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KR102645449B1 - 레스베라트롤을 함유하는 나노입자 - Google Patents

레스베라트롤을 함유하는 나노입자 Download PDF

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KR102645449B1
KR102645449B1 KR1020210061889A KR20210061889A KR102645449B1 KR 102645449 B1 KR102645449 B1 KR 102645449B1 KR 1020210061889 A KR1020210061889 A KR 1020210061889A KR 20210061889 A KR20210061889 A KR 20210061889A KR 102645449 B1 KR102645449 B1 KR 102645449B1
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Abstract

본 발명은 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자 및 이의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자는 유효성분인 레스베라트롤을 다량 포함할 수 있을 뿐 아니라, 입자 크기가 작고 균일하며 약물전달 효율이 높은 것으로 알려진 탄산칼슘 결정 형태인 배터라이트 및 칼사이트를 다수 포함할 수 있다. 또한 상기 나노입자는 안정성이 높고, 유효성분인 레스베라트롤의 안정성, 세포 보호 및 항산화 효능, 피부흡수율 및 경피투과율을 높일 수 있고, 레스베라트롤이 높은 농도에서 나타내는 세포 독성을 낮추어 안전성을 높일 수 있으며, 레스베라트롤이 갖는 항염증 효과를 가지는 것으로 나타나, 고기능성 화장품 소재로서의 높은 유용하게 사용될 수 있다.

Description

레스베라트롤을 함유하는 나노입자 {NANOPARTICLES COMPRISING RESVERATROL}
본 발명은 레스베라트롤의 화장품 성분으로서의 유용성을 향상시킬 수 있는 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게, 상기 나노입자는 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자이다.
건강과 외모에 대한 사람들의 관심이 급증함에 따라 이를 만족시키기 위한 화장품 조성물을 찾기 위한 회사들의 노력이 급격히 증가하고 있다. 고기능성 화장품은 코스메슈티컬(Cosmeceutical)이라고도 표현되는데, 이는 화장품(Cosmetics)과 의약품 (Pharmaceutical)을 합성한 신조어로 기존 화장품에 피부치료의 개념을 접목한 ‘피부의약품’을 의미한다. 최근에는 다양한 천연활성물질을 활용한 항노화 복합기능(주름개선, 미백) 및 탈모방지/발모촉진, 아토피 치료 등에 효과가 있는 성분들이 지속적으로 개발되고 있으나 아직은 피부 투과율이 낮아 성능을 제대로 발현하지 못하고 있다. 특히, 기존의 경피 흡수 촉진법은 피부 장벽 때문에 천연활성물질이 피부 속으로 전달되지 않아 이를 극복할 수 있는 새로운 화장품 소재 개발이 시급한 상황이다.
고기능성 나노화장품이란 나노사이즈의 크기를 갖는 나노바이오입자 또는 나노바이오구조체를 함유한 화장품으로, 나노바이오입자를 활용하여 활성물질을 담지하고 피부에 흡수시켜 피부재생 및 기능을 향상시키거나 또는 피부에 도포하여 자외선, 적외선, 미세먼지 등 외부의 유해광선이나 물질을 차단하는 등 피부의 보습, 향상성을 유지해주는 특별한 화장품을 말한다. 나노화된 물질을 이용하면 크기만 다른 동일 물질을 함유한 제품에 비해 질감(texture), 내오염성, 미학, 안정성, 자외선 차단 등에서 강점을 가지는 것으로 알려져 있다.
고기능성 화장품의 기술개발 초반에는 높은 기능성과 생체 안전성을 갖고 있는 활성물질을 적용한 바이오 화장품 개발이 일반적이었으나, 최근에는 나노기술을 적용한 고기능성 나노화장품이 시장을 선도하고 있다.
현재 기능성화장품을 포함한 코스메슈티컬 대부분의 제품들은 효능효과를 표시할 수 있으나, 유효성분이 대부분 피부 각질층 통과를 하지 못해 체감효능이 떨어지며 안전성에 대한 제어 기술이 부족하여 소비자 불만이 크다. 또한 대부분의 유효성분은 난용성으로, 나노크기의 리포좀(Liposome) 등의 기술을 통해 안정성 및 피부흡수율을 개선하고 있으나 충분하지 못하며, 합성에 의한 안정화물질은 효과를 충분히 구현하지 못하다.
따라서, 실제 화장품 유효성분의 전달성을 높이는 기술개발이 시급하며, 피부흡수율은 높이고 안정성이 높은 고기능성 나노바이오소재 화장품 기술개발이 무엇보다 필요한 실정이다.
한편, 레스베라트롤(Resveratrol)은 최근 가장 주목받는 페놀화합물의 한 종류로, 포도껍질에 다량 존재한다. 레스베라트롤은 강력한 항균성, 항바이러스성, 항산화 효능, 항혈전 및 항염증 작용 등 다양한 생리적 및 약리적 작용을 나타낸다. 이에 따라 심혈관계 보호 효능 및 암 예방, 항암 활성에 도움이 되는 것으로 확인되어 암 예방제로서 가능성이 증명되고 있으며, 식품이나 화장품의 성분으로도 각광받고 있다.
그러나 레스베라트롤은 난용성 성분으로 음료 등의 수용성 가공에 극히 제한적으로 사용되고 있고, 구조적인 불안정성으로 인해 빛, 열, 산소 등에 노출 시 트랜스(trans) 형이 생활성이 낮은 시스(cis) 형으로 변하며, 대사가 빠르고 체내 반감기가 짧아 섭취 시 생체이용효율이 매우 낮으며, 고농도에서는 독성을 가진다는 문제점을 가지고 있다. 따라서, 레스베라트롤 산업을 확장하고 발전시키기 위해서는 레스베라트롤의 생체이용률을 증가시키고 안전성을 높일 수 있는 기술 개발이 절실히 요청되고 있는 실정이다.
본 발명의 발명자들은 화장품 성분으로서의 레스베라트롤의 유용성을 높이기 위한 연구를 진행하였으며, 이를 통해 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 2020년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 지자체-대학 협력기반 지역혁신 사업의 결과임을 밝힌다.
등록특허공보 제10-2029685호(2019.10.10) 공개특허공보 제10-2019-0010212(2019.01.30)
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 화장품 성분으로서의 레스베라트롤의 유용성, 특히 특히, 경피투과성, 안정성 및 안전성을 높일 수 있는 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면은 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 나노입자는 직경이 10 nm 내지 150 nm이고, 다분산도 지수(polydispersity index)가 0.35 이하인 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 나노입자는 배터라이트(vaterite) 또는 칼사이트(calcite) 형태를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일측면은, 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 탄산칼슘의 전구체를 혼합하는 단계;를 포함하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자의 제조방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 혼합하는 단계는, 레스베라트롤을 유기용매에 혼합한 제1혼합물; 및 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 수계용매에 혼합한 제2혼합물;을 각각 준비한 후 제1혼합물 및 제2혼합물을 섞어 제조되는 것일 수 있다. 여기서, 상기 제1혼합물 내 레스베라트롤은 0.5 내지 10% 포함되는 것일 수 있다. 상기 제2혼합물 내 폴리비닐피롤리돈은 0.1 내지 10% 포함되고, 상기 제2혼합물 내 폴리아크릴산은 0.05 내지 5% 포함되는 것일 수 있다. 상기 제1혼합물과 제2혼합물의 비율(v/v)은 1:99 내지 20:80인 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산의 혼합물에 탄산칼슘의 전구체를 혼합하는 단계는, 상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산의 혼합물에 칼슘염 및 탄산염을 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면은, 상기 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 레스베라트롤을 0.1 μM 이상 포함하는 것일 수 있다.
발명의 일 구현예에 따른 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자는, 유효성분인 레스베라트롤을 다량 포함할 수 있을 뿐 아니라, 입자 크기가 작고 균일하며 약물전달 효율이 높은 것으로 알려진 탄산칼슘 결정 형태인 배터라이트 및 칼사이트를 다수 포함함을 확인하였다. 또한 상기 나노입자는 안정성이 높고, 유효성분인 레스베라트롤의 안정성, 세포 보호 및 항산화 효능, 피부흡수율 및 경피투과율을 높일 수 있고, 레스베라트롤이 높은 농도에서 나타내는 세포 독성을 낮추어 안전성을 높일 수 있으며, 레스베라트롤이 갖는 항염증 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 나노입자는 장기안정성이 우수하여 레스베라트롤의 산업적 이용에 유용할 뿐 아니라, 화장품 분야에서 레스베라트롤의 피부흡수율 및 경피투과율을 높이며 세포 독성을 낮추고 항산화, 세포보호 및 항염증 효능이 우수하여 피부재생, 피부탄력, 미백을 향상시킬 수 있는 성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 레스베라트롤 원액(a) 및 실시예 1에 따라 제조된 레스베라트롤(RSV)을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘(PVP-PAA-CaCO3) 나노입자(b)의 이미지이다.
도 2는 실시예1.1에 따른 나노입자 제조 시 PAA-CaCl2와 Na2CO3간 비율 조정에 따른 RSV의 PVP-PAA-CaCO3 나노입자 내 봉입율을 분석한 결과이다.
도 3은 레스베라트롤 단독(RSV), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 실시예1.1에 따라 제조된 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자 (도면 내 RSV-PAA,PVP로 표기)에 대한 FT-IR 비교분석(a) 및 PVP-PAA-CaCO3 나노입자 단독 FT-IR 분석(b)한 결과이다.
도 4는 실시예1.1에 따라 제조된 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 주사전자현미경(SEM) (a) 및 투과전자현미경(TEM) (b) 이미지(일부 입자 크기 표기)이다.
도 5는 실시예 1.1에 따라 제조된 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 엑스선결정학(XRD) 분석 결과이다.
도 6은 실시예 1.1에 따라 제조된 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 크기를 동적광산란법(Dynamic Light Scattering, DLS)으로 측정한 결과이다.
도 7은 레스베라트롤 단독(a) 및 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자(b)가 각각 농도별로 HaCaT 세포주의 세포생존에 미치는 영향을 비교분석한 결과이다.
도 8은 레스베라트롤 단독(a) 및 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자(b)가 각각 농도별로 NIH-3T3 세포주의 세포생존에 미치는 영향을 비교분석한 결과이다.
도 9는 HaCaT 및 NIH-3T3 세포주의 생존율에 농도별 Rose Bengal이 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 10은 HaCaT 및 NIH-3T3 세포주의 생존율에 IC50농도의 Rose Bengal을 처리 후 레스베라트롤을 단독으로 농도별 처리 시 영향을 분석한 결과이다.
도 11은 HaCaT 및 NIH-3T3 세포주의 생존율에 IC50농도의 Rose Bengal을 처리 후 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 농도별로 처리 시 영향을 분석한 결과이다.
도 12는 HaCaT 및 NIH-3T3 세포주의 생존율에 농도별 H2O2가 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 13은 HaCaT 및 NIH-3T3 세포주의 생존율에 IC50농도의 H2O2를 처리 후 레스베라트롤을 단독으로 농도별 처리 시 영향을 분석한 결과이다.
도 14는 HaCaT 및 NIH-3T3 세포주의 생존율에 IC50농도의 H2O2를 처리 후 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 농도별로 처리 시 영향을 분석한 결과이다.
도 15는 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 농도별 항산화능을 DPPH assay로 측정한 결과이다.
도 16은 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자가 LPS에 의해 유도된 COX-2 및 iNOS 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 17은 레스베라트롤 및 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 경피투과율을 HPLC로 분석한 결과이다.
본 발명의 일측면에 따른 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자는 레스베라트롤을 함유한다.
제약, 화장품 및 화학적 적용(예를 들어, 유전자 요법, 아로마 또는 약물 캡슐화)의 목적으로 약물이나 단백질, 펩티드 또는 핵산과 같은 불안정한 생물학적 물질을 안정화시키고 전달 가능한 소재의 제조에 대한 관심이 증가하고 있다. 이와 관련하여, 약물 전달체로서 탄산칼슘(calcium carbonate, CaCO3)은 템플릿으로서 생적합성이 높아 제조 및 복합화를 위해 많이 사용된다. 탄산칼슘 입자는 수십 나노미터에서 수 마이크로미터까지 다양한 크기를 가질 수 있다. 또한 입자화 혹은 표면 코팅을 통해서 구형 혹은 다각형 구조의 탄산칼슘 구조체가 형성될 수 있고, 탄산칼슘이 지니는 기공을 통해서 약물, 단백질, 효소 등의 다양한 물질을 봉입시킬 수 있다. 즉, 탄산칼슘은 물질의 활성성분을 보호하면서 안정화시킬 수 있어, 여러 약물은 물론 기능성 화장품의 유효물질로 활용되는 천연 생리활성 성분 등을 포함하는 합성체 또는 복합체를 위한 적용이 가능하다. 또한 탄산칼슘은 탄산칼슘 입자를 생성할 때 이용되는 다양한 물질, 예컨대 안정화제 등과 매우 쉽게 결합할 수 있고, 이러한 물질들을 조합하여 필요한 기능을 가지도록 화학적 및 물리적 성질들을 변화시킬 수 있다.
폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA)은 중합체로서 탄산칼슘 나노입자 생성 시 안정화제로 쓰일 수 있는 물질 중 하나이다. 이때, PAA는 결정의 형태에 큰 영향을 미칠 수 있는데, 저농도에서는 탄산칼슘 결정의 형태형성에 영향을 주지 못하며 고농도에서는 이산화탄소의 고정 및 탄산칼슘의 결정화를 억제한다는 것이 보고된 바 있다. PAA는 안정성과 생적합성이 높아 생체적용을 위한 나노입자에 사용하기 좋은 것으로 알려져 있다.
폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)은 크고(bulky) 독성이 낮으며 C=O, C-N 및 알킬기를 작용기로 가지는 비이온성 폴리머로, 나노입자의 제조시 안정화제로서 널리 쓰인다. PVP는 강력한 친수성 부분인 피롤리돈 모이어티와 약한 친유성기인 알킬기를 포함하는 등 양친매성을 띄며, 나노입자 생성 시 덩어리지는 현상(aggregation)을 방지하는 것으로 알려져 있다. 나노입자 생성 시 PVP의 길이는 해당 나노입자의 안정성 및 나노입자 내에 봉입되는 물질의 보호 효율과 관련이 있으며, PVP는 나노입자의 형태에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되었다. 특히, PVP는 넓은 pH 범위에서 물리화학적으로 비활성을 띄고 조직투과율을 높이는 등 생적합성 나노입자에 이용하기 좋은 특성을 가진다.
레스베라트롤(Resveratrol 또는 3,5,4′-trihydroxy-trans-stilbene)은 상기 나노입자의 유효성분으로서, 전술한 바와 같이 강력한 항산화, 항균, 항염증 및 미백 효능을 가져 피부의 노화를 방지하고 탄력을 유지하며 기미를 예방하는 등 피부미용에 유용한 화장품 성분으로서의 기능성이 높다. 다만, 레스베라트롤은 특히 난용성 및 안정성이 낮다는 점 등의 문제점에 의해 산업적 이용에 한계를 가진다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 레스베라트롤의 한계를 해결하기 위한 연구를 진행하였으며, 그 결과 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자가 상기 레스베라트롤의 안정성을 높일 뿐 아니라, 화장품 소재로서 추가적인 다양한 장점을 가질 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 상기 나노입자는 유효성분인 레스베라트롤을 다량 포함할 수 있을 뿐 아니라, 입자 크기가 작고 균일하며 약물전달 효율이 높은 것으로 알려진 탄산칼슘 결정 형태인 배터라이트 및 칼사이트를 다수 포함하였다. 상기 나노입자는 레스베라트롤이 갖는 항염증 효과를 가지고 피부흡수율 및 경피투과율을 높일 수 있으며, 특히, 예상치 못하게 유효성분인 레스베라트롤의 세포 보호 및 항산화 효능을 높일 수 있는 것으로 밝혀졌다.
일 구현예에서, 상기 나노입자는 직경이 10 nm 내지 150 nm이고, 다분산도 지수(polydispersity index)가 0.35 이하인 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 나노입자의 직경은 30 내지 100 nm, 더욱 바람직하게 35 내지 70 nm인 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 나노입자는 배터라이트(vaterite) 또는 칼사이트(calcite) 형태를 포함하는 것일 수 있다. 상기 나노입자 중 배터라이트와 칼사이트의 비율은 6:4 내지 9:1, 바람직하게 7:3 내지 8:2일 수 있다. 탄산칼슘 나노입자는 형태에 따라 칼사이트(calcite), 아라고나이트(aragonite) 및 배터라이트(vaterite)로 나뉜다. 칼사이트는 육면체 구조로 탄산칼슘 형태 중 가장 안정적이기 때문에 가장 흔히 볼 수 있다. 아라고나이트는 바늘모양이나 사방정계의 입자로서, 60-80 ℃ 이상의 높은 온도 조건이나 마그네슘 이온 존재 하에서 생성된다. 배터라이트는 구형의 입자로 칼사이트에 비해 준안정적인 형태이다. 일반적으로, 탄산칼슘이 생성되는 과정에서 비정질 탄산칼슘(amorphous calcium carbonate, ACC)이 먼저 생성되고, ACC의 용해 및 재결정화 과정을 통해 준안정적인 형태의 배터라이트가 생성된다. 또한 배터라이트의 용해 및 재결정화 과정을 통하여 안정적인 칼사이트가 생성된다. 배터라이트와 칼사이트는 아라고나이트에 비해 높은 비표면적, 높은 용해도, 높은 분산력 및 작은 비중을 가지는 탄산칼슘 나노입자로 아라고나이트보다 더 다양한 용도에 사용이 가능하다. 본 발명의 일 구현예에서, 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자는, 유효성분의 전달 측면에서 효율이 좋은 것으로 알려져 있는 이러한 배터라이트 또는 칼사이트를 다수 포함하고 있고, 그 중에서도 더 효율이 높은 배터라이트의 비중이 높은 것으로 나타났다.
본 명세서에서 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자, 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자 또는 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자, RSV-PAA,PVP 및 ‘상기 나노입자’는 모두 동일하게 본 발명의 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자를 지칭하는 것으로 사용된다.
본 발명의 다른 일측면에 따른 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자의 제조방법은, 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 탄산칼슘의 전구체를 혼합하는 단계;를 포함한다. 이때, 상기 폴리비닐피로리돈은 분자량이 1 내지 500 KDa인 것일 수 있고, 바람직하게 10 내지 100 KDa인 것일 수 있다. 상기 폴리아크릴산은 분자량이 0.5 내지 1000 KDa인 것일 수 있고, 바람직하게 1 내지 100 KDa인 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 혼합하는 단계는, 레스베라트롤을 유기용매에 혼합한 제1혼합물; 및 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 수계용매에 혼합한 제2혼합물;을 각각 준비한 후 제1혼합물 및 제2혼합물을 섞어 제조되는 것일 수 있다. 여기서, 상기 제1혼합물 내 레스베라트롤은 0.5 내지 10% 포함되는 것일 수 있다. 상기 제2혼합물 내 폴리비닐피롤리돈은 0.1 내지 10% 포함되고, 상기 제2혼합물 내 폴리아크릴산은 0.05 내지 5% 포함되는 것일 수 있다. 상기 제1혼합물과 제2혼합물의 비율(v/v)은 1:99 내지 20:80인 것일 수 있다.
상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산의 혼합물에 탄산칼슘의 전구체를 혼합하는 단계는, 상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산의 혼합물에 칼슘염 및 탄산염을 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 것; 또는 상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산의 혼합물에 칼슘염을 혼합한 후 100°C 이상에서 이산화탄소를 가하는 것; 중에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게 상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산의 혼합물에 칼슘염 및 탄산염을 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 것일 수 있다. 상기 칼슘염은 수용성인 것일 수 있고, 바람직하게 염화칼슘, 수산화칼슘, 아세트산칼슘, 인산화칼슘, 시트르산칼슘, 젖산칼슘, 글루콘산칼슘, 알긴산칼슘, 질산칼슘, 탄산칼슘, 브로민화칼슘, 중아황산칼슘, 황산칼슘, 황화칼슘, 탄산수소칼슘 및 그 조합 중에서 선택된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게 염화칼슘일 수 있다. 상기 탄산염은 수용성인 것일 수 있고, 바람직하게 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산암모늄, 탄산수소칼슘, 탄산수소마그네슘 및 그 조합 중에서 선택된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게 탄산나트륨일 수 있다. 상기 순차적 혼합은 칼슘염, 탄산염 순이거나 탄산염, 칼슘염 순일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따른 화장료 조성물은, 전술한 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자를 포함한다.
이때, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수; 훼이셜 로션 또는 바디로션 등과 같은 유액; 영양 크림, 수분 크림 또는 아이 크림 등과 같은 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제; 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제; 등의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 상기 나노입자 외에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징 제형인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 레스베라트롤을 0.05 μM 이상, 바람직하게 0.1 μM 이상, 더욱 바람직하게 1 μM 이상, 가장 바람직하게 5 μM 내지 10 mM 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물 내 레스베라트롤은 바람직하게 본 발명의 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자에 함유된 것으로, 상기 나노입자를 조성물에 넣어줌으로써 포함된 것일 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 나노입자 내 레스베라트롤의 함유량은 상기 나노입자의 제조과정에서 조절될 수 있고, 이에 따라 함유된 레스베라트롤의 양을 감안하여 상기 조성물 내 레스베라트롤의 최종 농도가 상기와 같은 범위가 되도록 상기 조성물에 포함되는 상기 나노입자의 양을 계산하여 넣어줄 수 있다.
상기 레스베라트롤을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자를 포함하는 조성물은 화장품으로 제품화되는 경우에, 유효성분인 레스베라트롤이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제 또는 세정제와 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 상기 유효성분을 비교적 높은 농도로 포함시킬 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림 또는 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 유효성분을 포함시켜도 무방할 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 레스베라트롤(RSV)을 함유하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 (PVP-PAA-CaCO 3 ) 나노입자 제조
실시예1.1: RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자 제조
1) Resveratrol (RSV)을 농도 5 %로 Ethanol에 녹이고, 2) 1% PVP (분자량 55,000 Da), 0.5% PAA (분자량 5,100 Da) 이 되도록 증류수에 녹인 후, 1) 및 2)를 5:95(v/v)로 섞어준 후, 4°C에서 12000 rpm으로 1분간 원심분리한 후, 상층액 (RSV가 함유된 폴리아크릴산 입자, PAA 입자)을 수득하였다. 상기의 PAA 입자 10 μl에 CaCl2 (2 M) 50 μl을 섞어주어 PAA-CaCl2를 제조하였다. 상기 PAA-CaCl2에 0.052 M Na2CO3 50 μl를 넣어주어 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 제조한 후, 4°C에서 12000 rpm으로 1분간 원심분리하고 상층액(A)을 제거하고 펠렛(RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 포함)을 수득하였다.
실시예1.2: RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자 내 유효성분 RSV의 봉입률 확인
유효성분 레스베라트롤이 나노입자 내에 다량 봉입되어야 화장품으로 사용되었을 시 효과를 높일 수 있다. 실시예 1.1과 같이 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 제조함에 있어, PAA-CaCl2와 Na2CO3의 비율을 조정하여 나노입자 내에 봉입될 수 있는 유효성분 RSV를 봉입률이 달라지게 된다. 봉입률 (Encapsulation efficiency, EE)는 다음의 식으로 계산된다.
EE = 100 - (상층액(A) RSV)/(초기 RSV *100)
PAA-CaCl2와 Na2CO3의 비율을 조정하여 레스베라트롤의 봉입율을 측정한 결과, 도 2와 같이 ratio 10에서 EE가 최대 80% 이상 나오는 것으로 나타났다. 비율을 높일 경우 EE가 더 높아질 수 있으나, 농도를 높일수록 수렴하는 양상이 나타나므로, ratio 10을 선택하여, 이하 실험에서는 ratio 10으로 제조된 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 이용하였다.
실시예1.3: 실시예1.1에 따라 제조된 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 FT-IR 분석
FT-IR은 적외선 빔의 광 흡광도, 투과도를 확인하여 시료의 고유 지문영역 (finger print)을 이용하여 유기물, 무기화합물 등의 정성적, 정량적 분석이 가능한 FT-IR 시험법이다. RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자(도 3 내 RSV-PAA,PVP)와 폴리아크릴산 (poly(acrylic acid), PAA), 폴리비닐피롤리돈(poly(vinylpyrrolidone), PVP) 및 레스베라트롤(RSV)에 대하여 FT-IR 분석을 진행하였다. 그 결과는 도 3과 같았으며, 상기 4 가지 물질의 FT-IR 결과를 도 3a과 같이 비교했을 때, 점선 부분의 차이를 통해 PAA와 PVP가 반응한 결과 PAA,PVP 화합물이 형성되었음을 알 수 있고, 특히 RSV-PAA,PVP에서는 RSV peak이 나타나지 않아 RSV가 나노입자(RSV-PAA,PVP) 내에 봉입되었다는 것을 확인할 수 있었다.
RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자에 대한 FT-IR 분석 데이터를 좀더 상세하게 살펴본 결과(도 3b), 1465 cm-1,874 cm-1,740 cm-1 peak으로 배터라이트(vaterite) 형태의 CaCO3 나노입자가 제조되었음을 확인하였으며 1409 cm-1,707 cm-1 peak으로 칼사이트(calcite) 형태도 포함되어 있음을 확인할 수 있었다. 이외의 peak들 분석 결과 CaCO3 나노입자 제조 과정에서 사용된 RSV-PAA,PVP (2971 cm-1, 3348 cm-1)가 확인되었다.
실시예1.4: RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 전자현미경 이미지 분석
PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 형태와 크기를 확인하기 위해 전자현미경 이미지를 분석하였다. 주사전자현미경(SEM) 이미지 분석을 위해서는 상기 나노입자를 카본 테이프(carbon tape)에 붙여 고루 펴지게 한 후, 백금(Pt) 코팅을 하고 FE-SEM 기기를 이용하였다. 투과전자현미경(TEM) 이미지 분석을 위해서는 상기 나노입자를 100% Ethanol에 분산시켜, Cu grid (구리 그리드)에 정착시킨 다음, 입자가 grid 표면에 완전히 정착하도록 오븐에서 24시간 건조시키고, 건조된 샘플을 FE-TEM 기기를 이용하였다. PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 SEM 및 TEM 이미지를 분석한 결과는 도 4와 같이, 크기가 100 nm 이하이고 배터라이트 형태의 CaCO3 나노입자가 다수인 것으로 나타났다.
실시예1.5: RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 엑스선결정학(XRD) 분석
RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 PAAM 소재의 XRD specimen holder에 정착시킨 후 XRD 기기를 통해 분석한 결과는 도 5와 같았으며, 배터라이트 및 칼사이트 형태를 확인할 수 있었다.
실시예1.6: RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 동적광산란법(DLS) 분석
RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 동적광산란법으로 분석하기 위해, 상기 나노입자를 증류수에 분산시킨 후, zeta sizer를 통해 입자 크기 및 전하를 측정하였는데, 이 때, polystyrene cuvette을 이용하여 입자 크기를, folded capillary zeta cell을 이용하여 전하를 측정하였다. RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 크기를 확인한 결과는 도 6과 같이 좁은 벨 형태로 나노입자 크기 분포가 좁은 영역에 모여 있는 것을 확인할 수 있었다. 이들 나노입자는 약 48nm 수준(평균 48.64 nm)으로 만들어진 것으로 나타났으며, 다분산도 지수(polydispersity index, PI)를 계산한 결과 0.2284로 나타나 상기 나노입자의 크기가 균일하다는 것을 알 수 있다.
실시예1.7: RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 안정성 분석
레스베라트롤은 안정성이 낮은데, 특히 UV와 높은 pH에서는 분 단위로 빠르게 분해 및/또는 이성질체화되고, 약염기성 및 태양광에 의해서는 각각 몇 시간 단위, 중성 및 약산성 조건에서는 며칠 단위 정도만에 안정성이 떨어지는 것으로 알려져 있다. 특히 열 안정성이 낮아, 예컨대, 상온에서는 샘플 내 레스베라트롤의 절반 이상이 5일 이내에 안정성을 잃고, 10일 후 90% 이상이 분해 및/또는 이성질체화되는 것으로 보고된 바 있다(Zupancic et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2015)).
RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 안정성 시험을 온도 25°C, 습도 60%의 항온항습챔버를 사용하여 진행하였다. 상기 나노입자에 대하여, 제조 당일, 제조 후 각각 1개월, 2개월 및 3개월 시점의 침전 정도, 입자 크기, 전위 및 주성분 함유 정도(봉입률)를 측정하여 표 1과 같은 결과를 얻었다.
측정 시점 제조 당일 제조 후 1개월 제조 후 2개월 제조 후 3개월
침전물 없음 없음 없음 없음
입자 크기(nm) 48 ±1.7 49 ±0.5 51±2.3 50±1.1
다분산도 지수 0.037 0.24 0.33 0.018
Zeta potential -7.7 -7.5 -9.4 -8.1
이미지
봉입률 81.75% 82.02% 81.95% 81.88%
결과를 살펴보면, 제조 당일은 물론 후 3개월 시점에서도 침전물은 확인되지 않았고, 크기 역시 모든 측정 시점에서 오차범위를 벗어나지 않는 수준으로, 다분산도 지수 값이 낮게 유지되는 등 나노입자의 크기가 균일하게 유지되는 것으로 나타났다. 또한, 유효성분인 레스베라트롤의 봉입률 또한 모든 측정 시점에서 유사한 수준으로, RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자는 안정성이 높고 유효성분인 레스베라트롤을 안정하게 유지할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
2. RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 세포 보호 효과 측정
RSV은 세포를 보호하는 효과가 있으나, 고농도에서는 오히려 세포 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자로 만들었을 때 RSV의 상기와 같은 효과에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해, HaCaT(인간 각질형성세포주, epidermal keratinocyte cell line) 및 NIH-3T3(마우스 태아 섬유아세포주, mouse embryonic fibroblast cell line) 두 가지 세포주를 이용하여 실험을 진행하였다. 이때, 세포배양용 96-웰 플레이트에 1X104 cell/well로 세포주를 부착시켜 24시간 배양을 진행하여 세포가 안정화 상태에서 실험을 진행하였으며, 여기서 사용된 배지는 DMEM (Dulbecco’s modified eagle’s medium), 10% FBS (Fetal bovine serum) 및 1% PS (penicillin-streptomycin)의 혼합물이고, 37°C, 5% CO2 조건 하에 배양을 진행하였다. 각 세포주가 안정화된 것을 확인한 후, 레스베라트롤 단독 또는 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를, 레스베라트롤 농도가 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 50 μM이 되도록 각각 처리한 다음, 30분 배양 후 CCK-8 assay kit를 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과가 도 7 및 도 8과 같았다.
결과를 살펴보면, HaCaT 세포주에 레스베라트롤을 단독으로 처리한 경우, 0.625, 1.25, 2.5, 및 5 μM에서 세포 생존율을 높이지만, 처리 농도가 높아지면서 이러한 효과가 감소하는 경향을 나타내며 50 μM에서는 오히려 세포 생존율을 낮추는 것을 확인할 수 있었다. 반면 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 경우, 처리 농도가 높아질수록 대체적으로 세포 생존율을 높이는 경향을 나타내어 처리 농도가 높은 경우에도 통계적으로 유의미하게 세포 생존율을 높일 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, NIH-3T3 세포주에 레스베라트롤을 단독으로 처리한 경우 처리 농도가 높아짐에 따라 세포 생존율이 전반적으로 감소하여 고농도인 20 및 50 μM를 처리 시 세포 생존율을 확연히 낮춘 반면, RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 경우 전체 처리 농도 구간에서 이러한 독성 효과가 나타나지 않았다.
종합해보면, 레스베라트롤 단독 고농도 처리시에 나타나는 독성이 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자에서는 더 이상 나타나지 않아, 레스베라트롤의 안전성을 높일 수 있다는 것을 알 수 있다. 이는, 상기 나노입자에 대한 선행 시험에서, 해당 나노입자를 세포에 처리 시에 레스베라트롤이 나노입자로부터 잘 방출(release)되는 것으로 나타난 바 있어(데이터는 본 명세서에 포함하지 않음), 나노입자 내 봉입으로 인해 결과적으로 처리되는 레스베라트롤의 농도가 낮아져 나타나는 효과는 아니라는 점을 확인할 수 있었다.
3. 산화 스트레스(oxidative stress)에 대한 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 세포 보호 효과 측정
실시예3.1. Rose Bengal 처리
본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자로 만들었을 때, 레스베라트롤의 항산화 효과에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해, 가시광선에 의해 라디칼을 형성하는 Rose Bengal와 HaCaT(인간 각질형성세포주, epidermal keratinocyte cell line) 및 NIH-3T3(마우스 태아 섬유아세포주, mouse embryonic fibroblast cell line) 두 가지 세포주를 이용하여 실험을 진행하였다. 이때, 세포배양용 96-웰 플레이트에 1X104 cell/well로 세포주를 부착시켜 24시간 배양을 진행하여 세포가 안정화 상태에서 실험을 진행하였으며, 여기서 사용된 배지는 DMEM (Dulbecco’s modified eagle’s medium), 10% FBS (Fetal bovine serum) 및 1% PS (penicillin-streptomycin)의 혼합물이고, 37°C, 5% CO2조건 하에 배양을 진행하였다.
각 세포주가 안정화된 것을 확인한 후, Rose Bengal을 농도별로 각각 처리한 다음, CCK-8 assay kit를 이용하여 세포 생존율을 측정하고, Rose Bengal의 IC50을 도출하였다(도 9). HaCaT cell line 과 NIH-3T3 세포주에 대한 Rose Bengal의 IC50은 각각 10 μM 및 16 mM로 나타났다. RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 산화 스트레스에 대한 보호효과를 확인하기 위해 이들 각 농도의 Rose Bengal을 적용하여 시험을 진행하였다.
레스베라트롤 단독 및 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 각각 농도별로 처리하여 30분 배양 후, 세포주별 IC50농도로 Rose Bengal을 포함하는 배지를 처리하여 30분간 luminescent light를 조사하고, CCK-8 assay kit를 이용하여 세포 생존율을 확인하였다.
그 결과, 레스베라트롤을 단독으로 처리한 경우는 HaCaT 및 NIH-3T3 세포주에 처리된 Rose Bengal에 의해 유발된 산화 스트레스에 대한 보호효과를 확인할 수 없었다(도 10). 반면, 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 처리한 경우 Rose Bengal이 처리된 두 세포주 모두에서 세포 생존율을 거의 전 농도 구간에서 확연히 높일 수 있으며(도 11), 특히 Rose Bengal을 처리하지 않은 세포군의 80~90% 수준으로 세포 생존율을 높일 수도 있는 것으로 나타나, 레스베라트롤을 단독으로 처리한 경우에 비해 더 뛰어난 산화 스트레스에 대한 보호 효과를 확인할 수 있었다.
실시예3.2. 과산화수소(H 2 O 2 )처리
본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자로 만들었을 때 레스베라트롤의 항산화 효과에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해, 과산화수소(H2O2)와 HaCaT(인간 각질형성세포주, epidermal keratinocyte cell line) 및 NIH-3T3(마우스 태아 섬유아세포주, mouse embryonic fibroblast cell line) 두 가지 세포주를 이용하여 실험을 진행하였다. 이때, 세포배양용 96-웰 플레이트에 1X104 cell/well로 세포주를 부착시켜 24시간 배양을 진행하여 세포가 안정화 상태에서 실험을 진행하였으며, 여기서 사용된 배지는 DMEM (Dulbecco’s modified eagle’s medium), 10% FBS (Fetal bovine serum) 및 1% PS (penicillin-streptomycin)의 혼합물이고, 37°C, 5% CO2조건 하에 배양을 진행하였다.
각 세포주가 안정화된 것을 확인한 후, H2O2를 농도별로 각각 처리한 다음, CCK-8 assay kit를 이용하여 세포 생존율을 측정하고, H2O2의 IC50을 도출하였다(도 12). HaCaT cell line 과 NIH-3T3 세포주에 대한 H2O2의 IC50은 각각 1 μM 및 6.25 μM로 나타났다. RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 산화 스트레스에 대한 보호효과를 확인하기 위해 이들 각 농도의 H2O2를 적용하여 시험을 진행하였다.
레스베라트롤 단독 및 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 각각 농도별로 처리하여 30분 배양 후, 세포주별 IC50농도로 H2O2를 포함하는 배지를 처리하여 30분간 배양하고, CCK-8 assay kit를 이용하여 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, 레스베라트롤을 단독으로 처리한 경우는 HaCaT 및 NIH-3T3 세포주에 가해진 H2O2에 의해 유발된 산화 스트레스에 대한 보호효과를 확인할 수 없었다(도 13). 반면, 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 처리한 경우 H2O2가 처리된 두 세포주 모두에서 세포 생존율을 전체 농도 구간에서 유의미하게 높일 수 있는 것으로 나타나(도 14), 레스베라트롤을 단독으로 처리한 경우에 비해 더 뛰어난 산화 스트레스에 대한 보호 효과를 확인할 수 있었다. 다만, 그 효과는 Rose Bengal에 대한 보호 효과에 비해 약한 편인데, 이는 레스베라트롤이 다른 항산화제에 비해 H2O2를 소거하는 활성이 낮기 때문일 것으로 보인다.
4. RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 항산화능 측정 (DPPH 시험법)
자유라디칼(free radical)은 활성 전자를 갖고 있어 매우 불안정하고 반응성이 크며, 이러한 반응성은 피부 세포에 손상을 주어 노화를 가속시키게 된다. 그러므로, 자유라디칼 생성을 억제하면 피부세포의 노화를 억제할 수 있다. 자유라디칼 소거능력을 확인할 수 있는 DPPH 시험법을 이용하여 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 항산화능을 확인하였으며, 이때, 상기 나노입자를 최종 레스베라트롤 농도가 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 50 및 100 μM이 되도록 각각 처리하여 30분 배양 후, DPPH antioxidant assay kit (Dojindo D678)을 사용하였다.
그 결과, 도15와 같이, 상기 나노입자를 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 나노입자를 처리한 세포군의 경우, 유효성분인 레스베라트롤의 최종 농도가 높아질수록 자유라디칼 소거능이 높아지는 것으로 나타났으며, 특히 RSV의 농도가 50 μM일 때 항산화 효과가 약 22%, RSV 100 μM에서 약 50% 높게 나오는 것을 확인할 수 있었다.
5. RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 항염증 효과 측정
COX-2 (Cyclooxygenase-2)는 성장인자, 염증유발인자, 산화적 스트레스, 사이토카인 등에 의해 유도되는 효소로, 염증 반응을 유발 혹은 악화시켜 질병을 일으킨다. iNOS (inducible nitric oxide synthase)는 Tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), lipopolysaccharide (LPS) 등의 염증유발인자에 의해 발현되어 과량의 nitric acid (NO)를 생성한다. 그 결과, NO는 free radical의 일종으로 세포 손상을 야기시켜 만성염증 및 세포사멸을 유도한다. 레스베라트롤은 항염증 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자 상태에서도 이러한 작용을 할 수 있는지 알아보고자, LPS로 세포에 염증반응을 유도하고, 전술한 바와 같은 염증반응성 분자인 COX-2 및 iNOS의 발현에 미치는 영향을 알아보았다.
본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 농도별로 Raw264.7 세포에 30분 처리한 후, LPS 1 μg을 처리하였다. 16시간 배양 후, cell lysate를 얻어 BCA 정량법을 통해 단백질 정량을 실시한 다음, 30 μg 동량의 단백질을 로딩하여 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 PVDF membrane으로 옮겨 COX-2, iNOS antibody를 처리하고, luminescence를 X-ray film에 감광해 결과를 확인하고(도16a), 신호 강도를 image-J 프로그램을 통해 정량화하였는데(도 16b), 이때 LPS 와 RSV를 처리하지 않은 대조군의 COX-2 및 iNOS 발현양이 각각 1이 되도록 하여 계산하였다.
그 결과, LPS 만을 처리한 그룹에서는 대조군 대비 COX-2가 약 3.5배, iNOS가 약 5.5 배로 발현되었다. 이에 비해 LPS와 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 레스베라트롤 농도가 50 μM 되도록 처리한 경우 COX-2 및 iNOS 발현이 대조군 대비 각 2 정도로 감소되었고, LPS와 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 레스베라트롤 농도가 100 μM 되도록 처리한 그룹에서는 대조군 대비 COX-2 발현이 1.3배, iNOS 발현이 1배 수준으로 낮아져, 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 농도가 높아질수록 항염증 및 항산화 활성이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
6. RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO 3 나노입자의 경피투과율 확인
Franz diffusion cell을 이용하여 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 경피투과율을 확인해 보았다. 이때, 실험에 사용된 피부조직은 경추탈골로 치사시킨 ICR Mouse로부터 적출하였으며, Receptor chamber를 receptor phase (EtOH : PBS = 50:5 w/w)로 채운 후, 각질층이 위로 향하도록 donor 와 receptor phase 사이에 피부를 고정시키고, 항온수조를 이용하여 온도를 37°C로 유지하며 실험을 진행하였다. 레스베라트롤 단독 또는 레스베라트롤이 함유된 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자가 동일 농도의 레스베라트롤이 포함되도록 들어 있는 시료 0.2 ml을 donor를 통해 피부 표면에 가한 후, 시간에 따라 0.5 ml의 receptor phase를 sampling port를 통해 채취하여 분석하였으며, 채취 직후 동량의 receptor phase를 chamber에 보충해주었다. 24시간 후, 각질층 (피부를 통과하지 못함, Stratum corneum, S.C), 피부(skin) 및 경피투과(Transdermal) 세 부분으로 나누어 HPLC분석을 진행하였으며, 그 결과는 도 17과 같다.
결과를 살펴보면, 레스베라트롤 단독(대조군) 및 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자(실험군)를 처리한 경우, 초기 시료 내 레스베라트롤 대비 각각 피부를 투과한 비율이 약 1.1%와 17%로, 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자가 훨씬 높은 비율로 피부를 투과한 것으로 나타났다. 또한, 피부(skin)에서는 레스베라트롤 단독과 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자를 처리한 경우 각각 약 11%와 13.6%의 레스베라트롤이 검출되었고, 통과하지 못하고 각질층에 남은 비율은 각각 약 7.0%와 10.5% 였다. 위의 시험 결과를 통해, 레스베라트롤이 함유된 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자가 서로 다른 피부층 전반에 대한 흡수율뿐 아니라 피부 투과율을 높이며, 특히 피부를 투과한 양은 대조군과 비교하여 약 17배 높은 것을 확인할 수 있었다. 위와 같은 대조군과 실험군 간 경피투과량의 차이는 레스베라트롤의 낮은 상온 안정성에서 일부 기인하기도 하는 것으로 나타났는데, 이는 레스베라트롤을 단독처리한 대조군에서는 초기 시료 대비 검출된 전체 레스베라트롤의 비율, 즉 각질층, 피부 및 경피투과 함량의 비율 합 자체가 낮게 나오는 것에서 확인할 수 있다. 반면, 레스베라트롤이 함유된 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자의 경우 유효성분인 레스베라트롤의 안정성이 높아져, HPLC 결과에서도 초기 시료 대비 검출된 전체 레스베라트롤의 비율이 높게 나오는 것을 확인할 수 있다.
종합해보면, 레스베라트롤이 함유된 본 발명의 RSV를 함유하는 PVP-PAA-CaCO3 나노입자는 유효성분인 레스베라트롤을 다량 포함할 수 있을 뿐 아니라, 입자 크기가 작고 균일하며, 약물전달 효율이 높은 것으로 알려진 CaCO3 결정 형태인 배터라이트 및 칼사이트를 다수 포함하였다. 또한 상기 나노입자는 안정성이 높고, 유효성분인 레스베라트롤의 안정성, 세포 보호 및 항산화 효능, 피부흡수율 및 경피투과율을 높일 수 있고, 레스베라트롤이 높은 농도에서 나타내는 세포 독성을 낮추어 안전성을 높일 수 있으며, 레스베라트롤이 갖는 항염증 효과를 가지는 것으로 나타나, 고기능성 화장품 소재로서의 높은 유용성을 가짐을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합물에 탄산칼슘의 전구체를 혼합하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산의 혼합물에 탄산칼슘의 전구체를 혼합하는 단계는,
    상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산의 혼합물에 칼슘염을 혼합한 제3 혼합물; 및 탄산염을 혼합하는 것이고,
    상기 제3 혼합물과 탄산염은 1:8 내지 1:10의 부피비율로 혼합되는 것이고,
    상기 칼슘염과 탄산염은 3:1 내지 5:1의 몰비로 혼합되는 것인, 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 레스베라트롤, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 혼합하는 단계는,
    레스베라트롤을 유기용매에 혼합한 제1혼합물; 및
    폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴산을 수계용매에 혼합한 제2혼합물;을 각각 준비한 후 제1혼합물 및 제2혼합물을 섞어 제조되는 것인, 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1혼합물 내 레스베라트롤은 0.5 내지 10중량% 포함되는 것인, 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제2혼합물 내 폴리비닐피롤리돈은 0.1 내지 10중량% 포함되고,
    상기 제2혼합물 내 폴리아크릴산은 0.05 내지 5중량% 포함되는 것인, 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자의 제조방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제1혼합물과 제2혼합물의 비율(v/v)은 1:99 내지 20:80인 것인, 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 제4항의 폴리비닐피롤리돈-폴리아크릴산-탄산칼슘 나노입자를 포함하는 화장료 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 레스베라트롤을 0.1 μM 이상 포함하는 것인, 화장료 조성물.
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