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KR102646495B1 - 재조합 pMHC II형 분자 - Google Patents

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KR102646495B1
KR102646495B1 KR1020197016386A KR20197016386A KR102646495B1 KR 102646495 B1 KR102646495 B1 KR 102646495B1 KR 1020197016386 A KR1020197016386 A KR 1020197016386A KR 20197016386 A KR20197016386 A KR 20197016386A KR 102646495 B1 KR102646495 B1 KR 102646495B1
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polypeptide
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hla
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dra
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페드로 산타마리아
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유티아이 리미티드 파트너쉽
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Abstract

본원에서 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동(cavity) 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단리된 이종이량체를 기재한다.

Description

재조합 pMHC II형 분자
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 11월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/419,947호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전문으로 본원에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 이로써 그 전문으로 참고에 포함된다. 상기 ASCII 사본은 2017년 10월 31일에 작성되었으며, 42363-711_601_SL.txt로 명명되었으며 크기는 242,369 바이트이다.
주요 조직 적합성 복합체(MHC: Major histocompatibility complex) II형 분자는 면역 반응을 조절하는 것을 돕는 동족 CD4+ T 세포에 항원을 제시하는 항원 제시 세포에서 통상적으로 발견된다. MHC II형 분자는 알파 및 베타 사슬의 이량체 화에 의해 형성되며, 알파 및 베타 사슬에 의해 형성된 결합 홈(groove)에 결합하는 폴리펩티드 항원의 존재하에 안정화된다. 그러나 시험관 내 조작된 시스템에서 MHC II형의 생산은 폴리펩티드의 존재하에서도 단백질 이종이량체의 내재적인 불안정성으로 인해 어려움이 있어왔다.
요약
본원에서 단리 및 정제된 항원-MHC 이종이량체 및 이의 효율적인 제조 방법을 개시한다. 이종이량체는 생산 및 단리의 용이성을 도모하기 위해 조작된다. 단리된 이종이량체의 생산을 증가시키기 위해 여러 가지 방법이 사용된다. 첫째, 알파 및 베타 사슬은 둘 다 IgG 중쇄의 일부분에 별도로 융합된 다음, IgG가 놉-인-홀(knob-in-hole) 구조를 갖도록 조작된다(알파 또는 베타 사슬 IgG 중 하나는 놉(knob)을 포함하고 다른 알파 또는 베타 사슬 IgG는 홀(hole)을 포함함). 일부 경우에, 이종이량체는 MHC II형 결합 홈의 잔기와 항원 사이에서 시스테인 트랩에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 시스테인 트랩을 사용하기 위해, 항원은 결합 홈에 매우 근접한 MHC 분자의 알파 또는 베타 사슬 상의 조작된 시스테인과 디설피드 결합을 형성하는 내인성 또는 조작된 시스테인을 포함할 수 있다. 이 시스테인 트랩은 펩티드 MHC 분자의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다. 예기치 않게, 놉-인-홀 구조는 이전에 사용된 이종의 이량체화 도메인이 없는 경우에 작동하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 이종의 이량체화 도메인은 이종이량체의 형성에 유해한 것으로 밝혀졌다.
본원의 한 양태에서, 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동(cavity) 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단리된 이종이량체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 하나 이상의 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 하나 이상의 자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 아르기닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 티로신 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 시스테인 잔기 및 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 알라닌, 세린, 트레오닌, 발린, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 세린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 트레오닌 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 공동은 발린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 시스테인 잔기, 세린 잔기, 알라닌 잔기, 및 발린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 항체의 CH3 도메인을 통해 계면을 이룬다. 일부 실시양태에서, CH3 도메인은 IgG로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, IgG는 IgG1 아형이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는 비오티닐화 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는 스트렙(Strep) 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 서열 번호 1에 의해 코딩되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 서열 번호 2에 의해 코딩되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 서열 번호 3에 의해 코딩되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 서열 번호 4에 의해 코딩되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 서열 번호 5 내지 8 중 어느 하나에 의해 코딩되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 서열 번호 1 내지 26, 64, 또는 65 중 어느 하나를 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 서열 번호 27 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 2개 이상의 단리된 이종이량체를 포함하는 다량체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 다량체는 아비딘을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 이종이량체 각각은 아비딘에 연결된다. 일부 실시양태에서, 다량체는 중합체 골격을 추가로 포함하고, 2개 이상의 이종이량체 각각은 중합체 골격에 연결된다. 일부 실시양태에서, 중합체 골격은 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 돌출부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 돌출부는 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 α2 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 돌출부는 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 MHC II형 α2 도메인과 조작된 돌출부를 갖는 CH3 도메인 사이에 위치하는 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 S354C, T366W, 및 S354C와 T366W 둘 모두(EU 번호 매김)로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 돌출부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 돌출부는 MHC II형 β1 도메인 또는 MHC II형 β2 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 돌출부는 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 MHC II형 β2 도메인과 조작된 돌출부를 갖는 CH3 도메인 사이에 위치하는 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 S354C, T366W, 및 S354C와 T366W 둘 모두(EU 번호 매김)로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 돌출부는 하나 이상의 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 하나 이상의 자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 아르기닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 티로신 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 시스테인 잔기 및 트립토판 잔기를 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 공동을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 공동은 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 α2 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 공동은 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 MHC II형 α2 도메인과 조작된 공동을 갖는 CH3 도메인 사이에 위치하는 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 Y349C, T366S, L368A, Y407V(EU 번호 매김), 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 공동을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 공동은 MHC II형 β1 도메인 또는 MHC II형 β2 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 공동은 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 MHC II형 β2 도메인과 조작된 공동을 갖는 CH3 도메인 사이에 위치하는 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 Y349C, T366S, L368A, Y407V(EU 번호 매김), 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 공동은 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 알라닌, 세린, 트레오닌, 발린, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 세린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 트레오닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 발린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 시스테인 잔기, 세린 잔기, 알라닌 잔기, 및 발린 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 돌출부는 CH3 항체 불변 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 공동은 CH3 항체 불변 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, 서열 번호 1 내지 26, 64, 또는 65 중 어느 하나를 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, 서열 번호 27 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체; 및 비리포좀성(non-liposomal)이고/거나 고체 코어를 갖는 나노입자를 포함하는 이종이량체-나노입자 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 고체 코어는 금 또는 산화철 코어이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 이종이량체는 나노입자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 이종이량체는 링커를 통해 나노입자에 공유적으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 제조 방법으로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하며,
(a) 각각의 계면을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 제1 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 돌출부를 코딩하기 위해 제1 폴리펩티드의 본래의 계면을 코딩하는 핵산으로부터 변경된 것이거나, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 공동을 코딩하기 위해 제2 폴리펩티드의 본래의 계면을 코딩하는 핵산으로부터 변경된 것이거나, 두 경우 모두이며, 배양은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 발현되도록 하는 것인 단계; 및 (b) 숙주 세포 배양물로부터 이종이량체를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 돌출부를 코딩하기 위해 본래의 핵산으로부터 변경된 것이고 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 공동을 코딩하기 위해 본래의 핵산으로부터 변경된 것이다.
일부 실시양태에서, 단계 (a)는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 본래의 아미노산 잔기를 코딩하는 하나 이상의 핵산 각각이 유입(import) 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 치환되는 단계가 선행되며, 돌출부는 하나 이상의 유입 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 및 시스테인으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 아르기닌이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 페닐알라닌이다.
일부 실시양태에서, 유입 잔기는 티로신이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 트립토판이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 시스테인이다.
일부 실시양태에서, 단계 (a)는 제2 폴리펩티드의 계면 내 본래의 아미노산 잔기를 코딩하는 하나 이상의 핵산 각각이 유입 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 치환되는 단계가 선행되며, 공동은 하나 이상의 유입 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 시스테인, 알라닌, 세린, 트레오닌, 또는 발린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 시스테인이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 알라닌이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 세린이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 트레오닌이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 발린이다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 각각은 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 불변 도메인은 CH3 도메인이다. 일부 실시양태에서, 항체 불변 도메인은 IgG로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, IgG는 인간 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 항체 불변 도메인은 CH2 및 CH3 도메인이다. 특정 실시양태에서, CH3는 조작된 돌출부(놉) 또는 공동(홀)을 추가로 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, 이종이량체-나노입자 접합체의 제조 방법으로서, 비리포좀성이고/거나 고체 코어를 갖는 나노입자에 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체를 결합시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 고체 코어는 금 또는 산화철 코어이다. 일부 실시양태에서, 결합 단계는 적어도 하나의 이종이량체를 나노입자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 단계는 링커를 통해 적어도 하나의 이종이량체를 나노입자에 공유적으로 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단리된 이종이량체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 하나 이상의 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체의 제1 또는 제2 폴리펩티드는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체의 제1 또는 제2 폴리펩티드는 서열 번호 54와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체의 제1 또는 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하고 CH3 도메인은 S354C, T366W, 및 S354C와 T366W 둘 모두(EU 번호 매김)로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 알라닌, 세린, 트레오닌, 발린, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체의 제1 또는 제2 폴리펩티드는 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체의 제1 또는 제2 폴리펩티드는 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체의 제1 또는 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하고 CH3 도메인은 Y349C, T366S, L368A, Y407V(EU 번호 매김), 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두는 이종의 이량체화 도메인을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두는 류신 지퍼를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두는 부위 특이적 비오티닐화 부위를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 자가면역 질환 관련 항원을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 질환 관련 항원은 적어도 11개의 아미노산 길이의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 자가면역 질환 관련 항원은 가요성 링커에 의해 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인에 연결된다. 특정 실시양태에서, 항원은 항원성 펩티드와 회합된 시스테인 아미노산과 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 시스테인 아미노산 사이에 형성된 디설피드 결합에 의해 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인에 공유적으로 연결된다. 특정 실시양태에서, MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 시스테인 아미노산은 MHC II형 결합 홈의 일부를 형성하는 잔기의 10개의 아미노산 이내에 존재한다. 특정 실시양태에서, MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 시스테인 잔기는 MHC II형 결합 홈의 일부를 형성하는 잔기의 3개의 아미노산 이내에 존재한다. 특정 실시양태에서, MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 시스테인 아미노산은 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 자연 발생 서열에 도입되었다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 자가면역 질환을 갖는 것으로 진단되거나 의심되는 개체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 본원에 기재된 제1 또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 게놈에 안정적으로 통합된다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 이종이량체는 비리포좀성이고/거나 고체 코어를 갖는 나노입자에 접합되어 이종이량체-나노입자 접합체를 형성한다. 특정 실시양태에서, 고체 코어는 금, 철 또는 산화철 코어이다. 특정 실시양태에서, 고체 코어는 100 나노미터 미만의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 이종이량체는 나노입자에 공유적으로 결합된다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 이종이량체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 링커를 통해 나노입자에 공유적으로 결합된다. 특정 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 말레이미드로 작용기화된다. 특정 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 5 kD 미만이다. 특정 실시양태에서, 이종이량체-나노입자 접합체를 포함하는 약학 조성물은 약학적 부형제, 안정화제, 또는 희석제와 함께 형성된다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체 또는 약학 조성물은 자가면역 질환 또는 염증성 병태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 질환 또는 염증성 병태를 치료하는 방법은 단리된 이종이량체-나노입자 접합체 또는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 제조 방법으로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하며; (a) 각각의 계면을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 제1 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 돌출부를 코딩하기 위해 제1 폴리펩티드의 본래의 계면을 코딩하는 핵산으로부터 변경된 것이거나, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 공동을 코딩하기 위해 제2 폴리펩티드의 본래의 계면을 코딩하는 핵산으로부터 변경된 것이거나, 두 경우 모두이며, 배양은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 발현되도록 하는 것인 단계; 및 (b) 숙주 세포 배양물로부터 이종이량체를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포 배양물 또는 숙주 세포 배양물들로부터 이종이량체를 회수하는 단계는 이종이량체를 포함하는 액체를 액체 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 액체 크로마토그래피 칼럼은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원의 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 제조 방법으로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하며; (a) 제1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계; (b) 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; (c) 숙주 세포 배양물들로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 폴리펩티드를 함께 인큐베이션하여 이종이량체를 형성하는 단계를 포함하며; 제1 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 돌출부를 코딩하기 위해 제1 폴리펩티드의 본래의 계면을 코딩하는 핵산으로부터 변경된 것이거나, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 공동을 코딩하기 위해 제2 폴리펩티드의 본래의 계면을 코딩하는 핵산으로부터 변경된 것이거나, 두 경우 모두인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포 배양물 또는 숙주 세포 배양물들로부터 이종이량체 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계는 이종이량체 또는 폴리펩티드를 포함하는 액체를 액체 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 액체 크로마토그래피 칼럼은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원의 한 양태에서, 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하며, 돌출부는 S354C 및 T366W(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고; (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하며, 공동은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 의해 형성되는 것인 단리된 이종이량체를 제공한다.
본원의 한 양태에서, 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하며, 돌출부는 S354C 및 T366W(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고; (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하며, 공동은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되는 것인 단리된 이종이량체를 제공한다.
[도 1A] 및 [도 1B]는 선형 (A) 및 원형 (B)의 렌티바이러스 벡터를 나타낸다.
[도 2]는 류신 지퍼를 사용하는 pMHC 조작의 예를 나타낸다.
[도 3]은 개략적인 놉-인-홀 pMHC 설계(류신 포함 또는 미포함)를 나타낸다.
[도 4A 내지 4C]. [도 4A]는 류신 지퍼 포함(왼쪽) 또는 미포함(오른쪽) BDC2.5mi/IAg7-놉-인-홀 pMHC를 코딩하는 렌티바이러스로 형질도입된 CHO 세포에서 eGFP 발현의 유동 세포 측정 분석을 나타낸다. [도 4B] 및 [도 4C]는 류신 지퍼 미포함(도 4B) 및 류신 지퍼 포함(도 4C) 놉-인-홀 기반 pMHC를 발현하는 CHO 세포로부터의 배양 상등액의 단백질 G 친화성 크로마토그래피 용출 프로파일을 나타낸다.
[도 5]는 천연(왼쪽) 및 변성(오른쪽) SDS-PAGE에 의한 지퍼 미포함 놉-인-홀 기반 pMHC의 전기영동 이동을 보여준다.
[도 6]은 종래의 pMHC 단량체(왼쪽 패널), 또는 지퍼 미포함 놉-인-홀 기반 설계(중간 및 오른쪽 패널)로 제조된 사량체를 사용하여 BDC2.5-CD4+ T 세포의 FACS 염색 프로파일을 나타낸다.
[도 7]은 지퍼 미포함 BDC2.5mi/IAg7 놉-인-홀 pMHC와 접합된 PFM 나노입자의 비변성(왼쪽) 및 변성(오른쪽) SDS-PAGE 겔 이미지를 보여준다.
[도 8]은 2.5mi/IAg7-지퍼 미포함 놉-인-홀 나노입자(왼쪽) 또는 지퍼 포함의 종래(비 놉-인-홀 기반) 2.5mi/Ag7-나노입자(오른쪽)로 처리한 마우스로부터의 T 세포 반응을 나타낸다. 마우스를 10회 투여(5주간 주 2회 투여)한 후, 비장 T 세포를 단리하고, 2.5mi/IAg7 사량체 양성 및 음성 분획으로 분류하고, 항-CD3/항-CD28 mAb 코팅된 비드로 자극하였다. 사량체 양성 및 음성 분획으로부터의 TR1 세포 관련 전사체의 존재에 대해 mRNA를 분석하였다.
[도 9A] 및 [도 9B]는 [도 8]에서와 같이 처리한 마우스로부터 단리된 T 세포로부터의 사이토카인 방출을 나타낸다. 2.5mi/IAg7 지퍼 미포함 놉-인-홀 나노입자 (A) 또는 지퍼 포함의 종래(비 놉-인-홀 기반) 2.5mi/Ag7-나노입자 (B)로 마우스를 처리하였다.
[도 10]은 BDC-PEG-비오틴 단백질의 모노-Q 정제 프로파일을 보여준다. 비오틴 스크리닝 ELISA 및 SDS page 분석을 위해 분획 번호 19 내지 38을 수집하였다.
[도 11]은 모노-Q 정제 분획의 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인은 각 FPLC 분획의 번호로 표시되어있다. 20 ㎕의 각 분획을 겔에 로딩하였다.
[도 12]는 분획 22 내지 25의 웨스턴 블롯 분석(레인 5 내지 9)에서 알파 사슬 내 비오티닐화 서열을 보유하고 BirA 효소를 사용하여 비오티닐화된 BDC2.5mi/IAg7 pMHC 단량체(레인 1)와 비교하여 pMHC 단량체의 알파 사슬에서만 비오틴의 존재를 나타냈음을 보여준다. 분획 # 25 내지 29를 모아서 pMHC 사량체를 제조하는데 사용하였다. 레인 11 내지 17은 분획 30 내지 36을 보여준다.
[도 13]은 BDC2.5mi/I-Ag7-말레이미드-PEG2-비오틴을 사용하여 생산된 사량체로 염색된 BDC2.5-CD4+ T 세포의 유동 세포 분석 프로파일을 보여준다.
[도 14A] 및 [도 14B]는 FPLC 용출 프로파일을 보여주며, [도 14C] 및 [도 14D]는 [도 14A] 및 [도 14B]에 나타난 용출 분획의 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
[도 15A] 내지 [도 15D]는 IGRP13 -25 폴리펩티드와 복합체화된 DR에 특이적인 TCR을 발현하는 GFP 표지된 JURMA 세포의 유동 세포 분석을 나타낸다. [도 15A]는 세포주 자체를 나타낸다. [도 15B]는 표준 류신 지퍼 이량체화 기술에 의해 제조된 PE 표지된 IGRP13 -25와 인큐베이션된 세포주를 나타낸다; [도 15C]는 류신 지퍼가 결여된, 놉-인-홀 및 시스테인 트랩 이량체화 기술을 사용하여 제조된 PE 표지된 DR3 IGRP13 -25와 인큐베이션된 세포주를 나타낸다; [도 15D]는 무관한 PE 표지된 MHC II형 이종이량체와 인큐베이션된 세포주를 나타낸다.
[도 16A] 및 [도 16B]는 나노입자에 접합된 IGRP13 -25 폴리펩티드와 복합체화된 DR에 특이적인 TCR을 발현하는 JURMA 세포의 자극을 나타낸다.
다양한 실시양태를 이하에서 설명한다. 구체적인 실시양태가 총망라하여 설명하는 것으로서 또는 본원에서 논의되는 더 폭넓은 양태를 제한하는 것으로서 의도되지 않음을 알아야 한다. 특정 실시양태와 관련하여 설명된 하나의 양태는 그 실시양태에 반드시 제한되는 것은 아니며 임의의 다른 실시양태(들)와 함께 실시될 수 있다.
본원의 한 양태에서, 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단리된 이종이량체를 제공한다. 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 둘 모두는 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 둘 모두는 MHC(α 또는 β 사슬)와 CH3 도메인 사이에 위치한 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 S354C, T366W, 및 S354C와 T366W 둘 모두(EU 번호 매김)로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 Y349C, T366S, L368A, Y407V(EU 번호 매김), 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 단리된 이종이량체는, 경우에 따라 제1 또는 제2 폴리펩티드에 공유적으로 결합된, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드를 포함한다. 경우에 따라, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드는 시스테인 트랩을 생성하기 위해 제1 또는 제2 폴리펩티드 내 시스테인 잔기와 상호 작용하는 시스테인 잔기를 포함한다.
한 양태에서, 이종이량체의 한 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 돌출부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 돌출부는 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 α2 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 돌출부는 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 MHC II형 α2 도메인과 조작된 돌출부를 갖는 CH3 도메인 사이에 위치하는 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 S354C, T366W, 및 S354C와 T366W 둘 모두(EU 번호 매김)로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드를 포함한다. 경우에 따라, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드는 시스테인 트랩을 생성하기 위해 MHC α1 또는 β1 도메인 내 시스테인 잔기와 상호 작용하는 시스테인 잔기를 포함한다.
한 양태에서, 이종이량체의 한 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 설계된 돌출부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 돌출부는 MHC II형 β1 도메인 또는 MHC II형 β2 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 돌출부는 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 MHC II형 β2 도메인과 조작된 돌출부를 갖는 CH3 도메인 사이에 위치하는 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 S354C, T366W, 및 S354C와 T366W 둘 모두(EU 번호 매김)로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드를 포함한다. 경우에 따라, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드는 시스테인 트랩을 생성하기 위해 MHC α1 또는 β1 도메인 내 시스테인 잔기와 상호 작용하는 시스테인 잔기를 포함한다.
한 양태에서, 이종이량체의 한 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 공동을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 공동은 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 α2 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 공동은 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 MHC II형 α2 도메인과 조작된 공동을 갖는 CH3 도메인 사이에 위치하는 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 Y349C, T366S, L368A, Y407V(EU 번호 매김), 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드를 포함한다. 경우에 따라, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드는 시스테인 트랩을 생성하기 위해 MHC α1 또는 β1 도메인 내 시스테인 잔기와 상호 작용하는 시스테인 잔기를 포함한다.
한 양태에서, 이종이량체의 한 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 설계된 공동을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 공동은 MHC II형 β1 도메인 또는 MHC II형 β2 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 공동은 폴리펩티드에 융합된 항체 CH3 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 MHC II형 β2 도메인과 조작된 공동을 갖는 CH3 도메인 사이에 위치하는 항체 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 CH3 도메인을 포함하고, 항체 CH3 도메인은 Y349C, T366S, L368A, Y407V(EU 번호 매김), 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드를 포함한다. 경우에 따라, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 펩티드는 시스테인 트랩을 생성하기 위해 MHC α1 또는 β1 도메인 내 시스테인 잔기와 상호 작용하는 시스테인 잔기를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "약"은 당업자에 의해 이해될 것이며, 이것이 사용되는 상황에 따라 어느 정도까지 달라질 것이다. 당업자에게 명확하지 않은 용어가 사용되는 경우, 이것이 사용되는 상황이 주어질 때, "약"은 특정 용어의 최대 ± 10%를 의미할 것이다.
요소들(특히 이하의 청구 범위와 관련하여)을 기재하는 문맥에서 용어 "하나의"("a" 및 "an" 및 "the") 및 유사한 지시어의 사용은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 분명히 모순되지 않는 한 복수 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석해야 한다. 본원에서 값의 범위의 열거는 본원에 달리 명시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로서 사용하고자 하며, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 나열된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 분명히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 실시양태를 더 명확히 설명하고자 하는 것이며, 달리 언급되지 않는 한 청구항의 범위에 제한을 주지 않는다. 명세서에서 어떠한 언어도 청구되지 않은 요소를 필수적으로 나타내는 것으로 해석해서는 안된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "이종이량체"는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 분자를 말하며, 제2 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 제1 폴리펩티드와 아미노산 서열에 있어 상이하다. "다량체"는 2개 이상의 이종이량체를 포함하거나 본원에 개시된 4개 이상의 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "개체"는 "대상체"와 동의어이다. 개체는 질환이 있다고 진단받을 수 있다. 개체는 상기 질환의 적어도 하나의 증상을 나타내는 것, 상기 질환의 가족력이 있는 것, 상기 질환에 대한 위험을 정의하는 데 관련된 유전자형을 갖는 것, 질환에 대해 위험에 있는 개체를 평가하는 수준에 또는 그 수준 가까이에 있는 것이나 표현형 측정값 "실험실 검사"를 받은 것을 근거로 하여 특정 질환을 갖는 것으로 의심받을 수 있다. 개체는 말, 고양이, 개, 돼지, 소, 염소 또는 양과 같은 포유류일 수 있다. 개체는 어떤 경우에는 인간일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드"는 일반적으로 약 10개 초과의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "제1 폴리펩티드"는 제2 폴리펩티드와 결합될 임의의 폴리펩티드이다. 제1 및 제2 폴리펩티드는 "계면"(아래에서 정의됨)에서 만난다. 계면 이외에도, 제1 폴리펩티드는 "결합 도메인"(예를 들어, 리간드 결합 도메인) 또는 CH2, CH1 및 CL 도메인을 포함하는 항체 불변 도메인(또는 이들의 일부)과 같은 하나 이상의 추가 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 항체로부터 유래한 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 도메인은 편리하게는 항체의 CH3 도메인과 같은 불변 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, 도메인은 제1 폴리펩티드의 계면을 형성한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제2 폴리펩티드"는 "계면"을 통해 제1 폴리펩티드와 결합될 임의의 폴리펩티드이다. 계면 이외에도, 제2 폴리펩티드는 "결합 도메인"(예를 들어, 리간드 결합 도메인) 또는 CH2, CH1 및 CL 도메인을 포함하는 항체 불변 도메인(또는 이들의 일부)과 같은 추가 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 항체로부터 유래한 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 도메인은 편리하게는 항체의 CH3 도메인과 같은 불변 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, 도메인은 제2 폴리펩티드의 계면을 형성한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 도메인"은 관심의 분자(예를 들어, 항원)에 선택적으로 결합하는 역할을 하는 폴리펩티드의 임의의 영역을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "결합 홈"은 MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 β2 도메인 사이에 형성된 MHC II형 이종이량체에 존재하는 분자 포켓 또는 움푹 들어간 부분을 지칭한다. 이것은 항원과 상호 작용하는 MHC II형 이종이량체의 일부이다. 항원은 일반적으로 폴리펩티드 항원이지만, 지질 모이어티, 글리콜 모이어 티, 또는 당지질 모이어티에 의해 추가로 변형될 수 있다. 결합 홈을 구성하는 잔기는 다형성을 나타내며 상이한 HLA 대립 유전자 간의 항원 결합에 있어 차이의 원인이 된다. MHC II형 분자에 대한 결합 홈의 중요한 특징은 홈의 단부가 개방되어 있고 항원이 결합 홈의 어느 한쪽 또는 양쪽 너머까지 미칠 수 있도록 한다는 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "계면"은 제2 폴리펩티드의 계면 내 하나 이상의 "접촉" 아미노산 잔기와 상호 작용하는 제1 폴리펩티드 내 "접촉" 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면은 면역 글로불린의 CH3 도메인을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 면역 글로불린은 IgG 항체로부터 유래한다. IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 면역 글로불린은 인간 IgG1 항체로부터 유래한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌출부"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 돌출하여, 인접한 계면(즉, 제2 폴리펩티드의 계면)에서 보상적 공동에 위치 가능하여 이종이량체를 안정화시키고, 이에 따라, 예를 들어, 동종이량체 형성보다 이종이량체 형성을 선호하게 하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 돌출부는 본래의 계면에 존재할 수 있거나 (예를 들어, 계면을 코딩하는 핵산을 변경함으로써) 합성으로 도입될 수 있다. "조작된 돌출부"는 합성적으로 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 돌출부를 코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제1 폴리펩티드의 계면 내 적어도 하나의 "본래의" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산은 본래 아미노산 잔기보다 측쇄 체적이 더 큰 적어도 하나의 "유입" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 치환된다. 하나 초과의 본래 잔기와 상응하는 유입 잔기가 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 치환되는 본래 잔기의 개수에 대한 상한은 제1 폴리펩티드의 계면 내 잔기의 총 개수이다. 일부 실시양태에서, 돌출부의 형성을 위한 유입 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 아르기닌(R), 시스테인(C), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 및 트립토판(W)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌 (F), 티로신(Y), 및 트립토판 (W)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 트립토판 및 티로신이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 트립토판 및 시스테인이다. 일부 실시양태에서, 돌출부의 형성을 위한 본래의 잔기는 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린과 같이 측쇄 체적이 작다. 일부 실시양태에서, 세린 잔기는 시스테인으로 치환되고 트레오닌 잔기는 트립토판으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 위치 354의 세린은 또 다른 아미노산 잔기로 치환되어 돌출부의 일부 또는 전체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 위치 366의 트레오닌은 또 다른 아미노산 잔기로 치환되어 돌출부의 일부 또는 전체를 형성한다. 추가의 실시양태에서, 아미노산 치환은 S354C 및 T366W(EU 번호 매김)를 포함한다. 모든 번호 매김은 에델만(Edelman)[Gerald M. et al.　PNAS 63(1) (1969): 78-85]에 따른다.
본원에 사용되는 바와 같이, "공동"은 제2 폴리펩티드의 계면으로부터 오목하게 되어 제1 폴리펩티드의 인접한 계면에 상응하는 돌출부를 수용하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 공동은 본래의 계면에 존재할 수 있거나 (예를 들어, 계면을 코딩하는 핵산을 변경함으로써) 합성으로 도입될 수 있다. "조작된 공동"은 합성으로 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 공동을 코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩티드의 계면 내 적어도 하나의 "본래의" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산은 본래 아미노산보다 측쇄 체적이 더 작은 적어도 하나의 "유입" 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA로 치환된다. 하나 초과의 본래의 잔기 및 상응하는 유입 잔기가 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 치환되는 본래의 잔기의 개수에 대한 상한은 제2 폴리펩티드의 계면 내 잔기의 총 개수이다. 일부 실시양태에서, 공동의 형성을 위한 유입 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 알라닌(A), 시스테인(C), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 알라닌(A), 시스테인(C), 세린(S), 및 발린(V)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 세린, 알라닌, 또는 트레오닌이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 알라닌(A), 시스테인(C), 세린(S), 및 발린(V)이다. 일부 실시양태에서, 위치 349의 티로신은 또 다른 아미노산 잔기로 치환되어 공동의 일부 또는 전체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 위치 366의 트레오닌은 또 다른 아미노산 잔기로 치환되어 공동의 일부 또는 전체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 위치 368의 류신은 또 다른 아미노산 잔기로 치환되어 공동의 일부 또는 전체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 위치 407의 티로신은 또 다른 아미노산 잔기로 치환되어 공동의 일부 또는 전체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 돌출부의 형성을 위한 본래의 잔기는 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판과 같이 측쇄 부피가 크다. 다른 실시양태에서, 본래의 잔기는 티로신, 트레오닌, 및 류신으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 티로신 잔기는 시스테인 또는 발린으로 치환되고, 트레오닌 잔기는 세린으로 치환되고, 류신 잔기는 알라닌으로 치환된다. 추가의 실시양태에서, 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V(EU 번호 매김)를 포함한다. 모든 번호 매김은 에델만[Gerald M. et al.　PNAS 63(1) (1969): 78-85]에 따른다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "본래의" 아미노산 잔기는 본래의 잔기보다 측쇄 체적이 더 작거나 더 클 수 있는 "유입" 잔기로 치환되는 잔기이다. 유입 아미노산 잔기는 자연 발생 또는 비자연 발생 아미노산 잔기일 수 있지만, 바람직하게는 전자이다. "자연 발생" 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 코딩되는 잔기이다. "비자연 발생" 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 코딩되지 않지만 폴리펩티드 사슬 내 인접한 아미노산 잔기에 공유적으로 결합할 수 있는 잔기를 의미한다. 비자연 발생 아미노산 잔기의 예로는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 및 기타 아미노산 잔기 유사체, 예를 들어 상기 문헌[Ellman et al.Meth. Emzym. 202: 301-336 (1991)]에 기재되어있는 것이다. 이러한 비자연 발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 상기 문헌[Noren et al. Science 244: 182 (1989) 및 Ellman et al.,]의 절차를 사용할 수 있다. 간략하게, 이것은 비자연 발생 아미노산 잔기를 가진 억제 tRNA를 화학적으로 활성화하는 단계, 이어서 RNA의 시험관 내 전사와 번역을 포함한다. 본 발명의 방법은 적어도 하나의 본래의 아미노산 잔기를 치환하는 단계를 포함하나, 하나 초과의 본래의 잔기가 치환될 수 있다. 통상적으로, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면 내 전체 이하의 잔기가 치환되는 본래의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 치환을 위해 선호되는 본래의 잔기는 "매몰"되어있다. "매몰"은 잔기가 용매에 본질적으로 접근할 수 없음을 의미한다. 특정 실시양태에서, 유입 잔기는 디설피드 결합의 가능한 산화 또는 오대합(mispairing)을 방지하기 위해 시스테인이 아니다.
돌출부는 공동 내에 "위치 가능"하며, 이는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 각각의 계면 상에 돌출부 및 공동의 공간적 위치 및 돌출부와 공동의 크기가 제1 및 제2 폴리펩티드의 계면에서의 정상적인 결합을 크게 교란시키지 않으면서 돌출부가 공동 내에 위치할 수 있음을 의미한다. Cys, Tyr, Phe, 및 Trp와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 아미노산 중 하나를 포함하는 돌출부는 전형적으로 계면의 축으로부터 수직으로 돌출되지 않고 바람직한 형태를 가지므로, 대응하는 공동과의 돌출부의 정렬은 X 선 결정학 또는 핵자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance)에 의해 수득한 것과 같은 3차원 구조에 기초한 돌출부/공동 쌍의 모델링에 의존한다. 이는 당해 분야에서 널리 받아들여지는 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
"본래의 핵산"은 돌출부 또는 공동을 코딩하기 위해 "변경"(즉, 유전자 조작 또는 돌연변이)될 수 있는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이다. 본래 또는 출발 핵산은 자연 발생 핵산일 수 있거나, 사전 변경을 거친 핵산(예를 들어, 인간화 항체 단편)을 포함할 수 있다. 핵산을 "변경"한다는 것은 관심 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈을 삽입, 결실 또는 치환함으로써 본래의 핵산이 변이된다는 것을 의미한다. 일반적으로, 본래 잔기를 코딩하는 코돈은 유입 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환된다. 이러한 방식으로 DNA를 유전적으로 변형시키는 기술은 문헌[Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991)]에서 검토되었으며, 위치 지정 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발, 및 중합 효소 연쇄 반응(PCR: poylmerase chain reaction) 돌연변이 유발 등이 있다.
돌출부 또는 공동은 합성 수단에 의해, 예를 들어, 재조합 기술, 시험관 내 펩티드 합성, 이전에 기재된 비자연 발생 아미노산 잔기를 도입하기 위한 기술, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링, 또는 이들 기술의 일부 조합에 의해 제1 및 제2 폴리펩티드의 계면으로 "도입"될 수 있다. 따라서, "도입된" 돌출부 또는 공동은 "비자연 발생적" 또는 "비천연"이고, 이는 이것이 자연에 또는 본래의 폴리펩티드(예를 들어, 인간화된 단클론 항체)에 존재하지 않음을 의미한다.
바람직하게는, 돌출부를 형성하기 위한 유입 아미노산 잔기는 비교적 소수(예를 들어, 약 3 내지 6)의 "로타머(rotamer)"를 갖는다. "로타머"는 아미노산 측쇄의 에너지학적으로 유리한 형태이다. 다양한 아미노산 잔기의 로타머의 수는 문헌[Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)]에 검토되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "놉-인-홀" 또는 "놉-인투-홀(knob-into-hole)"은 이종이량체 형성을 촉진하도록 공동 내에 돌출부가 위치될 수 있도록 제1 폴리펩티드의 계면의 돌출부(또는 "놉") 및 제2 폴리펩티드의 계면의 상응하는 공동(또는 "홀")을 필요로 하는 폴리펩티딜 구조를 지칭한다. 돌출부는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 페닐알라닌 또는 티로신)로 치환함으로써 구성될 수 있다. 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환함으로써 제2 폴리펩티드의 계면에서 생성될 수 있다. 돌출부 및 공동은 당업자가 통상적인 방법을 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 변경하거나 펩티드 합성과 같은 합성 수단에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 계면은 제1 폴리펩티드의 Fc 도메인 상에 위치하며; 제2 폴리펩티드의 계면은 제 2 폴리펩티드의 Fc 도메인 상에 위치한다. 놉-인-홀 이종이량체 및 이의 제조 및 사용 방법은 미국 특허 제5,731,168호; 제5,807,706호; 제5,821,333호; 제7,642,228호; 제7,695,936호; 제8,216,805호; 및 제8,679,785호; 및 문헌[Merchant et al., Nature Biotechnology, 1998, 16: 677-681]에 개시되어 있으며, 이들 모두는 그 전문으로 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "단리된" 이종이량체는 이의 천연 세포 배양 환경의 성분으로부터 동정, 분리 및/또는 회수된 이종이량체를 의미한다. 자연환경의 오염 성분은 이종이량체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이종이량체는 (1) 라우리(Lowry) 방법에 의해 측정될 때 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 단백질로 정제되거나, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 적어도 15개 잔기의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다.
본원에서 "나노 구체", "NP" 또는 "나노입자"는 대상체, 세포 표본, 또는 조직 표본에 적절하게 단독으로 또는 복수로 투여되는 작은 개별 입자를 의미한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 사용되는 용어 "나노입자"는 나노입자 코어 주위의 임의의 층을 포함한다. 특정 실시양태에서, 나노입자는 모양이 실질적으로 구형이다. 특정 실시양태에서, 나노입자는 리포솜 또는 바이러스 입자가 아니다. 추가의 실시양태에서, 나노입자는 임의의 적합한 물질, 예를 들어 고체, 고체 코어, 금속, 덴드리머, 중합체 미셀, 금속 산화물, 또는 단백질 또는 이들의 단편 또는 조합으로 구성된다. 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 구형"은 입자의 모양이 구형으로부터 약 10% 넘게 벗어나지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 공지된 다양한 항원 또는 펩티드 복합체가 입자에 적용될 수 있다. 본 발명의 나노입자는 크기가 약 1 nm 내지 약 1 μm, 약 1 nm 내지 약 500 nm, 또는 다르게는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 또는 다르게는 약 1 nm 내지 약 50 nm, 또는 다르게는 약 5 nm 내지 약 100 nm의 범위이고, 일부 양태에서, 다수의 나노입자가 의도될 때 다수의 나노입자의 평균 또는 중앙값의 직경을 지칭한다. 더 작은 나노 크기의 입자는 예를 들어, 더 큰 입자가 수용액에 침전되도록 하는 분획화 공정에 의해 수득할 수 있다. 이어서, 당업자에게 공지된 방법에 의해 용액의 상부를 회수한다. 이 상부는 작은 크기의 입자로 농축된다. 원하는 평균 크기가 생성될 때까지 공정을 반복할 수 있다. 용어 "나노 구조물"은 일반적으로 약 1 ㎛보다 작은 구조물을 기술하는데 사용된다.
항원-MHC-나노입자 복합체("NP-복합체" 또는 "복합체" 또는 pMHC-NP 또는 "나노입자 복합체")는 나노입자 코어와 같은 표면상에서 항원 분자 또는 단백질(즉, 자가 펩티드 또는 자가 항원)의 펩티드, 탄수화물, 지질, 또는 다른 항원성 분절, 단편 또는 에피토프의 제시를 나타낸다.
"나노입자 코어"는 층 또는 코팅을 포함하거나 포함하지 않는 나노입자 기재(substrate)이다. 나노입자 복합체는 코어에 커플링된 적어도 하나의 항원-MHC 복합체를 갖는 코어를 포함한다.
"밀도"는 나노입자당 pMHC를 언급할 때, 링커를 또한 포함할 수 있는 외부 층이 있거나 없는 나노입자 코어의 표면적으로서 계산된다. 표면적은 사용되는 구조물의 이용 가능한 전체 표면적이다. 한 양태에서, PEG 링커가 사용되는 경우, 이는 나노 입자의 전체 이용 가능한 표면적에 따라 표면적을 증가시키는 나노 입자의 약 20 nm2만큼 나노 입자 코어의 총 직경을 증가시킬 수 있다. 즉, pMHC, 보조 자극 분자 및 / 또는 사이토카인 중 하나 이상을 첨가하지 않은 나노 입자의 최종 표면적이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "항원"은 대상체에서 면역 반응을 유도하거나, 면역 세포, 바람직하게는 T 또는 B 세포의 증식을 유도할 수 있는 분자의 전체, 일부, 단편, 또는 분절을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "질환 관련" 항원은 선택된 질환을 치료하기 위해 선택된 항원 또는 이의 단편을 지칭하며, 질환 과정에 관여한다. 예를 들어, 당뇨병 관련 항원은 제시될 때 당뇨병을 치료하는 역할을 하는 면역 반응을 생성하는 항원 또는 이의 단편이다; 따라서 이러한 효과를 생성하는 당뇨 관련 항원은 당뇨병을 치료하기 위해 선택된다. 다발성 경화증(MS: multiple sclerosis)을 치료하기 위해 MS 관련 항원이 선택된다. 당뇨병 관련 항원은 MS 치료에 선택되지 않는다. 유사하게, 자가면역 관련 항원은 자가면역 질환과 관련이 있는 항원이며, 자가면역 이외의 장애 또는 질환, 예를 들어, 암의 치료를 위해 선택되지 않는다. 비제한적이고 예시적인 질환 관련 항원은 본원에 개시되어 있고, 또한, 그러한 항원은 문헌에 기재된 기술, 기전, 및 방법에 기초하여 특정 질환에 대해 결정될 수 있다.
MHC II형 이종이량체 및 놉-인-홀 설계
펩티드 리간드의 존재하에서도, 막 횡단 및 세포질 도메인이 없는 분비되는 MHC II형 α 및 β 사슬은 안정한 이종이량체를 형성하지 않기 때문에, MHC II형 분자의 발현에 어려움이 있어왔다. MHC II형 α 및 β 사슬의 막 횡단 영역은 아마도 2개의 α-나선 막 횡단 분절의 상호 작용을 통해서, αβ 이종이량체의 적절한 조립을 촉진한다.
현재, 최신 기술은 류신 지퍼를 사용하여 pMHC 사량체를 생성하기 위해 재조합 pMHC II형 분자를 생산하는 것이다. 이는 NIH 테트라머 퍼실리티(NIH tetamer facility) 및 pMHC 사량체의 상용 공급자에게도 해당된다.
그러나 이 접근법은 질환 관련 pMHC II형-나노입자 화합물의 생산을 위한 pMHC II형 단량체를 제조하기 위한 플랫폼으로서의 그 자체의 한계를 나타낸다: 1) jun/fos 서열이 "외래성"으로 인식됨에 따라서 pMHC-나노입자로 치료받은 개체에서 면역원성을 나타내어, 특히 반복 투여 후에 치료 활성을 잠재적으로 제한할 수 있을 가능성; 2) 친화성 분리 태그가 pMHC 복합체에 도입되지 않으면 진핵생물 세포 배양 (즉, 중국 햄스터 난소 -CHO-) 상등액으로부터 pMHC 복합체의 크로마토그래피 분리가 어렵다; 그리고 3) 친화성 태그는 또한 FLAG 또는 6xHIS와 같은 친화성 태그의 항원성으로 인해 문제가 된다. 항원성의 가능성과 상이한 단백질의 정제에 있어 잠재적으로 광범위한 사용 때문에, 이들 태그는 인간 치료제와 함께 사용하기에는 불리하다. 불행히도, 이러한 단백질에 친화성 태그를 추가하면 항-약물 항체(ADA: anti-drug antibody)의 생성을 유발할 수 있다.
본원의 한 양태에서, 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단리된 이종이량체를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단리된 이종이량체를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2 도메인을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 tMHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2 도메인을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인을 포함하는 것인 단리된 이종이량체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 각각은 항체의 CH3 도메인을 포함하고 CH3 도메인을 통해 계면을 이룬다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 각각은 항체의 CH2 도메인을 포함하고 CH2 도메인을 통해 계면을 이룬다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 각각은 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 조합을 통해 계면을 이룬다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 각각은 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고 CH3 도메인을 통해 계면을 이룬다. 일부 실시양태에서, CH3 도메인은 IgG로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, CH2 도메인은 IgG로부터 유래한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형일 수 있다. 일부 실시양태에서, IgG는 IgG1 아형이다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함한다.
BirA를 통한 pMHC의 비오티닐화는 스트렙타비딘을 사용하는 사량체화에 적합한 비오티닐화된 pMHC 단량체를 생산하는데 통상적으로 사용되는 기술이다. 이러한 pMHC 사량체 및 이의 고차 유도체(펜타머, 덱스트라머, 또는 다른 다량체)는 생물학적 샘플에서 항원 특이적 T 세포의 빈도를 계산할 수 있는 시약으로 유용하다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는 비오티닐화 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 비오티닐화 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 비오티닐화 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 비오티닐화 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 비오티닐화 부위를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는 스트렙 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 스트렙 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 스트렙 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 스트렙 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 스트렙 태그를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 류신 지퍼를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 C-Jun 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 C-Fos 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 류신 지퍼를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 BirA 효소가 비오틴 분자 또는 에피토프/친화성/정제 태그(예를 들어, c-Myc, FLAG, V5, 폴리히스티딘, 6xHIS 등)를 부착하기 위해 표적화하는 비오티닐화 서열과 같은 면역반응성의 표적이 될 수 있는 외래 단백질 서열이 없다. 종종 MHC 이량체는 이종의 이량체화 도메인을 사용하여 생산된다. 일부 예로는 류신 지퍼(Fos/Jun, 산-p1/염기-p1, 또는 GCN4 이량체), 콜리신 E9/E9 DN아제 면역 단백질 이량체, 또는 Kv1.2 T1 도메인 이량체가 포함된다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 놉-인-홀 구조 이외의 이량체화 도메인이 없다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 류신 지퍼 이량체화 도메인이 없다. 일부 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 c-FOS/c-JUN 이량체화 도메인이 없다.
특정 실시양태에서, 이종이량체의 MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인 및 MHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2 도메인은 인간 백혈구 항원(HLA: human leukocyte antigen) 분자, 예를 들어 HLA-DR, HLA-DQ, 또는 HLA-DP로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인은 DRA, DQA1, 또는 DPA1로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 α2 도메인은 DRA, DQA1, 또는 DPA1로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, MHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1, 또는 HLA-DPB1로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, MHC II형 β1 도메인 또는 MHC II형 β2는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1, 또는 HLA-DPB1로부터 유래한다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 이종이량체는 중합체 골격을 통해 서로 공유적으로 결합되어 다량체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 중합체 골격은 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 내 각각의 폴리펩티드는 중합체 골격에 부착된다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 내 각각의 폴리펩티드는 각각의 폴리펩티드 상의 말단 시스테인 잔기를 통해 중합체 골격에 부착된다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 내 각각의 폴리펩티드는 각각의 폴리펩티드 상의 비오티닐화 부위를 통해 중합체 골격에 부착된다.
일부 실시양태에서, 2개의 이종이량체는 아비딘을 통해 서로 공유적으로 부착되어 다량체를 형성한다.
항원
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 이종이량체는 항원을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원은 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 아미노산 길이이며, 특정 실시양태에서는 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산 길이보다 길지 않은 폴리펩티드 항원이다. 특정 실시양태에서, 항원은 질환 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 항원은 자가면역 질환 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 항원은 염증성 질환 관련 항원이다. 본원에 기재된 항원은 MHC II형 α 또는 MHC II형 β 폴리펩티드의 N-말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 항원은 가요성 펩티드 링커에 의해 연결된다. 링커는 예를 들어 폴리펩티드 링커일 수 있고 글리신 및 세린을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원은 자가면역 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 관련 항원은 I형 당뇨병, 다발성 경화증, 셀리악병, 원발성 담즙성 간경화증, 자가면역성 간염, 원발성 경화성 담관염, 천포창, 낙엽상 천포창, 심상성 천포창, 시신경척수염 스펙트럼 장애, 관절염(류마티스 관절염 포함), 알레르기성 천식, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염 포함), 전신 홍반 루푸스, 죽상경화증, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 건선, 자가면역성 간염, 포도막염, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 항인지질 증후군, ANCA 관련 혈관염, 또는 강직 인간 증후군 관련 항원이다. 추가 양태에서, 질환 관련 항원은 종양 또는 암 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 관련 항원은 I형 당뇨병 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 관련 항원은 다발성 경화증 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 관련 항원은 류마티스 관절염 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 관련 항원은 크론병 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 관련 항원은 궤양성 대장염 질환 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 관련 항원은 셀리악병 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 관련 항원은 간담즙성 자가면역 질환 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 간담즙성 자가면역 관련 항원은 원발성 담즙성 간경화증, 자가면역성 간염, 또는 원발성 경화성 담관염 질환 관련 항원이다. 특정 실시양태에서, 항원은 위장관의 미생물로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 위장관의 미생물로부터 유래한 항원은 플라젤린, Fla-2, Fla-X, 특징규명되지 않은 이. 콜라이(E. coli) 단백질(YIDX), 또는 박테로이데스(Bacteroides) 인테그라아제이다. 특정 실시양태에서, 항원은 식품 항원이다. 특정 실시양태에서, 식품 항원은 글리아딘이다. 특정 실시양태에서, 식품 항원은 오브알부민이다. 특정 실시양태에서, 식품 항원은 땅콩 유래 항원이다.
시스테인 트래핑
시스테인 트랩은 본원에 기재된 이종이량체를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 트래핑은 결합되지 않은 폴리펩티드 파트너로부터 공유적으로 결합된 폴리펩티드 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트래핑은 안정화된 폴리펩티드 복합체를 형성하기 위해 폴리펩티드 파트너의 상호 작용 계면 내에서 전략적으로 선택된 위치에 시스테인을 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트래핑은 폴리펩티드 복합체를 안정화시켜 특정 형태를 선호하고 해리를 방지할 수 있다. 시스테인 트래핑은 디설피드 트래핑 및 디설피드 가교라고도 지칭된다. 시스테인 트래핑의 방법 및 적용의 예는 문헌[Kufareva, et al., Methods Enzymol. 570: 389-420 (2016)]에 검토되어있다. MHC와 관련하여, 시스테인은 MHC II형 이량체의 결합 홈에서 결합하는 것으로 알려지거나 의심되는 폴리펩티드 내로 조작된다. 그 다음, 시스테인은 결합 홈 내 또는 그 근처에 조작되어, 폴리펩티드가 결합 홈과 결합할 때, 결합 홈 시스테인이 근접하여 폴리펩티드 시스테인과의 디설피드 결합을 형성할 수 있다.
시스테인 트랩을 사용하기 위해서는 2개의 시스테인이 이종이량체를 구성하는 폴리펩티드 내로 조작되어야 한다. 첫 번째 시스테인은 MHC II형 결합 홈 내부 또는 근처에 있는 "결합 홈 시스테인"이다. 결합 홈 시스테인은 결합 홈의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 이내에 있을 수 있다. 시스테인은 알파 또는 베타 사슬 중 어느 하나와 결합 홈의 N- 또는 C-말단 중 어느 하나에 위치할 수 있다. 두 번째 시스테인은 결합 홈에서 결합하는 항원성 폴리펩티드 내부 또는 근처에 있는 "폴리펩티드 시스테인"이다. 폴리펩티드 시스테인은 항원성 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 이내에 존재할 수 있다. 폴리펩티드 시스테인은 항원성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에 있을 수 있다. 일반적으로 항원성 폴리펩티드는 가요성 링커에 의해 알파 사슬 또는 베타 사슬 중 어느 하나에 연결되고, 시스테인은 링커와 항원성 폴리펩티드 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 사슬의 배열은 항원성 폴리펩티드-폴리펩티드 시스테인-링커-MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 사슬의 배열은 항원성 폴리펩티드-폴리펩티드 시스테인-링커-MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 사슬의 배열은 폴리펩티드 시스테인-항원성 폴리펩티드-링커-MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 사슬의 배열은 폴리펩티드 시스테인-항원성 폴리펩티드-링커-MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인이다. 이들 MHC II형 폴리펩티드는 하나의 폴리펩티드 상에 조작된 놉을 갖는 CH2 및 CH3 도메인, 및 다른 폴리펩티드 상에 조작된 홀을 갖는 CH2 및 CH3 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 경우에, 항원성 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 첨가할 필요성을 없애는 자연 발생 시스테인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이종이량체의 폴리펩티드는 시스테인을 도입하기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 MHC II형 알파 사슬에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 MHC II형 베타 사슬에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 MHC II형 α1 도메인에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 MHC II형 β1 도메인에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 알파 및 베타 사슬 중 어느 하나 또는 둘 모두에서, MHC II형 α1 과 β1 사슬 사이에 형성된 결합 홈 근처에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 결합 홈과 결합된 폴리펩티드 항원에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 결합 홈과 결합하는 항원성 폴리펩티드의 N-말단에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 결합 홈과 결합하는 항원성 폴리펩티드의 C-말단에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트랩은 MHC 결합 홈에서 결합하는 항원성 펩티드의 N-말단에서의 시스테인 잔기와 MHC II형 알파 사슬에 위치한 결합 홈의 N-말단에서의 잔기 사이에 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트랩은 MHC 결합 홈에서 결합하는 항원성 펩티드의 N-말단에서의 시스테인 잔기와 MHC II형 알파 사슬에 위치한 결합 홈의 C-말단에서의 잔기 사이에서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트랩은 MHC 결합 홈에서 결합하는 항원성 펩티드의 C-말단에서의 시스테인 잔기와 MHC II형 알파 사슬에 위치한 결합 홈의 N-말단에서의 잔기 사이에 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트랩은 MHC 결합 홈에서 결합하는 항원성 펩티드의 C-말단에서의 시스테인 잔기와 MHC II형 알파 사슬에 위치한 결합 홈의 C-말단에서의 잔기 사이에 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트랩은 MHC 결합 홈에서 결합하는 항원성 펩티드의 N-말단에서의 시스테인 잔기와 MHC II형 베타 사슬에 위치한 결합 홈의 N-말단에서의 잔기 사이에 형성될 수 있다. 일부의 실시양태에 있어서, 시스테인 트랩은 MHC 결합 홈에서 결합하는 항원성 펩티드의 N-말단에서의 시스테인 잔기와 MHC II형 베타 사슬에 위치한 결합 홈의 C-말단에서의 잔기 사이에 형성될 수 있다. 일부의 실시양태에서, 시스테인 트랩은 MHC 결합 홈에서 결합하는 항원성 펩티드의 C-말단에서의 시스테인 잔기와 MHC II형 베타 사슬에 위치한 결합 홈의 N-말단에서의 잔기 사이에 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트랩은 MHC 결합 홈에서 결합하는 항원성 펩티드의 C-말단에서의 시스테인 잔기와 MHC II형 베타 사슬에 위치한 결합 홈의 C-말단에서의 잔기 사이에 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 결합 코어 폴리펩티드에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 아미노산 잔기를 시스테인으로 치환하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 시스테인 잔기를 다른 잔기와 인 프레임(in frame)으로 부가하는 것을 포함한다.
시스테인 트랩을 포함하는 폴리펩티드의 비제한적인 예는 서열 번호 60 및 61에 기재된 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트래핑을 위한 폴리펩티드는 서열 번호 60 및 61 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스테인으로의 돌연변이는 서열 번호 62 및 63에 기재된 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 그 이상의 잔기에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 트랩핑을 위한 폴리펩티드는 서열 번호 62 및 63 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스테인으로의 돌연변이는 서열 번호 62 및 63에 기재된 폴리펩티드의 어느 하나 또는 그 이상의 잔기에 있을 수 있다.
이종이량체 -나노입자 접합체
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체 및 비리포좀성이고/거나 고체 코어를 갖는 나노입자를 포함하는 이종이량체-나노입자 접합체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 고체 코어는 금속 또는 금속 산화물일 수 있다. 특정 실시양태에서, 고체 코어는 철, 산화철, 또는 금일 수 있다. 고체 코어는 밀도가 약 2.0 g/cm3, 약 3.0 g/cm3, 약 4.0 g/cm3, 약 5.0 g/cm3, 약 6.0 g/cm3, 또는 약 7.0 g/cm3 초과가 되도록 고밀도 코어일 수 있다. 특정 실시양태에서, 고체 코어의 밀도는 약 4.0 g/cm3 내지 약 8.0 g/cm3이다. 특정 실시양태에서, 고체 코어의 밀도는 약 5.0 g/cm3 내지 약 8.0 g/cm3이다. 특정 실시양태에서, 고체 코어의 밀도는 약 5.0 g/cm3 내지 약 7.0 g/cm3이다. 특정 실시양태에서, 고체 코어의 밀도는 약 5.0 g/cm3 내지 약 6.0 g/cm3이다.
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체 및 나노입자를 포함하는 이종이량체-나노입자 접합체로서, 나노입자는 비리포좀성이고 산화철 코어를 갖는 것인 이종이량체-나노입자 접합체를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체 및 나노입자를 포함하는 이종이량체-나노입자 접합체로서, 나노 입자는 비리포좀성이고 금 코어를 갖는 것인 이종이량체-나노입자 접합체를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체 및 나노입자를 포함하는 이종이량체-나노입자 접합체로서, 나노입자는 비리포좀성이고 산화철 코어를 가지며, 적어도 하나의 이종이량체는 링커를 통해 나노입자에 공유적으로 결합되는 것인 이종이량체-나노입자 접합체를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체 및 나노입자를 포함하는 이종이량체-나노입자 접합체로서, 나노 입자는 비리포좀성이고 산화철 코어를 가지며, 적어도 하나의 이종이량체는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 링커를 통해 나노입자에 공유적으로 결합되는 것인 이종이량체-나노입자 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체 및 나노입자를 포함하는 이종이량체-나노입자 접합체로서, 나노입자는 비리포좀성이고 산화철 코어를 가지며, 적어도 하나의 이종이량체는 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 링커를 통해 나노입자에 공유적으로 결합되는 것인 이종이량체-나노입자 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 1 kD, 2 kD, 3 kD, 4 kD, 5 kD, 6 kD, 7 kD, 8 kD, 9 kD, 또는 10 kD 미만의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 말레이미드로 작용기화된다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 1 kD 내지 약 5 kD, 약 2 kD 내지 약 5 kD, 약 3 kD 내지 약 5 kD의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 말레이미드로 작용기화된다. 특정 실시양태에서, 고체 코어와 접촉하는 링커의 말단은 고체 코어 내에 매립된다.
일부 양태에서, 나노입자 코어는 약 1 nm 내지 약 100 nm; 약 1 nm 내지 약 75 nm; 약 1 nm 내지 약 50 nm; 약 1 nm 내지 약 25 nm; 약 1 nm 내지 약 25 nm; 약 5 nm 내지 약 100 nm; 약 5 nm 내지 약 50 nm; 약 5 nm 내지 약 25 nm, 약 15 nm 내지 약 25 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 20 nm의 군으로부터 선택된 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 코어는 약 25 nm 내지 약 60 nm, 약 25 nm 내지 약 50 nm, 약 20 nm 내지 약 40 nm, 약 15 nm 내지 약 50 nm, 약 15 nm 내지 약 40 nm, 약 15 nm 내지 약 35 nm, 약 15 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 25 nm, 다르게는 약 15 nm, 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 또는 약 40 nm의 직경을 갖는다.
일부 양태에서, pMHC의 나노입자 코어당 개수(본원에서 나노입자 복합체의 "원자가"로 지칭됨)는 약 1 pMHC 복합체 대 1 나노입자 코어 내지 약 6000 pMHC 복합체 대 1 나노입자 코어, 다르게는 약 10:1 내지 약 6000:1, 다르게는 약 11:1 내지 약 6000:1, 다르게는 약 12:1 내지 약 6000:1, 다르게는 적어도 2:1, 다르게는 적어도 8:1, 다르게는 적어도 9:1, 다르게는 적어도 10:1, 다르게는 적어도 11:1, 또는 다르게는 적어도 12:1의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, pMHC의 나노입자 코어당 개수는 약 10:1 내지 약 6000:1, 약 20:1 내지 약 5500:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 5000:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 4000:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 3500:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 3000:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 2500:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 2000:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 1500:1, 다르게는 약 10:1 내지 1000:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 500:1, 다르게는 약 10:1 내지 약 100:1, 다르게는 약 20:1 내지 약 50:1, 다르게는 약 25:1 내지 약 60:1; 다르게는 약 30:1 내지 약 50:1, 다르게는 약 35:1 내지 약 45:1, 또는 다르게는 약 40:1이다. 일부 실시양태에서, 나노입자 코어당 pMHC의 개수는 약 10:1 내지 약 100:1, 약 10:1 내지 약 110:1, 약 10:1 내지 약 120:1, 약 10:1 내지 약 130:1, 약 10:1 내지 약 140:1, 약 10:1 내지 약 150:1, 또는 약 10:1 내지 약 160:1이다. 일부 실시양태에서, 나노입자 코어당 pMHC의 개수는 약 30:1 내지 약 100:1, 약 30:1 내지 약 110:1, 약 30:1 내지 약 120:1, 약 30:1 내지 약 130:1, 약 30:1 내지 약 140:1, 약 30:1 내지 약 150:1, 또는 약 30:1 내지 약 160:1이다. 일부 실시양태에서, 나노입자 코어당 pMHC의 개수는 약 32:1 내지 약 100:1, 약 32:1 내지 약 110:1, 약 32:1 내지 약 120:1, 약 30:1 내지 약 130:1, 약 32:1 내지 약 140:1, 약 32:1 내지 약 150:1, 또는 약 32:1 내지 약 160:1이다.
일부 양태에서, 나노입자 코어는 코어의 표면적당 정의된 원자가(본원에서 "밀도"로도 지칭됨)를 갖는다. 이들 양태에서, 나노입자 당 pMHC 밀도는 약 0.025 pMHC/100 nm2(나노입자 코어의 표면적) 내지 약 100 pMHC/100 nm2, 다르게는 약 0.406 pMHC/100 nm2 내지 약 50 pMHC/100 nm2, 또는 다르게는 약 0.05 pMHC/100 nm2 내지 약 25 pMHC/100 nm2이다. 특정 양태에서, 나노입자당 pMHC 밀도는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 25 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 20 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 15 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 14 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 13 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 12 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 11.6 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 11.5 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 11 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 10 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 9 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 8 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 7 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 6 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 5 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 4 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 3 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 2.5 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 2 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 1.5 pMHC/100 nm2이다.
또 다른 양태에서, 나노입자는 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 10 pMHC/100 nm2, 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 9 pMHC/100 nm2, 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 8 pMHC/100 nm2, 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 7 pMHC/100 nm2, 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 6 pMHC/100 nm2, 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 5 pMHC/100 nm2, 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 4 pMHC/100 nm2, 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 3 pMHC/100 nm2, 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 2 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 1.5 pMHC/100 nm2의 pMHC 밀도를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자는 약 0.22 pMHC/100 nm2 내지 약 10 pMHC/100 nm2, 0.24 pMHC/100 nm2 내지 약 9 pMHC/100 nm2, 약 0.26 pMHC/100 nm2 내지 약 8 pMHC/100 nm2, 약 0.28 pMHC/100 nm2 내지 약 7 pMHC/100 nm2, 약 0.24 pMHC/100 nm2 내지 약 4 pMHC/100 nm2, 약 0.5 pMHC/100 nm2 내지 약 3 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.6 pMHC/100 nm2 내지 약 1.5 pMHC/100 nm2의 pMHC 밀도를 갖는다. 추가 양태에서, 나노입자는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 1.3 pMHC/100 nm2, 다르게는 약 0.5 pMHC/100 nm2 내지 약 0.9 pMHC/100 nm2, 또는 다르게는 약 0.6 pMHC/100 nm2 내지 약 0.8 pMHC/100 nm2의 pMHC 밀도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 또는 12.0 pMHC/100 nm2의 pMHC 밀도를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 나노입자는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 1.5 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 2.5 pMHC/100 nm2, 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 6 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100nm2 내지 약 12 pMHC/100 nm2의 pMHC 밀도를 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 나노입자는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 1.3 pMHC/100 nm2, 다르게는 약 0.5 pMHC/100 nm2 내지 약 0.9 pMHC/100 nm2, 또는 다르게는 약 0.6 pMHC/100 nm2 내지 약 0.8 pMHC/100 nm2의 본원에 정의된 바와 같은 pMHC 밀도를 가지며, 또한, 상기 나노입자 코어는 약 25 nm 내지 약 60 nm, 약 25 nm 내지 약 50 nm, 약 20 nm 내지 약 40 nm, 약 15 nm 내지 약 50 nm, 약 15 nm 내지 약 40 nm, 약 15 nm 내지 약 35 nm, 약 15 nm 내지 약 30 nm, 약 15 nm 내지 약 25 nm, 다르게는 약 15 nm, 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 또는 약 40 nm, 또는 약 50 nm의 직경을 갖는다.
보조 자극 분자 성분
특정 양태에서, NP는 적어도 하나의 보조 자극 분자를 추가로 포함하거나, 다르게는 본질적으로 이로 이루어지거나, 또한, 이로 이루어진다. 보조 자극 분자는 미접촉 T 세포를 특이적 항원을 보유한 세포에 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 특이적 T 세포로 활성화하는 역할을 하는 생체 내 2차 신호를 생성하는 분자이다. 본 발명은 임의의 특정 보조 자극 분자에 제한되지는 않는다. 다양한 보조 자극 분자는 당 업계에 잘 알려져있다. 보조 자극 분자의 일부 비제한적인 예는 4-IBBL, OX40L, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86, CD30L, 및 ICOSL이다. 하나의 특정 보조 자극 분자만이 하나의 나노입자에 커플링될 수 있거나 다양한 보조 자극 분자가 동일한 나노입자에 커플링될 수 있다. 특정 실시양태에서, 보조 자극 분자는 T 세포 상의 보조 자극 수용체를 작용시킬 수 있는(agonizing) 항체와 같은 단백질이다. 이 경우, 항체는 미접촉 T 세포를 활성화하고 항원 특이적 방식으로 면역 반응을 유도하는데 필요한 보조 자극 신호를 유도할 수 있다. 부가적으로 또는 다르게는, 본원에서 사용되는 용어 "보조 자극 분자"는 또한 천연 보조 자극 신호전달 분자에 작용제 효과를 가짐으로써 보조 자극 신호를 생성할 수 있는 작용물질(agent)을 지칭할 수 있으며, 예를 들어, CD28 보조 자극 반응을 생성하는 항-CD28 또는 CD28 리간드이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 보조 자극 분자는 하기 분자 B7-1/CD80, BTLA, B7-2/CD86, CD28, B7-H1/PD-L1, CTLA-4, B7-H2, Gi24/VISTA/B7-H5, B7-H3, ICOS, B7-H4, PD-1, B7-H6, PD-L2/B7-DC, B7-H7, PDCD6, LILRA3/CD85e, LILRB2/CD85d/ILT4, LILRA4/CD85g/ILT7, LILRB3/CD85a/ILT5, LILRB1/CD85j/ILT2, LILRB4/CD85k/ILT3, 4-1BB/TNFRSF9/CD137, GITR 리간드/TNFSF18, 4-1BB 리간드/TNFSF9, HVEM/TNFRSF14, BAFF/BLyS/TNFSF13B, LIGHT/TNFSF14, BAFF R/TNFRSF13C, 림포톡신-알파/TNF-베타, CD27/TNFRSF7, OX40/TNFRSF4, CD27 리간드/TNFSF7, OX40 리간드/TNFSF4, CD30/TNFRSF8, RELT/TNFRSF19L, CD30 리간드/TNFSF8, TACI/TNFRSF13B, CD40/TNFRSF5, TL1A/TNFSF15, CD40 리간드/TNFSF5, TNF-알파, DR3/TNFRSF25, TNF RII/TNFRSF1B, GITR/TNFRSF18, 2B4/CD244/SLAMF4, CD84/SLAMF5, BLAME/SLAMF8, CD229/SLAMF3, CD2, CRACC/SLAMF7, CD2F-10/SLAMF9, NTB-A/SLAMF6, CD48/SLAMF2, SLAM/CD150, CD58/LFA-3, CD7, DPPIV/CD26, CD96, EphB6, CD160, 인테그린 알파 4 베타 1, CD200, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, CD300a/LMIR1, LAG-3, CRTAM, TIM-1/KIM-1/HAVCR, DAP12, TIM-4, 덱틴-1/CLEC7A, TSLP R, ICOSL, 및/또는 이들의 생물학적 등가물 중 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.
보조 자극 분자는 pMHC 복합체와 동일한 방식으로 나노입자에 커플링될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 보조 자극 분자와 항원/MHC 복합체는 나노입자에 개별적으로 부착된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 보조 자극 분자와 pMHC 복합체는 먼저 함께 복합체화된 후 나노입자에 복합체화된다. 다수의 보조 자극 분자가 나노입자에 커플링될 수 있다. 이들은 다수의 동일한 보조 자극 분자 또는 다수의 상이한 보조 자극 분자일 수 있다. 전형적으로, 폴리펩티드 복합체를 나노입자에 첨가하여 나노입자당 약 1 내지 6000개 분자, 또는 다르게는 최소 약 또는 최대 약 0.1, 0.5, 1, 10, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 이상:1의 보조 자극 분자의 개수: 나노입자의 개수의 비, 전형적으로 0.1:1 내지 약 50:1의 범위를 갖는 흡착된 또는 커플링된 폴리펩티드 복합체를 갖는 나노입자를 얻는다. 또 다른 양태에서, 보조 자극 분자 대 pMHC 복합체의 비는 약 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50 이상 대 1일 수 있으며, 바람직하게는 1:1, 1:2, 1:9, 1:10, 1:100, 2:1, 9:1, 10:1, 또는 100:1의 보조 자극 분자:pMHC 복합체의 비를 수득한다. 유사하게, 나노입자 표면적에 대한 보조 자극 분자의 밀도는 pMHC 복합체와 동일한 관계식에 따라 계산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 나노입자의 단위 표면적당 보조 자극 분자의 밀도는 약 0.0022 보조 자극 분자/100nm2 내지 약 13.26 보조 자극 분자/100nm2이다. 일부 실시양태에서, 보조 자극 분자의 밀도 범위는 pMHC 복합체의 밀도 범위와 동일하거나 상이할 수 있다.
나노입자가 하나 이상의 보조 자극 분자를 포함하고 pMHC 복합체를 포함하지 않는 일부 실시양태에서, 나노입자는 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 6.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 6 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 5.8 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 5.75 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 5.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 3.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 3 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 2.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 2 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1.25 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1 보조 자극 분자/100 nm2, 또는 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 0.75 보조 자극 분자/100 nm2의 보조 자극 분자 밀도를 갖는다.
또 다른 양태에서, 나노입자는 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 3.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 3 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 2.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 2 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1 보조 자극 분자/100 nm2, 또는 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 0.75 보조 자극 분자/100 nm2의 보조 자극 분자 밀도를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 코어는 약 0.11 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 5 보조 자극 분자/100 nm2, 0.12 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.13 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.14 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 3.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.12 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 2 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.25 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1.5 보조 자극 분자/100 nm2, 또는 약 0.3 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 0.75 보조 자극 분자/100 nm2의 보조 자극 분자 밀도를 갖는다. 추가 양태에서, 나노입자 코어는 약 0.2 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 0.65 보조 자극 분자/100 nm2, 다르게는 약 0.25 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 0.45 보조 자극 분자/100 nm2, 또는 다르게는 약 0.3 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2의 보조 자극 분자 밀도를 갖는다.
나노입자가 pMHC 복합체 및 하나 이상의 보조 자극 분자를 포함하는 일부 실시양태에서, 나노입자는 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 13 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 12 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 11.6 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 11.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 11 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 10 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 9 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 8 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 7 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 6 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 3 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 2.5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 2 보조 자극 분자/100 nm2, 또는 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1.5 보조 자극 분자/100 nm2의 보조 자극 분자 밀도를 갖는다.
또 다른 양태에서, 나노입자는 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 10 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 9 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 8 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 7 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 6 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 5 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 3 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 2 보조 자극 분자/100 nm2, 또는 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1.5 보조 자극 분자/100 nm2의 보조 자극 분자 밀도를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 코어는 약 0.22 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 10 보조 자극 분자/100 nm2, 0.24 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 9 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.26 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 8 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.28 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 7 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.24 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 4 보조 자극 분자/100 nm2, 약 0.5 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 3 보조 자극 분자/100 nm2, 또는 약 0.6 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1.5 보조 자극 분자/100 nm2의 보조 자극 분자 밀도를 갖는다. 추가 양태에서, 나노입자는 약 0.4 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 1.3 보조 자극 분자/100 nm2, 다르게는 약 0.5 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 0.9 보조 자극 분자/100 nm2, 또는 다르게는 약 0.6 보조 자극 분자/100 nm2 내지 약 0.8 보조 자극 분자/100 nm2의 보조 자극 분자 밀도를 갖는다.
한 양태에서, 나노입자는 보조 자극 분자를 포함하고 펩티드-MHC 성분을 전혀 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 이 보조 자극 분자 나노입자 복합체는 나노입자 펩티드-MHC-복합체와 혼합되어 2개의 상이한 나노입자 집단, 즉 보조 자극 분자만을 포함하는 하나와 펩티드-MHC만을 포함하는 하나를 포함하는 조성물을 형성한다. 이 두 집단은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 또는 1:9를 포함하는 임의의 적합한 비의 보조 자극 분자 포함 나노입자 대 펩티드-MHC 포함 나노입자; 또는 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 또는 1:9의 펩티드-MHC 포함 나노입자 대 보조 자극 분자 포함 나노입자로 혼합될 수 있다.
사이토카인
특정 양태에서, NP는 적어도 하나의 사이토카인 분자를 추가로 포함하거나, 다르게는 본질적으로 이로 이루어지거나, 또한, 이로 이루어진다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "사이토카인"은 분자 및 세포 수준에서 체내의 광범위한 생물학적 과정을 조절하기 위한 신호전달 분자로서 작용하는 면역계의 다양한 세포에 의해 분비되는 저분자량 단백질을 포함한다. "사이토카인"은 림포카인, 인터루킨, 또는 케모카인의 부류에 속하는 각각의 면역 조절 단백질을 포함한다.
비제한적인 예가 본원에 개시되어있다: 예를 들어, IL-1A 및 IL-1B는 인간 인터루킨-1(IL-1) 패밀리의 2개의 다른 구성원이다. 성숙한 IL-1A는 섬유아세포 활성화 인자(FAF: fibroblast-activating factor), 림프구 활성화 인자(LAF: lymphocyte-activating factor), B 세포 활성화 인자(BAF: B-cell-activating factor), 백혈구 내인성 매개 인자(LEM: leukocyte endogenous mediator) 등으로도 알려진 18 kDa 단백질이다. IL-4는 T 헬퍼-2(Th2) 세포 분화를 유도하는 사이토카인이며, IL-13과 밀접한 관련이 있으며 유사한 기능을 갖는다. IL-5는 Th2 세포와 비만 세포에 의해 생성된다. 이는 B 세포 성장을 촉진하고 면역글로불린 분비를 증가시키는 역할을 한다. 이는 또한 호산구 활성화에 관여한다. IL-6는 염증촉진성(pro-inflammatory) 또는 항염증성 사이토카인으로 작용할 수 있는 인터루킨이다. 이는 염증을 일으키는 외상이나 다른 조직 손상에 대한 면역 반응을 자극하는 T 세포와 대식 세포에 의해 분비된다. IL-6는 또한 근육 수축에 반응하여 근육으로부터 생산된다. IL-8은 대식세포 및 다른 세포 유형, 예를 들어 상피 세포 및 내피세포에 의해 생성되는 케모카인이며, 선천적 면역계 반응에서 면역 반응의 중요한 매개 인자로서 역할을 한다. IL-12는 미접촉 T 세포의 T 헬퍼(Th1 또는 Th2) 세포로의 분화에 관여한다. 이종이량체 사이토카인으로서, IL-12는 2개의 별개의 유전자에 의해 코딩된 2개의 서브유닛, IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)가 단백질 합성 후에 이량체화된 후에 형성된다. IL-12p70은 이종이량체 조성을 나타낸다. 많은 세포 유형, 특히 Th2 세포에 의해 분비되는 사이토카인인 IL-13은 알레르기성 염증 및 질환의 중요한 매개 인자이다. IL-17은 T 헬퍼 세포에서 생산되는 사이토카인이며 IL-23에 의해 유도되어 지연형 반응에서 파괴적인 조직 손상을 일으킨다. IL-17은 세포 외 병원체에 의한 면역계의 침입에 반응하고 병원체 세포 매트릭스의 파괴를 유도하는 염증촉진성 사이토카인으로서 기능을 한다. IP-10, 또는 인터페론 감마-유도된 단백질 10은 C-X-C 모티프 케모카인 10(CXCL10) 또는 작은 유도성 사이토카인 B10으로도 알려져있다. CXC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인으로서, IP-10은 IFN-γ에 반응하여 여러 세포 유형(단핵구, 내피세포, 및 섬유아세포 포함)에 의해 분비된다. 대식세포 염증성 단백질(MIP: Macrophage Inflammatory Protein)은 케모카인 패밀리에 속한다. 인간 MIP의 두 가지 주요 형태인 MIP-1α와 MIP-1β가 있으며, 이들은 각각 케모카인(C-C 모티프) 리간드 3(CCL3)과 CCL4로도 알려져있다. 둘 다 박테리아 내독소로의 자극 후 대식세포에 의해 생성된다. 집락 자극 인자 3으로도 알려져있는 과립구 집락 자극 인자(Granulocyte colony-stimulating factor)(G-CSF 또는 GCSF)는 집락 자극 인자 호르몬이다. G-CSF는 골수를 자극하여 과립구 및 줄기세포를 생성하기 위해 다수의 상이한 조직에 의해 생성되는 당단백질, 성장 인자 및 사이토카인이다. G-CSF는 또한 호중구 전구체 및 성숙한 호중구의 생존, 증식, 분화 및 기능을 자극한다. 표피 성장 인자 또는 EGF는 그의 수용체 EGFR에 고친화성으로 결합함으로써 세포 성장, 증식, 및 분화의 조절에 중요한 역할을 하는 성장 인자이다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF: Vascular endothelial growth factor)는 혈관 형성(vasculogenesis)(배아 순환계의 새로운 형성)과 혈관신생(angiogenesis)(기존 맥관 구조에서 혈관의 성장) 모두에 관여하는 중요한 신호 전달 단백질인 성장 인자의 패밀리이다.
사이토카인 또는 사이토카인들은 pMHC 복합체와 동일한 방식으로 나노입자에 커플링될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인들 및 pMHC 복합체는 나노입자에 개별적으로 부착된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인들 분자 및 pMHC 복합체는 먼저 함께 복합체화된 후 이어서 나노입자에 복합체화된다. 다수의 사이토카인이 나노입자에 커플링 될 수 있으며; 이들은 다수의 동일한 사이토카인 또는 상이한 사이토카인일 수 있다.
일부 실시양태에서, 사이토카인은 항-사이토카인 항체에 복합체화되어 사이토카인/항-사이토카인 항체 복합체를 형성하며, 이 복합체는 이어서 나노입자에 복합체화된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인/항-사이토카인 항체 복합체는 IL-2/항-IL-2 복합체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. IL-2/항-IL-2 복합체는 작용성 또는 길항성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 사이토카인은 사이토카인 수용체에 복합체화되어 사이토카인/사이토카인 수용체 복합체를 형성하고, 이어서 이 복합체는 나노입자에 복합체화된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인/사이토카인 수용체 복합체는 IL-15/IL-15Ra 및/또는 IL-1/IL-2Ra를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, IL-15/IL-15Ra 복합체는 T 세포 보조 자극 인자로서 기능을 할 수 있다.
전형적으로, 폴리펩티드 복합체를 나노입자에 첨가하여 나노입자당 약 1 내지 5999개 분자, 또는 다르게는 최소 약 또는 최대 약 0.1, 0.5, 1, 10, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 이상 대 1의 사이토카인의 개수: 나노입자의 개수의 비, 예를 들어 0.1:1 내지 약 50:1의 범위를 갖는 흡착된 또는 커플링된 폴리펩티드 복합체를 갖는 나노입자를 얻는다. 다른 양태에서, 사이토카인 대 항원/MHC 복합체의 비는 약 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50 이상 대 1일 수 있으며, 바람직하게는 1:1, 1:2, 1:9, 1:10, 1:100, 2:1, 9:1, 10:1, 또는 100:1의 사이토카인 대 항원/MHC 비를 수득한다. 유사하게, 나노입자 표면적에 대한 사이토카인의 밀도는 항원/MHC 복합체와 동일한 관계식에 따라 계산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 나노입자의 단위 표면적당 사이토카인의 밀도는 약 0.0022 사이토카인/100nm2 내지 약 13.26 사이토카인/100nm2이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인의 밀도 범위는 항원/MHC 복합체의 밀도 범위와 동일하거나 상이할 수 있다.
한 양태에서, 나노입자는 사이토카인 분자를 포함하고 펩티드-MHC 성분을 전혀 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 이 사이토카인 분자 나노입자 복합체는 나노입자 펩티드-MHC 복합체와 혼합되어 2개의 상이한 나노입자 집단, 즉 사이토카인 분자만을 포함하는 하나와 펩티드-MHC만을 포함하는 하나를 포함하는 조성물을 형성한다. 이 두 집단은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 또는 1:9를 포함하는 임의의 적합한 비의 사이토카인 분자 포함 나노입자 대 펩티드-MHC 포함 나노입자; 또는 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 또는 1:9의 펩티드-MHC 포함 나노입자 대 사이토카인 분자 포함 나노입자로 혼합될 수 있다.
NP 합성
나노입자는, 미국 특허 제4,589,330호 또는 제4,818,542호에 교시된 바와 같이, 보조 자극 분자(들), pMHC 복합체, 및/또는 사이토카인, 및 중합체를 함유하는 수성상과 비수성 상을 접촉시킨 후 비수성 상을 증발시켜 수성 상으로부터 입자들의 합체를 유발하여 형성될 수 있다. 이러한 제제를 위한 특정 중합체는 젤라틴, 한천, 전분, 아라비노갈락탄, 알부민, 콜라겐, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 글리콜리드-L(-) 락티드 폴리(엡실론-카프로락톤, 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-락트산), 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-글리콜산), 폴리(β-히드록시 부티르산), 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리에틸렌, 폴리(알킬-2-시아노아크릴레이트), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리아미드, 폴리(아미노산), 폴리(2-히드록시에틸 DL-아스파타미드), 폴리(에스테르 요소), 폴리(L-페닐알라닌/에틸렌 글리콜/1,6-디이소시아네이토헥산), 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함하는 천연 또는 합성 공중합체 또는 중합체이다. 구체적으로, 특정 중합체는, 폴리에스테르, 예를 들어 폴리글리콜산, 폴리락트산, 글리콜리드-L(-) 락티드 폴리(엡실론-카프로락톤), 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-락트산), 및 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-글리콜산)이다. 중합체를 용해 시키는데 유용한 용매는 물, 헥사플루오로이소프로판올, 메틸렌클로라이드, 테트라히드로푸란, 헥산, 벤젠, 또는 헥사플루오로아세톤 세스퀴하이드레이트를 포함한다.
금 나노입자(GNP: gold nanoparicle)는 문헌[Perrault, S.D. et al. (2009) Nano Lett 9:1909-1915]에 기재된 바와 같이 시트르산나트륨으로 염화금을 화학적으로 환원시켜 합성한다. 간략하게, 2 mL의 1% HAuCl4(Sigma Aldrich)를 100 mL의 H2O에 격렬히 교반하면서 첨가하고 용액을 오일조에서 가열한다. 6 mL(14 nm GNP일 경우) 또는 2 mL(40 nm GNP일 경우)의 1% 시트르산나트륨을 끓는 HAuCl4 용액에 첨가하고 10분간 더 교반한 후 실온으로 냉각시킨다. GNP는 MHC의 수용체로서 -COOH 또는 -NH2 기로 작용기화된 1 μMol의 티올-PEG 링커(Nanocs, MA)를 첨가함으로써 안정화된다. 페길화된 GNP는 유리 티올-PEG를 제거하기 위해 물로 세척하고, 농축하고, 추가 분석을 위해 물에 보관한다. NP 밀도는 분광 측정법을 통해 결정하고 비어(Beer)의 법칙에 따라 계산한다.
또한, SFP 계열 산화철 NP(SFP IONP)가 계면 활성제의 존재하에 유기 용매 중 아세트산철의 열분해에 의해 제조될 수 있으며, 이어서 페길화에 의해 수성 완충액에서 용매로 된다(Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014; Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56:821-826). 간략하게, 벤질 에테르와 올레일아민의 10 mL의 혼합물에 2 mMol Fe(acac)3(Sigma Aldrich, 온타리오주 오크빌 소재)을 용해하고 1시간 동안 100℃로 가열한 다음 질소 블랭킷 보호하에서 환류시키면서 300℃로 2시간 동안 가열한다. 합성된 NP는 에탄올을 첨가하여 침전시키고 헥산에 재현탁한다. IONP의 페길화를 위해, 100 mg의 상이한 3.5 kDa DPA-PEG 링커(JenKem Tech USA)를 CHCl3과 HCON(CH3)2(디메틸포름아미드(DMF))의 혼합물에 용해하였다. 그런 후, NP 용액(20mg Fe)을 DPA-PEG 용액에 첨가하고 실온에서 4시간 동안 교반한다. 헥산을 첨가하여 페길화된 SFP NP를 밤새 침전시킨 후 물에 재현탁한다. 미량의 응집체를 고속 원심 분리(20,000 xg, 30분)로 제거하고, 단분산 SFP NP를 추가 특징규명 및 pMHC 접합을 위해 물에 보관한다. IONP 산물 중 철 농도는 2N HCL 중에 A410에서 분광 측정법으로 결정한다. 분자 구조 및 SFP NP의 분자 구조와 직경(Fe3O4; 8±1 nm 직경)(Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014)에 기초하여, 본 출원인은 1mg의 철을 함유하는 SFP 용액이 5x1014 NP를 함유하고 있다고 추산한다.
나노입자는 또한 나노입자 전구체를 열분해 또는 가열함으로써 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 나노입자는 금속 또는 금속 산화물 나노입자이다. 한 실시양태에서, 나노입자는 산화철 나노입자이다. 한 실시양태에서, 나노입자는 금 나노입자이다. 본원의 한 실시양태에서, 본 기술에 따라 제조된 나노입자를 제공한다. 본원의 한 실시양태에서, 철 아세틸 아세토네이트의 열분해 반응을 포함하는 산화철 나노입자의 제조 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 수득한 산화철 나노입자는 수용성이다. 한 양태에서, 산화철 나노입자는 단백질 접합에 적합하다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 단일 단계의 열분해 반응을 포함한다.
한 양태에서, 열분해는 작용기화된 PEG 분자의 존재하에 일어난다.
한 양태에서, 열분해는 철 아세틸 아세토네이트를 가열하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 열분해는 작용기화된 PEG 분자의 존재하에서 철 아세틸 아세토네이트를 가열하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 열분해는 벤질 에테르 및 작용기화된 PEG 분자의 존재하에 철 아세틸 아세토네이트를 가열하는 단계를 포함한다.
이론에 구애됨 없이, 한 실시양태에서, 작용기화된 PEG 분자는 환원 시약으로서와 계면 활성제로서 사용된다. 본원에서 제공된 나노입자를 제조하는 방법은 입자를 수용성으로 만들기 위해 PEG 분자에 의해 대체되기 어렵거나 완전히 대체되지 않는 계면 활성제를 사용하는 종래의 방법을 단순화시키고 개선한다. 통상적으로, 계면 활성제는 고가(예를 들어, 인지질)이거나 독성(예를 들어, 올레산 또는 올레일아민)을 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 이론에 구애됨 없이, 나노입자를 제조하는 방법은 통상적인 계면 활성제를 사용할 필요가 없어서, 높은 수준의 분자 순도 및 수 용해도를 달성한다.
한 실시양태에서, 열분해는 본원에서 사용된 것 이외의 통상적인 계면 활성제의 부재 하에서 철 아세틸 아세토네이트 및 벤질 에테르를 수반한다.
한 실시양태에서, 열분해를 위한 온도는 약 80℃ 내지 약 300℃, 또는 약 80℃ 내지 약 200℃, 또는 약 80℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 250℃ 또는 약 100℃ 내지 약 200℃, 또는 약 150℃ 내지 약 250℃, 또는 약 150℃ 내지 약 250℃이다. 한 실시양태에서, 열분해는 약 1 내지 약 2시간에 일어난다.
한 실시양태에서, 산화철 나노입자를 제조하는 방법은 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec) LS 자석 칼럼을 사용하는 것과 같은 정제 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 나노입자는 약 4℃에서 인산 완충 식염수(PBS: phosphate buffer Saline) 중에서 어떠한 검출 가능한 분해 또는 응집 없이 안정하다. 한 실시양태에서, 나노입자는 6개월 이상 안정하다.
본원의 한 양태에서, 산화철 나노입자 복합체의 제조 방법으로서, pMHC를 본원에 제공된 산화철 나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이론에 구애됨이 없이, pMHC는 그의 카르복시 말단에서 시스테인을 코딩하며, 이는 약 pH 6.2 내지 약 pH 6.5에서 약 12 내지 약 14시간 동안 작용기화된 PEG 내 말레이미드 기와 반응할 수 있다.
한 양태에서, 나노입자 복합체를 제조하는 방법은 밀테니 바이오텍 LS 자석 칼럼을 사용하는 것과 같은 정제 단계를 포함한다.
질환 관련 항원
MHC-NP의 pMHC 복합체는 치료하고자 하는 질환에 기초하여 사용하기 위해 선택된다. 예를 들어, 당뇨병 관련 항원은 자가면역 질환에서 표적화된 세포, 조직 또는 기관에서 발현되고 자가면역 반응에 의해 야기된 세포, 조직 또는 기관 손상시 면역계에 노출되는 항원 또는 이의 단편이며, 항원이 질환 과정의 유발 인자가 아니거나 이의 병인의 주요 작용 인자가 아니더라도, 제시될 때 당뇨병을 치료하는데 도움이 되는 면역 반응을 일으킨다. 따라서, 이 정의를 충족시키는 당뇨병 관련 항원은 당뇨병을 치료하기 위해 선택된다. MS 관련 항원은 MS를 치료하기 위해 선택된다. 당뇨병 관련 항원은 MS를 치료하기 위해 선택되지 않는다. 암 관련 또는 종양 관련 항원은 암 및/또는 종양을 치료한다. 비제한적이고, 예시적인 질환 관련 항원이 본원에 개시되어 있고, 또한 그러한 항원은 문헌에 잘 기술된 기술, 기전, 및 방법에 기초하여 특정 질환에 대해 결정될 수 있다.
특정 양태에서, 항원-MHC 복합체에 포함된 질환 관련 항원은 자가면역 질환 관련 항원, 염증 관련 항원, 또는 알레르기성 질환 관련 항원으로부터 선택된다. 추가의 양태에서, 면역 염증 관련 항원은 천식 관련 항원, 당뇨병 관련 항원, 전당뇨병 관련 항원, 다발성 경화증 관련 항원, 알레르기성 천식 관련 항원, 원발성 담즙성 간경화증 관련 항원, 간경화증 관련 항원, 시신경척수염 스펙트럼 장애(데빅병, NMO) 관련 항원, 자가면역 뇌염 관련 항원, 자가 항체 매개 신경학적 증후군 관련 항원, 강직 인간 증후군 관련 항원, 부종양(paraneoplastic) 질환 관련 항원, 중추 및 말초 신경계의 다른 질환 관련 항원, 심상성 천포창 관련 항원, 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease) 관련 항원, 크론병 관련 항원, 궤양성 대장염 관련 항원, 관절염 관련 항원, 류마티스 관절염 관련 항원, 전신 홍반 루푸스(SLE: systemic lupus erythematosus) 관련 항원, 셀리악병 관련 항원, 건선 관련 항원, 원형 탈모증 관련 항원, 후천성 혈소판 감소 자색반 관련 항원, 자가면역성 심근병증 관련 항원, 특발성 확장성 심근병증(IDCM: idiopathic dilated cardiomyopathy) 관련 항원, 중증 근무력증 관련 항원, 포도막염 관련 항원, 강직성 척추염 관련 항원, 그레이브스병 관련 항원, 하시모토 갑상선염 관련 항원, 면역 매개 근병증 관련 항원, 항인지질 증후군(ANCA+) 관련 항원, 죽상경화증 관련 항원, 피부경화증 관련 항원, 자가면역성 간염 관련 항원, 피부근염 관련 항원, 만성 폐쇄성 폐질환 관련 항원, 척수 손상 관련 항원, 외상성 손상 관련 항원, 담배 유도성 폐 파괴 관련 항원, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD: Chronic Obstructive Pulmonary Disease) 관련 항원, 폐기종 관련 항원, 경화성 담관염 관련 항원, 말초 신경병증 관련 항원, 기면증 관련 항원, 굿파스처 증후군 관련 항원, 가와사키 질환 관련 항원, 자가면역 포도막염 관련 항원, 대장염 관련 항원, 폐기종 관련 항원, 천포창 관련 항원, 낙엽상 천포창 관련 항원, 관절염 관련 항원, 쇼그렌 증후군 관련 항원, ANCA 관련 혈관염 관련 항원, 원발성 경화성 담관염 관련 항원, 지방 조직 염증/II형 당뇨병 관련 항원, 또는 비만 관련 지방 조직 염증/인슐린 내성 관련 항원의 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
특정 양태에서, 질환 관련 항원은 하기 군 중 하나 이상으로부터 유래한다: PPI, IGRP, GAD, 페리페린, 아글리아(aGlia), PDC-E2, 인슐린, DG1EC2, DG3, AQP4, PLP, MOG, MBP, CII, DERP1, DERP2, OVA, BacInt, CBir, Fla-X, Fla-2, YIDX, AChR, 갑상선 페록시다제, 갑상선 수용체, 인지질 항원, H4, H2B, H1, DNA, ApoB, ApoE, NMDAR, 전압 개폐 칼륨 통로, 엘라스틴, 아레스틴, PERM_HUMAN 미엘로페록시다제, PRTN3_HUMAN 미엘로블라스틴, CP2D6_HUMAN 시토크롬 P450 2D6, SPCS_HUMAN O-포스포세릴-tRNA(Sec) 셀레늄 트랜스퍼라아제, CAMP_HUMAN 카텔리시딘 항균 펩티드, DNA 토포이소머라아제 I, CENP-C, APOH_HUMAN 베타-2-당단백질 1, RO60_HUMAN 60 kDa SS-A/Ro 리보핵단백질, LA_HUMAN 루푸스 La 단백질, IRBP, 미오신, CD1d-결합 지질 항원, Cap18, CP2D6, SPCS, RO60, RO52, LA, APOH, MPO, PRTN3, 또는 HSP.
일부 실시양태에서, 질환 관련 항원은:
a) 당뇨병 관련 항원이며, 프리프로인슐린(PPI: preproinsulin), 췌도 특이적 글루코오스-6-포스파타아제(IGRP), 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD), 췌도 세포 자가 항원-2(ICA2), 인슐린, 프로인슐린, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
b) 다발성 경화증 관련 항원이며, 미엘린 염기성 단백질, 미엘린 관련 당단백질, 미엘린 희소 돌기 아교세포 단백질, 프로테오리피드 단백질, 희소 돌기 아교세포 미엘린 올리고단백질, 미엘린 관련 희소 돌기 아교세포 염기성 단백질, 희소 돌기 아교세포 특이적 단백질, 열 충격 단백질, 희소 돌기 아교세포 특이적 단백질, NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22, 2'3'-시클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라아제, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
c) 셀리악병 관련 항원이며, 글리아딘, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
d) 원발성 담즙성 간경화증 관련 항원이며, PDC-E2, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
e) 낙엽상 천포창 관련 항원 및/또는 심상성 천포창 관련 항원이며, DG1, DG3, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
f) 시신경척수염 스펙트럼 장애 관련 항원이며, AQP4, 또는 이의 단편 또는 등가물으로부터 유래하거나;
g) 관절염 관련 항원이며, 열 충격 단백질, 면역글로불린 결합 단백질, 이종 핵 RNP, 아넥신 V, 칼파스타틴, II형 콜라겐, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 신장 인자(elongation factor) 인간 연골 gp39, 만노오스 결합 렉틴, 시트룰린화된 비멘틴, II형 콜라겐, 피브리노겐, 알파 에놀라아제, 항-카르바밀화된 단백질(항-CarP), 펩티딜 아르기닌 데이미나아제 4형(PAD4), BRAF, 피브리노겐 감마 사슬, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H1, 알파-1-항트립신, 혈장 프로테아제 C1 억제제, 겔솔린, 알파 1-B 당단백질, 세룰로플라스민, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H4, 보체 인자 H, 알파 2 마크로글로불린, 혈청 아밀로이드, C-반응성 단백질, 혈청 알부민, 피브로겐 베타 사슬, 세로트랜스페린, 알파 2 HS 당단백질, 비멘틴, 보체 C3, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
h) 알레르기성 천식 관련 항원이며, DERP1, DERP2, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
i) 염증성 장 질환 관련 항원이며, 플라젤린, Fla-2, Fla-X, YIDX, 박테로이데스 인테그라아제, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
j) 전신 홍반 루푸스 관련 항원이며, 이중 가닥(ds)DNA, 리보핵단백질(RNP), 스미스(Sm), 쇼그렌 증후군 관련　항원　A(SS-A)/Ro, 쇼그렌 증후군 관련　항원　B(SS-B)/La, RO60, RO52, 히스톤, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
k) 죽상경화증 관련 항원이며, ApoB, ApoE 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
l) COPD 관련 항원 및/또는 폐기종 관련 항원이며, 엘라스틴, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
m) 건선 관련 항원이며, Cap18, ADMTSL5, ATL5, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
n) 자가면역성 간염 관련 항원이며, CYP2D6, SLA, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
o) 포도막염 관련 항원이며, 아레스틴, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
p) 쇼그렌 증후군 관련 항원이며, (SS-A)/Ro, (SS-B)/La, MR3, RO60, RO52, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
q) 피부경화증 관련 항원이며, CENP-C, TOP 1, RNA 폴리머라아제 III, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
r) 항인지질 증후군 관련 항원이며, APOH, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
s) ANCA 관련 혈관염 관련 항원이며, MPO, PRTN3, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
t) 강직 인간 증후군 관련 항원이며, GAD, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래한다.
당뇨병 관련 항원
당뇨병 관련 항원은 PPI, IGRP, GAD, 췌도 세포 자가 항원-2(ICA2) 및/또는 인슐린으로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 자가 반응성, 당뇨병 관련 항원성 펩티드는 미국 공개 제2005/0202032호(그 전문으로 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 펩티드 및 단백질 이외에 하기 표 1에 열거된 것, 및 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
MS 관련 항원
본 발명의 항원은 다발성 경화증과 관련된 항원을 포함한다. 이러한 항원은, 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 제2012/0077686호에 개시된 항원, 및 미엘린 염기성 단백질, 미엘린 관련 당단백질, 미엘린 희소 돌기 아교세포 단백질, 프로테오리피드 단백질, 희소 돌기 아교세포 미엘린 올리고단백질, 미엘린 관련 희소 돌기 아교세포 염기성 단백질, 희소 돌기 아교세포 특이적 단백질, 열 충격 단백질, 희소 돌기 아교세포 특이적 단백질 NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22, 또는 2'3'-시클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라아제로부터 유래한 항원을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원은 미엘린 희소 돌기 아교세포 당단백질(MOG: Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein)로부터 유래한다.
또 다른 양태에서, MS 및 MS 관련 장애를 치료하기 위한 펩티드 항원은 표 2에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 제한 없이 포함한다.
셀리악병 (CD) 관련 항원
셀리악병과 관련된 항원은 글리아딘으로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 글리아딘의 비제한적 유형은 알파/베타 글리아딘, γ-글리아딘, 또는 ω-글리아딘을 포함한다. 다른 비제한적이고 예시적인 셀리악병 관련 항원은 표 3에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
원발성 담즙성 간경화증( PBC : Primary Biliary Cirrhosis) 관련 항원
원발성 담즙성 간경변증과 관련된 항원은 PDC-E2로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 항원의 비제한적인 예는 표 4에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
낙엽상 천포창 ( PF : Pemphigus Folliaceus ) 및 심상성 천포창 ( PV : Pemphigus Vulgaris) 관련 항원
PF 및 PV와 관련된 항원은 데스모글레인 3(DG3) 및/또는 데스모글레인 1(DG1)에서 유래한 것들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 비제한적 예는 표 5에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
시신경척수염 스펙트럼 장애( NMO : Neuromyelitis optica spectrum disorder) 관련 항원
NMO와 관련된 항원은 AQP4 또는 아쿠아포린 4로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적인 예는 표 6에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
관절염 관련 항원
관절염과 관련된 항원은 열 충격 단백질, 면역글로불린 결합 단백질, 이종 핵 RNP, 아넥신 V, 칼파스타틴, II형 콜라겐, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 신장 인자 인간 연골 gp39, 만노오스 결합 렉틴, 시트룰린화된 비멘틴, II형 콜라겐, 피브리노겐, 알파 에놀라아제, 항-카르바밀화된 단백질(항-CarP), 펩티딜 아르기닌 데이미나아제 4형(PAD4), BRAF, 피브리노겐 감마 사슬, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H1, 알파-1-항트립신, 혈장 프로테아제 C1 억제제, 겔솔린, 알파 1-B 당단백질, 세룰로플라스민, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H4, 보체 인자 H, 알파 2 마크로글로불린, 혈청 아밀로이드, C-반응성 단백질, 혈청 알부민, 피브로겐 베타 사슬, 세로트랜스페린, 알파 2 HS 당단백질, 비멘틴, 보체 C3, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
알레르기성 천식 관련 항원
알레르기성 천식과 관련된 항원은 DERP1 및 DERP2로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적 예는 표 7에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
염증성 장 질환 관련 항원
염증성 장 질환과 관련된 항원은 크론병 관련 항원 및 궤양성 대장염 관련 항원을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환 관련 항원은 박테로이데스 인테그라아제, 플라젤린, 플라젤린 2(Fla-2/Fla-X), 또는 특징규명되지 않은 이. 콜라이 단백질(YIDX)로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적인 예는 표 8에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
전신 홍반 루푸스( SLE ) 관련 항원
SLE과 관련된 항원은 H4, H2B, H1', dsDNA, RNP, 스미스(Sm), 쇼그렌 증후군 관련 항원 A(SS-A)/Ro, 쇼그렌 증후군 관련 항원 B(SS-B)/La, 및/또는 히스톤으로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 히스톤은 H4, H2B, H1'을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적인 예는 표 9에 나열된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
죽상경화증 관련 항원
죽상경화증과 관련된 항원은 아포지질단백질 B(ApoB) 또는 아포지질단백질 E (ApoE)로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적인 예는 표 10에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
만성 폐쇄성 폐질환( COPD ) 및/또는 폐기종 관련 항원
COPD 및/또는 폐기종과 관련된 항원은 엘라스틴으로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적인 예는 표 11에 열거된 것들뿐만 아니라 이들 각각의 등가물 및/또는 조합을 포함한다.
건선 관련 항원
건선과 관련된 항원은 하기 표 12에 열거된 것들뿐만 아니라 이들의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 비제한적이고 예시적인 건선 관련 항원은 인간 아다미스 유사 단백질 5(ATL5), 카텔리시딘 항균 펩티드(CAP18), 및/또는 ADAMTS 유사 단백질 5(ADMTSL5)로부터 유래할 수 있다.
자가면역성 간염 관련 항원
자가면역성 간염 관련 항원은 하기 표 13에 개시된 것들뿐만 아니라 이들의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 비제한적이고 예시적인 자가면역성 간염 관련 항원은 마이크로솜 시토크롬 P450IID6(CYP2D6) 및/또는 가용성 간 항원(SLA: soluble liver antigen)으로부터 유래할 수 있다.
포도막염 관련 항원
포도막염 관련 항원은 하기 표 14에 개시된 것들뿐만 아니라 이들의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 비제한적이고 예시적인 포도막염 관련 항원은 아레스틴, 인간 망막 S 항원, 및/또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP: interphotoreceptor retinoid-binding protein)로부터 유래할 수 있다.
쇼그렌 증후군 관련 항원
쇼그렌 증후군 관련 항원은 하기 표 15에 개시된 것들뿐만 아니라 이들의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 비제한적이고 예시적인 쇼그렌 증후군 관련 항원은 (SS-A)/Ro, (SS-B)/La, RO60, RO52, 및/또는 무스카린 수용체 3(MR3)로부터 유래할 수 있다.
피부경화증 관련 항원
피부경화증 관련 항원은 하기 표 16에 개시된 것들뿐만 아니라 이들의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적이고 예시적인 피부경화증 관련 항원은 동원체 자가 항원 동원체 단백질 C(CENP-C), DNA 토포이소머라아제 I(TOP1) 및/또는 RNA 폴리머라아제 III으로부터 유래할 수 있다.
항인지질 증후군 관련 항원
항인지질 증후군 관련 항원은 하기 표 17에 개시된 것들뿐만 아니라 이들의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적이고 예시적인 항 인지질 증후군 관련 항원은 베타-2-당단백질 1(BG2P1 또는 APOH)로부터 유래할 수 있다.
ANCA 관련 혈관염 관련 항원
ANCA 관련 혈관염 관련 항원은 하기 표 18에 개시된 것뿐만 아니라 이들의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적이고 예시적인 ANCA-관련 혈관염 관련 항원은 미엘로페록시다제(MPO: myeloperoxidase), 프로테이나아제(PRTN3), 또는 박테리아 투과성 증가 인자(BPI: bacterial permeability increasing factor)로부터 유래할 수 있다.
강직 인간 증후군 관련 항원
강직 인간 증후군 관련 항원은 하기 표 14에 개시된 것들뿐만 아니라 이들의 등가물 및/또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 비제한적이고 예시적인 강직 인간 증후군 관련 항원은 글루타메이트 디카르복실라제(GAD)로부터 유래할 수 있다. 일부 실시 예에서, GAD는 GAD65를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물에서, 조성물에 ml당 약 0.001 mg 내지 약 10 mg의 총 단백질이 존재하는 것으로 고려된다. 따라서, 조성물 내 단백질 농도는 최소 약 또는 최대 약 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 50, 100 μg/ml 또는 mg/ml 이상(그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위)일 수 있다. 이 중, 약, 최소 약, 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 펩티드/MHC/나노입자 복합체일 수 있다.
본 발명은 자가면역 반응 또는 암과 관련된 질환 또는 병태의 발생에 대한 진단, 치료 또는 예방 요법을 수행하기 위한 펩티드/MHC/나노입자 복합체의 투여를 고려한다.
또한, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호(Hopp)는 친수성에 기초한 1차 아미노산 서열로부터의 에피토프의 동정 및 제조를 교시하고 있다. 상기 특허[Hopp]에 개시된 방법을 통해, 당업자는 아미노산 서열 내에서 잠재적인 에피토프를 동정하고 그의 면역원성을 확인할 수 있을 것이다. 수많은 과학 출판물은 또한 아미노산 서열의 분석으로부터 2차 구조의 예측과 에피토프의 동정에 전념해왔다(Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b; 1979). 원하는 경우 이들 중 어느 것이든 이용하여 미국 특허 제4,554,101호에서 상기 특허[Hopp]의 교시 내용을 보충할 수 있다.
기타 항원 성분
펩티드 이외의 분자는 MHC 분자와 복합체에서 항원 또는 항원 단편으로서 사용될 수 있다. 이러한 분자는 탄수화물, 지질, 소분자 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 탄수화물은 다양한 세포의 외부 표면의 주요 성분이다. 특정 탄수화물은 분화의 상이한 단계의 특징이며 매우 빈번하게 이러한 탄수화물은 특정 항체에 의해 인식된다. 특징적인 탄수화물의 발현은 특정 세포 유형에 제한될 수 있다. 자궁내막증 항원과 혈청 항원에 대한 자가 항체 반응은 자궁내막증의 공통적인 특징으로 나타났다. 탄수화물 에피토프에 특이적인 2-헤레만스 슈미츠(2-Heremans Schmidt) 당단백질 및 탄산 무수화효소를 포함하여 이전에 확인된 다수의 항원에 대한 자궁내막증에서의 혈청 자가 항체 반응이 설명되었다.
비제한적이고 예시적인 항원- MHC 복합체
특정 실시양태에서, 항원과 MHC의 특정 조합은 특정 질환의 치료를 위해 최적화될 수 있다. 비제한적인 예는 하기 예를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다:
I형 당뇨병의 치료를 위해, pMHC 복합체의 항원은 PPI76 -90( K88S ), IGRP13 -25, GAD555-567, GAD555 -567(557I), IGRP23 -35, B24-C36, PPI76 -90, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 항원으로부터 유래할 수 있고, pMHC 복합체의 MHC는 HLA-DRB1*0401/DRA, HLA-DRB1*0301/DRA, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 포함한다.
일부 실시양태에서, pMHC 복합체의 항원은
a) 당뇨병 관련 항원을 포함하며, 프리프로인슐린(PPI), 췌도 특이적 글루코오스-6-포스파타아제(IGRP), 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD), 췌도 세포 자가 항원-2(ICA2), 인슐린, 프로인슐린, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
b) 다발성 경화증 관련 항원을 포함하며, 미엘린 염기성 단백질, 미엘린 관련 당단백질, 미엘린 희소 돌기 아교세포 단백질, 프로테오리피드 단백질, 희소 돌기 아교세포 미엘린 올리고단백질, 미엘린 관련 희소 돌기 아교세포 염기성 단백질, 희소 돌기 아교세포 특이적 단백질, 열 충격 단백질, 희소 돌기 아교세포 특이적 단백질, NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22, 2'3'-시클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라아제, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
c) 셀리악병 관련 항원을 포함하며, 글리아딘, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
d) 원발성 담즙성 간경화증 관련 항원을 포함하며, PDC-E2, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
e) 낙엽상 천포창 관련 항원 및/또는 심상성 천포창 관련 항원을 포함하며, DG1, DG3, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
f) 시신경척수염 스펙트럼 장애 관련 항원을 포함하며, AQP4, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
g) 관절염 관련 항원을 포함하며, 열 충격 단백질, 면역글로불린 결합 단백질, 이종 핵 RNP, 아넥신 V, 칼파스타틴, II형 콜라겐, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 신장 인자 인간 연골 gp39, 만노오스 결합 렉틴, 시트룰린화된 비멘틴, II형 콜라겐, 피브리노겐, 알파 에놀라아제, 항-카르바밀화된 단백질(항-CarP), 펩티딜 아르기닌 데이미나아제 4형(PAD4), BRAF, 피브리노겐 감마 사슬, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H1, 알파-1-항트립신, 혈장 프로테아제 C1 억제제, 겔솔린, 알파 1-B 당단백질, 세룰로플라스민, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H4, 보체 인자 H, 알파 2 마크로글로불린, 혈청 아밀로이드, C-반응성 단백질, 혈청 알부민, 피브로겐 베타 사슬, 세로트랜스페린, 알파 2 HS 당단백질, 비멘틴, 보체 C3, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
h) 알레르기성 천식 관련 항원을 포함하며, DERP1, DERP2, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
i) 염증성 장 질환 관련 항원을 포함하며, 플라젤린, Fla-2, Fla-X, YIDX, 박테로이데스 인테그라아제, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
j) 전신 홍반 루푸스 관련 항원을 포함하며, 이중 가닥(ds) DNA, 리보핵단백질(RNP), 스미스(Sm), 쇼그렌 증후군 관련　항원　A(SS-A)/Ro, 쇼그렌 증후군 관련　항원　B(SS-B)/La, RO60, RO52, 히스톤, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
k) 죽상경화증 관련 항원을 포함하며, ApoB, ApoE 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
l) COPD 관련 항원 및/또는 폐기종 관련 항원을 포함하며, 엘라스틴, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
m) 건선 관련 항원을 포함하며, Cap18, ADMTSL5, ATL5, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
n) 자가면역성 간염 관련 항원을 포함하며, CYP2D6, SLA, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
o) 포도막염 관련 항원을 포함하며, 아레스틴, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
p) 쇼그렌 증후군 관련 항원을 포함하며, (SS-A)/Ro, (SS-B)/La, MR3, RO60, RO52, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
q) 피부경화증 관련 항원을 포함하며, CENP-C, TOP 1, RNA 폴리머라아제 III, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
r) 항인지질 증후군 관련 항원을 포함하며, APOH, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래하거나;
s) ANCA 관련 혈관염 관련 항원을 포함하며, MPO, PRTN3, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래하거나;
t) 강직 인간 증후군 관련 항원을 포함하며, GAD, 또는 이의 단편 또는 등가물로부터 유래한다.
일부 실시양태에서, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 고전적 MHC I형 단백질, 비고전적 MHC I형 단백질, 고전적 MHC II형 단백질, 비고전적 MHC II형 단백질, MHC 이량체(Fc 융합체), MHC 사량체, 또는 MHC 단백질의 중합체 형태를 포함하며, 상기 MHC 단백질은 경우에 따라 놉-인-홀 기반 MHC-알파-Fc/MHC-베타-Fc 이종이량체 또는 다량체를 포함한다.
일부 실시양태에서, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA DR, HLA DQ, HLA DP, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, CD1d, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 포함한다.
일부 실시양태에서, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 포함한다.
일부 실시양태에서, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DRB1/DRA, HLA-DRB3/DRA, HLA-DRB4/DRA, HLA-DRB5/DRA, HLA-DQA1/HLA-DQB1, HLA-DPB1/HLA-DPA1, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 포함한다.
특정 양태에서, pMHC 복합체는
a) hInsB10 -18, hIGRP228 -236, hIGRP265 -273, IGRP206 -214, hIGRP206 -214, NRP-A7, NRP-I4, NRP-V7, YAI/Db, INS B15-23, PPI76 -90 ( K88S ), IGRP13 -25, GAD555 -567, GAD555 -567(557I), IGRP23 -35, B24-C36, PPI76 -90, INS-I9, TUM, G6Pase, 프로인슐린L2 -10, 프로인슐린L3 -11, 프로인슐린L6 -14, 프로인슐린B5 -14, 프로인슐린B10 -18, 프로인슐린B14 -22, 프로인슐린B15-24, 프로인슐린B17 -25, 프로인슐린B18 -27, 프로인슐린B20 -27, 프로인슐린B21 -29, 프로인슐린B25 -C1, 프로인슐린B27 -C5, 프로인슐린C20 -28, 프로인슐린C25 -33, 프로인슐린C29 -A5, 프로인슐린A1-10, 프로인슐린A2 -10, 프로인슐린A12 -20, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 당뇨병 관련 항원을 포함하거나;
b) MOG35 -55, MOG36 -55, MAG287 -295, MAG509 -517, MAG556 -564, MBP110 -118, MOG114 -122, MOG166-175, MOG172 -180, MOG179 -188, MOG188 -196, MOG181 -189, MOG205 -214, PLP80 -88, MAG287 -295, MAG509 -517, MAG556 -564, MOG97 -109 MOG97 -109( E107S ), MBP89 -101, PLP175-192, PLP94 -108, MBP86 -98, PLP54 -68, PLP249 -263, MOG156 -170, MOG201 -215, MOG38 -52, MOG203 -217, PLP250 -264, MPB13 -32, MPB83 -99, MPB111 -129, MPB146 -170, MOG223 -237, MOG6 -20, PLP88 -102, PLP139 -154, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 다발성 경화증 관련 항원을 포함하거나;
c) 아글리아57 -68, 아글리아62 -72, 아글리아217 -229, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 셀리악병 관련 항원을 포함하거나;
d) PDC-E2122-135, PDC-E2249-262, PDC-E2249-263, PDC-E2629-643, PDC-E272-86, PDC-E2353-367, PDC-E2422-436, PDC-E2629-643, PDC-E280-94, PDC-E2353-367, PDC-E2535-549, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 원발성 담즙성 간경화증 관련 항원을 포함하거나;
e) 각각이 DG1216-229, DG397-111, DG3251-265, DG3441- 455,DG3351 -365, DG3453-467, DG3540-554, DG3280-294, DG3326-340, DG3367-381, DG313-27, DG3323-337, DG3438-452, DG148-62, DG1206-222, DG1363-377, DG13-17, DG1192-206, DG1326-340, DG11-15, DG135-49, DG1325-339, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 낙엽상 천포창 관련 항원 및/또는 심상성 천포창 관련 항원을 포함하거나;
f) AQP4129 -143, AQP4284 -298, AQP463 -76, AQP4129 -143, AQP439 -53, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 시신경척수염 스펙트럼 장애 관련 항원을 포함하거나;
g) DERP116 -30, DERP1171 -185, DERP1110 -124, DERP-226-40, DERP-2 107-121, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 알레르기성 천식 관련 항원을 포함하거나;
h) 박테로이데스 인테그라아제 항원183 -197, 박테로이데스 인테그라아제 항원146 -160, 박테로이데스 인테그라아제 항원175 -189, 박테로이데스 인테그라아제 항원1 -15, 박테로이데스 인테그라아제 항원183-197, 박테로이데스 인테그라아제 항원30 -44, 박테로이데스 인테그라아제 항원70-84, 박테로이데스 인테그라아제 항원337 -351, 박테로이데스 인테그라아제 항원171 -185, 박테로이데스 인테그라아제 항원4 -18, 박테로이데스 인테그라아제 항원256 -270, Fla-2/Fla-X366-380, Fla-2/Fla-X164-178, Fla-2/Fla-X261-275, Fla-2/Fla-X1-15, Fla-2/Fla-X51-65, Fla-2/Fla-X269-283, Fla-2/Fla-X4-18, Fla-2/Fla-X271-285, YIDX78 -92, YIDX93 -107, YIDX98 -112, YIDX23 -37, YIDX78 -92, YIDX195 -209, YIDX22 -36, YIDX80-94, YIDX101-115, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 염증성 장 질환 관련 항원을 포함하거나;
i) H471-94, H474-88, H476-90, H475-89, H478-92, H480-94, H2B10 -24, H2B16 -30, H1´22-42, H1´27-41, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 전신 홍반 루푸스 관련 항원을 포함하거나;
j) ApoB3501 -3516, ApoB1952 -1966, ApoB978 -993, ApoB3498 -3513, ApoB210A, ApoB210B, ApoB210C, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 죽상경화증 관련 항원을 포함하거나;
k) 각각이 엘라스틴89 -103, 엘라스틴698 -712, 엘라스틴8 -22, 엘라스틴94 -108, 엘라스틴13 -27, 엘라스틴695 -709, 엘라스틴563 -577, 엘라스틴558 -572, 엘라스틴698 -712, 엘라스틴566 -580, 엘라스틴645 -659, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 COPD 관련 항원 및/또는 폐기종 관련 항원을 포함하거나;
l) Cap1864 -78, Cap1834 -48, Cap1847 -61, Cap18151 -165, Cap18149 -163, Cap18152 -166, Cap18131-145, Cap1824 -38, ADMTSL5245 -259, ADMTSL5267 -281, ADMTSL5372 -386, ADMTSL5289 -303, ADMTSL5396 -410, ADMTSL5433 -447, ADMTSL5142 -156, ADMTSL5236 -250, ADMTSL5301 -315, ADMTSL5203-217, ADMTSL5404 -418, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 건선 관련 항원을 포함하거나;
m) (CYP2D6)193-207, CYP2D676 -90, CYP2D6293 -307, CYP2D6313 -332, CYP2D6393 -412, CYP2D6199-213, CYP2D6450 -464, CYP2D6301 -315, CYP2D6452 -466, CYP2D659 -73, CYP2D6130 -144, CYP2D6193 -212, CYP2D6305 -324, CYP2D6131 -145, CYP2D6216 -230, CYP2D6238-252, CYP2D6199 -213, CYP2D6235 -252, CYP2D6293 -307, CYP2D6381 -395, CYP2D6429 -443, SLA334-348, SLA196 -210, SLA115 -129, SLA373 -386, SLA186 -197, SLA317 -331, SLA171 -185, SLA417 -431, SLA359-373, SLA215 -229, SLA111 -125, SLA110-124, SLA299 -313, SLA342 -356, SLA49 -63, SLA119 -133, SLA260 -274, SLA26 -40, SLA86 -100, SLA331 -345, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 자가면역성 간염 관련 항원을 포함하거나;
n) 아레스틴199 -213, 아레스틴77 -91, 아레스틴250 -264, 아레스틴172 -186, 아레스틴354 -368, 아레스틴239 -253, 아레스틴102 -116, 아레스틴59 -73, 아레스틴280 -294, 아레스틴291 -306, 아레스틴195-209, 아레스틴200 -214, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 포도막염 관련 항원을 포함하거나;
o) RO60127-141, RO60523-537, RO60243-257, RO60484-498, RO60347-361, RO60369-383, RO60426-440, RO60267-281, RO60178-192, RO60358-372, RO60221-235, RO60318-332, RO60407-421, RO60459-473, RO6051-65, RO60312-326, LA241-255, LA101-115, LA153-167, LA178-192, LA19-33, LA37-51, LA133-147, LA50-64, LA32-46, LA153-167, LA83-97, LA136-150, LA297-311, LA59-73, LA151-165, LA86-100, LA154-168, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 쇼그렌 증후군 관련 항원을 포함하거나;
p) TOP1346 -360, TOP1420 -434, TOP1750 -764, TOP1419 -433, TOP1591 -605, TOP1695 -709, TOP1305-319, TOP1346 -360, TOP1419 -433, TOP1425 -439, TOP1614 -628, CENP-C297-311, CENP-C857-871, CENP-C887-901, CENP-C212-226, CENP-C643-657, CENP-C832-846, CENP-C167-181, CENP-C246-260, CENP-C846-860, CENP-C149-163, CENP-C833-847, CENP-C847-861, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 피부경화증 관련 항원을 포함하거나;
q) APOH235 -249, APOH306 -320, APOH237 -251, APOH295 -309, APOH28 -42, APOH173 -187, APOH264 -278, APOH295 -309, APOH49 -63, APOH269 -283, APOH295 -309, APOH321 -355, APOH322 -336, APOH324 -338, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 항인지질 증후군 관련 항원을 포함하거나;
r) MPO506 -520, MPO302 -316, MPO7 -21, MPO689 -703, MPO248 -262, MPO444 -458, MPO513 -527, MPO97-111, MPO616 -630, MPO462 -476, MPO617 -631, MPO714 -728, PRTN344 -58, PRTN3234 -248, PRTN359 -73, PRTN3117 -131, PRTN3164 -178, PRTN371 -85, PRTN3241-255, PRTN359 -73, PRTN3183 -197, PRTN362-76, PRTN3118-132, PRTN3239 -253, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 ANCA 관련 혈관염 관련 항원을 포함하거나;
s) GAD212 -226, GAD555 -569, GAD297 -311, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 강직 인간 증후군 관련 항원을 포함한다.
특정 양태에서, pMHC 복합체는:
a) hInsB10 -18, hIGRP228 -236, hIGRP265 -273, IGRP206 -214, hIGRP206 -214, NRP-A7, NRP-I4, NRP-V7, YAI/Db, INS B15-23, PPI76 -90 ( K88S ), IGRP13 -25, GAD555 -567, GAD555 -567(557I), IGRP23 -35, B24-C36, PPI76 -90, INS-I9, TUM, G6Pase, 프로인슐린L2 -10, 프로인슐린L3-11, 프로인슐린L6 -14, 프로인슐린B5 -14, 프로인슐린B10 -18, 프로인슐린B14-22, 프로인슐린B15 -24, 프로인슐린B17 -25, 프로인슐린B18 -27, 프로인슐린B20 -27, 프로인슐린B21 -29, 프로인슐린B25 -C1, 프로인슐린B27 -C5, 프로인슐린C20 -28, 프로인슐린C25-33, 프로인슐린C29 -A5, 프로인슐린A1-10, 프로인슐린A2 -10, 프로인슐린A12 -20, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 당뇨병 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
b) MOG35 -55, MOG36 -55, MAG287 -295, MAG509 -517, MAG556 -564, MBP110 -118, MOG114 -122, MOG166-175, MOG172 -180, MOG179 -188, MOG188 -196, MOG181 -189, MOG205 -214, PLP80 -88, MAG287 -295, MAG509 -517, MAG556 -564, MOG97 -109 MOG97 -109( E107S ), MBP89 -101, PLP175-192, PLP94 -108, MBP86 -98, PLP54 -68, PLP249 -263, MOG156 -170, MOG201 -215, MOG38 -52, MOG203 -217, PLP250 -264, MPB13 -32, MPB83 -99, MPB111 -129, MPB146 -170, MOG223 -237, MOG6 -20, PLP88 -102, PLP139 -154, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 다발성 경화증 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
c) 아글리아57 -68, 아글리아62 -72, 아글리아217 -229, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 셀리악병 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DQ 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
d) PDC-E2122-135, PDC-E2249-262, PDC-E2249-263, PDC-E2629-643, PDC-E272-86, PDC-E2353-367, PDC-E2422-436, PDC-E2629-643, PDC-E280-94, PDC-E2353-367, PDC-E2535-549, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 원발성 담즙성 간경화증 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
e) 각각이 DG1216-229, DG397-111, DG3251-265, DG3441- 455,DG3351 -365, DG3453-467, DG3540-554, DG3280-294, DG3326-340, DG3367-381, DG313-27, DG3323-337, DG3438-452, DG148-62, DG1206-222, DG1363-377, DG13-17, DG1192-206, DG1326-340, DG11-15, DG135-49, DG1325-339, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 낙엽상 천포창 관련 항원 및/또는 심상성 천포창 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
f) AQP4129 -143, AQP4284 -298, AQP463 -76, AQP4129 -143, AQP439 -53, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 시신경척수염 스펙트럼 장애 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
g) DERP116 -30, DERP1171 -185, DERP1110 -124, DERP-226-40, DERP-2 107-121, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 알레르기성 천식 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR, HLA-DP, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 포함하거나;
h) 박테로이데스 인테그라아제 항원183 -197, 박테로이데스 인테그라아제 항원146 -160, 박테로이데스 인테그라아제 항원175 -189, 박테로이데스 인테그라아제 항원1 -15, 박테로이데스 인테그라아제 항원183-197, 박테로이데스 인테그라아제 항원30 -44, 박테로이데스 인테그라아제 항원70-84, 박테로이데스 인테그라아제 항원337 -351, 박테로이데스 인테그라아제 항원171-185, 박테로이데스 인테그라아제 항원4 -18, 박테로이데스 인테그라아제 항원256-270, Fla-2/Fla-X366-380, Fla-2/Fla-X164-178, Fla-2/Fla-X261-275, Fla-2/Fla-X1-15, Fla-2/Fla-X51-65, Fla-2/Fla-X269-283, Fla-2/Fla-X4-18, Fla-2/Fla-X271-285, YIDX78-92, YIDX93 -107, YIDX98 -112, YIDX23 -37, YIDX78 -92, YIDX195 -209, YIDX22 -36, YIDX80-94, YIDX101-115, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 염증성 장 질환 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
i) H471-94, H474-88, H476-90, H475-89, H478-92, H480-94, H2B10 -24, H2B16 -30, H1´22-42, H1´27-41, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 전신 홍반 루푸스 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 I-Ad, HLA-DR, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 포함하거나;
j) ApoB3501 -3516, ApoB1952 -1966, ApoB978 -993, ApoB3498 -3513, ApoB210A, ApoB210B, ApoB210C, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 죽상경화증 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 I-Ab, 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
k) 각각이 엘라스틴89 -103, 엘라스틴698 -712, 엘라스틴8 -22, 엘라스틴94 -108, 엘라스틴13 -27, 엘라스틴695 -709, 엘라스틴563 -577, 엘라스틴558 -572, 엘라스틴698 -712, 엘라스틴566 -580, 엘라스틴645 -659, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 COPD 관련 항원 및/또는 폐기종 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
l) Cap1864 -78, Cap1834 -48, Cap1847 -61, Cap18151 -165, Cap18149 -163, Cap18152 -166, Cap18131-145, Cap1824 -38, ADMTSL5245 -259, ADMTSL5267 -281, ADMTSL5372 -386, ADMTSL5289 -303, ADMTSL5396 -410, ADMTSL5433 -447, ADMTSL5142 -156, ADMTSL5236 -250, ADMTSL5301 -315, ADMTSL5203 -217, ADMTSL5404 -418, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 건선 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
m) CYP2D6193 -207, CYP2D676 -90, CYP2D6293 -307, CYP2D6313 -332, CYP2D6393 -412, CYP2D6199-213, CYP2D6450 -464, CYP2D6301 -315, CYP2D6452 -466, CYP2D659 -73, CYP2D6130 -144, CYP2D6193-212, CYP2D6305 -324, CYP2D6131 -145, CYP2D6216 -230, CYP2D6238 -252, CYP2D6199 -213, CYP2D6235 -252, CYP2D6293 -307, CYP2D6381 -395, CYP2D6429 -443, SLA334-348, SLA196 -210, SLA115 -129, SLA373 -386, SLA186 -197, SLA317 -331, SLA171 -185, SLA417 -431, SLA359-373, SLA215 -229, SLA111 -125, SLA110-124, SLA299 -313, SLA342 -356, SLA49 -63, SLA119 -133, SLA260 -274, SLA26 -40, SLA86 -100, SLA331 -345, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 자가면역성 간염 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
n) 아레스틴199 -213, 아레스틴77 -91, 아레스틴250 -264, 아레스틴172 -186, 아레스틴354 -368, 아레스틴239 -253, 아레스틴102 -116, 아레스틴59 -73, 아레스틴280 -294, 아레스틴291 -306, 아레스틴195-209, 아레스틴200 -214, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 포도막염 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
o) RO60127-141, RO60523-537, RO60243-257, RO60484-498, RO60347-361, RO60369-383, RO60426-440, RO60267-281, RO60178-192, RO60358-372, RO60221-235, RO60318-332, RO60407-421, RO60459-473, RO6051-65, RO60312-326, LA241-255, LA101-115, LA153-167, LA178-192, LA19-33, LA37-51, LA133-147, LA50-64, LA32-46, LA153-167, LA83-97, LA136-150, LA297-311, LA59-73, LA151-165, LA86-100, LA154-168, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 쇼그렌 증후군 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR, HLA-DP, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 포함하거나;
p) TOP1346 -360, TOP1420 -434, TOP1750 -764, TOP1419 -433, TOP1591 -605, TOP1695 -709, TOP1305-319, TOP1346 -360, TOP1419 -433, TOP1425 -439, TOP1614 -628, CENP-C297-311, CENP-C857-871, CENP-C887-901, CENP-C212-226, CENP-C643-657, CENP-C832-846, CENP-C167-181, CENP-C246-260, CENP-C846-860, CENP-C149-163, CENP-C833-847, CENP-C847-861, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 피부경화증 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
q) APOH235 -249, APOH306 -320, APOH237 -251, APOH295 -309, APOH28 -42, APOH173 -187, APOH264 -278, APOH295 -309, APOH49 -63, APOH269 -283, APOH295 -309, APOH321 -355, APOH322 -336, APOH324 -338, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 항인지질 증후군 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
r) MPO506 -520, MPO302 -316, MPO7 -21, MPO689 -703, MPO248 -262, MPO444 -458, MPO513 -527, MPO97-111, MPO616 -630, MPO462 -476, MPO617 -631, MPO714 -728, PRTN344 -58, PRTN3234 -248, PRTN359 -73, PRTN3117 -131, PRTN3164 -178, PRTN371 -85, PRTN3241-255, PRTN359 -73, PRTN3183 -197, PRTN362-76, PRTN3118-132, PRTN3239 -253, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 ANCA 관련 혈관염 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR 또는 이의 단편 또는 등가물의 전체 또는 일부를 포함하거나;
s) GAD212 -226, GAD555 -569, GAD297 -311의 군 중 하나 이상으로부터 선택된 항원으로부터 유래한 강직 인간 증후군 관련 항원을 포함하며, pMHC 복합체의 MHC 단백질은 HLA-DR, HLA-DQ, 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 군의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 포함한다.
특정 양태에서, pMHC 복합체는
a) I형 당뇨병의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 PPI76 -90( K88S )-HLA-DRB1*0401/DRA, IGRP13 -25-HLA-DRB1*0301/DRA, GAD555 -567-HLA-DRB1*0401/DRA, GAD555 -567(557I)-HLA-DRB1*0401/DRA, IGRP23 -35-HLA-DRB1*0401/DRA, B24-C36-HLA-DRB1*0301/DRA, 또는 PPI76-90-HLA-DRB1*0401/DRA의 군으로부터 선택되거나;
b) 다발성 경화증의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 MBP86 -98-HLA-DRB1*1501/DRA, MBP89 -101-HLA-DRB5*0101/DRA, MOG38 -52-HLA-DRB4*0101/DRA, MOG97 -109( E107S )-HLA-DRB1*0401/DRA, MOG203 -217-HLA-DRB3*0101/DRA, PLP54-68-HLA-DRB3*0101/DRA, PLP94 -108-HLA-DRB1*0301/DRA, PLP250 -264-HLA-DRB4*0101/DRA, MPB13 -32-HLA-DRB5*0101/DRA, MPB83 -99-HLA-DRB5*0101/DRA, MPB111 -129-HLA-DRB5*0101/DRA, MPB146 -170-HLA-DRB5*0101/DRA, MOG223 -237-HLA-DRB3*0202/DRA, MOG6-20-HLA-DRB5*0101/DRA, PLP88 -102-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 PLP139-154-HLA-DRB5*0101/DRA의 군으로부터 선택되거나;
c) 셀리악병의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 아글리아57 -68-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, 아글리아62 -72-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, 아글리아217 -229-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0302, 또는 아글리아217 -229-HLA-DQA1*03/HLA-DQB1*0302의 군으로부터 선택되거나;
d) 원발성 담즙성 간경화증의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 PDC-E2122-135-HLA-DRB4*0101/DRA, PDC-E2249-262-HLA-DRB4*0101/DRA, PDC-E2249-263-HLA-DRB1*0801/DRA, PDC-E2629-643-HLA-DRB1*0801/DRA, PDC-E272-86-HLA-DRB3*0202/DRA, PDC-E2353-367-HLA-DRB3*0202/DRA, PDC-E2422-436-HLA-DRB3*0202/DRA, PDC-E2629-643-HLA-DRB4*0101/DRA, PDC-E280-94-HLA-DRB5*0101/DRA, PDC-E2353-367-HLA-DRB5*0101/DRA, 또는 PDC-E2535-549-HLA-DRB5*0101/DRA, mPDC-E2166-181-I-Ag7, 또는 mPDC-E282-96-I-Ag7의 군으로부터 선택되거나;
e) 낙엽상 천포창 및/또는 심상성 천포창의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 DG1216-229-HLA-DRB1*0101/DRA, DG1216-229-HLA-DRB1*0102/DRA, DG397-111-HLA-DRB1*0402/DRA, DG3251-265-HLA-DRB1*0402/DRA, DG3251-265-HLA-DRB1*0401/DRA, DG3441-455-HLA-DRB1*0402/DRA, DG3351-365-HLA-DRB3*0202/DRA, DG3453-467-HLA-DRB3*0202/DRA, DG3540-554-HLA-DRB3*0202/DRA, DG3280-294-HLA-DRB4*0101/DRA, DG3326-340-HLA-DRB4*0101/DRA, DG3367-381-HLA-DRB4*0101/DRA, DG313-27-HLA-DRB5*0101/DRA, DG3323-337-HLA-DRB5*0101/DRA, DG3438-452-HLA-DRB5*0101/DRA, DG148-62-HLA-DRB3*0202/DRA, DG1206-222-HLA-DRB3*0202/DRA, DG1363-377-HLA-DRB3*0202/DRA, DG13-17-HLA-DRB4*0101/DRA, DG1192-206-HLA-DRB4*0101/DRA, DG1326-340-HLA-DRB4*0101/DRA, DG11-15-HLA-DRB5*0101/DRA, DG135-49-HLA-DRB5*0101/DRA, 또는 DG1325-339-HLA-DRB5*0101/DRA의 군으로부터 선택되거나;
f) 시신경척수염 스펙트럼 장애의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 AQP4129-143-HLA-DRB1*0101/DRA, AQP4284 -298-HLA-DRB1*0301/DRA, AQP463 -76-HLA-DRB1*0301/DRA, AQP4129 -143-HLA-DRB1*0401/DRA, 또는 AQP439 -53-HLA-DRB1*1501/DRA의 군으로부터 선택되거나;
g) 알레르기성 천식의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 DERP-116-30-HLA-DRB1*0101/DRA, DERP-116-30 -HLA-DRB1*1501/DRA, DERP1171 -185-HLA-DRB1*1501/DRA, DERP-1110-124-HLA-DPB1*0401/DRA, DERP-226-40-HLA-DRB1*0101/DRA; DERP-226-40 -HLA-DRB1*1501/DRA, 또는 DERP-2107-121-HLA-DRB1*0301/DRA의 군으로부터 선택되거나;
h) 염증성 장 질환의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 박테로이데스 인테그라아제 항원183 -197-HLA-DRB3*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원146 -160-HLA-DRB3*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원175 -189-HLA-DRB3*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원1 -15-HLA-DRB5*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원183 -197-HLA-DRB5*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원183 -197-HLA-DRB3*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원30 -44-HLA-DRB5*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원70 -84-HLA-DRB4*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원337 -351-HLA-DRB4*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원171 -185-HLA-DRB4*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원4 -18-HLA-DRB3*0202/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원171 -185-HLA-DRB3*0202/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원256 -270-HLA-DRB3*0202/DRA, Fla-2/Fla-X366-380-HLA-DRB3*0101/DRA, Fla-2/Fla-X164-178-HLA-DRB3*0101/DRA, Fla-2/Fla-X261-275-HLA-DRB5*0101/DRA, Fla-2/Fla-X1-15-HLA-DRB5*0101/DRA, Fla-2/Fla-X51-65-HLA-DRB4*0101/DRA, Fla-2/Fla-X269-283-HLA-DRB4*0101/DRA, Fla-2/Fla-X4-18-HLA-DRB3*0202/DRA, Fla-2/Fla-X261-275-HLA-DRB3*0202/DRA, Fla-2/Fla-X271-285-HLA-DRB3*0202/DRA, YIDX78 -92-HLA-DRB3*0101/DRA, YIDX78 -92-HLA-DRB4*0101/DRA, YIDX93 -107-HLA-DRB3*0101/DRA, YIDX98 -112-HLA-DRB5*0101/DRA, YIDX23 -37-HLA-DRB5*0101/DRA, YIDX78-92-HLA-DRB4*0101/DRA, YIDX195 -209-HLA-DRB4*0101/DRA, YIDX22 -36-HLA-DRB3*0202/DRA, YIDX80 -94-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 YIDX101-115-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
i) COPD 및/또는 폐기종의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 엘라스틴89 -103-HLA-DRB3*0101/DRA, 엘라스틴698 -712-HLA-DRB5*0101/DRA, 엘라스틴8 -22-HLA-DRB5*0101/DRA, 엘라스틴94 -108-HLA-DRB5*0101/DRA, 엘라스틴13 -27-HLA-DRB4*0101/DRA, 엘라스틴695 -709-HLA-DRB4*0101/DRA, 엘라스틴563 -577-HLA-DRB4*0101/DRA, 엘라스틴558-572-HLA-DRB4*0101/DRA, 엘라스틴698 -712-HLA-DRB5*0101/DRA, 엘라스틴566 -580-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 엘라스틴645-659-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
j) 건선의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 Cap1864 -78-HLA-DRB3*0101/DRA, Cap1834-48-HLA-DRB3*0101/DRA, Cap1847 -61-HLA-DRB3*0101/DRA, Cap18151 -165-HLA-DRB4*0101/DRA, Cap18149 -163-HLA-DRB5*0101/DRA, Cap18152 -166-HLA-DRB5*0101/DRA, Cap18131 -145-HLA-DRB5*0101/DRA, Cap1824 -38-HLA-DRB3*0202/DRA, ADMTSL5245 -259-HLA-DRB3*0101/DRA, ADMTSL5267 -281-HLA-DRB3*0101/DRA, ADMTSL5372-386-HLA-DRB3*0101/DRA, ADMTSL5289 -303-HLA-DRB4*0101/DRA, ADMTSL5396 -410-HLA-DRB4*0101/DRA, ADMTSL5433 -447-HLA-DRB4*0101/DRA, ADMTSL5142 -156-HLA-DRB5*0101/DRA, ADMTSL5236 -250-HLA-DRB5*0101/DRA, ADMTSL5301 -315-HLA-DRB5*0101/DRA, ADMTSL5203-217-HLA-DRB3*0202/DRA, ADMTSL5404-418-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 ADMTSL5433 -447-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
k) 자가면역성 간염의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 CYP2D6193 -207-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D676 -90-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D6293 -307-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D6313 -332-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D6393 -412-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D6199 -213-HLA-DRB1*0401/DRA, CYP2D6450 -464-HLA-DRB1*0401/DRA, CYP2D6301-315-HLA-DRB1*0401/DRA, CYP2D6452 -466-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D659 -73-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D6130 -144-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D6193 -212-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D6305-324-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D6131 -145-HLA-DRB3*0202/DRA, CYP2D6216 -230-HLA-DRB3*0202/DRA, CYP2D6238 -252-HLA-DRB3*0202/DRA, CYP2D6199 -213-HLA-DRB4*0101/DRA, CYP2D6235-252-HLA-DRB4*0101/DRA, CYP2D6293 -307-HLA-DRB4*0101/DRA, CYP2D6238 -252-HLA-DRB5*0101/DRA, CYP2D6381 -395-HLA-DRB5*0101/DRA, CYP2D6429 -443-HLA-DRB5*0101/DRA, SLA334-348-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA196 -210-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA115 -129-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA373 -386-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA186 -197-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA317 -331-HLA-DRB1*0401/DRA, SLA171 -185-HLA-DRB1*0401/DRA, SLA417 -431-HLA-DRB1*0401/DRA, SLA359-373-HLA-DRB1*0701/DRA, SLA215 -229-HLA-DRB1*0701/DRA, SLA111 -125-HLA-DRB1*0701/DRA, SLA110 -124-HLA-DRB3*0202/DRA, SLA299 -313-HLA-DRB3*0202/DRA, SLA342 -356-HLA-DRB3*0202/DRA, SLA49 -63-HLA-DRB4*0101/DRA, SLA119 -133-HLA-DRB4*0101/DRA, SLA260-274-HLA-DRB4*0101/DRA, SLA26-40-HLA-DRB5*0101/DRA, SLA86 -100-HLA-DRB5*0101/DRA, 또는 SLA331 -345-HLA-DRB5*0101/DRA의 군으로부터 선택되거나;
l) 포도막염의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 아레스틴199 -213-HLA-DRB3*0101/DRA, 아레스틴77 -91-HLA-DRB3*0101/DRA, 아레스틴250 -264-HLA-DRB3*0101/DRA, 아레스틴172 -186-HLA-DRB4*0101/DRA, 아레스틴354 -368-HLA-DRB4*0101/DRA, 아레스틴239 -253-HLA-DRB4*0101/DRA, 아레스틴102 -116-HLA-DRB5*0101/DRA, 아레스틴59 -73-HLA-DRB5*0101, 아레스틴280 -294-HLA-DRB5*0101, 아레스틴291 -306-HLA-DRB1*0301/DRA, 아레스틴195-209-HLA-DRB3*0202/DRA, 아레스틴199 -213-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 아레스틴200 -214-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
m) 쇼그렌 증후군의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 RO60127-141-HLA-DRB1*0301/DRA, RO60523-537-HLA-DRB1*0301/DRA, RO60243-257-HLA-DRB1*0301/DRA, RO60484-498-HLA-DRB3*0101/DRA, RO60347-361-HLA-DRB3*0101/DRA, RO60369-383-HLA-DRB3*0101/DRA, RO60426-440-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60267-281-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60178-192-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60358-372-HLA-DRB5*0101/DRA, RO60358-372-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60221-235-HLA-DRB5*0101/DRA, RO60221-235-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60318-332-HLA-DRB5*0101/DRA, RO60318-332-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60407-421-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60407-421-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, RO60459-473-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60459-473-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, RO60318-332-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, RO6051-65-HLA-DRB3*0202/DRA, RO60312-326-HLA-DRB3*0202/DRA, RO60347-361-HLA-DRB3*0202/DRA, LA241-255-HLA-DRB1*0301/DRA, LA101-115-HLA-DRB1*0301/DRA, LA153-167-HLA-DRB1*0301/DRA, LA178-192-HLA-DRB3*0101/DRA, LA19-33-HLA-DRB3*0101/DRA, LA37-51-HLA-DRB3*0101/DRA, LA133-147-HLA-DRB4*0101/DRA, LA50-64-HLA-DRB4*0101/DRA, LA32-46-HLA-DRB4*0101/DRA, LA153-167-HLA-DRB5*0101/DRA, LA83-97-HLA-DRB5*0101/DRA, LA136-150-HLA-DRB5*0101/DRA, LA297-311-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, LA59-73-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, LA59-73-HLA-DRB4*0101/DRA, LA151-165-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, LA151-165-HLA-DRB4*0101/DRA, LA297-311-HLA-DRB4*0101/DRA, LA50-64-HLA-DRB3*0202/DRA, LA86-100-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 LA154-168-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
n) 피부경화증의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 TOP1346 -360-HLA-DRB3*0101/DRA, TOP1420 -434-HLA-DRB3*0101/DRA, TOP1750 -764-HLA-DRB3*0101/DRA, TOP1419 -433-HLA-DRB4*0101/DRA, TOP1591 -605-HLA-DRB4*0101/DRA, TOP1695-709-HLA-DRB4*0101/DRA, TOP1305 -319-HLA-DRB5*0101/DRA, TOP1346 -360-HLA-DRB5*0101/DRA, TOP1419 -433-HLA-DRB5*0101/DRA, TOP1420 -434-HLA-DRB3*0202/DRA, TOP1425-439-HLA-DRB3*0202/DRA, TOP1614 -628-HLA-DRB3*0202/DRA, CENP-C297-311-HLA-DRB3*0101/DRA, CENP-C857-871-HLA-DRB3*0101/DRA, CENP-C887-901-HLA-DRB3*0101/DRA, CENP-C212-226-HLA-DRB4*0101/DRA, CENP-C643-657-HLA-DRB4*0101/DRA, CENP-C832-846-HLA-DRB4*0101/DRA, CENP-C167-181-HLA-DRB5*0101/DRA, CENP-C246-260-HLA-DRB5*0101/DRA, CENP-C846-860-HLA-DRB5*0101/DRA, CENP-C149-163-HLA-DRB3*0202/DRA, CENP-C833-847-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 CENP-C847-861-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
o) 항인지질 증후군의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 APOH235 -249-HLA-DRB3*0101/DRA, APOH306 -320-HLA-DRB3*0101/DRA, APOH237 -251-HLA-DRB3*0101/DRA, APOH295 -309-HLA-DRB3*0101/DRA, APOH28 -42-HLA-DRB4*0101/DRA, APOH173-187-HLA-DRB4*0101/DRA, APOH264 -278-HLA-DRB4*0101/DRA, APOH295 -309-HLA-DRB4*0101/DRA, APOH49 -63-HLA-DRB5*0101/DRA, APOH269 -283-HLA-DRB5*0101/DRA, APOH295 -309-HLA-DRB5*0101/DRA, APOH321 -355-HLA-DRB3*0202/DRA, APOH322 -336-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 APOH324 -338-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
p) ANCA 관련 혈관염의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 MPO506 -520-HLA-DRB3*0101/DRA, MPO302 -316-HLA-DRB3*0101/DRA, MPO7 -21-HLA-DRB3*0101/DRA, MPO689 -703-HLA-DRB4*0101/DRA, MPO248 -262-HLA-DRB4*0101/DRA, MPO444 -458-HLA-DRB4*0101/DRA, MPO513 -527-HLA-DRB5*0101/DRA, MPO97 -111-HLA-DRB5*0101/DRA, MPO616-630-HLA-DRB5*0101/DRA, MPO462 -476-HLA-DRB3*0202/DRA, MPO617 -631-HLA-DRB3*0202/DRA, MPO714 -728-HLA-DRB3*0202/DRA, PRTN344 -58-HLA-DRB3*0101/DRA, PRTN3234-248-HLA-DRB3*0101/DRA, PRTN359 -73-HLA DRB3*0101/DRA, PRTN359 -73-HLA-DRB5*0101/DRA, PRTN3117 -131-HLA-DRB4*0101/DRA, PRTN3164 -178-HLA-DRB4*0101/DRA, PRTN371-85-HLA-DRB4*0101/DRA, PRTN3241 -255-HLA-DRB5*0101/DRA, PRTN3183 -197-HLA-DRB5*0101/DRA, PRTN362-76-HLA-DRB3*0202/DRA, PRTN3118 -132-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 PRTN3239 -253-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
q) 강직 인간 증후군의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 GAD212 -226-HLA-DRB1*0801/DRA, GAD555 -569-HLA-DRB1*0801/DRA, 또는 GAD297 -311-HLA-DRB1*0301/DRA의 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, pMHC 복합체는
a) I형 당뇨병의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 PPI76 -90( K88S )-HLA-DRB1*0401/DRA, IGRP13 -25-HLA-DRB1*0301/DRA, GAD555 -567-HLA-DRB1*0401/DRA, GAD555 -567(557I)-HLA-DRB1*0401/DRA, IGRP23 -35-HLA-DRB1*0401/DRA, 또는 PPI76 -90-HLA-DRB1*0401/DRA의 군으로부터 선택되거나;
b) 다발성 경화증의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 MBP86-98-HLA-DRB1*1501/DRA, MBP89 -101-HLA-DRB5*0101/DRA, MOG38 -52-HLA-DRB4*0101/DRA, MOG97 -109( E107S )-HLA-DRB1*0401/DRA, MOG203 -217-HLA-DRB3*0101/DRA, PLP54-68-HLA-DRB3*0101/DRA, PLP94 -108-HLA-DRB1*0301/DRA, PLP250 -264-HLA-DRB4*0101/DRA, MPB13 -32-HLA-DRB5*0101/DRA, MPB83 -99-HLA-DRB5*0101/DRA, MPB111 -129-HLA-DRB5*0101/DRA, MPB146 -170-HLA-DRB5*0101/DRA, MOG223 -237-HLA-DRB3*0202/DRA, MOG6-20-HLA-DRB5*0101/DRA, PLP88 -102-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 PLP139 -154-HLA-DRB5*0101/DRA의 군으로부터 선택되거나;
c) 셀리악병의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 아글리아57-68-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, 아글리아62 -72-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201, 또는 아글리아217 -229-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0302의 군으로부터 선택되거나;
d) 원발성 담즙성 간경화증의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 PDC-E2122-135-HLA-DRB4*0101/DRA, PDC-E2249-262-HLA-DRB4*0101/DRA, PDC-E2249-263-HLA-DRB1*0801/DRA, PDC-E2629-643-HLA-DRB1*0801/DRA, PDC-E272-86-HLA-DRB3*0202/DRA, PDC-E2353-367-HLA-DRB3*0202/DRA, PDC-E2422-436-HLA-DRB3*0202/DRA, PDC-E2629-643-HLA-DRB4*0101/DRA, PDC-E280-94-HLA-DRB5*0101/DRA, PDC-E2353-367-HLA-DRB5*0101/DRA, 또는 PDC-E2535-549-HLA-DRB5*0101/DRA의 군으로부터 선택되거나;
e) 낙엽상 천포창 및/또는 심상성 천포창의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 DG1216-229-HLA-DRB1*0101/DRA, DG397-111-HLA-DRB1*0402/DRA, DG3251-265-HLA-DRB1*0401/DRA, DG3441-455-HLA-DRB1*0402/DRA, DG3351-365-HLA-DRB3*0202/DRA, DG3453-467-HLA-DRB3*0202/DRA, DG3540-554-HLA-DRB3*0202/DRA, DG3280-294-HLA-DRB4*0101/DRA, DG3326-340-HLA-DRB4*0101/DRA, DG3367-381-HLA-DRB4*0101/DRA, DG313-27-HLA-DRB5*0101/DRA, DG3323-337-HLA-DRB5*0101/DRA, DG3438-452-HLA-DRB5*0101/DRA, DG148-62-HLA-DRB3*0202/DRA, DG1206-222-HLA-DRB3*0202/DRA, DG1363-377-HLA-DRB3*0202/DRA, DG13-17-HLA-DRB4*0101/DRA, DG1192-206-HLA-DRB4*0101/DRA, DG1326-340-HLA-DRB4*0101/DRA, DG11-15-HLA-DRB5*0101/DRA, DG135-49-HLA-DRB5*0101/DRA, 또는 DG1325-339-HLA-DRB5*0101/DRA의 군으로부터 선택되거나;
f) 시신경척수염 스펙트럼 장애의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 AQP4284 -298-HLA-DRB1*0301/DRA, AQP463 -76-HLA-DRB1*0301/DRA, AQP4129 -143-HLA-DRB1*0401/DRA, 또는 AQP439 -53-HLA-DRB1*1501/DRA의 군으로부터 선택되거나;
g) 알레르기성 천식의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 DERP-116-30-HLA-DRB1*0101/DRA, DERP-116-30 -HLA-DRB1*1501/DRA, DERP1171 -185-HLA-DRB1*1501/DRA, DERP-1110-124-HLA-DPB1*0401/DRA, DERP-226-40-HLA-DRB1*0101/DRA, DERP-226-40 -HLA-DRB1*1501/DRA, 또는 DERP-2107-121-HLA-DRB1*0301/DRA의 군으로부터 선택되거나;
h) 염증성 장 질환의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 박테로이데스 인테그라아제 항원1 -15-HLA-DRB5*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원183 -197-HLA-DRB3*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원70 -84-HLA-DRB4*0101/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원4 -18-HLA-DRB3*0202/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원171 -185-HLA-DRB3*0202/DRA, 박테로이데스 인테그라아제 항원256 -270-HLA-DRB3*0202/DRA, Fla-2/Fla-X366-380-HLA-DRB3*0101/DRA, Fla-2/Fla-X261-275-HLA-DRB5*0101/DRA, Fla-2/Fla-X51-65-HLA-DRB4*0101/DRA, Fla-2/Fla-X4-18-HLA-DRB3*0202/DRA, Fla-2/Fla-X261-275-HLA-DRB3*0202/DRA, Fla-2/Fla-X271-285-HLA-DRB3*0202/DRA, YIDX78 -92-HLA-DRB3*0101/DRA, YIDX78 -92-HLA-DRB4*0101/DRA, YIDX98 -112-HLA-DRB5*0101/DRA, YIDX22 -36-HLA-DRB3*0202/DRA, YIDX80 -94-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 YIDX101 -115-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
i) 폐기종의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 엘라스틴89 -103-HLA-DRB3*0101/DRA, 엘라스틴698 -712-HLA-DRB5*0101/DRA, 엘라스틴558 -572-HLA-DRB4*0101/DRA, 엘라스틴566 -580-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 엘라스틴645 -659-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
j) 건선의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 Cap1864-78-HLA-DRB3*0101/DRA, Cap1834-48-HLA-DRB3*0101/DRA, Cap1847 -61-HLA-DRB3*0101/DRA, Cap18151 -165-HLA-DRB4*0101/DRA, Cap18149 -163-HLA-DRB5*0101/DRA, Cap18152 -166-HLA-DRB5*0101/DRA, Cap18131 -145-HLA-DRB5*0101/DRA, Cap1824 -38-HLA-DRB3*0202/DRA, ADMTSL5245 -259-HLA-DRB3*0101/DRA, ADMTSL5267 -281-HLA-DRB3*0101/DRA, ADMTSL5372-386-HLA-DRB3*0101/DRA, ADMTSL5289 -303-HLA-DRB4*0101/DRA, ADMTSL5396 -410-HLA-DRB4*0101/DRA, ADMTSL5433 -447-HLA-DRB4*0101/DRA, ADMTSL5142 -156-HLA-DRB5*0101/DRA, ADMTSL5236 -250-HLA-DRB5*0101/DRA, ADMTSL5301 -315-HLA-DRB5*0101/DRA, ADMTSL5203-217-HLA-DRB3*0202/DRA, ADMTSL5404 -418-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 ADMTSL5433 -447-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
k) 자가면역성 간염의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 CYP2D6193 -207-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D676 -90-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D6293 -307-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D6313 -332-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D6393 -412-HLA-DRB1*0301/DRA, CYP2D6199 -213-HLA-DRB1*0401/DRA, CYP2D6450 -464-HLA-DRB1*0401/DRA, CYP2D6301-315-HLA-DRB1*0401/DRA, CYP2D6452 -466-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D659 -73-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D6130 -144-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D6193 -212-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D6305-324-HLA-DRB1*0701/DRA, CYP2D6131 -145-HLA-DRB3*0202/DRA, CYP2D6216 -230-HLA-DRB3*0202/DRA, CYP2D6238 -252-HLA-DRB3*0202/DRA, CYP2D6199 -213-HLA-DRB4*0101/DRA, CYP2D6235-252-HLA-DRB4*0101/DRA, CYP2D6293 -307-HLA-DRB4*0101/DRA, CYP2D6238 -252-HLA-DRB5*0101/DRA, CYP2D6381 -395-HLA-DRB5*0101/DRA, CYP2D6429 -443-HLA-DRB5*0101/DRA, SLA334-348-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA196 -210-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA115 -129-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA373 -386-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA186 -197-HLA-DRB1*0301/DRA, SLA317 -331-HLA-DRB1*0401/DRA, SLA171 -185-HLA-DRB1*0401/DRA, SLA417 -431-HLA-DRB1*0401/DRA, SLA359-373-HLA-DRB1*0701/DRA, SLA215 -229-HLA-DRB1*0701/DRA, SLA111 -125-HLA-DRB1*0701/DRA, SLA110 -124-HLA-DRB3*0202/DRA, SLA299 -313-HLA-DRB3*0202/DRA, SLA342 -356-HLA-DRB3*0202/DRA, SLA49 -63-HLA-DRB4*0101/DRA, SLA119 -133-HLA-DRB4*0101/DRA, SLA260-274-HLA-DRB4*0101/DRA, SLA26-40-HLA-DRB5*0101/DRA, SLA86 -100-HLA-DRB5*0101/DRA, 또는 SLA331 -345-HLA-DRB5*0101/DRA의 군으로부터 선택되거나;
l) 포도막염의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 아레스틴199-213-HLA-DRB3*0101/DRA, 아레스틴77 -91-HLA-DRB3*0101/DRA, 아레스틴250 -264-HLA-DRB3*0101/DRA, 아레스틴172 -186-HLA-DRB4*0101/DRA, 아레스틴354 -368-HLA-DRB4*0101/DRA, 아레스틴239 -253-HLA-DRB4*0101/DRA, 아레스틴102 -116-HLA-DRB5*0101/DRA, 아레스틴59 -73-HLA-DRB5*0101, 아레스틴280 -294-HLA-DRB5*0101, 아레스틴291-306-HLA-DRB1*0301/DRA, 아레스틴195 -209-HLA-DRB3*0202/DRA, 아레스틴199 -213-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 아레스틴200 -214-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
m) 쇼그렌 증후군의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 RO60127-141-HLA-DRB1*0301/DRA, RO60523-537-HLA-DRB1*0301/DRA, RO60243-257-HLA-DRB1*0301/DRA, RO60484-498-HLA-DRB3*0101/DRA, RO60347-361-HLA-DRB3*0101/DRA, RO60369-383-HLA-DRB3*0101/DRA, RO60426-440-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60267-281-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60178-192-HLA-DRB4*0101/DRA, RO60358-372-HLA-DRB5*0101/DRA, RO60221-235-HLA-DRB5*0101/DRA, RO60318-332-HLA-DRB5*0101/DRA, RO6051-65-HLA-DRB3*0202/DRA, RO60312-326-HLA-DRB3*0202/DRA, RO60347-361-HLA-DRB3*0202/DRA, LA241-255-HLA-DRB1*0301/DRA, LA101-115-HLA-DRB1*0301/DRA, LA153-167-HLA-DRB1*0301/DRA, LA178-192-HLA-DRB3*0101/DRA, LA19-33-HLA-DRB3*0101/DRA, LA37-51-HLA-DRB3*0101/DRA, LA133-147-HLA-DRB4*0101/DRA, LA50-64-HLA-DRB4*0101/DRA, LA32-46-HLA-DRB4*0101/DRA, LA153-167-HLA-DRB5*0101/DRA, LA83-97-HLA-DRB5*0101/DRA, LA136-150-HLA-DRB5*0101/DRA, LA50-64-HLA-DRB3*0202/DRA, LA86-100-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 LA154-168-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
n) 피부경화증의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 TOP1346-360-HLA-DRB3*0101/DRA, TOP1420 -434-HLA-DRB3*0101/DRA, TOP1750 -764-HLA-DRB3*0101/DRA, TOP1419 -433-HLA-DRB4*0101/DRA, TOP1591 -605-HLA-DRB4*0101/DRA, TOP1695-709-HLA-DRB4*0101/DRA, TOP1305 -319-HLA-DRB5*0101/DRA, TOP1346 -360-HLA-DRB5*0101/DRA, TOP1419 -433-HLA-DRB5*0101/DRA, TOP1420 -434-HLA-DRB3*0202/DRA, TOP1425-439-HLA-DRB3*0202/DRA, TOP1614 -628-HLA-DRB3*0202/DRA, CENP-C297-311-HLA-DRB3*0101/DRA, CENP-C857-871-HLA-DRB3*0101, CENP-C887-901-HLA-DRB3*0101, CENP-C212-226-HLA-DRB4*0101/DRA, CENP-C643-657-HLA-DRB4*0101/DRA, CENP-C832-846-HLA-DRB4*0101/DRA, CENP-C167-181-HLA-DRB5*0101/DRA, CENP-C246-260-HLA-DRB5*0101/DRA, CENP-C846-860-HLA-DRB5*0101/DRA, CENP-C149-163-HLA-DRB3*0202/DRA, CENP-C833-847-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 CENP-C847-861-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
o) 항인지질 증후군의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 APOH235 -249-HLA-DRB3*0101/DRA, APOH306 -320-HLA-DRB3*0101/DRA, APOH237 -251-HLA-DRB3*0101/DRA, APOH295 -309-HLA-DRB3*0101/DRA, APOH28 -42-HLA-DRB4*0101/DRA, APOH173-187-HLA-DRB4*0101/DRA, APOH264 -278-HLA-DRB4*0101/DRA, APOH295 -309-HLA-DRB4*0101/DRA, APOH49 -63-HLA-DRB5*0101/DRA, APOH269 -283-HLA-DRB5*0101/DRA, APOH295 -309-HLA-DRB5*0101/DRA, APOH321 -355-HLA-DRB3*0202/DRA, APOH322 -336-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 APOH324 -338-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
p) ANCA 관련 혈관염의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 MPO506 -520-HLA-DRB3*0101/DRA, MPO302 -316-HLA-DRB3*0101/DRA, MPO7 -21-HLA-DRB3*0101/DRA, MPO689 -703-HLA-DRB4*0101/DRA, MPO248 -262-HLA-DRB4*0101/DRA, MPO444 -458-HLA-DRB4*0101/DRA, MPO513 -527-HLA-DRB5*0101/DRA, MPO97 -111-HLA-DRB5*0101/DRA, MPO616-630-HLA-DRB5*0101/DRA, MPO462 -476-HLA-DRB3*0202/DRA, MPO617 -631-HLA-DRB3*0202/DRA, MPO714 -728-HLA-DRB3*0202/DRA, PRTN344 -58-HLA-DRB3*0101/DRA, PRTN3234-248-HLA-DRB3*0101/DRA, PRTN359 -73-HLA DRB3*0101/DRA, PRTN359 -73-HLA-DRB5*0101/DRA, PRTN3117 -131-HLA-DRB4*0101/DRA, PRTN3164 -178-HLA-DRB4*0101/DRA, PRTN371-85-HLA-DRB4*0101/DRA, PRTN3241 -255-HLA-DRB5*0101/DRA, PRTN3183 -197-HLA-DRB5*0101/DRA, PRTN362 -76-HLA-DRB3*0202/DRA, PRTN3118 -132-HLA-DRB3*0202/DRA, 또는 PRTN3239-253-HLA-DRB3*0202/DRA의 군으로부터 선택되거나;
q) 강직 인간 증후군의 치료를 위한 것이며, pMHC 복합체는 GAD212 -226-HLA-DRB1*0801/DRA, GAD555 -569-HLA-DRB1*0801/DRA, 또는 GAD297 -311-HLA-DRB1*0301/DRA의 군으로부터 선택된다.
pMHC/NP 복합체에 커플링될 보조 자극 분자 또는 분자들의 선택도 유사하게 최적화될 수 있으며, 주로 분화 또는 증식을 필요로 하는 면역 세포 집단의 성질에 의존할 것이다. 예를 들어, T 조절 세포 집단을 증식시키거나 분화하고자 하는 의도라면, 관련 조합은 보조 자극 분자 및 사이토카인, 예를 들어 IL15-IL15Ra, IL-2, IL-10, IL-35, ICOS-L, IL2/항-IL2 mAb 복합체, TGF-베타, IL-21, ITE 또는 ICOSL을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 대조적으로, 특정 유형의 암과 같은 특정 실시양태에서, T 조절 표현형의 증식 및/또는 분화는 원하는 반응이 아닐 수 있다. 따라서, 다른 보조 자극 분자 및 사이토카인이 특정 치료에 최적화될 것이다.
폴리펩티드
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 돌출부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인은 HLA-DR, HLA-DQ, 또는 HLA-DP와 같은 인간 백혈구 항원(HLA) 분자로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인은 DRA, DQA1, 또는 DPA1로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 α2 도메인은 DRA, DQA1, 또는 DPA1로부터 유래한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 돌출부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, MHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2 도메인은 HLA-DR, HLA-DQ, 또는 HLA-DP와 같은 인간 백혈구 항원(HLA) 분자로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, MHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1, 또는 HLA-DPB1로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, MHC II형 β1 도메인 또는 MHC II형 β2는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1, 또는 HLA-DPB1로부터 유래한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 공동을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합; 및 적어도 하나의 조작된 공동을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인; 및 적어도 하나의 조작된 돌출부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2 도메인; 및 적어도 하나의 조작된 돌출부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인; 및 적어도 하나의 조작된 공동을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본원의 또 다른 양태에서, MHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2 도메인; 및 적어도 하나의 조작된 공동을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 비오티닐화 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 스트렙 태그를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 26, 64, 또는 65 중 어느 하나를 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2를 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 3을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 4를 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 25를 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 26을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 8 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 3에 의해 코딩된다. 폴리펩티드는 서열 번호 4에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 6 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 8 중 어느 하나에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 26, 64, 또는 65 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 이것은 서열 번호 1 내지 8 중 어느 하나와 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 26, 64, 또는 65 중 어느 하나와 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2와 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 3과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 4와 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 6 중 어느 하나와 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 8 중 어느 하나와 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 26, 64, 또는 65 중 어느 하나와 적어도 85%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 85%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2와 적어도 85%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 3과 적어도 85%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 4와 적어도 85%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 6 중 어느 하나와 적어도 85%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 8 중 어느 하나와 적어도 85%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 26, 64, 또는 65 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 90%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2와 적어도 90%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 3과 적어도 90%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 4와 적어도 90%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 6 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 8 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 26, 64, 또는 65 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 95%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 3과 적어도 95%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 4와 적어도 95%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 6 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 8 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 27 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 35 내지 50의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 51의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 52의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 53의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 54의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 55 내지 59의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 "단편"은 적어도 5개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 본원에 기재된 조작된 돌출부, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 본원에 기재된 조작된 공동, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 본원에 기재된 조작된 돌출부, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 본원에 기재된 조작된 공동, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단편은 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 및 본원에 기재된 조작된 돌출부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 본원에 기재된 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 및 조작된 공동을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 및 본원에 기재된 조작된 돌출부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 및 본원에 기재된 조작된 공동을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 27 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이것은 서열 번호 27 내지 63 중 어느 하나와 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 35 내지 50 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 51의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 52의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 53의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 54의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 55 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 27 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 35 내지 50 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 51의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 52의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 53의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 54의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 55 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 27 내지 63중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 35 내지 50 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 51의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 52의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 53의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 54의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 55 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 27 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 35 내지 50 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 51의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 52의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 53의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 54의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 55 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 서열 번호 60 내지 61 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 60 내지 61 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 4개 이상의 폴리펩티드는 중합체 골격에 공유적으로 부착되어 다량체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 중합체 골격은 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드는 각각의 폴리펩티드의 말단 시스테인 잔기를 통해 중합체 골격에 부착된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드는 각각의 폴리펩티드 상의 비오티닐화 부위를 통해 중합체 골격에 부착된다.
일부 실시양태에서, 4개 이상의 폴리펩티드가 아비딘에 공유적으로 결합되어 다량체를 형성한다.
돌출부 및/또는 공동
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 조작된 돌출부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 하나 이상의 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 하나 이상의 자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 아르기닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 티로신 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 시스테인 잔기 및 트립토판 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 조작된 공동을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 하나 이상의 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 하나 이상의 자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 알라닌, 세린, 트레오닌, 발린, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 세린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 트레오닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 발린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 시스테인 잔기, 세린 잔기, 알라닌 잔기, 및 발린 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 돌출부 또는 공동은 폴리펩티드 상의 MHC II형 도메인에 위치하지 않는다. 일부 실시양태에서, 돌출부 또는 공동은 폴리펩티드 상의 CH3 항체 불변 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 폴리펩티드 상의 CH3 항체 불변 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 공동은 폴리펩티드 상의 CH3 항체 불변 도메인에 위치한다.
특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 공동은 면역글로불린 분자의 CH2 또는 CH3 도메인 내로 조작된다. 특정 실시양태에서, 공동은 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작된다. 특정 실시양태에서, 공동은 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동은 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 26에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 26에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 26에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 26에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 26에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 26에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 26에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 돌출부는 면역글로불린 분자의 CH2 또는 CH3 도메인 내로 조작된다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작된다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌출부는 면역글로불린 분자의 CH3 도메인 내로 조작되며 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
돌출부 및 공동은 MHC II형 알파 또는 베타 도메인 중 어느 하나에 융합된 IgG1의 CH3 도메인에서의 특이적 돌연변이에 의해 조작될 수 있다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 IgG1 분자의 CH3 영역에 S354C 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 IgG1 분자의 CH3 영역에 T366W 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 IgG1 분자의 CH3 영역에 S354C 및 T366W 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 IgG1 분자의 CH3 영역에 S354C 및 T366W 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌출부는 IgG1 분자의 CH3 영역에 S354C 및 T366W 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 공동은 IgG1 분자의 CH3 영역에 Y349C 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 IgG1 분자의 CH3 영역에 T366S 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 IgG1 분자의 CH3 영역에 L368A 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 IgG1 분자의 CH3 영역에 Y407V 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 IgG1 분자의 CH3 영역에 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공동은 IgG1 분자의 CH3 영역에 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이(EU 항체 번호 매김 체계)로 이루어진다.
한 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (ⅰ) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 돌출부는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고, (ⅱ) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 공동은 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성된다.
한 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하며, 돌출부는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고; (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 공동은 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성된다.
한 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 돌출부는 S354C 및 T366W(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고; (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 공동은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성된다.
한 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 돌출부는 S354C 및 T366W(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고; (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 공동은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성된다.
한 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인으로 이루어지고, 돌출부는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고, (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인으로 이루어지고, 공동은 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성된다.
한 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인으로 이루어지고, 돌출부는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고; (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인으로 이루어지고, 공동은 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성된다.
한 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인으로 이루어지고, 돌출부는 S354C 및 T366W(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고; (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인으로 이루어지고, 공동은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성된다.
한 실시양태에서, 단리된 이종이량체는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인으로 이루어지고, 돌출부는 S354C 및 T366W(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성되고; (ii) 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, IgG CH2 도메인, 및 IgG CH3 도메인으로 이루어지고, 공동은 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(EU 번호 매김)에 상응하는 IgG CH3 도메인에서의 돌연변이에 의해 형성된다.
제조 방법
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 이종이량체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 MHC II형 α1 도메인 및 MHC II형 α2 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 MHC II형 β1 도메인 및 MHC II형 β2 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 생산 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 각 폴리펩티드는 CH2 및 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CH3 도메인은 조작된 놉(돌출부) 또는 조작된 홀(공동) 중 어느 하나를 추가로 포함한다. 놉이 MHC II형 α1 및 α2 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 결합된다면, 홀은 MHC II형 β1 및 β2 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 결합된다. 구성은 MHC II형 β1 및 β2 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 결합된 놉과 MHC II형 α1 및 α2 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 결합된 홀로 전환될 수 있다. 또한, 이종이량체는 MHC II형 알파와 베타 사슬 사이에 형성되는 결합 홈 내에 결합된 면역학적으로 관련된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 가요성 아미노산 링커에 의해 그와 결합된 제1 또는 제2 폴리펩티드 사슬 중 어느 하나의 일부가 될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종이량체의 폴리펩티드는 진핵생물 세포주에 도입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 진핵생물 세포주는 포유류 세포주이다. 특정 실시양태에서, 진핵생물 세포주는 CHO 세포주(중국 햄스터 난소)이다. 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입(레트로바이러스 또는 렌티바이러스)과 같은 당 업계에 공지된 방법에 의해 또는 게놈에 통합된 폴리뉴클레오티드의 복제본을 포함하는 안정한 세포주를 생산함으로써 도입될 수 있다. 발현 후 이종이량체는 세포 내에서 조립되어 배양 배지로 분비된다. 이 단계에서 배양 배지는 적어도 하나의 추가 정제 단계를 거친다. 특정 실시양태에서, 이 정제 단계는 원심 분리, 초 원심 분리, 투석, 여과, 크로마토그래피, 또는 칼럼 크로마토그래피 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 면역 글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하므로, 크로마토그래피 단계는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 단계는 단백질 A를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 단계는 단백질 G를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 단계는 단백질 A/G를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 단계는 단백질 A를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 단계는 단백질 G를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 단계는 단백질 A/G를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 단계는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 이들의 조합 이외의 친화성 시약을 이용하지 않는다(이는 탈염 또는 크기 배제 크로마토그래피와 같은 비친화성 기반 크로마토그래피 단계를 포함하지 않음).
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 제조 방법으로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며; (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하며; (a) 각각의 계면을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 제1 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 돌출부를 코딩하기 위해 제1 폴리펩티드의 본래의 계면을 코딩하는 핵산으로부터 변경된 것이거나, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 공동을 코딩하기 위해 제2 폴리펩티드의 본래의 계면을 코딩하는 핵산으로부터 변경된 것이거나, 두 경우 모두이며, 배양은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 발현되도록 하는 것인 단계; 및 (b) 숙주 세포 배양물로부터 이종이량체를 회수하는 단계를 포함하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 돌출부를 코딩하기 위해 본래의 핵산으로부터 변경되었으며, 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 공동을 코딩하기 위해 본래의 핵산으로부터 변경되었다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터의 본래의 아미노산 잔기를 코딩하는 하나 이상의 핵산 각각이 유입 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 치환되는 단계가 선행되며, 돌출부는 하나 이상의 유입 잔기를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 유입 잔기는 본래의 아미노산 잔기보다 측쇄 체적이 더 크다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)는 제2 폴리펩티드의 계면에서 본래의 아미노산 잔기를 코딩하는 하나 이상의 핵산 각각이 유입 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 치환되는 단계가 선행되며, 공동은 하나 이상의 유입 잔기를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 유입 잔기는 본래의 아미노산 잔기보다 측쇄 체적이 더 작다.
일부 실시양태에서, 유입 잔기는 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 알라닌, 세린, 트레오닌, 발린, 및 시스테인으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 아르기닌이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 페닐알라닌이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 티로신이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 트립토판이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 알라닌이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 세린이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 트레오닌이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 발린이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 시스테인이 아니다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 시스테인이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 시스테인 및 트립토판이다. 일부 실시양태에서, 유입 잔기는 시스테인, 세린, 알라닌, 및 발린이다.
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 이종이량체-나노입자 접합체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비리포좀성이고/거나 고체 코어를 갖는 나노입자에 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체를 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비리포좀성이고 고체 코어를 갖는 나노입자에 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체를 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비리포좀성이거나 고체 코어를 갖는 나노입자에 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체를 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비리포좀성이고 고체 금 코어를 갖는 나노입자에 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체를 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비리포좀성이고 고체 산화철 코어를 갖는 나노입자에 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체를 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비리포좀성이고 산화철 코어를 갖는 나노입자에 본원에 기재된 적어도 하나의 이종이량체를 결합시키는 단계를 포함하고; 상기 결합 단계는 링커를 통해 적어도 하나의 이종이량체를 나노입자에 공유적으로 결합시키는 단계를 포함한다.
질환의 치료 방법
본원의 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 이종이량체 및/또는 본원에 개시된 이종이량체-나노입자 복합체를 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 본질적으로 이들로 이루어진 조성물을 사용하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질환은 자가면역 질환 또는 장애이다.
본 발명의 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 자가 반응성 T 세포를 T 조절 또는 TR1 세포로 재프로그램/분화시키는데 유용하다. 특정 실시양태에서, TR1 세포는 IL-10을 발현한다. 특정 실시양태에서, TR1 세포는 IL-10을 분비한다. 특정 실시양태에서, TR1 세포는 CD49b를 발현한다. 특정 실시양태에서, TR1 세포는 LAG-3을 발현한다. 이러한 표현형 특성을 갖는 T 세포는 개체의 염증 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 유용하다.
"자가면역 질환 또는 장애"는 개체 자신의 조직 또는 기관으로부터 일어나고 그에 대한 질환 또는 장애 또는 그의 징후 또는 그로부터 발생하는 병태를 포함한다. 한 실시양태에서, 이는 정상적인 신체 조직 및 항원과 반응성인 T 세포에 의한 생산에 기인하거나 그로 인해 악화되는 병태를 의미한다. 자가면역 질환 또는 장애의 예는 관절염(류마티스 관절염, 예를 들어 급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍 관절염, 급성 통풍 관절염, 급성 면역학적 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, II형 콜라겐-유발성 관절염, 감염성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 스틸병(Still's disease), 척추 관절염, 및 소아 발병 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염(arthritis chronica progrediente), 변형성 관절염(arthritis deformans), 만성 원발성 다발 관절염(polyarthritis chronica primaria), 반응성 관절염, 및 강직성 척추염), 염증성 과증식성 피부병, 건선(예를 들어, 판상형 건선, 적상 건선, 농포성 건선, 및 손발톱 건선), 아토피(건초열 및 죠브 증후군(Job's syndrome)과 같은 아토피 질환 포함), 피부염(접촉 피부염, 만성 접촉 피부염, 박리성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis), 화폐상 피부염(nummular dermatitis), 지루성 피부염, 비-특이적 피부염, 원발성 자극 접촉 피부염, 및 아토피 피부염 포함), x-연관 고IgM 증후군, 알레르기성 안내 염증성 질환, 두드러기(예를 들어, 만성 자가면역 두드러기를 포함하여 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기), 근염, 다발성 근염/피부근염, 소아 피부근염, 중독성 표피 박리증, 피부경화증(전신성 피부경화증 포함), 경화증(예를 들어, 전신성 경화증; 다발성 경화증(MS) 예를 들어 스피로-광학적 MS, 원발성 진행성 MS(PPMS: primary progressive MS), 및 재발 완화성 MS(RRMS: relapsing remitting MS); 진행성 전신성 경화증, 죽상경화증, 동맥경화증, 확산성 경화증, 및 실조성 경화증), 시신경척수염 스펙트럼 장애(NMO, 또한, 데빅병 또는 데빅 증후군으로 알려짐), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병; 자가면역-매개 위장관 질환; 대장염, 예를 들어 궤양성 대장염(ulcerative colitis, colitis ulcerosa), 미세형 대장염, 교원성 대장염, 용종성 대장염(colitis polyposa), 괴사성 전장염(necrotizing enterocolitis) 및 경벽성 대장염; 및 자가면역 염증성 장 질환), 장염, 괴저성 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 호흡 곤란 증후군(성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군ARDS: adult or acute respiratory distress syndrome) 포함), 뇌수막염, 포도막(uvea)의 전체 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액 장애, 류마티스성 척추염, 류마티스성 활막염, 유전성 혈관부종, 뇌수막염에서와 같은 대뇌 신경 손상, 임신포진, 임신 유사 천포창(pemphigoid gestationis), 음낭 가려움증(pruritis scroti), 자가면역 조기 난소 부전, 자가면역 병태로 인한 돌발성 난청, 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염과 같은 IgE-매개 질환, 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis) 및 대뇌변연계(limbic) 및/또는 뇌간 뇌염 등과 같은 뇌염, 포도막염(예를 들어, 전방 포도막염, 급성 전방 포도막염, 육아종 포도막염, 비육아종 포도막염, 파코안티제닉(phacoantigenic) 포도막염, 후방 포도막염, 또는 자가면역 포도막염), 신증후군 있거나 없는 사구체신염(GN: glomerulonephritis)(예를 들어, 만성 또는 급성 사구체신염, 예를 들어 원발성 GN, 면역 매개 GN, 막성 GN(막성 신장병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신장병증, I형 및 II형을 포함하는 막 증식성 GN(MPGN: membrano- 또는 membranous proliferative GN), 및 급성 진행성 GN, 또는 증식성 신염), 자가면역성 다선성 내분비 부전, 형질세포성 국한성 귀두염을 포함한 귀두염, 귀두포피염, 원심성 환상 홍반, 지속성 이색소성 홍반, 다형성 홍반, 환상 육아종, 광택 태선, 경화성 위축성 태선, 만성 단순 태선, 극상 태선, 편평태선, 층판 비늘증, 표피 박리과다각화증, 전암성 각화증, 괴저성 농피증, 알레르기 상태 및 반응, 알레르기 반응, 습진(알레르기성 또는 아토피 습진, 건성 습진, 한포진, 및 수포성 손발바닥 습진 포함), 천식(예를 들어, 기관지 천식(asthma bronchiale), 기관지 천식(bronchial asthma), 및 자가-면역 천식), T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 병태, 임신 중 태아 A-B-O 혈액형과 같은 외래 항원에 대한 면역 반응, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 루푸스(루푸스 신염, 루푸스 뇌염(lupus cerebritis), 소아 루푸스, 비-신성(nonrenal) 루푸스, 신외성 루푸스, 원판상 루푸스 및 원판상 홍반성 루푸스, 탈모성 루푸스, 전신 홍반 루푸스(SLE), 예를 들어 피부 SLE 또는 아급성 피부 SLE, 신생아 루푸스 증후군(NLE: neonatal lupus syndrome), 및 파종성 홍반성 루푸스 포함), I형 당뇨병, II형 당뇨병, 및 성인에서 잠복성 자가면역 당뇨병(또는 1.5형 당뇨병)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응, 유육종증, 육아종증(림프종양 육아종증, 베게너 육아종증 또는 무과립구증 포함), 맥관염(혈관염, 대혈관 혈관염(류마티스성 다발근통 및 거대세포(타카야수) 동맥염 포함), 중혈관 혈관염(가와사키병 및 결절성 다발 동맥염/결절 동맥주위염 포함), 현미경적 다발 동맥염, 면역 혈관염, CNS 혈관염, 피부혈관염, 과민성 혈관염, 전신성 괴사성 혈관염과 같은 괴사성 혈관염, 및 ANCA 관련 혈관염(예를 들어, 척-스트라우스 혈관염 또는 증후군(CSS: Churg-Strauss syndrome) 및 ANCA 관련 소혈관 혈관염) 포함), 측두동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역성 재생불량성 빈혈, 쿠움스(Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판(Diamond Blackfan) 빈혈, 용혈성 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈(AIHA: autoimmune hemolytic anemia)을 포함한 면역 용혈성 빈혈, 애디슨병, 자가면역성 호중구 감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 삼출을 포함한 질환, CNS 염증 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다중 기관 손상 증후군(예를 들어 패혈증, 외상 또는 출혈에 2차적인 것), 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 항-인지질 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병/증후군, 캐슬만 증후군, 굿파스처 증후군, 레이노드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 수포성 유사 천포창 및 피부 유사 천포창 등과 같은 유사 천포창, 천포창(심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 천포창 점막 유사 천포창, 및 홍반성 천포창 포함), 자가면역 다발성 내분비 병증, 라이터병 또는 증후군, 열상, 임신 중독증, 면역 복합체 신장염과 같은 면역 복합체 장애, 항체-매개 신장염, 다발성 신경병증, IgM 다발성 신경병증 또는 IgM-매개 신경병증과 같은 만성 신경병증, 자가면역성 또는 면역-매개 혈소판 감소증, 예를 들어 만성 또는 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP: idiopathic thrombocytopenic purpura)을 포함한 ITP, 후천적 혈소판 감소성 자반증, 공막염, 예를 들어 특발성 각-공막염, 상공막염, 자가면역성 고환염 및 난소염을 포함한 고환 및 난소의 자가면역성 질환, 원발성 갑상선 기능 저하증, 부갑상선 기능 저하증, 자가면역 내분비 질환(갑상선염(예를 들어, 자가면역 갑상선염, 하시모토병, 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염 포함), 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선 기능 저하증, 또는 그레이브스병 포함), 다선 증후군, 예를 들어 자가면역 다선 증후군(또는 다선성 내분비 병증 증후군), 신경 부종양 증후군를 포함하는 부종양 증후군, 예를 들어 람베르트-이튼 근무력 증후군 또는 이튼-람베르트 증후군, 강직 인간(Stiff-man 또는 Stiff person) 증후군, 뇌척수염, 예를 들어 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis 또는 encephalomyelitis allergica) 및 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE: experimental allergic encephalomyelitis), 중증 근무력증, 예를 들어 흉선종-관련 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근 긴장증, 안구간 대경련 또는 안구간대경련 근간대경련 증후군(OMS: opsoclonus myoclonus syndrome), 감각성 신경병증, 다초점성 운동 신경병증, 시한(Sheehan) 증후군, 자가면역성 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대세포 간염, 만성 활동 간염 또는 자가면역성 만성 활동 간염, 림프양 간질 폐렴(LIP: lymphoid interstitial pneumonitis), 폐쇄 세기관지염(비-이식) 대 NSIP, 길랭-바레 증후군, 버거씨병(IgA 신경병증), 특발성 IgA 신경병증, 선상 IgA 피부종, 급성 발열성 호중구성 피부염, 각질하 농포성 피부염, 일과성 극세포해리성 피부병, 간경화증, 예를 들어 원발성 담즙성 간경화븐 및 폐경변, 자가면역 장증 증후군, 셀리악병 또는 실리악병(Coeliac disease), 복강 흡수 불량증(celiac sprue)(글루텐 장증), 난치성 흡수 불량증, 특발성 흡수 불량증, 한랭 글로불린 혈증, 근위축성 측삭 경화증(ALS(amylotrophic lateral sclerosis); 루게릭병), 관상동맥질환, 자가면역성 이질환, 예를 들어 자가면역성 내이질환(AIED: autoimmune inner ear disease), 자가면역성 청각상실, 다발 연골염, 예를 들어 난치성 또는 재발성(relapsed 또는 relapsing) 다발 연골염, 폐포 단백증, 코간(Cogan) 증후군/비매독성 실질성 각막염, 안면 신경마비(Bell's palsy), 스위트병/증후군, 자가면역 장미증, 대상포진-연관 통증, 아밀로이드증, 비-암성 림프구증가증, 단클론성 B 세포 림프구증가증을 포함하는 원발성 림프구증가증(예를 들어, 양성 단세포군 감마글로불린병증 및 의미불명의 단세포군 감마글로불린병증, MGUS(monoclonal gammopathy of undetermined significance), 말초 신경병증, 부종양 증후군, 이온통로 병증, 예를 들어 뇌전증, 편두통, 부정맥, 근질환, 난청, 실명, 주기성 근육마비, CNS의 이온통로 병증, 자폐증, 염증성 근육병증, 국소 또는 분절 또는 국소 분절 사구체경화증(FSGS: focal segmental glomerulosclerosis), 내분비 안병증, 포도막 망막염, 맥락 망막염, 자가면역성 간장학적 장애, 섬유 근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축증, 초로성 치매, 탈수초성 질환, 예를 들어 자가면역성 탈수초성 질환 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 드레슬러 증후군, 원형탈모증, 전두탈모증, 크레스트 증후군(석회증, 레이노드 현상, 식도 운동장애, 수지경화증 및 모세혈관 확장증), 남성 및 여성 자가면역성 불임(예를 들면, 항-정자 항체로 인한), 혼합 결합조직 질환, 샤가스병, 류마티스 열(rheumatic fever), 재발성 유산, 농부 폐증, 다형서 홍반, 심장 절개술 후 증후군, 쿠싱 증후군, 조류 사육가 폐병, 알레르기성 육아종 혈관염, 양성 림프구 혈관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예를 들어 알레르기성 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질성 폐질환, 수혈 반응, 한센병, 말라리아, 기생충성 질환, 에를 들어 리슈만 편모충증, 카이파노소미아시스(kypanosomiasis), 주혈흡충증(schistosomiasis), 회충증(ascariasis), 아스페르길루스증(aspergillosis), 샘프터 증후군, 카플란 증후군, 뎅기열, 심내막염, 심내막 심근섬유증, 미만 간질성 폐섬유증, 간질성 폐섬유증, 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 낭포성 섬유증, 내안구염, 장기융기성 홍반, 태아 적아구증, 호산성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 필라리아증, 모양체염, 예를 들어 만성 모양체염, 이색 모양체염, 홍채모양체염(급성 또는 만성), 또는 푸크스 모양체염, 헤노흐-쉔라인 자반증, 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus) 감염증, SCID(중증 복합 면역 결핍증), 후천성 면역 결핍증(AIDS: acquired immune deficiency syndrome), 에코바이러스(echovirus) 감염증, 패혈증, 내독소혈증, 췌장염, 갑상선 중독증, 파보바이러스(parvovirus) 감염증, 풍진(rubella) 바이러스 감염증, 예방접종 후 증후군, 선천성 풍진 감염증, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 감염증, 볼거리, 에반스 증후군, 자가면역성 성선 부전증, 시드남 무도증(Sydenham's chorea), 연쇄상구균 감염 후 신염, 폐색성 혈전 혈관염, 갑상선 중독증, 척수로(tabes dorsalis), 맥락막염, 거대세포 다발성 근육통, 만성 과민성 폐렴, 건성 각결막염, 유행성 각결막염, 특발성 신염 증후군, 미세변화 신장 병증, 양성 가족성 및 허혈성 재관류 손상, 이식기관 재관류, 망막 자가면역, 관절염, 기관지염, 만성 기도폐쇄/폐질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화 장애, 아스퍼니오게네스(asperniogenese), 자가면역성 용혈, 베크병, 한랭 글로불린 혈증, 듀피트렌 구축, 수정체 과민성 내안구염(endophthalmia phacoanaphylactica), 알레르기성 장염, 나병성 결절성 홍반, 특발성 안면마비, 만성 피로 증후군, 류마티스 열(febris rheumatica), 함만-리치병, 감각신경성 청각상실, 발작성 헤모글로빈뇨(haemoglobinuria paroxysmatica), 성선기능저하증, 국한성 회장염(ileitis regionalis), 백혈구 감소증, 감염 단핵구증(mononucleosis infectiosa), 횡단성 척수염, 원발성 특발성 점액수종, 신증, 교감성 안염(ophthalmia symphatica), 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발 신경근염(polyradiculitis acuta), 괴저성 농피증, 퀘르바인 갑상선염(Quervain's thyreoiditis), 후천성 비장 위축증, 비-악성 흉선종, 백반증, 독소 충격 증후군, 식중독, T 세포의 침윤을 수반하는 병태, 백혈구-부착 결핍증, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 다중 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역성 다발성 내분비 병증, 난소암, 원발성 점액수종, 자가면역성 위축성 위염, 교감성 안염, 류마티스성 질환, 혼합 결합조직 질환, 신증후군, 인슐린염, 다발성 내분비 부전, 자가면역성 다선 증후군 I형, 성인-발병 특발성 부갑상선 기능저하증(AOIH: adult-onset idiopathic hypoparathyroidism), 심근병증, 예를 들어 확장성 심근병증, 후천성 표피 수포증(EBA: epidermolisis bullosa acquisita), 혈색소증, 심근염, 신증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골동염, 전두동염, 상악동염, 또는 접형동염, 호산구 관련 장애, 예를 들어 호산구 증가증, 폐침윤 호산구 증가증, 호산구 증가 근육통 증후군, 뢰플러 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구 증가증, 기관지 폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르질루스 육아종, 또는 호산구 함유 육아종, 아나필락시스, 혈청음성 척추관절염, 다발성 내분비 자가면역성 질환, 경화성 담관염, 공막염, 상공막염, 만성 점막 피부 칸디다증, 브루톤 증후군, 유아기의 일과성 저감마글로불린 혈증), 비스코트-알드리히 증후군, 모세혈관 확장성 운동실조 증후군, 혈관 확장증, 교원병 관련 자가면역성 장애, 류마티즘, 신경학적 질환, 림프절염, 혈압 반응에서의 감소, 맥관 부전, 조직 손상, 심혈관 허혈증, 통각 과민, 신허혈증, 뇌허혈증, 및 혈관신생(vascularization)을 수반하는 질환, 알레르기성 과민성 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 허혈성 재관류 장애, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 림프종 기관 기관지염, 염증성 피부질환, 급성 염증성 성분을 갖는 피부질환, 복합 장기 부전, 수포성 질환, 신피질 괴사, 급성 화농성 뇌막염 또는 다른 중추신경계 염증성 장애, 안구 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈 관련 증후군, 사이토카인-유발 독성, 기면증, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 동맥 내막 이상 증식증, 소화성 궤양, 판막염, 폐기종, 원형 탈모증, 지방 조직 염증/II형 당뇨병, 비만 관련 지방 조직 염증/인슐린 내성, 및 자궁내막증이 고려된다.
일부 실시양태에서, 자가면역 장애 또는 질환은 당뇨병 I형 및 II형, 전당뇨병, 이식 거부반응, 다발성 경화증, 다발성 경화증 관련 장애, 조기 난소 부전, 피부경화증, 쇼그렌 질환/증후군, 루푸스, 백반증, 탈모증(대머리), 다선성 기능 이상, 그레이브스병, 갑상선 저하증, 다발성 근염, 천포창, 크론병, 대장염, 자가면역성 간염, 뇌하수체 기능 저하증, 심근염, 애디슨병, 자가면역성 피부 질환, 포도막염, 악성 빈혈, 부갑상선 기능 저하증, 및/또는 류마티스성 관절염을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 관심의 다른 적응증은 천식, 알레르기성 천식, 원발성 담즙성 간경화증, 간경화증, 시신경척수염 스펙트럼 장애(데빅병, 시신경-척수형 다발성 경화증(OSMS: opticospinal MS)), 심상성 천포창, 염증성 장 질환(IBD), 관절염, 류마티스성 관절염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 셀리악병, 건선, 자가면역성 심근병증, 특발성 확장성 심근병증(IDCM), 중증 근무력증, 포도막염, 강직성 척추염, 면역 매개 근병증, 전립선암, 항인지질 증후군(ANCA+), 죽상경화증, 피부근염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐기종, 척수 손상, 외상성 손상, 담배 유도성 폐 파괴, ANCA 관련 혈관염, 건선, 경화성 담관염, 원발성 경화성 담관염, 및 중추 및 말초 신경계 질환을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 자가면역 장애 또는 질환은 I형 당뇨병, 다발성 경화증, 셀리악병, 원발성 담즙성 간경화증, 천포창, 낙엽상 천포창, 심상성 천포창, 시신경척수염 스펙트럼 장애, 관절염(류마티스 관절염 포함), 알레르기성 천식, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염 포함), 전신 홍반 루푸스, 죽상경화증, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 건선, 자가면역성 간염, 포도막염, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 항인지질 증후군, ANCA 관련 혈관염, 및 강직 인간 증후군을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 추가 양태에서, 질환 관련 항원은 종양 또는 암 관련 항원이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 및 희석제를 포함하는 약학 조성물에 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 멸균 용액 중에 현탁되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 0.9% NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용액은 완충제, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 숙시네이트, 포스페이트, 비카보네이트 및 히드록시메틸아미노메탄(트리스(Tris)); 계면 활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 폴리소르베이트 20(트윈 20) 및 폴록사머 188; 폴리올/이당류/다당류, 예를 들어 글루코오스, 덱스트로오스, 만노오스, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로오스, 및 덱스트란 40; 아미노산, 예를 들어 글리신 또는 아르기닌; 산화 방지제, 예를 들어 아스코르브산, 메티오닌; 또는 킬레이트제(예를 들어, EGTA 또는 EGTA) 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 동결 건조 상태로 운반/저장되고 투여 전에 재구성된다. 특정 실시양태에서, 동결 건조된 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체 제제는 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로오스, 또는 덱스트란(40)과 같은 증량제를 포함한다. 동결 건조된 제제는 유리로 구성된 바이알에 담을 수 있다. 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 제제화될 때, 재구성 여부에 상관없이 특정 pH, 일반적으로 7.0 미만에서 완충될 수 있다. 특정 실시양태에서, pH는 4.5 내지 6.5, 4.5 내지 6.0, 4.5 내지 5.5, 4.5 내지 5.0, 또는 5.0 내지 6.0일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 정맥 내 주사용으로 제제화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 경구 섭취용으로 제제화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 비경구, 근육 내, 또는 조직 내 주사용으로 제제화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 이종이량체 또는 단리된 이종이량체-나노입자 복합체는 면역 보조제 또는 면역 반응을 증가 또는 감소시키려고 의도된 다른 화합물 또는 폴리펩티드 없이 제제화되고/거나 투여될 수 있다.
본원의 또 다른 양태에서, 면역 세포, 바람직하게는 T 세포의 집단을 검출 및/또는 모니터링하는 방법으로서, 대상체가 본원에 개시된 이종이량체 및/또는 본원에 개시된 이종이량체-나노입자 접합체를 투여받은 경우 표지된 항원-MHC 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원의 특정 양태에서, 본원에 개시된 이종이량체 및/또는 본원에 개시된 이종이량체-나노입자 접합체를 받은 대상체에서 항원 특이적 방식으로 TR1 세포 및/또는 이펙터 T 세포의 집단을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 TR1 세포를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 유효량의 표지된 pMHC 복합체와 접촉시켜 다량체 복합체를 형성하는 단계, 및 임의의 다량체 복합체를 검출함으로써 TR1 세포의 집단을 검출하는 단계를 포함하거나, 다르게는 이들로 이루어지거나, 추가로 이들로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표지된 다량체 복합체를 사용하여 임의의 T 세포 집단을 염색하는 단계를 추가로 포함하거나, 다르게는 추가로 이로 이루어지거나, 추가로 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, TR1 세포의 집단을 검출하는 단계는 임의의 다량체 복합체를 검출하기 위한 유동 세포 분석법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 복합체 또는 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하거나, 다르게는 이로 이루어지거나, 추가로 이로 본질적으로 이루어진다.
본원의 특정 양태에서, 본원에 개시된 이종이량체 및/또는 본원에 개시된 이종이량체-나노입자 접합체를 투여받은 대상체에서 항원 특이적 방식으로 TR1 세포 및/또는 이펙터 T 세포의 집단을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 분석법 중 어느 하나를 포함하거나, 다르게는 이로 이루어지거나, 추가로 이로 본질적으로 이루어진다: 사이토카인 ELISPOT 분석법, 다량체 유도된 에피토프 분석법 또는 다량체 풀다운(pull-down) 분석법. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 이종이량체 및/또는 본원에 개시된 이종이량체-나노입자 접합체를 투여하는 단계를 추가로 포함하거나, 다르게는 이로 추가로 이루어지거나, 추가로 이로 본질적으로 이루어진다.
본원의 다른 양태에서, 대상체에서 항원 특이적 TR1 및/또는 이펙터 T 세포의 집단의 증식을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 a) 본원에 개시된 이종이량체 및/또는 본원에 개시된 이종이량체-나노입자 접합체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계로서, pMHC 복합체의 질환 관련 항체는 항원 특이적 TR1 및/또는 이펙터 T 세포를 증식시키기 위해 선택되는 것인 단계; b) 상기 집단을 함유하고 있다고 의심되는 대상체로부터 적절한 샘플을 단리하는 단계; c) 샘플을 유효량의 표지된 pMHC 복합체와 접촉시켜 다량체 복합체를 형성하고, 임의의 다량체 복합체를 검출하는 단계; 및 d) 상기 집단 내의 항원 특이적 TR1 및/또는 이펙터 T 세포의 수를 정량하는 단계를 포함하거나, 다르게는 이들로 이루어지거나, 추가로 이들로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 임의의 다량체 복합체를 염색하는 단계를 추가로 포함하거나, 다르게는 추가로 이들로 이루어지거나, 추가로 이들로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 항원 특이적 TR1 및/또는 이펙터 T 세포의 수를 정량하는 단계는 유동 세포 분석법 및/또는 ELISA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 이종이량체 및/또는 본원에 개시된 이종이량체-나노입자 접합체를 투여하는 단계를 추가로 포함하거나, 다르게는 추가로 이로 이루어지거나, 추가로 이로 본질적으로 이루어진다.
구현될 수 있는 많은 유형의 면역분석법이 존재한다. 본 발명에 포함되는 면역분석법에는 미국 특허 제4,367,110호(이중 단클론 항체 샌드위치 분석법) 및 미국 특허 제4,452,901호(웨스턴 블롯)에 기재된 것들이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 분석법은 시험관 내 및 생체 내에서 표지된 리간드의 면역 침전 및 면역 세포 화학을 포함한다.
순환하는 항원 특이적 면역 세포의 수를 정량하기 위한 한가지 방법은 사량체 분석법이다. 이 분석법에서, 특정 에피토프는 형광으로 표지된 MHC 분자의 합성 다량체 형태에 결합된다. 면역 세포는 MHC 분자에 결합된 짧은 펩티드의 형태로 항원을 인식하기 때문에 적절한 T 세포 수용체를 지닌 세포는 표지된 사량체와 결합할 것이고 유동 세포 분석법으로 정량될 수 있다. 이 방법은 ELISPOT 분석법보다 시간 소모가 적지만, 다량체 분석법은 결합만을 측정하며 기능을 측정하지는 않는다. 특정 항원에 결합하는 모든 세포가 반드시 활성화되는 것은 아니다. 그러나 ELISPOT, 다량체와 세포 독성 분석법 사이의 상관관계가 입증되었다.
면역 분석법은 일반적으로 결합 분석법이다. 다양한 유형의 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay), 방사 면역 측정법(RIA: radioimmunoassay) 또는 루미넥스(Luminex)® 기술과 같은 비드 기반 분석법을 비롯한 특정 면역 분석법이 당 업계에 공지되어있다. 조직 절편을 이용한 면역 조직 화학 검사 또한 유용하다.
ELISA의 일례로, 항체 또는 항원은 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 웰, 딥 스틱 또는 칼럼 지지체와 같은 선택된 표면상에 고정된다. 그런 후, 임상 샘플과 같은 원하는 항원 또는 항체를 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 결합 단계 및 비특이적으로 결합된 면역 복합체의 세척 단계 후에, 결합된 항원 또는 항체를 검출할 수 있다. 검출은 일반적으로 검출 가능한 표지와 결합된 원하는 항원 또는 항체에 특이적인 또 다른 항체를 첨가함으로써 이루어진다. 이러한 유형의 ELISA는 "샌드위치 ELISA"로 공지되어 있다. 또한, 검출은 원하는 항원에 특이적인 2차 항체를 첨가한 다음 2차 항체에 대해 결합 친화성을 가지며 검출 가능한 표지에 결합되어 있는 3차 항체를 첨가하여 이루어질 수 있다. ELISA 기술에 대한 변형은 당업자에게 공지되어있다.
또한, 시험 샘플이 기지량의 표지된 항원 또는 항체와의 결합과 경쟁하는 경쟁 ELISA가 가능하다. 미지의 샘플 내 반응 종의 양은 코팅된 웰과의 인큐베이션 전 또는 도중에 기지의 표지된 종과 샘플을 혼합함으로써 결정된다. 샘플 내 반응 종의 존재는 웰에 결합하기 위해 이용 가능한 표지된 종의 양을 감소시키는 작용을 하여, 궁극적인 신호를 감소시킨다.
사용된 형식에 관계없이, ELISA는 코팅, 인큐베이션 또는 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출과 같은 특정 특징을 공통으로 갖는다.
또한, 항원 또는 항체는 플레이트, 비드, 딥 스틱, 막, 또는 칼럼 매트릭스의 형태와 같은 고체 지지체에 결합될 수 있으며, 분석할 샘플은 고정된 항원 또는 항체에 적용된다. 항원 또는 항체로 플레이트를 코팅할 때, 일반적으로 플레이트의 웰을 항원 또는 항체의 용액과 밤새 또는 특정 기간 동안 인큐베이션할 것이다. 그런 후, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거할 것이다. 그런 후, 웰의 잔여의 이용 가능한 표면을 시험 항혈청에 대해 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"한다. 여기에는 소 혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin), 카제인, 및 분유 용액이 포함된다. 코팅은 고정화 표면상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 하여, 표면상에 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기되는 배경을 감소시킨다.
ELISA에서, 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 더 통상적이다. 따라서, 웰과의 항원 또는 항체의 결합, 배경을 감소시키기 위한 비반응성 물질로의 코팅, 및 결합되지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 후, 면역 복합체(항원/항체) 형성을 가능하게 하는 효과적인 조건하에서 시험될 임상 또는 생물학적 샘플과 고정화 표면을 접촉시킨다. 그런 후, 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 또는 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.
또한, 유동 세포 분석법을 사용하여 세포 표면 마커에 따라 특정 세포 아형을 검출하고 정량할 수 있다. 유동 세포 분석법을 통한 통상적인 검출 및 정량 방법은 각각의 면역 세포 아형에 특이적인 세포 표면 마커에 결합하는 형광 표지된 비드, 예를 들어, CD4+ T 세포를 선택하기 위한 CD4 특이적 비드의 사용 등을 포함한다.
본원에 기재된 조성물은 통상적으로 비경구적으로, 주사에 의해, 예를 들어, 정맥 내로, 피하로 또는 근육 내로 투여될 수 있다. 정맥 내로 투여되는 조성물은 안정화제, 부형제, 및 방부제를 포함할 수 있다. pMHC-나노입자 조성물은 멸균 식염수, 완충 식염수, 또는 인산 완충 식염수에 현탁될 수 있다. 또한, 특정 실시양태에서, 정맥 내 제제는 덱스트로스, 글루코오스, 만니톨, pH 완충액, 또는 중탄산나트륨을 포함한다. 다른 투여 방식에 적합한 추가 제제는 경구 제제를 포함한다. 경구 제제는 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제제 또는 분말의 형태를 취하며 약 10% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%의 활성 성분을 함유한다. 대상체의 면역 상태를 변형시키는 항원-MHC-나노입자 복합체를 함유하는 수성 조성물의 제조는 본 발명을 비추어 당업자가 알 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 흡입될 수 있다(예를 들어, 그 전문이 참고로 구체적으로 포함된 미국 특허 제6,651,655호). 한 실시양태에서, 항원-이종이량체-나노입자 복합체(즉, 항원-pMHC-NP 복합체)는 전신으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 pMHC-NP 복합체 또는 본원에 기재된 다수의 pMHC-NP 복합체를 포함하는 조성물은 정맥 내로 투여된다.
실시예
실시예 1. 류신 지퍼 포함 펩티드- MHC ( pMHC ) 복합체의 발현
CHO-S 세포에서 pMHC 복합체를 발현시키기 위해, pMHC 복합체를 코딩하는 DNA 단편(상이한 구성으로, [도 2] 참조)을 pLV/CMV-GW 렌티바이러스 발현 벡터(도 1A 및 1B)에 클로닝하였다. pMHC 복합체의 알파 및 베타 사슬 둘 모두는 P2A 리보솜 스키핑(skipping) 서열에 의해 분리된 2개의 분리된 사슬(도 2, 상부)로서 또는 2개의 상이한 벡터에 클로닝된 두 개의 분리된 사슬(도 2, 하단)로서 단일 ORF에 의해 코딩된다. pMHC 코딩 단편을 IRES-EGFP 카세트의 상류에 클로닝한다. 발현된 베타 사슬 생성물은 리더 서열, 에피토프 서열, GS 링커, 이어서 베타 사슬의 세포 외 도메인 및 C-Jun 단편(40 a.a.)으로 이루어진다. 발현된 알파 사슬은 리더 서열, 알파 사슬의 세포 외 도메인, C-fos 단편(40 aa), BirA 비오티닐화 부위(14 aa) 및 C-말단 시스테인을 갖는 6X 히스티딘 및/또는 스트렙 태그를 함유한다. 바람직한 벡터 설계(도 2, 하단)는 별도의 플라스미드 상에 두 사슬 모두를 코딩한다.
실시예 2. 놉-인-홀 기반 pMHC 이종이량체화.
하기 실험은 개선된 안전성, 효능, 및 조절 특성을 갖는, 인간에서의 임상 용도를 위한 pMHC 이종이량체를 개발하기 위한 노력을 기술하며, 이러한 임상 용도에 필요한 대량 정제가 가능하다. 에피토프 태그는 항-약물 항체의 생성을 유발할 수 있기 때문에, 표준 에피토프 태그(예를 들어, FLAG, 6xHIS)를 포함하는 현재의 생물학적 약물은 임상적 견지에서 환영받지 못하고 있다. 이는 다른 약이 동일한 태그를 보유하거나 동일한 약물이 후속적인 투여를 요구할 때 특히 관련된다. 예를 들어, 에피토프 태그 X를 사용하여 정제된 약물 A를 환자에게 주사하면, 에피토프 태그 X에 대해 면역 반응을 초래할 수 있어, 동일한 약물 또는 동일한 에피토프 태그를 갖는 다른 약물의 후속 투여는 약물 A의 최초 투여에 의해 생성된 항체 반응에 의해 중화될 것이다. 에피토프 태그를 사용하지 않는 정제는 가용성 MHC II형 α-β 이종이량체를 시험관 내에서 단리하는데 문제를 일으킨다. 이는 MHC 폴리펩티드의 크로마토그래피 분리 기술이 다량의 고순도 단백질의 정제를 허용하지 않기 때문이다.
따라서, 재조합 pMHC의 정제를 용이하게 하는 재조합 MHC II형 분자로서, a) CHO 세포로부터의 분비가 향상된; b) 정제 태그를 사용할 필요가 없는; 그리고 c) 서열에 비오티닐화 태그를 도입할 필요없이 사량체 생산을 위한 단량체의 비오티닐화를 가능하게 하는 재조합 MHC II형 분자를 개발하고자 하였다. 처음에는 이종이량체화 류신 지퍼를 보유하지만 인간 IgG1 Fc의 "놉-인-홀" 형태에 융합된 안정한 MHC II형 이종이량체를 생산하여 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 배양 상등액으로부터 정제할 수 있는 재조합 pMHC 이종이량체를 만들고자 하였다. 대조군으로서, 류신 지퍼 미포함 형태(도 3의 오른쪽 도면에 나타냄)를 생성하였고, 이는 불안정한 pMHC 이종이량체를 생성할 것으로 예상하였다. MHC 복합체의 알파 및 베타 사슬이 P2A 리보솜 스키핑 서열에 의해 분리된 2개의 분리된 사슬을 코딩하는 단일 ORF에 의해 코딩되는 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 구조물(도 1A, 1B 및 2)을 선택하여 발현되도록 하였다. BirA 비오티닐화 부위(14 aa)(종래의 효소 기반 비오티닐화를 위함), 6X 히스티딘 및 스트렙 태그(필요 시 제제의 순도를 향상시키기 위해), 및 C-말단 시스테인(말레이미드 작용기화된 나노입자와의 접합을 가능하게 하기 위해)도 포함하였다. 그러나 비오티닐화 부위, 6X 히스티딘, 및 스트렙타비딘 태그의 존재는 선택적이며, 단백질 A/G/L을 사용하여 이종이량체가 정제되도록 하기 위해서 생략될 수 있음에 유의해야 한다.
간략하게, 류신 지퍼 포함 또는 미포함 쥣과 BDC2.5mi/IAg7 또는 인간 IGRP13 -25/DRB1*0301 pMHC II형 알파 사슬을 폴리펩티드 "놉"을 포함하도록 변형된 인간 IgG1의 Fc 영역에 연결하였다. 마찬가지로, 펩티드-MHC 베타 사슬 구조물(류신 지퍼 포함 또는 미포함)을 폴리펩티드 "홀"을 포함하도록 변형된 인간 IgG1의 Fc 영역에 연결하였다. 서열 번호 1 내지 8 및 27 내지 34는 상응하는 pMHC-코딩 카세트의 DNA 및 아미노산 서열을 각각 제공한다.
이들 pMHC 구조물을 발현하기 위해, 먼저 pMHC 유전자를 함유하는 플라스미드를 바이러스 패키징을 위해 HIV 바이러스 코어 및 엔벨로프 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 293T 세포에 형질감염시켰다. 그런 후 패키징된 바이러스 입자를 사용하여 CHO-S 세포를 형질도입시켰다. 최고 수준의 eGFP를 발현하는 형질도입된 CHO-S 세포를 FACS 세포 분류에 의해 선별하였다. EGFP가 높은 세포를 추가로 증식시키고 보관한 후 pMHC 생산 세포주로서 사용하였다.
C-Jun/C-Fos 류신 지퍼 포함, 또는 C-Jun/C-Fos 류신 지퍼 미포함 쥣과 BCD2.5rmi/IAg7 코딩 구조물에 노력을 집중하였다. 구조물로 형질도입된 CHO 세포주 둘 모두가 상응하는 세포주에서 높은 수준의 eGFP(유동 세포 분석법에 의해 측정됨)의 발현에 의해 기재된 바와 같이 트랜스제닉 RNA를 발현하였다. [도 4A]는 C-Jun/C-Fos 류신 지퍼 포함 (402), 또는 C-Jun/C-Fos 류신 지퍼 미포함 (404) BDC2.5mi/IAg7-코딩 구조물로 형질도입된 CHO 세포를 음성 대조군 CHO 세포 (401) 및 (403)과 각각 비교하여 나타낸다. CHO-S 세포의 상등액을 투석을 이용하여 농축하고 투명하게 하였다. 농축 배지 내 pMHC를 단백질 G 기반 친화성 크로마토그래피를 거쳐 산성 pH에서 용리시켰다. [도 4C]는, 놀랍게도, RNA 메시지를 발현하지만, 류신 지퍼를 함유하는 pMHC 놉-인-홀을 발현하는 CHO 세포주는 극히 낮은 수준의 pMHC를 생산하였음을 보여준다. 단백질 G 용출 프로파일로부터 피크(406)를 참조한다(도 4C). 가장 예상하지 못한 것은 [도 4B]에 나타난 바와 같이, 지퍼 미포함 pMHC 놉-인-홀을 발현하는 세포주가 풍부한 양의 단백질 G-결합 물질을 발현하였다는 것이다. 단백질 G 용출 프로파일로부터 피크(405)를 참조한다(도 4B).
단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의해 수집된 지퍼 미포함 pMHC 물질을 정량하고 천연 및 변성 SDS-PAGE 둘 모두에서 전기영동을 사용하여 그 순도를 분석하였다. [도 5]는 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의해 수집된 지퍼 미포함 pMHC 물질이 비환원 조건(마커의 왼쪽)에서 단일 밴드로서 이동하였고, 예상한 바와 같이, 이들 분자 종은 변성 SDS-PAGE에서 3개의 분리된 밴드로서 이동하였으며, 양상은 종래의 C-Jun/C-Fos 류신 지퍼 기반 구조물을 사용하여 발현된 pMHC로 보이는 것과 현저하게 유사하다. 비환원 조건에서 단일 밴드에 대해 (501) 및 (502)를 참조하고 변성 조건에서 3개의 밴드에 대해 (503)을 참조한다(도 5).
실시예 3. pMHC 복합체와 동족 T 세포의 결합.
정제된 지퍼 미포함 pMHC 복합체가 동족 T 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 시험하기 위해, 정제된 복합체를 시험관 내에서 비오티닐화한 다음 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 비오티닐화 분획을 모으고, 투석하고, 형광 색소 접합된 스트렙타비딘을 사용하여 pMHC 사량체를 제조하는데 사용하였다. 그런 후, 이 시약들이 시험관 내에서 동족 T 세포에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 시험하였다. BDC2.5mi 특이적 T 세포 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 비장 CD4+ T 세포를 사용하였는데, 이들 중 대부분의 CD4+ T 세포는 동일한 항원 특이성을 공유한다(높은 다클론 항원성 TCR 레퍼토리를 갖는 것과 반대). 양성 대조군으로서, [도 2]에 기재된 C-Jun/C-Fos 류신 지퍼 기반 구조물을 사용하여 발현된 pMHC 단량체를 사용하여 생성된 사량체를 사용하였다. [도 6]에 나타난 바와 같이, 지퍼 미포함 놉-인-홀 pMHC 기반 사량체는 본질적으로 이의 지퍼 포함의 비-Fc-융합 대응물과 유사하게 수행하였으며, 이는 이 신규한 접근법의 실현 가능성을 증명해준다.
실시예 4. 말레이미드 -작용기화된 나노입자에 지퍼 미포함 pMHC의 커플링.
이 지퍼 미포함 형태의 pMHC가 C-말단 유리 시스테인을 통해 말레이미드-작용기화된 나노입자에 생산적으로 커플링될 수 있는지를 확인하기 위해, PF-Mal 나노입자를 정제된 단백질과 인큐베이션한 후, 밀테니-바이오텍 자석 칼럼을 사용하여 유리 pMHC로부터 접합제를 제거하여 정제하였다. [도 7]의 왼쪽 패널은 유리 pMHC(N1 레인: 6 μg의 2.5mi-놉-인-홀) 대 pMHC-접합된 나노입자(N2 레인: 6.4 ㎕의 2.5mi-놉-인-홀-PFM-031716 및 N3 레인: 3.2 ㎕의 2.5mi-놉-인-홀-PFM-031716)의 천연 겔 이미지를 나타낸다. 이 도면은 제제 중에 대부분의 pMHC가 겔에 들어가지 않은 나노입자에 커플링됨을 보여준다. [도 7]의 오른쪽 패널은 나노입자 표면으로부터 pMHC를 분리하는 변성 조건(10% SDS-PAGE) 하에서 동일 제제에 수행된 SDS-PAGE 겔의 이미지를 나타낸다. 레인 1은 단백질 사다리를 포함하고, 레인 2는 6μg의 2.5mi-놉-인-홀을 포함하였다. 레인 3은 6.4 ㎕의 2.5mi-놉-인-홀-PFM-031716을 포함하고, 레인 4는 3.2 ㎕의 2.5mi-놉-인-홀-PFM-031716을 포함하였다. 이미지는 지퍼 미포함 pMHC의 두 사슬 모두가 나노입자 표면에 생산적으로 결합됨을 명확하게 보여준다. pMHC 원자가의 정량은 각각의 나노입자상에 42 pMHC가 존재함을 나타내었으며, 이는 종래의 지퍼 미포함 pMHC 단량체로 얻은 원자가와 비슷한 원자가이다.
실시예 5. 지퍼 미포함 pMHC 나노입자를 사용한 자가 조절 T 세포의 증식.
지퍼 미포함 놉-인-홀 pMHC로 코팅된 나노입자가 그의 지퍼 포함의 종래의 pMHC(비-놉-인-홀) 대응물의 경우와 같이 생체 내에서 동족 자가 조절 CD4+ T 세포(T-조절 1형, TR1)의 형성 및 증식을 유발하는 능력을 확인하였다. [도 8]에 나타난 바와 같이, 이 화합물의 처리에 반응하여 생체 내에서 증식된 동족(사량체+) CD4+ T 세포는 실시간 정량 PCR에 의해 결정된 바와 같이 그의 비동족(사량체 음성) 대응물과 비교하여 TR1 관련 mRNA 마커를 발현하였다. [도 9A] 및 [도 9B]는 이와 일치하여 생체 내에서 증식된 (사량체+) CD4+ T 세포가 사량체 음성의 대응물과 달리 생체 외에서 항-CD3 및 항-CD28 mAb로 자극시 TR1 관련 사이토카인을 분비하였다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 지퍼 미포함 놉-인-홀 기반 pMHC 이종이량체는 지퍼 포함의 종래의 pMHC의 생물학적 활성과 관련하여 유사한 생물학적 활성을 갖는다.
실시예 6. 비오티닐화 ( BirA ) 태그가 없는 지퍼 미포함 pMHC 이종이량체의 부위 지정 비오티닐화 .
치료 목적을 위해 생산된 pMHC는 BirA 효소가 비오틴 분자를 부착시키기 위해 표적화하는 비오티닐화 서열과 같은 면역 반응성의 표적이 될 수 있는 외래 단백질 서열이 결여되어야 한다. BirA를 통한 pMHC의 비오티닐화는 스트렙타비딘을 사용하여 사량체화에 적합한 비오티닐화 pMHC 단량체를 제조하는 데 통상적으로 사용되는 기술이다. 이러한 pMHC 사량체 및 이들의 고차 유도체(펜타머, 덱스트라머 등, 총체적으로 "다량체"로 정의됨)는 생물학적 샘플에서 항원 특이적 T 세포의 빈도를 계산할 수 있는 시약으로서 유용하다. 여기에서, 비오티닐화 태그가 없는 pMHC 단량체로부터 pMHC 다량체의 생산을 가능하게 하여, 치료 목적을 위해 생산되는(예를 들어, 나노입자를 통해 전달되는) pMHC 단량체의 사용으로 진단 유도체를 생성할 수 있도록 하는 방법을 하기에 설명한다.
이는 말레이미드로 작용기화된 비오틴-커플링된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스페이서를 통해 BDC2.5mi/IAg7 단량체의 카르복시 말단 시스테인에 단일 비오틴 분자를 커플링시킴으로써 달성되었다. 간략하게, 상이한 길이의 비오틴-PEG-말레이미드 링커와 pMHC를 밤새 인큐베이션한 다음, 12 내지 14 kD 분자량 컷-오프 막을 통해 광범위하게 투석하여 유리의 비오틴-PEG-말레이미드를 제거하였다. 생성된 혼합물을 모노 Q 칼럼 상의 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여(도 10) ELISA를 통해 비오티닐화된 pMHC 분자를 함유하는 용출 분획을 확인하였다. [도 10]의 (1001)에서의 피크 UV 흡광도를 참조한다. 그런 후, 양성 분획을 변성 SDS-PAGE 겔에 분석하였다. [도 11]에 나타난 바와 같이, 분획 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 및 34는 최고 농도의 비오티닐화된 pMHC를 함유하였다. [도 12]에 나타난 바와 같이, MHC 알파 사슬의 웨스턴 블롯팅은 분획 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 및 34가 비오티닐화된 MHC 이종이량체를 포함함을 입증하였다. 그런 후, 이들 분획에 함유된 pMHC 분자에 완충액을 교환하고 형광 색소 접합된 스트렙타비딘을 사용하여 pMHC 사량체를 생성하는데 사용하였다. 그런 후, 이러한 pMHC 사량체를 유동 세포 분석법을 사용하여 BDC2.5 T 세포 수용체 트랜스제닉 CD4+ T 세포에 결합하는 능력에 대해 시험하였다(도 13).
다양한 길이의 PEG를 사용한 초기 실험은 성공적이지 못했다. 놀랍게도, 단지 2개의 PEG 단위만을 함유하는 저분자량 비오틴-PEG-말레이미드를 사용하는 실험은 성공적인 결과를 가져왔으며, 이는 심지어 소량의 유리된 비접합된 비오틴-PEG-말레이미드 분자가 존재해도 사량체 형성을 방해하기에 충분하다는 것을 시사한다.
실시예 7. 열 분해에 의한 페길화된 Fe( PFM ) 나노입자(NP)의 합성.
합성을 위한 재료로는 철(Ⅲ) 아세틸아세토네이트{Fe(acac)3, Fe(C5H7O2)3}, M.W. 353.17(Sigma-Aldrich, Cat# 517003-50G); 벤질 에테르{(C6H5CH2)2O}, M.W. 198.26(Sigma-Aldrich, Cat# 108014-1KG); 헥산, CH3(CH2)4CH3 , M. W. 86.18(Sigma-Aldrich, Cat# 34859-1L); FeCl3.6H2O, M.W. 270.3(Sigma-Aldrich, Cat# 44944-50G); mPEG2000-말레이미드(JenKem Tech USA, Cat# A3214-10);
반구형 패브릭 가열 맨틀(Hemispherical Fabric Heating Mantle), 50 mL(Safety Emporium, lab and safety supplies, Item#: 20310); 디지트릴(DigiTril) II 전력 제어 장치(Safety Emporium, lab and safety supplies, Item#: 20010); 50 mL 둥근 바닥 비등 플라스크(VWR, Cat# 89091-464, 24/40 조인트); 나선형 응축기(VWR, Cat# 89053-932, 24/40 조인트); 스윙 로터가 구비된 데스크 탑 원심 분리기(Beckman Coulter, 알레그라(Allegra) 25R 원심분리기); SS5 로터가 구비된 고속 원심분리기(Sorvall RC-6 Plus, Thermo Scientific); SS6 로터에 대한 어댑터가 구비된 30 mL 유리 원심분리 튜브(Corex, No 8445); LS 칼럼 및 자석(Miltenyi Biotech, Cat# 130-042-041); 투과 전자 현미경(H7650, Hitachi); 써모믹서(THERMOMIXER)®(Eppendorf, 24웰); 분광 광도계(UV-2550, SHIMADZU); 및 분광 광도계용 마이크로큐벳(100 ㎕)이 포함되었다.
반응 프로토콜:
50 mL의 비등 플라스크를 교반 플레이트 상 가열 맨틀 상에 놓았다. 가열 맨틀을 디지트릴 II 전력 제어 장치에 연결한다. PEG2000-말레이미드(1.5g)를 비등 플라스크에 넣는다. 온도를 80℃로 설정하고 PEG 재료가 완전히 녹을 때까지 PEG 재료를 가열한다. 벤질 에테르(3.5 mL) 및 Fe(acac)3(353 mg)을 비등 플라스크에 교반하면서 넣는다. 혼합물을 110℃에서 1시간 동안 탈수시킨다. 나선형 응축기를 비등 플라스크에 부착한다. 혼합물을 260℃로 가열한다. 혼합물의 색이 진한 갈색에서 검은색으로 변한다. 혼합물의 온도를 환류시키면서 260℃에서 2시간 동안 유지시킨 후, 혼합물을 실온으로 서서히 냉각시킨다. 내독소가 없는 물(20 mL)을 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 한 개의 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 2분 동안 격렬히 볼텍싱한다. 혼합물을 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 4,000 rpm에서 20분간 원심 분리한다. 펠렛을 버린다. 헥산(15 mL)을 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 2분 동안 격렬하게 볼텍싱한다. 혼합물을 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 4,000 rpm에서 10분간 원심분리한다. 각 튜브로부터의 검은색 수성 분획(아래 분획)을 수집하고 50 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다. 헥산 세척을 3회 반복한다. 검은색 용액을 2개의 30 mL 유리 원심 분리 튜브로 옮긴다. 각 튜브를 고속 원심 분리기를 사용하여 20,000 rpm에서 20분간 원심 분리한다. 검은색 용액을 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 펠릿을 버린다. 검은색 용액을 LS 칼럼을 사용하여 정제한다(예를 들어, 검은색 용액(2 내지 3 mL)을 정제를 위해 로딩하고, 용액을 칼럼을 통해 배출시키고, 칼럼을 물 5 mL로 3회 세척함). LS 칼럼에 보유된 NP를 깨끗한 50 mL 원뿔형 튜브로 밀어 넣어 정제된 PFM NP를 수집한다. PFM NP 용액을 0.45 μm, 0.2 μm 및 0.1 μm 공극 크기의 일련의 주사기 필터 장치를 통과시켜 멸균한다.
생성물의 특징규명:
1. 입자 크기 및 단분산:
1a. 개별 PFM NP의 산화철 코어 크기: 투과 전자 현미경( TEM : Transmission Electron microscopy) 분석.
TEM 분석을 위한 샘플 제조: PFM NP 용액(20 ㎕)을 물(40 ㎕)에 희석하고, 희석된 PFM NP(10 ㎕) 용액을 폴리비닐 포름바르(formvar)(Electron Microscopy Sciences, 카탈로그 # FF300-Cu) 또는 탄소 필름(Electron Microscopy Sciences, 카탈로그 # CF300-Cu)으로 피복된 구리 그리드의 표면에 적하한다. 잔류 용액을 여과지로 제거한다.
TEM 분석은 H7650(Hitachi)을 사용하여 10,000 X 내지 40,000 X 사이의 배율로 수행한다. 30 내지 50 PFM NP의 크기를 측정하여 평균 크기를 얻는다(평균 PFM NP 코어 크기는 18 내지 20 nm 사이로 예상됨) .
1b. PFM NP의 유체 역학 크기:
동적 광산란(DLS: Dynamic Light Scattering) 분석.
PFM NP 용액(20 ㎕)을 DLS 큐벳에서 물 1 mL에 희석하고, 용액 중의 PFM NP의 DLS 크기를 결정하기 위해 제타 나노사이저 유닛(Zeta NanoSizer unit)(Melvern, UK)을 사용하여 검사한다. ~ 45 내지 50 nm의 단일 피크가 예상된다.
2. Fe 농도(분광 측정 분석):
2a. Fe 농도 표준:
FeCl3.6H2O(48.3mg)를 탈이온수(5mL)에 용해시켜 2 mg Fe/mL 표준 용액을 제조한다. 표준 용액(20 ㎕)을 마이크로튜브 1에서 6N HCl(400 ㎕)에 첨가한다. 마이크로튜브 1에서 희석된 표준 용액(200 ㎕)을 200 ㎕의 6 N HCl이 들어있는 마이크로튜브 2에 옮긴다. 마이크로튜브 2에서 희석된 표준 용액(200 ㎕)을 6N HCl(200 ㎕)이 들어있는 마이크로튜브 3으로 옮긴다. 희석을 4회 더 반복한다.
2b. 샘플 용액:
PFM NP 용액(20 ㎕)을 마이크로튜브 S1에서 6N HCl(400 ㎕)에 첨가하고 혼합한다. 마이크로튜브 S1에서 희석된 PFM NP 용액(200 ㎕)을 6N HCl(200 ㎕)이 들어있는 마이크로튜브 S2로 옮긴다. 마이크로튜브 S2에서 희석된 PFM NP 용액(200 ㎕)을 6N HCl(200 ㎕)이 들어있는 마이크로튜브 S3으로 옮긴다. PFM NP 용액의 희석을 3회 더 반복한다.
2c. 샘플 가열:
연속 희석된 Fe 표준 및 PFM NP 용액이 들어있는 마이크로튜브를 60℃로 30분 동안 가열한 후, 실온으로 냉각시킨다.
2d. 분광 측정법:
A410(λ= 410nm)에서의 Fe 표준 및 PFM NP 용액의 흡광도를 마이크로큐벳(100㎕)이 구비된 분광 광도계를 사용하여 측정한다.
2e. 계산:
표준 곡선을 플롯팅하였다. PFM NP 용액의 Fe 농도를 계산한다.
3. 표면 전하 및 화학
3a. PFM NP의 표면 전하: 제타 전위의 측정.
PFM NP 용액(100 ㎕)을 모세관 셀에서 탈이온수(1 mL)로 희석한다. PFM NP의 제타 전위는 제타 나노사이저 유닛(Melvern, UK)을 사용하여 결정한다.
3b. 작용기를 노출하는 표면의 분석: 푸리에 변환 적외선(FT-IR: Fourier Transforms Infrared) 분광법 분석.
대조군 샘플: mPEG-Mal 샘플을 ATR(Attenuated Total Reflection: 감쇠 전반사) 플레이트 상에 놓는다.
PFM NP 샘플: PFM NP 용액(10 ㎕)을 ATR 플레이트 상에 적하하고 공기 건조한다.
FT-IR 분석: 니콜렛(Nicolet) FT-IR 분광 광도계에 의해 ATR(감쇠 전반사) 모드에서 대조군 PEG 및 PFM-NP 표면에 고정된 PEG의 FT-IR 스펙트럼을 생성한다. 각 스펙트럼은 4 cm-1 스펙트럼 해상도에서 평균 256 스캔으로 기록한다.
실시예 8. pMHC -나노입자 접합체( pMHC - PFM )의 제조.
합성을 위한 재료로는 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2 내지 7.4; 200 mM 인산 완충액, pH 6.2; PBS 중의 pMHC-Cys 단백질(1 내지 6 mg/mL, 분자 공학을 통해 하나의 시스테인 잔기가 pMHC 알파 사슬의 C-말단에 첨가됨); 1 M 염화나트륨 용액; 0.5 M EDTA 용액, pH 8.0; PFM NP 용액(1 내지 3 mg Fe/mL); LS 칼럼 및 자석(Miltenyi Biotech, Cat # 130-042-041); 투과 전자 현미경(H7650, Hitachi); 써모믹서®(Eppendorf, 24웰); 분광 광도계(UV-2550, SHIMADZU); 및 분광 광도계(100 ㎕)용 마이크로큐벳이 포함되었다.
접합 반응 프로토콜:
pMHC-cys 단백질(M.W. ~55 KD) 및 PFM NP(18 내지 20 nm, 약 1 X 1014 NP/mg Fe)를 150 mM NaCl 및 2 mM EDTA을 함유하는 40 mM 인산 완충액(pH 6.2)에서 100:1의 몰 비로 혼합한다. 반응 용액의 총 부피(1 내지 5 mg Fe에 해당하는 PFM NP를 포함함)는 10 mL이다. pMHC 단백질과 PFM-NP 둘 모두에 대해 40 내지 50%의 회수율이 기대된다. 인산 완충액, pH 6.2(2.0 mL)를 15 mL 원뿔형 튜브에 넣는다. 0.5 M EDTA 용액(0.04 mL)을 첨가하고, 1M 염화나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도를 150 mM로 조정한다. 물을 첨가하여 단백질 및 PFM NP 용액의 부피를 포함하여 최종 반응 부피를 10 mL까지로 만든다. pMHC 단백질(3 mg)을 첨가한다. 반응물을 실온에서 서서히 진탕하면서 밤새 인큐베이션한다. 반응 용액을 50 mL 원뿔형 튜브에 옮기고 PBS(30 mL)를 첨가한다. 반응 용액을 온화한 진탕 조건하에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 반응 용액을 LS 칼럼을 사용하여 정제한다(예를 들어, 반응 용액(5 mL)을 정제를 위해 로딩하고, 용액을 칼럼을 통해 배출시키고, 칼럼을 5 mL PBS로 3회 세척함). LS 칼럼에 보유된 NP를 15 mL 원뿔형 튜브에 밀어 넣어 정제된 PFM NP를 수집한다. 정제된 pMHC-PFM NP 용액을 0.45 μm 공극 크기의 주사기 필터 장치를 통과시켜 멸균한다. pMHC-PFM NP 용액은 4℃에서 보관한다.
생성물:
PBS 중 ~50 pMHC/NP의 pMHC 원자가를 갖는 pMHC-PFM NP, pH 7.4.
실시예 9. 비오틴-PEG- 말레이미드로 pMHC 단량체의 비오티닐화
비오티닐화 반응
단백질(꼬리에 유리 시스테인을 갖는 II형 pMHC)(5.0mg)을 2 mM EDTA를 포함한 pH 6.2의 40 mM 인산 완충액(2.0 mL)에 용해시킨다. PBS(190 ㎕)를 EZ-링크 말레이미드-PEG2-비오틴(2.0 mg)(Thermo Scientific: 카탈로그 # 21902BID, 품목: EZ-Link® Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh™ Format, 8 x 2 mg)에 첨가하여 20 mM 저장 용액(매번 새로 제조함)을 만든다. 저장 용액(78.12 ㎕)을 단백질 용액에 신속히 첨가하였다(이것은 Mal-PEG2- 비오틴을 단백질에 비해 20배의 몰 과량으로 제공함). 빛으로부터 보호하기 위해 반응 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 온화한 진탕 조건하에서 실온에서 밤새 인큐베이션한다. 10KD 아미콘(amicon) 초원심 분리(Millipore: 카탈로그 # UFC801024) 장치를 사용하여 20 mM 트리스 pH 8.0으로 완충액 교환을 5회 이상 수행하여 과량의 Mal-PEG2-비오틴을 제거한다. 과량의 Mal-PEG2-비오틴을 확실히 제거하기 위해 단백질 용액을 20 mM 트리스 pH 8.0에서 12 내지 14 KD 컷오프 막(Spectra/Por®: 카탈로그 # 132678)을 사용하여 밤새 투석한다(과량의 Mal-PEG2-비오틴의 오염은 정제 및 비오틴 특이적 스크리닝 ELISA를 방해할 수 있음). 모노 Q 정제를 위해 단백질 샘플을 수집한다.
정제 - 모노-Q IEX 크로마토그래피
라인 A를 완충액 A[20mM 트리스 pH 8.0]에 넣고 라인 B를 완충액 B[20mM 트리스 + 400mM NaCl]에 넣는다. ddH2O(10 내지 20 mL)를 샘플 루프에 주입하고 ~ 0.5 mL를 제외한 전체를 수동으로 주입하여 샘플 루프를 플러시한다. 모노-Q 칼럼과 유량 제한 어댑터(FR902)를 FPLC에 부착한다. 칼럼을 완충액 A로 평형화한다. 단백질 비오티닐화 반응 혼합물의 부피를 20 mM 트리스 pH 8.0로 5 내지 10 mL로 증가시킨다. 혼합물을 수퍼 루프(super-loop)(INV-900)에 주사기로 주입한다. 샘플을 주입하여 칼럼에 결합시키고, 결합되지 않은 단백질을 세척해내고, 결합된 단백질을 완충액 B의 구배로 용출시킨다. 크로마토그램 피크와 관련된 모든 용출 분획을 수집한다. 각각을 시행한 후 최소 2 mL의 2 M NaCl, 4 mL의 1 M NaOH 및 또 다시 2 mL의 2 M NaCl로 0.5 mL/min의 유속 세척으로 제조자의 프로토콜에 따라 칼럼을 세척한다. 기준선이 안정될 때까지 칼럼을 물로 세척한다(최소 2 mL). 필요에 따라 칼럼을 뒤집어 세정한다. 라인 A와 B를 20% 에탄올에 넣고, 보관을 위해 칼럼을 세척하기 위해서 펌프워시(PumpWash)를 수행한 후 플러시한다. 칼럼 및 유량 제한 장치를 제거하고 샘플 루프에서 잔류 단백질을 세정한다.
비오티닐화된 단량체의 확인을 위한 ELISA
ELISA 플레이트를 중복하여 PBS로 총 100 ㎕까지 수집된 각각의 용출 분획의 2 내지 20 ㎕(피크 강도에 따라)로 웰마다 코팅한다. 플레이트를 37℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션한다. 양성 대조군은 항 마우스 Kd-비오틴의 1:200 희석액이다. 음성 대조군은 PBS이다. 플레이트를 PBS 중 0.05% 트윈-20 150㎕으로 3회 세척한다. 차단 완충액(PBS 중 0.02% NaN3, 1% BSA) 중에 1:2000 희석액인 HRP-엑스트라비딘(HRP-Etravidin)(Sigma: 카탈로그 # E2886-1ML) 100 ㎕를 웰마다 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS 중 0.05% 트윈-20 150 ㎕로 3회 세척한다. 미리 가온시킨 TMB 기질(100 ㎕)을 웰마다 첨가하고, 플레이트를 어두운 곳에 실온에서 15 내지 30분(색 변화에 따라) 인큐베이션한다. 2 N H2SO4(50 ㎕)을 웰마다 첨가하여 반응을 정지시킨다. 플레이트를 OD450-570nm에서 평가한다. 음성 대조군은 OD450-570nm가 ~ 0.005이어야 한다. 양성 대조군은 OD450-570nm가 ~ 3이어야 하다. 우수한 양성 샘플은 OD450-570nm가 2 내지 3이다.
비오티닐화된 단량체의 확인을 위한 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯
모노-Q 정제의 각 분획(피크 강도에 따라 10-20 ㎕/웰)에 대해 SDS PAGE를 수행하여 원하는 밴드 형성 양상을 갖는 단백질 분획을 확인한다. 웨스턴 블롯 분석을 위해: 웰당 2 μg의 각 분획으로 또 다른 SDS PAGE를 수행한다. 이동(transfer) 완충액에 겔을 15분 동안 인큐베이션한다(이동 완충액: 25 mM 트리스, 190 mM 글리신, 20% 메탄올, pH 8.3). 이동 샌드위치를 만들어 18V의 정전압에서 15분 동안 이동시킨다. 막을 차단 완충액과 1시간 내지 하룻밤 인큐베이션한다(차단 완충액: pH 7.5의 150 mM 염화나트륨을 함유하는 20 mM 트리스 완충액 중 3% BSA). 막을 HRP-엑스트라비딘(차단 완충액에 1:2000 희석됨)에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 막을 TBST로 5회 세척한다(TBST: 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20, pH 7.5). 화학 발광 기질(Thermo Scientific: 카탈로그 # 34087)을 첨가하여 이미지를 얻는다(알파 사슬 위치에서 단일 밴드가 예상됨).
비오티닐화된 단량체의 수집:
ELISA, SDS PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 따라, 원하는 분획을 모으고, 10KD 아미콘 초원심 분리 장치를 사용하여 PBS로의 완충액 교환을 수행한다. 비오티닐화된 단량체의 농도는 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하고 명확한 라벨이 있는 여러 개의 튜브로 분액한다.
아마도 과량으로 존재하는 유리의 비접합된 비오틴-PEG-말레이미드 분자가 적절하게 제거되지 않아서 사량체 형성을 방해할 수 있었기 때문에, 동족 CD4+ T 세포를 염색하는데 스트렙타빈-PE를 사용하여 pMHC 사량체를 제조한다. 재료는 -80℃에서 보관하다.
실시예 10. Cys - 트래핑된 류신 지퍼 미포함 놉-인-홀 pMHC 이종이량체는 pMHC 이종이량체를 안정화시킨다
놉-인-홀 구조는 일부 펩티드 MHC II형 이종이량체를 위해 충분하다. 그러나 일부 이종이량체는 추가 안정화를 필요로 한다. [도 14A]의 FPLC (1401) 프로파일에서 용출 피크가 없는 것과 [도 14C]에 나타난 용출된 분획의 SDS-PAGE 겔에 나타난 바와 같이 IGRP13 -25 폴리펩티드와의 복합체 내 HLA DR3 이종이량체는 놉-인-홀로 구성되고 류신 지퍼가 없을 때 발현되지 않았다. IGRP 폴리펩티드를 홀-베타 도메인(서열 번호 61)에 연결하는 스페이서 사이 IGRP13 -25의 C-말단에서 시스테인이 도입되고 놉-알파 도메인(서열 번호 60)과 함께 발현되었을 때, 안정한 이종이량체가 형성될 수 있었다. [도 14B]의 용출 피크 (1402) 및 [도 14D]의 SDS-PAGE를 참조한다.
실시예 11. IGRP 13 -25 /DR3 pMHC 이종이량체는 동족 TCR을 발현하는 세포주에 결합한다
다음으로, cys-트랩핑된, 지퍼 미포함, 놉-인-홀 IGRP13-25 pMHC-DR3 이종이량체가 T 세포 수용체에 결합하는 능력을 시험하였다. 이를 위해, IGRP13 -25 pMHC-DR3에 특이적인 인간 T 세포 수용체로부터의 알파 및 베타 사슬을 발현하는 리포터 세포주를 사용하였다.
IGRP - TCR을 코딩하는 레트로바이러스로 JURMA - hCD4 세포주의 형질도입 프로토콜
GP+EnvAM12 패키징 세포주의 생성. 본 발명자들은 gag/pol 및 VSV 패키징 구조물과 함께 IGRP-TCR 및 GFP 리포터를 발현하는 레트로 바이러스로 293T 세포를 형질감염시켰다. VSV-위형(pseudotyped)의 농축 상등액을 수거하고 3일 후에 분액하여 동결시켰다. 이들 분액을 사용하여 회전 감염(2700 rpm 1시간)에 의해 앰포트로픽(amphotrophic) 패키징 세포주 GP+envAm12(ATCC CRL-9641)를 형질도입시켰다. 5회 스핀 감염 후, 형질도입된 GP + envAm12를 필요한 경우 GFP의 발현에 대해 분류하였다.
IGRP - TCR을 코딩하는 레트로바이러스로 JURMA - hCD4 세포주의 형질도입
형질도입되고 분류된 3백만개의 GP+envAm12를 3 ㎖의 최종 부피로 6 웰 플레이트의 웰마다 플레이팅하였다. 다음날, 100,000개의 JURMA-hCD4를 8㎍/ml의 폴리브렌이 보충된 3ml의 최종 부피로 사전-플레이팅된 형질도입된 GP+envAm12와 함께 배양하였다. 이 공동 배양을 2 또는 3일 마다 배지를 교환하면서 2주 동안 유지시켰다. 공동 배양 후, JURMA-hCD4 세포를 수거하고 유동 세포 분석법에 의해 분석하고 높은 전이유전자 발현에 대해 분류하였다. 이어서, 세포를 PE 표지된 이종이량체로 염색하였다. [도 15A]는 음성 대조군으로서 염색되지 않은 세포를 나타내고, [도 15D]는 무관한 사량체로 염색된 세포를 나타낸다. [도 15B]는 cys-트랩 및 류신 지퍼 기술을 사용하여 발현된 이종이량체로 제조된 사량체를 이용한 염색을 나타낸다. [도 15C]는 류신 지퍼 없이 cyc, 트랩 및 놉-인-홀 기술을 사용하여 발현된 이종이량체로 제조된 사량체를 나타낸다. 어느 한 기술을 사용하여 제조된 이종이량체 사이의 염색은 확실하였다. 이 데이터는 지퍼 미포함 cys-트래핑된 놉-인-홀 기술을 사용하여 제조된 이종이량체가 T 세포 수용체에 결합할 수 있음을 보여준다.
실시예 12. IGRP 13 -25 /DR3 놉-인-홀 pMHC 이종이량체는 시험관 내에서 리포터 세포주를 자극한다
cys-트래핑된, 놉-인-홀 안정화된 이종이량체가 산화철 나노입자에 부착될 때 T 세포 신호전달을 자극하는 능력을 NFAT 프로모터의 조절하에 인간 IGRP13 -25 TCR 및 루시퍼라제를 발현하는 Jurma 세포를 사용하여 시험하였다. [도 16A] 및 [도 16B]에 나타낸 이 결과는 cys-트래핑된, 놉-인-홀 안정화된 이종이량체가 산화철 나노입자에 부착될 때 T 세포 신호 전달을 유도할 수 있음을 나타낸다.
특정 실시양태가 예시되고 설명되었지만, 하기의 청구 범위에서 정의된 바와 같이 더 넓은 양태에서의 기술로부터 벗어나지 않고 당해 기술 분야의 통상의 기술에 따라 그 안에서 변경 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 예시적으로 설명된 실시양태는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들이 없이 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "포함하는 또는 함유하는(comprising, including, containing)" 등의 용어는 광범위하게 제한 없이 해석될 것이다. 또한, 본원에서 사용된 용어 및 표현은 제한의 용어가 아닌 설명의 용어로서 사용되었으며, 보여주고 설명한 특징 또는 그 일부의 등가물을 배제하는 이러한 용어 및 표현을 사용하고자 하는 의도는 없지만, 청구된 기술의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식해야 한다. 또한, "본질적으로 이루어진"이라는 문구는 구체적으로 나열된 요소 및 청구된 기술의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소를 포함하는 것으로 이해될 것이다. "~로 이루어진"이라는 문구는 명시된 않은 요소를 배제한다.
본 발명은 본 출원에 기재된 특정 실시양태의 측면에서 제한되지 않는다. 당업자에게 명백하듯이, 많은 변형 및 변화가 그 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다. 본 발명에 열거된 것 이외에, 본 발명의 범위 내에 있는 기능적으로 동등한 방법 및 조성물은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구 범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 발명은 청구 범위가 부여되는 등가물의 전체 범위와 함께 첨부된 청구 범위의 조건에 의해서만 제한된다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양태는 마쿠시 군의 측면에서 기술되는 경우, 당업자는 본 발명이 이로써 마쿠시 군의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 측면에서 기술됨을 인식할 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 모든 목적을 위해, 특히 서술된 설명을 제공하는 측면에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 가능한 모든 하위 범위 및 이들의 하위 범위의 조합을 포함한다. 열거된 임의의 범위는 동일한 범위가 적어도 동일한 2분의 1, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 나뉠 수 있다는 것을 충분히 설명하고 이를 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에서 논의된 각각의 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1 등으로 쉽게 나뉠 수 있다. 당업자가 역시 이해하는 바와 같이, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 용어는 나열된 수를 포함하고 상기에 논의된 바와 같이 하위 범위로 계속하여 나뉠 수 있는 범위를 의미한다. 마지막으로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다.
본 명세서에 언급한 모든 간행물, 특허 출원, 발행된 특허, 및 기타 문헌은 각각의 개별 간행물, 특허 출원, 발행된 특허, 또는 기타 문헌이 그 전문으로 참조로 포함되도록 구체적으로 개별적으로 명시된 것처럼 본원에 참고로 포함된다. 참고로 인용된 본문에 포함된 정의는 본 발명에서의 정의와 모순되는 정도까지 배제된다.
다른 실시양태는 하기의 청구 범위에 설명된다.
SEQUENCE LISTING <110> UTI LIMITED PARTNERSHIP <120> RECOMBINANT PMHC CLASS II MOLECULES <130> 42363-711.601 <140> <141> <150> 62/419,947 <151> 2016-11-09 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 atgggttctc tgcaaccgct ggccaccttg tacctgctgg gtatgctggt cgctagcagc 60 ctcggacagc acctgcagaa ggactacaga gcctactaca ccttcggagg tggaggcggc 120 tcaggaggtg gaagcggcgg ctctggggac acccgaccac gtttcttgga gtactctacg 180 tctgagtgtc atttcttcaa tgggacggag cgggtgcggt acctggacag atacttccat 240 aaccaggagg agaacgtgcg cttcgacagc gacgtggggg agttccgggc ggtgacggag 300 ctggggcggc ctgatgccga gtactggaac agccagaagg acctcctgga gcagaagcgg 360 ggccgggtgg acaactactg cagacacaac tacggggttg tggagagctt cacagtgcag 420 cggcgagtcc atcctaaggt gactgtgtat ccttcaaaga cccagcccct gcagcaccat 480 aacctcctgg tctgttctgt gagtggtttc tatccaggca gcattgaagt caggtggttc 540 cggaatggcc aggaagagaa 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gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc 1440 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1500 catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctcc cggcggctcc 1560 ggagccacga acttctctct gttaaagcaa gcaggagacg tggaagaaaa ccccggtccc 1620 atggctatca tctacctcat cctcctgttc accgctgtgc ggggcatcaa agaagaacat 1680 gtgatcatcc aggccgagtt ctatctgaat cctgaccaat caggcgagtt tatgtttgac 1740 tttgatggtg atgagatttt ccatgtggat atggcaaaga aggagacggt ctggcggctt 1800 gaagaatttg gacgatttgc cagctttgag gctcaaggtg cattggccaa catagctgtg 1860 gacaaagcca acctggaaat catgacaaag cgctccaact atactccgat caccaatgta 1920 cctccagagg taactgtgct cacaaacagc cctgtggaac tgagagagcc caacgtcctc 1980 atctgtttca tagacaagtt caccccacca gtggtcaatg tcacgtggct tcgaaatgga 2040 aaacctgtca ccacaggagt gtcagagaca gtcttcctgc ccagggaaga ccaccttttc 2100 cgcaagttcc actatctccc cttcctgccc tcaactgagg acgtttacga ctgcagggtg 2160 gagcactggg gcttggatga gcctcttctc aagcactggg agtttgatgc tccaagccct 2220 ctcccagaga ctacagagtc cggaggcgga ggcggactga cagatacact ccaagcggag 2280 acagatcaac ttgaagacga gaagtctgcg ttgcagaccg agattgccaa tctactgaaa 2340 gagaaggaaa aactggagtt tattttggca gcccacgaca aaactcacac atgcccaccg 2400 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 2460 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 2520 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 2580 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 2640 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aagtctccaa caaagccctc 2700 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 2760 tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg 2820 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 2880 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 2940 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 3000 catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctcc gggcggtagt 3060 ggtagtggta gtggatctct gggtggtatc 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taatgccaag 2340 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 2400 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aagtctccaa caaagccctc 2460 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 2520 tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg 2580 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 2640 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 2700 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 2760 catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctcc gggcggtagt 2820 ggtagtggta gtggatctct gggtggtatc ttcgaggcta tgaagatgga gctgcgcgat 2880 caccatcacc atcaccataa ctggagccac cctcagttcg agaagtgttg a 2931 <210> 3 <211> 3168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3 atggctatca tctacctcat cctcctgttc accgctgtgc ggggcagatc tgcccaccat 60 cccatctggg cccgaatgga cgccggaggt ggaggctcac tagtgccccg 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gagtttggcc aattgatact ctttgagccc caaggtggac tgcaaaacat agctgcagaa 1860 aaacacaact tgggaatctt gactaagagg tcaaatttca ccccagctac caatgaggct 1920 cctcaagcga ctgtgttccc caagtcccct gtgctgctgg gtcagcccaa cacccttatc 1980 tgctttgtgg acaacatctt cccacctgtg atcaacatca catggctcag aaatagcaag 2040 tcagtcacag acggcgttta tgagaccagc ttcctcgtca accgtgacca ttccttccac 2100 aagctgtctt atctcacctt catcccttct gatgatgaca tttatgactg caaggtggag 2160 cactggggcc tggaggagcc ggttctgaaa cactgggaac ctgagattcc agcccccatg 2220 tcagagctga cagagtccgg aggcggaggc ggactgacag atacactcca agcggagaca 2280 gatcaacttg aagacgagaa gtctgcgttg cagaccgaga ttgccaatct actgaaagag 2340 aaggaaaaac tggagtttat tttggcagcc cacgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 2400 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 2460 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 2520 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 2580 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2640 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2700 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2760 accctgcccc catgccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc 2820 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2880 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2940 ctcaccgtgg acaagagtag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 3000 gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctccggg cggtagtggt 3060 agtggtagtg gatctctggg tggtatcttc gaggctatga agatggagct gcgcgatcac 3120 catcaccatc accataactg gagccaccct cagttcgaga agtgttga 3168 <210> 4 <211> 2928 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4 atggctatca tctacctcat cctcctgttc accgctgtgc ggggcagatc tgcccaccat 60 cccatctggg cccgaatgga cgccggaggt ggaggctcac tagtgccccg aggctctgga 120 ggtggaggct ctggagactc cgaaaggcat ttcgtgcacc agttcaaggg cgagtgctac 180 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tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agtaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1260 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320 ccgggcggta gtggtagttg ttga 1344 <210> 65 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 65 atgggttctc tgcaaccgct ggccaccttg tacctgctgg gtatgctggt cgctagcagc 60 ctcggacagc acctgcagaa ggactacaga gcctactaca cctgtggagg tggaggcggc 120 tcaggaggtg gaagcggcgg ctctggggac acccgaccac gtttcttgga gtactctacg 180 tctgagtgtc atttcttcaa tgggacggag cgggtgcggt acctggacag atacttccat 240 aaccaggagg agaacgtgcg cttcgacagc gacgtggggg agttccgggc ggtgacggag 300 ctggggcggc ctgatgccga gtactggaac agccagaagg acctcctgga gcagaagcgg 360 ggccgggtgg acaactactg cagacacaac tacggggttg tggagagctt cacagtgcag 420 cggcgagtcc atcctaaggt gactgtgtat ccttcaaaga cccagcccct gcagcaccat 480 aacctcctgg tctgttctgt gagtggtttc tatccaggca gcattgaagt caggtggttc 540 cggaatggcc aggaagagaa gactggggtg gtgtccacag gcctgatcca caatggagac 600 tggaccttcc agaccctggt gatgctggaa acagttcctc ggagtggaga ggtttacacc 660 tgccaagtgg agcacccaag cgtgacaagc cctctcacag tggaatggag agcacggtct 720 gaatctgcac agagcaagtc cggaggcgga ggcggagaca aaactcacac atgcccaccg 780 tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 840 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 900 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 960 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1020 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aagtctccaa caaagccctc 1080 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1140 tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gagctgcgcg 1200 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1260 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc 1320 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1380 catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctcc cggctga 1437

Claims (42)

  1. 서열 번호 53 및 서열 번호 54에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드, 및
    서열 번호 51 및 서열 번호 52에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 제2 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이종이량체로서,
    제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동(cavity) 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하며;
    (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; 또는
    (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두는 류신 지퍼 또는 부위 특이적 비오티닐화 부위를 포함하지 않는 것인 단리된 이종이량체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 돌출부는 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 단리된 이종이량체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 단리된 이종이량체의 제1 또는 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하고, CH3 도메인은 S354C, T366W, 및 S354C와 T366W 둘 모두(EU 번호 매김)로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌출부를 포함하거나; 또는 CH3 도메인은 Y349C, T366S, L368A, Y407V(EU 번호 매김), 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 공동을 포함하는 것인 단리된 이종이량체.
  7. 제1항에 있어서, 공동은 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 이종이량체.
  8. 제1항 또는 제7항에 있어서, 공동은 알라닌, 세린, 트레오닌, 발린, 및 시스테인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 단리된 이종이량체.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항 또는 제3항에 있어서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두는 이종의 이량체화 도메인을 포함하지 않는 것인 단리된 이종이량체.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항 또는 제3항에 있어서, 자가면역 질환 관련 항원을 추가로 포함하는 단리된 이종이량체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 질환 관련 항원은 적어도 11개의 아미노산 길이의 폴리펩티드를 포함하는 것인 단리된 이종이량체.
  17. 제15항에 있어서, 자가면역 질환 관련 항원은 가요성 링커에 의해 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인에 연결되는 것인 단리된 이종이량체.
  18. 제15항에 있어서, 항원은, 항원성 펩티드와 회합된 시스테인 아미노산과 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 시스테인 아미노산 사이에 형성된 디설피드 결합에 의해 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인에 공유적으로 연결되는 것인 단리된 이종이량체.
  19. 제18항에 있어서, MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 시스테인 아미노산은 MHC II형 결합 홈(groove)의 일부를 형성하는 잔기의 10개 아미노산 이내에 존재하는 것인 단리된 이종이량체.
  20. 제19항에 있어서, MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 시스테인 잔기는 MHC II형 결합 홈의 일부를 형성하는 잔기의 3개 아미노산 이내에 존재하는 것인 단리된 이종이량체.
  21. 제18항에 있어서, MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 시스테인 아미노산은 MHC II형 α1 도메인 또는 MHC II형 β1 도메인의 자연 발생 서열에 도입되어 있는 것인 단리된 이종이량체.
  22. 제1항 또는 제3항의 단리된 이종이량체를 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
  23. 제1항 또는 제3항의 제1 또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  25. 제24항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 게놈에 안정적으로 통합되는 것인 숙주 세포.
  26. 제1항 또는 제3항에 있어서, 적어도 하나의 이종이량체가 나노입자에 접합되어 이종이량체-나노입자 접합체를 형성하고, 나노입자는 하기 특성 중 하나 또는 둘 모두를 만족하는 것인 단리된 이종 이량체:
    i) 나노입자는 비리포좀성(non-liposomal)임;
    ii) 나노입자는 고체 코어를 가짐.
  27. 제26항에 있어서, 고체 코어는 금, 철, 또는 산화철 코어인 단리된 이종이량체.
  28. 제26항에 있어서, 고체 코어는 1 나노미터 내지 100 나노미터 미만의 직경을 갖는 것인 단리된 이종이량체.
  29. 제26항에 있어서, 적어도 하나의 이종이량체는 나노입자에 공유적으로 결합되는 것인 단리된 이종이량체.
  30. 제29항에 있어서, 적어도 하나의 이종이량체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 링커를 통해 나노입자에 공유적으로 결합되는 것인 단리된 이종이량체.
  31. 제30항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 말레이미드로 작용기화된 것인 단리된 이종이량체.
  32. 삭제
  33. 제26항의 단리된 이종이량체, 및 약학적 부형제, 안정화제, 또는 희석제를 포함하는, 자가면역 질환 또는 염증성 병태의 치료를 필요로하는 개체에서 자가면역 질환 또는 염증성 병태를 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
  34. 삭제
  35. 서열 번호 53 및 서열 번호 54에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및
    서열 번호 51 및 서열 번호 52에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 제조 방법으로서,
    제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하고, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두는 류신 지퍼 또는 부위 특이적 비오티닐화 부위를 포함하지 않고;
    (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; 또는
    (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하며;
    (iii) 계면을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 제1 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 본래의 핵산 서열은 돌출부를 코딩하기 위해, 제1 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 본래의 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열이 본래의 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄 체적을 갖는 적어도 하나의 유입 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열로 대체되도록 변경되거나, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 본래의 핵산 서열은 공동을 코딩하기 위해, 제2 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 본래의 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열이 본래의 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 체적을 갖는 적어도 하나의 유입 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열로 대체되도록 변경되거나, 또는 두 경우 모두이며, 배양은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 발현되도록 하는 것인 단계; 및
    (iv) 숙주 세포 배양물로부터 이종이량체를 회수 및 정제하는 단계
    를 포함하는, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 제조 방법.
  36. 서열 번호 53 및 서열 번호 54에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및
    서열 번호 51 및 서열 번호 52에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 제조 방법으로서,
    제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 계면에서 만나고, 제1 폴리펩티드의 계면은 제2 폴리펩티드의 계면 내 조작된 공동 내에 위치 가능한 조작된 돌출부를 포함하고, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두는 류신 지퍼 또는 부위 특이적 비오티닐화 부위를 포함하지 않고;
    (i) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; 또는
    (ii) 제1 폴리펩티드는 MHC II형 β1 도메인, MHC II형 β2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 MHC II형 α1 도메인, MHC II형 α2 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하며;
    (iii) 제1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (iv) 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (v) 숙주 세포 배양물들로부터 제1 및 제2 폴리펩티드를 회수하는 단계; 및
    (vi) 제1 및 제2 폴리펩티드를 함께 인큐베이션하여 이종이량체를 형성하는 단계
    를 포함하고, 제1 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 본래의 핵산 서열은 돌출부를 코딩하기 위해, 제1 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 본래의 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열이 본래의 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄 체적을 갖는 적어도 하나의 유입 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열로 대체되도록 변경되거나, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 본래의 핵산 서열은 공동을 코딩하기 위해, 제2 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 본래의 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열이 본래의 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 체적을 갖는 적어도 하나의 유입 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열로 대체되도록 변경되거나, 또는 두 경우 모두인, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체의 제조 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 통합되는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포를 포함하는 것인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 제1 및 제2 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는 것인 방법.
  40. 제35항 또는 제36항에 있어서, 숙주 세포 배양물 또는 숙주 세포 배양물들로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계는 이종이량체를 포함하는 액체를 액체 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 액체 크로마토그래피 칼럼은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  42. 삭제
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