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KR102660682B1 - 세포 배양용 시트 - Google Patents

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KR102660682B1
KR102660682B1 KR1020207037805A KR20207037805A KR102660682B1 KR 102660682 B1 KR102660682 B1 KR 102660682B1 KR 1020207037805 A KR1020207037805 A KR 1020207037805A KR 20207037805 A KR20207037805 A KR 20207037805A KR 102660682 B1 KR102660682 B1 KR 102660682B1
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후미아키 시마
고지 나카자와
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가부시키가이샤 닛폰 쇼쿠바이
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Abstract

개구부의 구경이 직경 1000㎛ 이하의 오목부를 복수개 가지고, 상기 오목부의 내측면이 세포 비접착성 표면을 가지면서, 상기 오목부의 저면이 세포 접착성 표면을 갖는 세포 배양용 시트 및, 직경 1000㎛ 이하의 관통공을 복수개 가지는 세포 비접착성 표면을 갖는 층 및 세포 접착성 표면을 갖는 층을 적층하는 세포 배양용 시트의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 시트는 간편하게 제조할 수 있으며, 또한 세포 배양 작업 자체도 효율적으로 수행할 수 있게 되므로, 예를 들면, 스페로이드 함유 제제 등의 세포제제 분야에 적절하게 사용할 수 있다.

Description

세포 배양용 시트
본 발명은 세포 배양용 시트에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 세포 배양용 시트 및 그 제조방법, 상기 시트를 포함한 세포 배양용 기구, 및 상기 시트 또는 기구를 이용한 스페로이드(spheroid)의 제조방법에 관한 것이다.
세포 배양에 있어서, 더욱 생체 조직을 모방할 수 있다는 등의 측면에서, 최근 배양세포를 삼차원적으로 배양하는 기술이 주목받고 있다.
예를 들면, 특허문헌 1에는, 세포유지 캐비티를 복수로 가지는 마이크로칩에서, 상기 캐비티의 저면(底面)이 세포 접착성을 나타내는 접착성 영역과, 상기 접착성 영역을 둘러싸고 세포 비접착성을 나타내는 비접착성 영역을 포함함으로써, 균일한 형상 및 크기의 세포조직을 형성할 수 있음이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 2에서는, 관통공을 갖는 다공질 필름상에서 세포를 배양하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 다공질 필름 표면이 세포 접착성 영역과 세포 비접착성 영역으로 구성되어, 신선한 배양액의 공급이나 노폐물의 배출을 원활하게 하면서 효율적으로 3차원 조직체를 배양하는 방법이 개시되어 있다.
일본 특개 2006-121991호 공보 일본 특개 2008-199962호 공보
그러나, 종래기술의 방법은, 세포 배양용 기구의 제조가 번잡하거나, 얻어지는 세포 조직체의 균일성이 아직 충분하지 않은 등, 추가적인 기술이 요구되고 있다.
본 발명은 신규한 세포 배양용 시트의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 간편하게 제조할 수 있으면서, 또한 세포 배양을 효율적으로 수행할 수 있는 세포 배양용 시트 및 그 제조방법, 상기 시트를 포함하는 세포 배양용 기구, 및 상기 시트 또는 기구를 이용하는 스페로이드의 제조방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의검토한 결과, 세포 배양면을 특정 표면에 형성함으로써, 세포 배양 시트의 제조가 간편할뿐만 아니라, 배지의 교환이나 세포파종 등의 세포 배양 작업 자체도 용이하게 되고, 또한 얻어지는 세포응집괴(스페로이드)의 균일성이 향상되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기 [1] 내지 [10]에 관한 것이다.
〔1〕 개구부의 구경이 직경 1000㎛ 이하의 오목부를 복수개 가지고, 상기 오목부의 내측면이 세포 비접착성 표면을 가지면서, 상기 오목부의 저면은 세포 접착성 표면을 갖는, 세포 배양용 시트.
〔2〕 상기 〔1〕에 있어서, 관통공(貫通孔)을 갖는 세포 비접착성 표면을 갖는 층과, 세포 접착성 표면을 갖는 층의 적층물인 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
[3] 상기 〔2〕에 있어서, 세포 비접착성 표면을 갖는 층과 세포 접착성 표면을 갖는 층 사이에, 추가로 접착층을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
[4] 상기 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 있어, 세포 접착성 표면이 합성수지로 구성된 것을 특징으로 하는, 상기 세포 배양용 시트.
[5] 상기 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 하나에 있어, 세포 접착성 표면이 폴리이미드를 포함하는 수지 조성물로 구성된 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
[6] 상기 〔1〕 내지 〔5〕 중 어느 하나에 있어, 오목부가 저면측을 향하여 테이퍼 형상으로 형성되는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
[7] 상기 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 하나에 있어, 오목부가 단위면적당(㎠) 10 내지 1000개로 형성되는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
[8] 직경 1000㎛ 이하의 관통공을 복수개 가지는 세포 비접착성 표면을 갖는 층 및 세포 접착성 표면을 갖는 층을 적층하는, 세포 배양용 시트의 제조방법.
[9] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 세포 배양용 시트를 포함하는 세포 배양용 기구.
[10] 상기 [1] 내지 [7], [9] 중 어느 하나에 기재된 세포 배양용 시트 또는 세포 배양용 기구로 배양하는, 스페로이드의 배양방법.
본 발명의 세포 배양 시트는, 간편하게 제조할 수 있으면서, 또한 세포 배양 작업 자체도 효율적으로 수행할 수 있게 된다.
또한, 본 발명의 세포 배양 시트를 이용함으로써, 얻어지는 세포 응집괴(스페로이드)의 균일성을 향상시키고, 나아가 세포의 품질 관리가 용이하게 되는 우수한 효과를 발휘할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 세포 배양용 시트의 일 실시예에 있어서, 시트의 단면구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는, 본 발명의 세포 배양용 시트의 일 실시예에 있어서, 시트의 단면구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 3은, 본 발명의 세포 배양용 시트의 일 실시예에 있어서, 시트의 단면구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 4는, 본 발명의 세포 배양용 시트에서, 세포를 배양한 일 실시예를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 5는, 본 발명의 세포 배양용 시트에서, 세포를 배양한 일 실시예를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 6은, 본 발명의 세포 배양용 시트의 일 실시예에 있어서, 시트의 단면구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 7은, 본 발명의 세포 배양용 시트를 이용하여 얻은 스페로이드의 사진을 나타낸 도면이다.
도 8은, 본 발명의 세포 배양용 시트를 이용하여 얻은 스페로이드의 유체직경을 나타내는 도면이다.
도 9는, 본 발명의 세포 배양용 시트를 이용하여 얻은 스페로이드의 등면적직경(projected area diameter)을 나타내는 도면이다.
도 10은, 본 발명의 세포 배양용 시트를 이용하여 얻은 스페로이드의 원형도를 나타내는 도면이다.
도 11은, 시험예 2 및 3에서 이용한 세포 배양용 시트의 구분을 나타내는 도면이다.
도 12는, 본 발명의 세포 배양용 시트를 이용하여 얻은 스페로이드의 지점별 등면적직경을 나타내는 도면이다.
도 13은, 본 발명의 세포 배양용 시트를 이용하여 얻은 스페로이드의 지점별 등면적직경을 나타내는 도면이다.
도 14는, 실시예 2 내지 5의 세포 배양용 시트를 이용하여 얻은 스페로이드의 사진을 나타낸 도면이다.
본 발명의 세포 배양용 시트는, 개구부(開口部)의 구경(口徑)이 직경 1000㎛ 이하의 오목부를 복수개 가지고, 또한 상기 오목부의 내측면이 세포 비접착성 표면을 가지면서, 상기 오목부의 저면이 세포 접착성 표면을 갖는다. 여기서, 본 발명의 세포 배양용 시트의 구조를, 오목부에 대하여 수직 방향으로 절단한 시트 단면도의 일예를 이용하여 설명한다. 도 1의 모식도와 같이, 시트 표면(12)에 오목부(11)가 복수개 존재하고, 오목부(11)는 내측면(11a)과 저면(11b)로 구성되어, 오목부(11) 내에서 세포조직체(스페로이드)를 형성시킨다.
본 발명의 세포 배양용 시트는 시트 표면에 오목부를 복수개 갖는다. 예를 들면, 도 1에서는, 시트 표면(12)에 오목부(11)가 복수개 존재한다. 오목부의 개수는, 시트 면적이나 배양세포의 종류 등에 따라 일률적으로 설정할 수 없지만, 해당 기술상식에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 단위면적당(㎠) 최소 개수는 1개일 수 있으나, 10개, 20개, 30개, 50개 등을 예로 들 수 있고, 최대 개수는 1000개, 500개, 300개, 200개, 100개 등을 예로 들 수 있다. 또한 시트 표면의 오목부의 총수는 예를 들면, 10개 이상, 100개 이상, 1000개 이상, 10000개 이상, 50000개 이상 등으로 적절히 설정할 수 있다.
오목부의 개구부의 형상은 원형에 한정되지 않고, 예를 들면, 다각형 또는 타원형일 수도 있다. 개구부의 구경은 직경 1000㎛ 이하이면 되고, 배양세포의 크기에 따라 해당 기술상식에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「구경(口徑)」이라 함은, 대상 개소의 형상에 관계없이, 대상 부분을 포함하여 닿도록 형성되는 원의 직경(최대 길이)을 말하고, 개구부의 구경이라 함은, 예를 들면, 도 1에서, D(11)로 표시되는 길이를 말한다. 개구부의 구경은, 예를 들면, 10 내지 1000㎛, 10 내지 700㎛, 10 내지 600㎛, 10 내지 500㎛의 범위가 있다.
오목부의 저면 형상은 원형에 한정되지 않고, 예를 들면, 다각형 또는 타원형일 수도 있고, 개구부의 형상과 동일하거나 다를 수도 있다. 또한, 저면의 구경(길이)은 개구부의 구경과 동일하거나 다를 수도 있고, 저면의 구경이 개구부의 구경보다 작을 수도 있고, 저면의 구경이 개구부 구경보다 클 수도 있다. 저면의 구경은, 예를 들면, 도 1에서는, DB(11b)로 나타내는 길이이며, 저면의 구경은, 예를 들면, 10 내지 1000㎛, 10 내지 700㎛, 10 내지 600㎛, 10 내지 500㎛, 10 내지 400㎛, 10 내지 300㎛의 범위에 있다. 예를 들면, 저면의 구경이 개구부의 구경보다 작은 경우, 오목부의 형상은 오목부의 저면측을 향하여 테이퍼 형상으로 형성된다.
저면의 구경과 개구부의 구경의 비(저면의 구경/개구부의 구경)은 특별히 한정되지 않지만, 세포의 파종과 회수(回收)의 용이성의 측면에서, 5/1 내지 1/5, 3/1 내지 1/3, 1/1 내지 1/2을 예로 들 수 있다.
또한, 개구부와 인접한 개구부 사이와의 거리(간격)는, 예를 들면, 도 1에서는 D(12)로 표시되는 길이이며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 원하는 세포 배양에 따라, 예를 들면, 800㎛ 이하, 700㎛ 이하, 600㎛ 이하, 500㎛ 이하, 300㎛ 이하, 200㎛ 이하, 100㎛ 이하 등의 범위를 예로 들 수 있고, 유한값을 가지면 된다.
오목부의 깊이는, 배양하는 세포의 크기에 따라 해당 기술상식에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 오목부의 깊이는, 예를 들면, 도 1에서 D(11a)로 나타내는 길이이며, 예를 들면, 10 내지 300㎛나, 10 내지 1000㎛의 범위가 될 수 있다.
개구부의 구경과 오목부의 깊이의 비(개구부의 구경/오목부의 깊이)는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 세포의 파종과 회수의 용이성의 측면에서, 5/1 내지 1/5, 3/1 내지 1/3, 2/1 내지 1/2을 예로 들 수 있다. 상기 범위 내에서, 세포가 오목부로부터 비어져 나오기 어렵고, 또한 세포의 회수 및 탈포 처리 등의 작업이 쉬워진다.
오목부의 저면의 두께는 특별히 한정되지 않고, 당해 기술상식에 따라 적절하게 설정할 수 있다.
오목부는 내측면이 세포 비접착성 표면을 갖고, 저면이 세포 접착성 표면을 갖는다. 이러한 구성을 가짐으로써, 얻어지는 세포 조직체의 균일성을 향상시킬 수 있게 된다. 예를 들면, 도 1에서는, 내측면(11a)이 세포 비접착성 표면을 가지며, 저면(11b)이 세포 접착성 표면을 갖는다.
「세포 비접착성 표면」이란, 예를 들면, 배양에 사용되는 용액 중에서, 세포가 해당 표면상에 침강(沈降)한 경우, 상기 세포가 그 형상을 거의 변화시키지 않으면서, 완전히 접착하지 않거나 또는 일시적으로 약하게 접착하더라도 자연스럽게 이탈하는 표면을 말한다. 상기 표면, 예를 들면 세포 비접착성을 나타내는 물질이 오목부를 구성하는 기재 표면에 물리적 또는 화학적으로 고정되어 형성된 것이면 되고, 기재 자체가 세포 비접착성을 나타내는 물질로 이루어진 것이어도 무방하다. 예를 들면, 세포 비접착성을 나타내는 물질이 표면에 고정되어 있는 경우, 도 2의 모식도에 나타난 것과 같이, 시트 표면(12)과 오목부(11)의 내측면(11a)에, 세포 비접착성을 나타내는 물질(21)이 고정되어 있다.
세포 비접착성을 나타내는 물질로는, 배양에 사용하는 세포가 접착하지 않거나 또는 사용하는 세포의 세포막에 존재하는 단백질이나 당사슬 등의 세포 표면 분자에 대하여 결합하지 않는 물질이라면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있고, 생체적합성을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 또한 소수성을 나타내는 것이거나 친수성을 나타내는 것일 수도 있고, 예를 들면, 초발수성(초소수성)이나 초친수성일 수도 있다. 세포의 비접착성, 스페로이드의 균일성 및 형성성 등의 관점에서, 소수성(특히 초소수성)[예를 들면, 소수성 또는 친수성(특히 소수성)의 세포 접착성 표면 또는 해당 표면을 구성하는 수지(추가적으로 그 접촉각)에 대해 더욱 소수성(특히 초소수성)]을 나타내는 물질이 특히 바람직하지만, 친수성(특히 초친수성)[예를 들면, 친수성 또는 소수성(예를 들면, 소수성)의 세포 접착성 표면 또는 해당 표면을 구성하는 수지(추가적으로는 그 접촉각)에 대해 더욱 친수성(특히 초친수성)]을 나타내는 물질도 바람직하다.
이러한 물질의 일례로는, 폴리에틸렌글리콜 및 그 유도체, MPC(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린), poly-HEMA(폴리하이드록시에틸메타크릴레이트), SPC(세그먼트화 폴리우레탄) 등의 화합물이나, 생체로부터 얻어진 단백질(알부민 등)을, 세포의 종류에 따라 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 그 중에서도 기재로 이용되는 합성 수지와의 접착성의 측면, 또는 세포 배양용 시트의 제조공정을 간소화할 수 있는 측면, 또는 얻어지는 세포조직체의 균일성이 향상되는 측면 등을 고려하여, MPC(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린)이 바람직하다.
또한, 해당물질은 취급성, 원하는 소수성(예를 들면, 초소수성)친수성(예를 들면, 초친수성)의 정도 등에 따라, 적절히 변성한 것을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 친수성 물질에 가교처리 등을 함으로써, 친수성과 물에 대한 저용해도를 양립시킬 수도 있다. 또한 원료가 되는 물질(예를 들면, 소수성 또는 친수성)에 대해 적절하게 소수화처리 내지 친수화처리(예를 들면, 소수성기 내지 친수성기를 도입하는 등)를 함으로써, 원하는 소수성 내지 친수성 재질을 얻을 수도 있다.
세포 비접착성을 나타내는 물질의 고정화는, 이들을 함유하는 용액을 기재표면상에서 건조시키는 방법, 해당 물질을 용융시켜 압착하는 방법, 기재에 도포한 해당 물질을 UV 등의 에너지선으로 경화시키는 방법, 해당 물질이 갖는 작용기와 기재상의 작용기 사이에 화학반응(예를 들면, 카복시기와 아미노기 등의 작용기 사이의 축합반응 등)을 일으켜 공유결합을 형성시키는 방법, 또는 해당 물질이 갖는 티올기와 기재에 미리 형성된 금속(백금, 금 등) 박막을 결합시키는 방법에 의해, 해당 기재 표면상에 고정화할 수 있다. 고정화할 때의 두께는 특별히 제한되지 않고, 0.01 내지 1000㎛를 예로 들 수 있다.
세포 비접착성을 나타내는 표면이 오목부의 내측면을 차지하는 비율은 특별히 제한되지는 않지만, 배양세포의 부착성을 감소시키는 정도인 것이 바람직하다. 바람직하게는 내측면 면적의 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 전부를 차지하는 것이 바람직하다.
세포 비접착성을 나타내는 표면은, 형성되는 세포조직체의 크기를 균일하게 하거나 원형도를 향상시키는 측면에서, 그 표면특성으로서, 예를 들면, 후술하는 물(水)에 대한 정적 접촉각(static contact angle)을 지표로 판단할 수 있다. 예를 들면, 상기한 바와 같은 물질로 형성된 소수성 표면인 경우, 물에 대한 정적 접촉각은 바람직하게는 90°이상, 보다 바람직하게는 93°이상, 더욱 바람직하게는 95°이상이 된다. 또한 150°이하가 될 수도 있고, 바람직하게는 130°이하, 보다 바람직하게는 120°이하이다.
한편, 친수성 표면인 경우, 물에 대한 정적 접촉각은 바람직하게는 65°이하, 보다 바람직하게는 55°이하, 더욱 바람직하게는 50°이하가 된다. 또한 0° 이상이 될 수도 있고, 바람직하게는 5°이상, 보다 바람직하게는 10°이상이다.
일례를 들면, 소수성이 높은 MPC(또는 해당 MPC로 형성된 표면)에서, 물에 대한 정적 접촉각이 예를 들면, 90°이상, 100°이상과 같은 물에 대한 정적 접촉각을 실현할 수 있다.
또한, 이러한 물에 대한 정적 접촉각은 세포 비접착성 표면에서의 값일 수도 있고, 세포 비접착성을 나타내는 물질(또는 세포 비접착성 표면을 구성하는 물질)에서의 값일 수도 있다. 또한 물에 대한 정적 접촉각은, 예를 들면, 아래의 방법 등으로 측정할 수 있다.
세포 접착성 표면이라 함은, 예를 들면, 배양에 사용되는 용액 내에서, 세포가 해당 표면상에 침강한 경우에, 당해 세포가 일정한 접착점을 가지고 접착하는 것이다. 또는 피펫팅 등의 액체 흐름 등에 의해 박리가 가능한 정도로 고정되도록 접착하는 표면을 말한다. 또한, 세포가 접착하여 2차원적으로 유지 또는 증식되도록하는 표면이 아니라, 층상이나 스페로이드 형상 등의 입체적인 또는 3차원의 조직체을 형성할 수 있는 정도로 접착하는 표면을 예로 들 수 있다. 상기 표면은 예를 들면, 세포 접착성을 나타내는 물질이 오목부 저면을 구성하는 기재표면에 물리적 또는 화학적으로 고정 또는 배치되어 형성된 것일 수도 되고, 세포 접착성을 나타내는 물질이 해당 오목부 이외에 배치된 것이거나, 기재 그 자체가 세포 접착성을 나타내는 물질로 이루어진 것일 수도 있다. 예를 들면, 기재 자체가 세포 접착성을 나타내는 물질로 이루어진 경우, 도 3의 모식도와 같이 오목부(11)의 저면(11b)를 포함하는 영역이 세포 접착성을 나타내는 물질(22)로 이루어진 층으로 형성되어 있을 수도 있다.
세포 접착성을 나타내는 물질로는, 배양에 사용하는 세포가 접착되거나 또는 사용하는 세포의 세포막에 존재하는 단백질과 당사슬 등의 세포 표면 분자에 대해 결합할 수 있는 물질이라면 특별히 한정되지 않고 사용할 수 있다. 친수성을 나타내는 것이거나 소수성을 나타내는 것이어도 무방하나, 세포 접착성이나 스페로이드의 형성성 등의 측면에서, 친수성(특히, 초친수성이 아닌 친수성) 또는 소수성(특히, 초소수성이 아닌 소수성)인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 소수성을 나타내는 것이 바람직하다. 또한, 세포 접착성을 나타내는 물질의 접착력 정도는, 세포가 오목부 안으로부터 비어져나가지 않을 정도이면 된다. 이러한 물질의 일례를 들면, 생체에서 얻어진 또는 합성된 물질이 있고, 예를 들면, 단백질(콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등)이나 합성수지(불소수지, 폴리이미드 수지, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리디메틸실록산, 이들의 혼합물 등)가 포함된다. 합성수지를 선택하는 경우, 합성수지 자체의 강도나 내열성으로 취급성이 뛰어난 세포 배양용 시트를 얻을 수 있다. 또한, 생체적합성의 측면에서, 접착성 세포조직체를 얻을 수 있는 측면, 얻어지는 세포조직체의 균일성을 향상하는 측면, 또는 여러 가지 세포와 적절하게 접착하여 배지교환 작업이 용이해지는 측면에서, 폴리이미드 수지와 같은 합성수지를 선택하는 것이 바람직하다. 폴리이미드 수지 등의 비생물에서 유래한 성분을 선택함으로써, 폴리이미드 수지를 포함하는 본 발명의 세포 배양용 시트에 의해 얻어지는 세포조직체(스페로이드)는, 재생의학이나 신약개발 등의 분야에 적용이 용이해진다.
폴리이미드 수지로는 다음의 식 (I)로 표시되는 구성 단위를 포함하는 폴리이미드 수지를 예로 들 수 있다. 또한 스페로이드 형성이 양호하다는 측면에서, 분자내에 불소원자를 가지는 수지가 바람직하고, 불소함유 폴리이미드(불소함유 폴리이미드 수지)가 보다 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 폴리이미드 수지는, 일반적으로는, 산이무수물과 디아민을 각각 1종 이상 중합시켜 얻어지는 폴리아미산(polyamic acid)을 이미드화하여 얻어진다. 폴리이미드 수지는 폴리아미산을 화학구조의 일부에 포함하고 있을 수도 있다. 폴리이미드 수지를 제조하는 방법은 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 일례로 이단계 합성법을 이용할 수 있다. 폴리이미드 수지의 이단계 합성법은 전구체로서 폴리아미산을 합성하고, 폴리아미산을 폴리이미드산으로 변환하는 방법이다. 전구체로서의 폴리아미산은 폴리아미산 유도체일 수도 있다. 폴리아미산 유도체로서는, 예를 들면 폴리아미산염, 폴리아미산 알킬에스테르, 폴리아미산 아미드, 비스메틸리덴피로메틸라이드로부터의 폴리아미산 유도체, 폴리아미산 실릴에스테르, 폴리아미산 이소이미드 등이 있다. 폴리이미드로서는 피로멜리트산 이무수물, 비페닐테트라카르복실산 무수물, 벤조페논테트라카르복실산 무수물 등의 산무수물과, 옥시디아민, 파라페닐렌디아민, 메타페닐렌디아민, 벤조페논디아민 등의 디아민으로 이루어지는 폴리이미드를 예로 들 수 있다. 불소원자를 가지는 수지로서는, 예를 들면, 4,4'-헥사플루오로이소프로필리덴디프탈산 무수물(6FDA)/1,4-비스(아미노페녹시)벤젠(TPEQ) 공중합체, 6FDA/4,4'-옥시디프탈산 무수물(ODPA)/TPEQ 공중합체, 4,4'-(4,4'-이소프로필리덴디페녹시)디프탈산(BPADA)/2,2-비스[4-(4-아미노페녹시)페닐]헥사플루오로프로판(HFBAPP), 6FDA/2,2-비스(4-(4-아미노페녹시)페닐)프로판(BAPP) 공중합체, 6FDA/2,2'-비스(트리플루오로메틸)벤지딘(TFMB) 공중합체, 6FDA/4,4'-디아미노디페닐에테르(ODA) 공중합체, 6FDA/4,4'-비스(4-아미노페녹시)페닐(BAPB) 공중합체 등의 이하의 식(I)로 표시되는 구성단위를 포함하는 불소함유 폴리이미드 수지; 에틸렌-테트라플루오로에틸렌 공중합체 등을 예로 들 수 있다.
[화학식 1]
상기 식 (I) 중, X0는 산소원자, 황원자 또는 2차의 유기 작용기 중 하나를 나타내며;
Y는 2차의 유기 작용기를 나타내고;
Z1, Z2, Z3, Z4, Z5 및 Z6는 서로 독립적으로 수소원자, 불소원자, 염소원자, 브롬원자 또는 요오드원자 중 하나를 나타내며, p는 0 또는 1이다.
또한, 폴리이미드 수지에서, 식 (I)로 표시되는 화학구조는, 수지의 구성단위별로 다르거나 동일할 수도 있다. X0, Y, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5 및 Z6 중 적어도 하나는 불소원자를 1개 이상 포함하는 것이 바람직하다.
상기 식 (I) 중, p=0 인 경우에는 X0가 존재하지 않고(다시 말하면, 좌우의 벤젠고리가 직접 결합되어 있을 수도 있으나), p=1 인 경우는 좌우의 벤젠고리가 X0을 개재하여 결합된다.
X0로 표시되는 2차의 유기 작용기로는, 구체적으로 알킬렌기, 아릴렌기, 아릴렌옥시기, 아릴렌티오기 등을 들 수 있으며, 이들 중에서도 알킬렌기, 아릴렌옥시기, 아릴렌티오기가 바람직하고, 알킬렌기, 아릴렌옥시기가 보다 바람직하며, 이들은 불소원자로 치환되어 있을 수 있다. 상기 알킬렌기의 탄소수는, 예를 들면 1 내지 12이고, 바람직하게는 1 내지 6이다.
X0의 구체예인 불소원자로 치환된 알킬렌기로는, 예를 들면, -C(CF3)2-, -C(CF3)2-C(CF3)2- 등을 예로 들 수 있다. X0의 구체예인 상기 알킬렌기 중에서는 -C(CF3)2-가 바람직하다.
X0의 구체예인 아릴렌기로는, 예를 들면, 하기의 것이 있다.
[화학식 2]
X0의 구체예인 아릴렌옥시기로는, 예를 들면 하기의 것이 있다.
[화학식 3]
X0의 구체예인 아릴렌티오기로는, 예를 들면 하기의 것이 있다.
[화학식 4]
기재상에 스페로이드를 양호하게 형성할 수 있다는 측면에서, X0로 표시되는 2차의 유기 작용기는, 상기 b-2 내지 b-10 및 c-2 내지 c-10로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하고, 상기 b-7 내지 b-9 및 c-7 내지 c-9로 이루어진 군에서 선택되는 것이 보다 바람직하며, b-8로 표시되는 구조인 것이 더욱 바람직하다. 또한 X0로 표시되는 2차의 유기 작용기는 -C(CF3)2- 인 것도 마찬가지로 바람직하다.
X0의 구체예인 상기 아릴렌기, 아릴렌옥시기 및 아릴렌티오기는, 각각 독립적으로, 할로겐원자(예를 들면, 불소원자, 염소원자, 브롬원자, 요오드원자이고, 바람직하게는 불소원자 또는 염소원자이며, 보다 바람직하게는 불소원자이다), 메틸기 및 트리플루오로메틸기로 이루어진 군에서 선택되는 작용기에 의해 치환되어 있을 수 있다. 이러한 치환기는 복수개일 수도 있고, 그 경우에는 치환기의 종류는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 아릴렌기, 아릴렌옥시기 및 아릴렌티오기로 치환하는 바람직한 치환기는 불소원자 및/또는 트리플루오로메틸기이며, 바람직하게는 불소원자이다. 아릴렌기, 아릴렌옥시기 및 아릴렌티오기는 Y에 불소원자가 포함되지 않는 경우, 적어도 1개 이상의 불소원자로 치환되는 것이 바람직하다.
상기 식 (I) 중, Y로 표시되는 2차의 유기 작용기로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 방향족 고리를 갖는 2차의 유기 작용기가 있다. 상세하게는, 1개의 벤젠고리로 이루어진 작용기 또는 2개 이상의 벤젠고리가 탄소원자(즉, 단일결합 또는 알킬렌기), 산소원자, 황원자를 개재하여 또는 직접 결합된 구조를 갖는 작용기를 예로 들 수 있다. 구체적으로는 하기의 작용기를 예로 들 수 있다.
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
Y의 구체예인 상술한 방향족 고리를 갖는 2차의 유기 작용기는, 치환가능하다면, 할로겐 원자(예를 들면, 불소원자, 염소원자, 브롬원자, 요오드원자이고, 바람직하게는 불소원자 또는 염소원자, 더욱 바람직하게는 불소원자다), 메틸기 및 트리플루오로메틸기로 이루어진 군에서 선택되는 작용기에 의해 치환되어 있을 수 있다. 이들 치환기는 복수개일 수도 있고, 그 경우에는 치환기의 종류는 서로 동일하거나 상이할 수도 있다. 방향족 고리를 갖는 2차의 유기 작용기로 치환하는 바람직한 치환기는, 특히 X0에 불소원자를 포함하지 않는 경우는, 불소원자 및/또는 트리플루오로메틸기인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 불소원자이다.
스페로이드 형성성의 관점에서, 상기 식 (I) 중, Y는 d-3, d-9, e-1 내지 e-4, f-6 및 f-7로 이루어진 군에서 선택되는 구조인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 e-1 e-3 또는 e-4의 구조이다.
상기 식 (I) 중, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 각각 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 독립적으로 수소원자, 불소원자, 염소원자, 브롬원자 또는 요오드원자에서 선택되고, X0 및 Y의 적어도 한쪽에 불소원자를 포함하지 않는 경우, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5 및 Z6 중 적어도 하나는 불소원자인 것이 바람직하다.
스페로이드 형성성의 관점에서, 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 상기 식 (I) 중, X0로 표시되는 2차의 유기 작용기가 -C(CF3)2-, 상기 b-2 내지 b-10 및 c-2 내지 c-10으로 이루어진 군에서 선택되면서; 또한, Y가 d-3, d-9, e-1 내지 e-4, f-6 및 f-7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 보다 바람직한 실시예에서는, 상기 식 (I) 중, X0로 표시되는 2차의 유기 작용기가 -C(CF3)2-, b-7 내지 b-9 및 c-7 내지 c-9으로 이루어진 군에서 선택되면서; 또한, Y가 e-1, e-3 및 e-4로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 식 (I)로 표시되는 구성단위로 이루어지는 폴리이미드 수지는, 산이무수물과 디아민의 중합에 의해 얻어지는 폴리아미산을 소성하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한, 상기 「식 (I)로 표시되는 구성단위로 이루어지는 폴리이미드 수지」의 이미드화 비율은 100 %가 아니어도 된다. 즉, 식 (I)로 표시되는 구성단위로 이루어지는 폴리이미드 수지는, 상기 식 (I)로 표시되는 구조단위 만으로 이루어지는 것이어도 되지만, 본 발명의 목적 효과가 손상되지 않는 범위 내에서, 환상이미드 구조가 탈수고리닫힘 반응하지 않고 아미드산인채로 남아있는 구성단위가 일부에 포함되어 있어도 된다.
폴리아미산 합성반응은 유기용매 중에서 수행되는 것이 바람직하다. 폴리아미산 합성반응에 사용되는 유기용매로는, 원료인 산이무수물과 디아민의 반응이 효율적으로 진행될 수 있으면서, 이들 원료에 대해 불활성이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, N-메틸피롤리돈(NMP), N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디메틸포름아미드, 테트라하이드로퓨란, 디메틸설폭사이드, 설포란, 메틸이소부틸케톤, 아세토니트릴, 벤조니트릴, 니트로벤젠, 니트로메탄, 아세톤, 메틸에틸케톤, 이소부틸케톤, 메탄올 등의 극성용매; 톨루엔이나 자일렌 등의 비극성 용매 등이 있다. 그 중에서도 극성용매를 이용하는 것이 바람직하다. 이들 유기용매는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 혼합물로 사용될 수도 있다. 아미드화 반응후의 반응혼합물을 그대로 열 이미드화에 제공할 수도 있다. 상기 폴리아미산의 용액중의 상기 폴리아미산 농도는 특별히 제한되지 않지만, 얻어지는 수지 조성물의 중합반응성과 중합후의 점도, 이후의 제막, 소성에서의 취급용이성의 측면에서, 바람직하게는 5 중량% 이상, 보다 바람직하게는 10 중량% 이상, 바람직하게는 50 중량% 이하, 보다 바람직하게는 40 중량% 이하이다.
상기 폴리아미산을 열 이미드화 또는 화학 이미드화 중 어느 하나에 의해 이미드화하여 불소함유 폴리이미드를 포함하는 수지 조성물을 얻는다. 특정 실시예에서, 상기 폴리아미산을 가열처리에 의해 이미드화(열 이미드화)하여 불소함유 폴리이미드를 포함하는 수지 조성물을 얻는다. 열 이미드화로 얻어진 폴리이미드는, 촉매의 잔존 가능성이 없고, 세포 배양 용도로 더욱 바람직하다.
열 이미드화에 의해 이미드화하는 경우, 예를 들면, 상기 폴리아미산을 공기중에서, 또는 보다 바람직하게는 질소, 헬륨, 아르곤 등의 불활성가스 분위기하에서, 또는 진공상태에서, 바람직하게는 온도 50 내지 400℃, 더욱 바람직하게는 100 내지 380℃, 바람직하게는 0.1 내지 10 시간, 보다 바람직하게는 0.2 내지 5 시간의 조건에서 소성하여 이미드화반응을 수행함으로써 폴리이미드를 포함하는 수지 조성물을 얻을 수 있다.
열 이미드화 반응에 제공하는 상기 폴리아미산은, 적당한 용매중에 용해된 형태인 것이 바람직하다. 용매로는, 폴리아미산을 용해하는 것이면 되고, 폴리아미산 합성반응에 대해 위에서 언급한 용매를 사용할 수도 있다.
화학 이미드화에 의해 이미드화하는 경우는, 적당한 용매중에서 후술하는 탈수고리화 시약의 사용에 의해 폴리아미산을 직접 이미드화할 수 있다.
상기 탈수고리화 시약은, 폴리아미산을 화학적으로 탈수고리화하여 폴리이미드하는 작용을 갖는 것이면 특별히 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 탈수고리화 시약으로는 3차 아민화합물을 단독으로 사용하거나, 3차 아민화합물과 카복실산 무수물을 조합하여 사용하는 것이, 이미드화를 효율적으로 촉진시킬 수 있다는 점에서 바람직하다.
3차 아민화합물로는, 예를 들면, 트리메틸아민, 트리프로필아민, 트리부틸아민, 피리딘, 1,4-디아자바이사이클로[2,2,2]옥탄(DABCO), 1,8-디아자바이사이클로[5,4,0]운데카-7-엔, 1,5-디아자바이사이클로[4,3,0]노나-5-엔, N,N,N',N'-테트라메틸디아미노메탄, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민, N,N,N',N'-테트라메틸-1,3-프로판디아민, N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-페닐렌디아민, N,N,N'N'-테트라메틸-1,6-헥산디아민, N,N,N',N'-테트라에틸메틸렌디아민, N,N,N',N'-테트라에틸에틸렌디아민 등이 있다. 이 중에서도 특히, 피리딘, DABCO, N,N,N',N'-테트라메틸디아미노메탄이 바람직하고, DABCO가 더욱 바람직하다. 3차 아민은 1종만이어도 되고, 2종 이상이어도 된다.
카복실산무수물로는, 예를 들면, 무수아세트산, 무수트리플루오로아세트산, 무수프로피온산, 무수부티르산, 무수이소부티르산, 무수숙신산, 무수말레산 등이 있다. 이 중에서도 특히, 무수아세트산, 무수트리플루오로아세트산이 바람직하고, 무수아세트산이 보다 바람직하다. 카복실산무수물은 1종만이어도 되고, 2종 이상이어도 된다.
화학 이미드화에서 폴리아미산을 용해하는 용매로는, 용해성이 우수한 극성 용매가 바람직하다. 예를 들면, 테트라하이드로퓨란, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디메틸설폭사이드 등이 있고, 이 중에서도 특히, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디메틸포름아미드 및 N-메틸피롤리돈으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 균일반응을 한다는 측면에서 바람직하다. 아미드화 반응의 용매로 이러한 용매를 이용한 경우, 아미드화 반응후의 반응 혼합물로부터 폴리아미산을 분리하지 않고 그대로 화학 이미드화에 사용할 수 있다.
폴리이미드 수지의 중량평균 분자량은, 예를 들면 5,000 내지 2,000,000, 바람직하게는 8,000 내지 1,000,000이며, 더욱 바람직하게는 20,000 내지 500,000이다. 또한, 본 명세서에서, 수지의 중량평균 분자량은 다음의 방법에 의해 측정된 값이다. 상기 범위의 중량평균 분자량에서, 폴리이미드 수지의 합성 및 취급, 필름화, 스페로이드 형성성(形成性)이 더욱 양호하게 된다.
(중량평균 분자량의 측정)
- 장치 : 도소(東ソ) 주식회사 HCL-8220GPC
- 컬럼 : TSKgel Super AWM-H
- 용리액(LiBr · H2O, 인산함유 NMP) : 0.01mol/L
- 측정방법 : 0.5 중량%의 용액을 용리액(eluant)으로 제작하고, 폴리스티렌으로 작성한 검량선(calibration curve)을 기초로 분자량을 산출한다.
세포 접착성 물질 또는 세포 접착성 표면[소수성(특히, 초소수성이 아닌 소수성)의 세포 접착성 물질 또는 세포 접착성 표면]은, 바람직하게는 물에 대한 정적 접촉각이 70°이상일 수 있고, 전락각(falling angle)이 15°이상일 수도 있으며, 또한 물에 대한 정적 접촉각이 70°이상이면서 전락각이 15°이상일 수도 있다.
세포 접착성 물질 또는 세포 접착성 표면이 이러한 조건을 충족함으로써, 스페로이드 형성이 더욱 촉진된다.
스페로이드의 접착성 및 스페로이드 형성성의 관점에서, 물에 대한 정적 접촉각은, 더욱 바람직하게는 75°이상(예를 들면, 75°초과)이며, 더욱 바람직하게는 77°이상, 더욱 바람직하게는 79°이상, 더더욱 바람직하게는 80°이상(예를 들면, 80°초과)이며, 물에 대한 정적 접촉각의 상한은, 예를 들면 150°미만이고, 바람직하게는 120°이하(예를 들면, 120°미만)이며, 보다 바람직하게는 110°이하이며, 더욱 바람직하게는 100°이하 (예를 들면, 99°이하, 98°이하, 97°이하, 95°이하 등)이다.
한편, 세포 접착성 물질 또는 세포 접착성 표면[친수성 (특히, 초친수성이 아닌 친수성)의 세포 접착성 물질 또는 세포 접착성 표면]은 물에 대한 정적 접촉각이 65°이하, 보다 바람직하게는 55°이하, 더욱 바람직하게는 50°이하일 수 있다. 또한, 하한은 0°이상일 수 있고, 바람직하게는 5°이상, 보다 바람직하게는 10°이상일 수도 있다.
스페로이드 형성성의 관점에서 전락각은 18°이상, 19°이상, 20°이상, 22°이상, 24°이상, 26°이상, 28°이상, 30°이상의 순으로 높을수록 바람직하다. 전락각의 상한값은 예를 들면 80°미만이고, 바람직하게는 70°이하(예를 들면, 70° 미만)이며, 보다 바람직하게는 60°이하(예를 들면, 60°미만)이며, 더욱 바람직하게는 50°이하(예를 들면, 50°미만)이다. 또한, 상기 물에 대한 정적 접촉각과 전락각은 다음의 방법에 의해 측정된 값일 수도 있다.
(물에 대한 정적 접촉각(static contact angle)의 측정 방법)
- 장치 : 자동 접촉각계(교와(協和)계면과학 제품 : DM-500)
- 측정방법 : 표면(세포 비접착성 표면 또는 세포 접착성 표면) 또는 필름(세포 비접착성 또는 세포 접착성 물질로 형성한 필름) 위에 물 2μL을 적하한 직후의 액적(液滴)의 부착 각도를 측정한다(측정온도 : 25℃).
(전락각(falling angle)의 측정 방법)
- 장치 : 자동 접촉각계(교와계면과학 제품 : DM-500)
- 측정방법 : 표면(세포 비접착성 표면 또는 세포 접착성 표면) 또는 필름 (세포 비접착성 또는 세포 접착성 물질로 형성한 필름) 위에 물 25μL를 적하한 후, 기재를 지속적으로 기울이면서, 흘러떨어질 때의 각도를 전락각으로 한다(측정온도 : 25℃).
또한, 얻어지는 스페로이드의 크기 균일성나 원형도를 향상시키는 점에서는, 세포 접착성 표면과 세포 비접착성 표면에 대한 접착정도의 균형을 잡는 것도 중요하다. 따라서, 가령 세포 비접착성 표면이 접착성을 나타내는 것이라도, 세포 접착성 표면보다 낮은 접착력이면 무방하다. 예를 들면, 상기 물에 대한 정적 접촉각을 지표로 한 경우, 세포 접착성 표면(또는 세포 접착성 물질)과 세포 비접착성 표면(또는 세포 비접착성 물질)에서의 물에 대한 정적 접촉각의 차이(또는 그 절대값)가 3°이상(예를 들면, 5°이상) 되는 것이 바람직하고, 10°이상(예를 들면, 12° 이상) 되는 것이 보다 바람직하며, 15°이상인 것이 더욱 바람직하다. 또한 상한은 세포 비접착성 물질(표면) 및 세포 접착성물질(표면)의 소수성친수성의 조합 등에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 100°, 90°, 80°, 70°, 60°, 50°, 40°, 30°등일 수도 있다.
세포 접착성 표면을 구성하는 수지는 가소제, 산화 방지제 등의 첨가제 성분을 더 포함할 수도 있다.
세포 접착성을 나타내는 표면이 오목부의 저면을 차지하는 비율은 특별히 한정되지 않지만, 오목부의 저면 중 90% 이상, 95% 이상, 99%이상, 실질적으로 저면 전체를 차지하는 것이 바람직하다.
오목부는 상기의 구조를 가지게 되는데, 본 발명의 세포 배양용 시트에서, 오목부의 변두리부이기도 한 시트 표면은 세포 배양시트의 제조를 단순화할 수 있는 측면에서 세포 비접착성 표면을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 구성을 가지게 됨으로써, 변두리부에 파종된 세포도 오목부내에서 스페로이드를 형성하기 쉬워지게 된다. 예를 들면, 도 1에서는, 시트 표면 12로 표시된다. 시트 표면의 세포 비접착성 표면은 오목부의 내측면과 동일한 세포 비접착성 표면일 수도 있고, 상이한 세포 비접착성 표면일 수도 있다. 동일한 세포 비접착성 표면인 경우, 시트 표면과 오목부의 내측면은 연속적인 표면을 가진다. 세포 비접착성을 나타내는 표면이, 오목부의 변두리부이기도 한 시트 표면을 차지하는 비율은, 특별히 한정되지 않지만, 오목부의 변두리부 중 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 실질적으로 변두리부 전체를 차지하는 것이 바람직하다. 세포 비접착성을 나타내는 표면이 오목부의 변두리부와 오목부의 내측면과의 합계를 차지하는 비율은 특별히 한정되지는 않지만, 오목부의 변두리부와 오목부의 내측면과과 합계 중 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 실질적으로 변두리부와 내측면 전체를 차지하는 것이 바람직하다.
참고적으로, 도 4 및 도 5에, 본 발명의 세포 배양용 시트에서 오목부에서의 세포 배양 상태를 모식적으로 나타낸다. 본 발명의 세포 배양용 시트는 상기의 오목부 구조를 복수개 갖고 있지만, 도 4 및 도 5보다, 오목부의 저면을 포함하는 층과 오목부의 내측면을 포함 층을 포함하는 층상 구조물이라고도 할 수 있다. 여기서, 오목부의 내측면을 포함하는 층은, 층 자체가 관통공을 갖는 층을 구성하고있다. 따라서, 본 발명의 세포 배양용 시트의 일형태로서, 관통공을 갖는 세포 비접착성 표면을 갖는 층과 세포 접착성 표면을 갖는 층과의 적층물인 형태를 예로 들 수 있다.
세포 비접착성 표면을 갖는 층은, 세포 비접착성을 나타내는 물질을 층상의 기재에 고정화한 것이거나, 세포 비접착성을 나타내는 물질로 이루어진 층이어도 되지만, 관통공을 형성하는 관점, 또는 세포 배양용 시트의 제조를 단순화하는 관점에서, 세포 비접착성을 나타내는 물질을 층상의 기재에 고정화한 것이 바람직하다. 이러한 형태를 취함으로써, 세포 배양 시트의 제조가 보다 간편해지고, 또한 예를 들면 기재에 관통공 또는 오목부를 형성하고나서 세포 비접착성을 나타내는 물질을 고정하는 것 등에 의해, 세포 배양 시트의 오목부 형성에 수반되어 세포 비접착성 표면이 손상을 받는 것을 없애는 것도 가능하게 되므로, 세포 배양 시트의 세포 배양 특성을 향상하는 관점에서도 바람직하다.
층상의 기재로는 당해 기술 분야에서 공지된 것이라면 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에스테르(폴리에틸렌테레프탈레이트 등), 폴리우레탄, 폴리설폰, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐, 폴리사이클로올레핀, 폴리에테르케톤, 폴리에테르에테르케톤, 폴리이미드, 실리콘 등의 합성 수지, EPDM(Ethylene Propylene Diene Monomer) 등의 합성고무나 천연고무, 유리, 세라믹, 스테인리스 등의 금속재료 등으로 이루어지는 판상체가 있다. 투명기재인 것도 바람직한 형태의 하나이다.
층상의 기재에 세포 비접착성을 나타내는 물질을 고정화하는 것은, 상기한 오목부의 내측면에 세포 비접착성을 나타내는 물질을 고정화하는 방법과 동일하게 수행할 수 있다. 또한, 작업성의 관점에서, 후술하는 관통공을 형성한 후 고정화하는 것이 바람직하다.
세포 비접착성 표면을 갖는 층은, 바람직하게는 본 발명의 세포 배양용 시트의 시트 표면과 관통공을 포함한다. 상기 관통공은, 바람직하게는 그 벽이 상술한 오목부의 내측면에 해당하는 것으로, 개구부와 그 반대의 단부의 구멍 크기나 형상은, 상기 오목부와 동일하게 설정할 수 있다. 또한, 관통공의 깊이는 세포 비접착성 표면을 갖는 층의 두께에 해당하나, 상기한 오목부의 깊이에도 해당하여, 오목부와 동일하게 설정할 수 있다. 또한 세포 비접착성을 나타내는 물질을 층상의 기재에 고정화하는 경우는, 세포 비접착성을 나타내는 물질의 층으로서, 예를 들면, 1nm 이상인 것이 바람직하고, 10nm 이상인 것이 보다 바람직하며, 세포 비접착성을 나타내는 물질의 층과 기재를 포함한 층 전체의 두께가, 상기한 세포 비접착성 표면을 갖는 층의 두께의 범위내에 있다면 적절하게 설정할 수 있다.
관통공의 형성은, 상기 크기의 관통공이 형성될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고 실시할 수 있다. 예를 들면, 천공가공(드릴 등), 광미세가공(레이저 (예를 들면, CO2 레이저, 엑시머 레이저, 반도체 레이저, YAG 레이저) 등), 에칭가공, 엠보싱가공 등으로 형성할 수 있다. 상기 가공에 있어서, 관통공의 형상이 테이퍼 형상이 되는 가공일 수도 있고, 그 때 단부의 주변이 변형되어, 예를 들면, 도 5와 같이, 개구부의 변두리부와 개구부와 인접한 개구부의 중간 영역에 위치하는 부분의 층 두께가 다르게 되는 등의 구조를 형성할 수도 있다.
세포 접착성 표면을 갖는 층은 세포 접착성을 나타내는 물질을 층상의 기재에 고정화 한 것이거나, 세포 접착성을 나타내는 물질로 이루어진 층일 수도 있다.
세포 접착성 표면을 갖는 층의 두께는 예를 들면, 1nm 이상 4mm 이하이며, 1㎛ 이상 1mm 이하인 것이 바람직하고, 상기한 오목부의 저면의 두께와 동일할 수도 있다.
본 발명의 세포 배양용 시트로서, 상기 세포 접착성 표면을 갖는 층과 세포 비접착성 표면을 갖는 층의 사이에, 추가로 접착층(점착층)을 포함하는 실시형태도 포함된다. 예를 들면, 도 6에 그 일례를 나타내며, 세포 접착성을 나타내는 물질(22)로 이루어진 층과 세포 비접착성을 나타내는 물질(21)이 고정된된 부분의 사이에, 접착층(23)을 포함하는 실시형태가 보여진다.
접착층으로는 해당 기술분야에서 공지된 것이면 사용할 수 있다. 예를 들면, 실리콘계 수지, 합성고무, 천연고무 등이 있으며, 바람직하게는 저용출성 접착층을 이용할 수 있다. 바람직하게는 시판중인 양면테이프 등을 이용할 수도 있다.
접착층의 두께는 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위내라면 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 0.5 내지 100㎛로 할 수 있다.
본 발명의 세포 배양용 시트는 상기 이외의 층이 적층되어있어도 되고, 공동(空洞)를 갖는 층이 적층되어있을 수도 있다.
본 발명의 세포 배양용 시트는, 두께는 특별히 한정되지 않지만, 취급성의 측면에서 10 내지 5000㎛가 바람직하고, 100 내지 2000㎛가 더욱 바람직하다. 또한 시트의 면적도 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 0.01 내지 10000㎠, 바람직하게는 0.03 내지 5000㎠로 할 수 있다.
본 발명의 세포 배양용 시트는, 공지의 세포 배양 장치에 그대로 설치하여 사용할 수 있다. 그 때, 대상장치의 크기에 맞게 적절하게 사이징 가공할 수도 있다.
본 발명의 세포 배양용 시트에 적용이 가능한 세포는 제한되지 않는다. 예를 들면, 서로 결합을 형성하여 세포집합체를 형성할 수 있는 것이면 본 발명의 세포 배양용 시트를 이용하여, 오목부 저면의 세포 접착성 표면에 세포가 접착하여 배양함으로써, 배지교환도 용이하고, 배지교환시의 세포 손실도 줄일 수 있게 되어, 간편하게 스페로이드를 제조할 수 있다. 유래하는 동물, 장기, 조직의 종류를 불문하고, 목적에 따라 임의 종류의 세포를 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
구체적으로 예를 들면, 인간 또는 인간 이외의 동물(원숭이, 돼지, 개, 쥐, 마우스 등)의 모든 장기 또는 조직(뇌, 간, 췌장, 비장, 심장, 폐, 창자, 연골, 뼈, 지방 신장, 신경, 피부, 골수, 배 등)에서 유래하는 초대세포, 주화세포(株化細胞, established cell line), 또는 이들에 유전자 조작 등을 실시한 세포를 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 예를 들면, ES 세포, iPS 세포, 신경 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 조직 줄기세포(체세포 줄기세포), 조혈 줄기세포, 암 줄기세포, 기타 미분화된 줄기세포 또는 전구세포를 사용할 수 있다. 또한 예를 들면, 간계세포나 췌장계세포 등의 소화기계 장기 유래의 세포, 신장계 세포, 신경계 세포, 심근세포 등의 순환기계 장기 유래의 세포, 지방 세포, 피부진피 등의 결합조직 유래의 섬유아세포, 피부표피 등의 상피계조직 유래의 상피 세포, 골계 세포, 연골계 세포, 망막 등의 눈조직 유래의 세포, 혈관계 세포, 혈구계 세포, 생식계 세포 등의 분화된 세포를 이용할 수도 있다. 또한 종양화 세포를 이용할 수도 있다. 이러한 세포로는 1 종류의 세포를 단독으로 사용할 수 있고, 또는 2 종류 이상의 세포를 임의의 비율로 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 세포 배양용 시트는 상기한 구성을 갖는 것이라면, 그 제조방법은 특별히 한정되지 않지만, 제조효율의 관점에서 직경 1000㎛ 이하의 관통공을 복수로 구비하는 세포 비접착성 표면을 갖는 층 및 세포 접착성 표면을 갖는 층이 차례로 적층되는 것을 특징으로 하는 제조방법이 바람직하다.
세포 비접착성 표면을 갖는 층, 세포 접착성 표면을 갖는 층의 각 층의 제조는, 본 발명의 세포 배양용 시트에 관한 페이지를 참조할 수 있다. 세포 비접착성 표면을 갖는 층의 관통공의 형성도 마찬가지이다.
적층방법은 미리 제조한 각 층을 순차적으로 적층하는 것일 수도 있고, 미리 제조한 층상에 별도, 층을 형성하는 방법일 수도 있으며, 이들을 조합한 것일 수도 있다. 구체적으로, 예를 들면, 표면을 박리처리한 이형시트(예를 들면, 폴리에틸렌 기재 등의 유기고분자 필름, 세라믹, 금속 등) 위에, 세포 접착성을 나타내는 물질을 캐스팅, 스핀코팅, 롤 코팅 등의 방법으로 적절한 두께로 도공하여 가열함으로써 세포 접착성 표면을 갖는 층을 시트 형태로 성형할 수 있다. 한편, 세포 비접착성 표면을 갖는 층의 기재에 관통공을 형성한 후, 세포 비접착성을 나타내는 물질을 표면에 코팅하여 세포 비접착성 표면을 갖는 층을 미리 제조할 수 있다. 그리고, 앞에서 성형한 세포 접착성 표면을 갖는 층의 박리시트를 박리한 후에 별도로 조제한 세포 비접착성 표면을 갖는 층을 적층하여 제조할 수 있다. 또한 세포 비접착성 표면을 갖는 층과 세포 접착성 표면을 갖는 층의 적층에 있어서는, 상기 접착층(점착층)을 이용하여 적층할 수도 있고, 또는 용착(고주파 용착, 초음파 용착 등), 압착(열압착 등)에 의해 적층할 수도 있다.
본 발명의 세포 배양용 시트는 한쪽 표면에 세포를 포함하는 배지를 얹어 세포 배양을 실시하거나, 상기 시트를 배양 페트리디쉬, 플라스크, 배양백 등의 각종 세포 배양용기에 수용하여 고정하고, 상기 용기에 세포를 포함하는 배지를 첨가하여 세포 배양을 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 세포 배양용 시트를 포함하는 세포 배양용 기구를 제공한다.
본 발명의 세포 배양용 기구는, 그 자체가 싱글 또는 멀티웰 플레이트 등의 배양용 플레이트, 배양 페트리디쉬, 플라스크, 배양백 등의 각종 세포 배양 용기의 형태일 수도 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 세포 배양용 시트 또는 세포 배양용 기구에서 배양하는 것을 특징으로 하는 스페로이드의 배양방법을 제공한다.
세포를 배양할 때에 사용하는 배지나 조건은, 사용하는 세포에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 배양용 시트 또는 세포 배양용 기구를 사용할 때, 필요에 따라 미리 탈포처리를 하는 것이 바람직하다. 탈포처리로는 특별히 제한되지 않고, 분무, 피펫팅, 진탕, 가온냉각 등의 온도변화, 원심처리, 진공탈기, 초음파 처리 등의 일반적인 처리를 수행할 수 있으며, 바람직한 것은 분무, 피펫팅, 온도변화이다.
본 발명의 세포 배양용 시트를 이용함으로써, 구획으로 나뉜 형태(복수의 오목부에 의해 형성되는 형상)에 따라 파종세포가 정렬되고, 또한 기재가 보유한 적당한 부착성이 발휘되므로, 얻어지는 스페로이드의 균일성이 향상된다. 또한, 상기 적당한 부착성으로 인해, 배양작업시 취급이 우수하고, 세포 배양용 시트 또는 세포 배양용 기구를 흔들거나 또는 가볍게 피펫팅하는 것만으로 스페로이드를 회수할 수 있다. 본 발명의 세포 배양용 시트는, 1000㎛ 이하의 미세한 오목부임에도 불구하고, 각각의 오목부에서 세포 접착성 저면과 그것을 둘러싼 세포 비접착성 측벽면에 의해 특수한 접착환경이 형성됨으로써, 얻어지는 스페로이드의 크기 균일성 및 원형도가 향상될뿐만 아니라, 수율도 향상되는 효과가 발휘되는 것으로 추정된다. 그러나, 본 발명은 이러한 추측에 구속되는 것은 아니다.
얻어지는 스페로이드의 직경은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 10 내지 1000㎛, 바람직하게는 10 내지 800㎛이다. 여기서, 스페로이드의 직경은, 통상의 방법(예를 들면, 이미지분석 소프트웨어, 입도분포계)에 의해 측정할 수 있으며, 예를 들면, 유체직경, 등면적직경(projected area diameter)으로 표시될 수 있다. 얻어지는 스페로이드는 원형도가 예를 들면 0.5 내지 1.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.0이다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하의 실시예에서, 실온은 20℃ 내지 30℃를 의미한다.
실시예 1 : 세포 배양용 시트
<세포 접착성 표면을 갖는 층의 제조(불소함유 폴리이미드 필름의 제조)>
100mL 용량의 3구 플라스크에 1,4-비스(아미노페녹시)벤젠 2.976g(10.2mM), 4,4'-헥사플루오로이소프로필리덴디프탈산 무수물 4.524g(10.2mM), N-메틸피롤리돈 42.5g을 투입하였다. 질소 분위기하의 실온에서 교반후, 5일 동안 보관유지하여, 불소함유 폴리아미산 수지 조성물(고형분 농도 15.0 중량%, 6FDA/TPEQ 폴리아미산)을 얻었다. 상기 폴리아미산의 중량평균 분자량은 12만이고, 점도는 6Pa·s이었다. 또한, 폴리아미산의 중량평균 분자량과 소성후의 불소함유 폴리이미드의 중량평균 분자량은 실질적으로 동일하다.
상기와 같이 얻어진 불소함유 폴리아미산 수지 조성물을, 소성후의 불소함유 폴리이미드 필름의 두께가 40㎛가 되도록 다이코터를 이용하여 유리기재상에 도포하여 도막을 형성하였다. 이어서, 360℃에서 1시간, 질소 분위기하에서 도막의 소성을 실시했다. 그 후, 소성물을 유리기재로부터 박리하여 불소함유 폴리이미드 필름을 얻었다. 이 불소함유 폴리이미드 필름의 물에 대한 정적 접촉각은 83.0°, 전락각은 24.0°이었다.
상기한 물성의 측정방법은 다음과 같다.
(중량평균 분자량의 측정)
- 장치 : 도소(東ソ) 주식회사 HCL-8220GPC
- 컬럼 : TSKgel Super AWM-H
- 용리액(LiBr·H₂O, 인산함유 NMP) : 0.01mol/L
- 측정방법 : 0.5 중량%의 용액을 용리액으로 제작하고, 폴리스티렌으로 작성한 검량선을 기초로 분자량을 산출한다.
(점도 측정)
- 장비 : 애즈원(AS ONE) 제품 점도계 VISCOMETER TV-22
- 설정 : VI RANGE : H ROTOR No.6 SPEED : 10rpm
- 점도계 교정용 표준액 : 일본그리스 (주) JS 14000
- 측정방법 : 점도계 교정용 표준액으로 교정후, 바니시(varnish) 0.3g을 이용하여 측정한다(측정온도 : 23℃).
(물에 대한 정적 접촉각 측정)
- 장치 : 자동 접촉각계(교와계면과학 제품 : DM-500)
- 측정방법 : 필름에 물 2μL을 적하한 직후에 액적의 부착각도를 측정한다(측정온도 : 25℃).
(전락각의 측정)
- 장치 : 자동 접촉각계(교와계면과학 제품 : DM-500)
- 측정방법 : 필름에 물 25μL를 적하한 후, 기재를 지속적으로 기울여서, 흘러떨어질 때의 각도를 전락각으로 한다(측정온도 : 25℃).
<세포 비접착성 표면을 갖는 층의 제조>
양면테이프(두께 25㎛)의 한쪽면 박리테이프를 박리한 후 투명한 PET 필름(두께 250㎛)에 붙인 것에 대해, CO2 레이저를 사용하여 직경 300㎛, 피치 500㎛로 엇갈림배열의 관통공을 형성하였다(형성된 관통공 : 400개/㎠, 24000개/시트, 레이저 입사측 구멍 직경 500㎛, 레이저 방출측 구멍 직경 300㎛). 그 후, PET 필름측의 표면에 스핀코터(미카사 제품 : MS-A150)을 이용하여 MPC 폴리머용액(0.5% 에탄올 용액, 소수성 MPC 폴리머)을 두께가 0.05㎛가 되도록 코팅(스핀조건 : 1000rpm, 10초간)하고, 50℃의 건조기내에서 2시간 건조처리하여, 세포 비접착성 표면을 갖는 층[PET 필름의 코팅층(MPC 폴리머 코팅층)쪽의 물에 대한 정적 접촉각 107. 5°를 얻었다.
<세포 배양용 시트, 배양용기의 제조>
이어서, 세포 비접착성 표면을 갖는 층의 양면 테이프의 또 다른쪽의 박리테이프를 제거한 쪽의 면에, 앞에서 제작한 세포 접착성 표면을 갖는 층을 붙여서, 세포 배양용 시트를 제조하였다(시트 두께 : 315㎛). 얻어진 세포 배양 시트를 배양플레이트 내에 설치하고, 세포 배양에 사용하는 용기를 완성했다.
시험예 1
세포는 인간 지방유래 줄기세포(Human adipose derived stem cell : AdSC)를 사용하였다. AdSC는 시판제품(론자(Lonza)사, PT-5006)을 구입하여 사용하였다.
<세포의 확대배양>
동결세포를 37℃ 항온수조에서 용해시켜, 5% FBS, 1% 항생제를 포함한 KBM ADSC-2 배지(기초배지, 코진바이오 제품) 9mL에 가하였다. 이어서, 500×g에서 5분간 원심처리를 실시한 후, 상청(上)을 제거하고 10mL의 기초배지에 분산시켰다. 800mL 세포 배양용 플라스크(스미토모 베이클라이트 제품)에 세포현탁액을 가한 후의 총량이 30mL가 되도록 기초배지를 미리 가하여 두고, 거기에 세포 현탁액을 1.0×106세포/플라스크가 되도록 첨가하여, 37℃의 5%(v/v) CO2 인큐베이터내에서 배양(확대배양)을 실시했다.
<탈포처리>
별도로, 실시예 1의 배양용기의 탈포처리를 실시했다. 구체적으로, 용기에 25mL 정도의 PBS를 가하고 피펫팅 작업을 2번 반복하여 탈포를 수행했다. 이어서, 1% 항생물질을 포함한 KBM ADSC-2 배지를 12mL 가하고, 37℃의 5% (v/v) CO2 인큐베이터내에서 하룻밤 정치하였다.
<스페로이드의 배양>
배양용 플라스크에서 배지를 제거하고, 세포박리액 accutase(프로모셀 제품)을 5mL 첨가한 후, 37℃의 5% (v/v) CO2 인큐베이터내에서 5분 정도 유지하여 세포를 박리했다. 이어서, 박리액을 회수하고, PBS를 이용하여 총량이 25mL가 되도록하여 튜브로 옮겼다. 500×g에서 5분간 원심처리하고, 10mL의 1% 항생물질을 포함한 KBM ADSC-2 배지에서 현탁시켜, 세포수를 카운팅하였다. 그 후, 1.0 × 106세포/mL의 농도가 되도록 제조하였다.
37℃의 5%(v/v) CO2 인큐베이터에서 하룻밤 정치하여 탈포처리한 배양용기의 배지를 제거하고, 500세포/구멍 또는 200세포/구멍이 되도록 세포를 파종했다. 안전캐비닛에서 15분 정치한 후, 37℃의 5%(v/v) CO2 인큐베이터에 넣고 4시간 정치했다. 이어서, 추가로 1% 항생물질을 포함한 KBM ADSC-2 배지를 첨가하고, 다시 37℃의 5%(v/v) CO2 인큐베이터에 넣어 배양하였다(배양 0일째). 배양은 14일째까지 실시했다. 3일에 1번, 1% 항생물질을 포함한 KBM ADSC-2 배지로 전량 배지교환을 실시했다. 또한, 배지교환시 등에 배양 용기에 진동을 가하더라도 스페로이드가 비어나오지 않았고, 스페로이드의 회수는 피펫팅에 의해 실시하였다.
<스페로이드의 형태 평가>
배양 3일째, 6일째, 14일째에 스페로이드를 촬영하고(도 7), 이미지분석 소프트웨어인 WinROOF(미타니상사(三谷商事) 제품)로 스페로이드의 등면적직경, 유체직경, 원형도를 분석하였다(도 8 내지 10).
결과, 얻어진 스페로이드 크기의 균일성(500세포/구멍 : 등면적직경 151 내지 179㎛, SD 14 내지 16㎛, 200 세포/구멍 : 등면적직경 116 내지 130㎛, SD 14 내지 15㎛)이 높고, 원형도가 높았다(500세포/구멍 : 원형도 0.841 내지 0.873, SD 0.067 내지 0.083, 200세포/구멍 : 원형도 0.849 내지 0.882, SD 0.080 내지 0.086). 또한, 파종 세포수를 변화시킴으로써, 크기가 다른 스페로이드를 얻을 수 있음도 알아냈다. 따라서, 본 발명의 세포 배양용 시트를 이용함으로써, 균일하면서도 대량의 스페로이드를 안정적이고 쉽게 얻을 수 있었다.
시험예 2
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하고 탈포처리한 세포 배양 시트를 이용하여, 인간 골수유래 중간엽줄기세포주(UE7T-13 세포; JCRB1154)의 배양을 실시하였다. 배지는 DMEM + 10% FBS를 사용했다.
구체적으로는, 세포 배양 시트에 4.8Х106세포(1 well 당 200 세포)를 배지량이 22mL가되도록 파종하고, 37℃의 5%(v/v) CO2 인큐베이터에서 3일간 배양하였다. 배양중에는 배지를 교환하지 않았다. 배양 3일째, 4일째에 스페로이드의 형태를 평가하였다.
평가는 세포 배양 시트를 A 지점에서 I 지점까지 9개로 구분하여(도 11), 각각에 대해 스페로이드를 촬영하고, 이미지분석 소프트웨어 WinROOF(미타니 상사 제품)로 스페로이드 등면적직경을 분석하였다(도 12는 배양 3일째의 분석결과를 나타낸다).
결과, 얻어진 스페로이드는 크기의 균일성이 높고(배양 3일째 : 등면적직경 96㎛, SD 8㎛ 배양 4일째 : 등면적직경 97㎛, SD 9㎛), 또한 구분에 따라 변동하는 것이 아님을 알 수 있었다.
시험예 3
파종 세포수가 세포 배양 시트에 1.2×107세포(1 well 당 500 세포)가 되는 것 외에는, 시험예 2와 동일하게 세포를 배양하여, 배양 1일째에 스페로이드 등면적직경을 평가하였다(도 13).
결과, 얻어진 스페로이드는 크기의 균일성이 높고(배양 1일째 : 등면적직경 151㎛, SD 11㎛), 또한, 구분에 따라 변동하는 것이 아님을 알 수 있었다.
실시예 2 내지 5
세포 접착성 표면을 갖는 층의 제조(불소함유 폴리이미드 필름의 제조)를 아래와 같이 실시하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 세포 배양용기를 제조하였다. 또한, 각 실시예에서의 폴리아미산의 중량평균 분자량과, 소성후의 불소함유 폴리이미드의 중량평균 분자량은 실질적으로 동일하다.
실시예 2 : 6FDA/TFMB
500mL 용량의 3구 플라스크에 4,4'-헥사플루오로이소프로필리덴디프탈산 무수물 21.792g (0.049 몰), N-메틸피롤리돈 148.75g을 투입하여 용해시켰다. 여기에 2,2'-비스(트리플루오로메틸)벤지딘 15.708g(0.049몰), N-메틸피롤리돈 63.75g을 투입하여 용해시킨 것을 적하투입하고 질소 분위기하의 실온에서 교반후, 5일 동안 보관함으로써, 불소함유 폴리아미산 수지 조성물(고형분 농도 15 중량%, 6FDA/TFMB 폴리아미산)을 얻었다. 상기 폴리아미산의 중량평균 분자량은 18.9만, 점도는 9.1Pa·s이었다. 얻어진 불소함유 폴리아미산 수지 조성물을 사용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 불소함유 폴리이미드 필름을 얻었다. 이 불소함유 폴리이미드 필름의 물에 대한 정적 접촉각은 82.1°, 전락각은 19.9°였다.
실시예 3 : 6FDA/ODA
500mL 용량의 3구 플라스크에 4,4'-헥사플루오로이소프로필리덴디프탈산 무수물 26.89g(0.058 몰), N-메틸피롤리돈 154.7g을 투입하여 용해시켰다. 여기에 4,4'-디아미노디페닐에테르 12.11g(0.058 몰), N-메틸피롤리돈 66.3g을 투입하여 용해시킨 것을 적하투입하고, 질소 분위기하의 실온에서 교반후, 5일 동안 보관함으로써, 불소함유 폴리아미산 수지 조성물(고형분 농도 15 중량%, 6FDA/ODA 폴리아미산)을 얻었다. 상기 폴리아미산의 중량평균 분자량은 15.3만, 점도는 7.7Pa·s이었다. 얻어진 불소함유 폴리아미산 수지 조성물을 사용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 불소함유 폴리이미드 필름을 얻었다. 이 불소함유 폴리이미드 필름의 물에 대한 정적 접촉각은 79.5°, 전락각은 31.0°였다.
실시예 4 : 6FDA/BAPP
500mL 용량의 3구 플라스크에 4,4'-헥사플루오로이소프로필리덴디프탈산 무수물 19.49g(0.044 몰), N-메틸피롤리돈 148.75g을 투입하여 용해시켰다. 여기에 2,2-비스(4-(4-아미노페녹시)페닐)프로판 18.01g (0.044 몰), N-메틸피롤리돈 63.75g을 투입하여 용해시킨 것을 적하투입하고, 질소 분위기하의 실온에서 교반후, 5일 동안 보관함으로써, 불소함유 폴리아미산 수지 조성물(고형분 농도 15 중량%, 6FDA/BAPP 폴리아미산)을 얻었다. 상기 폴리아미산의 중량평균 분자량은 18.5만, 점도는 7.1Pa·s이었다. 얻어진 불소함유 폴리아미산 수지 조성물을 사용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 불소함유 폴리이미드 필름을 얻었다. 이 불소함유 폴리이미드 필름의 물에 대한 정적 접촉각은 82.5°, 전락각은 32.2°였다.
실시예 5 : 6FDA/BAPB
500mL 용량의 3구 플라스크에 4,4'-헥사플루오로이소프로필리덴디프탈산 무수물 20.50g(0.046 몰), N-메틸피롤리돈 148.75g을 투입하여 용해시켰다. 여기에 4,4'-비스(4-아미노페녹시)페닐 17.00g(0.046 몰), N-메틸피롤리돈 63.75g을 투입하여 용해시킨 것을 적하투입하고, 질소 분위기하의 실온에서 교반후, 5일간 유지함으로써, 불소함유 폴리아미산 수지 조성물(고형분 농도 15 중량%, 6FDA/BAPB 폴리아미산)을 얻었다. 상기 폴리아미산의 중량평균 분자량은 11.2만, 점도는 8.1Pa·s이었다. 얻어진 불소함유 폴리아미산 수지 조성물을 사용하여, 실시예 1과 동일하게 하여 불소함유 폴리이미드 필름을 얻었다. 이 불소함유 폴리이미드 필름의 물에 대한 정적 접촉각은 79.0°, 전락각은 32.2°였다.
시험예 4
사용하는 세포는, 시험예 1과 동일한 것을 사용하였다.
<인간지방 유래 줄기세포의 확대 배양>
동결세포를 37℃의 항온수조에서 용해시켜, 5% FBS, 1% 항생물질을 포함한 KBM ADSC-2 배지(기초배지, 코진바이오 제조) 9mL에 추가했다. 이어서, 210×g에서 5분간 원심분리처리를 실시한 후, 상청(上淸)을 제거하고 1mL의 기초배지에 분산시켰다. 800mL 세포 배양용 플라스크(스미토모 베이클라이트 제조)에 세포현탁액을 가한 후의 총량이 30mL가되도록 기초배지를 미리 가하여 두고, 거기에 세포현탁액을 1.0×106세포/플라스크가 되도록 첨가하여, 37℃의 5%(v/v) CO2 인큐베이터에서 배양을 실시하였다.
<용기의 탈포처리>
실시예 2 내지 5의 배양용기의 탈포처리를 수행하였다. 구체적으로는, 용기에 2mL 정도의 PBS를 가하고 피펫팅작업을 2회 반복하여, 탈포를 실시했다. 이어서, 1% 항생물질을 포함한 KBM ADSC-2 배지를 0.2mL 첨가하여, 37℃의 5% (v/v) CO2 인큐베이터에서 하룻밤 정치하였다.
<스페로이드의 배양>
배양용 플라스크에서 배지를 제거하고, 세포박리액 accutase(프로모셀 제조)을 5mL 첨가한 후, 37℃의 5 %(v/v) CO2 인큐베이터 내에서 5분 정도 보관하여 세포를 박리했다. 이어서, 박리액을 회수하고, PBS를 이용하여 총량이 15mL가 되도록 하여 튜브로 옮겼다. 210×g에서 5분간 원심분리처리를 실시한 후, 2mL의 1% 항생물질을 포함한 KBM ADSC-2 배지에서 현탁시켜, 세포수를 카운팅하였다. 그 후, 1.0×106세포/mL의 농도가 되도록 조제하였다.
37℃의 5%(v/v) CO2 인큐베이터에서 하룻밤 정치한 배양용기의 배지를 제거하고, 500 세포/구멍이 되도록 세포를 파종하였다. 그 후, 시험예 1과 동일하게 하여 배양을 개시하고, 배양 3일째까지 실시했다. 얻어진 스페로이드의 형태를 시험예 1과 동일하게 촬영했다. 결과를 도 14에 나타낸다.
이와 같이 세포 접착성 표면의 수지 종류 및 세포종이 다르더라도, 스페로이드가 형성됨을 알 수 있었다. 또한, 형성된 스페로이드의 균일성도 상기 시험예와 마찬가지로 높았다.
본 발명의 세포 배양 시트는 준비가 간편하고, 세포 배양 작업도 용이하며, 얻어지는 세포조직체의 균일성도 양호하다고 할 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명의 세포 배양 시트는 간편하게 제조할 수 있으며, 또한 세포 배양 작업 자체도 효율적으로 수행할 수 있게 되므로, 예를 들면, 스페로이드 함유 제제 등의 세포제제 분야에 적합하게 사용할 수 있다.
1 : 세포 배양용 시트
11 : 오목부
11a : 오목부의 내측면
11b : 오목부의 저면
12 : 시트 표면
21 : 세포 비접착성을 나타내는 물질
22 : 세포 접착성을 나타내는 물질
23 : 접착층

Claims (14)

  1. 개구부의 구경이 직경 1000㎛ 이하의 오목부를 복수개 가지고, 상기 오목부의 내측면이 세포 비접착성 표면을 가지면서, 상기 오목부의 저면이 세포 접착성 표면을 갖고,
    상기 세포 비접착성 표면은 폴리에틸렌글리콜, MPC(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린), poly-HEMA(폴리하이드록시에틸메타크릴레이트), 세그먼트화 폴리우레탄, 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 세포 접착성 표면은 폴리이미드를 포함하는 수지 조성물로 구성되며, 원형도가 0.8 내지 1.0인 스페로이드 제조를 위한 세포 배양용 시트로,
    상기 세포 배양용 시트는,
    상기 개구부의 관통공(貫通孔)을 갖는 세포 비접착성 표면을 갖는 층과, 세포 접착성 표면을 갖는 층의 적층물인 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    세포 비접착성 표면을 갖는 층과 세포 접착성 표면을 갖는 층과의 사이에, 추가로 접착층을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서,
    오목부가 저면측을 향하여 테이퍼 형상으로 형성되는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
  7. 청구항 1에 있어서,
    오목부가 단위면적당(㎠) 10 내지 1000 개의 개수로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 시트.
  8. 삭제
  9. 직경 1000㎛ 이하의 관통공을 복수개 가지는 세포 비접착성 표면을 갖는 층 및 세포 접착성 표면을 갖는 층을 적층하고, 상기 세포 비접착성 표면은 폴리에틸렌글리콜, MPC(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린), poly-HEMA(폴리하이드록시에틸메타크릴레이트), 세그먼트화 폴리우레탄, 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 세포 접착성 표면은 폴리이미드를 포함하는 수지 조성물로 구성되며, 원형도가 0.8 ~1.0인 스페로이드 제조를 위한 세포 배양용 시트의 제조 방법.
  10. 삭제
  11. 청구항 1에 따른 세포 배양용 시트를 포함하는 원형도가 0.8 내지 1.0인 스페로이드 제조를 위한 세포 배양용 기구.
  12. 삭제
  13. 청구항 1에 기재된 세포 배양용 시트로 또는 상기 시트를 포함하는 세포 배양용 기구로 배양하는, 원형도가 0.8 내지 1.0인 스페로이드의 배양 방법.
  14. 삭제
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