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KR102647696B1 - Mage-a4 유래 펩티드를 인식하는 항원 결합성 단백질 - Google Patents

Mage-a4 유래 펩티드를 인식하는 항원 결합성 단백질 Download PDF

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KR102647696B1
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야스시 아카호리
유야 가토
요시히로 미야하라
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고쿠리츠다이가쿠호진 미에다이가쿠
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Abstract

(과제)암 특이적인 세포내 항원을 사용한 CAR수주요법에 사용할 수 있는 CAR-T세포를 제공하는 것이다.
(해결수단)MAGE-A4 유래 펩티드와 HLA-A2 복합체를 인식하는 항체를 구비한 암치료용 CAR-T세포이며, 상기 항체는, 배열번호36의 VH의 아미노산 배열과, 배열번호38의 VL의 아미노산 배열을 구비하는 암치료용 CAR-T세포에 의해 해결된다. 이때에 상기 항체는, 배열번호32의 아미노산 배열을 구비하는 것이 바람직하다.

Description

MAGE-A4 유래 펩티드를 인식하는 항원 결합성 단백질
본 발명은, MAGE-A4 유래 펩티드를 인식하는 항원 결합성 단백질 등에 관한 것이다.
현재 악성종양은 사망원인의 30%를 넘어, 선진국의 제1위의 사인(死因)이다. 의료의 진보에 따라 완치되는 암도 존재하지만, 치료 곤란한 암도 많이 존재하고 있다. 암의 신규치료법을 개발하는 것은 긴급한 과제이다. 암의 치료법으로서는, 수술, 화학요법, 방사선요법이 3대 치료법이며, 주로 이들을 조합시켜서 치료할 수 있다.
최근에 면역요법(免疫療法)이라고 불리는 제4의 암치료법이 진전되어, 그 비침습성(非侵襲性)과 효과의 유효성이 주목을 받고 있다. 면역요법은, 주로 백신요법, 항체요법(抗體療法), 세포수주요법(細胞輸注療法)의 3개로 대별된다. 세포수주요법에는, 암에 특이적으로 반응하는 세포상해성 T세포(細胞傷害性T細胞) 유래(由來)의 T세포 수용체(T cell receptor : TCR)의 유전자를 환자의 림프구에 체외(體外)에서 도입(導入)한 후에 수주(輸注)하는 T세포 수용체 유전자도입 림프구 수주요법과, 항원인식부위(抗原認識部位)로서의 scFv와 세포내 시그널 전달 분자(細胞內 signal 傳達分子)로서의 CD3ζ를 결합시킨 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor : CAR)를 환자 말초혈 림프구에 도입하여 수주하는 치료법이 있다. 이들 치료법은, 항원특이성(抗原特異性)을 가지는 림프구를 수용체 유전자도입이라고 하는 방법에 의해 단기간에 대량으로 제작할 수 있기 때문에, 다양한 종류의 암환자에 대한 특이적 T세포 치료를 가능하게 한다.
TCR유전자수주요법은, 펩티드 MHC 복합체(peptide-MHC complex : pMHC)를 인식해서 암을 죽이는 시스템이기 때문에, 안전하고 효과적인 치료법으로서 세계에서 개발이 진행되고 있다. 그러나 그것에 사용할 수 있는 킬러 T세포 클론(killer T細胞 clone)을 단리(單離)하는 것이 극히 곤란하다고 하는 문제가 있다.
한편, CAR수주요법의 이점으로서 다음의 3가지를 들 수 있다. (1)단쇄항체(單鎖抗體)(scFv)와 T세포 수용체(TCR)나 부자극 분자(副刺戟分子)의 시그널 전달 도메인으로 이루어지는 CAR을 도입한 T세포는, 본래의 T세포와는 달리, MHC 비의존성으로 암항원(癌抗原)을 인식하여 파괴할 수 있기 때문에, 광범위한 환자에 적응 가능하게 되는 장점을 가진다, (2)CD8양성 T세포뿐만 아니라, CD4양성 T세포나 비T세포에도 기능을 부여할 수 있다, (3)항체의 반응성(反應性)을 계승하기 때문에 TCR과 비교하여 친화성이 높다. 실제로 CAR치료법은, 항CD19항체를 사용한 CAR치료법으로서 백혈병 및 림프종의 환자에 대하여 매우 높은 임상효과가 보고되어 있다(비특허문헌1:문헌에 대해서는 뒤에 정리해서 나타낸다). CD19분자는 B세포에서도 발현되지만, B세포의 소실은 면역 글로불린의 보충 등으로 대처 가능하다. 일반적으로는 암세포에서만 발현되는 항원을 사용하는 것이 이상적이다. 그러나 그러한 세포표면항원은 현재의 상태에서는 발견되지 않는다고 하는 과제가 있다.
한편, 세포내에 존재하는 분자에는, 암정소항원이나, 네오안티젠(neoantigen) 등의 암 특이적인 것이 보고되어 있다. 그러나 암 특이적인 세포내 항원을 사용한 CAR수주요법에 대해서는 알려져 있지 않았다.
이러한 상황을 감안하여, 본 발명자는, MHC와 세포내 항원 유래 펩티드와의 복합체를 인식하는 항체를 단리하고, 그 항체를 사용하여 CAR면역요법에 응용하는 방법을 생각했다. 펩티드 MHC 복합체를 특이적으로 인식하는 항체는 한정된 수의 성공예밖에 보고되어 있지 않다(비특허문헌2). 펩티드 MHC 복합체를 특이적으로 인식하는 항체를 취득하고, 암세포를 특이적으로 살상하는 CAR-T세포를 제작할 수 있다면, 획기적인 치료법이 이루어질 수 있다. 펩티드 MHC 복합체를 인식하는 CAR에 있어서, 체내에 CAR-T세포를 수주함과 동시에 CAR-T세포가 특이적으로 인식하는 펩티드를 투여함으로써 항원제시세포에 의한 CAR-T세포의 증식을 기대할 수 있다.
Brentjens RJ, et al: Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B- leukemias. Blood 2011, 118:4817-4828. Dao T, Yan S, Veomett N, Pankov D, Zhou L, Korontsvit T, et al: Targeting the intracellular WT1 oncogene product with a therapeutic human antibody. Sci Transl Med 2013; 5 : 176ra133. Van Der Bruggen P, Zhang Y, Chaux P, Stroobant V, Panichelli C, Schultz ES, Chapiro J, Van Den Eynde BJ, Brasseur F, Boon T. Tumor-specific shared antigenic peptides recognized by human T cells. Immunological Reviews 2002. Vol.188 : 51-64. Duffour MT, Chaux P, Lurquin C, Cornelis G, Boon T, van der Bruggen P. A MAGE-A4 peptide presented by HLA-A2 is recognized by cytolytic T Lymphocytes. Eur. J. Immunol 1999. 29 : 3329-3337. Muraoka D, Harada N, Hayashi T, Tahara Y, Momose F, Sawada S, Mukai SA, Akiyoshi K, Shiku H. Nanogel-based immunologically stealth vaccine targets macrophages in the medulla of lymph node and induces potent antitumor immunity. ACS Nano. Sep 23, 2014 ; 8(9) : 9209-18. Hillig RC, Coulie PG, Stroobant V, Saenger W, Ziegler A, Huelsmeyer M. High-resolution Structure of HLA-A*0201 in Complex with a Tumour-specific Antigenic Peptide Encoded by the MAGE-A4 Gene. J. Mol. Biol. 2001, 310, 1167-1176.
본 발명은 상기한 과제에 비추어 이루어진 것으로서, 그 목적은, MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2 복합체를 특이적으로 인식하는 항원 결합성 단백질을 제공하는 것이다.
MHC에 제시되는 항원으로서 MAGE-A4분자를 사용했다. MAGE-A4는, 악성 흑색종을 포함하는 고형암(固形癌)에서 발현되고 있고(비특허문헌3), NY-ESO-1과 마찬가지로 CTA(cancer testis antigen)이다. 이들 분자는, 정소와 태반 이외의 정상조직에서의 단백 발현이 확인되지 않는다. MAGA-A4는 세포내에서 발현된 후에, 프로테아좀(proteasome)에 의하여 분해된다. 그 일부는 10아미노산의 MAGE-A4 펩티드가 되어, 소포체에서 HLA-A*0201, beta-2 마이크로글로불린(microglobulin)과 회합하여 암 특이적인 항원으로서 세포표면에 제시된다. HLA-A*0201 상에 제시되는 펩티드로서, p230-239(GVYDGREHTV:배열번호1)를 선택했다(비특허문헌4).
A2-MAGE-A4를 특이적으로 인식하는 CAR을 인간 림프구에 유전자도입하고, 타겟인 암에 특이적인 반응을 나타내는 CAR-T세포를 제작하여, 그것을 인간의 세포수주요법에 응용하는 방법을 확립했다. 즉 (1)MAGE-A4 유래 펩티드와 HLA-A2 복합체를 인식하고 친화성이 높은 복수 개의 항체를 단리하고, (2)단리한 항체의 특이성을 조사하고, (3)특이성이 높은 항체를 선별하고, (4)이것을 사용한 CAR-T세포를 제작하고, 그 CAR-T세포가 타겟인 암세포에 특이적으로 활성화되어, 세포상해활성을 야기하는 것을 확인했다. CAR-T세포를 수주한 인간 종양 이식 마우스에 의한 인 비보(in vivo) 암치료 모델에 있어서, 마우스 체내에서 CAR-T세포의 특이적 증식과, 종양에 대한 침윤이 관찰되었다. 이렇게 해서, 기본적으로는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 관한 항원 결합성 단백질은, 이하의 (A) 또는 (B)의 폴리펩티드를 포함하고, HLA-A2-MAGE-A4 복합체를 항원으로서 인식하는 것, 즉 (A)배열번호36의 VH(중쇄가변영역)의 아미노산 배열과, 배열번호38의 VL(경쇄가변영역)의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (B)배열번호36의 VH(중쇄가변영역)의 아미노산 배열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열과, 배열번호38의 VL(경쇄가변영역)의 아미노산 배열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 한다. 이때에 VH와 VL과의 사이에, 이하의 (C) 또는 (D)의 폴리펩티드, 즉 (C)배열번호37의 sc(1개 쇄(chain))의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (D)배열번호37의 sc(1개 쇄)의 아미노산 배열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 배열번호32의 아미노산 배열, 또는 배열번호32의 아미노산 배열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 상기 항원 결합성 단백질이, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 1개 쇄 Fv(scFv)인 것이 바람직하다. 또 본 명세서 중에 있어서, 항원 결합성 단백질에는 항체 그 자체 또는 항체유도체 등이 포함된다.
본 발명에 있어서 상동성은, 2개(또는 3개 이상)의 아미노산 배열 또는 염기배열을 비교함으로써 결정되는 관계를 의미한다. 상동성은, 아미노산 배열 또는 염기배열의 사이의 얼라인먼트에 의하여, 또는 일련의 부분적인 배열간의 상관성의 정도를 의미한다. 구체적으로는, 배열의 동일성과 유지성(배열 중의 특정 아미노산 또는 배열 중의 물리화학특성을 유지하는 치환)에 의해 결정된다. 상동성을 결정하는 방법은, 대비하는 배열간에 가장 길게 얼라인먼트할 수 있는 방법인 것이 바람직하다. 상동성을 결정하기 위해서 인터넷을 통하여 이용가능한 프로그램, 예를 들면 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)<https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>를 사용해서 구해진다. 배열번호32, 36, 37, 38의 아미노산 배열과 90% 이상(더 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 나타내고, 또한 HLA-A2-MAGE-A4 복합체를 항원으로서 인식하는 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
또한 다른 발명에 관한 핵산은, 제1발명에 기재되어 있는 항원 결합성 단백질을 코드한다.
다른 발명에 관한 벡터는, 상기 핵산을 포함한다. 여기에서 핵산이란, DNA 또는 RNA가 포함된다. 또한 핵산은, 1개 쇄(chain) 또는 2개 쇄의 어느 것이라도 좋다. 벡터에는, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등이 포함된다.
다른 발명에 관한 키메라 항원 수용체는, 상기 항원 결합성 단백질과 시그널 전달 단백질의 세포내 도메인을 포함한다. 이때에 시그널 전달 단백질은, CD3zeta(CD3ζ)쇄 또는 공자극분자 CD(GITR) 중의 어느 하나인 것이 바람직하다. 또한 CD28의 세포내 도메인 또는 GITR의 세포내 도메인 중의 어느 하나를 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한 다른 발명에 관한 핵산은, 상기 키메라 항원 수용체를 코드한다. 다른 발명에 관한 벡터는, 이 핵산을 포함한다.
다른 발명에 관한 세포는, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 것이다. 또한 다른 발명에 관한 의약조성물은, 이 세포를 유효성분으로서 함유한다.
본 발명에 의하면, MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2 복합체를 특이적으로 인식하는 항원 결합성 단백질, 항원 결합성 단백질을 코드하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터, 항원 결합성 단백질을 포함하는 키메라 항원 수용체, 키메라 항원 수용체를 코드하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 및 이 세포를 포함하는 의약조성물이 제공된다. MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2 복합체를 특이적으로 인식하는 항원 결합성 단백질은, 세포의료, 유전자치료의 분야에서 사용할 수 있다. 또한 MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2 복합체를 발현하는 종양세포의 검출, 종양의 치료 및 그 연구·시험에 극히 유용하다. 또한 본 발명의 CAR-T세포는 부작용이 매우 적으므로, 대단히 유효한 암치료법을 제공할 수 있다.
[도1]MAGE#17 scFV의 배열 이미지를 나타내는 도면이다.
[도2]CAR의 구축방법을 설명하기 위한 유전자 배열 이미지를 나타내는 도면이다.
[도3](A), (B) 모두 픽업한 클론에 대해서, 복수의 항원에 대한 반응성을 ELISA를 사용해서 확인한 결과를 나타내는 막대 그래프이다.
[도4]MAGE#17에 대해서, KD값을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. (A)는 시간경과에 대한 검출감도의 동적변화를 측정한 그래프를, (B)는 그래프로부터 읽어낸 데이터에 의거하여 KD값을 계산한 결과를 나타내는 표를 각각 의미한다.
[도5]MAGE-A4 p230, CMV, DMSO를 펄스한 T2세포에 대하여, 항체 MAGE#17, #86, #209, #345 및 #672를 반응시켰을 때의 시프트량을 FACS로 조사한 결과를 나타내는 그래프(A) 및 막대 그래프(B)이다.
[도6]알라닌 치환한 펩티드를 펄스했을 때의 T2세포 표면 상의 HLA량을 FACS로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도7]알라닌 치환한 펩티드를 T2세포에 펄스하고, MAGE#17을 반응시켜, 항체인식에 관여하는 아미노산을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도8]리스크 펩티드를 T2세포에 펄스하고, T2세포 표면 상의 HLA량을 FACS로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도9]리스크 펩티드를 T2세포에 펄스하고, MAGE#17을 반응시켜, 리스크 펩티드와의 반응성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도10]PBMC에 도입한 CAR(mRNA)이 발현되고 있는지 아닌지를 테트라머(tetramer) 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
[도11]mRNA를 도입한 CAR-T세포가 타겟 세포를 특이적으로 인식하고, IFNγ 생산을 증대시키는 것을 나타내는 그래프이다.
[도12]PBMC에 도입한 CAR유전자(레트로바이러스)가 발현되고 있는지 아닌지를 테트라머 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
[도13]레트로바이러스를 도입한 CAR-T세포가 타겟 세포를 특이적으로 인식하고, IFNγ 생산을 증대시키는 것을 나타내는 그래프이다.
[도14]MAGE#17 CAR을 도입한 T세포가, MAGE-A4 펩티드를 펄스한 T2세포와의 공배양에 의해 활성화한 것을 나타내는 그래프이다.
[도15]MAGE#17 CAR을 도입한 T세포가, A2양성 MAGE-A4양성세포와의 공배양에 의해 활성화한 것을 나타내는 그래프이다.
[도16]MAGE-A4 롱펩티드를 삽입한 항원제시세포와 CAR-T를 공배양함으로써 CAR-T의 인터페론 생산이 증대한 것을 나타내는 그래프이다.
[도17]MAGE-A4 펩티드를 펄스한 T2세포가, MAGE-A4 특이적인 세포상해활성을 가지는 것을 나타내는 그래프이다.
[도18]타겟 세포에 있어서, A2양성 MAGE양성세포에 특이적인 세포상해활성을 가지는 것을 나타내는 그래프이다.
[도19]수주한 CAR-T세포의 CAR양성률을 테트라머 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
[도20](A)A2양성 MAGE-A4양성종양(NW-MEL-38)에 대한 CAR-T세포의 효과 또는 (B)A2양성 MAGE-A4음성종양(HCT116)에 대한 CAR-T세포의 효과를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도21]CAR zG의 유전자 배열 이미지를 나타내는 도면이다.
[도22]A2양성 MAGE-A4양성종양(NW-MEL-38)에 대하여, 세포내 도메인(ICD)이 다른 CAR-T세포를 투여했을 때의 효과를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. (A)종양지름, (B)체중을 각각 나타낸다. 그래프 중의 화살표는, 좌측이 방사선전신조사(TBI)의 처치일(3일째), 우측이 림프구 투여일(4일째)을 각각 나타낸다.
[도23]CAR비도입 CD8양성 T세포(NGMC:컨트롤), zG형 CAR도입 CD8양성 T세포(zG) 및 28z형 CAR도입 CD8양성 T세포(28z)의 CAR양성률을 테트라머 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
[도24]CAR-T세포가 타겟 세포를 특이적으로 인식하고, IFNγ 생산을 증대시키는지 아닌지를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도25]CAR-T세포가 타겟 세포를 특이적으로 인식하고, IFNγ 생산을 증대시키는지 아닌지를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
다음에 본 발명의 실시형태에 대해서 도표를 참조하면서 설명한다. 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시형태에 의해 한정되는 것이 아니라, 발명의 요지를 변경하지 않고 여러가지 형태로 실시할 수 있다.
본 명세서 중에 있어서 「항체」, 「항원 결합성 프래그먼트」란, 면역계에 있어서의 항원 결합성 단백질을 의미한다. 항원 결합성 영역을 구비하는 항체는, 디설피드(disulfide) 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄(H쇄) 및 2개의 경쇄(L쇄)를 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄에는, 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄정상영역(CH)이 포함된다. 중쇄정상영역은, CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각 경쇄에는, 경쇄가변영역(VL) 및 경쇄정상영역(CL)이 포함된다. VL은, CL도메인으로 구성된다. VH 및 VL영역은, 상보성결정영역(CDR)이라고 하는 초가변성을 구비하는 영역 및 프레임워크영역(FR)이라고 하는 어느 정도 보존되어 있는 영역으로 더 세분할 수 있다. VH 및 VL은, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단을 향하여, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순으로, 3개의 CDR 및 4개의 FR이 각각 배열되어 있다. 항원과의 결합에는, CDR3이 중요한 것이 알려져 있다. VH 및 VL은, 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다.
본 명세서에 있어서 「HLA」란, 휴먼 류코사이트 안티젠(Human Leukocyte Antigen)(인간 백혈구형 항원)으로, 인간 주요조직 적합 유전자 복합체(MHC)를 의미하고, 면역세포에 대한 항원제시에 필요한 세포표면분자를 코드하는 유전자의 복합체를 의미한다. HLA는 클래스I 및 클래스II로 분류할 수 있다. 클래스I HLA는, α사슬과 β2-마이크로글로불린으로 구성된다. 클래스I HLA는, 거의 모든 유핵세포에 발현되어져, CD8양성 T세포에 대한 항원제시에 있어서 기능한다. 클래스I HLA는 또한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 분류할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「키메라 항원 수용체(CAR)」란, 항원에 결합하는 세포외 도메인, 이 세포외 도메인과는 다른 폴리펩티드에서 유래하는 막관통 도메인 및 적어도 1개의 세포내 도메인을 포함하는 융합 단백질을 의미한다. CAR은 「키메라 수용체」, 「T-body」, 「키메라 면역수용체(CIR)」라고도 불리는 경우가 있다. 「항원에 결합하는 세포외 도메인」은, 어떤 항원에 결합하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미하고, 「세포내 도메인」은, 세포내에서 생물학적 프로세스를 활성화 또는 저해하는 시그널을 전달하는 도메인으로서 기능하는 것이 알려져 있는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에 있어서 「항원 결합성 단백질」은, 항원에 결합하고, 항원에 대한 특이성을 항체에 부여하는 항체의 일부 또는 전부의 단백질의 단편(斷片)을 의미한다.
다음에 본 발명을 구체적으로 설명한다.
(1)본 발명의 항원 결합성 프래그먼트 및 이들을 코드하는 핵산
항MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2(HLA-A2-MAGE-A4) 복합체 항체는, HLA-A2 구속성의 MAGE-A4 유래 펩티드인 P230-239(배열번호1)와 HLA-A2와의 복합체를 특이적으로 인식·결합하는 항체이다. 본 발명의 항체는, 특이성이 높고, HLA-A2 이외의 펩티드와 HLA-A2의 복합체 및 P230-239펩티드와 HLA-A2 이외의 HLA의 복합체와는 결합하지 않는다(또는 결합활성이 극히 낮다). 이 때문에 본 발명의 항원 결합성 프래그먼트는, HLA-A2-MAGE-A4 복합체를 특이적으로 검출 또는 표적으로 할 수 있다.
본 발명의 항원 결합성 프래그먼트는, (A)배열번호36의 VH(중쇄가변영역)의 아미노산 배열과, 배열번호38의 VL(경쇄가변영역)의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (B)배열번호36의 VH(중쇄가변영역)의 아미노산 배열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열과, 배열번호38의 VL(경쇄가변영역)의 아미노산 배열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 VH와 VL과의 사이에, (C)배열번호37의 sc(1개 쇄)의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (D)배열번호37의 sc(1개 쇄)의 아미노산 배열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
항원 결합성 프래그먼트에는, 항원에 특이적으로 결합하는 1 또는 2 이상의 프래그먼트가 포함된다. 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 항체의 프래그먼트는 완전장(full-length) 항체와 마찬가지로 항원을 특이적으로 인식한다. 항원 결합성 프래그먼트에 포함되는 항체 또는 그 단편의 예로서, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 1개 쇄(single chain) Fv(scFv)가 예시된다. Fab는, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가의 항체 프래그먼트이다. Fab'은, VL, VH, CL, CH1 도메인 및 힌지부로 구성되는 1가의 항체 프래그먼트이다. F(ab')2는, 힌지부의 디설피드 결합에 의해 결합한 2개 Fab단편을 포함하는 2가의 항체 프래그먼트이다. Fv는, 항체의 단완(單腕)의 VL 및 VH로 구성되는 1가의 항체 프래그먼트이다. Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는, 서로 별개의 유전자에 의해 코드되어 있고, 유전자재조합기술에 의해 이들의 도메인을 링커(linker)로 연결해서 1분자의 단백질인 scFv를 제작할 수 있다. scFv는 VH 및 VL의 사이에 링커(single chain:sc)를 포함한다. 이 sc는, VH 및 VL을 연결하고, scFv 항체의 항원 결합능을 안정화하기 위해서 당업계에서 통상적으로 이용되는 펩티드이다(예를 들면 Huston et al., Methods in Enzymology, 203:46-88(1991), Whitlow et al., Protein Eng., 6:989(1993)). sc는 일반적으로 글리신 및 세린을 포함하고, 그 길이는 15∼18아미노산이다.
본 발명의 하나의 태양으로서, 항원 결합성 프래그먼트의 조합을 포함한다. 이러한 분자는, Fab3, Diabody, Triabody, Tetrabody, Minibody, Bis-scFv, (scFv)2-Fc, intact-IgG가 예시된다(Holliger et al., Nature Biotechnology, 23(9), p.1126-36(2005)).
항원 결합성 프래그먼트는, 그 특성에 실질적인 영향을 미치지 않는 한, 1개 또는 몇 개의 아미노산을 개변(改變)할 수 있다. 예를 들면 정상영역이나 FR영역에 있어서, 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입될 수 있다. 이 개변은, 부위특이적 변이도입법(점돌연변이 도입 및 카세트식 변이도입 등), 유전자상동재조합법, 프라이머신장법(primer伸長法) 및 PCR법 등의 주지의 방법을 조합시켜서 용이하게 실시할 수 있다.
본 발명은, 상기 항원 결합성 프래그먼트를 코드하는 핵산을 포함한다. 또한 본 발명의 핵산은, 배열표의 배열번호31, 33∼35에 나타내는 염기배열을 포함한다. 이들의 핵산은, 코드하는 아미노산 배열을 변경시키지 않고 숙주세포에 적절한 코돈(codon)(최적 코돈)으로 개변할 수 있다. 최적 코돈으로 개변함으로써 숙주세포내에 있어서의 폴리펩티드의 발현효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 항원 결합성 프래그먼트는, 공지의 유전자공학적 방법 또는 화학합성 등의 방법을 사용해서 제조할 수 있다. 유전자공학적 방법으로서는, 본 발명의 핵산을 함유하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 제작하고, 이 벡터를 숙주세포에 도입하고, 숙주세포를 배양하고 핵산을 발현시켜서, 얻어진 폴리펩티드를 회수·정제함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 핵산이 복수의 핵산분자로 이루어지는 경우에는, 각 핵산분자를 포함하는 복수 벡터의 조합을 숙주세포에 도입하거나 또는 복수의 핵산을 포함하는 1개의 벡터를 숙주세포에 도입할 수 있다. 폴리펩티드를 제조할 때에 펩티드 태그를 연결시켜, 이 펩티드 태그를 사용해서 회수·정제할 수 있다.
본 발명의 벡터는, 적당한 숙주내에서 핵산을 발현시키도록, 적당한 제어 배열과 기능적으로 연결되어 있다. 이러한 제어 배열로서는, 핵산을 전사시키는 프로모터(promoter), 전사를 제어하는 오퍼레이터 배열, 리보솜(ribosome) 결합부위를 코드하는 배열, 인헨서(enhancer), 폴리아데닐화 배열 및 전사·번역의 종료를 제어하는 배열 등이 포함된다. 벡터에는, 공지의 각종 배열(예를 들면 제한효소 절단부위, 약제내성 유전자 등의 마커 유전자(선택 유전자), 시그널 배열, 리더 배열 등)을 사용할 수 있다. 각종 배열은, 발현시키는 폴리펩티드의 종류, 숙주세포, 배지 등의 조건에 따라 적절하게 선택해서 사용할 수 있다.
벡터로서는, 숙주 게놈에 조립되는 벡터·조립되지 않는 벡터, 세포질에 존재해서 자율적으로 복제하는 에피소말벡터 등을 사용할 수 있다. 그러한 벡터로서는, 예를 들면 레트로바이러스 벡터(온코레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 슈도타입 벡터를 포함한다), 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 시미안바이러스 벡터, 왁시니아바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 엡스타인·바 바이러스(EBV) 벡터, HSV 벡터 등의 바이러스 벡터를 예시할 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 감염된 세포내에서 바이러스가 자기복제할 수 없도록 복제능을 결손시킨 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한 리포솜 및 양이온 지질 등의 축합제와의 병용에 의하여 비바이러스 벡터도 사용할 수 있다. 또한 인산칼슘 형질이입, DEAE-덱스트란, 일렉트로포레이션, 파티클 밤바드먼트(particle bombardment)에 의해 세포에 핵산을 도입할 수 있다.
숙주세포로서는, 공지의 세포를 사용할 수 있다. 예를 들면 대장균(E.coli) 등의 원핵세포, 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO세포), 인간 유래 세포 등의 포유동물세포, 효모, 곤충세포 등의 진핵세포를 들 수 있다.
숙주세포에서 발현된 본 발명의 항원 결합성 프래그먼트는, 숙주세포의 배지, 숙주세포의 추출물 및/또는 용해물로부터 정제할 수 있다. 정제방법은 공지의 방법을 적절하게 조합시켜서 실시할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 이온교환칼럼 상에서의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로오스(heparin sepharose)에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 수지 크로마토그래피(폴리아스파르트산 칼럼 등), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전 및 어피니티 크로마토그래피 등을 적절하게 사용할 수 있다.
(2)본 발명의 조성물
본 발명은, 상기 (1)에 기재된 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 프래그먼트를 포함하는 조성물, 및 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 프래그먼트를 코드하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합성 프래그먼트는, MAGE-A4 유래 펩티드와 HLA-A2의 복합체에 대한 프로브로서 사용할 수 있다. MAGE-A4는 암세포의 내부에서 발현되고, HLA에 의해 제시되는 것이 밝혀져 있어, T세포는 항원인식에 의거하여 당해 암세포를 공격한다. 그래서 본 발명의 항원 결합성 프래그먼트는, 암세포에 대한 프로브, 즉 검출용 조성물 또는 진단용 조성물로서 사용할 수 있다.
그러한 검출방법으로서는, 공지의 검출방법, 예를 들면 ELISA, 형광항체 어세이, 방사성면역 어세이, 방사성면역침강법, 도트블롯어세이(dot blot assay), 저해 또는 경합 어세이, 샌드위치 어세이, 라텍스 비즈 응집 어세이 등을 예시할 수 있다.
진단이나 검출의 대상으로 하는 샘플은, 생물학적 샘플(예를 들면 질환부위의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 뇨(尿) 등의 체액)이 포함된다. 이들 샘플은, 필요에 따라 예비정제, 균질화, 원심분리 또는 희석을 한 후에, 적절한 완충액 중에서 본 발명의 항원 결합성 프래그먼트를 접촉시켜, 항원·항체복합체를 검출한다. 이 경우에, 본 발명의 항원 결합성 프래그먼트를 표지(標識)하더라도 좋고, 표지 2차항체를 사용하더라도 좋다. 표지로서는, 효소(예를 들면 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제 등), 방사성 동위원소(예를 들면 32P, 35S, 3H, 125I 등), 형광성 물질(예를 들면 로다민(rhodamine), 플루오레사민(fluorescamine), 댄실클로라이드(dansyl chloride), 그것들의 유도체 등), 태그 펩티드 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 항원 결합성 프래그먼트는, 의약을 표적에 송달하기 위해서 사용할 수 있다. 의약과 연결시킨 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 프래그먼트는, WT1펩티드와 HLA-A24와의 복합체를 특이적으로 인식하고 의약조성물을 표적으로 송달하기 위해서, 사이토카인(IL2, TNF, IFN-γ 등), 그것들의 수용체 단백질, 세포독(리신, 디프테리아, 겔로닌(gelonin) 등), 방사성 핵종(90Y, 131I, 225Ac, 213Bi, 223Ra 및 227Th 등), 세포(T세포, NK세포 등) 또는 저분자 화합물(칼리키아미신(calicheamicin), 독소루비신(doxorubicin) 등)이 예시된다.
본 발명의 의약조성물의 유효성분의 유효량은, 목적, 종양의 종류, 부위 및 크기 등의 투여 대상의 병상(病狀), 환자의 조건 및 투여 경로등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 의약조성물로서 사용할 때에는, 유효성분에 더하여, 공지의 약학상 허용할 수 있는 각종 성분(예를 들면 담체, 부형제, 완충제, 안정화제 등)을 첨가할 수 있다. 의약조성물은, 조건 에 따라 정제, 물약, 분말, 겔, 분무제, 또는 마이크로캡슐, 콜로이드상 분배계(리포솜, 마이크로에멀션 등) 및 매크로 에멀션 등의 약제형태를 취할 수 있다. 의약조성물의 투여방법으로서는, 정맥내, 복강내, 뇌내, 척수내, 근육내, 안(眼)내, 동맥내, 담관내, 병변내 경로에 의한 주입, 주사, 지속방출형 시스템 제제에 의한 방법을 들 수 있다. 의약조성물은, 수액에 의해 연속적으로 또는 주사로 투여할 수 있다.
본 발명의 의약조성물은, 만성골수성 백혈병, 급성림프성 백혈병(ALL), 급성골수성 백혈병(AML) 등의 조혈기종양이나 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배(胚)세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 중피종 등의 고형암의 치료, 각 종양·고형암의 진단·검출을 위하여 사용된다. 특히 MAGE-A4양성, HLA-A2양성의 조혈기종양·고형암의 치료·진단·검출에 유용하다.
(3)본 발명의 키메라 항원 수용체
본 발명은, 상기 (1)에 기재된 항원 결합성 프래그먼트와 시그널 전달 단백질의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. CAR은, HLA-A2-MAGE-A4 유래 펩티드 복합체를 특이적으로 인식·결합하여 CAR을 발현하는 세포에 시그널 전달할 수 있다. CAR은, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인에는, 본 발명의 항원 결합성 프래그먼트가 포함된다. 세포외 도메인과 HLA-A2-MAGE-A4 복합체가 특이적으로 결합하면, CAR의 세포내 도메인을 통하여 세포내에 시그널이 전달되어, CAR을 발현시키고 있는 세포를 자극한다. 자극을 받은 세포는 사이토카인 등을 생산하여, 복합체가 발현되고 있는 표적세포에 대하여 세포상해성을 발휘하거나, 또는 다른 면역세포의 세포상해성을 유도할 수 있다.
CAR의 세포내 도메인으로서, 동일분자내에 존재하는 세포외 도메인이 MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2 복합체와 상호작용(결합)했을 때에 세포내로 시그널을 전달할 수 있는 것을 사용할 수 있다. 그러한 시그널 전달 단백질로서는, 막 단백질, 시그널 수용체, 사이토카인 수용체로부터 선택되는 단백질이 예시된다. CAR의 세포내 도메인은, CD3zeta(CD3ζ), FCRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d에서 유래하는 1차세포질 시그널 전달 배열을 포함하는 세포내 도메인이 예시된다. 또한 CD2, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD28, CD137(「4-1BB」라고도 한다), CD134, ICOS, GITR 및 CD154에서 유래하는 2차세포질 시그널(공자극 시그널) 전달 배열을 포함하는 세포내 도메인이 예시된다. 또한 IL-2수용체, IL-21수용체에서 유래하는 3차세포질 시그널 전달 배열을 포함하는 세포내 도메인이 예시된다.
CAR의 막관통 도메인은, 예를 들면 T세포 수용체의 α쇄, β쇄, CD3ζ쇄, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137(「4-1BB」라고도 한다), ICOS, CD154, GITR의 막관통 도메인을 사용할 수 있다. 또한 인위적으로 설계한 배열이어도 좋다.
본 발명은, CAR을 코드하는 핵산을 포함한다. CAR을 코드하는 핵산은, 적절한 프로모터의 제어 하에 발현되어지도록 다른 핵산과 연결할 수 있다. 프로모터로서는 구성적으로 발현을 촉진하는 것, 약제 등(예를 들면 테트라사이클린(tetracycline) 또는 독소루비신)에 의해 유도되는 것 등의 어느 것이나 모두 사용할 수 있다. 예를 들면 포스포글리세린산 키나아제(PGK) 프로모터, Xist 프로모터, β-액틴 프로모터, RNA폴리머라아제II 프로모터 등의 포유류 유래 프로모터, SV40 초기 프로모터, 시토메갈로바이러스 프로모터, 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘키나아제 프로모터, 각종 레트로바이러스의 LTR 프로모터 등의 바이러스 유래 프로모터를 사용할 수 있다. 효율적인 핵산의 전사를 달성하기 위하여, 프로모터 또는 전사시작 부위와 협동하는 다른 조절 요소(예를 들면 인헨서 배열 또는 터미네이터 배열)를 포함하는 핵산을 연결하더라도 좋다. 또한 핵산의 발현을 확인하기 위한 마커가 될 수 있는 유전자(예를 들면 약제내성 유전자, 리포터효소를 코드하는 유전자, 또는 형광단백질을 코드하는 유전자 등)를 더 조립해도 좋다.
CAR을 코드하는 핵산은, 상기의 벡터를 사용해서 세포에 도입할 수 있다. 또한 CAR을 코드하는 핵산은, 의약용 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다. CAR을 코드하는 핵산을 포함하는 의약용 조성물은 상기 (2)의 기재에 의거하여 제조 및 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 있어서, CAR을 발현하는 세포가 포함된다. 당해 세포는, 본 발명의 CAR을 코드하는 핵산을 세포에 도입하는 공정에 의해 조제할 수 있다. CAR을 발현하는 세포는, CAR을 통하여 HLA-A2-MAGE-A4 복합체와 결합함으로써 세포내에 시그널이 전달되어 활성화된다. 세포의 활성화는, 숙주세포의 종류나 세포내 도메인에 의해 다르지만, 사이토카인의 방출, 세포증식율의 향상, 세포표면분자의 변화 등을 지표로서 확인할 수 있다. 예를 들면 활성화된 세포로부터의 세포상해성의 사이토카인(종양괴사인자, 림포톡신 등)의 방출은, 복합체를 발현하는 종양세포의 파괴를 가져온다. 또한 사이토카인 방출이나 세포표면분자의 변화에 의하여 다른 면역세포, 예를 들면 B세포, 수상세포, NK세포, 대식세포(macrophage) 등을 자극한다. 따라서 CAR발현세포는 양자면역요법, 특히 MAGE-A4양성, HLA-A2양성의 종양 또는 암에 대한 양자면역요법에 있어서 유용하다.
CAR을 코드하는 핵산을 세포에 도입하는 공정은, 생체외(ex vivo) 또는 생체내(인 비보(in vivo))에서 실시된다. 핵산을 도입하는 세포는, 포유동물, 예를 들면 인간 유래의 세포 또는 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 개 등의 비인간 포유동물 유래의 세포를 사용할 수 있다. 세포의 종류로서는, 예를 들면 혈액(말초혈, 제대혈 등), 골수 등의 체액, 조직 또는 기관으로부터 채취, 단리, 정제, 유도된 세포를 사용할 수 있다. PBMC, 면역세포[수상세포, B세포, 조혈줄기세포, 대식세포, 단구 또는 NK세포, 혈구계 세포(호중구, 호염기구, 단구)], 조혈줄기세포, 제대혈 단핵구, 섬유아세포, 전구지방세포, 간세포, 혈구세포, 피부각화세포, 간엽계 줄기세포, 조혈줄기세포, 지방줄기세포, 다능성 줄기세포, 각종 암세포주 또는 신경줄기세포를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 특히 T세포, T세포의 전구세포(조혈줄기세포, 림프구 전구세포 등), 다능성 줄기세포 또는 이들을 함유하는 세포집단의 사용이 바람직하다. T세포에는, CD8양성 T세포, 또는 CD4양성 T세포, 제어성 T세포, 세포상해성 T세포, 종양침윤 림프구가 포함된다. T세포 및 T세포의 전구세포를 함유하는 세포집단에는 PBMC가 포함된다. 본 발명에서 사용하는 세포는 생체로부터 채취된 것, 그것을 확대, 배양한 것 또는 세포주로서 수립된 것의 어느 것이라도 좋다. 핵산을 도입한 세포 또는 당해 세포로부터 분화시킨 세포를 생체에 이식하는 것이 요구되는 경우에는, 그 생체 자신 또는 동종의 생체로부터 채취된 세포에 핵산을 도입하는 것이 바람직하다.
본 발명의 CAR을 발현하는 세포는, 대상에 투여하기 전에 적절한 배지 및/또는 자극 분자를 사용해서 배양 및/또는 자극을 하여도 좋다. 자극 분자에는 사이토카인류, 적당한 단백질, 그 밖의 성분이 포함된다. 사이토카인류로서는, 예를 들면 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN-γ 등이 예시되며, 적합하게는 IL-2가 예시된다. IL-2의 배지 중의 농도로서는, 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 0.01∼1×105U/mL, 더 적합하게는 1∼1×104U/mL이다. 또한 적당한 단백질로서는, 예를 들면 CD3리간드, CD28리간드, 항IL-4항체가 예시된다. 또한 그 밖에 렉틴 등의 림프구 자극 인자를 첨가할 수도 있다. 또한 배지 중에 혈청이나 혈장을 첨가하더라도 좋다. 이들의 배지 중에 대한 첨가량은 특별하게 한정되지 않지만, 0∼20용량%가 예시되며, 배양단계에 따라 사용하는 혈청이나 혈장의 양을 변경할 수 있다. 혈청 또는 혈장농도를 단계적으로 감소시켜서 사용할 수 있다. 혈청 또는 혈장의 유래로서는, 자기(배양하는 세포와 유래가 같은 것을 의미한다) 혹은 비자기(배양하는 세포와 유래가 다른 것을 의미한다)의 어느 것이라도 좋지만, 적합하게는 안전성의 관점으로부터 자기 유래의 것이 사용된다.
세포의 배양에 사용되는 세포배양용 기재(器材)로서는, 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 샬레, 플라스크, 백, 대형 배양조, 바이오리액터 등을 사용할 수 있다. 또 백으로서는 세포배양용 CO2가스 투과성 백을 사용할 수 있다. 또한 공업적으로 대량의 세포집단을 제조하는 경우에는 대형 배양조를 사용할 수 있다. 또한 배양은 개방계, 폐쇄계의 어느 것이라도 실시할 수 있지만, 적합하게는 얻어지는 세포집단의 안전성의 관점으로부터 폐쇄계로 배양을 하는 것이 바람직하다.
본 발명에는, CAR을 발현하는 세포를 유효성분으로서 함유하는 의약조성물이 포함된다. 본 발명의 의약용 조성물은 비경구적으로 투여한다. 비경구적인 투여방법으로서, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 투여 및 피하투여 등의 방법이 포함된다. 항종양작용을 높이기 위해서, 수막종(髓膜腫) 또는 근방조직, 예를 들면 피하에 투여할 수 있다. 투여량은 대상의 상태, 체중, 연령 등에 따라 적절하게 선택된다. 보통 세포수로서, 체중 60kg에 대하여 1회당 107∼109세포 정도, 바람직하게는 5×107∼5×108세포가 투여된다. 의약조성물은 1회 또는 복수 회에 걸쳐서 투여할 수 있다. 의약조성물은 비경구투여에 적당한 형태, 예를 들면 주사 또는 주입제로 할 수 있다. 의약조성물은 적당하게 약리학적으로 허용할 수 있는 부형제를 포함하고 있어도 좋다. 의약조성물은, 세포를 안정하게 유지하기 위해서, 생리식염수, 인산완충 생리식염수(PBS), 배지 등을 포함해도 좋다. 배지로서는, 특별하게 한정되는 것은 아니지만, RPMI, AIM-V, X-VIVO10 등의 배지를 일반적으로 들 수 있다.
<시험방법>
1.인간 항체 파지 라이브러리를 이용한 항체 스크리닝
(1)pMHC비즈의 제작
pMHC로서의 A2-MAGE-A4 20μg과, 스트렙트아비딘(Streptavidin)을 결합시킨 자기 비즈(磁氣 beads) 200mg을 혼합하고, 0.05% Tween/PBS(-) 용액에서 4℃로 밤새 반응시켰다. 이것에 3μL의 2mM 바이오틴/PBS(-)를 가하여 1시간 반응시켰다. 이것을 0.05% Tween/PBS(-) 용액으로 2회 세정한 후에, 0.05% Tween/PBS(-) 용액 400μL로 현탁했다. 이것을 항원 비즈라고 했다.
(2)인간 항체 라이브러리
수십명의 건강한 사람 유래의 편도선, 제대혈, 말초혈, 골수를 바탕으로 VH와 VL을 PCR로 증폭하고, 이것을 파지미드(phagemid) 벡터 pUC119 상에 조합시켜서 3.4×1012의 레퍼토리(repertoire)의 scFv가 되도록 조제하고, M13 phage의 cp3 상에 디스플레이한 것을 인간 항체 라이브러리라고 했다.
(3)인간 항체 라이브러리를 이용한 스크리닝, 항체의 단리, cp3-배양 상청(上淸(표면에 떠 있는 부분))의 조정
반응액으로서 3.4×1012cfu의 인간 항체 라이브러리 용액, 스트렙트아비딘(Streptavidin)(Pierce사) 100μg, A2-CMV 테트라머(tetramer) 30μg, A2-Foxp69 테트라머(tetramer) 30μg, A2-IDOp41 테트라머(tetramer) 30μg, A2-IDOp195 테트라머(tetramer) 30μg, 감마가드(Gamma guard) 20μg, 2% BSA 솔루션(solution) 100μL, 10% TritonX100 65μL, 1% TritonX100/PBS 1000μL를 제작하고, 실온에서 1시간 회전시켜 혼화(混和)한 후에, A2-MAGE-A4 테트라머(tetramer)를 결합시킨 자성 비즈액 100μl를 섞어서 1시간 회전시켜 혼화했다. 그 후에 마그넷 트랩퍼(도요보(TOYOBO CO., LTD.))로 자성 비즈를 트랩하면서 1% TritonX100/PBS로 5회 세정한 뒤에 PBS로 1회 세정했다. 이것을 배양한 XL1-blue에 가하여 37℃에서 1시간 감염시킨 후에, 원심(遠心)해서 600μL의 2×YTAG배지(200μg/mL 암피실린, 1% glucose/2×YT)로 현탁하고, YTAG 한천배지(200μg/mL 암피실린, 2% glucose/보통 한천배지(닛수이제약(NISSUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)))에 뿌리고, 37℃로 15시간 배양했다. 콜로니(colony)를 30mL의 2×YTAG배지에서 회수하고, 그 중에서 200μL를 20mL의 2×YTAG배지에 가하고, 30μL의 헬퍼 파지(phage) VCSM을 가했다. 37℃에서 30분 감염시킨 뒤에 37℃로 90분 배양했다. 배양액에 80mL의 2×YTAG배지, 50μg/mL 카나마이신 60μL, 1M IPTG 50μL를 가하고, 28℃로 20시간 배양했다. 이것을 원심해서 얻어진 상청에 25mL의 PEG 용액(20% PEG#600, 2.5M NaCl)을 넣어서 혼화하고, 원심해서 침전을 회수하여, 이것을 1mL PBS로 현탁한 뒤에 필터멸균했다. 이상의 조작을 2회 반복하고, 2회째에 종료한 후에, 회수된 대장균을 YTAG 한천배지에 뿌렸다. 30℃로 배양하고, 얻어진 콜로니를 LB배지에서 30℃, 밤새 배양하여, 일부를 사용해서 미니프렙 DNA 키트(miniprep DNA kit)(QIAGEN)로 DNA를 추출하고, 배열결정을 하였다. 또한 배양 50μL를 1.5mL의 2×YTAI(0.5mM의 IPTG를 넣은 2×YT배지)와 섞고, 30℃, 밤새 배양한 뒤, 원심해서 상청을 취했다. 이것을 cp3 상청이라고 했다. 이것을 이용해서 ELISA를 하였다.
2.엔자임 링크드 이뮤노소르벤트 어세이(Enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)
(1)사용한 MHC-펩티드 복합체(모노머)
MAGE-A4 p230, MAGE-A4 p286, MAGE-A3 p195, CMV, MelanA, GP3, HTLV-1, NY-ESO-1 p157, NY-ESO-1 p159, Foxp3 p69, Foxp3 p127, Foxp3 p390, IDO p41, IDO p41, IDO p195 및 IDO p199의 각 펩티드가 HLA-A*0201과 결합한 것을 사용했다.
(2)pMHC의 고상화(固相化)
PBS 50μL로 현탁한 500ng 뉴트라아비딘(neutraavidin)(PIERCE사 제품)을 맥시솝 루즈(Maxisop loose)(Nunc사)에 넣고, 4℃로 밤새 진탕(shake)했다. 용액을 버린 후에, 200μL의 2% BSA/PBS를 넣어 밤새 정치(靜置)하고, 블록킹을 하였다. 용액을 버린 후에, HLA-A2-MAGE-A4 모노머 300ng/50μl PBS를 넣어 4℃로 밤새 진탕했다. 그 후에 PBS로 세정했다.
음성 컨트롤인 HLA-A2-CMV의 고상화도 동일하게 하였다.
(3)ELISA반응 측정
고상화한 항원 플레이트에 100μl의 cp3 배양 상청을 넣고, 실온에서 1시간 진탕한 뒤에, 플레이트를 PBS로 세정하고, 0.05% Tween20/PBS로 2000배 희석한 항cp3 토끼 항체 100μl를 넣고, 실온에서 1시간 진탕했다. PBS로 세정한 후에, 0.05% Tween20/PBS로 4000배 희석한 HRP표지 항토끼IgG(MBL사 제품) 100μl를 넣고, 실온에서 1시간 진탕했다. PBS로 세정한 후에, 0.01% H2O2, 0.1M Na2PO4, 0.1M 시트릭애씨드(citric acid)(pH5.1)로 현탁시킨 OPD(WAKO사 제품)를 반응시켜서 발색을 확인한 뒤에, 2N H2SO4를 첨가해서 반응을 정지시키고, SpectraMaxM2(몰레큘라디바이스사 제품)로 490nm의 파장에서 흡광도를 측정했다.
3.항체의 정제
(1)정제용 벡터로의 대체
scFv-FLAG/His의 형태로 하기 위해서, His/FLAG 발현 벡터로 대체했다. FLAG tag는 FACS에서의 검출용으로, His-tag는 칼럼에서의 정제용으로, 각각 이용했다.
(2)형질전환
단리한 항체 클론 DNA를 SalI(다카라바이오사 제품)로 다이제션(消化)한 후에, T4 DNA ligase로 연결반응을 시킨 뒤에, 컴피턴트 세포(competent cell) DH5α(TOYOBO사 제품)로 형질전환을 하고, 이것을 LBGA 플레이트에 뿌렸다. 30℃로 밤새 배양하고, 얻어진 콜로니를 2×YTAG에서 배양한 후에, 일부를 2×YTAI에서 배양하고, 원심해서 상청을 조정했다.
(3)scFv-FLAG/His 발현의 확인
항원 플레이트에 배양 상청 100μl를 넣고 실온에서 1시간 진탕한 후에, PBS로 세정했다. His-tag의 발현확인의 경우에는, 0.05% Tween20/PBS로 4000배 희석한 anti-His HRP표지항체를 반응시켜서 실온에서 1시간 진탕했다. FLAG-tag의 발현확인의 경우에는, Anti-FLAG(DDDK)항체, HRP표지항체의 순으로 반응시켰다.
항원 플레이트를 PBS로 세정한 후에, 0.01% H2O2, 0.1M Na2HPO4, 0.1M 시트릭애씨드(citric acid)(pH5.1)로 현탁한 OPD(WAKO사 제품)를 반응시켜 발색을 확인한 후에, 2N H2SO4를 첨가해서 반응을 정지시키고, SpectraMaxM2(몰레큘라디바이스사 제품)로 490nm의 파장에서 흡광도를 측정했다.
(4)항체의 러프 정제(粗精製)
전배양(前培養)한 균액(菌液) 2mL를 100mL의 2×YTAI에 넣고, 30℃로 밤새 배양했다. 이것을 원심(8000rpm, 10min, 4℃)하여 상청을 회수하고, 포화 황산 100mL를 넣고 교반(攪拌)했다. 이것을 원심(8000rpm, 20min, 4℃)하고, 얻어진 침전을 PBS 컴플리트(complete) 10.5mL로 현탁했다. 이것을 원심(12000rpm, 1h, 4℃)한 후에, 상청에 PBS로 평형화한 Ni Sepharose excel(GE 헬스케어) 1mL를 가하고, 4℃로 밤새 배양했다. 샘플을 칼럼에 충전하고, 0.5M NaCl PBS, 20mM 이미다졸·0.5M NaCl PBS로 세정하고, 250mM 이미다졸·0.5M NaCl PBS로 용출(溶出)했다. PBS로 투석을 하고, 투석 종료후에 아미콘울트라10K(밀리포어사 제품)로 농축했다. 샘플의 일부를 사용해서 SDS-PAGE를 하고, CBB염색을 해서 밴드를 확인하여, 러프 정제한 항체의 단백농도를 판정했다.
(5)AKTA Prime plus를 이용한 His-tag단백질의 정제
러프 정제한 항체를 AKTA Prime plus(GE 헬스케어)에 의해 HisTRAP 칼럼을 사용해서 더 정제를 하였다. 순서는 부속의 His-tag 정제 프로토콜을 따랐다. 피크가 나타난 프랙션을 회수하여 SDS-PAGE로 확인했다.
4.해리정수(KD값)의 측정
정제한 항체의 KD값은, BiacoreX100(GE헬스케어)을 사용해서 측정했다. 리간드의 고상화에는 Biotion capture kit(GE헬스케어)를 사용했다.
(1)리간드의 고상화
센서 칩 CAP에 HLA-A2-MAGE-A4 p230을 고상화했다. HBS 버퍼(buffer)로 200nM로 조정하고, 적절한 RU(resonance unit)가 되도록 고상화했다.
(2)아나라이트(analyte) 용액의 조정
정제한 항체를 HBS EP + 버퍼(buffer)로 12.5nM, 25nM, 50nM, 100nM, 200nM의 농도가 되도록 조정했다.
(3)KD값의 측정
센서 칩의 플로우 셀에 아나라이트 용액을 흘려서 180초간의 결합반응을 측정했다. 다음에 HBS 버퍼(buffer)로 바꾸어서 300초간의 해리반응을 측정했다. 측정은 아나라이트를 낮은 농도부터 연속해서 흐르는 싱글사이클법의 프로그램을 사용해서 하였다.
전부의 농도에 대해서 반응이 종료하면, 커브 피팅의 프로그램을 사용해서 결합정수를 계산했다.
5.플로사이토메트리(flow cytometry)에 의한 해석(FACS)
(1)사용 기기
플로사이토메트리의 측정에는, FACS Calibur/FACS Cant/FACS CantII(BD)를 사용했다.
(2)사용한 형광표지항체
형광표지항체로서, 표1에 기재되어 있는 것을 사용했다.
(3)테트라머PE
테트라머PE(Tetramer-PE)는, 스트렙트아비딘-PE에 바이오틴화된 모노머가 4개 결합한 것을 의미하고 있고, 항원특이적 T세포의 검출에 사용했다. 사용한 테트라머는, A2-MAGE-A4 p230 테트라머와 A2-NY-ESO-1 p157 테트라머이었다.
6.HLA 스테빌러티 어세이(stability assay)와 scFv 바인딩 어세이(binding assay)
(1)T2세포(HLA-A*02 + 인간 B-T하이브리드 림프아구세포주)
T2세포는, 트랜스포터 어소시에이티드 위드 안티젠 프로세싱(Transporter Associated with Antigen Processing)(TAP) 결손주로서, 세포내 단백이 HLA에 제시되지 않는다고 하는 특징을 가진다.
(2)T2세포에 대한 펩티드 펄스
인간 RPMI1640 중에 종농도(終濃度) 10μM가 되도록 펩티드를 가하여 실온에서 15분간 두고, 20% FCS 인간 RPMI1640을 FCS가 10%가 되도록 가했다. CO2 인큐베이터(incubator)에서 37℃로 45min 인큐베이트한 뒤에, 두번 세정을 한 후에 어세이(assay)에 사용했다.
(3)HLA 스테빌러티 어세이(stability assay)
펩티드 펄스를 한 T2세포에 항HLA-A2 Alexa Fluor488을 1시간 반응시켜 FACS로 검출함으로써 T세포 표면 상에서 안정화한 HLA의 양을 측정했다.
(4)scFv 바인딩 어세이(binding assay)
펩티드 펄스를 한 T2세포에 취득한 항체를 1시간 반응시키고, 항FLAG 항체를 1시간, 항마우스FITC 항체를 1시간 반응시켜 FACS로 검출했다.
(5)1아미노산 치환 펩티드와 리스크 펩티드
표2에 나타나 있는 바와 같이 MAGE-A4 p230-239의 10개의 아미노산 배열 중에서, 1군데의 아미노산을 알라닌(A), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)으로 치환한 1아미노산 치환 펩티드를 합성하고, 각 펩티드의 IC50을 조사했다. 각 펩티드는 DMSO로 종농도 10mM이 되도록 조정했다.
MHC IC50은 IEDB(http://tools.immuneepitope.org/processing/)에 의해 계산되는 이론값으로, 숫자가 낮을수록 HLA-A*0201과 펩티드와의 결합이 강한 것을 나타내고 있다.
표2에는, 1아미노산 치환 펩티드의 아미노산 배열과 IC50을 나타냈다.
표3에는, MAGE family 펩티드와 MAGE#17항체의 인식에 관여하는 아미노산으로부터 BLAST서치에 의해 밝혀낸 리스크 펩티드의 아미노산 배열과 IC50값을 나타냈다.
7.CAR의 컨스트럭트와 벡터의 구축
(1)MAGE#17 28z CAR
도1에는, CAR의 컨스트럭트(construct)의 배열 이미지를 나타냈다. 이 컨스트럭트에는, 5'측으로부터 Leader, VH, VL, CL, CD28TM, CD28ICD(CD28의 세포내 도메인) 및 CD3zeta(CD3ζ)쇄가 연결되어 있다. 이 중에서 VH, VL이 MAGE＃17 scFv이다.
(2)CAR의 구축
도2에는, CAR의 구축 스텝을 도식적으로 나타냈다. 각 스텝을 설명하면 다음과 같다.
우선, scFv-cp3을 주형으로 하여 PCR반응에 의하여 VH-VL의 5'측에 EcoRI 인식부위를 가지는 Leader를, 3'측에 AscI 인식부위를 가지는 CL을 각각 부가했다. 다음에 이 PCR산물을 EcoRI와 AscI로 처리한 프래그먼트와, 28z CAR벡터를 EcoRI와 AscI로 처리한 프래그먼트를 리가아제(ligase)로 반응시켜, CAR 28z를 얻었다.
8.인간 림프구 조정
인간 림프구는, 건강한 도너(donor)에게서 제공을 받은 혈액으로부터, Ficoll-PaqueTM PLUS(17-1440-03, GE Healthcare)를 사용해서 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cells)를 분리함으로써 얻었다. 본 연구에 사용한 인간 말초혈 등의 검체의 채집, 해석은 헬싱키선언에 따라 행하여졌고, 모두 일본국 미에대학 의학부 연구윤리위원회에서 승인된 프로토콜에 따라, 피험자 본인의 서면에 의한 동의서를 얻어서 실시되었다.
채취한 검체는, 본인 특정이 불가능한 암호화가 되어 도난방지처치를 실시한 냉장고, 액체질소탱크에 저장했다. 피험자 개인정보에 관해서는 익명화되어, 개인의 프라이버시, 유전자해석의 결과가 외부에 누설되지 않도록 엄중한 주의, 처치가 시행되었다.
9.일렉트로포레이션법에 의한 세포에 대한 mRNA 도입
(1)mRNA의 제작
제작한 CAR의 DNA를 1개 쇄로 절단하여 linear DNA 템플레이트를 제작했다. Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System(Promega)의 키트를 사용해서 DNA의 정제를 하였다. 정제한 샘플을 mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(Life technologies)를 사용해서 mRNA의 제작을 하였다.
(2)바이오 애널라이저에 의한 체크
바이오 애널라이저(Agilent Technologies)를 사용하여 mRNA의 polyA 부가를 확인했다.
(3)PBMC배양 플레이트의 제작
Anti-CD3항체(OKT-3 eBioscience)를 종농도 5μg/mL, RetroNectin(다카라바이오)을 종농도 25μg/mL가 되도록 ACD-A액(TERUMO)으로 희석한 뒤, 12웰 플레이트(well plate)(Nunc)의 각 웰(well)에 대하여 400μL씩 넣고, CO2 인큐베이터에서 37℃, 5-10시간 정치했다.
(4)CM(caluture medium)의 제작
림프구용 배지 GT-T503 50mL에 대하여, human IL-2(600IU)를 50μL, 알부미나(25% HSA) 400μL, 림프구 도너의 플라즈마(plasma) 300μL를 가한 것을 PBMC배양의 배지로 했다.
(5)PBMC의 분리 및 배양
건강한 사람 혈액으로부터 Ficoll을 사용해서 분리한 말초혈단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 2×105개/mL가 되도록 CM으로 현탁하여 2.5mL를 플레이트에 넣고, CO2 인큐베이터에서 37℃, 4일간 배양했다.
(6)일렉트로포레이션
분리 10일 후의 PBMC에, 제작한 mRNA를 일렉트로포레이션으로 도입했다. 도입후 24시간 이내에 어세이(assay)에 사용했다.
10.레트로바이러스에 의한 세포에 대한 유전자도입(감염실험)
(1)패키징(Packaging)세포 plat-A에 의한 레트로바이러스의 제작
패키징(Packaging)세포 plat-A에 FuGENE(promega)을 사용해서 CAR의 유전자를 도입하고 2일간 배양한 뒤에, 상청을 회수해서 바이러스액으로 했다.
(2)PBMC의 분리 및 배양
상기 9.(3)∼(5)와 동일한 순서를 따랐다.
(3)레트로바이러스 감염용 플레이트(plate)의 제작
레트로넥틴(RetroNectin)을 ACD-A액으로 희석하고 종농도 20μg/mL가 되도록 조정했다. 이것을 24웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 대하여 500μL씩 넣고, 4℃로 O/N(밤새) 정치했다. 바이러스액을 넣기 전에 ACD-A로 두번 세정했다.
(4)감염용 레트로바이러스 플레이트(plate) 조정, 세포에 대한 감염
상기 10.(1)에서 제작한 바이러스액을 1mL씩 레트로바이러스 감염용 플레이트(plate)에 넣고 2000×g, 2시간, 32℃로 원심하여, 바이러스를 플레이트에 코트했다. 계속하여 이것을 1.5% 알부미나/PBS로 두번 세정했다.
(5)PBMC의 레트로바이러스 감염 CAR-T세포의 제작
상기 10.(2)에서 배양한 PBMC를 회수하여 4×105개/mL가 되도록 CM으로 희석한 뒤에, 950μl를 레트로바이러스 감염용 플레이트(plate)에 뿌리고, 1000×g, 10분간, 32℃로 원심한 후에 CO2 인큐베이터에서 37℃로 배양했다.
제작한 CAR-T세포는 PBMC의 분리로부터 세서 12∼14일째에 어세이(assay)에 사용했다.
(6)컨트롤 세포의 제작
상기 10.(2)에서 배양한 것의 일부를 컨트롤 세포(유전자도입 조작 없는 세포)로서 사용했다.
11.인 비트로(in vitro) 실험에 사용한 튜머 셀 라인(tumor cell line)의 특징
본 실시형태에 있어서, 인 비트로(in vitro) 실험에 사용한 세포주의 특징을 표4에 나타냈다.
12.IF-γ 릴리즈 어세이(release assay)
이바이오사이언스(eBioscience)의 키트(kit)를 사용하여 배양액 중에 포함되는 IFN-γ의 양을 ELISA로 측정했다.
10×코팅 버퍼(Coating buffer)를 정제수로 10배 희석하여 코팅 버퍼(Coating buffer)를 조정했다. 코팅 버퍼(Coating buffer) 12mL에 대하여 1차항체를 48μL 첨가하고, 96웰(well) 평평한 바닥 플레이트에 100μL/well씩 첨가했다. 이것을 4℃로 밤새 정치한 후에 0.05% PBS-T로 5회 세정했다. 5×Assay diluents를 정제수로 5배 희석하여 Assay diluents를 조정했다. Assay diluents 200μL/well씩 가했다. 실온에서 1시간 블록킹한 후에 0.05% PBS-T로 5회 세정했다. IFN-γ는 최고농도를 1000pg/mL로 조정하고, 이것을 2배씩 7단계로 희석하여 스탠다드(standard)로 했다. 샘플과 스탠다드(standard)를 플레이트에 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 후에, 0.05% PBS-T로 5회 세정했다. Assay diluents 12mL에 대하여 2차항체를 48μL 첨가하고, 100μL씩 웰(well)에 가했다. 실온에서 1시간 반응시킨 후에 0.05% PBS-T로 5회 세정했다. Assay diluents 12mL에 스트렙트아비딘(Streptavidin)-HRP를 48μL 첨가하고 100μL/well씩 가했다. 어두운 곳(暗所), 실온에서 30분간 반응시킨 후에 0.05% PBS-T로 7회 세정했다. TMB ㅅ서브스트레이트 솔루션(bstrate solution)을 100μL씩 가하여 어두운 곳, 실온에서 15분간 반응시킨 후에, 0.18M H2SO4를 50μL씩 가하여 반응을 정지시켰다. 즉시 마이크로플레이트 리더 모델(microplate reader Model) 680(Bio-Rad)으로 파장 450nm에서 계측했다.
13.인트라셀룰라 사이토카인 스테이닝(intracellular cytokine staining)(ICS)
타겟 세포를 1×105개/mL, 이펙터 세포를 1×105개/mL가 되도록 조정했다. APC Anti human CD107a를 1샘플당 0.5μL씩 첨가하고, 타겟 세포:이펙터 세포=1:1로 96웰 플레이트(well plate)(U)에서 37℃로 1시간 공배양을 하였다. 그 후에 각 웰(well)에 대하여 0.7μL씩 golgistop(Protein Transport Inhibitor)을 첨가하고, 37℃로 4시간 배양했다. 각 웰(well)의 세포를 V형 96웰 플레이트(well plate)로 옮기고, 1200rpm, 5분간 4℃로 원심을 한 뒤에 0.5% BSA/PBS 2회 세정했다. APC-cy7 Anti-Human CD4 및 FITC Anti-human CD8을 각 웰(well)에 대하여 0.5μL씩 첨가하고, 차광(遮光)으로 빙상(氷上)에서 20분간 정치하고, 0.5% BSA/PBS로 2회 세정을 했다. 세포고정액(cytofixl cytoperm:BD)을 100μL 첨가하고, 차광조건으로 빙상에서 20분간 정치한 후에, perm/wash(BD) 100μL를 첨가해서 원심했다. 그 후에 perm/wash액으로 2회의 세정을 했다. 각 웰(well)에 0.5μL씩 V450 IFN-γ, PE-Cy7 TNF-α를 첨가했다. 차광조건하에서 빙상에서 30분간 정치한 후에, 0.5% BSA/PBS로 2회의 세정을 했다. 그 후에 FACSCanto II 플로사이토미터(BD)로 측정을 하고, FACS Diva Software(BD)로 해석을 했다.
14.APC에 의한 롱펩티드의 혼입 크로스 프레젠테이션
(1)MAGE-A4 롱펩티드
MAGE-A4 롱펩티드의 아미노산 배열은 NYKRCFPVIF GKASEGVYDG REHTVYGEPR KAETSYVKVL EHVVRVNARV RI(배열번호28)이며, 분자량은 6006.811이었다. 이 롱펩티드는, A24 MAGE-A4 143-151 에피토프(NYKRCFPVI:배열번호29), A2 MAGE-A4 230-239에피토프(GVYDGREHTV:배열번호1) 및 헬퍼 에피토프(AETSYVKVLE HVVRVNARVR I:배열번호30)를 연결해서 설계했다.
(2)CHP-롱펩티드
CHP-롱펩티드는, 드러그딜리버리시스템인 CHP나노겔에 MAGE-A4 롱펩티드가 싸인 것을 의미한다. 이 물질을 사용함으로써 세포성 면역유도를 기대할 수 있다(비특허문헌5).
(3)CD3 네거티브 비즈 셀렉션(negative beads selection)
인간 림프구를 1×107개당 2% FCS/PBS 80μL로 현탁했다. 여기에 CD3 마이크로 비즈(Micro Beads)(Miltenyi Biotec)를 20μL 가하여 잘 혼합했다. 차광상태로 해서 4℃로 15분간 반응시킨 후에 10배량의 2% FCS/PBS로 세정했다. 세포를 2% FCS/PBS 3mL로 현탁해서 세포현탁액으로 했다. MACS 칼럼을 세트한 MACS 세퍼레이터(Separator)에 세포현탁액을 통과시켰다. 칼럼을 빠져나온 분획을 CD3 음성분획이라고 하고 APC로서 사용했다.
15.사이토탁시서티 어세이(Cytotoxicity assay)
(1)Cr 릴리즈 어세이(release assay)
표적세포를 원심하여 모으고, 100% FCS로 1×106세포가 50μL로 현탁되어 있는 상태로 했다. 이것에 50μCi(3.7×106Bq)의 51CR을 첨가하고, CO2 인큐베이터에서 37℃로 1시간 배양했다. 이펙터 세포는 ETratio에 따라10% FCS·RPMI1640으로 세포수를 조정하여, U자형 96웰 플레이트(well plate)에 파종했다. 배양 종료후에 10% FCS·RPMI1640으로 3회 세정했다. 세포를 1×105개/mL가 되도록 10% FCS·RPMI1640로 현탁하고, 1×104개/100μL/well이 되도록 U자형 96웰 플레이트(well plate)에 파종했다. CO2 인큐베이터에서 37℃로 8시간 배양했다. 배양 종료후에 1200rpm, 5분간 4℃의 원심을 하고, 해석용의 플레이트에 상청을 30μL씩 옮기고, 하룻밤 풍건(風乾)에 의해 건조시켰다. 51Cr의 양을 신틸레이션 카운터 MicroBeta2(퍼킨엘머)에 의해 측정했다. 세포상해활성의 계산은 하기 식으로 구했다. 최대 릴리스값(maximam release)은, 1% NP-40을 100μL 첨가했을 때의 측정치로 했다.
세포상해활성(%）＝100×(측정치(cpm)-자발 릴리스값(cpm))/(최대 릴리스값(cpm)-자발 릴리스값(cpm))
16.NOG마우스를 사용한 인 비보(in vivo) 암치료 모델 실험
(1)사용 마우스
NOG마우스(NOD/Shi-scid, IL-2RγKO Jic)는 일본 크레아주식회사로(CLEA Japan, Inc.)부터 구입했다. 실험에는 암컷의 마우스를 사용하고, 7-8주령(週齡)에 실험에 사용했다. 실험동물을 사용한 T세포수주요법, 유전자면역요법의 연구는, 일본국 미에대학의 재조합DNA실험심사위원회, 미에대학 의학부 연구윤리위원회, 동물실험심사위원회에 있어서 승인을 받았다. 마우스는 일본국 미에대학 생명과학연구지원센터 동물실험시설에서 사육했다.
(2)인간 종양의 이식과 방사선 전신조사(TBI)
전처치(前處置)로서, 세포수주의 전일(前日)에 NOG마우스에 방사선 전신조사(TBI) 2.5Gy를 하였다. 그 전처치에 의하여 레시피언트(recipient) 체내의 림프구수를 감소시켜, 수주한 도너 림프구가 생착(生着)하기 쉬운 상태로 했다. 수주한 CAR-T세포 및 인간 림프구는 1×107개/마리로 했다. 각 세포는, 미정맥(尾靜脈)으로부터 NOG마우스에 수주했다. 체중은 2-3일마다 측정했다.
NOG마우스에 대한 종양의 이식은 CAR-T세포를 수주하는 7일 전에 하고, 마우스 우체(右體)측에 NW-MEL-38(A2양성 MAGE-A4양성)을 2.5×106개/마리, 마우스 좌체(左體)측에 HCT116(A2양성 MAGE-A4 음성)을 2.5×106개/마리로 피하주사했다. 종양지름은 2-3일마다 측정했다.
(3)수주세포의 제작
수주용의 CAR-T세포는, 상기 「10.레트로바이러스에 의한 세포에 대한 유전자도입」의 방법에 따라 제작했다.
(4)안와채혈에 의한 마우스 말초혈 중의 PBMC분리
마우스의 안와(眼窩)로부터 말초혈을 채취하고, Ficoll을 사용해서 PBMC를 분리했다. A2-MAGE-A4 테트라머, 인간 CD4CD8형광항체를 사용해서 염색하고, FACS로 수주한 세포를 확인했다.
(5)TIL(tumor infiltrating lymphocytes)의 확인
마우스로부터 채취한 종양을 갈아서 으깨고, A2-MAGE-A4 테트라머, 인간 CD4CD8형광항체를 사용해서 염색하고, FACS로 수주한 세포를 확인했다.
(6)면역염색
마우스로부터 절제한 암을 액체질소로 얼리고, 크라이오스탯(cryostat)으로 동결 절편을 제작했다. DAPI, 인간 CD4-FITC, 인간 CD8-FITC에 의해 염색을 하고 형광현미경으로 관찰했다.
17.zG형 CAR도입 CD8양성 T세포 및 4-1BBz형 CAR도입 CD8양성 T세포를 사용한 인 비트로 시험
ICD부분의 차이에 의한 CAR-T세포의 효과를 확인했다. 구체적으로는, CD28의 것(28z)부터 GITR의 것(zG) 및 CD137의 것(4-1BBz)으로 한 것을 제작하고, 그 효과를 확인했다. CAR zG는, 도21에 나타나 있는 바와 같이ICD로서 CD28의 것에 대신하여, GITR(글루코코르티코이드 유도 종양괴사인자 수용체)을 사용했다. 마찬가지로 CD28의 것에 대신하여, CD137(4-1BBz)의 것을 사용했다.
컨트롤로서, CAR 비도입 CD8양성 T세포(NGMC)를 사용했다.
<시험결과>
1.HLA-A2-MAGE-A4를 인식하는 항체의 단리와 평가
MAGE-A4(HLA-A2-MAGE-A4)는 멜라노마에서의 발현이 높은 것이 알려져 있다. 그래서 MAGE-A4를 인식하는 복수의 항체를 인간 항체 라이브러리를 사용한 스크리닝에 의해 단리했다. 항체의 단리에는 파지 디스플레이법을 사용했다. 이 방법에서는, 파지코트단백 cp3의 일부로서 scFv가 제시되고, 항원에 대하여 결합성이 높은 클론을 ELISA에 의해 좁혀 갈 수 있다. 약 1500의 클론을 픽업하고, scFv-CP3의 상태로 ELISA를 하였다. 포지티브 타겟인 HLA-A2-MAGE-A4에 반응하고, 네거티브 타겟인 A2-CMV에 반응하지 않는 것을 선택했다. 선택한 항체에 대해서, 결합특이성의 검토를 하기 위해서, 복수의 펩티드-MHC 복합체(pMHC)를 사용해서 ELISA를 하였다. HLA-A2-MAGE-A4 p230, MAGE-A4 p286, MAGE-A3 p195, CMV, MelanA, GP3, HTLV-1 p11, NY-ESO-1 p157, NY-ESO-1 p159, Foxp3 p69, Foxp3 p127, Foxp3 p390, IDO p41, IDO p41, IDO p195, IDO p199의 각 pMHC 모노머를 고상화하고, 선택한 항체로 ELISA를 하였다. 도3에는 ELISA의 결과의 일례를 나타냈다.
HLA-A2-MAGE-A4에 강한 결합성을 나타내는 클론의 배열을 비교한 결과, HLA-A2-MAGE-A4에 대하여 특이적인 반응을 나타내는 15개의 클론을 얻었다. 이 중에서 결합력이 높은 클론 5개의 클론, 즉 MAGE＃17, ＃86, ＃209, ＃345, ＃672를 후보의 클론으로서 해석을 진행시켰다.
다음에 MAGE#17항체에 대해서, BiacoreX100에 의한 KD값의 측정을 했다. Biacore에 있어서의 KD값 측정은, 시간경과에 대한 검출감도(레저넌스, 칩상의 질량변화를 반영한다)의 동적변화를 측정함으로써 구했다. 동적변화의 커브로부터 해리속도정수(Kd)와 결합속도정수(Ka)를 구하고, 그 2개의 정수의 비로부터 그 결합정수를 구했다. 측정한 결과, MAGE#17의 결합정수는 22nM이었다(도4).
2.취득한 항체의 A2-MAGE-A4 복합체에 대한 인식특이성과 리스크 항원에 대한 검토
T2세포는, 트랜스포터 어소시에이티드 위드 안티젠 프로세싱(Transporter Associated with Antigen Processing)(TAP) 결손주로서, 세포내 단백이 HLA에 제시되지 않는다. T2세포에 펩티드를 펄스하면 T2상의 HLA가 안정화하기 때문에, 형광표지된 항HLA항체를 사용함으로써 HLA발현량을 확인할 수 있고, 그 펩티드가 HLA에 어느 정도 결합하고 있는지를 알 수 있다.
MAGE-A4 p230, CMV, DMSO의 각 펩티드를 펄스한 T2세포에, 취득한 항체MAGE＃17, #86, #209, #345, #672를 반응시켜, FACS로 시프트량을 확인했다. MAGE-A4 p230을 펄스한 T2세포에 있어서만, 취득한 항체 클론 MAGE#17, #86, #209, #345, #672의 모두에 있어서 시프트량의 변화가 확인되었다(도5).
다음에 항체의 인식에 관여하는 아미노산을 조사하기 위해서, MAGE-A4 p230(GVYDGREHTV:배열번호1)의 아미노산을 1개씩별로 아미노산(주로 알라닌으로) 치환한 펩티드를 제작하고, HLA-A*0201과의 결합력을 IEDB(Immune Epitope Database)를 사용해서 조사하고, MHC IC50을 구했다(표2). MHC IC50은 IEDB에 의해 계산되는 이론값으로서, 숫자가 낮을수록 HLA-A*0201과 펩티드와의 결합이 강한 것을 나타낸다. T2세포에 알라닌 치환한 펩티드를 펄스하고, T2세포 표면 상의 HLA의 양을 FACS로 측정했다(도6). 펩티드가 강하게 HLA에 결합할수록 peptide-HLA의 구조가 안정화하여 FACS의 시프트량이 증가하기 때문에, MFI의 값은 펩티드와 HLA의 결합력의 지표가 된다. 일부의 펩티드를 제외하고, MFI의 값과 MHC IC50값과는 서로 대응했다.
다음에 T2세포에 알라닌 치환한 펩티드를 펄스하고 MAGE#17을 반응시켜, 항체의 인식에 관여하는 아미노산을 조사했다(도7). 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 8A에서 MFI의 값이 저하했으므로, 이 7개의 아미노산이 인식에 관여하고 있다고 판단했다. GVYDGRxHxx의 아미노산 배열로 BLAST서치를 하여 리스크가 되는 펩티드를 추출했다(표3). 리스크 펩티드를 T2세포에 펄스하고, T2세포 표면 상의 HLA의 양을 FACS로 측정했다. 도6에 나타내는 결과와 마찬가지로, MFI의 값은 MHC IC50의 값과 대응하고 있었다(도8).
다음에 리스크 펩티드를 T2세포에 펄스하고 MAGE#17을 반응시켜, 리스크 펩티드를 인식하지 않는 것을 확인했다(도9). 동일한 어세이를 다른 클론#86, #209, #345, #672에서도 실시한 결과, 인식에 관여하는 아미노산의 수가 가장 많았던 클론이 #17이었다. 이 때문에 MAGE#17을 최종적인 후보로 했다.
MAGE#17의 염기배열(배열번호31)과 펩티드 배열(배열번호32)을 나타냈다.
MAGE＃17의 염기배열(배열번호31）： CAGGTCCAGC TGGTACAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGAGG CACCTTCAGC AGCTATGCTA TCAGCTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATGGGAGGG ATCATCCCTA TCTTTGGTAC AGCAAACTAC GCACAGAAGT TCCAGGGCAG AGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA GCAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGATCCCCC CGGCGGGCAT ATCATGATGC TTTTGATATC TGGGGCCAAG GGACAATGGT CACCGTCTCT TCAGGTGGAG GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC AGCGGCGGTG GCGGGAGTTC CTATGAGCTG ACTCAGCCAC CCTCGATGTC AGTGGCCCCA GGAAAGACGG CCAGCATTAC CTGTGGCGGA GACCATATTG GAAGTAAAAG TGTTCACTGG TACCAGCAGA AGCCAGGCCA GGCCCCTGTA CTGGTCGTCT ATGATGATAG CGACCGGCCC TCAGGGATCC CTGAGCGATT CTCTGGCTCC AACTCTGGGA ACACAGCCAC TCTGACCATC AGCGGGACCC AGGCTATGGA TGAGGCTGAC TATTACTGTC TGGCGTGGGA CAGCAGCACT GCGATCTTCG GCGGAGGGAC CAAGCTGACC GTCCTC.
MAGE＃17의 아미노산배열（배열번호32）： QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGG IIPIFGTANY AQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSP RRAYHDAFDI WGQGTMVTVS SGGGGSGGGG SGGGGSSYEL TQPPSMSVAP GKTASITCGG DHIGSKSVHW YQQKPGQAPV LVVYDDSDRP SGIPERFSGS NSGNTATLTI SGTQAMDEAD YYCLAWDSST AIFGGGTKLT VL.
상기 각 배열은, 하기에 나타나 있는 바와 같이, VH(배열번호33), sc(배열번호34) 및 VL(배열번호35)의 염기배열, 및 VH(배열번호36), sc(배열번호37) 및 VL(배열번호38)의 아미노산 배열을 결합한 것으로 되어 있다.
VH의 염기배열（배열번호33）： CAGGTCCAGC TGGTACAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGAGG CACCTTCAGC AGCTATGCTA TCAGCTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATGGGAGGG ATCATCCCTA TCTTTGGTAC AGCAAACTAC GCACAGAAGT TCCAGGGCAG AGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA GCAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGATCCCCC CGGCGGGCAT ATCATGATGC TTTTGATATC TGGGGCCAAG GGACAATGGT CACCGTCTCT TCA.
sc부분의 염기배열(배열번호34) : GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCAGC GGCGGTGGCG GGAGTTCCTA T.
VL부분의 염기배열(배열번호35）： GAGCTGACTC AGCCACCCTC GATGTCAGTG GCCCCAGGAA AGACGGCCAG CATTACCTGT GGCGGAGACC ATATTGGAAG TAAAAGTGTT CACTGGTACC AGCAGAAGCC AGGCCAGGCC CCTGTACTGG TCGTCTATGA TGATAGCGAC CGGCCCTCAG GGATCCCTGA GCGATTCTCT GGCTCCAACT CTGGGAACAC AGCCACTCTG ACCATCAGCG GGACCCAGGC TATGGATGAG GCTGACTATT ACTGTCTGGC GTGGGACAGC AGCACTGCGA TCTTCGGCGG AGGGACCAAG CTGACCGTCC TC.
VH부분의 아미노산 배열(배열번호36) : QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGG IIPIFGTANY AQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSP RRAYHDAFDI WGQGTMVTVS S.
sc부분의 아미노산 배열(배열번호37) : GGGGSGGGGS GGGGSSY.
VL부분의 아미노산 배열(배열번호38) : ELTQPPSMSV APGKTASITC GGDHIGSKSV HWYQQKPGQA PVLVVYDDSD RPSGIPERFS GSNSGNTATL TISGTQAMDE ADYYCLAWDS STAIFGGGTK LTVL.
3.MAGE#17 CAR은 타겟 암세포를 특이적으로 인식해서 IFN-γ의 생산이 증대했다
항체 클론 MAGE#17의 특이성을 확인할 수 있었으므로, MAGE#17을 CAR의 벡터와 대체했다. 다음에 mRNA를 조정해 바이오애널라이저로 확인한 뒤에, 일렉트로포레이션법에 의하여 인간 말초혈 림프구(PBMC)에 CAR의 유전자를 도입했다. 도입한 CAR이 정상적으로 발현하고 있는지 아닌지를 테트라머 염색에 의해 확인했다. 그 결과, CAR-T세포의 CAR양성률은 CD8에서 98.8%, CD4에서 98.5%이었다(도10). CAR-T세포와 펩티드 펄스를 한 T2세포를 24시간 공배양하여 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ를 측정하였더니, MAGE-A4를 펄스한 T2세포 특이적으로 IFN-γ의 산출이 증대했다. 컨트롤 세포(유전자도입하지 않고 있는 세포)를 사용하여 동일하게 시험을 했다. 또한 타겟 세포인 A2양성 MAGE-A4양성의 NW-MEL-38, LB-23에서는, 오프 타겟인 LC-1/sq, MEL72와 비교하여 종양 특이적인 IFN-γ의 산출이 나타났다(도11).
mRNA에 의한 CAR의 발현은 일과성인 것이기 때문에, 항상적인 CAR의 발현을 위하여 레트로바이러스에 의한 유전자도입을 했다. CAR 도입의 레트로바이러스 벡터를 구축하고, 패키징(packaging) 세포 plat-A에 의해 레트로바이러스를 제작하고, PBMC에 감염시킴으로써 CAR-T세포를 제작했다. 유전자도입은, 상기 「10.레트로바이러스에 의한 세포에 대한 유전자도입」의 방법을 따랐다. CAR의 발현을 테트라머 염색에 의해 확인했다. 그 결과, CAR-T세포의 CAR양성률은 CD8에서 59.3%, CD4에서 49.5%이었다(도12).
레트로바이러스에 의해 유전자도입한 CAR-T세포와 펩티드 펄스를 한 T2세포를 24시간 공배양하여 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ를 측정하였더니, MAGE-A4를 펄스한 T2세포 특이적으로 IFN-γ의 산출이 증대했다. 컨트롤 세포(유전자도입하지 않고 있는 세포)를 사용하여 동일하게 시험을 했다. 또한 타겟 세포인 A2양성 MAGE-A4양성의 NW-MEL-38, LB-23에서는, 오프 타겟인 LC-1/sq, MEL72와 비교하여 종양 특이적인 IFN-γ의 산출이 나타났다(도13). mRNA, 레트로바이러스 벡터에 의한 CAR유전자의 도입으로, 양자 모두 CAR이 발현되고, 특이적으로 종양을 인식하고, IFN-γ를 산출하는 것을 확인할 수 있었다.
4.MAGE#17 CAR을 유전자도입한 CAR-T세포는, 타겟 암세포를 특이적으로 인식해서 세포장해성 활성을 나타냈다
CAR-T세포는, 암세포 상에 발현되고 있는 A2-MAGE-A4를 항원으로서 인식해서 활성화하고, 세포상해활성을 발휘해서 표적세포를 상해하는 것이 기대되었다. T세포의 활성화의 지표로서 알려져 있는 분자로서, IFN-γ, TNF-α, CD107a 등이 있고, 이들은 T세포의 활성화에 따라 발현이 항진한다. 그래서 펩티드 펄스한 T2세포, 타겟 세포와 공배양한 MAGE#17 CAR의 세포내 사이토카인 염색(intracellular cytokine staining:ICS)을 했다.
그 결과, MAGE-A4 p230을 펄스한 T2세포와의 공배양에서, IFN-γ, TNF-α, CD107a로 염색된 CAR-T세포의 비율이 증가했다(도14). 또한 타겟 세포와의 공배양에서는, A2양성 MAGE-A4양성의 NW-MEL-38, LB-23과의 공배양에 있어서 IFN-γ, TNF-α, CD107a로 염색된 CAR-T세포의 비율이 증가했다(도15).
5.MAGE-A4 Long펩티드를 삽입한 항원제시세포(antigen presenting cell:APC)의 항원제시에 의하여 CAR-T세포의 IFN-γ의 생산이 증대했다
건강한 사람의 말초혈로부터 PBMC를 분리하고, CD3 마그넷 비즈(magnet beads)를 사용하여 네거티브 셀렉션을 하고, CD3-의 분획을 항원제시세포(antigen presenting cell:APC)로서 사용했다. MAGE-A4 p230이 제시되는 APC로서 A2-APC, 네거티브 컨트롤의 APC로서 A24-APC를 사용했다. MAGE-A4 Long펩티드, CHP-MAGE-A4 Long펩티드를 종농도 10μM이 되도록 가하여 밤새 배양을 하고, CAR-T와 24시간 공배양했다. CAR-T세포에 대한 유전자도입은, 상기 「10.레트로바이러스에 의한 세포에 대한 유전자도입」의 방법을 따랐다. 그 결과, A2-APC에 MAGE-A4 Long펩티드를 펄스한 것과의 공배양에서, 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ의 값이 상승했다(도16).
MAGE-A4 Long펩티드가 APC에 삽입되고, MAGE-A4 p230이 MHC-class I에 크로스 프레젠테이션되어, 그것을 인식한 CAR-T의 IFN-γ 생산이 특이적으로 증대하는 것이 확인되었다. 한편, 드러그딜리버리시스템인 CHP나노겔로 싸여진 CHP-MAGEA4 롱펩티드에 있어서는 IFN-γ의 특이적인 생산은 보이지 않았다.
6.MAGE#17 CAR을 유전자도입한 CAR-T세포는 타겟 암세포를 특이적으로 상해했다
51Cr 릴리즈 어세이(release assay)에 의해, MAGE#17 CAR의 특이적인 세포장해활성이 일어나는지 아닌지를 확인했다. CAR-T세포와 타겟의 암세포의 비율을 ET ratio(effector/타겟 ratio)로 하여, 크롬을 삽입한 타겟의 암세포와 CAR-T세포를 ET ratio 10:1, 3:1, 1:1로 8시간 공배양하고, 상청에 포함되는 51Cr의 방사선량의 값으로부터 세포장해율(%lysis)을 구했다. CAR-T세포에 대한 유전자도입은, 상기 「10.레트로바이러스에 의한 세포에 대한 유전자도입」의 방법을 따랐다.
그 결과, MAGE-A4 p230 펩티드를 펄스한 T2세포에서 MAGE-A4 특이적인 세포장해가 확인되었다(도17). 또한 타겟 세포에 있어서도, A2양성 MAGE-A4양성의 NW-MEL-38에 특이적인 세포장해가 확인되었다(도18).
7.마우스 암치료 모델
(1)NW-MEL-38 및 HCT116을 사용한 모델
NOG마우스는 코먼γ리셉터를 결손하고 있으므로, NK세포가 존재하지 않는다. 이 때문에 인간 세포나 인간 조직의 생착성(生着性)이 NOD-SCID마우스와 비교하여 현저하게 높아, 인간의 암이나 인간 정상조직을 고율(高率)로 생착시킬 수 있다. 또한 인간 조혈줄기세포 이식후에 인간 T세포의 분화가 확인되기 때문에, 인간 면역계 모델 마우스로서의 수요가 높아지고 있다. NOG마우스의 특징으로서, T세포 및 B세포의 결실, 내츄럴 킬러(NK)세포의 결실, 수상세포기능의 저하, 대식세포 기능의 저하, 보체(補體) 활성의 결실, 노화에 따른 T세포 및 B세포의 누출(leakiness)이 확인되지 않는 것을 들 수 있다.
NOG마우스에 대해서, 우체측에 NW-MEL-38(A2양성 MAGE-A4양성)을 2.5×106개/마리, 좌체측에 HCT116(A2양성 MAGE-A4음성)을 2.5×106개/마리로 피하주사했다. 종양이식후 6일째에, 전처치로서 방사선전신조사(TBI) 2.5Gy를 하였다. TBI에 의하여 레시피언트 체내에서의 림프구수를 감소시켜, 수주한 도너 림프구가 생착하기 쉬운 상태로 했다. 7일째에 MAGE#17 CAR-T세포 및 인간 림프구를 세포수1×107개/마리로 미정맥으로부터 수주했다. CAR-T세포에 대한 유전자도입은 상기 「10.레트로바이러스에 의한 세포에 대한 유전자도입」의 방법을 따랐다. CAR양성률은 CD8 36.3%, CD4 38.5%이었다(도19).
CAR-T세포 수주군(n=2), 인간 림프구(CAR 비도입) 수주군(n=2), PBS군(n=2)으로 실험을 하고, 종양지름과 체중을 2-3일마다 측정했다. 측정은 종양이식후 42일째까지 하였다.
그 결과, CAR-T세포 수주군에서는, 마우스#1과 마우스#2에서 NW-MEL-38(A2양성 MAGE-A4양성)의 증식억제가 확인되었다. 한편, HCT116(A2양성 MAGE-A4음성)의 증식억제는 확인되지 않았다. 마우스#1은 종양이식 34일후에 사망했다. 사망원인은 종양사(腫瘍死)가 아니라, 감염의 가능성이 높다고 생각되었다(도20).
(2)세포내 도메인(ICD)의 차이에 의한 효과확인시험
다음에 ICD부분의 차이에 의한 CAR-T세포의 효과를 확인했다. CAR zG의 유전자 배열 이미지를 도21에 나타냈다. CAR zG에서는, ICD로서 CD28의 것에 대신하여 GITR의 것을 사용했다. GITR은, 글루코코르티코이드 유도 종양괴사인자 수용체를 의미하고 있어, 이 ICR을 사용한 CAR에서는, CAR의 발현량에 대한 사이토카인 생산량이 높게 이루어질 수 있는 것이 알려져 있다(WO2013051718). CAR zG는, 도2의 CAR 28z에 있어서 CD28 ICD부분을 다른 ICD인 GITR ICD로 변경하고, CAR 28z에 있어서의 CD3ζ와 ICD 도메인의 순서를 변경한 것이다. 그 밖의 부분은 CAR 28z와 동일한 배열을 가진 것을 사용했다.
NOG마우스에 대해서, NW-MEL-38(A2양성 MAGE-A4양성)을 2.5×106개/마리로 피하주사했다. 종양이식후 3일째에, 전처치로서 방사선전신조사(TBI) 2.0Gy를 하였다. 4일째에, 하기에 나타내는 A군∼C군(n=4)의 각각에 세포 또는 PBS와, 인간 림프구를 세포수 4×106개/마리로 미정맥으로부터 수주했다. CAR-T세포에 대한 유전자도입은 상기 「10.레트로바이러스에 의한 세포에 대한 유전자도입」의 방법을 따랐다. A군에는 PBS, B군에는 MAGE#17 CAR-T세포(28z), C군에는 CAR-T세포(zG)를 투여했다.
A군∼C군에 대해서 종양지름과 체중을 2-3일마다 측정했다. 측정은 종양이식후 24일째까지 하였다.
그 결과, ICH가 28z 및 zG의 어느 쪽의 CAR-T세포를 수주하였을 경우에도 NW-MEL-38(A2양성 MAGE-A4양성)의 증식억제가 확인되었다(도22). 이와 같이 본 실시형태에서는 세포내 도메인을 변경하였을 경우에도 같은 효과가 얻어진다는 것을 알 수 있었다.
8.zG형 CAR도입 CD8양성 T세포 및 4-1BBz형 CAR도입 CD8양성 T세포의 효과확인시험
(1)zG형 CAR 및 28z형 CAR을 도입한 레트로바이러스 벡터를 구축하고, 패키징(packaging) 세포 plat-A에 의해 레트로바이러스를 제작하고, PBMC에 감염시킴으로써 CAR-T세포를 제작했다. 유전자도입은 상기 「10.레트로바이러스에 의한 세포에 대한 유전자도입」의 방법을 따랐다. CAR의 발현을 테트라머 염색에 의해 확인했다. 그 결과, zG형 CAR-T세포의 CAR양성률은 CD8에서 99.1%, 28z형 CAR-T세포의 CAR양성률은 CD8에서 99.8%이었다(도23).
(2)레트로바이러스에 의해 유전자도입한 CAR-T세포(4×104개)와 펩티드 펄스를 한 T2세포 및 각종 세포주 NW-MEL-38, SK-MEL-37, HCT116(각각 2×105개)을 18시간 공배양하고, 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ를 측정했다. 도24에 나타나 있는 바와 같이 zG형 CAR 및 28z형 CAR을 도입한 CAR-T세포에서는, MAGE-A4를 펄스한 T2세포와 NW-MEL-38세포 및 SK-MEL-37세포에 특이적으로 IFN-γ의 산출이 증대했다.
컨트롤 세포(유전자도입하지 않고 있는 세포)를 사용하여 동일하게 시험을 했다. 타겟 세포인 A2양성 MAGE-A4음성의 HCT116에서는 IFN-γ의 산출이 보이지 않았다. 또 이펙터만(Effector-only) 및 표적만(Target-only)에서는 IFN-γ의 산출은 보이지 않았다.
이와 같이 zG형 CAR도입 CD8양성 T세포는 인 비트로(in vitro)계에 있어서 IFN-γ의 산출을 유도했다. 이 결과는, 인 비보(in vivo)계의 결과를 잘 설명할 수 있는 것이었다.
(3)다음에 상기 (1) 및 (2)와 동일한 시험을 4-1BBz형 CAR도입 CD8양성 T세포의 특성에 대해서 검토했다. 도25에 나타나 있는 바와 같이 4-1BBz형 CAR을 도입한 CAR-T세포에서는, MAGE-A4를 펄스한 T2세포에 특이적으로 IFN-γ의 산출이 증대했다.
컨트롤 펩티드로 자극한 T2세포에서는 IFN-γ의 산출이 보이지 않았다. 또 이펙터만(Effector-only) 및 표적만(Target-only)에서는 IFN-γ의 산출은 보이지 않았다.
이와 같이 ICD를 4-1BBz형으로 변경하였을 경우에도 같은 효과가 확 인되었다. 이 인 비트로(in vitro)계의 데이터는, 인 비보(in vivo)계의 결과를 용이하게 설명할 수 있는 것이다.
이렇게 ICD를 변경하였을 경우에도 zG형과 동일한 효과가 확인되었다.
이와 같이 본 실시형태에 의하면, MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2 복합체를 특이적으로 인식하는 항원 결합성 단백질, 항원 결합성 단백질을 코드하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터, 항원 결합성 단백질을 포함하는 키메라 항원 수용체, 키메라 항원 수용체를 코드하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 및 이 세포를 포함하는 의약조성물이 제공되었다.
MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2 복합체를 특이적으로 인식하는 항원 결합성 단백질은, 세포의료, 유전자치료의 분야에서 사용할 수 있다. 또한 MAGE-A4 유래 펩티드/HLA-A2 복합체를 발현하는 종양세포의 검출, 종양의 치료 및 그 연구·시험에 극히 유용하다. 본 발명의 CAR-T세포는 부작용이 매우 적으므로 대단히 유효한 암치료법을 제공할 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> MIE University <120> CAR-T cells for cancer treatment <130> JP2018001MIU <150> JP2017-111157 <151> 2017-06-05 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1A <400> 2 Ala Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2A <400> 3 Gly Ala Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 3A <400> 4 Gly Val Ala Asp Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 4A <400> 5 Gly Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 5A <400> 6 Gly Val Tyr Asp Ala Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 6A <400> 7 Gly Val Tyr Asp Gly Ala Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial 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<210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Ser Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Leu Tyr Asp Gly Arg Glu His Ser Val 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Val Tyr Val Gly Lys Glu His Met Phe 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Leu Tyr Asp Gly Arg Glu His Leu Ile 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Phe Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gly Val Tyr Asp Gly Glu Glu His Ser Val 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Leu Tyr Asp Gly Ile Glu His Phe Met 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Phe Val 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 His Val Tyr Asn Gly Arg Thr His Gln Trp 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Val Tyr Asp Gly Arg Glu Ile Leu Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gly Val Tyr Ser Gly Arg Ala His Pro Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MAGE-A4 Long Peptide <400> 28 Asn Tyr Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Gly 1 5 10 15 Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Ala 20 25 30 Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu His Val Val Arg Val Asn Ala 35 40 45 Arg Val Arg Ile 50 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Asn Tyr Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile 1 5 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu His Val Val Arg Val Asn 1 5 10 15 Ala Arg Val Arg Ile 20 <210> 31 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MAGE #17 <400> 31 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatccccc 300 cggcgggcat atcatgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcgggagttc ctatgagctg 420 actcagccac cctcgatgtc agtggcccca ggaaagacgg ccagcattac ctgtggcgga 480 gaccatattg gaagtaaaag tgttcactgg taccagcaga agccaggcca ggcccctgta 540 ctggtcgtct atgatgatag cgaccggccc tcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc 600 aactctggga acacagccac tctgaccatc agcgggaccc aggctatgga tgaggctgac 660 tattactgtc tggcgtggga cagcagcact gcgatcttcg gcggagggac caagctgacc 720 gtcctc 726 <210> 32 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MAGE #17 <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Arg Arg Ala Tyr His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro 130 135 140 Ser Met Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Ser Ile Thr Cys Gly Gly 145 150 155 160 Asp His Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly 180 185 190 Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 225 230 235 240 Val Leu <210> 33 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH of MAGE #17 <400> 33 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatccccc 300 cggcgggcat atcatgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tca 363 <210> 34 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sc of MAGE#17 <400> 34 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg ggagttccta t 51 <210> 35 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL of MAGE#17 <400> 35 gagctgactc agccaccctc gatgtcagtg gccccaggaa agacggccag cattacctgt 60 ggcggagacc atattggaag taaaagtgtt cactggtacc agcagaagcc aggccaggcc 120 cctgtactgg tcgtctatga tgatagcgac cggccctcag ggatccctga gcgattctct 180 ggctccaact ctgggaacac agccactctg accatcagcg ggacccaggc tatggatgag 240 gctgactatt actgtctggc gtgggacagc agcactgcga tcttcggcgg agggaccaag 300 ctgaccgtcc tc 312 <210> 36 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH of MAGE#17 <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Arg Arg Ala Tyr His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sc of MAGE#17 <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Tyr <210> 38 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL of MAGE#17 <400> 38 Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala 1 5 10 15 Ser Ile Thr Cys Gly Gly Asp His Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp 35 40 45 Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 50 55 60 Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu 65 70 75 80 Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Ile Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100

Claims (14)

  1. 이하의 (A) 및 (C)의 폴리펩티드를 포함하고, HLA-A2-MAGE-A4 복합체의 GVYDGREHTV 펩티드를 항원으로서 인식하는 항원 결합성 단백질:
    (A)배열번호36의 VH(중쇄가변영역)의 아미노산 배열과, 배열번호38의 VL(경쇄가변영역)의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드;
    (C)배열번호37의 sc(1개 쇄)의 아미노산 배열을 포함하고, 아미노 말단에서부터 순서대로 배열번호36, 배열번호37 및 배열번호38을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    항원 결합성 단백질이, 1개 쇄 Fv(scFv)인 항원 결합성 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항의 항원 결합성 단백질을 코드하는 핵산.
  4. 제3항의 핵산을 포함하는 벡터로서, 상기 항원 결합성 단백질이 발현 가능하게 되어 있는 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항의 항원 결합성 단백질과 시그널 전달 단백질의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체로서, 상기 항원 결합성 단백질이 상기 키메라 항원 수용체 아미노 말단측에 위치하여 세포외에 있고, 상기 세포내 도메인이 상기 키메라 항원 수용체의 카르복시 말단측에 위치하여 세포내에 있고, 상기 시그널 전달 단백질이 CD3zeta(CD3ζ)쇄 또는 공자극 분자CD(GITR) 중의 어느 하나인 키메라 항원 수용체.
  6. 제5항에 있어서,
    CD28의 세포내 도메인 또는 GITR의 세포내 도메인 중의 어느 하나를 더 포함하는 키메라 항원 수용체.
  7. 제5항의 키메라 항원 수용체를 코드하는 핵산.
  8. 제6항의 키메라 항원 수용체를 코드하는 핵산.
  9. 제7항의 핵산을 포함하는 벡터로서, 키메라 항원 수용체가 발현 가능하게 되어 있는 벡터.
  10. 제8항의 핵산을 포함하는 벡터로서, 키메라 항원 수용체가 발현 가능하게 되어 있는 벡터.
  11. 제5항의 키메라 항원 수용체를 발현하는, 인체내의 세포를 제외한 세포.
  12. 제6항의 키메라 항원 수용체를 발현하는, 인체내의 세포를 제외한 세포.
  13. 제11항의 세포로서 인체내의 세포를 제외한 세포를 유효성분으로서 함유하는, 만성골수성 백혈병, 급성림프성 백혈병(ALL), 급성골수성 백혈병(AML)을 포함하는 조혈기종양, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배(胚)세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 중피종을 포함하는 고형암 중의 적어도 어느 하나의 치료용의 의약조성물.
  14. 제12항의 세포로서 인체내의 세포를 제외한 세포를 유효성분으로서 함유하는, 만성골수성 백혈병, 급성림프성 백혈병(ALL), 급성골수성 백혈병(AML)을 포함하는 조혈기종양, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배(胚)세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 중피종을 포함하는 고형암 중의 적어도 어느 하나의 치료용의 의약조성물.
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