 방법보다 T 세포의 항암 효능을 더 증진시킬 수 있다는 가능성을 제시한다. As a result, as shown in Figure 10, the cell death activity was about 5% when 5ug/ml and 10ug/ml of hIgG1, a negative control, were used, whereas when tiragolumab was used at 5ug/ml and 10ug/ml, respectively. It was about 12% and 14%, and when 5ug/ml and 10ug/ml of the antibody of the present invention was used, the cell death activity was about 15% and 18%. In other words, it was confirmed that when using the antibody of the present invention, it shows a more excellent effect than tiragolumab, a previously known anti-cancer immunotherapy agent, even when treated in the same amount. The results raise the possibility that even though PVR and TIGIT interact with each other to regulate T cell activity, an approach that blocks cancer cell-expressed PVR may improve the anticancer efficacy of T cells more than an approach that blocks T cell-expressed TIGIT. present.
상기에서는 본 발명의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.In the above, representative embodiments of the present invention have been described by way of example, but the scope of the present invention is not limited to the specific embodiments described above, and those skilled in the art will understand that the scope of the present invention is within the scope stated in the claims of the present application. It will be possible to change it appropriately.
Claims (16)
서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1-L, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2-L 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3-L을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하고
PVR(Poliovirus receptor)에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A heavy chain variable region comprising CDR1-H consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, CDR2-H consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and CDR3-H consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and
A light chain variable region comprising CDR1-L consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2-L consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and CDR3-L consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to PVR (Poliovirus receptor).
상기 항체의 항원 결합 단편은 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragment; scFv)인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
In claim 1,
An antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the antigen-binding fragment of the antibody is a single chain variable fragment (scFv).
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
In claim 1,
The heavy chain variable region includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
The light chain variable region is an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
상기 중쇄는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고,
상기 경쇄는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
In claim 3,
The heavy chain includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
The light chain is an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 마우스의 PVR 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
In claim 1,
The antibody or antigen-binding fragment thereof is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a human or mouse PVR protein.
A gene encoding the antibody of claim 1 or an antigen-binding fragment thereof.
청구항 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는 서열번호 11의 염기서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 것인, 유전자.
In claim 6,
The heavy chain of the antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1 includes the base sequence of SEQ ID NO: 11, and the light chain includes the base sequence of SEQ ID NO: 12.
A recombinant expression vector containing the gene of claim 6.
An isolated host cell into which the recombinant expression vector of claim 8 has been introduced.
A method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a human or mouse PVR protein, comprising culturing the isolated host cell of claim 9.
A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising the antibody of claim 1 or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
상기 암은 PVR(Poliovirus receptor)을 발현하는 암인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
In claim 11,
A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, wherein the cancer is a cancer that expresses PVR (Poliovirus receptor).
상기 암은 폐암, 간암, 신장암, 신경교종, 흑색종, 위암, 신경모세포종, 대장암, 유방암, 자궁암, 췌장암, 만성 골수성 백혈암, 전립선암 및 두경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
In claim 11,
The cancer is at least one selected from the group consisting of lung cancer, liver cancer, kidney cancer, glioma, melanoma, stomach cancer, neuroblastoma, colon cancer, breast cancer, uterine cancer, pancreatic cancer, chronic myeloid leukemia, prostate cancer, and head and neck cancer, Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
상기 항체는 하기 i) 및 ii)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 활성을 갖는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
i) NK 세포 매개 ADCC를 통한 암세포의 사멸 촉진; 및
ii) TIGIT 면역관문 수용체 억제를 통한 T 세포의 항암 활성 촉진.
In claim 11,
A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, wherein the antibody has at least one activity selected from the group consisting of i) and ii) below:
i) Promoting cancer cell death through NK cell-mediated ADCC; and
ii) Promoting anti-cancer activity of T cells through inhibition of TIGIT immune checkpoint receptor.
청구항 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
을 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용투여용 약학적 조성물.
cetuximab or tiragolumab; and
The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1;
A pharmaceutical composition for combined administration for the prevention or treatment of cancer, comprising.
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| KR20180133399A (en) * | 2016-03-01 | 2018-12-14 | 이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디. | Antibodies specific for the human polyoviral receptor (PVR) |
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