KR102631862B1 - 면역 크로마토그래피 검사의 감도 향상을 위한 방법 - Google Patents
면역 크로마토그래피 검사의 감도 향상을 위한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본원은 면역 크로마토그래피 검사의 감도 향상을 위한 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 검출이 필요한 시료 및 크로마토그래피 전개를 위한 완충액을 별도의 위치에서 순차적으로 적용하여, 시료에 포함된 표적 분석물의 검출감도 향상된다. 본원에 따른 방법은 항원 항체 결합 기반의 인비트로 검출에서 위음성을 크게 낮출 수 있다.
Description
본원 면역크로마토그래피 방식의 생물학적 물질 검사의 감도를 향상시킬 수 있는 기술과 관련된 것이다.
일반적으로 측방 유동형 (lateral flow) 또는 딥스틱 형태 등으로 구현되는 면역 크로마토그래피 기반의 진단 시약은 1980년대에 처음 개발된 이래, 사람 및 동물의 감염병 진단, 식품 검사, 환경 시료 분석 등의 광범위한 분야에서 널리 활용되고 있다 (Wong & Tse, Lateral Flow Immunoassay, 2009). 가장 잘 알려진 예는 임신 진단 시약이다. 이러한 시약은 간편하고 휴대성이 있다. 뇨를 샘플패드에 적시면 5분 이내에 결과 창을 통해 검사선과 대조선의 색띠를 보고 결과를 판정할 수 있다. 또한 감염병 진단에서는 혈액, 혈청, 혈장, 비인두, 비강 검체와 같은 시료가 사용된다.
이러한 면역 크로마토그래피 기술은 항원-항체 반응 원리에 근거를 두고 있다. 예를 들면 검출자 항체는 골드입자 (20-40nm) 또는 라텍스 입자 (100~ 300nm)에 컨쥬게이션되고, 분석물질의 종류에 따라 항체 또는 항원은 니트로셀룰로오스 멤브레인 (10 ~ 15um 공극)에 일정한 양으로 분주 되어 고정된다. 분석물질은 생물학적 시료 내에 있는 병원체의 단백질 (예: 코로나-19 유래의 단백질 또는 항원) 또는 병원체 감염 후 체내 면역반응으로 생성된 항체 (IgM, IgA, IgG 등)일 수 있다.
최근 COVID-19 감염증의 원인인 SARS-CoV-2 바이러스는 핵산 기반의 PCR 검사로 검출되고 있다. 반면 면역 크로마토그래피 방식의 항원-항체 기반의 검사는 신속성 및 편리성에도 불구하고 PCR 검사와 비교하여 상대적으로 낮은 감도로 인한 위음성의 문제로 사용이 제한적이다.
따라서 이러한 면역 크로마토그래피 기반의 검사의 감도를 높이는 기술의 개발이 필요하다.
본원은 항원-항체 반응 기반의 면역크로마토그래피를 이용한 시료 중의 표적 분석물 검출의 감도를 향상시키는 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 시료 중의 표적 분석물을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 방법에서, 상기 표적 분석물의 검출 감도를 향상시키는 방법으로, 상기 방법은 기존의 방법인 시료와 전개 완충액을 혼합하여 샘플 패드에 적하하는 대신에, 시료와 전개 완충액을 혼합하지 않고, 각각 전개용 매질과 샘플 패드에 순차적으로 적하하는 것을 특징으로 한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 면역 크로마토그래피에 사용되는 검사 스트립을 제공하는 단계로, 상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하며, 상기 전개용 매질에는 상기 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자, 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자가 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 부착되어 있고, 상기 포획자 부착 부위 전방의 전개용 매질에 상기 시료를 적하하는 단계; 및 상기 시료 적하 후에, 상기 샘플패드에, 상기 스트립에서의 크로마토그래피 전개를 위한 전개 완충액을 적하하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 상기 스트립은 컨주게이션 패드를 추가로 포함하며, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치한다.
다른 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 시료가 적하되는 상기 전개용 매질 상의 위치는 색소로 표시될 수 있으며, 상기 색소는 상기 크로마토그래피 전개와 함께 이동한다.
다른 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 스트립은 지지대를 추가로 포함하며, 상기 샘플 패드, 상기 전개용 매질 및 상기 흡수 패드는 상기 지지대 상에 위치한다.
다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 방법에 사용되는 스트립을 제공하며, 상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질에는 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자 및 대조물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 위치하며, 상기 전개용 매질 상의 상기 포획자 부착 부위 전방에는 색소로 표시된 시료 적하 부위를 포함하며, 상기 색소는 크로마토그래피 전개 방향으로 이동할 수 있는 수용성 색소이다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법이 사용되는 스트립은 컨주게이션 패드를 추가로 포함하며, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치한다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 스트립을 수용하기 위한 하우징으로, 상기 하우징은 상기 스트립의 샘플 패드에 완충액을 적하하기 위한 제 1 창, 시료를 적하하기 위한 제 2 창, 및 포획자 및 대조군 물질이 부착된 부위에서의 반응을 검출하기 위한 제 3 창을 포함하여 구성된다.
본원에 따른 면역 크로마토그래피 검사의 감도 향상 방법은 검출이 필요한 시료 및 크로마토그래피 전개를 위한 완충액을 별도의 위치에서 순차적으로 적용하여, 시료에 포함된 표적 분석물의 검출 감도가 향상된다. 본원에 따른 방법은 항원 항체 결합 기반의 인비트로 검출의 가장 큰 단점인 위음성을 크게 낮출 수 있다.
도 1a는 본원의 일 구현예에 따른 방법의 면역크로마토그래피에 사용될 수 있는 스트립의 구조를 도식적으로 나타낸 것으로, 본원의 방법에 따른 전개 완충액 및 시료 적하 부위를 표시하였다.
도 1b는 본원의 일 구현예에 따른 방법의 면역크로마토그래피에 사용될 수 있는 스트립의 구조를 도식적으로 나타낸 것으로, 여기에 기존 방법에 따른 전개 완충액 및 시료 적하 부위를 표시하였다.
도 2는 본원에 따른 시료 적하 방법 (①)과 기존의 적하 방법(②)을 적용한 면역크로마토그래피로 분석물로서 일본 뇌염바이러스 IgM항체를 검사한 결과이다. 저농도의 분석물은 본원에 따른 적하 방법은 양성인 반면, 기존의 방법은 음성으로 검출되었다. 이는 기존 방법에 의한 결과는 상대적으로 낮은 감도에 의한 위음성임을 나타낸다.
도 3은 시료 적하 부위가 색소로 표시된 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 스크립의 일 구현예이다.
도 4는 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 스트립을 수용할 수 있는 하우징의 일 구현예로서, 상기 하우징은 크로마토그래피 전개용 완충액 적하를 위한 창 및 시료 적하용 창이 별도로 구비되어 있다.
도 5는 본원에 따른 방법이 사용되는 스트립의 구체적 예를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 딥스틱 형태의 스트립 및 사용예를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 본원의 일 구현예에 따른 방법의 면역크로마토그래피에 사용될 수 있는 스트립의 구조를 도식적으로 나타낸 것으로, 여기에 기존 방법에 따른 전개 완충액 및 시료 적하 부위를 표시하였다.
도 2는 본원에 따른 시료 적하 방법 (①)과 기존의 적하 방법(②)을 적용한 면역크로마토그래피로 분석물로서 일본 뇌염바이러스 IgM항체를 검사한 결과이다. 저농도의 분석물은 본원에 따른 적하 방법은 양성인 반면, 기존의 방법은 음성으로 검출되었다. 이는 기존 방법에 의한 결과는 상대적으로 낮은 감도에 의한 위음성임을 나타낸다.
도 3은 시료 적하 부위가 색소로 표시된 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 스크립의 일 구현예이다.
도 4는 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 스트립을 수용할 수 있는 하우징의 일 구현예로서, 상기 하우징은 크로마토그래피 전개용 완충액 적하를 위한 창 및 시료 적하용 창이 별도로 구비되어 있다.
도 5는 본원에 따른 방법이 사용되는 스트립의 구체적 예를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 딥스틱 형태의 스트립 및 사용예를 도식적으로 나타낸 것이다.
본원은 시료 중 특정 표적 분석물의 검출을 위한 크로마토그래피 분석에 있어서, 시료 적하 (loading) 부위, 전개 완충액과의 혼합 여부 및 적하 시기를 기존과 달리함으로써 특정 표적 분석물의 검출 감도를 향상시킬 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
이에 한 양태에서 본원은 시료 중의 표적 분석물을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 방법에서 상기 표적 분석물의 검출 감도를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 면역 크로마토그래피에 사용되는 측방유동 분석용 스트립을 제공하는 단계; 상기 스트립의 제 1 위치에 분석이 필요한 표적 분석물을 포함하는 시료를 적하하는 단계; 및 상기 시료 적하 후에, 상기 스트립의 제 2 위치에 크로마토그래피 전개를 위한 전개 완충액을 적하하는 단계를 포함하며, 상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질에는 상기 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 위치하며, 상기 제 1 위치는 상기 전개용 매질 상의 상기 포획자 앞에 일정 간격을 두고 위치하며, 상기 제 2 위치는 샘플 패드 상에 위치한다.
본원에서 사용된 용어 "시료" 또는 검체는 표적 분석물을 포함하는 분석대상 물질을 가리키며, 본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 액체상 또는 액체와 유사한 유동성 있는 물질, 예를 들면 각 종 고형 조직/세포, 혈액, 타액, 소변, 땀, 체모 또는 이로부터 추출된 물질 등을 포함하며, 또는 주위 환경(예로, 대기, 토양, 물 등)으로부터 수집된 물질 등 다양한 물질을 포함한다. 예로는 이로 제한하는 것은 아니나, 혈액, 뇨, 타액 등을 포함하며, 혈액은 전혈, 혈장, 혈청이나 소정의 처리(예를 들면 응고 방지)가 이루어진 혈액, 혈장, 혈청 등이 이에 해당될 수 있다. 조직 또는 세포의 추출물은 예를 들면 탄수화물, 지질, 핵산, 단백질 등으로부터 선택된다. 상기 분석대상물은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 각 종 질환과 연관된 마커, 예를 들면 바이러스 병원체 (HIV, HCV, SARS-CoV-2, dengue virus, Japanese encephalitis virus 등)의 단백질 또는 이에 대응하여 생성된 사람 항체, 염증 질환의 마커 (CRP, PCT), 종양표지자 (PSA, AFP CA-125 등), 호르몬 (Cortisol, progesterone 등) 등을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "분석물"은 시료 중의 검출 또는 분석 대상 화합물로, 표적 분석물 또는 표적 이라고도 하며 단백질 또는 핵산을 포함하는 것이다. 본원에서 단백질은 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 것이며, 기능적으로는 항체, 항원, 병원성 바이러스 또는 박테리아 유래의 특정 단백질을 포함한다. 일 구현예에서는 SARS-CoV-2 감염으로 인한 항체 또는 SARS-CoV-2 유래의 스파이크와 같은 단백질을 포함한다. 또한 본원에서 용어 "핵산"은 지놈 DNA, cDNA 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화학합성 DNA 및 RNA를 포함한다.
본원에서 시약은 상술한 분석물의 검출 및 분석에 적합한 물질로, 구체적 분석물에 따라 상이하며, 예를 들면, 상기 시약은 상기 체성분 내의 다양한 물질 예를 들면 항원 등과 반응을 일으키는 소정의 항체, 또는 크로마토그래피의 전개를 위한 완충액 등일 수 있고, 이에 한정하지 않는다.
면역 크로마토그래피는 시료 중의 표적 분석물을 항원/항체 반응에 기반한 크로마토그래피로 검출하는 것으로, 크로마토그래피의 방식에 따라 측방유동 분석을 포함한다. 측방유동 분석은 시료에 포함된 표적 분석물, 예를 들면 특정 단백질 또는 핵산을 정량 또는 정성적으로 검출하는 방법으로, 예를 들면 일정한 서열의 핵산에 교잡하는 올리고뉴클레오타이드 또는 특정 항체 및/또는 항원이 특정 위치에 결합되어 있는 나이트로셀룰로스 막(전개용 매질)을 포함하는 스트립에서 크로마토그래피 방법으로 시료를 이동시켜 서열 특이적 교잡반응 또는 항원 항체 반응을 통해 시료 중의 표적 분석물을 검출하는 방법이다. 예를 들면 대한민국 공개 특허공보 제2003-0065341호, 제2011-0007699호, 제2011-0127386호, 및 등록공보 제1149357호 등에 기재된 것을 참조할 수 있다.
예를 들면 일 구현예에서 본원의 방법이 적용될 수 있는 측방유동 스트립은 일 구현예에서 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 흡수 패드의 한 단부 및 상기 샘플 패드의 한 단부와 액체의 흐름이 형성될 수 있도록 접해 있으며, 상기 전개용 매질에는 포획자 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 포획자는 샘플패드에 가까이 위치한다. 스트립에 포함된 전개용 매질은 그 자체가 지지대가 될 수 있다.
예를 들면 다른 구현예에서 본원의 방법이 적용될 수 있는 측방유동 스트립은 지지대, 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 지지대는 상기 전개용 매질, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드를 지지하며, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드는 서로 겹치지 않도록 상기 지지대의 양 단부에 각 각 위치되어 있으며, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 흡수 패드의 한 단부 및 상기 샘플 패드의 한 단부와 액체 흐름이 형성될 수 있도록 접해 있으며, 상기 전개용 매질에는 포획자 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 포획자는 샘플패드에 가까이 위치한다.
또한 크로마토그래피 분석 수단으로, 측방유동에 사용되는 스트립 및 이에 포함된 각 구성은 예를 들면 대한민국 공개 특허공보 제2011-0046833호에 개시된 바와 같은 측방유동 분석용 스트립을 참조할 수 있다. 예를 들어 전개용 매질은 통상적으로 크로마토그래피 매질을 일컫는 것으로 바람직하게는 액체 시료, 분석물, 특히 생물학적 시료에 포함된 단백질 또는 핵산이 모세관력에 의해 신속하게 이동하여 그 위에 부착된 포획자에 도달될 수 있도록 하는 것이면 어느 것이든 사용될 수 있다. 일반적으로 전개용 크로마토그래피 매질은 모세관력에 반응하여 수성 매질에 의해 이동하는 다공성 물질이다. 전개용 매질의 예로는 측방이동에 사용될 수 있는 예컨대 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서 전개용 매질은 나이트로셀룰로스이다. 나이트로셀룰로스를 사용하는 경우에, 구멍의 직경은 전형적으로 5 μm ~ 15μm이다. 다른 구현예에서 입자형태의 표지물질을 사용할 경우, 구멍의 크기는 입자 직경의 약 10배 이상이 되어야 한다. 상기 예시된 물질은 단독으로 사용되거나 다른 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 예로는 세라믹 물질을 들 수 있다. 또한 크로마토그래피 매질은 다작용성이거나 다작용성으로 변형시켜 포획자와 공유결합을 가능하게 할 수 있다.
본원 도 1 내지 도 4를 참조하면, 본원에 따른 방법에 사용되는 스트립은 포획자 (T)를 포함한다. 본원에서 용어 "포획자"는 시료 중의 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 물질로서, 표적 분석물이 항원 또는 항체와 같은 단백질인 경우, 각각 상응하는 항체 또는 항원일 수 있고, 표적 분석물이 핵산인 경우 서열 특이적 결합을 할 수 있는 상보적 핵산을 포함한다. 포획자는 전개용 매질을 통해 이동하는 표적 분석물을 이러한 특이적 결합 반응에 의해 선택적으로 포획할 수 있으며, 검사선 (Test Line)이라고도 한다. 상기 포획자는 전개용 매질 상에 공유 또는 비공유적 결합으로 부착될 수 있으며, 부착이란, 상기 전개 매질의 이동상이 이동하더라도 같이 이동하지 않고 고정된 자리 위치한 상태를 말한다. 일 구현예에서 상기 포획자는 전개용 매질에 비공유 결합으로 부착되어 있다. 항원 또는 항체를 포함하는 단백질 또는 핵산을 예를 들면 나이트로셀룰로스와 같은 다공성 막에 부착하는 방법은 공지되어 있다. 이러한 포획자는 예를 들면 나이트로셀룰로스 막에 선폭 약 1mm 이하로 분주 될 수 있으나 이러한 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 구체적 수치는 사용하는 전개용 매질의 종류의 따라 달라질 수 있다. 적어도 하나의 포획자가 스트립으로 사용되는 전개용 매질 상의 소정의 위치에 위치하며, 분석을 위해 양성 또는 음성 대조군용 포획자를 포함할 수 있다.
본원 도 1 내지 도 4를 참조하면, 본원에 따른 방법에 사용되는 스트립은 크로마토그래피 전개 방향으로 포획자 부착 부위에서 일정 간격 떨어진 지점에 대조선 (Control Line, C)이라고도 불리는 대조군 또는 대조물질을 포함한다. 대조선에는 분석물질 및 포획자와 전혀 관련이 없는 물질(항체 또는 항원)이 부착되어 있고 컨쥬게이션 패드에는 이 대조선에 부착된 물질과 결합하는 물질(항체 또는 항원)이 금입자와 결합되어 있다.
상술한 스트립의 검사선 및 대조선은 선폭 약 1mm 이하로 분주 될 수 있으나 이러한 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다.
본원 도 1 내지 도 6을 참조하면, 본원에 따른 방법에서 혈청과 같은 시료는 기존의 방법과 달리 스트립의 샘플 패드가 아닌, 포획자 부착 부위 전방의 전개용 매질 상의 소정의 위치에 적하된다.
본원의 도 1 내지 도 6을 참조하면, 본원에서 시료가 적하되는 소정의 위치는 포획자 부착 부위 전방의 포획자 부착 부위로부터 일정 간격 떨어진 위치이다. 시료가 적하되는 위치는 검사 스트립의 폭 (통상적으로 약 4 mm ~ 5mm) 및 전개용 매질의 공극 (10μm ~ 15μm), 및 전개용 매질에 적하할 시료의 양 등을 고려하여 조절하여야 한다. 포획자 부착부위 전방에 시료를 적하하는 경우, 전개용 매질에 적하된 시료가 이동하여 포획자 (본 실시예를 예로 들면 일본뇌염바이러스의 단백질)가 부착된 부위 (T, 검사선)에 도달하여 항원-항체 반응 (human anti-Japanese encephalitis virus antibody와 바이러스 단백질 간의 결합반응)이 일어나는 것이다. 이 점이 시료를 먼저 포획자-금입자 컨쥬게이트와 반응시키는 전통적인 기존의 방식과 가장 큰 차별적 특징으로 이로 인해 감도가 향상된다. 이어서 샘플패드쪽에서 전개 완충액을 적하하면 컨쥬게이션 패드에 포함되어 있던, 본 실시예를 예로 들면 검출자 항체 (goat anti-human IgM antibody)-금입자 결합체가, 전개용 매질쪽으로 이동하여 항원-항체 결합체가 형성된 포획자 선에 도달하게 된다. 일 구현예에서 본 실시예 1에 개시된 바와 같이, 검사 스트립의 폭이 4mm, 전개용 매질의 공극이 12μm이고 시료의 양을 약 3㎕ ~ 5u㎕ 적용하고자 할 때에는 시료 적하부위를 포획자 부착부위(검사선, T)에서 약 4-5mm 떨어진 곳에 위치하였을 때에 감도향상을 위한 최적의 조건인 것으로 확인되었다.
또한, 전개용 매질에 시료의 양을 과도하게 (10㎕ 이상) 적하였을 때에는 전개용 매질의 너무 젖어 있어서 샘플패드에 전개완충액을 적하하였을 때에 골드입자-검출자 항체 결합체가 전개막을 잘 흐르지 못하는 문제가 발생하여 검사가 이루어지지 않을 수 있다. 따라서 적용되는 시료의 양은 스트립의 폭과 전개막의 공극을 고려하여 결정하여야 한다.
따라서 당업자라면 본원 발명의 실시예를 포함하여 개시된 내용을 근거로 검사 스트립의 폭 및 전개용 매질의 공극 및 전개용 매질에 적하할 시료의 양을 적절히 고려하여 본원에 따른 방법의 시료 적하 부위를 결정할 수 있을 것이다.
일 구현예에서 본원에 따른 시료 적하 부위는 스트립의 전개용 매질상에 선폭 약 1mm 이하의 식용색소 등으로 표시될 수 있다. 적색 제 2호, 적색 제3호, 적섹 제 40호, 적색 제 102호, 황색 제 4호, 황색 제 5호, 녹색 제 3호, 청색 제 1호, 청색 제2호 등이 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에 사용되는 스트립은 컨쥬게이션 패드를 추가로 포함할 수 있다. 일예로 도 5를 참조하면 컨쥬게이션 패드는 항체 또는 항원과 같은 표적 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 표지된 검출입자를 포함한다. 검출입자로는 다양한 비드 예를 들면, 폴리스티렌 미세구, 라텍스입자, 나노골드입자, 콜로이드성 골드입자, 금속입자, 자성입자, 형광입자, 및 반도체 나노크리스탈 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 표적 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 표지된 검출입자는 특이적 반응에 의해 분석물과 결합하고 이는 다시 전개용 매질의 포획자와 결합하고, 이러한 복합체는 검출장치를 통해 검출될 수 있다. 예를 들면 샌드위치 방식으로 검출을 하기 위해, 전개막의 검사선에 포획자로서 시료의 항원을 검출할 수 있는 항체가 부착되고, 컨쥬게이션 패드에도 상기 시료의 항원을 검출할 수 있는 항체가 접합된 비드를 포함한다. 또는 간접적 방식으로 검출하기 위해, 시료에서 검출하고자하는 분석 표적물이 항체인 경우, 전개막에는 항원이 부착되고 컨쥬게이션 패드에는 anti- species 항체 (IgA, IgG, IgM, IgE)가 접합된 비드를 포함한다. 컨쥬게이션 패드에 포함된 이러한 비드는 샘플패드에 적용된 완충액으로 인한 모세관력에 따라 이동하여 포획자 (검사선) 및 대조선의 물질과 결합할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 도 6와 같은 딥스틱 형태로 전개 완충액이 적용되는 면역크로마토그래피에도 적용될 수 있다. 이 경우 시료는 위에 설명한 바와 같이 적용되고, 스트립의 샘플패드의 일 말단을 완충액에 담그면 흡수패드 방향으로 모세관력이 발생한다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 방법이 사용되는 스트립에 관련된 것이다. 일 구현예에서 본원에 따른 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질에는 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자 및 대조물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 위치하며, 상기 전개용 매질 상의 상기 포획자 부착 부위 전방에는 색소로 표시된 시료 적하 부위를 포함하며, 상기 색소는 크로마토그래피 전개 방향으로 이동할 수 있는 수용성 색소이다.
일 구현예에서 본원에 따른 스트립은 컨주게이션 패드를 추가로 포함하며, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 방법이 적용될 수 있는 스트립을 수용하기 위한 하우징에 관한 것이다. 도 4를 참조하면 일 구현예에서 이러한 하우징은 상기 스트립의 샘플 패드에 완충액을 적하하기 위한 제 1 창, 시료를 적하하기 위한 제 2 창, 및 포획자 및 대조군 물질이 부착된 부위에서의 반응을 검출하기 위한 제 3 창을 포함한다. 상기 제 2 창은 본원에 따른 방법에 의한 시료 적하부위에 상응하는 위치이다. 일 구현예에서 특히 전개 완충액을 파이펫과 같은 도구를 이용해서 적용하는 방식의 스트립에 특히 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1- 일본뇌염 IgM항체 검사키트 제작
1.1 Goat anti-Human IgM antibody와 금 입자 결합체 제조
항체-금 입자 결합체의 제조를 위해 Goat anti-Human IgM antibody를 3차 증류수에 2mg/mL의 농도로 희석하였다. 이 항체용액을 40 nm 직경의 금 입자 용액 (pH 8.0 ~ pH 8.8) 1mL 당 6.0ug~12.0ug을 첨가하여 상온에서 10 ~ 30분간 교반하며 반응시켰다. 이 용액에 Blocker 용액 (10% BSA or 1% PEG 6,000)을 최종 농도 0.02% ~ 0.1%가 되도록 넣어주고 5 ~ 10분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 항체-금 입자 결합체를 원심 분리하여 침전시킨 후, 2mM borate buffer (pH 8.0 ~ pH 8.8, 0.01% NaN3 포함)에 현탁하여 냉장에서 보관하였다.
1.2 항체-금 입자 컨쥬게이션 패드 제조
실시예 1에서 제조된 [Goat anti-Human IgM antibody-금 입자 결합체]를 sucrose (4% ~10%), TritonX-100 (0.1% ~ 0.5%)가 포함된 Tris 기반의 용액(20-100mM Tris-Cl, pH 8.0 ~ 8.8)에 혼합하여 최종 OD526-532 값을 5.0 ~ 6.0 로 하여 폴리에스테르 재질의 섬유 (10mm X 300mm)에 고르게 적신 후 40℃ ~ 50℃ 온도에서 건조시켜 건쥬게이션 패드를 제조하였다.
1.3 나이트로셀룰로스 막 (전개용 매질) 위에 단백질 고정
분주기를 이용하여 나이트로셀룰로스 막 (공극 12μm) 표면에 1.5 mg/mL ~ 2.0 mg/mL의 일본뇌염바이러스 피막단백질(검사선)과 0.8 mg/mL ~ 1.2 mg/mL의 rabbit anti-goat IgG 항체 (대조선)를 1.0 mm 폭의 선 형태로 분주하였다. 분주한 후, 나이트로셀룰로오스 막을 37℃ ~ 50℃ 에서 2 ~ 3시간 동안 건조시켜 고정하였다.
1.4 샘플패드 전처리
샘플패드에 적하된 시료가 항체-금 입자 결합체와 반응한 후 나이트로셀룰로스 막을 통해 원활하게 전개될 수 있도록 샘플패드를 Tween-20 (0.1% ~ 1.0%)가 포함된 Tris 기반의 완충용액 (20-100mM Tris-Cl, pH 7.5 ~ 8.5)에 충분히 적신 후 30℃ ~ 40℃ 온도에서 완전히 건조시켰다.
1.5 전개완충액 제조
검체전개를 보조하는 전개완충액은 Tris를 (20mM ~ 100mM, pH 7.5 ~ 8.5) 기반으로 하여 Triton X-100 (0.1% ~ 1%), Tween- 20 (0.1% ~ 1.0%) 및 보존제 (아지드화나트륨 0.01% ~ 0.1%)를 포함하여 제조하였다.
1.6 진단 키트의 조립
[항체-금 입자 결합체]가 함유된 컨쥬게이션 패드와 샘플 패드를 나이트로셀룰로스 막에 중첩되도록 부착하고 검체 패드 반대편의 나이트로셀룰로스 막에는 모세관 현상을 통해 상기 복합체가 원활히 전개될 수 있도록 흡수패드를 중첩하여 부착하였다. 이렇게 제조한 진단용 스트립 (60mm x 4.0mm)을 검사선(T) 및 대조선(C)이 표기된 플라스틱 재질의 케이스에 넣고 조립하여 진단키트를 제조하였다
실시예 2. 본 발명에 따른 방법 및 기존 방법의 검출 효능 비교
기존 방식 원리를 설명하면 다음과 같다. 일본뇌염 검출이 필요한 사람 혈청(혈장) 10㎕를 검체 투입구에 적하하고 이어서 전개완충액을 100㎕을 동일한 투입구에 적하한다. 이어 시료 용액은 골드 컨쥬게이트 패드 쪽으로 이동한다. 여기서 시료 안에 있는 human IgM 항체는 골드컨쥬게이트 패드에 건조되어 있는 goat anti-human IgM 항체에 결합한다. 이어 골드입자-항체 복합체는 전개막으로 계속 이동하게 된다. 시료 내에 anti-Japanese encephalitis virus IgM 항체가 존재한다면 상기 복합체가 포획자 (일본뇌염바이러스 항원)가 고착된 검사선 (T)을 지날 때, [금입자 + goat anti-human IgM + human IgM +일본뇌염바이러스항원]복합체가 생성되고 검사선에 계속해서 쌓이게 된 복합체는 빨간색으로 보이게 된다. 남은 복합체는 계속해서 전개막을 따라 대조선 (C, anti-goat IgG antibody가 고착됨)에 이르게 된다. 여기에서 [금입자 + goat anti-human IgM + anti-goat IgG antibody]복합체가 생성되고 대조선에 계속해서 쌓이게 된 복합체는 빨간색으로 보이게 된다. 따라서 검사선과 대조선 모두에서 빨간색이 보이면 양성으로, 대조선에서만 빨간색이 보이면 음성으로 판정한다.
기존의 방법과 본원에 따른 방법에 따른 성능을 비교하기 위해 실시예 1에서 제작한 진단 키트에 일본뇌염 환자 혈청을 본원의 방법인 1) 나이트로셀룰로스 막에 직접 적하한 후, 전개완충액을 샘플패드 홀에 적하하였고, 기존이 방법대로 2)검체를 샘플패드 쪽 홀에 적하하여 패드에 스며들게 한 후에 전개완충액을 동일한 홀에 적하하는 방식으로 검사하여 두 방식 간 검사선의 진하기 (검출 감도)를 비교하였다.
검체는 일본뇌염바이러스 양성 검체로서 ELISA 법으로 양성이 확인된 검체를 사용하였다. 양성검체를 고농도, 중농도, 저농도로 나눈 후 상기에서 기술한 두 가지 방법을 적용하여 발색에 따른 민감도의 차이를 확인하였다.
본원에 따른 방법 적용을 위해 실험용 파이펫으로 검체를 3㎕ 덜어서 나이트로셀룰로스 막의 검사선 앞에 직접 적하하고 샘플패드쪽 홀에 전개완충액 100㎕를 적하하였다. 결과는 10분 후 육안으로 판독하였다. 기존 방법의 경우, 실험용 파이펫으로 검체를 10㎕ 덜어서 샘플패드쪽 홀에 적하하고 시료가 패드에 스며들면 동일한 홀에 전개완충액 100㎕를 적하하였다. 검사 결과는 10분 후 육안으로 판정하였다. 검사선 (T) 및 대조선 (C)이 모두 붉은색으로 변하면 양성, 대조선 (C)만 붉은색으로 변하면 음성으로 판정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 실험 결과, 본 발명에서 제시한 검사방법은 전통적인 방식에 비해 더 적은 양의 검체를 사용함에도 불구하고 검출감도가 월등히 높은 것으로 나타났다. 특히 양성 저농도의 검체를 시험했을때에 본 발명에 따른 방법으로는 양성결과를, 전통적인 방식으로 시험했을때에는 음성결과를 보였다. 이는 본원에 따른 방법은 감도를 향상시켜 위음성 문제를 해결할 수 있음을 나타내는 것이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
Claims (7)
- 시료 중의 표적 분석물을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 방법에서, 상기 표적 분석물의 검출 감도를 향상시키는 방법으로, 상기 방법은:
상기 면역 크로마토그래피에 사용되는 검사 스트립을 제공하는 단계로, 상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드, 흡수 패드 및 컨쥬게이션 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하며, 상기 전개용 매질에는 상기 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자, 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자가 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 부착되어 있고, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치하고,
상기 포획자 부착 부위 전방의 전개용 매질에 상기 시료를 적하하는 단계; 및
상기 시료 적하 후에, 상기 샘플패드에, 상기 스트립에서의 크로마토그래피 전개를 위한 전개 완충액을 적하하는 단계를 포함하는, 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 시료가 적하되는 상기 전개용 매질 상의 위치는 색소로 표시되며 상기 색소는 상기 크로마토그래피 전개와 함께 이동하는 것인, 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 스트립은 지지대를 추가로 포함하며, 상기 샘플 패드, 상기 전개용 매질 및 상기 흡수 패드는 상기 지지대 상에 위치하는 것인, 방법.
- 제 1 항, 제 3 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용되는 스트립으로,
상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드, 흡수 패드 및 컨쥬게이션 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치하고,
상기 전개용 매질에는 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자 및 대조물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 위치하며, 상기 전개용 매질 상의 상기 포획자 부착 부위 전방에는 색소로 표시된 시료 적하 부위를 포함하며, 상기 색소는 크로마토그래피 전개 방향으로 이동할 수 있는 수용성 색소인, 스트립. - 삭제
- 제 5 항에 따른 스트립을 수용하기 위한 하우징으로,
상기 하우징은 상기 스트립의 샘플 패드에 완충액을 적하하기 위한 제 1 창, 시료를 적하하기 위한 제 2 창, 및 포획자 및 대조군 물질이 부착된 부위에서의 반응을 검출하기 위한 제 3 창을 포함하는 것인, 하우징.
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