KR102649112B1 - 인간의 소변을 검체로 이용하여 대장암을 진단하는 진단키트 - Google Patents
인간의 소변을 검체로 이용하여 대장암을 진단하는 진단키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대장암에 대한 분자 마커로서 프리온 단백질을 제안한다. 본 발 명의 마커는 소변 마커로서 대장암을 편리하고, 신속 및 정확하게 진단하는데 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 인간의 소변을 검체로 하여 대장암을 진단할 수 있는 진단 키트 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 면역 크로마토그래피 (Immunochromatography)법을 이용하여 육안으로 대장암 발생 여부를 진단할 수 있는 진단키트에 관한 것이다.
대장은 입으로 섭취된 음식물의 소화, 흡수가 이루어지는 곳이며, 잉여 음식물이 머무르는 곳이기도 하다. 또한, 이곳에서 수분을 흡수하여 대변이 만들어 지고, 이와 더불어 여러 종류의 많은 세균이 서식하는 곳이기도 하다. 사람의 경우, 대장의 길이는 약 2m 정도이고, 결장과 직장, 항문으로 구성되어 있다. 대장점막이 있는 곳이면 어디서나 암이 생기지만, 암이 생기기 쉬운 부위는 에스결장과 직장이다.
현재 우리나라에서 대장암 발생률은 매우 현저하게 증가하고 있고, 대장암에 의한 사망은, 남성의 경우 위암, 폐암, 간암에 이어 네 번째를 차지하고 있으며, 여성의 경우 또한 유사하다. 대장암 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전인자보다도 환경인자의 비중이 크다고 여겨지고 있는데, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성 지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나, 5% 전후의 대장암은 유전적 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다.
대장암은 조기 발견시 내시경적 절제나 외과적 치료에 의해 완전히 치유될 수 있으며, 진행되어 간이나 폐로 전이(원격전이) 되었더라도 수술이 가능한 시기라면 외과적 치료에 의한 완치를 기대할 수 있다. 그러나, 발견이 늦어지면 폐, 간, 림프절이나 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어나기 때문에 상기의 경우처럼 외과적 치료를 사용할 수 없다.
이와 같이, 대장암은 조기인 경우라면 거의 100% 가까이 완치되지만, 일반적으로 자각증상이 없기 때문에 무증상인 시기에 발견하는 것이 매우 어렵고, 이에 따라 주기적인 검사가 선행되어야 한다. 대장암의 진단은 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에게 직장 수지검사(rectal digital examination), 분변 잠혈검사(fecal occult blood test) 및 대장조영술에 의해 수행되고 있으며, 필요에 따라 결장경 검사를 통한 조직검사가 행해진다.
현재 이용 가능한 가장 조기의 검출방법은 분변혈에 대한 시험 또는 내시경 과정을 수반한다. 그러나, 분변혈이 검출되면 일반적으로 종양 크기가 상당하다. 잠혈 기준 (guaiac-based)의 분변 검사의 감수성 역시 26%로, 이는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출되지 않음을 의미한다(Ahlquist et al., Gastroenterol. Clin. North Am. 26: 41-55, 1997). 전암성 및 암성 병변의 시각화는 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 결장 내시경은 상당한 비용뿐만 아니라, 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있다는 문제점이 있다(Anderson et al., J. Natl. Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).
상기와 같은 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 피검체들에게 불편을 주는 문제점이 있다.
KR 10-1212024
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로서, 인간의 소변에서 검출되는 지표물질을 검체로 이용하여 면역학적 방법으로 대장암 발병 여부를 간단하게 확인할 수 있는 진단키트를 제공하고자 하는 목적을 갖는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 특별한 장비 없이도 의료기관이나 가정 등에서 소변을 검체로 이용해 육안으로 간단히 대장암 여부를 확인, 판독 가능한 대장암 진단키트 및 그 진단키트의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 대장암을 진단하기 위한 진단 스트립; 상기 진단 스트립을 각종 오염물질로부터 보호하며, 상기 진단 스트립에 검체를 투입하기 위한 소변샘플주입구와, 상기 소변샘플주입구를 통해 투입된 소변의 진단 결과를 나타내도록 각각의 진단 스트립에 형성되는 결과표시부를 포함하는 상부 케이스; 상기 진단 스트립의 일면을 지지하는 지지구가 형성된 하부 케이스를 포함하는 대장암 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서 진단 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단스트립의 재료로 이용되는 소재로, 예를 들어 나이트로 셀룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체류가 사용될 수 있으며, 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제가 포함되어 제공될 수 있다.
또한, 검출 표지제가 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제가 포함할 수 있는바 적합한 담체로는 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS) 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 진단용 항체는 스트립의 제조에 사용할 수 있는 통상의 상업적으로 이용가능한 항체의 원료인 정제된 단일클론 anti-PSA, 토끼 anti-PSA, 산양 anti-쥐 IgG 들을 사용 할 수 있는바, 바람직하게는 산양-anti 마우스 IgG다중클론항체, 토끼-anti prion단일클론항체를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 표현, "대장암 진단용 키트"는 대장암 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "대장암 진단용 키트"는 "대장암 진단용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용 가능하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 대장암의 단계 결정 또는 치료에 대한 반응성 예측)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
대장암은 대장에 생긴 암세포로 이루어진 각종 악성종양을 의미하는데, 본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 채취한 시료로부터 대장암의 발병 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 명세서에서 사용된 용어, "대장암 진단 마커 혹은 대장암 마커"란 대장암을 진단할 수 있는 물질로, 정상인에 비하여 대장암이 발병한 개체에서 증가 양상을 보이나 소변에서는 감소 양상을 보이는 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 대장암 진단 마커는 인간 프리온 단백질이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 항원-항체 반응을 통해 면역학적 복합체를 형성하게 되고, 형성된 면역학적 복합체는 면역분석법을 사용하여 검출할 수 있으며, 항원을 검출하거나 정량하는데 사용되는 수많은 면역분석법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988, 556-612, Reiter RE., Gu Z., Watabe T., Thomas G., Prostate stem cell antigen : A cell surface marker overexpressed n prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Feb 17;95(4):1735-40]을 참조 가능하다.
본 발명의 대장암 진단용 키트는 면역크로마토그래피법(immunochromatograpic assay)을 기초로 고안되어 현재 시판되고 있는 대장암 진단용 키트의 원리가 그대로 적용될 수 있는바, 면역크로마토그래피법은 면역화학법 (immunochemistry)과 크로마토그래피법 (chromatogrphic assay)을 결합한 검사방법으로 항원에 대한 항체의 특이적인 면역반응성 및 유동성 막(porous membrane)의 모세관현상에 의한 분자의 이동을 응용한 검사방법이다.
면역크로마토그래피법은 기존의 멀티-스텝(multi-step) 면역측정법에서 요구 되는 검체 희석, 세정 및 효소 결합체와 기질의 반응을 통한 발색 과정을 하나로 통합하여 원-스텝(one-step)으로 신속하게 검사할 수 있는 편리성이 있으며 또한 특정한 장비를 사용하지 않고 검사결과를 판정할 수 있는 용이성 및 경제성, 검사결과 판독의 신속성 등에서 장점을 갖는다.
본 발명의 바람직한 일 적용예에서, 인간 프리온 단백질에 대한 항체가 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 인간의 소변 시료를 첨가하여 반응시키고, 효소-2차 항체 결합체를 반응시킨 후 상기 효소의 기질을 처리하여 흡광도를 측정하고, 상기 흡광도를 표준곡선과 비교하여 인간 소변 내에 존재하는 프리온 단백질을 정량 비교한 결과를 바탕으로 대장암을 진단할 수 있다.
또한 본원에서 제공되는 진단키트는 소변을 검체로 이용할 수 있을뿐 아니라 혈액을 시료로 면역크로마토그래피법을 적용하여 인간 프리온 단백질의 특이적인 항원를 측정함으로써 대장암, 대장암관련 악성종양 및 양성종양 등 대장암질환의 진단방법에도 적용될 수 있다.
본 발명은 면역크로마토그래피(Immunochromatography)법에 의해 소변 및 혈액에서의 프리온 단백질 양을 반정량적으로 측정할 수 있는 진단키트로 제공될 수 있으며, 또한 본 발명의 정확한 진단을 위해서 소변성분에 대한 면역반응 측정 리더기를 이용해 정확하게 진단하는 방법으로 적용될 수 있는바, 이의 구체적인 제조방법 및 적용 실시양태는 하기의 '발명을 실시하기 위한 구체적인 내용' 란 기재를 통하여 상세히 설명된다.
본 발명은 대장암을 의사의 소견에 의한 판단이 아니라, 분자 진단 방법으로 판단한다. 본 발명의 마커는 대장암에서 고농도로 존재하는 생체 분자이나 본 발명의 검체인 인간의 소변에서는 저농도로 존재하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 간편하면서도 신속하게 대장암의 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 나온 데이터를 근거로 하여 대장암 치료제를 환자에게 처리할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 대장암에 대한 바이오마커로서 소변 내 프리온 단백질을 제안한다.
(ⅱ) 본 발명의 마커는 소변 마커로서 대장암을 편리하고, 신속 및 정확하게 진단하는데 이용될 수 있다.
도 1은 정상인과 대장암 환자의 소변 내 프리온 농도를 비교한 값을 나타낸 도이다.
도 2는 정상인과 대장암 환자의 소변 내 프리온 농도를 비교한 그래프를 나타낸 도이다.
도 3a는 본 발명의 대장암 진단 키트 스트립을 나타낸 도이다.
도 3b는 본 발명의 대장암 진단 키트를 구성하는 부속품의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3c는 본 발명의 대장암 진단 키트 스트립과 하부케이스를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 대장암 진단 키트에 의해 대장암 환자를 대상으로 검출한 소변에서의 프리온 단백질의 효소 면역 반응 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 정상인과 대장암 환자의 소변 내 프리온 농도를 비교한 그래프를 나타낸 도이다.
도 3a는 본 발명의 대장암 진단 키트 스트립을 나타낸 도이다.
도 3b는 본 발명의 대장암 진단 키트를 구성하는 부속품의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3c는 본 발명의 대장암 진단 키트 스트립과 하부케이스를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 대장암 진단 키트에 의해 대장암 환자를 대상으로 검출한 소변에서의 프리온 단백질의 효소 면역 반응 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현 예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1. 검체의 수집
본 발명은 IRB 심의 면제 번호 (P01-202108-31-006)하에 총 100명 (아주대를 방문한 환자 중 정상군에 해당하는 사람 50명 및 충남대학교를 방문한 환자 중 대장암 환자 50명) 으로부터 소변을 모집하였다
실시예 2. 효소 면역 검사법의 개발
정상 대조군 50명을 대상으로 소변을 수집하고, 대장암 환자 50명을 대상으로 소변을 수집하여 소변에서의 프리온 단백질을 효소 면역 방법에 의해서 정량적으로 확인하였다.
그 결과 정상군에 해당하는 사람 50명의 소변에서 검출된 프리온 단백질의 양이 대장암 환자의 소변에서 검출된 프리온 단백질과 유의미하게 차이가 있는 것을 확인할 수 있다.
정상군 50명의 결과 평균치는 약 0.6255ng/ml의 값을 보여주었다. 반면 대장암을 가지는 환자 50명의 평균 결과 값은 약 0.5366ng/ml 값을 나타내었다(도 1 참조).
결과적으로 사람 소변에 존재하는 프리온 단백질을 바이오마커로서 이용하고 항체를 사용한 효소 면역 방법을 사용하여 이를 검출함으로써 대장암을 조기 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 소변을 검체로 한 스트립의 제조
3-1. 항체결합 패드(접합 패드), 샘플 패드 및 흡수 패드의 제조
항체결합 패드(접합 패드)는 폴리에스테르(100%Polyester) 패드를 사용하며, 항체를 패드에 고르게 분무하여 건조해 항체 결합 패드를 제조하여 사용하였고, 샘플 패드의 경우 유리섬유(Glass microfiber)또는 면섬유(Cotton Linter)로 제공하되 0.1~3.0% Triton X-100 계면활성제가 고르게 분무해 건조 후 사용하였다.
면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 역할을 하도록 흡수패드(100% Cotton Linter)는 면 섬유 패드를 사용하였다.
3-2. 진단 스트립의 제조
스트립 소재가 나이트로셀룰로오즈 멤브레인이 이용되고, 멤브레인은 2개 라인(1라인:Control, 2라인:Test)이 점적되되, 제1조절 라인(Control)은 산양-anti 마우스 IgG다중클론항체로 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되고, 제2조절(Test) 라인은 토끼-anti prion단일클론항체로 0.5 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적 되어 건조 후 사용하였다.
상기 나이트로셀룰로우즈 멤브레인의 2개 라인(1라인:Control, 2라인:Test)에 항체를 5 ~ 8 ㎝/sec 속도로, 0.5㎕/㎝ ~ 1.3㎕/㎝의 분주량으로 주가하는 방법이 적용하였으며, 상기 멤브레인의 2개 라인(1라인:Control, 2라인:Test)에 사용되는 항체를 완충액 1X PBS(1x(ablet) 10mM phosphate buffer)로 희석하며, 추가로 수크로우스 당이 최종농도 0.5% 내지 10%의 비율로 혼합하여 적용하였다.
실시예 4. 진단 키트의 제작
상기 진단 스트립은 나이트로셀룰로우즈 멤브레인과 소변이 2~3방울 적가되는 샘플패드와 폴리에스테르로 제공되는 접합패드와 면 섬유로 제공되는 흡수패드로 제공되게 하였다.
나이트로셀룰로우즈 멤브레인은 2개 라인으로 제1라인은 산양-anti 마우스 IgG 다중클론항체가 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되어 대조선 C-line을 이루며 제2라인은 토끼-anti prion단일클론항체가 0.5 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적되고 건조 후 사용되어 발색 유무 및 농도 진하기를 대조해 관찰할 수 있도록 제공되는 결과선 T-line을 갖는 구성으로 제공 되었다. 또한 접합패드는 항체를 가하여 폴리에스테르(100%Polyester) 패드에 고르게 분무된 후 건조하여 제공되며, 흡수패드는 면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 역할을 하도록 면 섬유로(100%Cotton Linter) 사용되어 제공되는 구성으로 진단 스트립이 사용되었다.
상기 진단 키트는 하부케이스와 상부케이스가 플라스틱 하우징을 이루어 제공되되, 하부케이스는 상부스트립홀더 및 하부스트립홀더와 측면으로 다수개의 지지구와 상단걸림턱 및 하단걸림턱을 갖는 구조로 제공되어 상단걸림턱에 상기 진단 스트립의 흡수패드가 위치되고, 하단걸림턱에 진단 스트립의 샘플패드가 위치하는 구조로 상부스트립홀더와 하부스트립홀더에 안정적으로 재치/내삽되는 구성을 이루며, 상부케이스는 일단으로 손잡이부를 갖고 중앙부에는 소변샘플주입구 및 진단스트립의 대조선 C-line과 결과선 T-line이 표시되는 결과표시부를 가지며 리더기에 내삽되는 진입방향표시부를 갖는 구성의 진단 키트가 프리온 특이항원의 항원-항체 반응에 따른 발색을 통해 대장암을 진단할 수 있도록 구성한다.
실시예 5. 프리온 단백질에 대한 반응 확인
대장암을 진단하기 위해 프리온 단백질을 검출하는 효소 면역 방법의 원리를 이용하여 발명한 진단 키트로 검체 시료를 적하하여 검사선 및 대조선의 발색 결과를 판정하였다.
구체적으로 진단 키트의 샘플패드(12)에 검체 시료인 소변을 2-3방울(80 내지 120㎕)의 소변을 가하고 5 내지 10분 후 대조선C(control line)와 결과선T(test line)의 발색 유무를 판단하였다. 결과적으로 양성 시료일 때는 대조선만 발색되어 적자색으로 표시되었으며, 음성 시료일 때는 대조선과 결과선이 함께 적자색으로 발색되는 것을 확인하였다. 즉 이를 통해 진단 키트의 결과를 판정하였다.
10 : 진단 스트립 11 : 멤브레인
12 : 샘플패드 13 : 접합패드
14 : 흡수패드 20 : 하부케이스
21 : 상부스트립홀더 22 : 하부스트립홀더
23 : 지지구 24 : 상단걸림턱
25 : 하단걸림턱 30 : 상부케이스
31 : 손잡이부 32 : 소변샘플주입구
33 : 결과표시부 34 : 진입방향표시부
40 : 진단키트
12 : 샘플패드 13 : 접합패드
14 : 흡수패드 20 : 하부케이스
21 : 상부스트립홀더 22 : 하부스트립홀더
23 : 지지구 24 : 상단걸림턱
25 : 하단걸림턱 30 : 상부케이스
31 : 손잡이부 32 : 소변샘플주입구
33 : 결과표시부 34 : 진입방향표시부
40 : 진단키트
Claims (5)
- 대장암을 진단하기 위한 진단 스트립;
상기 진단 스트립을 각종 오염물질로부터 보호하며, 상기 진단 스트립에 검체를 투입하기 위한 소변샘플주입구와, 상기 소변샘플주입구를 통해 투입된 소변의 진단 결과를 나타내도록 각각의 진단 스트립에 형성되는 결과표시부를 포함하는 상부 케이스; 및
상기 진단 스트립의 일면을 지지하는 지지구가 형성된 하부 케이스;를 포함하는, 대장암 진단키트에서,
상기 진단 스트립은 검체의 대장암 진단 결과를 나타내는 검사선과 대조군 조성물을 포함하는 대조선이 구비되는 멤브레인; 검체가 투입되는 샘플패드; 프리온 단백질에 대한 항체가 고르게 분무되어 건조 후 사용되는 접합패드; 및 잔량의 검체를 흡수하는 흡수 패드;를 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 검사선은 토끼-anti prion단일클론항체 0.5 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적되는 것을 특징으로 하며,
상기 진단키트는 사람의 소변 중 프리온단백질의 양이 0.5366ng/㎖ 이하인 경우에 대장암으로 판정되도록 제공되는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단키트. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 멤브레인은 나이트로셀룰로오즈가 이용되고, 2개 라인(1라인 : Control, 2라인 : Test)이 점적되되, 제1조절 라인(Control)은 산양-anti 마우스 IgG 다중클론항체로 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되고, 제2조절(Test) 라인은 토끼-anti prion단일클론항체로 0.5 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적 되어 건조 후 사용되는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단키트. - 삭제
- 사람의 소변을 검체로 활용하여 대장암을 진단하도록 제공되는 진단키트의 결과 판정방법에 있어서,
제1항의 진단키트의 샘플패드에 시료로 소변을 가하고 대조선 C(control line)와 결과선 T(test line)의 발색 유무를 판단할 때 양성시료일 때는 대조선만 발색되어 적자색으로 표시되고, 음성시료일 때는 대조선과 결과선이 함께 적자색으로 발색되어 판정되는 하도록 적용되는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단키트의 결과 판정방법에서,
상기 진단키트는 사람의 소변 중 프리온단백질의 양이 0.5366ng/㎖ 이하인 경우에 대장암으로 판정되도록 제공되는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단키트의 결과 판정방법.
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| PG1601 | Publication of registration |